PT736011E - Di-hidropiridinas aneladas e sua utilizacao para a preparacao de composicoes farmaceuticas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "DI-HIDROPIRIDINAS ANELADAS E SUA UTILIZAÇÃO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS" A invenção refere-se a novos ácidos acéticos derivados de di-hidropiridinas aneladas, a um processo para a sua preparação e a medicamentos contendo estes compostos. A EP-A 37 934 deu a conhecer di-hidroisoquinolinas. Os compostos ai referidos têm acção cardiotónica e apresentam uma componente eficaz no aumento da contractilidade e na influência sobre a pressão sanguínea. São aconselhados para melhorar a irrigação dos tecidos e o fornecimento de oxigénio aos tecidos.

Estas possibilidades de aplicação têm a ver com a eficácia vascular dos compostos. Na EP-A 251 194 e na EP-A 288 048 descreve-se que as di-hidropiridinas carbocíclicas e heterocíclicas aneladas possuem um efeito protector cardíaco ou cerebral e constituem um tipo completamente novo de compostos antagonistas do cálcio. Na WO/11010 encontra-se descrita a utilização destes compostos em agentes protectores do cérebro, para o tratamento de processos inflamatórios crónicos e para a inibição da coagulação sanguínea ou da agregação das plaquetas. O objectivo da presente invenção são novas di- hidropiridinas carboxílicas e heterocíclicas aneladas e a utilização farmacêutica destes compostos. Os novos compostos têm valiosas propriedades farmacêuticas que se podem aproveitar. São utilizáveis como agentes cardioprotectores, como agentes protectores cerebrais (em especial no tratamento de pacientes que sofreram um ataque de apoplexia ou que estão em risco de- o vir a sofrer) , como agentes para o tratamento de processos \ inflamatórios crónicos (por exemplo asma brônquica, artrite). Além disso, estes compostos podem utilizar-se como agentes com efeito antiproliferativo e como agentes para o tratamento da colite ulcerosa e da Morbus Crohn.

A invenção refere-se a compostos de fórmula geral I 1

J V

em que A significa um grupo benzo, indolo ou tieno; em que, quando A é benzo m é 2 ou 3 (de preferência 2, estando os dois R2 nas posições 6 e 7), e os substituintes R2 independentemente um do outro significam hidroxilo, alcooxilo-(C^-C^ , benziloxi, halogénio (F, Cl, Br, I), alquilo- (C;l-C4) , metanossulfoniloxi ou metanossulfonamido, ou dois substituintes R2 vizinhos podem formar em conjunto -0-CH2-0- ou -0-CH2-CH2-0-; e quando A é indolo ou tieno m é zero; B significa o grupo -0-, -S- ou -CHR5-, em que R5 é hidrogénio, alquilo-(C^Cg) , fenilo ou benzilo; R3 significa 2- ou 3-tienilo, cicloalquilo-(C4-C7) , cicloalquil-(C4-C6)-alquilo-(C-j^-Cg) ou

ou -C-R! em que R é alquilo-(04-04) , hidroxilo, -N3, halogénio (F, Cl, Br, I) , CF3 ou alcooxilo-(Cx-C,}) , uéO, 1, 2 ou 3, e R7, R8 e R9, independentemente uns dos outros, podem ser metilo, etilo, propilo, fenilo ou benzilo, em que não mais do que dois dos substituintes podem ser ao mesmo tempo fenilo ou benzilo; R4 significa (a) alcenilo ramificado ou não ramificado com 3 a 6 átomos de carbono, que pode estar substituído por fenilo, ou (b) alcinilo ramificado ou não ramificado com 3 a 6 átomos de carbono, que pode estar substituído por fenilo, ou (c) alquilo ramificado ou não ramificado com 1-13 átomos de carbono, em que o grupo alquilo pode estar substituído por 2

J

J

L·, ^ hidroxilo, alcooxilo-(C2-C4), di-alquil-(02-04) -amino, furilo, piridilo, pirrolidinilo, N-metilpirrolidinilo, morfolino, indolilo, nitrilo, tienilo, adamantilo, ciclo-hexilo, fenoxi, benziloxi, naftiloxi ou fenilo, em que este grupo fenilo ou o grupo fenilo contido no grupo fenoxi ou benziloxi pode estar substituído uma, duas ou três vezes por hidroxilo, alcooxilo-(C2-C4) , benziloxi, halogénio (F, Cl, Br, I), CF3, N3, N02, alquilo-(02-04) , adamantilo, -S02NH2, NHCOCH3, -NHS02CH3 ou -C(0)OR24 [em que R24 é cicloalquilo-(C3-C7) ou alquilo-(C2“C6) ramificado ou não ramificado, em que o grupo alquilo pode estar substituído uma a três vezes por fenilo, em que este grupo fenilo pode estar substituído por halogénio (F, Cl, Br, I), CF3, alquilo C2 ou C2, alcooxilo C2 ou c2] ou pode estar substituído pela ponte -0-CH2-0-, ou por dois grupos fenilo não substituídos; (d) 3 .3

em que R6 é alquilo-(¢^-04) , hidroxilo, N3, halogénio (F, Cl, Br, I), CF3, N02 ou alcooxilo-{Cx-C^} e v é 0, 1, 2 ou 3, ou aos respectivos sais com ácidos fisiologicamente toleráveis ou complexantes.

Os compostos de fórmula I formam tautómeros de fórmula II

4

V &- tl

U t

Os tautómeros são separáveis de acordo com métodos conhecidos, por exemplo por cromatografia em coluna ou por redução selectiva (NaBH4 ou redução catalítica).

Os compostos de fórmula II podem existir nas formas cis e/ou trans:

II

Quando a estrutura de um composto não for expressamente indicada, a referência à fórmula I deve entender-se como abrangendo também a fórmula II.

Nas definições utilizadas no texto os substituintes e grupos podem ser iguais ou diferentes, isto é quando um dos substituintes já mencionados aparecer várias vezes numa determinada molécula, o respectivo significado pode ser escolhido livremente no âmbito da gama de definição.

Por alquilo entendem-se em especial grupos alquilo-(C^-Cg) e -(C1-C4) que por sua vez podem estar substituídos ou que são componentes alquílicas de um grupo funcional como alcooxi ou alquiltio. Os grupos alquilo incluem os grupos metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, tert-butilo, bem como os vários grupos alquilo isoméricos pentilo e hexilo, como por exemplo os grupos isopentilo, neopentilo, n- pentilo e n-hexilo.

Os halogénios são flúor, cloro, bromo e iodo, de preferência flúor, cloro e bromo e em segundo lugar iodo.

Cicloalquilos-(C3-C7) são ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclo-hexano e ciclo-heptano.

Alcinos-(C3-C6) são os hexinos, pentinos e butinos isoméricos e propino, preferindo-se o propargil. 5 V τ Λ

Alcenos-(03-05) são os hexenos, pentenos e butenos isoméricos e propeno, preferindo-se o alilo.

