PT88187B

PT88187B - Processo para a preparacao de conjugados anticorpo-enzima em associacao com profarmacos para a libertacao de agentes citotoxicos em celulas tumorais

Info

Publication number: PT88187B
Application number: PT88187A
Authority: PT
Inventors: Mark G Saulnier; Peter D Senter; Joseph P Brown; David E Kerr
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1987-08-04
Filing date: 1988-08-03
Publication date: 1995-12-29
Also published as: EP0302473A2; ES2068191T3; HUT47437A; FI883597A7; KR930006757B1; EP0540859A1; NZ225599A; IL87319A0; FI98197C; FI883597A0; JP3127136B2; EP0540859B1; IE882379L; PT88187A; IE950981L; NO883414L; ATE162196T1; DE3853028D1; DE3856112T2; JPH02223532A

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A utilização de imunoconjugados para o fornecimento selectivo de agentes citotóxicos a células tumorais no tratamento de cancro é um processo conhecido na especialidade. 0 fornecimento de agentes citotóxicos ao local da células tumorais é bastante desejável uma vez que a administração sistémica desses agentes origina frequentemente a aniquilação das células normais existentes no corpo concumitantemente com as células tumorais que se pretende eliminar. Deste modo, em conformidade com os sistemas de fornecimento de fármacos anti-tumor vulgarmente utilizados conjuga-se um agente citotóxico com um anticorpo especifico do tumor para proporcionar um imunoconjugado que se liga às o agente utilizados anticorpo, Monoclonal 603-05 (March [veja-se por células tumorais e consequentemente fornece citotóxico ao local do tumor. Os imunoconjugados nesses sistemas dirigidos englobam os conjugados -fármaco [veja-se por exemplo R.W.Baldwin et al., Antibodies For Câncer Treatment, Lancet, pp.

e os conjugados anticorpo-toxina

15, 1986) exemplo P. E. Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review, em Monoclonal Antibodies '84:

Biological And Clinicai Applications, A. Pinchera et al. (ed. S), pp. 475-506 (1985)].

Tanto os anticorpos policlonais como os anticorpos monoclonais têm sido utilizados nesses imunoconjugados [veja-se por exemplo, K. Ohkawa et al., Selective In Vitro And In Vivo Growth Inhibition Against Human Yolk Sac Tumor Cell Lines By Purified Antibody Against Human α-Fetoprotein Conjugated With Mitomycin C Via Human Serum Albumin, Câncer Immunol. Immunother., 23, pp, 81-86 (1986) e G. F. Rowland et al., Drug Localisation And Growth

Anti-CEA Conjugates

1. Immunother., 21,

Inhibition Studies Of Vindesine-Monoclonal In A Human Tumour Xenograft, Câncer Immuno pp. 183-87 (1986)]. Os fármacos utilizados nestes imunoconjugados englobam a daunomicina [veja-se por exemplo,

J. Gallego et al., Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates with Anti-Tumour Activity, Int. J. Câncer, 33, pp. 737-44 (1984) and R. Arnon et al., In Vitro And In Vivo Efficacy Of Conjugates Of Daunoraycin With Anti-Tumor Antibodies, Immunological Rev., 62, pp. 5-27 (1982)], metotrexato [N. Endo et al., In Vitro Cytotoxicity Of A Human Serum Albumin-Mediated Conjugate Of Methotrexate With Anti-MM46 Monoclonal Antibody, Câncer Research, 47, pp.

1076-80 (1987)], mitomicina C [K. Ohkawa et al., supra] e vindesina [G. F. Rowland et al., supra]. As toxinas utilizadas nos conjugados anticorpo-toxina englobam as toxinas bacterianas tais como a toxina da difteria e as toxinas de origem vegetal tais como a ricina [veja-se por exemplo, F. L. Moolten et al., Antibodies Conjugated To Potent Cytotoxins As Specific Antitumor Agents, Immunol. Rev., 62, pp. 47-73 (1982)].

Apesar de toda a investigação dirigida no sentido da utilização de imunoconjugados para fins terapêuticos, são evidentes diversas limitações associadas a esses sistemas de fornecimento [veja-se por exemplo, M. J. Embleton, Targeting Of Anti-Cancer Therapeutic Agents By Monoclonal Antibodies,

Biochemical Society Transactions, 14, pp. 393-395 (615th Meeting, Belfast 1986)]. Em primeiro lugar a grande quantidade de fármaco que é necessário fornecer às células tumorais alvo para se conseguir a aniquilação dessas células é frequentemente impossível de obter devido às limitações impostas pelo número de antígenos associados aos tumores existentes à superfície das células e pelo número de moléculas

do fármaco que podem ser acopladas a qualquer determinada molécula de anticorpo. Esta limitação conduziu à utilização de agentes citotóxicos mais poderosos tais como as toxinas de origem vegetal nesses conjugados e conduziu também ao desenvolvimento de conjugados anticorpo-fármaco ligados a polímeros, os quais possuem rácios de multiplicidade do fármaco muito elevados [veja-se por exemplo, Ρ. E. Thorpe, supra, pp. 475-506 e R. W. Baldwin et. al., Design And

Therapeutic Evaluation Of Monoclonal Antibody 791T/36 - Methotrexate Conjugates,em Monoclonal Antibodies And Câncer

Therapy, pp. 215-31 (Alan R. Liss, mesmo com grandes rácios de carga

Inc de

1985)]. Contudo, fármaco ou com a utilização de toxinas poderosas, muitos imunoconjugados exibem ainda uma actividade citotóxica abaixo dos valores óptimos (sub-óptimo) e não conseguem efectuar uma aniquilação completa em doses segundo as quais todos os locais antigénicos disponíveis ficam saturados.

Em segundo lugar foi confirmado que a actividade citotóxica de um imunoconjugado depende frequentemente da sua absorção, mediada pelo componente anticorpo do conjugado, no interior da célula tumoral [veja-se por exemplo J. M. Lambert et al., Purified Immunotoxins That Are Reactive With Human Lymphoid Cells, J. Biol. Chem. 260 (n² 22), pp. 12035-12041, (1985)]. Esta internalização é crucial quando se utiliza um conjugado anticorpo-fármaco no qual o fármaco possui um local intracelular de acção ou anticorpo-toxina. Contudo, quando se utiliza conjugados a grande maioria dos antígenos associados aos tumores e consequentemente os anticorpo-fármaco ou anticorpo-toxina ligados antígenos, não é internalizada. Os conjugados internalizados são frequentemente transportados conjugados a esses que são para o lisossoma da célula onde o fármaco ou a toxina se degrada

[veja-se E.S. Vitetta et al., Science, 238, pp.1098-1104 (1987)]. Em consequência, embora o conjugado anticorpo-fármaco ou anticorpo-toxina possa exibir excelentes características de ligação ao tumor, é eventualmente possível, mesmo assim, que o conjugado possua uma utilidade citotóxica limitada devido a uma incapacidade para atingir o seu local de acção no interior da célula.

Por outro lado, sabe-se perfeitamente que as populações de células tumorais são frequentemente heterogéneas no que diz respeito à expressão do antígeno [veja-se por exemplo, A. P. Albino et al., Heterogeneity In Surface

Antigen And Glycoprotein Expression Of Cell Lines Derived From Different Melanoma Metastases Of The Same Patient, J. Exp.

Med., 154, pp. 1764-78 (1981)]. Além disso foi demonstrado que as células tumorais positivas em antígenos podem eventualmente originar uma progenia negativa em antígenos [veja-se por exemplo, M. Yeh et al., Clonal Variation For Expression Of A Human Melanoma Antigen Defined By A Monoclonal Antibody, J. Immunol., 126 (N⁸ 4), pp. 1312-17 (1981)].

Deste modo, em qualquer população de células tumorais, existirá um determinado número de células que não possuem o antígeno para o qual um imunoconjugado particular é específico. Em consequência o imunoconjugado não será capaz de se ligar a essas células e mediar a sua aniquilação.

Devido a esses inconvenientes, os sistemas de fornecimento de fármacos ou de toxinas anti-tumor actualmente utilizados possuem um sucesso limitado, especialmente quando utilizados em tratamentos in vivo.

Para além dos imunoconjugados objecto da discussão anterior, têm sido estudados também conjugados

anticorpo-enzima in vitro em combinação com uma segunda enzima não dirigida para a conversão de iodeto ou de arsfenamina nas suas formas tóxicas com o objectivo de amplificar a citotoxicidade mediada pelo anticorpo [veja-se por exemplo, C. W. Parker et al., Enzimatic Activation And Trapping Of Luminol-Substituted Peptides and Proteins. A Possible Means Of Amplifying The Cytotoxicity Of Anti-Tumor Antobodies, Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 72 (N^a 1), pp. 338-42 (1975) e G. W. Philpott et al., Affinity Cytotoxicity Of Tumor Cells With Antibody-Glucose Oxidase Conjugates, Peroxidase, And Arsphenamine, Câncer Research, 34, pp. 2159-64 (1974)].

De acordo com estes estudos in vitro, efectua-se o acoplamento da enzima glicose-oxidase a uma anticorpo e utiliza-se em combinação com uma enzima peroxidase não dirigida que converte o iodeto ou a arsfenamina em iodo ou arsénio citotóxico, respectivamente. Em consequência este tipo de abordagem exige não só o encaminhamento da enzima glicose-oxidase para as células tumorais com anticorpo, mas também a presença no local do tumor de dois outros agentes não dirigidos. A probabilidade de os três agentes se encontrarem simultaneamente presentes in vivo no local do tumor é bastante pequena pelo que este tipo de abordagem apresenta pouca importância terapêutica.

A patente canadiana n^a 1216791 de autoria de F.

Jansen e colaboradores, de 20 de Janeiro de 1987 descreve e revela a conjugação com um anticorpo de uma enzima capaz de libertar iões de amónio a partir dos substratos. Nessa patente afirma-se que os iões de amónio são capazes de potenciar a acção citotóxica de algumas imunotoxinas dirigidas ao local do tumor.

Finalmente o pedido de patente 84302218.7 descreve e revela um método para o europeia n^Qtratamento de uma população celular de tipo tumoral, em anticorpo para dirigir um antígeno não que se utiliza um metabolizável para células tumorais. 0 antígeno acumula-se no interior de pelo menos uma parte percentual das células tumorais as quais sofrem então uma acção de citólise para libertar o antígeno no interior de uma matriz capturadora de fibronectina ubiquista formada no local do tumor. Sendo assim, em conformidade com o método da invenção administra-se um ligando contendo iodo o qual é específico para o antígeno fixo à matriz, ao qual se ligará. Desta forma o iodo citotóxico actuará de modo a aniquilar as células tumorais nesse local. Nesse pedido de patente são descritas e reveladas muitas variantes alternativas, uma das quais sugere a utilização de um conjugado anticorpo-enzima para dirigir uma enzima para um local de um tumor e a adição de um substrato não letal que a enzima pode converter num material citotóxico [veja-se o pedido de patente europeia, páginas 34-35]. Todavia, em nenhum sítio da memória descritiva desse pedido de patente existe qualquer referência à forma de executar essa variante. De modo idêntico, Hellstrom e colaboradores, Antibodies For Drug Delivery, em Controlled Drug Delivery (2^a ed.), Robinson e Lee (ed.s), p. 639 (1987) sugere que os fármacos que não forem tóxicos até serem 'activados' por um agente (por exemplo, uma enzima) localizado no tumor podem ser considerados eventualmente como outra forma de abordagem ....

Todavia até ao momento presente ninguém descreveu, revelou ou sugeriu a forma como esse tipo de abordagem ali referenciada pode ser implementada nem ninguém tentou realmente este tipo de abordagem para encaminhar fármacos para o seu alvo.

SUMARIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos problemas anteriormente enunciados, proporcionando um novo método para o fornecimento de agentes citotóxicos a células tumorais por utilização combinada de conjugados anticorpo-enzima e pró-fármacos. De acordo com a presente invenção conjuga-se uma enzina que é capaz de converter um pró-fármaco fracamente ou mesmo não citotóxico num fármaco citotóxico activo, com um anticorpo específico de um tumor. Administra-se este conjugado anticorpo-enzima a um mamífero hospedeiro de um tumor e liga-se, devido à especificidade do anticorpo, à superfície das células tumorais que possuem o antígeno tumoral para o qual o anticorpo é específico. Depois administra-se o pró—fármaco ao hospedeiro sendo convertido no local do tumor por acção da enzima ligada ao anticorpo, originando um fármaco citotóxico mais activo.

A presente invenção descreve também um método para o fornecimento de fármacos citotóxicos a células tumorais segundo o qual uma série de pró-fármacos é activada por uma única enzima ligada a um anticorpo. Por outro lado, de acordo com a presente invenção é possível utilizar uma série de imunoconjugados diferentes, isto é, anticorpos específicos de tumores que suportam enzimas diferentes, para se converter diversos pró-fármacos diferentes nas suas formas mais citotóxicas para o tratamento de tumores. Em alternativa, de acordo com a presente invenção é possível utilizar uma série de imunoconjugados diferentes em que a especificidade do componente anticorpo do conjugado varia, isto é, cada imunoconjugado contem um anticorpo contra um local antigénico diferente na célula tumoral, para se converter um pró-fármaco ou diversos pró-fármacos em formas citotóxicas mais activas.

De acordo com um aspecto preferencial da presente invenção utilizou-se conjugados anticorpo-enzima contendo a enzima, uma fosfatase alcalina (AP), em conjunto com o novo pró-fármaco etopósido-4'-fosfato ou 7-(2'-amino-etil-fosfato)mitomicina ou uma sua combinação, para se efectuar a aniquilação das células tumorais. De acordo com outra variante da presente invenção utilizou-se um conjugado anticorpo-enzima contendo a enzima, penicilina V-amidase (PVA), em conjunto com um novo pró-fármaco N-(p-hidróxi-fenóxi-acetil)adriamicina para se efectuar a aniquilação das células tumorais. Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção descreve-se a utilização de um conjugado anticorpo-enzima contendo a enzima, citosina-desaminase (CD) em combinação com o pró-fármaco 5-fluorocitosina, para se efectuar a aniquilação das células tumorais.

Os imunoconjugados e os pró-fármacos podem ser utilizados eventualmente em composições anti-tumor tais como as composições que incorporam uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo menos um imunoconjugado ou um pró-fármaco da presente invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Além disso, os imunoconjugados e os pró-fármacos podem ser utilizados eventualmente em combinações e em métodos para o tratamento de tumores em mamíferos, caracterizados pela existência de um passo de tratamento de um mamífero com uma quantidade farmaceuticamente eficaz das composições da presente invenção.

De modo vantajoso, os métodos, imunoconjugados, pró-fármacos, composições farmacêuticas e combinações da presente invenção proporcionam um procedimento relativamente simples e directo para o fornecimento de fármacos citotóxicos às células tumorais, permitindo uma citotoxicidade selectiva aperfeiçoada ao mesmo tempo que evitam os problemas da expressão de antígenos heterogéneos, a internalização de antígenos/anticorpos e a potência insuficiente do fármaco inerente em técnicas de imunoterapia de tipo convencional dirigidas para anticorpos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa a estratégia utilizada para a activação de pró-fármacos em células tumorais que se unem aos conjugados anticorpo-enzima.

A Figura 2 representa uma análise em gel de SDS-poliacrilamida (gel em gradiente de 5-12,5%, não redutor) de: (A) imunoconjugado 96.5-AP; (B) iraunoconjugado L6-AP; (C) AP; (D) anticorpo monoclonal 96.5; e (E) anticorpo monoclonal L6.

A Figura 3 representa a preparação e a hidrólise dos pró-fármacos etoposido fosfato e do etoposido tiofosfato da presente invenção.

A Figura 4 representa a cromatografia em líquido de elevada pressão (CLEP) (verificada a 254 nm) de: (A) apenas etopósido-4'-fosfato, isto é, na ausência de AP ou do conjugado AP-L6; (B) apenas etoposido; (C) o produto produzido minutos após a reacção do pró-fármaco etopósido-4'-fosfato com AP; e (D) o produto produzido 5 minutos após a reacção do pró-fármaco etopósido-4'-fosfato com o conjugado L6-AP da presente invenção.

A Figura 5 é uma representação gráfica comparativa da percentagem de libertação de etoposido ao longo do tempo por exposição dos pró-fármacos etopósido-4'-fosfato ou etopósido-4'-tiofosfato à fosfatase alcalina.

A Figura 6 representa a ligação comparativa às células tumorais H3347 dos anticorpos monoclonais L6 e 96.5 e dos conjugados L6-AP e 96.5-AP da presente invenção.

A Figura 7 representa a ligação comparativa às células tumorais H3347 dos anticorpos monoclonais L6 e 1F5 e dos conjugados L6-AP e 1F5-AP da presente invenção.

A Figura 8 é uma representação gráfica comparativa do valor percentual das células tumorais aniquiladas em função da concentração molar de etopósido ou do pró-fármaco fosfato de etopósido. 0 gráfico revela o valor percentual acrescido da aniquilação que resulta da reacção do pró-fármaco relativamente não citotóxico alternativamente com o conjugado L6-AP ou com o conjugado 96.5-AP da presente invenção.

A Figura 9 é uma representação gráfica comparativa do valor percentual da inibição de incorporação de 3

H-timidina no ADN das células tumorais H3347 tratadas com • : etopósido, 0: EP, o : L6-AP+EP ou : 1F5-AP+EP. O gráfico revela o acréscimo de actividade citotóxica observada quando as células tumorais foram tratadas com o conjugado L6-AP e com EP comparativamente com a actividade que se observa ao fazer-se o tratamento apenas com EP.

A Figura 10 representa análises da actividade da fosfatase em tumores que não foram tratados ou que foram tratados com os conjugados da presente invenção. A Figura 10A revela a actividade da fosfatase total em células tumorais

Η3347 ao longo do tempo em murganhos não tratados comparativamente com murganhos tratados 24 horas antes com o conjugado L6-AP da presente invenção. A Figura 10B mostra secções transversais de tumores provenientes de murganhos não tratados ou de murganhos pré-tratados com L6-AP ou com 1F5-AP com marcação feita alternativamente com hematoxilina e eosina ou com um substrato de AP. As áreas enegrecidas indicam uma elevada actividade da fosfatase.

A Figura 11 é uma representação gráfica comparativa do volume tumoral ao longo do tempo nos murganhos : não tratados ou tratados com 0: etoposido, : EP, α _:

1F5-AP+EP ou à : L6-AP+EP. As setas indicam o início do tratamento com o fármaco e sempre que aplicável, os conjugados foram administrados 18 a 24 horas mais cedo. O gráfico revela o efeito anti-tumor pronunciado observado sob acção do tratamento com L6-AP e EP.

A Figura 12 revela as estruturas químicas dos derivados de mitomicina utilizados em conformidade com a presente invenção, incluindo o novo pró-fármaco 7-(2'-amino-etil-fosfato)mitomicina (MOP).

A Figura 13 revela a reacção do MOP com a enzima fosfatase alcalina ao longo do tempo. A evolução da reacção foi verificada por CLEP para a libertação de MOH que é o derivado alcoólico mitomicínico do MOP.

A Figura 14 revela a ligação comparativa às células tumorais H2981 dos anticorpos monoclonais L6 e 1F5 e dos conjugados L6-AP e 1F5-AP da presente invenção.

A Figura 15 é uma representação gráfica *

comparativa do valor percentual de inibição da incorporação de 3

H-timidina no interior da ADN das células tumorais H2981 tratadas com a : etopósido, : EP, π : AP+EP, · : L6-AP+EP ou 0: 1F5-AP+EP. 0 gráfico revela o acréscimo da actividade citotóxica relativamente à utilização apenas de EP que se observa quando as células tumorais foram pré-tratadas com o conjugado L6-AP da presente invenção.