Um aspecto preferencial da invenção são compostos de fórmula geral I, em que A significa benzo; m é 2 (em que os dois substituintes R2 estão de preferência nas posições 6 e 7) e os substituintes R2, independentemente um do outro, significam hidroxilo, alcooxilo-(Ci-C4), benziloxi, halogénio (F, Cl, Br, I) ou alquilo-(C3-C4) , ou dois substituintes R2 vizinhos formam em conjunto -0-CH2-0-; B significa o grupo -0-, -S- ou -CHR5, em que R5 é hidrogénio, metilo, fenilo ou benzilo; R3 significa 2- ou 3-tienilo, cicloalquilo-(C4-C7) ou

em que R é alquilo-(03-04) , halogénio (F, Cl, Br, I), CF3 ou alcooxilo-(C!-C4), u é 0, 1, 2 ou 3, e R7, R8 e R9, independentemente uns dos outros, podem ser metilo, etilo, propilo, fenilo ou benzilo, em que não mais do que dois dos substituintes podem ser ao mesmo tempo fenilo ou benzilo; R4 é (a) alcenilo ramificado ou não ramificado com 3 a 6 átomos de carbono, que pode estar substituído por fenilo, ou (b) alcinilo ramificado ou não ramificado com 3 a 6 átomos de carbono, que pode estar substituído por fenilo, ou (c) alquilo ramificado ou não ramificado com 1 a 13 átomos de carbono, em que o grupo alquilo pode estar substituído por tienilo, adamantilo, ciclo-hexilo, fenoxi, benziloxi, ou fenilo, 6 (em que este grupo fenilo ou o grupo fenilo contido no grupo fenoxi ou benziloxi pode estar substituído uma, duas ou três vezes por alcooxilo-(C]_-C4) , halogénio (F, Cl, Br, I), CF3, N3, N02, alquilo- (^-04) ou -C (0) -0- (CH2 ) i-3"CH3 ou pela ponte -0-CH2-0-), ou por dois grupos fenilo não substituídos; (d) é /~~Λ -N _ N-(CH2)0, 1

y—s- -c- s em que R6 é alquilo-(C1-C4) , hidroxilo, N3, halogénio (F, Cl, Br, I), CF3, N02 ou alcooxilo-(C1-C4) e v é 0, 1, 2 ou 3, ou os respectivos sais com ácidos fisiologicamente toleráveis ou complexantes.

De entre os compostos de fórmula I, em que A é benzo, preferem-se aqueles em que m é 2 e os dois grupos R2, 7 independentemente um do outro, são metoxi, hidroxilo, benziloxi, metilo ou cloro ou formam em conjunto -0CH20-, em que os dois grupos R2 se encontram nas posições 6 e 7, em especial os compostos em que R2 é metoxi, hidroxilo, benziloxi ou metilo, em particular aqueles em que os dois grupos R2 são iguais e significam hidroxilo ou metoxi. São de destacar os compostos de fórmula I, em que R4 tem um dos seguintes significados: (a) vinilo, de preferência substituído por fenilo; (b) alquilo não substituído com 4 a 9 átomos de carbono que, caso seja ramificado, pode conter metilo como cadeia ou cadeias laterais; (c) alquilo substituído com 1 a 4 (de preferência 2 ou 3) átomos de carbono que, caso seja ramificado, pode conter um grupo metilo como cadeia lateral, em que o grupo alquilo pode estar substituído por um ou dois grupos fenilo, fenoxi, benziloxi, tienilo (de preferência 3-tienilo), ciclo-hexilo ou 1- ou 2-adamantilo, em que, quando o grupo alquilo está substituído por um grupo fenilo ou por fenoxi ou benziloxi, o grupo fenilo em causa pode estar substituído por metilo, metoxi (1 a 3 grupos metoxi),

Cl, Br, BF3, N02 ou C(0)0(CH2)3CH3 8

em especial aqueles em que R4 tem um dos seguintes significados: (a) alquilo-(C4-C7) ; (b) alquilo substituído com 1 a 4 (de preferência 2 ou 3) átomos de carbono que, caso seja ramificado, pode conter um grupo metilo como cadeia lateral, em que o grupo alquilo pode estar substituído por um ou dois grupos fenilo, fenoxi, benziloxi, tienilo (de preferência 3-tienilo) ou ciclo-hexilo, em que, quando o grupo alquilo está substituído por um grupo fenoxi ou benziloxi ou, de preferência, por um grupo fenilo, o grupo fenilo em causa pode estar substituído por metoxi (1 a 3 grupos metoxi),

Cl, Br, BF3,

N02 OU C(0)0(CH2)3CH3; 9

São ainda de destacar os compostos de fórmula I, em que B é 0, S, CH2 ou C(CH3)H, de preferência aqueles em que B é 0. São também de realçar os compostos em que R3 é fenilo (que pode estar substituído 1, 2 ou 3 vezes por metoxi, halogénio ou CF3), ciclo-hexilo, tienilo ou tert-butilo, em especial os compostos em que R3 é fenilo, metoxifenilo, Cl-benzilo, di-Cl-benzilo ou ciclo-hexilo. São também de destacar os compostos em que R3 é tienilo (de preferência 3-tienilo) ou tert-butilo. São ainda de destacar os compostos em que A é benzo, que está substituído nas posições 6 e 7, em que os dois substituintes R2, independentemente um do outro, são metoxi, benziloxi, hidroxilo, metilo ou cloro, em especial em que R2 na posição 6 é metoxi, hidroxilo ou benziloxi e R2 na posição 7 é metoxi ou metilo, de preferência em que A é o grupo 6,7-dimetoxibenzo.

Preferem-se muito em especial os compostos em que R4 possui um dos seguintes significados 10 ch2—ch2—o

Br t ch2

ch2 CO —O (CH2) 3—ch3

CH2—CH—<( OCH,

CH CF, CH2- -CH, -CH,-

CH2-CH2-CH

Cl CH,- -CH, -CH.

(CH2)4-ch3 em especial aqueles em que B é O ou CH2 e A se define como acima, sendo de preferência 6,7-dimetoxibenzo. Dentro deste grupo de compostos preferem-se aqueles em que R3 é tert-butilo, tienilo ou de preferência fenilo ou ciclo-hexilo.

Os compostos de fórmula I podem preparar-se de acordo com processos em si conhecidos, de preferência de modo análogo aos métodos descritos no registos de patente alemão P 37 18 570.5 e nas EP 358 957, EP 37 934, EP 251 794 e EP 288 048.

Na presença de um agente de condensação pode ciclizar-se um composto de fórmula geral IV (R2)

4 H H 11 .¾

em que R2, R3, R4 e m se definem como acima e Ar significa fenilo, indolilo ou 2- ou 3-tienilo, obtendo-se os compostos correspondentes.

Como agentes de condensação para este processo são apropriados ácidos de Lewis fortes, como por exemplo oxicloreto de fósforo, pentacloreto de fósforo, tricloreto de fósforo, pentóxido de fósforo, tetracloreto de titânio, trifluoreto de boro, tetracloreto de estanho, e ainda ácidos inorgânicos, como por exemplo ácido polifosfórico, ácido sulfúrico, ácido fluorossulfónico e ácido fluoridrico, ou misturas destes agentes de condensação, como por exemplo uma mistura de oxicloreto de fósforo e pentacloreto de fósforo, ou uma mistura de pentacloreto de fósforo e ácidos alquilsulfónicos- (C1-C4) por exemplo com uma parte de P205 com cerca de 10% em peso. A ciclização pode efectuar-se na presença ou na ausência de um solvente. São adequados todos os solventes inertes, desde que apresentem uma solubilidade suficiente para os reagentes e possuam um ponto de ebulição suficientemente elevado, por exemplo benzeno, alquilbenzenos (por exemplo tolueno, xileno) , clorobenzenos, clorofórmio, acetonitrilo, decalina. Uma variante preferencial do processo consiste em utilizar como agente de condensação oxicloreto de fósforo em mistura com acetonitrilo ou uma mistura de ácidos alquilsulfónicos-(C1-C4) / pentóxido de fósforo, sem adição de solventes. A ciclização efectua-se de preferência com oxicloreto de fósforo / acetonitrilo ou em casos mais difíceis com uma mistura de pentóxido de fósforo e ácidos alquilsulfónicos-(¢^-04) (de preferência ácido metanossulfónico). A reacção pode realizar-se numa larga gama de temperaturas, de preferência aquecendo de 50°C até cerca do ponto de ebulição da mistura reaccional. 0 tempo de reacção necessário situa-se, conforme o composto de partida de fórmula IV, entre 2 e 15 horas. 12 y u, t

Compostos de partida:

Os éteres de fórmula geral IV podem preparar-se segundo os processos usuais descritos na literatura. Prefere-se a utilização do "método do mesilato" e do "método do brometo", de preferência do "método do mesilato". No processo preferencial é de ter em conta que na reacção se tem de prescindir da habitual adição de base, de modo a evitar a formação de produtos secundários não etéreos indesejados.