A Figura 16 é uma representação gráfica comparativa do valor percentual de inibição da incorporação de 3

H-timidina no interior do ADN das células tumorais H2981 tratadas com o : mitomicina C (MMC), a : MOH, : MOP, Δ : MOP+AP, · : L6-AP+MOP ou 0: 1F5-AP+MOP. O gráfico revela o acréscimo na actividade citotóxica observado quando as células tumorais foram pré-tratadas com o conjugado L6-AP da presente invenção seguindo-se o tratamento com o MOP, comparativamente com a actividade observada quando se faz o tratamento apenas com o MOP.

A Figura 17 é uma representação gráfica comparativa do valor percentual de inibição da incorporação de

H-timidina no interior do ADN de células CEM tratadas com : MMC, □ : MOH, : MOP, · : L6-AP+MOP ou 0: 1F5-AP+MOP.

Este gráfico demonstra a especificidade da citotoxicidade melhorada observável na Figura 16 anterior devido ao facto de não se observar uma melhoria significativa nas células CEM a que falta o antígeno L6.

A Figura 18 é uma representação gráfica comparativa do volume tumoral ao longo do tempo nos murganhos • : não tratados (controlo) ou tratados com : MOH, 0: MOP, : 1F5-AP+MOP ou □ : L6-AP+MOP. As setas indicam os tratamentos espaçados com fármaco e sempre que aplicável os

conjugados foram administrados 18 a 24 horas mais cedo do que cada tratamento com fármaco. 0 gráfico revela o efeito anti-tumor pronunciado observável com o tratamento dos tumores com L6-AP+MOP.

A Figura 19 é uma representação gráfica comparativa do volume tumoral ao longo do tempo nos murganhos : não tratado (controlo) ou tratado com □ : MOP/EP, 0: 1F5-AP+MOP/EP ou · : L6-AP+MOP/EP. As setas indicam os tratamentos espaçados com fármaco e sempre que aplicável os conjugados foram administrados 18 a 24 horas mais cedo do que cada tratamento com fármaco. O gráfico revela o efeito anti-tumor pronunciado observável com o tratamento dos tumores com o conjugado L6-AP da presente invenção e com uma combinação dos pró-fármacos MOP e EP.

A Figura 20 representa a estrutura química de um pró-fármaco de adriamicina da presente invenção (APO) e a sua preparação a partir da adriamicina.

A Figura 21 é uma representação gráfica comparativa do valor percentual da adriamicina libertada ao longo do tempo por reacção do APO com 4 : enzima amidase isenta de penicilina V ou 0 e □ : o conjugado L6-PVA da presente invenção e entre 10 e 100 μg de proteína total/ml, respectivamente. A evolução da reacção foi verificada por CLEP.

A Figura 22 revela a ligação comparativa às células tumorais H2981 do anticorpo monoclonal L6 e dos conjugados L6-PVA e 1F5-PVA da presente invenção.

A Figura 23 é uma representação gráfica

comparativa do valor percentual da inibição da incorporação de

H-timidina no interior do ADN das células tratadas com 0: adriamicina (ADM), · : APO, ou 4 : 1F5-PVA+APO. O gráfico representa o actividade citotóxica observável quando as células tumorais foram pré-tratadas com o conjugado L6-PVA seguindo-se o tumorais H2981

Δ : L6-PVA+APO acréscimo na tratamento com APO comparativamente com a actividade que se observa quando se efectua o tratamento apenas com APO.

A Figura 24 revela a ligação comparativa às células do linfoma de Daudi dos anticorpos monoclonais L6 e 1F5 e dos conjugados L6-PVA e 1F5-PVA da presente invenção.

A Figura 25 é uma representação gráfica comparativa do valor percentual de inibição da incorporação de ^H-timidina no interior do ADN da células do linfoma de Daudi tratadas com · : ADM, 0: APO, : L6-PVA+APO ou α : 1F5-PVA+APO. O gráfico revela o aumento na actividade citotóxica observável quando as células tumorais foram pré-tratadas com o conjugado 1F5-PVA seguindo-se o tratamento com APO comparativamente com o efeito citotóxico observável quando se efectua o tratamento das células apenas com APO.

A Figura 26 revela as estruturas químicas dos compostos 5-fluorocitosina (5-FC) e 5-fluorouracilo (5-FU). O composto 5-FC é um pró-fármaco que é convertido em

5-FU em conformidade com os métodos da presente invenção.

A Figura 27 é uma representação gráfica

comparativa da quantidade de	produto	que se forma ao	longo	do
tempo por reacção da citosina	(cito)	com · : CD, 0:	L6-CD	ou
: 1F5-CD ou por reacção do	5-FC com	ι α : CD, A :	L6-CD	ou

Δ : 1F5-CD. O produto formado quando se utilizou a citosina

como substrato foi o uracilo e o produto que se formou quando se utilizou o composto 5-FC como substrato foi o composto 5-FU. A evolução da reacção foi verificada por espectrofotometria.

A Figura 28 revela a ligação comparativa às células tumorais H2981 do anticorpo monoclonal L6 e dos conjugados L6-CD e 1F5-CD da presente invenção.

A Figura 29 é uma representação gráfica comparativa do valor percentual de inibição da incorporação de 3

H-leucina no interior da proteína das células tumorais H2981 tratadas com · : 5-FU, Π : 5-FC, 0: L6-CD+5-FC ou : 1F5-CD+5-FC. O gráfico revela o acréscimo na actividade citotóxica observável quando as células tumorais foram pré-tratadas com o conjugado L6-CD seguindo-se o tratamento com o composto 5-FC comparativamente com a actividade que se observa quando se efectua o tratamento apenas com o composto 5-FC.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um novo método para o fornecimento de agentes citotóxicos a células tumorais e proporciona uma aniquilação selectiva aperfeiçoada das células tumorais no tratamento de cancros tais como os carcinomas e melanomas e ainda no caso de outros tumores.

De acordo com o método da presente invenção administra-se um conjugado anticorpo-enzima a uma mamífero hospedeiro afectado por um tumor. Este conjugado -enzima consiste num anticorpo do tumor unido a uma anticorpoenzima que é capaz de converter um pró-fármaco, o qual é menos citotóxico

correspondente, ser introduzido para as células tumorais do que o fármaco nesse mesmo fármaco original mais activo. Ao no hospedeiro o componente anticorpo desse conjugado, o qual é reactivo com um antígeno existente nas células tumorais, dirige o conjugado para o local do tumor e liga-se às células tumorais. Em consequência o anticorpo pode ser considerado como fornecedor da enzima ao local do tumor. Depois introduz-se um pró-fármaco que é um substrato para a enzima no interior do hospedeiro, sendo convertido no local do tumor pela enzima originando um fármaco citotóxico activo. 0 fármaco é assim activado extracelularmente e pode difundir-se no interior de todas as células tumorais existentes nesses local, isto é, nas células que suportam o antígeno do tumor particular para as quais o anticorpo do conjugado é específico e com as quais o anticorpo se liga e também com as células que são negativas para o antígeno mas que apesar de tudo existem no local do tumor (ver a Figura 1). Em consequência o método da presente invenção vem resolver os problemas actuais da heterogeneidade antigénica tumoral e a necessidade de internalização de antigeno/conjugado associada com as técnicas convencionais de fornecimento de um fármaco imunoconjugado.

Por outro lado, uma vez que o método da presente invenção não exige que o fármaco se ligue directamente ao anticorpo limitando por esse facto a quantidade de fármaco que pode ser fornecida, não há qualquer confrontação com o conhecido problema associado à potência do fármaco no local do tumor. Na realidade, o método da presente invenção amplifica o número de moléculas de fármaco activo existentes no local do tumor uma vez que a enzima do conjugado ligada ao anticorpo pode sofrer diversas modificações de substrato, convertendo-se repetidamente o pró-fármaco em fármaco activo. Por outro lado, o método da presente invenção permite libertar o fármaco activo especificamente no local do tumor sem libertação noutros tecidos. Isto é assim porque a concentração da enzima no local do tumor é superior à sua concentração noutros tecidos devido ao revestimento das células tumorais com o conjugado anticorpo-enzima.

componente anticorpo do imunoconjugado da presente invenção pode ser qualquer anticorpo que se ligue especificamente a um antígeno associado ao tumor. Como exemplos desses anticorpos refere-se, sem que isso constitua qualquer limitação, aqueles que se ligam especificamente aos antígenos existentes nos carcinomas, melanomas, linfomas e sarcomas dos ossos e de tecidos moles e ainda no caso de outros tumores. São preferíveis os anticorpos que permanecem ligados à superfície celular durante períodos prolongados ou que são internalizados muito lentamente. Esses anticorpos podem ser de tipo policlonal ou preferencialmente de tipo monoclonal, podem ser eventualmente moléculas de anticorpos intactos ou seus fragmentos contendo a região de ligação activa do anticorpo, por exemplo Fab ou F(ab')2 θ podem ser produzidos utilizando-se técnicas bem conhecidas na especialidade [ver por exemplo, R.A. DeWeger e colaboradores, Eradication Of Murine Lymphoma And Melanoma Cells By Chlorambucil-Antibody Complexes, Immunological Rev., 62, pp. 29-45 (1982) (anticorpos policlonais específicos do tumor produzidos e utilizados em conjugados); M. Yeh e colaboradores Cells Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibodies, Proc. Natl. Acad. Sei., 76, p. 2927 (1979); J. P. Brown e colaboradores Structural Characterization Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 With

Monoclonal Antibodies, J. Immunol., 127 (N^B 2), pp. 539-546 (1981) (anticorpos monoclonais específicos do tumor produzidos); e J. P. Mach e colaboradores, Improvement Of

Colon Carcinoma Imaging: From Polyclonal Anti-CEA Antibodies And Static Photoscanning To Monoclonal Fab Fragments And ECT, em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, R. W. Baldwin e colaboradores (ed.s), pp. 53-64 (Academic Press 1985) (fragmentos de anticorpos produzidos e utilizados para localizar células tumorais)]. Além disso, no caso de se utilizar anticorpos monoclonais, esses anticorpos podem ser eventualmente de origem humana ou obtidos a partir de murganhos ou podem ser anticorpos quiméricos [ver por exemplo, V. T. Oi, Chimeric Antibodies, BioTechniques, 4 (N^õ 3), pp. 214-221 (1986)].

componente enzimático do imunoconjugado da presente invenção pode ser qualquer enzima capaz de actuar sobre um pró-fármaco de modo a convertê-lo na sua forma citotóxica mais activa. 0 termo pró-fármaco utilizado nesta memória descritiva refere-se a um precursor ou a um derivado de uma substância farmaceuticamente activa que é menos citotóxica para as células tumorais comparativamente com o fármaco original e que é capaz de ser enzimaticamente activado ou convertido nessa forma original mais activa [ver por exemplo D.E.V. Wilman, Prodrugs In Câncer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382 (615th Meeting, Belfast 1986) e V. J. Stella e colaboradores Prodrugs: A Chemical Approach To Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, R. Borchardt e colaboradores (ed.), pp. 247-267 (Humana Press 1985)].

As enzimas úteis no método da presente invenção podem ser, sem que isso constitua qualquer limitação, a fosfatase alcalina útil para converter pró-fármacos que contenham fosfato originando fármacos autónomos, aril-sulfatase útil para converter pró-fármacos que contenham útil para converter o composto 5-fluorocitosina não tóxico

originando o fármaco anti-cancro 5-fluoro-uracilo, proteases tais como a protease do género Serratia, termolisina, subtilisina, carboxi-peptidases e catepsinas (tais como as catepsinas B e L) que são úteis para converter pró-fármacos que contenham peptidos em fármacos autónomos,D-alanil-carboxi-peptidases úteis para converter pró-fármacos que contenham substituintes D-aminoácidos, enzimas clivadoras dos hidratos de carbono tais como a β-galactosidase e a neuraminidase úteis para converter pró-fármacos glicosilados em fármacos autónomos, a β-lactamase útil para converter fármacos transformados com β-lactamas em fármacos autónomos e as amidases das penicilinas tais como a amidase da penicilina V ou a amidase da penicilina G úteis para converter fármacos transformados nos seus átomos de azoto do radical amina com grupos fenóxi-acetilo ou fenil-acetilo, fármacos autónomos. Em alternativa, respectivamente, em é possível utilizar anticorpos com actividade especialidade como azimas, enzimática, também conhecidos para conversão dos pró-fármacos na da presente exemplo, pssível invenção em fármacos activos autónomos [ver por R. J. Massey, Nature, 328, pp. 457-458 (1987)] É preparar os conjugados anticorpo-azima conforme descrito nesta memória descritiva para o fornecimento da azima a uma população de células tumorais.

De modo idêntico, os pró-fármacos da presente invenção, podem ser, sem que isso constitua qualquer limitação, os pró-fármacos anteriormente enumerados, por exemplo, os pró-fármacos que contenham fosfato, os pró-fármacos que contenham tiofosfato, os pró-fármacos que contenham sulfato, os pró-fármacos que contenham peptidos, os pró-fármacos modificados por D-aminoácidos, os pró-fármacos

os pró-fármacos que contenham β-lactamas, os que contenham fenóxi-acetamida facultativamente glicosilados, pró-fármacos substituída ou os pró-fármacos que contenham fenil-acetamida facultativamente substituída, o pró-fármaco 5-fluoro-citosina e outros pró-fármacos derivados de 5-fluoro-uridina os quais podem ser convertidos pela enzima do conjugado num fármaco autónomo citotóxico mais activo. Como exemplos de fármacos citotóxicos que é possível transformar numa forma de pró-fármaco para utilização na presente invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, o etoposido, o teniposido, a adriamicina, a daunomicina, a carminomicina, a aminopterina, a dactinomicina, as mitomicinas, cis-platina e análogos de cis-platina, as bleomicinas, as esperamicinas [ver a Patente Norte-americana n^Q 4 675 187], 5-fluoro-uracilo, o melfalano e outras mostardas azotadas afins.

As enzimas da presente invenção podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos da presente invenção por técnicas bem conhecidas na especialidade tais como a utilização dos reagentes reticulantes heterobiofuncionais

SPDP propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) ou SMCC ciclo-hexano-l-carboxilato de (succinimidil-4-(N-maleimidometilo) [ver por exemplo P. E. Thorpe e colaboradores, The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunological Rev., 62, pp. 119-58 (1982); J. M. Lambert e colaboradores, supra, na p. 12038; G.

e colaboradores, supra, nas pp. 183-84, e J. colaboradores, supra, nas pp. 737-38]. Em é possível construir proteínas de fusão contendo peio menos a região de ligação do antígeno de um anticorpo da presente invenção ligado a pelo menos uma porção funcionalmente activa de uma enzima da presente invenção

F. Rowland Gallego e alternativa utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na

especialidade [ver por exemplo M. S. Neuberger e colaboradores, Nature, 312, pp. 604-608 (1984)]. Estas proteínas de fusão actuam essencialmente de forma idêntica à dos conjugados anticorpo-enzima descritos na presente memória descritiva.

De acordo com um aspecto preferencial da presente invenção conjugou-se um anticorpo específico para um antígeno de um cancro humano com a utilizou-se em conformidade enzima fosfatase alcalina e com o método da presente invenção para converter um derivado de 4'-fosfato dos glicósidos epipodofilotoxina num fármaco activo anti-cancro.

Esses derivados englobam os compostos etopósido-4'-fosfato, etopósido-4'-tiofosfato e tenipósido-4'-fosfato (ver Figura 3 para as estruturas desses derivados; o derivado tenipósido possui um grupo 2-tienilo em vez do grupo metilo no radical açúcar das estruturas representadas). De acordo com outros aspectos da presente invenção faz-se referência eventualmente a derivados fosfato desses glicósidos em que o radical fosfato é substituído em outros grupos hidroxilo nos glicósidos.

Contudo, de acordo com um aspecto mais preferencial da presente invenção o derivado fosfato utilizado como pró-fármaco é qualquer dos compostos etopósido-4'-fosfato ou etopósido-4'-tiofosfato.

De acordo com a presente invenção uniu-se covalentemente a fosfatase alcalina (AP) ao anticorpo monoclonal L6 que é um anticorpo IgG2a que se liga a um antígeno glicoprotéico nas células do carcinoma do pulmão humano [I. Hellstrom e colaboradores,Antitumor Effects Of L6, An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, pp. 7059-63 (1986)]. 0 imunoconjugado resultante não demonstrou qualquer perda de actividade enzimática comparativamente com a da enzima não conjugada. Por outro lado a maioria da actividade ligante do anticorpo L6 foi conservada no imunoconjugado.

Recorrendo a ensaios de citotoxicidade in vitro demonstrou-se que o tratamento das células de uma linha celular de carcinoma humano com o imunoconjugado L6-AP seguindo-se a exposição dessas células a um pró-fármaco fosfato de etoposido originou uma citotoxicidade comparável à utilização apenas de etoposido nessas células cancerosas. Pelo contrário, o fosfato de etoposido utilizado por si só demonstrou fraca citotoxicidade.

Além disso, estudos efectuados in vivo em murganhos rapados demonstraram que o imunoconjugado L6-AP se localiza em xenoenxertias tumorais positivas em L6. A avaliação histológica desses tumores indicou que a enzima AP dirigida para o alvo se distribuiu por toda a massa tumoral.

Além disso o imunoconjugado L6-AP demonstrou uma poderosa actividade anti-tumor in vivo em experiências terapêuticas em que o conjugado foi administrado a murganhos rapados que possuíam tumores subcutâneos positivos em L6 seguindo-se o tratamento com um pró-fármaco fosfato de etoposido. 0 efeito anti-tumor deste tratamento incluiu a regressão completa de vários tumores e foi superior ao efeito do tratamento com o pró-fármaco ou com o fármaco original por si sós.

De acordo com outro aspecto preferencial da presente invenção utilizou-se o imunoconjugado L6-AP para se converter um novo pró-fármaco de fosfato de mitomicina num fármaco activo derivado de mitomicina. Tal como sucede no

caso do pró-fármaco fosfato de etoposido, a enzima AP do conjugado remove o grupo fosfato do pró-fármaco libertando o agente activo anti-tumor. 0 pró-fármaco fosfato de mitomicina 7 desta variante pode ser um derivado de fosfato de N -alquilo(C^-Cg) da mitomicina C ou da porfiromicina ou um seu 7 sal farmaceuticamente aceitável. 0 símbolo N representa o átomo de azoto acoplado à posição 7 do núcleo do mitosano do fármaco original. De acordo com uma variante mais preferencial o derivado utilizado é o composto 7-(2'-amino-etil-fosfato)mitomicina (MOP) (ver a Figura 12 para as estruturas da mitomicina C e da MOP sob a forma de um sal derivado da porfiromicina correspondente possui um grupo metilo no átomo de azoto di-sódio; o composto MOP aziridina da mitomicina C). Em alternativa o pode ser designado por sal dissódico de de ao da composto MOP 9a-metoxi-7(((fosfono-oxi)etil]amino]mitosano. De acordo com outras variantes -fármacos da presente invenção é possível utilizar 7 os fosforotioatos de N -alquil-mitomicina.

como próEstudos in vitro indicaram que o tratamento de células de uma linha celular de tumor de pulmão humano com o imunoconjugado L6-AP seguindo-se a exposição dessas células ao composto MOP teve como consequência uma citotoxicidade comparável à utilização do comprovado agente anti-tumor mitomicina utilização utilizado por si só em células tumorais. A do pró-fármaco fosfato de mitomicina por si só em células tumorais teve como citotoxicidade. Identicamente consequência uma o imunoconjugado fraca

L6-AP demonstrou um efeito anti-tumor pronunciado in vivo em experiências terapêuticas em que o conjugado foi administrado a murganhos rapados portadores de tumores de pulmão humano seguindo-se o tratamento com o pró-fármaco fosfato de mitomicina. Este efeito anti-tumor foi superior ao que é observável utilizando apenas o pró-fármaco, utilizando apenas o fármaco original ou utilizando o pró-fármaco conjuntamente com um conjugado anticorpo-AP não ligante.

Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção ligou-se covalentemente uma enzima penicilina-amidase ao anticorpo monoclonal L6 e utilizou-se o imunoconjugado resultante para se converter o novo pró-fármaco da adriamicina num fármaco activo anti-tumor, a adriamicina. A amidase particular utilizada foi uma amidase da penicilina V (PVA) isolada a partir de Fusarium oxysporum que hidrolisa as ligações fenóxiacetil-amida. Desta forma o pró-fármaco particular utilizado foi o composto N-(p-hidróxi-fenóxi-acetil)adriamicina (APO) o qual foi hidrolisado pela amidase para libertar o poderoso agente anti-tumor que é o composto adriamicina. 0 imunoconjugado L6-PVA não demonstrou qualquer perda de actividade enzimática comparativamente com a da enzima não conjugada e a maior parte da actividade de ligação do anticorpo L6 foi mantida no conjugado.

De acordo com os estudos in vitro agora efectuados, o tratamento de células de tumores do pulmão humano com o conjugado L6-PVA seguindo-se a exposição dessas células ao pró-fármaco APO teve como consequência uma citotoxicidade comparável à que se observa no tratamento dessas células utilizando apenas adriamicina. É importante salientar que o pró-fármaco APO por si só demonstrou muito menor citotoxicidade no que diz respeito às células tumorais.

De modo idêntico foram efectuados também estudos in vitro utilizando-se um conjugado 1F5-PVA no qual a enzima PVA foi conjugada com o componente 1F5 que é um anticorpo monoclonal reactivo com um antigeno existente nas células dos linfomas. 0 tratamento das células do linfoma de Daudi com o conjugado 1F5-PVA seguindo-se a exposição dessas células ao pró-fármaco APO teve como consequência uma citotoxicidade comparável à que é observável no tratamento utilizando apenas adriamicina, ao passo que o tratamento dessas células utilizando apenas o pró-fármaco APO teve como consequência uma citotoxicidade bastante fraca.

Embora a síntese e a utilização do novo pró-fármaco da adriamicina, o composto N-(p-hidróxi-fenóxi-acetil)adriamicina, seja descrita na presente memória descritiva, faz-se observar que a presente invenção refere também a síntese e a utilização de outros pró-fármacos associados à adriamicina que podem ser transformados por um processo praticamente idêntico. Por exemplo, o pró-fármaco N-(fenóxi-acetil)adriamicina está também abrangido no âmbito da presente invenção na medida em que esse pró-fármaco pode ser sintetizado em conformidade com o protocolo descrito na presente memória descritiva mas utilizando o ácido fenóxi-acético em vez do reagente ácido p-hidróxi-fenóxi-acético (ver o Exemplo 4 infra). Por outro lado faz-se observar que os pró-fármacos da adriamicina da presente invenção englobam outros derivados da adriamicina de radicai N-hidróxi-fenóxi-acetilo, por exemplo, susbtituídos em diferentes posições do anel do fenilo e ainda os derivados de radical N-fenóxi-acetilo que contenham substituintes no anel do fenilo diferentes do grupo hidroxilo descrito na presente memória descritiva.

Além disso esta variante engloba a utilização de outras amidases tais como a amidase da penicilina G como enzima componente do imunoconjugado e também outros pró-fármacos correspondentemente transformados de tal modo que a esse pró-fármaco

Por exemplo, no caso

G como enzima, o prófenil-acetil-amida amidase particular possa hidrolisar originando uma forma activa anti-tumor. de se utilizar uma amidase da penicilina -fármaco deve conter um grupo esse (contrariamente ao grupo fenóxi-acetil-amida do composto APO) uma vez que as amidases da peniclina G hidrolisam este tipo de ligação amida [ver por exemplo, A.L.Margolin e colaboradores, Biochim. Biophys. Acta, 616, pp. 283-89, (1980)]. Deste modo existem outros pró-fármacos da presente invenção englobando os compostos N—(p-hidróxi-fenil-acetil)adriamicina, N-(fenil-acetil)adriamicina e ainda outros derivados de adriamicina de grupo N-fenil-acetilo substituído.

Faz-se observar também que a presente invenção engloba quaisquer pró-fármacos obtidos por reacção do grupo amina do fármaco original com o grupo carboxilo do ácido fenóxi-acético com o acido fenil-acético ou com outros ácidos afins. Desta forma, os pró-fármacos de antraciclinas diferentes da adriamicina susceptíveis de serem transformados e que actuam praticamente do mesmo modo dos pró-fármacos de adriamicina descritos na presente memória descritiva, consideram-se também englobados no âmbito da presente invenção. Por exemplo, existem outros pró-fármacos que podem ser produzidos e utilizados em conformidade com a presente invenção, incluindo os compostos de grupo hidróxi-fenóxi-acetilamida, de grupo hidróxi-fenil-acetilamida, de grupo fenóxi-acetilamida e de grupo fenil-acetilamida derivados de antraciclinas tais como a daunomicina e a carminomicina. Também é possível modificar outros fármacos que contenham o grupo amina tais como os compostos melfalano, mitomicina, aminopterina, bleomicina e dactinomicina, conforme descrito na presente memória descritiva, para proporcionar pró-fármacos da presente invenção.

I

Em consequência é evidente que a presente invenção engloba os compostos de fórmulas gerais I e II:

em que:

o símbolo R representa o átomo de hidrogénio e 3 o símbolo R representa o grupo OH ou OCH3; ou

- 1 3 o símbolo R representa o grupo OH e o símbolo R representa o grupo OCH3; e o símbolo R representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e

em que:

o símbolo R representa o átomo de hidrogénio e

o símbolo R representa o grupo OH ou OCH3; ou

3 o símbolo R representa o grupo OH e o símbolo R representa o grupo OCH3; e o símbolo R representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH.

Um outro apecto preferencial da presente invenção implica a conjugação da enzima citosina-desaminase (CD) com o anticorpo monoclonal L6. A enzima desaminase catalisa a conversão do composto 5-fluorocitosina (5-FC) que é um composto ao qual falta actividade anti-neoplásica, para proporcionar o poderoso fármaco anti-tumor 5-fluoro-uracilo (5-FU) (ver a Figura 24). Deste modo utilizou-se o imunoconjugado L6-CD da presente invenção para se converter o pró-fármaco 5-FC no composto 5-FU daí resultando um significativo efeito citotóxico sobre as células tumorais in vitro.

Tal como sucedia com os imunoconjugados da presente invenção anteriormente descritos, o conjugado L6-CD não demonstrou qualquer perda significativa de actividade enzimática ou de ligação devida à conjugação. Além disso os estudos in vitro agora efectuados demonstraram que o tratamento de células tumorais de pulmão humano com o conjugado L6-CD seguindo-se a exposição dessas células ao pró-fármaco 5-FC teve como consequência um efeito citotóxico igual ao que é observável no tratamento dessas células com o poderoso fármaco anti-tumor 5-FU utilizado por si só. 0 tratamento dessas células tumorais com o pró-fármaco por si só teve como consequência um efeito citotóxico insignificante.

selectivo

descritos -fármaco da presente para a tumorais, actividade

A partir dos resultados exaustivos agora é evidente que a combinação imunoconjugado/próinvenção proporciona um mecanismo aniquilação de células administrando-se um pró-fármaco que diminui a citotóxica, sendo esse pró-fármaco convertido num derivado altamente citotóxico no local das células tumorais devido à presença nesse local da enzima encaminhada pelo anticorpo.

Por outro lado, a citotoxicidade conseguida por este método é aumentada em relação às técnicas convencionais de encaminhamento de anticorpos uma vez que o fármaco activo libertado no local do tumor não é obstruído pelas limitações físicas associadas aos sistemas de fornecimento de conjugados anticorpo-fármaco, conforme descrito antes. Por essa razão é evidente que o método da presente invenção proporciona uma via para melhorar a citotoxicidade selectiva no que diz respeito às células tumorais no caso de tratamento de cancros e de outros tumores.

Outra variante do método da presente invenção proporciona um método de combinação de quimioterapia utilizando vários pró-fármacos e apenas um único conjugado anticorpo-enzima. Em conformidade com esta variante utiliza-se diversos pró-fármacos os quais constituem todos substratos para a mesma enzima num determinado imunoconjugado. Desta forma, um conjugado anticorpo-enzima particular converte diversos pró-fármacos numa forma citotóxica daí resultando uma actividade anti-tumor acrescida no local do tumor. Por exemplo obteve-se um efeito anti-tumor pronunciado em estudos in vivo em que se administrou o imunoconjugado L6-AP da presente invenção a murganhos rapados portadores de tumores do pulmão humano, seguindo-se o tratamento com uma combinação de novos pró-fármacos, isto é, um pró-fármaco fosfato de etoposido e um pró-fármaco conjuntamente. De modo fosfato de mitomicina administrados idêntico a administração de pró-

-fármacos fosfato de etoposido, fosfato de adriamicina (ver a patente norte americana n° 4185111) e monofosfato de 5-fluoro-uridina [ver por exemplo, C. Heidelberger e colaboradores, Fluorinated Pyrimidines And Their Nucleosides, em Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 54, pp. 57-119 (1983)], após tratamento com um conjugado anticorpo-AP anti-tumor tem como consequência a formação de uma combinação de poderosos fármacos antitumor no local do tumor, isto é, a formação dos fármacos etoposido, adriamicina e 5-fluoro-uridina.

De acordo com outras variante utiliza-se diversos imunoconjugados diferentes em que a componente enzima do conjugado varia. Cada imunoconjugado pode ser utilizado para converter o seu correspondente pró-fármacos ou os seus correspondentes pró-fármacos em formas citotóxicas no local do tumor. Por exemplo, é possível ligar um anticorpo anti-tumor ao componente AP para formar um conjugado e é possível ligar esse anticorpo à enzima citosina-desaminase para formar outro conjugado. Depois administra-se os dois imunoconjugados ao hospedeiro portador do tumor nele ocorrendo a ligação ao antígeno tumoral no local do tumor devido à especificidade do anticorpo. A administração dos pró-fármacos fosfato de etoposido e 5-fluoro-citosina terá como consequência a formação dos compostos etoposido e 5-fluoro-uracilo no local do tumor, sendo qualquer deles um poderoso agente anti-tumor.

Uma outra variante da presente invenção implica a utilização de diversos imunoconjugados em que a especifificidade do componente anticorpo do conjugado varia, isto é, utiliza-se diversos imunoconjugados, possuindo cada um deles um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno

diferente sobre o tumor em causa. A componente enzima desses imunoconjugados pode ser a mesma ou pode ser diferente. Esta variante pode eventualmente ser bastante útil em situações em que as quantidades dos diversos antígenos à superfície do tumor são desconhecidas e sempre que se queira garantir que há uma quantidade suficiente de enzima dirigida para o local do tumor. A utilização de diversos conjugados portadores de diferentes especificidades antigénicas para o tumor aumenta a possibilidade de se obter uma quantidade suficiente de enzima no local do tumor para a conversão de um pró-fármaco ou de uma série de pró-fármacos. Além disso esta variante é importante para se conseguir um elevado grau de especificidade para o tumor uma vez que é pequena a possibilidade de o tecido normal possuir todos os antígenos associados ao tumor [cf., I. Hellstrom e colaboradores, Monoclonal Antibodies To Two Determinants Of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In

Complement-Dependent Cytotoxicity, J. Immunol., 127 (N^a 1), pp. 157-160 (1981)].

A presente invenção refere-se também a composições, combinações e métodos farmacêuticos para o tratamento de cancros e para o tratamento de outros tumores.

Mais particuiarmente a presente invenção descreve combinações constituídas por conjugados anticorpo-enzima da presente invenção e do correspondente pró-fármaco para utilização num método para o tratamento de tumores segundo o qual se trata um mamífero hospedeiro, de uma forma aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, com uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um conjugado ou de vários conjugados anticorpo-enzima e com uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um pró-fármaco ou de vários pró-fármacos. A combinação e os métodos da presente invenção são úteis para o tratamento de qualquer mamífero incluindo os seres humanos, cães, gatos e

I

De acordo com uma variante preferencial, equídeos .

administra-se o conjugado anticorpo-enzima antes da introdução do pró-fármaco no hospedeiro. É necessário deixar decorrer um período de tempo suficiente entre a administração do conjugado e do pró-fármaco de modo a permitir que o anticorpo do conjugado oriente e localize a enzima no local do tumor. Esse período de tempo suficiente pode variar eventualmente entre 12 horas e uma semana consoante o tipo de conjugado utilizado.

Os conjugados e os pró-fármacos da presente invenção podem ser administrados em conformidade com modos convencionais de administração incluindo, sem que isso constitua qualquer limitação, as vias intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática ou ainda a administração directa no local do tumor. Considera-se preferencial a administração intravenosa.

As composições da presente invenção, compreendendo os imunoconjugados ou pró-fármacos, podem apresentar-se eventualmente segundo uma ampla variedade de formas de dosagem as quais englobam , sem que isso constitua qualquer limitação, as soluções ou suspensões no estado líquido, os comprimidos, as pílulas, os pós, os supositórios, as microcápsulas ou microampôlas poliméricas, os lipossomas e soluções injectáveis ou para administração por infusão. A forma preferencial depende do modo de administração e da aplicação terapêutica. Por exemplo, a administração oral do conjugado anticorpo-enzima pode ser desfavorável uma vez que as proteínas conjugadas tendem a degradar-se no estômago quando ingeridas, por exemplo, sob a forma de comprimidos. As composições de conjugados ou de pró-fármacos incorporam também preferencialmente veículos e adjuvantes convencionais

como a albumina do soro humano, os permutadores de alumina, a lecitina, substâncias tampão tais como os fosfatos, a glicina, o ácido sórbico, o sorbato de potássio e sais ou electrólitos tais como o sulfato de protamina.

modo de administração e o regime de dosagem mais eficazes para as composições da presente invenção dependem da gravidade e da evolução da doença, da saúde do paciente e da resposta ao tratamento e ainda da opinião do especialista médico responsável pelo tratamento. Em consequência, as doses dos imunoconjugados e dos pró-fármacos devem ser tituladas em função de cada paciente.

Todavia uma dose eficaz de um conjugado anticorpo-enzima da presente invenção pode estar compreendida eventualmente entre 1,0 e 100 mg/m . Uma dose eficaz do pró-fármaco da presente invenção dependerá do pró-fármaco particular utilizado e do fármaco original do qual derivou. Uma vez que o pró-fármaco é menos tóxico do que o fármaco original é possível utilizar eventualmente doses que excedem as quantidade recomendadas na especialidade para o fármaco original. Por exemplo, uma dose eficaz de pró-fármacos do etoposido pode estar compreendida eventualmente entre 75 e 500 mg/m . Uma dose eficaz dos pró-fármacos de fosfato de mitomicina pode estar compreendida eventualmente no intervalo 2 entre 50 e 1000 mg/m . Uma dose eficaz dos pro-fármacos de adriamicina pode estar compreendida eventualmente no intervalo entre 15 e 150 mg/m . Finalmente, uma dose eficaz de pró-fármacos de 5-fluoro-citosina e de outros derivados de 5-fluoro-uridina pode estar compreendida eventualmente no 2 intervalo entre 600 e 2000 mg/m .

possa

Para que a presente ser compreendida mais invenção agora descrita globalmente procede-se seguidamente à descrição de alguns exemplos. Faz-se observar que esses exemplos têm apenas objectivos ilustrativos e com eles não se pretende de forma alguma limitar o âmbito da presente invenção.

EXEMPLO 1 exemplo seguinte demonstra a utilização dos imunoconjugados e dos métodos da presente invenção para a conversão de um pró-fármaco fosfato de etoposido num etoposido através de uma fosfatase alcalina ligada ao anticorpo e demonstra a consequente citotoxicidade in vitro para as células tumorais e os efeitos anti-tumor in vivo proporcionados pela utilização dos métodos da presente invenção.

Preparação dos conjugados anticorpo-fosfatase alcalina de acordo com a presente invenção

Neste exemplo preparou-se e estudou-se três imunoconjugados constituídos alternativamente pelo anticorpo monoclonal L6, 96.5 ou 1F5 conjugado com a enzima, a fosfatase alcalina (AP). 0 componente L6 é um anticorpo monoclonal da subclasse IgG2a que é específico de um antígeno glicoprotéico, a ele se ligando, sobre as células de carcinoma do pulmão humano [ver I. Hellstrom e colaboradores, (1986), supra]. 0 componente 96.5 é um anticorpo monoclonal da subclasse IgG2a que é específico para o p97, um antígeno associado ao melanoma [ver J. P. Brown e colaboradores, Structural Characterization Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 With Monoclonal Antibodies, J. Immunol., 127 (N^s 2), pp. 539-46 (1981)]. 0 componente 1F5 é um anticorpo monoclonal da subclasse IgG2a que é específico para o antígeno CD-20 em células B normais e

neoplásicas	(ver,	E. A. Clark	e colaboradores,	Role Of	The
Bp35 Cell	Surface	Polypeptide	In Human	B-Cell	Activation,
Proc. Natl	Acad.	Sei. USA,	82, pp.	1766-70	(1985) ] .	0
hibridoma	L6 que	produz o	anticorpo	monoclonal L6	foi

depositado na Colecção Americana de Culturas Tipo (ATCC) com o número de acesso HB8677 simultaneamente com o requerimento do pedido de patente europeia n^s 207963 publicada em 14 de Janeiro de 1987. O hibridoma 1F5 que produz o anticorpo monoclonal 1F5 foi depositado na instituição ATCC em 12 de Fevereiro de 1988 sob o número de acesso HB9645. O anticorpo monoclonal 96.5 encontra-se comercialmente disponível.

Os conjugados anticorpo-enzima foram preparados ligando covalentemente o componente AP aos anticorpos monoclonais L6, 96.5 ou 1F5 através de uma ponte tioéter utilizando-se um método idêntico ao descrito por J. M. Lambert e colaboradores, Purified Immunotoxins That Are Reactive With Human Lymphoid Cells, J. Biol, Chem., 260 (N⁵ 22), pp. 12035-12041 (1985). De acordo com um protocolo experimental os conjugados L6-AP e 96.5-AP foram preparados do modo seguinte: adicionou-se 2-iminotiolano (50 mM em cloridrato de trietanolamina 0,5M com 10 mM de EDTA a pH 8,0) a uma solução de anticorpo L6 ou 96.5 na concentração de 8,0 mg/ml (em 50 mM de cloridrato de trietanolamina e lmM de EDTA a pH 8,0) de tal modo que a concentração final de 2-iminotiolano foi 1,3 mM. Decorridos 90 minutos à temperatura de 0’C interrompeu-se a reacção por filtração em gel Sephadex G-25 utilizando-se como eluente uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) para o valor de pH 7,2. A reacção dos anticorpos com o composto 2-iminotiolano introduziu grupos sulfidrilo tendo-se determinado o seu número o qual estava compreendido entre 1,9 e 3,5 utilizando-se para o efeito o reagente de Ellman W. Riddles e colaboradores, Ellman's Reagent:

-dithiobis(2-nitrobenzoic Acid)-A Reexamination, Analytical Biochemistry, 94, pp. 75-81, (1979)].