Os tioéteres de fórmula geral IV podem preparar-se segundo os processos usuais descritos na literatura. Prefere-se o "método do mesilato": reacção de um mercaptano com o mesilato da N-(2-(3,4-dimetoxifenil)etil)amida do ácido mandélico, num meio isento de solventes e de base, a 100°C.

Os alcanos de fórmula geral IV preparam-se por reacção dos ácidos 2-fenilalquilcarboxílicos com 2-(3,4-dimetoxifenil)etilamina, obtendo-se as amidas de cadeia aberta (de preferência através do método do carbonildiimidazole).

Os compostos de fórmula I são bases e podem transformar-se nos aductos (sais) fisiologicamente toleráveis pretendidos, de modo usual, com ácidos inorgânicos ou orgânicos bem como com agentes complexantes ou formadores de sais. Ácidos adequados para a formação de sais são por exemplo os ácidos clorídrico, bromídrico, iodidrico, fluorídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, acético, propiónico, butírico, capróico, valérico, oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, láctico, tartárico, cítrico, málico, benzóico, p-hidroxibenzóico, ftálico, cinâmico, salicílico, ascórbico, metanossulfónico e semelhantes.

Os compostos podem administrar-se por via oral, parenteral ou tópica. A dose terapêutica desejada depende da indicação e da forma de administração e pode ser determinada experimentalmente. Formas de aplicação adequadas são por exemplo comprimidos, cápsulas, supositórios, soluções, sumos, emulsões, aerossois ou pós dispersáveis. Os comprimidos podem preparar-se por exemplo por mistura do ingrediente activo ou dos ingredientes activos com aditivos conhecidos, por exemplo diluentes inertes, como carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou lactose, agentes 13

V

desintegrantes, como amido de milho ou ácido algínico, agentes ligantes, como amido ou gelatina, lubrificantes, como estearato de magnésio ou talco, e/ou agentes para a obtenção do efeito de depósito, como carboxipolimetileno, carboximetilcelulose, ftalato de acetato de celulose ou acetato de polivinilo. Os comprimidos podem ser constituídos por várias camadas.

As drageias podem preparar-se por revestimento de núcleos preparados de modo análogo ao dos comprimidos, com agentes habitualmente usados no revestimento de drageias, por exemplo colóides, laca de conchas, goma arábica, talco, dióxido de titânio ou açúcar. Para a obtenção de um efeito de depósito ou para evitar incompatibilidades o núcleo pode também ser constituído por várias camadas. Do mesmo modo, o revestimento das drageias pode também ser constituído por várias camadas para a obtenção de um efeito de depósito, podendo empregar-se os aditivos referidos acima para os comprimidos.

Os sumos contendo ingredientes activos ou combinações de ingredientes activos de acordo com a invenção podem ainda conter adicionalmente um agente adoçante, como sacarina, ciclamato, glicerina ou açúcar, bem como um agente para melhorar o sabor, por exemplo aromatizantes, como vanilina ou extracto de laranja. Podem além disso conter aditivos de suspensão ou agentes espessantes, como carboximetilcelulose de sódio, agentes humectantes, por exemplo produtos de condensação de álcoois gordos com óxido de etileno, ou agentes de protecção, como p-hidroxibenzoatos.

As soluções injectáveis preparam-se de modo usual, por exemplo sob adição de agentes conservantes, como p-hidroxibenzoatos, ou estabilizadores, como sais alcalinos do ácido etilenodiaminotetraacético, e colocam-se em frascos ou ampolas para injecção.

As cápsulas contendo um ou mais ingredientes activos ou combinações de ingredientes activos podem preparar-se por exemplo encapsulando os ingredientes activos misturados com veículos inertes, como lactose ou sorbitol, em cápsulas de gelatina. 14 r~ L·, ^^

Os supositórios podem preparar-se por exemplo por mistura com os veículos para tal apropriados, como gorduras neutras ou polietilenoglicol ou os respectivos derivados.

Os compostos podem administrar-se tanto por via enteral como parenteral. Como doses para a aplicação oral propõem-se 0,1 a 500 mg de ingrediente activo por dose, para a aplicação intravenosa 0,05 a 150 mg por dose. A dose terapêutica desejada é dependente da indicação e da forma de administração e pode determinar-se experimentalmente.

Os medicamentos são adequados para administração oral ou parenteral e, conforme o caso, também tópica. Como formas medicamentosas empregam-se principalmente comprimidos, drageias, ampolas e preparações em sumo. A dose unitária nestas formas medicamentosas situa-se entre 1,0 e 200 mg, de preferência entre 20 e 50 mg por 75 kg de peso corporal. Conforme a gravidade da situação administram-se em geral diariamente 1 a 3 doses unitárias.

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar detalhadamente a invenção.

Exemplo 1: Ácido O-(3-fenilpropil)-fenilacético

Dissolvemrse 7,8 g (0,2 Mol) de potássio em 136 g (1 Mol) de 3-fenil-l-propanol por aquecimento a 100°C e após arrefecimento até à temperatura ambiente mistura-se gota a gota com uma solução de 21,5 g (0,1 Mol) de ácido a-bromofenilacético em 20 ml de 3-fenil-l-propanol.

Após 2,5 horas de aquecimento a 110°C adicionam-se à temperatura ambiente 500 ml de éter dietílico e extrai-se a solução 3 vezes com 100 ml de água de cada vez. Os extractos aquosos reunidos acidificam-se sob arrefecimento em gelo com 30 ml de HC1 4N; o óleo que se separa toma-se em éter, lava-se com 15

água e seca-se sobre MgS04. Após destilação do solvente obtêm-se 23,4 g (86,6% do rendimento teórico) do éter de ácido carboxilico pretendido na forma de um resíduo oleoso, que se pode utilizar sem mais purificação para a reacção seguinte. N-[2-(3,4-dimetoxifenil)etil]amida do ácido O-(3-fenilpropil)-fenilacético