Preparou-se uma solução de fosfatase alcalina (intestino de vitelo, Boehringer Mannheim, 10 mg/ml) em tampão fosfato 100 mM para o valor de pH 7,0 e tratou-se com

4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfossuccinimidilo (sulfo-SMCC) (Pierce Chemical Co., 20 mM em dimetilformamida (DMF)) de tal modo que a concentração final do composto sulfo-SMCC foi 2,4 mM. Decorridos 30 minutos à temperatura de 30°C submeteu-se a enzima modificada a purificação por filtração em gel Sephadex G-25 e efectuou-se a eluição com PBS.

Depois adicionou-se o componente AP modificado ao anticorpo tratado com tiolato numa proporção molar correspondente a 2:1. A reacção do componente AP com o composto sulfo-SMCC introduziu grupos maleimido na enzima que ao reagir com os grupos sulfidrilo de cada anticorpo modificado originou a formação de uma ponte tioéter entre o anticorpo e o componente AP. Adicionou-se iodo-acetamida (concentração final de lmM) à solução protéica após 1 hora de reacção com o objectivo de bloquear quaisquer grupos tiol remanescentes que não tivessem reagido e purificou-se os conjugados numa coluna de Sephacryl S-300 utilizando-se PBS como eluente. As fracções foram verificadas a 280 nm e efectuou-se o ensaio da actividade do componente AP de cada fracção (diluída 64000 vezes) para um valor de pH 9,5 utilizando fosfato de p-nitrofenilo como substrato (P. Tijsseη, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, pp. 366-67, (Elsevier Press 1985)]. As fracções que

continham conjugados com níveis adequados de proporções AP-anticorpo foram determinadas segundo o protocolo SDS-PAGE sobre um gel de gradiente entre 5 e 12,5% (ver a Figura 2) e depois foram reunidas. Determinou-se a concentração protéica a 280 nm verificando-se que uma solução a 0,1% dos anticorpos e do componente AP exibe valores de absorvência correspondentes aos valores DO (densidade óptica) de 1,4 e 0,76 respectivamente. A análise dos conjugados sobre o gel indicou que eram constituídos essencialmente por anticorpo e enzima na proporção de 1:1. Sob condições de desnaturação utilizadas para o gel, o componente AP que existe na natureza sob a forma de um homodímero de peso molecular correspondente a 140 kd migrou como banda única de 70 kd. Esta banda protéica de 70 kd foi observada sobre o gel nas colunas que continham também as bandas dos conjugados de peso molecular mais elevado uma vez que uma das sub-unidades da enzima se dissociou do conjugado anticorpo-enzima covalentemente ligado (ver a Figura 2, sulcos A e B). A filtração sobre gel em coluna de Sephacryl S-300 indicou que não existia qualquer enzima livre na preparação do conjugado.

Utilizou-se também um segundo protocolo experimental idêntico para se preparar os conjugados L6-AP e 1F5-AP da presente invenção, em que o anticorpo foi modificado com iminotiolano (0,5 mM ) para se introduzir um único grupo tiol livre e o componente AP foi modificado com o composto 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) de tal modo que a concentração final do composto SMCC foi 1,0 mM. As proteínas modificadas foram depois combinadas e efectuou-se a combinação dos conjugados resultantes por filtração em gel Sephacryl S-300. A posterior análise de acordo com o protocolo SDS-PAGE indicou que essas preparações de conjugados estavam isentas de agregados e proteínas não conjugadas. Conforme descrito antes, as concentrações protéicas das preparações foram determinadas por absorvência a 280 nm em que soluções do anticorpo (peso molecular: 160 kd) e do componente AP (peso molecular: 140 kd) em concentrações de 1 mg/ml exibem valores de absorvência correspondentes aos valores DO de 1,4 e 0,76 unidades respectivamente.

Preparação dos pró-fármacos, Fosfato de etopósido e Tiofosfato do etopósido

De acordo com o passo seguinte do método da invenção fez-se reagir cada conjugado anticorpofosfato de etopósido ou particularmente, os própresente

-enzima com um novo pró-fármaco tiofosfato do etopósido. Mais

-fármacos utilizados foram o ester fosfato 4'-dissódico do etopósido e o ester tiofosfato 4'-dissódico do etopósido possuindo respectivamente as fórmulas representadas na Figura

O fosfato do etopósido e o tiofosfato de etopósido foram sintetizados fazendo reagir o etopósido com oxicloreto de fósforo ou com cloreto de tiofosforilo respectivamente, para proporcionar alternativamente um intermediário diclorofosfato ou dicloro-tiofosfato. A reacção de fosforilação efectua-se num solvente orgânico anidro adequado, por exemplo, em acetonitrilo e preferencialmente em presença de uma base de amina terciária, por exemplo, N,N-di-isopropil-etil-amina. A evolução da reacção é verificada por cromatografia de camada fina (CCF) a qual permite avaliar o tempo óptimo de reacção pelo aspecto do produto, pelo desaparecimento do material de partida ou por ambos estes factores. De acordo com a experiência conseguida a reacção compreendido dependendo da

pode desenvolver-se durante um período de tempo aproximadamente entre 4 horas e 72 horas, qualidade dos reagentes fosforosos utilizados. A hidrólise do intermediário diclorofosfato ou dicloro-tiofosfato originando o pró-fármaco fosfato ou tiofosfato dissódico respectivamente, foi efectuada por adição de uma solução de bicabornato de sódio (20 a 50 vezes em excesso) em água directamente à mistura de reacção e deixando essa mistura sob agitação à temperatura ambiente durante 1,5 ou 3 horas respectivamente. A repartição entre acetato de etilo e água seguindo-se a cromatografia de fase inversa da camada aquosa utilizando uma mistura de água/metanol proporcionou os pró-fármacos desejados após liofilização ou após evaporação do meio aquoso in vácuo.

Seguidamente descreve-se mais pormenorizadamente uma preparação do derivado fosfato 4'-dissódico do etoposido o qual foi utilizado como um dos pró-fármacos no método de acordo com a presente invenção.

Preparou-se uma suspensão agitada magneticamente de etoposido (Bristol-Myers Co., 2,30 g; 3,91 mmol) em acetonitrilo seco (210 ml) e aqueceu-se para proporcionar uma solução praticamente completa, deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente e tratou-se com N,N-di-isopropil-etil-amina (2,36 ml; 13,5 mmol). Depois arrefeceu-se a mistura para a temperatura de 0°C e tratou-se, utilizando uma seringa durante 30 segundos, com cloreto de fosforilo POCI3 (666 mg;

4,34 mmol). Deixou-se a mistura aquecer lentamente até à temperatura ambiente durante um período de 2 a 3 horas e agitou-se à temperatura ambiente durante 63 horas. No final deste período tratou-se a mistura de reacção com uma solução de bicarbonato de sódio (6,0 g; 71,4 mmol·) em água desionizada (110 ml), agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante minutos e depois repartiu-se entre uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (20 ml), água desionizada (125 ml) e acetato de etilo (350 ml). Extraiu-se ainda a camada orgânica com água desionizada (1 x 50 ml) e as camadas aquosas combinadas foram lavadas com acetato de etilo (250 ml) e depois foram submetidas a uma intensidade de vácuo correspondente a 0,5 mm Hg à temperatura ambiente hora para remoção dos solventes ainda dissolvidos durante 1 A seguir aplicou-se a porção aquosa a uma coluna com o diâmetro de 4 cm contendo 15 cm de octadecil-silano (C-18) ligado a gel de sílica que havia sido carregado em metanol e depois equilibrou-se com água. Após a aplicação de toda a porção aquosa efectuou-se a eluição da coluna com água (175 ml) para remoção dos sais inorgânicos e a seguir efectuou-se a eluição do produto com uma solução de metanol a 20% em água. A concentração do solvente à pressão de 0,5 Torr proporcionou 744 mg (36%) do composto fosfato do etoposido no estado sólido e incolor. Em alternativa, a liofilização proporciona o composto puro no estado sólido com um aspecto bastante macio e de fraca densidade.

De acordo com outra variante foi possível preparar o pró-fármaco fosfato do etoposido conforme a seguir se descreve.

Preparou-se uma suspensão agitada magneticamente do etoposido (10,50 g; 17,84 mmol, seco sobre P2O5 a 80°C/0,5 Torr) em acetonitrilo seco (450 ml) e tratou-se com di-isopropil-etil-amina (4,20 ml; 24,1 mmol). Depois adicionou-se-lhe clorofosfato de difenilo (2,00 ml; 9,65 mmol) utilizando uma seringa. Agitou-se a mistura sob uma atmosfera de azoto durante 2 horas à temperatura de 50°C verificando-se nessa altura que todo o etoposido estava dissolvido.

Adicionou-se mais clorofosfato de difenilo (l,80ml; 8,68 mmol) e depois manteve-se a mistura de reacção à temperatura de 45 °C durante 72 horas. Depois de se ter adicionado mais base de amina (0,75 ml) e clorofosfato de difenilo (0,80 ml; 3,86 mmol) agitou-se a mistura a uma temperatura entre 40 e 45’C durante 27 horas, tratou-se com mais clorofosfato de difenilo (0,40 ml) e manteve-se a uma temperatura entre 40 e 45’C durante 22 horas. A seguir adicionou-se isopropanol (20 ml), evaporou-se o solvente in vácuo e dissolveu-se o resíduo sólido em CH2CI2 (500 ml) e fez-se uma partição com água (400 ml). Extraiu-se ainda a camada aquosa com CH2CI2 (100 ml) e depois os extractos orgânicos combinados foram lavados com uma solução salina (250 ml) e submetidos a secagem (Na2SO4/MgSC>4) . A evaporação rotativa seguida por cromatografia intermitente sobre gel de silica utilizando com eluente um gradiente entre 2 e 3% de CH3OH em CH2CI2 proporcionou 12,50 g (85%) do fosfato de etopósido-4'-difenilo no estado sólido e incolor.

Seguidamente adicionou-se óxido de platina (0,198 g; 0,87 mmol) proveniente de um frasco recentemente aberto (Aldrich Chemical Co.) à solução do fosfato de etopósido-4'-difenilo (0,79 g; 0,962 mmol) em 95 ml de etanol absoluto. Hidrogenou-se a solução num aparelho de Parr a uma pressão entre 45 e 50 psi durante 4 horas à temperatura ambiente.

Filtrou-se a mistura de reacção através de uma almofada de celite utilizando etanol como eluente. A concentração in vacuo e a secagem sobre P2O5 durante 14 horas in vacuo proporcionou o etopósido-4'-fosfato no estado sólido e de cor branca (0,627; 94%):

EM BAR: m/e 669 (M+H)⁺

IV (KBr) 3440, 2930, 1778, 1604, 1498 cm¹.

	RMN-¹H	(DMSO-dg) δ 6,93	(s, 1H), 6,46	(s,	1H) ,
6,12 (s,	2H), 5,94	(m, 2H), 5,17	(slr., 1H),	4,86	(d,
J=3.93Hz,	1H), 4,64	(q, J=7.5,5.8Hz,	1H), 4,51-4,42	(m,	2H) ,
4,20 (d,	J=10,7Hz,	1H), 4,01 (dd, J	=12,1,5,3Hz,	1H) ,	3,51

(s,6H), 3,51-2,75 (m,7H), 2,83 (m, 1H), 1,16 (d,J=5,lHz, 3H).

RMN-¹³C (DMSO-dg) δ 174,5, 151,2, 151,1, 147,7,

146,2, 126,1, 132,3, 128,8, 109,8, 109,7, 107,9, 101,5, 101,2,

98,5, 80,0, 74,3, 72,7, 71,7, 67,6, 67,2, 65,7, 55,8, 43,0,

37,1, 20,2, 18,5.

Anal. Calcul. para C29H33O16P. 0,85%H2O: 0,50,95; H, 5,11. Encontrado: 0,51,42; H,4,97.

Depois converteu-se o etopósido-4'-fosfato no seu sal dissódico por adição de água desionizada (50 ml) e bicarbonato de sódio (3,00 g; 35,7 mmol) a uma quantidade de 2,90 g (4,34 mmol) do produto etopósido-4'-fosfato. Agitou-se a mitura à temperatura ambiente durante 0,5 horas tendo cessado a libertação de CO2 durante esse período de tempo. A seguir aplicou-se esta mistura directamente a uma coluna C-18 conforme descrito para a variante anterior. Efectuou-se a eluição da coluna primeiro com 300 ml de água desionizada para remoção dos sais em excesso e depois efectuou-se a eluição com uma mistura 4:1 de H2O/CH3OH para proporcionar uma quantidade de 1,90 g (61%) do sal dissódico do etopósido-4'-fosfato puro no estado sólido, de cor branca e com um aspecto macio após liofilização.

Os derivados fosfato ou tiofosfato 4'-dissódicos do etoposido representam pró-fármacos do etoposido altamente solúveis em água com uma reduzida actividade citotóxica. Contudo, a reacção desses compostos com a fosfatase alcalina remove o radical fosfato ou tiofosfato respectivamente, ^f .« libertando o poderoso fármaco etoposido anti-cancro (ver a Figura 3).

Uma experiência em que cada um dos compostos etopósido-4'-fosfato e etopósido-4'-tiofosfato reagiu com a fosfatase alcalina indicou que os 2 pró-fármacos são substratos para a enzima. Conforme se mostra na Figura 5, o fosfato do etoposido é hidrolisado pela enzima mais rapidamente do que o pró-fármaco tiofosfato do etoposido. Todavia, em determinadas condições, o tiofosfato do etoposido pode eventualmente possuir uma utilidade particular devido à sua estabilidade acrescida no que diz respeito à hidrólise.

Reacção dos Conjugados Anticorpo-Fosfatase Alcalina Com um

Pró-Fármaco Fosfato do Etoposido

Os conjugados da presente invenção não exibem qualquer perda aparente de actividade enzimática devida ao acoplamento da enzima ao anticorpo conforme é evidenciado pelo facto de os conjugados e a enzima livre exibirem actividades iguais nos substratos fosfato de p-nitrofenilo [ver P. Tijssen, supra] ou fosfato do etoposido.

Por exemplo, adicionou-se alternativamente apenas o componente AP ou o conjugado anticorpo-enzima L6-AP produzido conforme descrito antes (para uma concentração final do componente AP correspondente a 5 μg/ml) a uma solução de etopósido-4'-fosfato (0,1 mM) em tampão Tris (100 mM) contendo MgCl2 (lmM) e ZnCl2 (0,lmM) para o valor de pH 7,0. Verificou-se a reacção por cromatografia em líquido de elevada pressão (CLEP) utilizando uma coluna IBM C-18 (3 μ, 4,5 x a 50% (0,5 ml/minuto, com verificação a 254 nm). Verificou-se

que decorridos 5 minutos contados a partir do início da reacção, o componente AP tanto na sua forma de enzima livre como fazendo parte do conjugado anticorpo L6-enzima tinha efectuado a hidrólise de pelo menos 85% do composto etopósido-4'-fosfato para proporcionar o etopósido (ver as Figuras 4C e 4D). Tal como essas Figuras indicam não houve perda da actividade da enzima AP devido ao seu acoplamento ao anticorpo no conjugado. Na ausência da enzima não ocorreu a hidrólise do fosfato (ver a Figura 4A). As soluções aquosas de fosfato do etopósido ou de tiofosfato do etopósido mostraram-se estáveis durante pelo menos 8 horas à temperatura ambiente e durante vários dias à temperatura de 4°C.

Ligação dos Conjugados Anticorpo-Fosfatase Alcalina às Células

Tumorais H3347

A Figura 6 revela os resultados de ensaios de ligação de conjugados efectuados para se conjugar a capacidade dos conjugados L6-AP e 96.5-AP e também dos anticorpos independentes L6 e 96.5 para se ligarem às células tumorais da linha celular de carcinoma metastásico do cólon humano, identificada por H3347 (fornecida por Judy Anderson Oncogen).

Esse ensaio de ligação foi efectuado do modo seguinte: os imunoconjugados ou os anticorpos livres foram diluídos em série em meio de Delbecco incompleto modificado (IMDM, Gibco) e procedeu-se à incubação de aliquotas de 100 μΐ à temperatura de 4°C com 10° células durante 30 minutos. Essas células foram lavadas e incubadas com 50 μΐ de FITC-anticorpo de murganho conjugado em caprino (Tago, diluição a 1:12.5) durante mais 30 minutos à temperatura de 4°C. As células foram lavadas e analisadas utilizando-se para um aparelho de análise celular por fluorescência

de tipo

Coulter Epics-C. Procedeu-se à remoção das células mortas e obteve-se para cada amostra o logaritmo do valor médio da intensidade da fluorescência na banda do verde. Converteu-se este número numa escala linear e procedeu-se ao cálculo das relações entre os elementos de controlo negativos (células + FITC-anticorpo de murganho conjugado em caprino) e todas as amostras de ensaio.

A Figura 6 demonstra que nos conjugados foi conservada a maior parte da capacidade de ligação dos anticorpos, isto é, a conjugação não afectou a capacidade de ligação dos anticorpos. Por outro lado, a figura mostra a especificidade de ligação dos anticorpos, isto é, mostra que tanto o anticorpo livre 96.5 como o conjugado 96.5-AP se ligam muito mais fracamente às células tumorais do que o anticorpo L6 e o conjugado L6-AP. Este resultado era previsível desde que se considerasse que as células tumorais H3347 são provenientes de um carcinoma humano e o anticorpo L6 é um específico para um antigeno do carcinoma ao passo que o anticorpo 96.5 é específico para um antigeno de melanoma.

Experiências de ligação idênticas utilizando L6, L6-AP, 1F5 e 1F5-AP demonstraram também que o anticorpo L6 e o conjugado L6-AP se ligam à linha celular de carcinoma H3347 (saturação a 10 μς/πιΐ de anticorpo) ao passo que apenas se observou uma ligação muito fraca ou não houve mesmo qualquer detecção no que diz respeito ao anticorpo 1F5 ou ao conjugado 1F5-AP (ver Figura 7). Este resultado vem demonstrar também a especificidade de ligação dos conjugados, havendo ligação do conjugado L6-AP à linha de células tumorais positivas em L6 e não havendo qualquer ligação do conjugado 1F5-AP, com uma especificidade para as células do linfoma B.

Citotoxicidade In Vitro de uma Combinação Conjugado/Pró-Fármaco da Presente Invenção

Seguidamente demonstrou-se o efeito citotóxico das combinações conjugado/pró-fármaco da presente invenção in vitro utilizando-se alternativamente um ensaio de citotoxicidade clonogénico ou um ensaio de absorção de H-timidina.

ensaio de citotoxicidade clonogénico utilizado foi o ensaio de inibição de colónias descrito por I. Hellstrom e colaboradores Colony Inhibition And Citotoxicity Assays , em In Vitro Methods In Cell-Mediated Immunity, Bloom and Glade (ed. s), pp. 409-14 (1971). As células utilizadas para a detecção da citotoxicidade foram as células tumorais H3347 descritas antes. Os dois conjugados L6-AP e 96.5-AP foram testados para se determinar a sua capacidade para converterem o pró-fármaco num fármaco livre.

Resumidamente, preparou-se uma suspensão de β

células H3347 (10 /ml) em meio de crescimento IMDM (contendo cada um dos imunoconjugados na concentração de 10 úg/ml tomando-se como base a concentração do anticorpo) e efectuou-se a incubação durante 30 minutos à temperatura de 37°C. As células foram lavadas duas vezes, novamente colocadas em suspensão em meio IMDM e adicionou-se o fármaco ou o pró-fármaco existentes no meio. Manteve-se a incubação à temperatura de 37°C durante 15 horas. Após lavagem por duas vezes procedeu-se à colocação das células em placas e efectuou-se a contagem do número de colónias (> 8 células/colónia) decorridos entre 7 e 10 dias.