Dissolvem-se 30,3 g (113 mMol) de ácido o-(3-fenilpropil)-fenilacético em 250 ml de tetra-hidrofurano absoluto, adicionam-se 18,14 g (112 mMol) de carbonildiimidazole e agita-se durante 2 horas à temperatura ambiente. A esta solução reaccional adicionam-se gota a gota, sob arrefecimento em gelo, 20,27 g (112 mMol) de 2-(3,4-dimetoxifenil)-etilamina em 50 ml de tetra-hidrofurano absoluto e continua a agitar-se durante mais 15 horas à temperatura ambiente. Em seguida, destila-se o solvente em vácuo, dissolve-se o resíduo em 250 ml de acetato de etilo, extrai-se 3 vezes com 100 ml de HC1 IN de cada vez, 2 vezes com 75 ml de uma solução saturada de NaHC03 de cada vez e 2 vezes com 50 ml de uma solução saturada de NaCl de cada vez. A solução de acetato de etilo seca-se sobre MgS04 e concentra-se em vácuo. O produto reaccional oleoso de 44,28 (91,3% do rendimento teórico) pode utilizar-se sem mais purificação. 16

Variante; N-[2-(3,4-dimetoxifenil)etil]amida do ácido mandélico

Aquecem-se 33,2 g (0,2 Mol) de éster metilico do ácido mandélico e 72 g (0,4 Mol) de 2-(3,4-dimetoxifenil)etilamina, sob uma atmosfera de N2 e agitação durante 5 horas a 160-165°C, com um refrigerante descendente (para remover o metanol que se vai libertando). O resíduo arrefecido dissolve-se em 300 ml de acetato de etilo, extrai-se 2 vezes com 100 ml de HCl 2N de cada vez, 1 vez com uma solução saturada de NaHC03 e com uma solução saturada de NaCl, seca-se sobre MgS04 e remove-se o solvente por destilação. O resíduo cristalino dissolve-se em 200 ml de acetato de etilo e precipita-se o produto da reacção com adição de 160 ml de n-hexano.

Rendimento: 51,2 g (80,95% do teórico); P.f.: 89-91°C. N-[2-(3,4-dimetoxifenil)etilamida do ácido O-mesilmandélico

A uma solução de 19,6 g (62,2 mMol) de N-[2-(3,4-dimetoxifenil)etil]amida do ácido mandélico em 60 ml de piridina absoluta adicionam-se gota a gota, sob agitação e arrefecimento, 7,8 g (69 mraol) de cloreto do ácido metanossulfónico, mantendo-se a solução reaccional a -5 a -15°C. Após 5 horas de agitação à temperatura ambiente adicionam-se 200 g de gelo e acidifica-se 17

sob arrefecimento em gelo com 180 ml de HC1 4N. A solução ácida extrai-se 2 vezes com 400 ml de acetato de etilo de cada vez e lava-se a fase orgânica 2 vezes com 60 ml de H20 de cada vez e 2 vezes com uma solução saturada de NaHC03, seca-se sobre MgS04 e destila-se o solvente em vácuo. O resíduo cristalino precipita-se com 100 ml de acetato de etilo e 50 ml de n-heptano, obtendo-se 16,3 g (66,6% do rendimento teórico) de produto reaccional de P.f. 89-90°C. N-[2-(3,4-dimetoxifenil)etil]amida do ácido O-(3-fenilpropil)-fenilacético

Dissolvem-se 1,95 g (5 mMol) de N-[2—(3,4— dimetoxifenil)etilamida do ácido O-mesilmandélico em 3,4 g (25 mMol) de 3-fenil-l-propanol e aquece-se durante 30 min. sob agitação a 100°C. Após arrefecimento até à temperatura ambiente dissolve-se o produto reaccional em 100 ml de acetato de etilo, lava-se 2 vezes com uma solução saturada de NaHC03 e 1 vez com uma solução de NaCl, seca-se sobre MgS04 e destila-se o solvente em vácuo. 0 produto reaccional oleoso purifica-se por cromatografia numa coluna de sílica gel com acetato de etilo / n-heptano 1:1, obtendo-se assim 1,54 g (71,5% do rendimento teórico) do éter pretendido na forma de um óleo. 18

t Éter (R, S) - (3,4-di-hidro-6,7-dim.etoxiisoquinolino-l-il) -2-fenil-2- (3-fenilpropílico)

Aquece-se uma solução de 44,28 g (102,3 mMol) de N-[2-(3,4-dimetoxifen.il) etil] amida do ácido 0-(3-fenilpropil)-fenilacético e 46, 93 g (307 mMol) de oxicloreto de fósforo em 300 ml de acetonitrilo, durante uma hora em atmosfera de N2 à ebulição sob refluxo. Após arrefecimento até à temperatura ambiente dissolve-se a mistura reaccional em 1 1 de acetato de etilo, lava-se 2 vezes com 150 ml de água gelada de cada vez, 3 vezes com 150 ml de uma solução saturada de NaHC03 de cada vez e 2 vezes com 100 ml de uma solução saturada de NaCl de cada vez, seca-se sobre MgS04 e destila-se o solvente em vácuo. Dissolve-se o resíduo em 110 ml de acetona e acidifica-se, sob agitação e arrefecimento em gelo, com HC1 etéreo, cristalizando 17,6 g (38,68% do rendimento teórico) de produto reaccional pretendido na forma de cloridrato; P.f.; 176-178°C.

Exemplo 2: N-[2-(3,4-dimetoxifenil)etil]amida do ácido S-(3-fenilpropil)-fenilacético

+ HS-ÍCH2)-j ^ ^

s—<ch2; 3·

Aquecem-se 3,93 g (10 mMol) de N—[2—(3,4— dimetoxifenil) etil] amida do ácido mandélico e 4,56 g (30 mMol) de 3-fenil-n-propilmercaptano, durante 30 min. sob agitação a 100°C. 0 produto reaccional arrefecido dissolve-se em 100 ml de acetato de etilo, lava-se 2 vezes com 20 ml de uma solução 19 L--- saturada de NaHC03 de cada vez e 1 vez com uma solução saturada de NaCl. Após secagem sobre MgS04 remove-se o solvente por destilação em vácuo. 0 resíduo oleoso purifica-se por cromatografia numa coluna de sílica gel com acetato de etilo / n-heptano 1:1 como eluente.

Rendimento: 2,55 g (56,8% do teórico).

Tioéter_(R, S) - (3,4-di-hidro-6, 7-dimetoxiisoquinolino-l-il·) -2- fenil-2-(3-fenilpropílico)

Aguecem-se 2,55 g (5,67 mMol) de N-[2-(3,4-dimetoxifenil)etil]amida do ácido S-(3-fenilpropil)-fenilacético e 2,6 g (17 mMol) de oxicloreto de fósforo, em 35 ml de acetonitrilo durante 1,5 horas sob atmosfera de N2 e agitação a 100°C. Mistura-se a solução reaccional à temperatura ambiente com 125 ml de acetato de etilo, lava-se 3 vezes com 25 ml de água gelada de cada vez, 3 vezes com 25 ml de uma solução saturada de NaHC03 de cada vez e 1 vez com uma solução saturada de NaCl e seca-se sobre MgS04.

Após destilação da fase orgânica em vácuo, purifica-se o resíduo oleoso numa coluna de sílica gel com acetato de etilo como eluente, obtendo-se 1,18 g do produto reaccional pretendido na forma amorfa. 20

V d

Exemplo 3: Ν-[2-(3/4-dimetoxifenil)etil]amida do ácido 2,5-fifenilpentano-carboxílico CH-0

CH ,0

Agita-se uma solução de 3,0 g (11,8 mMol) de ácido 2,5-difenilpentanocarboxílico e 1/91 g (11,8 mMol) de carbonildiimidazole, durante 1 hora à temperatura ambiente e mistura-se em seguida com uma solução de 2,13 g (11,8 mMol) de 2-(3,4-dimetiletoxifenil)etilamina em 20 ml de tetra-hidrofurano, continua a agitar-se durante a noite à temperatura ambiente e após destilação do solvente dissolve-se o resíduo em acetato de etilo. Lava-se a fase orgânica 2 vezes com 15 ml de HC1 IN de cada vez, 2 vezes com 20 ml de uma solução saturada de NaHC03 de cada vez e finalmente com uma solução saturada de NaCl. Após secagem sobre MgS04 e remoção do solvente por destilação obtêm-se 4,9 g (100% do rendimento teórico) do produto final pretendido, que se utiliza na forma de óleo para o passo seguinte sem mais purificação. (R,S)-(3,4-di-hidro-6,7-dimetoxiisoquinolino-l-il)-1,4-difenilbutano

Aquece-se à ebulição a refluxo uma solução de 4,9 g (11,75 mMol) de N-[2-(3,4-dimetoxifenil)etil]amida do ácido 2,5-difenilpentanocarboxílico e 5,39 g (35,2 mMol) de oxicloreto de 21

fósforo em 40 ml de acetonitrilo absoluto durante 1,5 horas sob atmosfera de N2 e agitação. Dilui-se a solução reaccional com 150 ml de acetato de etilo e lava-se sucessivamente 2 vezes com 40 ml de água gelada de cada vez, 3 vezes com 30 ml de uma solução saturada de NaHC03 de cada vez e com uma solução saturada de NaCl e seca-se a fase orgânica sobre MgS04. Após destilação do solvente em vácuo dissolve-se o resíduo oleoso em acetona a acidifica-se com ácido clorídrico etéreo. 0 produto reaccional pretendido precipita assim na forma de uma substância sólida amorfa como sal com HCl.

Rendimento: 2,6 g (50,8% do teórico).

As tabelas seguintes resumem exemplos de compostos de acordo com a invenção. A preparação destes compostos pode efectuar-se de modo análogo ao dos processos acima descritos.

Tabela 1: N° Rn OCH-: OCHn *2 0CH3 OCHo

R3 r4 c6h5 c6h5

ρ, f. °C Forma de sal amorfo OX αή

142-145 OX

3 och3 och3 c6Hs 165-168 CL 4 och3 och3 C6h5 —o 176-178 CL 5 och3 och3 c6h5 CHS—CH,—CH*-CHj-^ ^ 56-60 OX 22 6 OCH3 OCH3 C6H5 CK, ^===^

112-114 OX OCH: OCH: C6H5 CH,-CH—CH. L ‘ 8 OCH- OCH' c6H5

CH,-CH,-CH I CH OCH: OCH: c6H5 10 OCH: OCH: c6h5

123-126 CL

CH,-CK,-CH

11 OCH: OCH: c6h5 OCH,

70-80 OX 12 OCH: OCH:

C«H 6n5

amorfo CL CH.. — CH,-Cll. 13 OCH: OCH: C6H5

amorfo OX CHj-CHj---CHj--if >-OCH. 14 OCH: OCH: 15 OCH: OCH·:

CH, —CH, CH,-^

amorfo OX 16 OCH: OCH: c6h5

amorfo OX 23 17 OCH3 OCH3 CgH5

18 OCH' OCH' c6h5 c^—ckz—í y—ci 19 OCH' OCH'

CKH 6h5 CHj—CH2 CH,-\ y-Cl 20 OCH' OCH' c6H5 CH2—CH,-CH.- 21 OCH' OCH3 22 och3 OCH3

CH--CH,-CH. CH--CH„—CH. 23 OCH3 OCH- c6H5

LA

24 OCH3 OCHc c6h5

25 OCHc OCH-

CcH 6n5 CH2-CH.-< y-Cr j 26 OCHi och3 c6h5 CH,—CH,-CH. CF3 '<5 27 OCH3 OCH3 C5H5 /

NO,

U

141-143 OX

143-145 MA 75

OX

139-142 OX

159-163 OX

108-110 CL

amo r f o OX

138-140 OX 24 *· É 28 OCH' OCH·:

CcH 6n5 29 OCH3 och3 c6h5

30 OCH' OCH' c6h5 no2 31 OCH3 OCH' c6h5 32 OCH3 OCH3 C6H5 33 OCH^ OCH'

CsH 6n5 34 OCH3 OCH3 CgH5

35 OCH- OCH'

CcH 6n5

36 OCH' OCH' c6h5 CH,-CH.

120-122 MA 37 OCH' OCH' c6h5

-OO 80-100 OX (decomposição) 38 OCH' OCH'

CcH 6n5 25 39 OCH' OCH' c6h5 Γ - L·. ^ t 50-75 OX (decomposição) 40 OCH< OCH' c6h5 41 OCH' OCH'

C«H 6n5 6°-80 1 ^==/ (decompo sição)

OX 42 OCH3 OCH' C6h5

43 OCH- OCH'

CSH 6n5 • -CH,—CH,—CH,—CH,

amorfo OX 44 OCH' OCH'

C^H 6n5 b

amorfo OX 45 OCH' OCH'

C«H 6n5

4 6 OCH·; OCH' c6h5 60-70 (decomposição ) 124-127

OX

OX 47 OCH' OCH' c6h5 48 OCH' OCH'

50 OH OCH'

CSH 6n5 51 och3 c6h5

52 OH CH'

CcH 6n5

CH2 CHj—( H

145-147 OX 138-140 OX 65-80 (decomposição ) amorfo

OX

OX 75-120 OX (decomposição) 26 P U, ^

ι J t

58 och3 och3 c6*5 amorfo CL 59 och3 och3 c6h5 CH,-CH.,—CH,—CH, ?. í. Δ. 3 60 och3 och3 C6H5 ch.—ch2—CK2—ch2—ch3 105-110 OX 61 och3 och3 c6h5 ch2—ch2—ch2—ch2—ch2—CHj 82-85 OX 62 och3 och3 c6H5 CH,-CHZ-CHj-CH2-CH2—CK2—CK3 96-100 OX 63 och3 och3 c6h5 CH,-CHS—CH,—CH,—CH,—CH,—CH,—CU3 60-65 OX 64 och3 och3 c6h5 . CH..-CH —CH.,—CH,.—Chu ' 1 ' ~60 OX CH. (decompo- sição) 65 och3 och3 C6H5 Ch:2-CH2-ψ—CH2~CH3 CH, 66 och3 och3 c6H5 CH,-CH,-CH.-CH—CH, 1. CH, 67 och3 och3 c6H5 CH-1 ' 150-152 OX 1 CH,-C-CH, 1 1 CH3 68 och3 och3 c6h5 ÇP 105-110 OX CH,-CH,-C—CH, <£. έ ι ·1 CH, -> 27 V •f f:

69 OCH3 OCH3 c6h5 70 OCH3 OCH3 c6h5 71 OCH3 OCH3 c6H5 72 OCH3 OCH3 c6h5 73 OCH3 OCH3 c6h5 74a OCH3 OCH3 c6H5 CH,-CH,-CH, C—CH,

I CH,

CH2—CH2—1-ada.T.antar.o 155-150 OX CH2 —C H2 —2 -«dama n ta nc CH2-CH2-CH2—1. -adanantano CH2 Cfi2 —CH2~“2-ada;nantanc

Tabela 2:

N° R1 r2 r3 74 OCH3 OCH3 c6H5 75 OCH3 OCH3 c6H5 76 OCH3 OCH3 c6h5 77 OCH3 OCH3 c6»5 78 OCH3 OCH3 c6H5 79 OH OCH3 c6h5 R4 P.F. °C Forma de sal

28

29 ! I !