Os resultados do ensaio estão indicados na Figura 8 ( o valor percentual da inibição é a média de 6 amostras). Conforme se mostra na Figura, o etoposido (CI50 = 0,20 μΜ) foi muito mais citotóxico do que o composto etopósido-4'-fosfato (EP) (CI50 =5,8 μΜ). O pró-fármaco só por si demonstrou uma actividade citotóxica muito fraca. O tratamento das células H3347 com o conjugado L6-AP, seguindo-se a exposição ao fosfato de etoposido, teve como consequência um acréscimo bastante grande na actividade citotóxica comparativamente com os valores observáveis quando se utiliza apenas o pró-fármaco, sendo a actividade citotóxica acrescida comparável à actividade citotóxica que se observa quando se utiliza apenas o etoposido. O tratamento das células com o conjugado 96.5-AP e com o fosfato do etoposido demonstrou um acréscimo muito menor de actividade citotóxica em comparação com os valores observáveis quando se utiliza apenas o pró-fármaco. Este resultado é eventualmente susceptível de ser atribuído à pequena quantidade de conjugado 96.5-AP que se liga às células H3347, conforme descrito antes (ver Figura 6). Os conjugados não são citotóxicos por si próprios uma vez que o tratamento das células utilizando apenas os conjugados não provocou a morte de quaisquer células.

Estudou-se também o efeito citotóxico dos conjugados da presente invenção utilizando-se um ensaio de 3 absorçao de H-timidina. Em conformidade com este ensaio θ preparou-se uma suspensão de 10 células tumorais H3347 em 0,1 ml de meio IMDM contendo 10% de soro de bovino fetal e procedeu-se à sua incubação durante 1 hora à temperatura de 4’C em presença de conjugado na concentração de 5 μg/ml. As células foram lavadas duas vezes com meio contendo 10% de soro de bovino fetal, novamente colocadas em suspensão (em 1 ml) e depois colocadas em placas de microtitulação com 96 cavidades

(10000 células/cavidade). Depois adicionou-se o fármaco ou o pró-fármaco em IMDM e iniciou-se a incubação à temperatura de 37 °C prolongando-se por 6 horas. As células foram lavadas duas vezes e manteve-se a incubação durante mais 12 horas 3 seguindo-se um período de 6 horas para marcação com H-timidina (1,0 μθί/σ3νίά3άθ). Efectuou-se o congelamento das placas à temperatura de -20C para separar as células e a seguir efectuou-se a colheita dessas células sobre discos de fibra de vidro. Submeteu-se os filtros a contagem num contador por cintilação de tipo Beckman 3801.

Utilizando este ensaio mediu-se a inibição da 3 incorporação de H-timidina no ADN das células tumorais e consequentemente determinou-se o efeito citotóxico do etopósido ou do pró-fármaco EP sobre as células na ausência ou em presença dos conjugados L6-AP ou 1F5-AP. Conforme se mostra na Figura 9, o etopósido (CI50 - 1 μΜ) demonstrou ser 100 vezes mais tóxico do que o composto EP (35% de inibição a 100 μΜ). O pré-tratamento das células com o conjugado 1F5-AP antes da exposição ao composto EP teve como consequência uma variação nula da citotoxicidade. Todavia observou-se um aumento extraordinário da actividade citotóxica quando as células foram expostas primeiro ao conjugado L6-AP e depois ao composto EP. Deste modo, nos dois ensaios utilizados para se determinar a citotoxicidade in vitro, o efeito citotóxico da combinação conjugado/pró-fármaco foi comparável aos valores observáveis quando se utiliza apenas o etopósido e este efeito foi específico do antígeno conforme indicado pelo facto de a citotoxicidade do composto EP não ter aumentado identicamente por tratamento das células H3347 com os conjugados de controlo 96.5-AP e 1F5-AP respectivamente.

Localização dos Conjugados em Xenoenxertias Tumorais nos

Murganhos

A seguir efectuou-se estudos de localização in vivo para se descobrir com que rapidez e com que intensidade os conjugados da presente invenção se acumulavam num tumor. Esta informação demonstrou ser útil na determinação de um intervalo adequado de tempo entre a administração do conjugado anticorpo-enzima e o pró-fármaco nos estudos efectuados sobre a terapia de tumores.

Em primeiro lugar injectou-se fêmeas de murganho da estirpe Balb/C nu/nu (4 a 6 semanas de idade) ( obtidas em 7

Life Sciences, St. Petersburg, Florida) com 10 células tumorais H3347, por via subcutânea (s.c.) nos flancos posteriores esquerdo e direito. As células tumorais foram obtidas a partir de culturas in vitro que haviam sido colocadas em suspensão, durante 2 minutos, com tripsina (0,5 g/1) e com EDTA (0,2 g/1). As células foram lavadas duas vezes com IMDM e incubadas durante 1 hora à temperatura de

37’C em IMDM contendo 10% de soro de bovino fetal. Essas células foram lavadas, colocadas em suspensão em meio PBS e foram mantidas à temperatura de 4’C antes da injecção. Tanto os estudos de localização como os estudos terapêuticos descritos na presente memória descritiva foram iniciados 3 quando os tumores atingiram uma dimensão media de 225 mm .

Para os estudos de localização efectuados procedeu-se à marcação do anticorpo L6 e do conjugado L6-AP 125 com I e procedeu-se à marcaçao do anticorpo 1F5 e do

131 conjugado 1F5-AP com I, utilizando-se o método do iodogeneo [ver P. J. Fraker e colaboradores, Commun., 80, pp. 849-857 (1978)]

Biochem. Biophys. Res. Dois dias antes das foram colocados em

Cada murganho foi experiências de localização os animais solução de iodo de Lugol a 0,5% (v/v).

injectado por via i.p. com 100 μ9 (tomando por base qualquer dos anticorpos monoclonais) de qualquer das soluções seguintes: L6-AP (5 μθί) e 1F5-AP (2,5 μϋί) em 0,2 ml de PBS a pH 7,2 ou uma combinação de L6 (5 μθί) e 1F5 (2,5 μθί) em 0,2 ml de PBS. A intervalos periódicos os murganhos foram anestesiados, sangrados através do plexo orbital e sacrificados. Efectuou-se a pesagem dos tecidos e procedeu-se a uma contagem num contador de raios gama. Determinou-se a localização efectuando a comparação da localização do I-L6

131 com a localização do I-1F5, isto é, determinando as relações entre a absorção de unidades de contagem específicas 125 131 ( I) e não específicas ( I) nos diversos tecidos. Os resultados obtidos para a aborção no tumor e no fígado encontram-se resumidos no Quadro 1 seguinte.

Quadro 1

DOSE PERCENTUAL INJECTADA POR CADA GRAMA DE MASSA DE PROTEÍNAS TECIDUAIS ADMINISTRADAS

L6

L6-AP tumor fígado tumor fígado

2	horas	1,6	(8,0)	4,9	(2,0)	1,5	(7,5)	5,2	(0,7)
24	horas	3, 6	(12,0)	2, 3	(1,4)	1,0	(10.0)	1,3	(1,3)
48	horas	4,0	(8,0)	2,5	(1,3)	0,5	(5,0)	0, 8	(1,0)

quocientes

Os números entre parenteses representam os L6/1F5 ou L6-AP/1F5-A

Os os números entre parenteses representam quocientes L6/1F5 ou L6-AP/1F5-AP.

Tal como o Quadro indica, o anticorpo conjugado L6 localizou-se eficazmente no tumor no intervalo de 24 horas e ali se manteve durante pelo menos 48 horas. Durante esse período de tempo a proporção entre L6 e 1F5 no tumor variou entre 8 e 12 ao passo que a proporção no fígado foi bastante fraca (1,3-1,4). 0 nível máximo de absorção específica no tumor, para o caso do conjugado L6-AP, ocorreu aproximadamente ao fim de 24 horas sendo nessa altura a proporção entre os conjugados L6-AP e 1F5-AP correspondente a 10,0. Esses resultados indicam qua o conjugado L6-AP se localizou no interior do tumor bastante melhor do que o conjugado 1F5-AP mas não tão bem como o anticorpo L6 não modificado.

Depois determinou-se a quantidade de actividade de fosfatase natural no tumor e o grau segundo o qual essa actividade pode ser aumentada devido ao facto de se encaminhar a enzima AP para o tumor utilizando os conjugados da presente invenção. Os tumores foram excisados dos murganhos que haviam sido tratados durante 24 horas com 100 μg (tomando como base o anticorpo L6) de conjugado L6-AP e mediu-se a actividade da fosfatase total utilizando-se o fosfato de p-nitrofenilo como substrato tal como se descreve seguidamente: lavou-se o tumor excisado e depois centrifugou-se suavemente à temperatura de 23°C conjuntamente com fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml) em Tris (100 mM), pH 9,5, contendo NaCl (100 mM) e MgCl2 (5 mM). A evolução da reacção foi verificada medindo a quantidade de p-nitrofenol libertada a 410 nm e os resultados foram corrigidos em função da massa do tumor. Descobriu-se que os tumores dos murganhos que tinham recebido o conjugado L6-AP demonstravam aproximadamente 10 vezes o nível de actividade da fosfatase observável nos tumores de murganhos não tratados (ver a Figura 10A).

Realizou-se uma análise histológica mais pormenorizada da actividade da fosfatase do tumor em secções transversais de tumores obtidas a partir de murganhos que não haviam sido tratados ou que haviam sido previamente tratados, 24 horas mais cedo, com 300 μg (tomando como base o anticorpo) de qualquer dos conjugados L6-AP ou 1F5-AP. Avaliou-se a actividade da fosfatase por imunoistologia utilizando-se um substrato de fosfatase que depositou um precipitado negro no local da actividade da enzima, conforme se descreve a seguir: após a excisão dos tumores procedeu-se à sua rápida congelação para a temperatura de -28°C e neles se efectuou secções transversais sequenciais com espessura de 8μιη em conformidade com processo de microtomia de Reichert-Jung. Mediu-se a actividade da fosfatase com um estojo de substrato para AP proveniente de Vector Laboratories (Burlingame, CA) e procedeu-se à comparação dos resultados com secções que haviam sido coloradas com hematóxilina e eosina (H. e E., ver a Figura 10B).

Tal como a Figura 10B demonstra, foi detectada fraca actividade enzimática em tumores de murganhos que não haviam sido tratados ou que haviam sido tratadas com o conjugado 1F5-AP. Contudo, nos murganhos que receberam o conjugado L6-AP, a actividade da fosfatase foi bastante elevada e foi possível observá-la distribuída pelo tumor. A avaliação microscópia revelou que a maior parte das células tumorais nos murganhos tratados com o conjugado L6-AP exibiam uma coloração altamente positiva para a actividade da fosfatase.

I

Efeito Anti-Tumor In Vivo de uma Combinação Conjugado/Pró-Fármaco Fosfato do Etoposido da Presente Invenção

Foram efectuadas experiências terapêuticas em murganhos rapados que possuíam tumores subcutâneos com o 3 volume aproximado de 225 mm . Os conjugados L6-AP e 1F5-AP foram administrados (i.p.) entre 18 e 24 horas antes do tratamento com o composto EP. Comparou-se o crescimento dos tumores com o crescimento de tumores de murganhos não tratados e com o crescimento de tumores de murganhos tratados com as doses máximas toleradas de etoposido ou de composto EP por si só.

Mais particularmente tratou-se um grupo de 8 murganhos rapados, com tumores bilaterais de tipo H3347, alternativamente com etoposido (0,2 ml contendo 1,2 mg de etoposido numa solução 2:3 de DMSO:H2O) ou com o composto EP (0,2 ml contendo 2 mg de EP em água) por si só ou com o conjugado L6-AP (0,1 ml contendo 300 μg de anticorpo em PBS) ou com 1F5-AP (0,1 ml contendo 300 μ9 de anticorpo em PBS) seguindo-se o tratamento com o composto EP. Cada experiência continha um grupo de murganhos de controlo que não foram tratados. Os volumes dos tumores foram avaliados em diversos dias após a implantação do tumor, de acordo com a fórmula seguinte:

[(largura na perpendicular) /2] x maior comprimento

Os resultados dessas experiências estão indicadas na Figura 11. O etoposido exibiu um efeito bastante fraco sobre o crescimento do tumor na dose utilizada e as doses mais elevadas não foram bem toleradas. 0 pró-fármaco EP foi menos tóxico para os animais pelo que a dose mais elevada que consequentemente foi possível administrar originou um efeito anti-tumor superior aquele que é observável com o etopósido por si só. Observou-se um grau idêntico de actividade anti-tumor nos murganhos que receberam o conjugado de controlo 1F5-AP antes do tratamento com o composto EP. Todavia, no caso em que os murganhos foram tratados com o conjugado L6-AP seguindo-se o tratamento com o composto EP observou-se um efeito anti-tumor muito mais pronunciado. 0 conjugado L6-AP por si só não exibiu qualquer efeito sobre o crescimento do tumor (dados não apresentados).

sobre as aplicada.

Quadro 2 seguinte agrupa um conjunto de dados respostas de cada tumor individual à terapia Entre 16 tumores de 8 murganhos tratados com o conjugado L6-AP e com o composto EP, 6 deles sofreram uma regressão completa e outros 2 ficaram menores do que no início do tratamento. Não foram observadas quaisquer respostas completas ou parciais em nenhum dos outros protocolos de tratamento.

Quadro 2

EFEITOS DOS DIVERSOS TRATAMENTOS SOBRE O CRESCIMENTO TUMORAL

RESPOSTA *
Agente	progressão	estável	parcial	completa
Nenhum	16	0	0	0
Etoposido	12	4	0	0
EP	6	10	0	0
1F5-AP + EP	9	7	0	0
L6-AP + EP	3	5	2	6

Os resultados representam as respostas de 16 tumores em cada grupo 23 dias após a implantação do tumor.

* Resposta: progressão - contínuo desenvolvimento tumoral; estável - ausência de qualquer crescimento adicional do tumor; parcial - diminuição de volume do tumor; completa - regressão que conduz à ausência aparente de qualquer tumor.

A presente invenção demonstra claramente a aplicabilidade do método agora descrito para o fornecimento de um fármaco anti-tumor citotóxico a células tumorais, utilizando-se um conjugado anticorpo-enzima específico do tumor e um pró-fármaco susceptível de ser convertido pela enzima passando de uma forma relativamente não citotóxica para uma poderosa forma citotóxica.

EXEMPLO 2

Este exemplo demonstra a utilização dos imunoconjugados e dos métodos da presente invenção para converter um pró-fármaco fosfato de mitomicina relativamente não citotóxico num fármaco activo derivado de mitomicina originando uma citotoxicidade in vitro relativamente às células tumorais. Por outro lado, tal como se demonstrou no Exemplo 1 anterior, o exemplo a seguir descrito demonstra a aplicabilidade dos imunoconjugados, pró-fármacos e métodos da presente invenção para o fornecimento de um fármaco anti-tumor citotóxico a células tumorais in vivo.

Neste exemplo utiliza-se os imunoconjugados L6-AP e 1F5-AP preparados conforme descrito no Exemplo 1 anterior.

Em conformidade com esta variante da presente invenção fez-se reagir cada um desses conjugados anticorpo-enzima com um novo pró-fármaco fosfato de mitomicina. Mais particularmente, o 7 pro-farmaco utilizado foi o sal díssódico de um N -alquil(Ci~ —Cg)-fosfato de mitomicina. 0 agente anti-tumor libertado em consequência desta reacção foi o derivado alcoólico de mitomicina. A combinação conjugado L6-AP/pró-fármaco fosfato de mitomicina da presente invenção teve como consequência um efeito citotóxico em relação às células tumorais in vitro e um pronunciado efeito anti-tumor em murganhos in vivo.

Preparação de um Novo Pró-Fármaco Fosfato de Mitomicina novo pró-fármaco fosfato de mitomicina com a designação 7-(2'-amino-etil-fosfato) de mitomicina (adiante

referido como MOP) é o derivado fosfato 2-amino-etílico da mitomicina C (MMC) e foi preparado conforme a seguir se descreve.

Preparou-se uma solução de di-hidrogeno-fosfato de 2-amino-etilo (56 mg; 0,4 mmol) em água (0,35 ml) e em trietilamina (0,3 ml, 2 mmol) e adicionou-se a uma quantidade de mitomicina A ( composto a seguir identificado por MMA) (140 mg; 0,4 mmol) em metanol (6 ml) e deixou-se a reacção prosseguir à temperatura ambiente durante a noite. Depois adicionou-se 1,4 ml de uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e repartiu-se a solução entre água e cloreto de metileno. Concentrou-se a fase aquosa até à secagem e depois adicionou-se e evaporou-se várias porções de metanol. Extraiu-se o resíduo com metanol, filtrou-se e aplicou-se a uma coluna de sílica C-18 com as dimensões de 2 x cm (fase inversa). Efectuou-se a eluição do água e evaporou-se todo o material volátil, metanol e evaporou-se conforme descrito antes secou-se o resíduo durante 24 horas sob vácuo produto com Adicionou-se e a seguir intenso num dessecador com pentóxido de fósforo. Obteve-se o derivado fosfato de mitomicina, MOP, com o aspecto de um fino pó azul (190 mg, 97%).

360 MHz: RMN -¹H (D₂O) δ 1,94 (s, 3H, CH₃), 2,9-3,1 (m, 4H),

3,20 (s, OCH₃), 3,28 (S, IH), 3,36 (s, IH), 3,5-3,65 (m, 4H),

4,1-4,25 (m, 2H), 4,50-4,57 (dd, IH, 10-H).

Deste modo o composto MOP foi preparado por deslocamento do grupo 7-metóxi do composto MMA com ácido 2-amino-etil-fosfórico (ver a Figura 12). 0 produto foi convertido no correspondente sal dissódico solúvel em água por tratamento com bicarbonato de sódio.

correspondente derivado alcoólico de mitomicina, 7-[(2-hidróxi-etil)amino]-9a-metóxi-mitosano (adiante identificado por MOH) foi preparado fazendo reagir o composto MMA (100 mg; 0,286 mmol) com etanolamina (26 mg;

0,429 mmol) em conformidade com o método de B. S. Iyengar e colaboradores, Mitomycin C and Porfiromycin Analogues With Substituted Ethylamines At Position 7, J. Med. Chem., 26, pp. 16-20 (1983). Obteve-se o produto com o aspecto de um fino pó azul (58 mg; 54%).

Reactividade e Estabilidade do Pró-Fármaco Fosfato de Mitomicina

O pró-fármaco MOP foi depois testado para se determinar a sua reactividade com a enzima AP. A uma solução de MOP (lmM) em 100 mM de Tris tamponada a pH 7,2 e à temperatura ambiente adicionou-se a enzima AP proveniente do intestino de bovino ou da placenta humana (concentração final de 1 pg/ml). A evolução da reacção foi verificada por cromatografia em líquido de elevada pressão (CLEP) em coluna de tipo C-18 (4,6 x 150 mm) e em conformidade com as condições seguintes: detecção a 280 nm; 30-95% de metanol em tampão acetato (100 mM; pH 5,2) durante 8 minutos, reequilíbrio após 15 minutos; débito de 0,8 ml/minuto. Nessas condições a eluição da fracção contendo o componente MMC ficou completa decorridos 7,0 minutos e para a fracção contendo o componente MOH ocorreu ao fim de 8,5 minutos e para o componente MOP ocorreu ao fim de 4,0 minutos. Conforme se demonstra na Figura 13, o grupo fosfato do pró-fármaco MOP foi rapidamente clivado com a enzima AP. A cromatografia em líquido de elevada pressão (CLEP) serviu para confirmar que se tinha formado o álcool correspondente MOH. Nas condições de reacção utilizadas o período de semi-vida para a hidrólise do componente MOP foi de cerca de 10 minutos e a reacção ficou completa decorridos 40 minutos.