89 och3 och3 90 och3 och3 91 och3 och3 92 och3 och3 93 och3 och3 94 och3 och3 95 och3 och3 96 och3 och3 97 och3 och3 98 och3 och3 99 och3 och3 100 och3 och3 101 och3 och3 102 och3 och3 103 OH och3 104 OH och3

30 * 105 OH ch3 106 OH ch3 107 OH ch3 108 OH ch3 109 OH Cl 110 OH Cl 111 OH Cl 112 OH Cl 113 och3 och3 114 och3 och3 115 och3 och3 116 oh och3 117 och3 och3 118 och3 och3 119 och3 och3 120 och3 och3

-Η2—CK2—ch2—f \

96-100 r u 121 och3 och3 c6H5 ch2—(CH2) 6—ch3 amorfo ox 122 och3 och3 c6h5 CH2-(CH2) g—ch3 45-53 ox (decompo- sição) 123 och3 och3 c6h5 CH2—CH-—CH2—1-adamantino 124 och3 och3 c6H5 CH2—CH2—1-adamantano 156-159 ox 125 och3 och3 c6h5 ch2—(CH2) :0-ch3 amorfo ox 126 och3 och3 c6h5 CH,-CH—CH, 1 178-180 CL 1 CH, 127 och3 och3 C6H5 /CH3 198-202 Cl CH„-CH,—CH " 2 N CH3 128 och3 och3 C6h5 ch2-CH2—ch3 144-147 ox 129 och3 och3 0 121-124 ox É também objectivo da presente invenção a utilização destes novos compostos.

Os compostos são vantajosos para o tratamento de doenças degenerativas e necrotizantes do cérebro. Também é possível o tratamento profilático de pacientes que sofram dessas doenças. Este efeito dos compostos não tem a ver com uma melhoria da irrigação dos tecidos. Os compostos são por isso adequados para um novo tipo de tratamento da epilepsia e da doença de Alzheimer, e em especial para o tratamento de pacientes que tenham sofrido um ataque cardíaco ou que estejam em risco de o vir a sofrer.

Um outro objectivo da presente invenção é a utilização dos referidos compostos para a preparação de agentes para o tratamento de processos inflamatórios crónicos, da colite ulcerosa e da doença de Morbus Crohn e de agentes com efeito antiproliferativo. 0 efeito dos compostos pode demonstrar-se pela sua inibição dos canais catiónicos não selectivos (CCNS). 32

V

A patofisiologia da asma brônquica crónica assenta em processos inflamatórios, que são mediados pela activação de células inflamatórias (BARNRS, 1987; SEIFERT e SCHULTZ, 1991). A activação regulada por receptores de células inflamatórias (por exemplo granulócitos neutrófilos e células do recto ou as respectivas linhas celulares permanentes células HL-60 ou células RBL sensibilizadas, isto é, carregadas com gamaglobulina E) é inibida, independentemente do tipo dos agonistas estimulantes (por exemplo endotelina, PAF, leucotrienos, péptido fMLP quemotactico ou antigene contra células do recto sensibilizadas) , por bloqueadores dos canais catiónicos não selectivos (CCNS) (RINK, 1990). Através destes canais o cálcio extracelular entra nas células, sendo necessário para a persistência das activação celulares mediadas pelo receptor (PUTNEY, 1990). Se este fornecimento de cálcio for interrompido resulta um bloqueamento da activação das células inflamatórias.

Os antagonistas do cálcio clássicos do tipo di-hidropiridina ou fenilalaquilamina não inibem nem os CCNS nem os processos inflamatórios (WELLS et al., 1986).

Como medida da activação celular ou como medida da respectiva inibição pelos bloqueadores CCNS quantifica-se fluorometricamente a cinética da concentração dos iões cálcio no citoplasma em células carregadas com Fura-2, de acordo com o método descrito por GRYNKIEWICZ et al. (1985). Este modo de proceder revelou-se fiável no âmbito da invenção como método de "screening" para detectar bloqueadores de CCNS.

Para a caracterização especifica de bloqueadores dos canais catiónicos não selectivos é apropriada a chamada inibição de TAPSIGARGINA funcional. A TAPSIGARGINA é um promotor tumoral descrito por THASTRUP et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 87, 2466-2470, 1990), que inibe de forma selectiva e irreversível a Ca2+ATPase do armazenador intracelular sensitivo ao IP3 do Ca2+. Em consequência disto ocorre um rápido esgotamento dos armazenadores de Ca2+. Como descrito por J. PUTNEY (Calcium, 11, 611-624, 1990) o esvaziamento destes armazenadores representam a excitação fisiológica para a abertura de canais catiónicos não 33

V

selectivos na membrana celular. 0 resultado é uma entrada massiva de Na+ e Ca2+ na célula. Devido a estas propriedades, a tapsigargina é adequada como estimulador indirecto da abertura de canais catiónicos não selectivos independentes de agonistas e de IP3.

No âmbito da presente invenção efectuou-se com sucesso a estimulação por tapsigargina de canais catiónicos não selectivos em células HL-60 (células de leucemia humana), em células do hipocampo e em células neuronais corticais, bem como em células RBL (células do linfoma basofílico de ratazana), identificando-se assim a existência destes canais nas linhas celulares respectivas. A concentração de Ca2+ no citoplasma ([Ca2+]j_) desempenha um papel importante na proliferação celular e no crescimento de tumores (para revisão ver L.R. ZACHARSKI, Journal of Medicine 19: 145-177, 1988) . Em particular, a entrada de Ca2+ na célula estimulada pela activação dos receptores com consequente mediação de trifosfato de inositol (IP3) é de importância decisiva para a proliferação celular oncogénica (U. KIKKAWA e Y. NISHIZUKA, Ann. REV. CELL. BIOL. 2: 149-178, 1986). Este mecanismo desempenha também um papel na formação de metastases e na "Multi-Drug-Resistende" (para revisão ver a publicação acima mencionada de L.R. ZACHARSKI), J. MED. 19: 145-177, 1980.

Esta hipótese é apoiada pelo facto de a tapsigargina, como estimulador indirecto dos canais catiónicos não selectivos (CCNS), levar tanto a um excesso de Ca2+ na célula, como também ser um promotor tumoral altamente eficaz (V. THASTRUP et al. Proceedings of the Natl. Acad. Sei. (USA) 87: 2466-2470, 1990). O bloqueamento da entrada de Ca2+ através dos CCNS leva a uma normalização da concentração de iões Ca intracelular e, por isso, a uma inibição do crescimento dos tumores, etc.

Os antagonistas do cálcio clássicos não inibem estes CCNS. Verificou-se surpreendente que os compostos de acordo com esta invenção inibem a entrada de cálcio na célula através dos CCNS.