Determinou-se a estabilidade dos componentes MOP e EP no soro humano por CLEP medindo a velocidade de desaparecimento dos pró-fármacos e a velocidade de formação do composto MOH e do etoposido. Sendo assim, a título de exemplo, adicionou-se uma solução de MOP (1 mM em 100 mM de Tris, pH 7,2) a uma quantidade de soro humano recente de tal modo que a concentração final do fármaco foi de 0,1 mM. Efectuou-se a diluição de aliquotas (0,25 ml) com metanol (0,25 ml) e com EDTA (50 μΐ a 100 mM) para precipitar a proteínas do soro e para interromper a reacção. Efectuou-se a centrifugação das amostras e procedeu-se à sua análise por CLEP tal como anteriormente descrito. Verificou-se que ocorria 50% da hidrólise do composto EP decorrida 1 hora mas que apenas 25% do composto MOP ficava hidrolisado decorridas 4 horas. É possível conseguir rapidamente uma hidrólise completa adicionando a enzima AP ao soro.

Ligação dos Conjugados Anticorpo-Fosfatase Alcalina às Células

Tumorais H2981

Seguidamente mediu-se a capacidade dos conjugados anticorpo-enzima L6-AP e 1F5-AP da presente invenção para se ligarem às células tumorais H2981. A linha celular H2981 foi definida a partir de um adenocarcinoma primário do pulmão humano [ver I. Hellstrom e colaboradores,

Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinomas, Câncer Res., 46 (N^e 8), pp. 3917-23 (1986)]. O anticorpo L6 é conhecido pelo facto de se ligar fortemente às células H2981 (saturação a 10 μg/ml) ao passo que o anticorpo 1F5 demonstra uma ligação muito fraca com essas células.

descrito no activado por o conjugado tempo que se do anticorpo ensaio de ligação foi efectuado exemplo 2. A análise com separador celular fluorescência (SCAF) indicou que o anticorpo L6 e L6-AP se ligavam fortemente às células ao mesmo confirmava uma ligação muito mais fraca no caso 1F5 e do conjugado 1F5-AP (ver Figura 14).

Citotoxicidade In Vitro da Combinação Conjugado/Pró-Fármaco da

Presente Invenção nas Células Tumorais H2981

Demonstrou-se o efeito citotóxico das combinações conjugado/pró-fármaco da presente invenção in vitro em ~ 3 conformidade com o ensaio de absorçao de H-timidina descrito no Exemplo 1; neste caso utilizou-se células tumorais H2981 para testar a citotoxicidade in vitro e utilizou-se células CEM como elemento de controlo. A linha celular ALL das células T designada por CEM foi obtida na instituição ATCC e não se liga aos anticorpos monoclonais L6 ou 1F5. Procedeu-se à análise dos efeitos citotóxicos dos pró-fármacos EP e MOP nas células tumorais na ausência ou em presença dos imunoconjugados L6-AP ou 1F5-AP. Os efeitos citotóxicos dessas combinações foram também comparados com o efeito citotóxico de cada fármaco original utilizado por si só.

Resumidamente preparou-se uma suspensão de 10 células H2981 ou CEM em 0,1 ml de meio IMDM contendo 10% de soro de bovino fetal e procedeu-se à incubação durante 1 hora à temperatura de 4’C em presença de conjugado na concentração de 10 μg/ml. Lavou-se as células duas vezes com o meio contendo 10% de soro de bovino fetal, preparou-se nova suspensão em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato a pH 7,2 (PBS) e efectuou-se a sua colocação em placas de microtitulação de 96 cavidades (10 000/cavidade). Depois

adicionou-se o pró-fármaco em PBS e iniciou-se a incubação à temperatura de 37°C prolongando-se durante 1 hora no caso do composto MOP ou durante 5 horas no caso do composto EP. A seguir lavou-se as células 2 vezes e manteve-se a incubação durante um período total de 24 horas (incluindo um período de ~ 3 horas de marcaçao com H-timidina, 1,0 μθί/cavidade). Efectuou-se o congelamento das placas para a temperatura de -70°C para separar as células e após a descongelação procedeu-se à recolha da células sobre discos de fibra de vidro. Submeteu-se os filtros a contagem utilizando um contador de cintilação Beckman 3801 e efectuou-se a comparação dos efeitos citotóxicos das combinações conjugado/pró-fármaco com a citotoxicidade observável quando se efectua o tratamento das células apenas com o pró-fármaco ou com o fármaco original. Os resultados obtidos estão indicados nas Figuras 15-17.

Conforme se mostra na Figura 15, o etopósido (CI5Q a 2 μΜ) foi significativamente mais tóxico para as células H2981 do que o composto EP (20% de aniquilação a 30 μΜ). O pré-tratamento das células com o conjugado 1F5-AP antes da exposição ao pró-fármaco teve como consequência um ligeiro aumento da citotoxicidade. Contudo, observou-se um acréscimo extraordinário da actividade citotóxica quando as células foram expostas primeiro ao conjugado L6-AP e depois ao composto EP. 0 efeito citotóxico foi comparável àquele que se observa com o etopósido por si só.

Observou-se um resultado semelhante utilizando derivados de mitomicina. Conforme se indica na Figura 16, os composto MMC e MOH foram igualmente citotóxicos em relação às células H2981 e apresentaram valores CI50 para concentrações aproximadas de 1 μΜ. O pró-fármaco fosfato MOP demonstrou ser muito menos citotóxico (5% de células aniquiladas para uma

de 10 μΜ), provavelmente devido à sua para penetrar as células. Contudo a actividade concentração incapacidade do composto MOP foi comparável à dos compostos MOH e MMC quando as células tumorais foram pré-expostas ao conjugado L6-AP da presente invenção. Esta melhoria é especifica do antigeno uma vez que o conjugado que não se liga 1F5-AP não afectou significativamente a actividade citotóxica do pró-fármaco. Nem o conjugado L6-AP nem o conjugado 1F5-AP aumentaram significativamente o efeito citotóxico do composto MOP contra as células CEM, fenómeno que é consistente com o facto de esses conjugados não se ligarem a esta linha celular (ver a Figura 17). Sendo assim, estes resultados indicam que o grupo fosfato de cada um dos pró-fármacos testados inactiva o fármaco e que após hidrólise do grupo fosfato por um conjugado anticorpo-enzima ligado à superfície das células tumorais, qualquer dos pró-fármacos EP ou MOP proporciona fármacos citotóxicos activos.

Efeito Anti-Tumor In Vivo da Combinação da Presente Invenção

Conjugado/Pró-Fármaco de Mitomicina

Antes de se investigar a actividade anti-tumor in vivo do composto MOP em combinação com o conjugado L6-AP da presente invenção, procedeu-se à determinação das toxicidades relativas do pró-fármaco e do seu derivado activo libertado, o composto MOH, em murganhos da estirpe Balb C nu/nu. Quando se administrou os fármacos (i.p.) em duas doses iguais separadas por um intervalo de 4 dias obteve-se os valores DL5Q de 45 e 90 mg de fármaco/kg de massa corporal respectivamente para os composto MOH e MOP. Descobriu-se também que seria possível administrar consideravelmente mais fármaco utilizando doses menores durante um período de tempo mais longo. Verificou-se que quantidades até 40 mg/kg de composto

MOH e de 100 mg/kg de composto MOP foram bem toleradas quando administradas em 4 doses iguais durante um período de 25 dias. Estes estudos indicam que foi tolerado significativamente mais quantidade de pró-fármaco de mitomicina devido à sua reduzida toxicidade.

Procedeu-se depois à realização de estudos terapêuticos sobre fêmeas de murganho rapadas da estirpe Balb C nu/nu (6 murganhos por cada grupo de tratamento) (4-6 semanas de idade) obtidos em Life Sciences (St. Petersburg, Fia.) nos quais haviam sido implantadas (s.c., flanco posterior direito) células tumorais H2981 obtidas a partir de origens in vivo. As experiências foram efectuadas quando os tumores atingiram o volume aproximado de 100 min . Administrou-se cada um dos conjugados L6-AP e 1F5-AP (0,1 ml contendo 200 μg de anticorpo em PBS) (i.p.) 18 a 24 horas antes do tratamento com o composto MOP (0,2 ml contendo 0,6 mg de composto MOP em água). Comparou-se o crescimento tumoral com o crescimento que é observável em murganhos não tratados e em murganhos tratados apenas com as doses máximas toleradas do composto MOP (0,2 ml contendo 0,6 mg do composto MOP em água) ou do composto MOH (0,2 ml contendo 0,2 mg do composto MOH em água) .

Conforme se mostra na Figura 18 tanto o composto MOH como o composto MOP exibiram significativas actividades anti-tumor in vivo. 0 período de tempo necessário para se 3 atingir tumores com um volume médio de 750 mm foi de 45 dias nos murganhos tratados com o composto MOH, foi de 63 dias nos murganhos tratados com o pró-fármaco MOP e foi de 27 dias no grupo de controlo. Conforme relatado antes, o pró-fármaco MOP demonstrou ser menos tóxico para os animais e consequentemente a dose superior que foi possível administrar teve como consequência um efeito anti-tumor superior ao que observável com o derivado do composto MOH. Embora o conjugado não ligante 1F5-AP tivesse aumentado de alguma forma a actividade do composto MOP, observou-se um efeito muito mais pronunciado no grupo que recebeu o conjugado L6-AP antes do tratamento com o composto MOP. Tal como a Figura indica ao 70^a dia os tumores que haviam sido pré-tratados com o conjugado L6-AP (seguindo-se o tratamento com o composto MOP) apresentava um volume correspondente aproximadamente a um terço do volume dos tumores pré-tratados com o conjugado 1F5— AP. Por outro lado, conforme se indica no Quadro 3 seguinte, ao 63^a dia pós-implantação verificou-se que 3 dos 6 tumores nos murganhos tratados com L6-AP + MOP haviam sofrido uma regressão completa e o volume dos 3 tumores restantes não tinha aumentado desde o início do tratamento. Pelo contrário, 3 dos 5 tumores do grupo tratado com 1F5-AP+MOP possuíam geralmente um volume que tinha aumentado, 2 dos 5 tumores apresentavam-se estáveis e não tinha havido regressões parciais ou completas.

Quadro 3

RESPOSTA DOS TUMORES (AO 63² DIA) AO TRATAMENTO COM CONJUGADOS ANTICORPO-AP E DERIVADOS DE MITOMICINA C

	RESPOSTAS	DOS TUMORES
Grupo	progressão	estável regressão	regressão
		parcial	completa
Controlo	6/6
MOH	6/6
MOP	4/5	1/5
1F5-AP + MOP	3/5	2/5
L6-AP + MOP		3/6	3/6

Estas experiências demonstram claramente a especificidade e o efeito aumentado anti-tumor da combinação enzima/MOP dirigida a um alvo, de acordo com a presente invenção in vivo.

EXEMPLO 3

Este exemplo demonstra a aplicabilidade dos imunoconjugados dos pró-fármacos e dos métodos da presente invenção para o fornecimento de um número diversificado de fármacos às células tumorais. Utilizando o conjugado actividade anti-tumor anticorpo-fosfatase alcalina L6-AP -fármacos EP e MOP demonstrou-se intensificada in_vivo. Desta forma invenção proporciona a utilização de uma única

a presente enzima dirigida para o alvo por um anticorpo, com um painel de pró-fármacos para uma quimioterapia combinada contra tumores.

Os pró-fármacos EP e MOP foram preparados conforme descrito respectivamente nos Exemplos 1 e 2. A preparação dos imunoconjugados L6-AP e 1F5-AP encontra-se descrita no Exemplo 1. Os estudos in vivo sobre murganhos rapados foram efectuados conforme anteriormente descrito nos Exemplos 1 e 2. Deste modo, os murganhos rapados aos quais haviam sido implantadas células tumorais H2981 foram pré-expostos aos conjugados L6-AP ou 1F5-AP 18 a 24 horas antes do tratamento com uma combinação de MOP/EP (0,2 ml contendo 1 mg de EP e 0,3 mg de MOP em água). Efectuou-se a comparação do crescimento tumoral com o crescimento que é observável em murganhos não tratados e em murganhos tratados apenas com a combinação dos compostos MOP/EP.

Conforme se mostra na Figura 19, as actividades anti-tumor da combinação MOP/EP por si só e da combinação MOP/EP mais o tratamento com o conjugado 1F5-AP foram aproximadamente iguais. Adicionalmente, tal como se indica no Quadro 4 seguinte, todos os tumores destes dois grupos e bem assim os tumores dos murganhos de controlo não tratados aumentaram de volume. Todavia, o pré-tratamento dos murganhos portadores de tumores com o conjugado L6-AP seguindo-se o tratamento com a combinação MOP/EP teve como consequência uma pronunciada resposta anti-tumor. Tal como a Figura 19 indica, ao 70° dia os tumores que haviam sido pré-tratados com o conjugado L6-AP (seguindo-se o tratamento com a combinação r

I

terço do conjugado

MOP/EP) apresentavam um volume de aproximadamente um valor correspondente aos tumores pré-tratados com o

1F5-AP. Por outro lado o Quadro 4 mostra que ao dia pós-implantação um dos 6 tumores do grupo dos murganhos pré-tratados com o conjugado L6-AP tinha sofrido uma regressão completa, em 3 dos 6 tumores tinha cessado o aumento de volume e apenas 2 desses 6 tumores tinham aumentado de volume.

Quadro 4

RESPOSTA DOS TUMORES (AO 63² DIA) AO TRATAMENTO COM CONJUGADOS ANTICORPO-AP E COM COMBINAÇÕES DE

MITOMICINA/ETOPOSIDO

RESPOSTAS DOS TUMORES
Grupo	progressão	estável	regressão parcial	regressão completa
Controlo	6/6
MOH/EP	5/5
1F5-AP + MOP/EP	6/6
L6-AP + MOP/EP	2/6	3/6		1/6

Sendo assim, estes estudos in vivo indicam a aplicabilidade dos conjugados, dos pró-fármacos e dos métodos da presente invenção para uma terapia combinada contra tumores.

Em alternativa, os conjugados da presente invenção tais como o conjugado L6-AP podem ser utilizados com outras combinações de pró-fármacos tais como EP, adriamicina-14-fosfato e monofosfato de 5-fluorouridina para fornecer inúmeros agentes citotóxicos às células tumorais.

Repetindo a preparação do conjugado anticorpo-enzima L6-AP e do pró-fármaco etopósido-4'-fosfato efectuou-se conforme descrito no Exemplo 1. 0 composto adriamicina-14-fosfato foi preparado conforme descrito na patente norte-americana n² 4185111 atribuída a J. B. Ducep em 12 de Janeiro de 1980. O composto monofosfato de 5-fluorouridina foi preparado conforme descrito por M. J. Robins e colaboradores, Can. J. Chem., 53, pp. 1302-1306 (1975).

A reacção do conjugado L6-AP com os três pró-fármacos anteriormente referidos efectuou-se conforme se descreve a seguir: alternativamente adicionou-se apenas a enzima AP ou o conjugado L6-AP (concentração final em AP correspondente a 5 pg/ml) a soluções de etopósido-4'-fosfato ou adriamicina-14-fosfato (0,1 mM) em tampão Tris (100 mM) contendo MgCl2 (1 mM) e ZnCÍ2 (0,1 mM) a pH 7,0. No caso do pró-fármaco 5-fluorouridina as condições de reacção exigem uma solução de 5-fluorouridina (3 μΜ) em tampão fosfato (100 mM) a pH 8,0. A reacção do conjugado L6-AP alternativamente com qualquer dos pró-fármacos fosfato do etopósido ou 5-fluorouridina foi verificada conforme descrito no Exemplo 1. A reacção do conjugado L6-AP com o composto adriamicina-14-fosfato foi verificada por CLEP em coluna C-18 de modelo IBM (3 μ, 4,5 x 100 mm) e utilizando como eluente uma solução de metanol a 65% em água contendo 3% de acetato de amónio (0,5ml/min, verificado a 495 nm).

A reacção do conjugado anticorpo-AP com qualquer dos pró-fármacos teve como consequência a remoção hidrolítica dos radicais fosfato para libertar os fármacos livres [ver por exemplo, R. B. McComb e colaboradores, Alkaline Phosphatase, Plenum Press (New York 2979)].

É possível demonstrar a citotoxicidade para as células tumorais de qualquer dos três pró-fármacos em presença do conjugado L6-AP da presente invenção utilizando o ensaio de inibição das colónias tal como anteriormente descrito no

Exemplo 1. Após a remoção do radical fosfato de cada um dos pró-fármacos efectuada pelo conjugado liberta-se os compostos etoposido, adriamicina e 5-fluorouridina. Foi já demonstrado que qualquer desses fármacos é um poderoso agente anti-tumor [ver por exemplo, P. J. O'Dwyer e colaboradores, Etoposide: Current Status Of An Active Anticancer Drug, New England Journal Of Medicine, 312, pp. 692-700 (1985); M. J. Embleton e colaboradores, Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents, em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, R. W. Baldwin e V. S. Byers (ed. s), pp. 321-22 (Academic Press 1985); Patente norte americana n^Q 4185111, supra; S.T. Crooke e S.D. Reich (ed. s), Anthracyclines: Current Status And New Developments, Academic Press (New York 1980); e C. Heidelberger e colaboradores, Fluorinated Pyrimidines And Their Nucleosides, em Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 54, pp. 57-119 (1983) ] .

Em consequência os pró-fármacos etoposido, adriamicina e 5-fluorouridina podem ser utilizados conjunta ou sequencialmente para a libertação dos correspondentes agentes anti-tumor conhecidos anticorpo-fosfatase Demonstrou-se, por no local do tumor pelos alcalina da presente exemplo, que os agentes conjugados invenção. anti-tumor

administrados em combinação uns com os outros podem actuar sinergicamente [ver por exemplo, S. Monfardini e colaboradores, Manual of Câncer Chemotherapy, UICC Technical Report Series, 56 (1981)]. Em consequência este aspecto da presente invenção proporciona um método para uma quimioterapia combinada contra tumores.

EXEMPLO 4 exemplo seguinte demonstra a utilização de outros imunoconjugados e pró-fármacos da presente invenção para a conversão de um pró-fármaco relativamente não citotóxico num agente activo anti-tumor que exibe in vitro citotoxicidade contra as células tumorais. Em conformidade com este exemplo utiliza-se um imunoconjugado L6-penicilina V-amidase (adiante identificada por PVA) para converter um derivado N-fenóxi-acetílico da adriamicina num conhecido agente anti-tumor designado por adriamicina.

Preparação dos Conjugados da Presente Invenção Anticorpo-Penicilina V-Amidase

Neste exemplo preparou-se um imunoconjugado L6-PVA e um conjugado 1F5-PVA. Os anticorpos L6 e 1F5 e as suas fontes já foram descritos anteriormente. A enzima amidase utilizada foi uma amidase da penicilina V isolada a partir de culturas fúngicas de Fusarium oxysporum de acordo com os métodos descritos por D.A. Lowe e colaboradores, Enzymatic Hydrolysis Of Penicillin V to 6-Aminopenicillanic Acid By Fusarium Oxysporum, Biotechonology Letters, 8 (3), pp. 151-56 (1986). As estirpes de Fusarium oxysporum a partir das quais é possível isolar esta enzima encontram-se depositadas na instituição ATCC. Deste modo, a enzima PVA é uma enzima de fácil obtenção que converte a penicilina-V em ácido penicilânico. Mais especificamente, a enzima PVA hidrolisa a ligação fenóxiacetil-amida da penicilina-V para proporcionar o ácido penicilânico. Em consequência a enzima que reage com as fenóxiacetamidas pode ser utilizada eventualmente para clivar os pró-fármacos de agentes citotóxicos conhecidos que tenham sido transformados com o ácidos fenóxi-acético ou com o ácido p-hidróxi-fenóxi-acético.

Os conjugados anticorpo-PVA desta variante da presente invenção foram preparados praticamente conforme descrito para os conjugados da enzima AP do Exemplo 1. Os anticorpos L6 e 1F-5 reagiram com o composto iminotiolano tal como descrito e determinou-se que era de 1-2 o número de grupos sulfidrilo introduzidos em cada um dos anticorpos.

Depois dissolveu-se a enzima PVA na proporção de 9 mg/ml em PBS e tratou-se com SMCC (Pierce Chemical Co., 100 mM em DMF) de tal modo que a concentração final foi de 5 mM. 0 tratamento com SMCC introduziu grupos maleimido na enzima.

Decorridos 30 minutos à temperatura de 30 °C submeteu-se a enzima modificada a purificação por filtração em gel G-25 PD-10 Sephadex (Pharmacia, Upsalla, Suécia) e efectuou-se a eluição com PBS. Depois adicionou-se a enzima PVA modificada a uma solução de cada anticorpo tiolado, segundo uma razão molar 3:1. Saturou-se cada mistura de reacção com azoto e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 3 horas e depois efectuou-se a incubação à temperatura de 4‘C durante mais 18 horas. Decorrido esse período de tempo adicionou-se a cada solução o composto 2-amino-etanotiol (concentração final de 1 mM) para bloquear quaisquer outros grupos maleimido que não tivessem reagido.

Depois fez-se passar a cada mistura de através de uma coluna de filtração em gel (G-25) utilizando-se como eluente Tris 20 mM, pH 7,2 com NaCl 50 mM. Purificou-se as misturas resultantes em colunas DEAE Sephadex (2,5 x 10 cm). As fracções foram verificadas a 280 nm. O anticorpo de cada mistura que não reagiu não se ligou à coluna e o conjugado e a enzima PVA que não reagiu foram submetidos a eluição com Tris 20 mM, pH 7,2 com NaCl 0,5 M. As fracções que continham a enzima PVA e o conjugado foram depois concentradas utilizando-se para o efeito um filtro de ultrafiltração Amicon YM-30 e efectuou-se a purificação em coluna de Sephacryl S-300 (2,5 x 95 cm) utilizando PBS como eluente. As fracções foram verificadas a 280 nm e as que continham o conjugado puro, tal como determinado pelo protocolo SDS-PAGE (gel em gradiente entre 4 e 12%) foram reunidas.

Preparação de Um Novo Pró-Fármaco de Adriamicina

Posteriormente fez-se reagir cada um dos conjugados anticorpos-PVA anteriormente preparados, com um novo pró-fármaco de adriamicina. Mais particuiarmente, o pró-fármaco utilizado foi o composto N-(p-hidróxi-fenóxi-acetil)adriamicina (adiante designado por APO) , em que a adriamicina é acilada na posição amino-açucar com o ácido p-hidróxi-fenóxi-acético conforme representado na Figura 20.

Este pró-fármaco adriamicina foi sintetizado conforme se descreve a seguir.

A 10 ml de tetra-hidrofurano adicionou-se 84 mg (0,5 mmole) de ácido p-hidróxi-fenóxi-acético, 57 mg (0,5 mmole) de N-hidróxi-succinimida e 100 mg (0,49 mmole) de diciclo-hexil-carbo-di-imida. Agitou-se esta mistura durante 2 horas e depois filtrou-se a solução e adicionou-se o filtrado a 200 mg (0,35 mmole) de cloridrato de adriamicina. Adicionou-se uma quantidade de 0,1 ml de trietilamina à mistura de reacção e manteve-se a agitação durante 4 horas. Depois filtrou-se a mistura de reacção através de lã de vidro e evaporou-se sob vácuo intenso até se obter um resíduo. Purificou-se a mistura resultante em coluna de gel de sílica (2,5 x 20 cm) e efectuou-se a eluição com uma mistura 95:5 constituída por diclorometano:metanol. As fracções reunidas foram novamente purificadas utilizando-se uma coluna do mesmo tipo para proporcionar 70 mg (0,1 mmole, 30% de rendimento) de N-(p-hidróxi-fenóxi-acetil)-adriamicina pura.

BAR: EM m/e 694.2125 (M+H)⁺. Calculado ^c35^h36ⁿ⁰14' 694.2136. 360 MHz RMN-¹H (CDC1₃) δ 1,06 (d, 3H, CH3 do açúcar), 1,5-2,2 (m, 6H, H do açúcar), 3,0 (q, 2H) 4,0 (s, 3H, OCH₃), 4,35 (s, 2H, COCH₂O), 4,8-5,0 (m, 3H), 5,2 e

5,4 (s, 1H), 6,6-6,8 (dd, 4H, ArH do fenoxi), 7,4-7,9 (m, 3H, 2,3,4-H), 9,0 (s, 1H, ArOH), 11,61 e 12,39 (s, 1H, ArOH).

Faz-se observar que os outros derivados de adriamicina com fenóxi-acetil-amidas podem ser sintetizados utilizando-se praticamente o mesmo procedimento descrito antes. Por exemplo, é possível sintetizar o composto N-(fenóxi-acetil)adriamicina tal como descrito nesta secção segundo uma reacção em que o ácido p-hidróxi-fenóxi-acético foi substituído por 0,5 mmole (76 mg) de ácido fenóxi-acético. De modo idêntico, é possível sintetizar o composto N-(p-hidróxi-fenóxi-acetil)melfalano ou os pró-fármacos de daunomicina ou o composto N-(fenóxi-acetil)melfalano ou os pró-fármacos de daunomicina, utilizando-se 100 mg de mefalano ou 200 mg de daunomicina (0,35 mmole).

Reacção de um Conjugado Anticorpo-Penicilina V-Amidase com um

Pró-Fármaco de Adriamicina

Mediu-se a capacidade do designado abreviadamente L6-PVA,para -fármaco APO em adriamicina conforme conjugado anticorpo-PVA, se converter o novo prose descreve a seguir:

adicionou-se concentração alternativamente a) apenas a enzima PVA (na final de 50 μg/ml), b) conjugado L6-PVA na proporção de 100 μg/ml (concentração final da enzima PVA: 25 μg/ml) ou c) o conjugado L6-PVA na proporção de 10 μg/ml (concentração final da enzima PVA: 2,5 μg/ml) a uma solução de APO (0,1 mM) em PBS. Cada reacção foi verificada por CLEP em coluna Phenominex C-18 (3 μιυ; 4,5 x 100 mm) e efectuando a eluição com um gradiente variável entre 20 e 60% de tetra-hidrofurano em água contendo 0,1 % de H3PO4 (1,0 ml/minuto, verificação a 495 nm). Nessas condições a eluição da adriamicina ocorreu ao fim de 8,9 minutos e a composto APO ocorreu ao fim de 12,2 minutos. Os estão indicados na Figura 21.

eluição do resultados

Tal como a Figura demonstra, o grupo amida do composto APO foi realmente hidrolisado pela enzima PVA conforme indicado pela geração do composto adriamicina. Nas consições utilizadas o período de semi-vida da hidrólise do composto minutos.

contados só como

APO pela enzima PVA foi de aproximadamente 20 Além disso descobriu-se qua ao fim de 40 minutos a partir do início da reacção tanto a enzima por si o conjugado anticorpo-PVA eram capazes de efectuar a hidrólise de pelo menos 80% de APO em adriamicina. O conjugado a proporção de 10 μg/ml (2,5 μg/ml de PVA) foi capaz de alcançar este nível de hidrólise em 120 minutos. Pinalmente, é evidente a partir destes estudos que o conjugado anticorpo-PVA da presente invenção não exibe qualquer perda

I

aparente de actividade enzimática devida ao acoplamento da enzima ao anticorpo conforme é evidenciado pelo facto de o conjugado e a enzima livre exibirem capacidades semelhantes de hidrolisar o composto APO em adriamicina.

Estabilidade Sérica do Novo Pró-Fármaco de Adriamicina da Presente Invenção

Determinou-se a estabilidade do composto APO no soro humano por CLEP e mediu-se a velocidade de desaparecimento do composto APO e a velocidade de formação de adriamicina. Deste modo, adicionou-e uma solução do prófármaco APO (10 mM em dimetilformamida) a uma quantidade de soro humano recente de tal modo que a concentração final foi de 0,1 mM. Diluiu-se aliquotas (50 μΐ) com metanol (50 μΐ) para precipitar as proteínas do soro. Estas amostras foram depois centrifugadas e analisadas por CLEP tal como anteriormente descrito. A hidrólise do pró-fármaco APO em adriamicina ocorreu ao fim de 2 horas.

Ligação dos Conjugados Anticorpo-PVA às Células Tumorais H2981

Mediu-se a capacidade dos conjugados L6-PVA e 1F5-PVA da presente invenção para se ligarem às células tumorais H2981 conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Os resultados do ensaio de ligação estão representados na Figura 22 .

A análise por SCAF indicou que tanto o anticorpo L6 como o conjugado L6-PVA se ligam fortemente às células tumorais ao passo que o conjugado 1F5-PVA não exibe qualquer quantidade significativa de ligação. Este estudo de ligação indica em primeiro lugar que a conjugação com a enzima

praticamente não afecta a capacidade de ligação do componente anticorpo dos imunoconjugados da presente invenção. Em segundo lugar este ensaio vem novamente demonstrar a especificidade de ligação dos conjugados; o conjugado L6-PVA liga-se às células tumorais H2981 positivas em L6 e o conjugado 1F5-PVA, devido à falta de especificidade dos anticorpos 1F5 para as células tumorais, não demonstra praticamente nenhuma ligação.

Citotoxicidade In Vitro de uma Combinação Conjugado Anticorpo-PVA/Pró-Fármaco Adriamicina da Presente Invenção em Células

Tumorais H2981

Mediu-se o efeito citotóxico in vitro de uma combinação anticorpo-PVA/pró-fármaco de adriamicina em células tumorais H2981 utilizando-se para o efeito o ensaio de absorção de H-timidina descrito nos Exemplos 1 e 2 anteriores. Resumidamente, as células tumorais H2981 foram colocadas em placas de microtitulação de 96 cavidades contendo meio IMDM (10 000 células/cavidade) e deixou-se a incubação prosseguir durante 18 horas à temperatura de 37°C. Depois adicionou-se os conjugados anticorpo-PVA, L6-PVA ou 1F5-PVA segundo uma concentração do anticorpo correspondente a 10 μς/πιΐ e efectuou-se a incubação das placas durante 30 minutos à temperatura de 4 °C. As cavidades foram depois lavadas 4 vezes com o meio IMDM e adicionou-se o pró-fármaco APO em concentrações variáveis em meio IMDM. Decorridas 2 horas lavou-se novamente as cavidades, adicionou-se IMDM e deixou-se as celúlas em repouso durante 18 horas à temperatura de 37°C.

Decorrido esse período de tempo adicionou-se H-timidina (1 μθί por cavidade) e decorridas 6 horas procedeu-se à congelação das placas para uma temperatura de -70°C para separar as células. Após a descongelação efectuou-se a recolha das células em filtros de 3 de H-timidina num

contador de cintilação Beckman 3801 e efectuou-se a comparação das células tratadas apenas com APO ou com adraimicina (ADM).

Utilizando este ensaio mediu-se a inibição da 3 incorporação de H-timidina no ADN das células tumorais e consequentemente o efeito citotóxico do pró-fármaco APO sobre as células em presença ou na ausência de pré-tratamento da células com os conjugados L6-PVA ou 1F5-PVA. Os efeitos citotóxicos dessa combinações foram comparados com a citotoxicidade observada quando se fez o tratamento das células apenas com o fármaco original adriamicina. Conforme se mostra na Figura 23, em células tumorais não tratadas com nenhum conjugado, a adriamicina exibiu um valor CI5Q correspondente a uma concentração de 38 nM o que demonstra que foi significativamente mais tóxica do que o composto APO ao qual corresponde um valor CI5Q de 2 μΜ. Isto era previsível tomando como base os conhecimentos já existentes que demonstram que as amidas de adriamicina são menos tóxicas do que a adriamicina [ver por exemplo, Y. Levin and B. A. Sela, FEBS Letters, 98, p. 119 (1979) e R. Baurain e colaboradores, J. Med. Chem, 23, p. 1171 (1980)]. O pré-tratamento das células com o conjugado L6-PVA aumentou a citotoxicidade do composto APO 20 vezes até a um nível comparável ao que é observável quando se utiliza apenas adriamicina. O pré-tratamento da células com o conjugado 1F5-PVA não afectou a toxicidade do composto APO de forma alguma. Estes resultados indicam que o conjugado L6-PVA é susceptível de hidrolisar o pró-fármaco relativamente não citotóxico APO para aniquilar as células tumorais com uma intensidade comparável à que se observa utilizando apenas adriamicina e indicam também que esta citotoxicidade é específica do antígeno conforme é

possível concluir pelo facto de o conjugado 1F5-PVA, o qual não se liga significativamente a esta linha particular de células tumorais, não demonstrar tal citotoxicidade.

Ligação dos Conjugados Anticorpo-PVA às Células do Linfoma de

Daudi

Mediu-se também a capacidade dos conjugados L6-PVA e 1F5-PVA da presente invenção para se ligarem à conhecida linha de células de Daudi. Esta linha de células é uma linha celular do linfoma Burkitt depositada na instituição ATCC (ATCC # CCL 213), que expressa o antígeno CD-20 ao qual se liga o anticorpo 1F5. 0 ensaio de ligação foi efectuado

conforme	descrito	no	Exemplo 1 com a excepção	de se ter
utilizado	células	de	Daudi encontrando-se os	resultados
indicados	na Figura	24.

No caso vertente, o anticorpo monoclonal 1F5 e o conjugado 1F5-PVA ligam-se ambos fortemente às células do linfoma. Sendo assim, este estudo demonstra também que a capacidade de ligação dos conjugados não foi significativamente afectada pelo procedimento de ligação.

Por outro lado, conforme indicado na Figura, o anticorpo L6 e o conjugado L6-PVA demonstraram não exibir qualquer ligação apreciável às células de Daudi. Este facto era previsível uma vez que as células tumorais de Daudi não possuem o antígeno com o qual reage o anticorpo L6. Assim, este estudo considerado em combinação com os estudos prévios de ligação descritos na presente memória descritiva demonstra claramente a especificidade de ligação dos conjugados da presente invenção isto é, os conjugados que contêm o anticorpo L6 ligam-se especificamente às células tumorais positivas em c

L6 e os conjugados que contêm o anticorpo 1F5 ligam-se * especificamente às células tumorais positivas em CD-20.

Citotoxicidade In Vitro da Combinação Conjugado Anticorpo-PVA/Pró-Fármaco de Adriamicina da Presente Invenção nas

Células de Dausi

Efectuou-se o teste do efeito citotóxico in vitro dos conjugados L6-PVA ou 1F5-PVA em combinação com o pró-fármaco APO sobre as células de Daudi.

~ 3

Efectuou-se o ensaio de absorçao de H-timidina praticamente conforme descrito nos exemplos anteriores com ligeiras modificações devido ao facto de as células de Daudi serem de tipo não aderente. Sendo assim, colocou-se aproximadamente 250 000 células de Daudi em meio IMDM em cada uma das cavidades de uma placa de microtitulação de 96 cavidades e adicionou-se o conjugado anticorpo-enzima. Efectuou-se a incubação da mistura de reacção à temperatura de 4’C durante 30 minutos. Removeu-se o conjugado anticorpo-enzima não ligado por centrifugação a 500 x g durante 5 minutos e efectuou-se a remoção do sobrenadante. Com as células preparou-se nova suspensão em meio IMDM e repetiu-se o procedimento de lavagem 3 vezes até à remoção de todo o conjugado desligado. Depois adicionou-se o pró-fármaco APO em meio IMDM durante 2 horas e lavou-se uma vez conforme descrito antes. A parte restante do ensaio foi realizada conforme descrito nos exemplos anteriores.

Utilizando este ensaio mediu-se a inibição de 3 incorporação de H-timidina no ADN das células de Daudi e consequentemente o efeito citotóxico do pró-fármaco APO sobre essas células com tratamento prévio ou sem pré-tratamento com

o conjugado L6-PVA ou 1F5-PVA. Os efeitos citotóxicos dessa combinações foram comparados com a toxicidade que é observáve lquando se efectua o tratamento das células apenas com adriamicina. Conforme se mostra na Figura 25, nas células de Daudi não tratadas com qualquer conjugado, a adriamicina foi significativamente mais tóxica do que o pró-fármaco APO. 0 pré-tratamento das células com o conjugado 1F5-PVA melhorou significativamente a citotoxicidade do pró-fármaco APO até a um nível comparável ao que se observa com a adriamicina quando utilizada por si só, ao passo que o pré-tratamento com o conjugado L6-PVA não originou qualquer melhoria.

Faz-se observar que os resultados obtidos nestes estudos de ligação e de citotoxicidade são opostos aos resultados obtidos com esses conjugados nos estudos anteriormente descritos neste exemplo quando se utilizou células tumorais H2981 caso em que a combinação do conjugado L6-PVA mais pró-fármaco APO demonstrou efeitos citotóxicos aumentados contrariamente à combinação do conjugado 1F5-PVA mais o pró-fármaco APO. Este facto era previsível tendo em consideração as diferentes especificidades dos anticorpos L6 e 1F5 dos conjugados e demonstra claramente a especificidade dos efeitos citotóxicos obtidos com as combinações conjugado/pró-fármaco da presente invenção.

Por outro lado, este estudo indica a utilidade do conjugado 1F5-PVA em combinação com o pró-fármaco APO para a produção de efeitos citotóxicos em células tumorais in vitro. Desta forma, os estudos de citotoxicidade in vitro deste exemplo demonstram a aplicabilidade da presente invenção a qualquer conjugado que contenha um anticorpo reactivo com um antígeno associado a um tumor, para o tratamento de tumores com os quais esse anticorpo reaja.

EXEMPLO 5

Este exemplo refere-se à utilização dos imunoconjugados e dos métodos da presente invenção para a conversão do pró-fármaco 5-fluorocitosina (adiante designado por 5-FC) no fármaco anti-tumor 5-fluorouracilo (adiante designado por 5-FU), através de uma enzima citosina-desaminase (CD) ligada ao anticorpo (ver a Figura 26). A combinação de conjugado anticorpos-CD/pró-fármaco 5-FC desta variante demonstrou um significativo efeito citotóxico sobre células tumorais in vitro.