Como demonstrado por S.H. MURCH et al. (Lancet 339: 381-385, 15 Fev. 1992), a endotelina I desempenha um papel patofisiológico importante em. doenças inflamatórias do intestino 34

Ll ^^ como a colite ulcerosa e a doença de Morbus Crohn. Por meio de métodos imuno-histoquímicos pôde verificar-se que doentes com M. Crohn na região da submucosa e pacientes com colite ulcerosa na região da lâmina própria do epitélio do intestino delgado apresentam concentrações de endotelina I fortemente aumentadas em comparação com pessoas saudáveis. Admite-se que a acumulação local de endotelina provoca espasmos massivos dos vasos com consequente isquémia disseminada com microinfartes, que se podem considerar a causa real das doenças referidas. A efectividade vaso-espasmogénica da endotelina comprova-se com uma sobrecarga de Ca2+ de miócitos vasculares. Nesse caso, a endotelina desencadeia primariamente uma libertação de Ca2+ intracelular mediada por IP3, à qual se segue uma entrada massiva de Ca2 + transmembranal através de canais insensitivos à di-hidropiridina (M.S. Simson et al., Clin. Invest. Med. 14: 499-507, 1991; T. Masaki, J. Cardiovasc. Pharmacol. 100: 383-392, 1990). Estes canais são canais catiónicos não selectivos, cuja existência também nas células da mucosa do intestino grosso foi há pouco descrita (Chr. Siemer e H. Gõgelin, Europ. J. Physiol. 420: 319-338, 1992).

Como modelo de "screening" adequado para detectar antagonistas funcionais da endotelina revelou-se a activação estimulada pela endotelina de células de leucemia humana (células HL 60) carregadas com Fura-2. Segundo G. GRYNKIEWICZ et al. (J. Biol. Chem. 260: 340-345) pode seguir-se por espectrofluorometria a concentração de Ca2+ intracelular no citoplasma de células HL 60 (suspensões) e quantificar-se como medida da activação celular pela endotelina. A estimulação efectuou-se por adição de endotelina 0,1 rnM e inibiu-se pelas substâncias de acordo com a invenção de forma dependente da dose. O antagonismo funcional à endotelina das substâncias de acordo com a invenção é mediado por um bloqueamento dos canais catiónicos não selectivos. Por isso, a identificação de um antagonismo funcional à tapsigargina em células RBL-hml é também adequada como método de "screening" para antagonistas funcionais da endotelina. 35

Execução dos testes:

Para fins de "screening" estimulam-se, num meio de incubação isento de Ca2+, células RBL-hml adesivas carregadas com Fura-2, com tapsigargina 0,1 μΜ. Após 4 minutos restitui-se o Ca2+ extracelular a 1,5 mM e, com base na fluorescência do Fura-2, regista-se a subida adicional da concentração de Ca2+ citoplasmática em consequência de uma entrada massiva de Ca2+ transmembranal pelos canais catiónicos não selectivos.

Esta entrada é exclusivamente inibivel, de forma dependente da dose, por bloqueadores dos canais catiónicos não selectivos. Nem os antagonistas do cálcio clássicos nem os bloqueadores específicos dos agonistas que estimulam o "turnover" de ΙΡ3, conseguem inibir a entrada de Ca2+ transmembranal provocada indirectamente pela tapsigargina. Os compostos de acordo com a presente invenção distinguem-se por inibir os CCNS. A determinação fluorométrica de cálcio no citoplasma de células RBL-hml aderentes isoladas efectua-se de modo análogo ao método descrito por KUDO e OGURA (1986) para células neuronais. Utiliza-se um microscópio de fluorescência AXIOVERT 35 da firma ZEISS em combinação com um sistema de "imaging" da firma HAMAMATSU, constituído pelo sistema de tratamento de imagem ICMS, câmara de luz residual com unidade de controle e amplificador de imagem DVS 3000. A cinética da concentração de Ca2+ citoplasmática regista-se continuamente como curva de concentrações-tempo após a activação celular estimulada pela tapsigargina (0,1 μΜ) . Comparam-se as curvas de duas culturas celulares activadas na presença e na ausência de 10 μΜ da substância a testar. A superfície sob estas curvas (área sob a curva = ASC) integra-se e regista-se como medida da activação celular. A eficácia inibitória dos bloqueadores de CCNS testados calcula-se com base na seguinte equação: %I = 100 - (ASCinh X 100) / (ASC (controle) ) 36

V

%Ι = inibição percentual da entrada de cálcio através dos canais catiónicos não selectivos que é estimulada e inibida por 10 μΜ da substância testada. ASCinh = área sob a curva registada na presença do estimulante mais 10 μΜ da substância inibitória testada.

Asc (controle) = área sob a curva registada após a adição do estimulante.

Literatura referente aos dados anteriores:

BARNES P.J., I.W. RODGER e N.C. THOMSON

Pathogenesis os asthma, em "ASTHMA, basic mechanisms and clinicai management"

Ed. por P.J. BARNES; ACADEMIC PRESS, LONDON, 1988 GRYNKIEWICZ G., Μ. POENIE e R.Y. TSIEN A new generation of Ca2+-indicators with greatly improved fluorescence propereties J. BIOL. CHEM. 260: 3440-3450, 1985

HIDE M. e M.A. BEAVEN

Calcium influx in a rat mastcell (RBL-2H3) line J. BIOL. CHEM. 266: 15221-15229, 1991

KUDO Y. e A. OGURA

Glutamate-induced increase in intracellular Ca2+-concentration in isolated hippocampal neurones BR. J. PHARMACOL. 89: 191-198, 1986 PUTNEY J.W. Jr.

Capacitative calcium entry revised CELL CALCIUM 11: 611-624, 1990 RINK T.J.

Receptor-mediated calcium entry FEBS LETT. 268: 381-385, 1990 37 r d

SEIFERT R. e G. SCHULTZ

The superoxide forming NADPH oxidase of phagocitose: An enzym system regulated by multiple mechanism REV. PHYSIOL. BIOCHEM. PHARACOL., Vol. 117, SPRINGER VERL., 1991 WELLS E., C.G. JACKSON, S.T. HARPER, J. MANN e R.P. EAOY Characterization of primate bronchovascular mast cells II, inhibition of histamine, LTC4 and PGF2a release from primate bronchoalveolar mast cells and a comparison with rat peritoneal mast cells J. IMMUNOL. 137: 3941-3945, 1986.

Resultados das determinações:

Indica-se a inibição percentual dos CCNS após estimulação por tapsigargina (0,1 μΜ de tapsigargina) em células RBL-hml. A concentração unitária da substância a testar é 10"5 Mol.

Com base nos testes seguintes pode comprovar-se a eficácia antiinflamatória funcional.

Utilizam-se células RBL-2H3 aderentes a placas de vidro (uma linha celular de tumor aparentada com as células do recto). A cultura e aderência das células RB1-2H3 efectua-se segundo o método descrito por HIDE e BEAVEN (1991) . Para a sensibilização das células RBL-2H3 aderentes incubam-se as células durante 2 horas à temperatura ambiente com uma solução de gamaglobulina E comercial diluída a 1:2000 com um complexo de dinitrofenol - albumina de soro bovino (antigene DNP-BSA). Em seguida lavam-se as células. Por adição de 0,1 ml de solução de DNP-BSA (10 μg/ml) ocorre uma activação celular imunológica massiva, que é mediada por um excesso de Ca2+ citoplasmático. A medição fluorométrica do cálcio no citoplasma de células RBL-2H3 aderentes isoladas efectua-se de modo análogo ao do método descrito por KUDO e OGURA (1996) para células neuronais, que aliás também se ilustra nesta memória descritiva. 38

Como substância de comparação utiliza-se nestes testes cromoglicato (10 μΜ) , que promove uma inibição de cerca de 50% da activação celular induzida pelo antigene.

Neste teste, os compostos acima mencionados apresentam valores de %I comparáveis aos valores acima referidos.