Preparação dos Conjugados Anticorpo-Citosina-Desaminase da

Presente Invenção

Procedeu-se à preparação dos imunoconjugados L6CD e 1F5-CD utilizando os anticorpos monoclonais L6 e 1F5 referenciados nos exemplos anteriores e uma enzima citosina— desaminase. Apesar de as enzimas CD terem sido detectadas e isoladas a partir de uma multiplicidade de microrganismos (ver por exemplo, West e colaboradores, Biochem. Biophys. Acta., 719, pp. 251-58 (1982)], a enzima CD particular utilizada neste exemplo foi purificada a partir de levedura de padeiro comprimida, em conformidade com um processo idêntico ao descrito por P. L. Ipata e colaboradores , Baker's Yeast Cytosine Deaminase. Some Enzymatic And Properties And Allosteric Inhibition By Nucleosides And Nucleotides, Biochemistry, 10, pp. 4270-76 (1971).

Resumidamente, submeteu-se uma quantidade de células de levedura (Saccharomyces cerevisiae) (2,0 kg) a uma reacção de plasmolise com acetato de etilo e efectuou-se a precipitação (50-73%) com sulfato de amónio 2 vezes para

se obter uma preparação enzimática impura. Submeteu-se a diálise o granulado de sulfato de amónio em presença de tampão Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, aplicado a uma coluna de permuta aniónica Q-Sepharose (Pharmacia) e efectuou-se a eluição com gradiente de KC1 (0-0,3 M).

As fracções foram analisadas para determinação da actividade da enzima CD utilizando-se como substrato citosina

3mM (ou 5-FC) em o procedimento

PBS à temperatura de 27°C em conformidade com descrito por T. Nishiyama e colaboradores,

Antineoplastic In Combination Research, 45, pp

Effects In With Cytosine

1753-61 (1985).

Rats Of Deaminase

5-Fluorocytosine Capsules, Câncer este procedimento, adicionou-se

Deste modo, uma pequena de acordo com quantidade da preparação enzimática ao substrato verificou-se a evolução da reacção por citosina (ou 5-FC) e espectofotometria de UV para a geração de uracilo (ou 5-FU) em aliquotas que foram temperadas com HC1 0,1 N. Utilizou-se as proporções de 250/280 ( para a citosina) e de 255/290 (para o composto 5-FC) para se medir a quantidade formada de uracilo ou de 5-FU.

Este procedimento para a determinação da actividade da enzima CD foi utilizado em cada passo de purificação da enzima CD e também durante a purificação dos conjugados da presente invenção que continham a enzima CD, conforme adiante descrito.

Sendo assim, reuniu-se as fracções activas provenientes do gradiente de KC1, efectuou-se a sua concentração e purificação em coluna G-75 Sephadex. Nesta fase o ensaio SDS-PAGE (14%, não redutor) indicou que a fracção que continha a actividade da enzima CD era constituída por uma proteína principal com peso molecular (PM) correspondente a 18 kd e por quantidades menores de proteínas \

de 20 e 30 kd. A actividade da enzima CD desta fracção foi de 10 U/mg de proteína (utilizando-se a citosina como substrato). As outras preparações proporcionaram um material com uma actividade da ordem de 17 U/mg de proteína. Todos os ensaios protéicos foram efectuados utilizando o reagente de ensaio protéico BCA fornecido por Pierce (Rockford, IL).

A enzima CD purificada foi depois conjugada com os anticorpos monoclonais L6 ou 1F5 por um processo praticamente idêntico ao descrito para os conjugados com a enzima AP do Exemplo 1. Os conjugados impuros (não tratados com iodoacetamida) foram purificados por filtração em gel em coluna de Sepharose S-200 utilizando-se PBS como eluente. As fracçoes foram verificadas a 280 nm e submeteu-se cada fracção a ensaios para determinação da actividade da enzima CD conforme descrito imediatamente antes. As fracçoes que continham os conjugados com níveis adequados de proporções CD-anticorpo foram reunidas e analisadas em conformidade com o protocolo SDS-PAGE em gel não redutor de gradiente variável entre 4 e 12% para proporcionar preparações purificadas de conjugados L6-CD e 1F5-CD.

Reacção dos Conjugados Anticorpo-Citosina-Desaminase com o Pró-Fármaco 5-fluorocitosina

Mediu-se a capacidade dos conjugados L6-CD e 1F5-CD da presente invenção para converterem o pró-fármaco 5-FC em 5-FU ou para converterem a citosina em uracilo do modo seguinte: alternativamente adicionou-se a enzima CD livre (concentração final: 5 μg/ml), o conjugado L6-CD (concentração final da enzima CD: 5 μg/ml) ou o conjugado 1F5-CD (concentação da enzima CD: 5 μς/ιτιΐ) a uma solução 3 mM de a) citosina ou b) composto 5-FC em PBS à temperatura de 27C e mediu-se por espectrofotometria a quantidade de produto que se formou ao longo do tempo, conforme descrito no exemplo da secção anterior. Os resultados estão indicados na Figura 27.

Tal como a Figura indica, o composto 5-FU foi gerado a partir do pró-fármaco 5-FC tanto pela enzima CD livre como pelos conjugados anticorpo-CD da presente invenção. A Figura mostra também que não houve qualquer perda significativa da actividade da enzima CD devido ao acoplamento da enzima ao anticorpo em qualquer dos conjugados conforme é evidenciado pelo facto de esses conjugados exibirem actividades iguais às que são observáveis com a enzima CD por si só. A actividade especifica da enzima livre e dos conjugados foi de aproximadamente de 4 U/mg de enzima.

Para efeitos de comparação testou-se a reactividade dos conjugados utilizando-se citosina em vez do composto 5-FC como substrato. Tal como a Figura indica, quando se utilizou citosina como substrato, os conjugados exibiram também actividades da enzima CD praticamente iguais às que são observáveis quando se utiliza apenas a enzima CD livre. A actividade específica dos conjugados - 10 U/mg de enzima ligada - indica também que a actividade original da enzima CD foi conservada no conjugado. Este nível de actividade foi mantida durante várias semanas durante as quais o conjugado foi armazenado em meio PBS à temperatura de 4 °C.

Ligação dos Conjugados Anticorpo-CD às Células Tumorais H2981

Mediu-se a capacidade dos conjugados L6-CD e 1F5-CD da presente invenção para se ligarem às células tumorais H2981 conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Os resultados do ensaio de ligação estão indicados na Figura 28.

A análise por SCAF indicou que tanto o anticorpo L6 como o conjugado L6-CD se ligam fortemente às células tumorais ao passo que o conjugado 1F5-CD não exibe qualquer ligação às células. Tal como sucedia nos estudos de ligação anteriormente descritos, este ensaio indica a conservação da actividade de ligação destes conjugados apesar da conjugação do anticorpo à enzima e também a especificidade de ligação dos conjugados.

Citotoxicidade In Vitro da Combinação da Presente Invenção

Conjugado Anticorpo-CD/Pró-Fármaco 5-FC Sobre as Células

Tumorais H2981

Mediu-se a citotoxicidade in vitro da combinação da presente invenção conjugado anticorpo-CD/pró-fármaco 5-FC sobre as células tumorais H2981 utilizando-se o ensaio de incorporaç (=o de H-leucina semelhante ao ensaio de 3 incorporação de H-timidina descrito nos Exemplos 1 e 2.

De acordo com este ensaio preparou-se uma suspensão de 10 células H2981 em 0,1 ml de meio IMDM contendo 10% (vol/vol) de soro de bovino fetal e colocou-se sobre placas de microtitulação de 96 cavidades e esperou-se que ocorresse a aderência durante a noite à temperatura de 37°C. As placas foram depois lavadas e adicionou-se os conjugados L6-CD ou 1F5-CD (10 μg de proteína total/ml contendo 10 U/mg de actividade da enzima CD ligada, utilizando-se citosina como substrato) em 0,1 ml de meio IMDM. Decorridos 30 minutos à temperatura de de 4’C procedeu-se à lavagem das placas 4 vezes e adicionou-se às cavidades 0,15 ml de meio RPMI isento de leucina contendo concentrações variáveis dos fármacos 5-FC ou 5-FU. As células foram incubadas durante 18 horas à temperatura de 37“C e depois efectuou-se uma marcação 3 pulsatória durante 6 horas com H-leucina (1 μΟί/θ3νΐά3άβ) em 0,05 ml de meio RPMI isento de leucina. Seguidamente efectuou-se o processamento das placas conforme descrito nos 3

Exemplos 1 e 2 para o ensaio de incorporação de H-timidina.

Utilizando este ensaio mediu-se a inibição de H-leucina no interior da proteína da células tumorais e consequentemente o efeito citotóxico do pró-fármaco 5-FC sobre as células com tratamento ou sem tratamento dessas células com os conjugados L6-CD ou 1F5-CD. Procedeu-se à comparação dos efeitos citotóxicos dessas combinações com a citotoxicidade observada quando se efectuou o tratamento das células apenas com o fármaco original 5-FU. Conforme se mostra na Figura 29, sobre as células tumorais não tratadas com qualquer conjugado, o conjugado 5-FC exibiu uma actividade citotóxica bastante fraca ao passo que o composto 5-FU inibiu o crescimento celular qunatificado por um valor CI5Q de 20 μΜ. Todavia, o pré-tratamento das células com o conjugado L6-CD aumentou a citotoxicidade do composto 5-FC até a um nível igual ao que se observa quando se utiliza apenas o composto 5-FU. Este resultado é consistente com o facto de o conjugado L6-CD ligado ao antígeno ser susceptível de converter o pró-fármaco não tóxico 5-FC no composto 5-FU. 0 conjugado não ligante 1F5-CD não exibiu esse tipo de melhoria indicando a natureza específica do antígeno desta citotoxicidade aumentada.

Embora se tenha apresentado e descrito diversas variantes da presente invenção, é evidente que a construção básica agora proposta pode ser alterada de modo a proporcionar outras variantes que utilizem os métodos, os imunoconjugados e os pró-fármacos da presente invenção. Em

consequência, faz-se observar que o âmbito da presente invenção fica definido pelas reivindicações anexas e não pelas variantes específicas que foram apresentadas nas presente memória descritiva a título de exemplo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Método pera a distribuição de aperres citotoxicos para células tumorais. caracterizado pelo facto de se administrar uma /compreendida entre 1 e ICC mg/m“, quantidade eficaz/de oelo menos um conjugado de anticorpo-enzima cue oom.oorta um anticoroo reactivo oara um antisenio da suoerfíoie : Σ’Ξ T 2 ó S S C β 2'2 2. Ξ Ξ T¹U 7?. Ο T 2 í.
2C77 *277. £7.2277.3

C ΟΓι β T Oelc 77£7.OS UT?. 7707 27^7.7 7 ί Tê 3 277£7; 7 £ C*t .as -umorais, comparado com o farmaco principal correspondi firmaco crinoioal mais cãtctcxico e ce se a cm ini-tr ar um. a ecacac oc reserax procarmaoo.

.'.t= - -.· X.

BAD ORIGINAL pelo facto ce se escolher o anticorpo no grupo constituído por anticorpos monoclonais, policlonais e quiméricos.
3. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado oelo facto de se escolher o anticorpo no grupo constituído por anticorpos monoclonais 15. SE, 5 e 1Γ5.
4. - Método de acordo com. a reivindicação 1. caracterizado pelo facto de se escolher o enzima no grupo constituído por fosfat_a ses alcalinas, penicilina-smicases. arilsulfatases, eitosina-desaminases , proteases, l-elenil-carboxipep-idases. enzimas çue cindem hidratos de carbono e 4} -lactan.ases.
5 . — 3 *7 2 d O d 3 c C O ^rG O C O” 3 *“· 3 2 V 2 H d “ C 3 Ç 3 O 2. CcrâCtêriZcCO oelo facto de c enzima ser uma fosfatase alcalina.

£ . — — q A q d 3 sCO^CO C C 73 3 2 V 2 <2 2 C 3 Ç 3 O 2. , <ct er2 23cc

2510 23C“O ce Ο 673225 Ξ32 UT3 D32.2:

.O U. C . C. - L z r· — r\

3 3333223^ C 2 323.2

BAD ORIGINAL aminocterina . daccinomicina , miconicinas , cis-pl da cis-clatina, cleomicinas, esperamicinas, 5 -íluorouracilo, melfa lar, e outras mostardas azotadas.
9.- Método de acordo cor. a reivindicação 1, caracterizado ceio facto de c fármaco principal ser o ecocosido.
10.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizad: peio facto de o fármaco principal ser uma mitomicina.
11. - Método de acordo com a reivindicação 1. caracterizado ceio facco de c farmaco crincicai ser a adriamicina.
12. - Método de acordo com a re i v in d z c s ca o 1 , car act er z zado ceio facto de se utilizar 5-flucrou^aczio como

13.- Método de acor v z n c z c a ç α o nc zrucc c<

:erzza:

;rc:a:

maces cortenco co:

r -laccama- cr :ue com

BAD ORIGINAL *

pele iactc ce se escolher o prefarmaoc no grupo consootuccc por fosfatos de etoposido, tiofosfatos de etoposido, sulfatos ce etopo sido, fosfatos de teniposico, tiofosfatos de teniposido, sulfatos de teniposido, fosfatos de adriamicina, sulfatos de adriamicina, fosfatos ce N -(alcuil C. „)-mitomicina e sulfatos de N_-(alouil C-, __g)-mitomicina.

11.- Método Ce accrdo com a reivindicação 1, caraczerozado pelo ^acto de se utilizar como troíarnaco, etoposido-¹· '-fosf azo ou um seu sal aceitável sob o tonto de vista farmacêutico.

z r* qvtq r', QQ~ B. ~ 7 Y * C L CÇ 3 * C ^1 ZsCC ;ar como prcfarmacc ?-( 2 '-amiroecil-fosfatc') · ;a_ aceotavel soc c tonto o.e vesta oar~;aoeutl co.

cara co — c.

se esco_rer c trocar :ruto

BAD ORIGINAL f

1?.- Metooo ae acordo com a rezvzncccaçao caracterzzaco oaio facto de se utilizar conc conjugado de anticorpo-enzima o conjugado L5-AP.

20. - Método de acordo com. a reivindicação 1, caracterizado relo facto de se utilizar cozo conjugado anticorpo-enzima o conjugado 96,δ-A?.

21. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado njugaco antz ccrpo-er.z ima o conçuzelo cacto ae se utzizzar como co

BAD ORIGINAL ?el·: fasto de se r cc

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ação 1, caracterizado r L5-A? e o profárma-(alcuil C% _ θ)-mitom.i ista farmacêutico.

pelo facto co ser fo5 eira ou um

- Método de acordo cora a reivindic de o conjugado anticorpo-enzima se ato ce 4 ’-etoposido, fosfato de \’₇seu sal acei-avel sob o conto de v

27.- Método de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado ceio facto ce o contugado anticoroo-enzima ser L6-PVA e o orefarmacc ser escolhido de entre (o-hidrexifencxiacetil)-adriamicina e (fencxiacetil) - adriamicina.

BAD ORIGINAL mz/m , oe um. conjugaco anticorpo-enzima que incorpora um anticorpo cus reage cor um antigénio na superfície cas referidas células turno rais conjugado com um enzima capaz de converter mais do que um profãrmaco, cada um dos quais fracamente citotóxico para as células tumorais em. comparação com os fármacos principais correspondentes , em fármacos principais mais citotóxicos e de se administrar mais co cue um dos referidos orofarmacos em uma ouanticade eficaz.

31.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado nelo facto de se escolher o enzima no grupo constituído por fcsfatases alcalinas, penicilina-amidases, arilsulfatases, citosina-desa — inases , —^cteases , D-alanil-carhoxitett idases . enzimas de cisão ce r.i tratos e .<) -uactama ses .

32.- Método de acorde ccm a reivindicaçao 31, caractenze>elo facto de o enzima ser uma fosfatase alcalina.

BAD ORIGINAL

CC “ -3 C Ú O C£ Sê éSCOi^S''*· O^c> C^C * ê'^v*~ ê CC *~'O STuCO CC’ cor crcfõVTiâccs coe ccr-OeiT: ícsíêto, crcfêrcêccs CUê COriOêCC

Po, profarmacos que contêm péptidos, profarmacos glicosilados, pro (ã . - - rarmaccs cue contem !V-lactamas, orozarmacos de r-ammoaciccs modificados. profarmacos cue contêm, fenoxiacetamida facultativamente substituída e crcfarmacos cue contêm: fenilacetamida eventualmente

35.- Método de accrdo com a reivindicação 30, caracterizaic facto ce se escolherem cs profarmacos no grupo constituído osfatcs ce etoposido, tiofosfatcs ce etoposido, sulfatos ce

BAD ORIGINAL

Met ode σε acordo co?. £ reivindicação 3· C, cera cterizado pele facto de se escolher o conjugado anticorpo-enzima no grupo constituído por L£-A.?, 96,5-A? e 1F5-A?.

39.- Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de se utilizar como conjugado anticorpo-enzima L6-A?

e como orofarmacos fosfato de ^{14 1}-e tonos ido e fosfato de N„-alcuil / (0_Ί__q)-mitomicina ou cs seus sais aceitáveis sob o ponto de vista r- ci. ô C / T ^Ί C

90.- Método para a libert citotóxiccs em células tumorais, açac ce uma assooiaçac de agentes caracterizadc nelo facto de se escoam

BAD ORIGINAL

41.- Processo para a preparação de um conjugado anticorpo-enzima, caracterizado pelo facto de se conjugar um anticorpo reactivo com um antigénio sobre a superfície de células de tumor com um enzima capaz de converter um profármaco fracamente citotõxico no seu fármaco principal correspondente mais activo, compreendendo a fase que consiste em fazer reagir o anticorpo e o enzima com agentes de reticulação heterobifuncionais, de modo que se forma uma ligação tioéter ou dissulfureto entre o anticorpo e o enzima .

42.- Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de se conjugar fosfatase-alcalina, AP, com o anticorpo 96,5.

43.- Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de se conjugar fosfatase-alcalina, AP, com o anticorpo ^: 1F5 .

44. - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de se conjugar penicilina V amidase, PVA, com o anticorpo L6.

45. - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de se conjugar penicilina V amidase com o anticor po 1F5.

46.- Processo de acordo com a reivindicação 41, do pelo facto de se conjugar citosina-desaminase, CD, corpo L6.

caracterizacom o anti47.- Processo do pelo facto de se de acordo conjugar com a reivindicação citosina-desaminase

41 caracterizacom o anticorpo

1F5.

48.- Processo para a preparação de compostos de formula geral na qual

*1 representa um átono de hidrogénio e ^R3 representa um grupo OE ou OCH^; ou ^R1 representa um grupo OE e ^R3 representa um grupo OCHg; e ^R2 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidro-

xi;

caracterizado pelo facto de se fazer reagir um composto de fórmula geral na qual R e R^ têm os significados definidos antes, ou um seu sal de adição de ácido, com um composto de fõrmula geral

Em que ^tem ° significado definido antes, ou um seu equivalente de acilação.

LO Ο

49.- Processo de acordo com a reivindicação 48, para a preparação de compostos de fõrmula geral

na qual ^R1 representa um ^R3 representa um ^R1 representa um ^R3 representa um ^R2 representa um droxi-

caracterizado pelo facto de se pondentemente substituídos, ãtomo de hidrogénio e grupo hidroxi ou metoxi; ou grupo hidroxi e grupo metoxi; e ãtomo de hidrogénio ou um grupo hi utilizar compostos iniciais corres o Agsnte Oftóol do Prcp.-.edcde Indus.riol ·%

ENZIMAS DIRIGIDAS PARA ACTIVAÇÃO DE PRÓ-FÁRMACO o

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a sua aniquilação

Figura 2

Figura 3

RESPOSTA DO DETECTOR

Figura 4

CD)

1.·.. 1

Z3

TEMPO EM MINUTOS

Φ

Figura 5

Minutos

Figura 6

Ligação do anticorpo e do conjugado às células H3347