Em ensaios efectuados em microculturas de várias linhas tumorais humanas, por meio do teste do tetrazólio para a determinação do efeito antiproliferativo das substâncias de acordo com a invenção, verificou-se surpreendentemente que os compostos testados são 5 a 100 vezes mais eficazes do que a substância de comparação verapamil. A eficácia antiproliferativa das substâncias testadas determinou-se por meio do teste MTT (MTT = brometo de [3-(4,5-dimetiltiazolo-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] da firma CHEMICON Inc. EI Segundo, Ca. USA) descrito por MOSMAN (J. IMMUNOL. METH. 65: 55-63, 1983), DENIZOT et al. (J. IMMUNOL. METH. 89: 271-277, 1986) e J. ELIASON et al. (INT. J. CÂNCER 46: 113-117, 1990).

Este indicador é apenas metabolizado por células vivas com mitocôndrias intactas a um produto de formazano azul. Utilizaram-se neste teste as linhas tumorais humanas seguintes: A 549 (adenocarcinoma do pulmão), A 431 (carcinoma da epiderme da vulva), PC 3 (adenocarcinoma da próstata), SK BR 3 (adenocarcinoma da mama), HT 29 (CX1 1) (adenocarcinoma do cólon) e K 562 (células leucémicas mielóicas crónicas). O teste efectuou-se em placas de microtitulação. Em cada orifício colocou-se 100 ml de uma suspensão de células (0,2 x 106 células / ml). Como meio de incubação utilizou-se RPMI 1640 com 10% de soro de vitela fetal inactivado pelo calor e 50 μg/ml de gentamicina. Incubaram-se as suspensões de células durante 0, 24, 48 ou 72 horas em ar saturado de humidade numa mistura de C02 (5%) - ar (95%) a 37°C, na presença e na ausência de variadas concentrações de substâncias antiproliferativas a testar. As substâncias a testar dissolveram-se em DMSO (diluição final: 0,1%). Em seguida adicionaram-se 10 μΐ de solução MTT (3 mg/ml) e após 3 horas 100 ml de uma solução de isopropanol contendo HC1 0, 08N. Após mais uma hora mediu-se a absorpção de luz a 57 0 nm (comprimento de onda de comparação 630 nm) num 39

Lc, leitor de microplacas. A absorpção de luz é directamente proporcional ao número de células vivas. Metade da concentração máxima de inibição das substâncias testadas situava-se a 1 μ g/ml. A eficácia vasospasmolítica dos antagonistas funcionais acima mencionados endotelina ou tapsigargina acima mencionados comprovou-se em preparados de vasos isolados: em corações de ratazanas LANGENDORF batendo espontaneamente perfundidos em sentido retrógrado quantificou-se continuamente a perfusão coronária por meio de medição electromagnética de fluxo (aparelho de Hugo Sachs Elektronik, MARCH). Com este dispositivo puderam registar-se dimensão, duração e forme de ocorrência dos espasmos dos vasos com maior precisão. Se se perfundir com 100 nM de concentração de endotelina, reduz-se o fluxo de perfusão coronária de 11 para 5 ml/min. A diminuição de perfusão pode impedir-se com as substâncias de acordo com a invenção. A eficácia dos compostos de acordo com a invenção em relação à inibição por tapsigargina em células RBL-hml carregadas com Fura-2 ou a efectividade da inibição por endotelina em células HL 60 carregadas com Fura-2 correlacionou-se claramente com a eficácia vasospasmolítica das substâncias testadas verificada nos preparados de Langendorf. Pode concluir-se daqui que o antagonismo vasospsmolítico das substâncias testadas resulta de um bloqueamento dos canais catiónicos não selectivos. 40

Exemplos de aplicação farmacêutica a) Drageias 30.0 mg 100.0 mg 75.0 mg 3, 0 mg 2, 0 mg 210.0 mg 1 núcleo de drageia contém: ingrediente activo de fórmula geral I lactose amido de milho gelatina estearato de magnésio

Preparação

Granula-se a mistura da substância activa com lactose e amido de milho juntamente com uma solução aquosa de gelatina a 10%, através de um peneiro com 1 mm de malha, seca-se a 40°C e passa-se novamente por um peneiro. O granulado assim obtido mistura-se com estearato de magnésio e comprime-se. Os núcleos assim obtidos revestem-se de modo usual com uma cobertura, que se aplica através de uma suspensão aquosa de açúcar, dióxido de titânio, talco e goma arábica. As drageias prontas pulem-se com cera de abelha. b) Comprimidos ingrediente activo de fórmula geral I 30,0 mg lactose 100, 0 mg amido de milho 70,0 mg amido solúvel 7,0 mg estearato de magnésio 3,0 mg 210,0 mg

Preparação

Granulam-se o ingrediente activo e o estearato de magnésio com uma solução aquosa do amido solúvel, seca-se o granulado e mistura-se intimamente com lactose e amido de milho. Prensa-se então a mistura obtendo-se comprimidos de 210 mg. 41

c) Cápsulas 20.0 mg 230.0 mg 40.0 mg 10.0 mg 300.0 mg ingrediente activo de fórmula I lactose amido de milho talco

Preparação

Misturam-se primeiro o ingrediente activo, a lactose e o amido de milho num misturador e depois numa trituradora. Coloca-se de novo a mistura no misturador, mistura-se basicamente com o talco e coloca-se em cápsulas de gelatina dura por meio de uma máquina apropriada. d) Comprimidos ingrediente activo de acordo com a invenção 40,0 mg lactose 100,0 mg amido de milho 50,0 mg sílica coloidal 2,0 mg estearato de magnésio 3,0 mg total 200,0 mg

Preparação

Mistura-se o ingrediente activo com uma parte dos aditivos e granula-se com uma solução do amido solúvel em água. Após a secagem do granulado mistura-se com o resto dos aditivos e prensa-se a mistura para se obterem comprimidos. e) Drageias ingrediente activo de acordo com a invenção 20,0 mg lactose 100,0 mg amido de milho 65,0 mg sílica coloidal 2,0 mg amido solúvel 5,0 mg estearato de magnésio 3,0 mg total 195,0 mg 42 4.

U

Preparação

Transforma-se em núcleo de comprimidos o ingrediente activo e os aditivos, como descrito no exemplo 1, e estes transformam-se em drageias de modo usual com açúcar, talco e goma arábica. f) Supositórios ingrediente activo de acordo com a invenção 50,0 mg lactose 250,0 mg massa para supositórios qb até 1,7 g

Preparação

Misturam-se entre si o ingrediente activo e a lactose e suspende-se homogeneamente a mistura na massa para supositórios fundida. Moldam-se as suspensões na forma arrefecida obtendo-se supositórios de 1,7 g de peso. g) Ampolas ingrediente activo de acordo com a invenção 20,0 mg cloreto de sódio 5,0 mg água bidestilada qb até 2,0 ml

Preparação

Dissolvem-se o ingrediente activo e o cloreto de sódio em água bidestilada e coloca-se a solução em ampolas esterilizadas. h) Ampolas 10.0 mg 7.0 mg 1.0 ml 0,70 g 0,07 g 0,03 g 100,0 ml ingrediente activo de acordo com a invenção cloreto de sódio água bidestilada qb até i) Gotas ingrediente activo de acordo com a invenção éster metilico do ácido p-hidroxibenzóico éster propilico do ácido p-hidroxibenzóico água desmineralizada qb até 43

Preparação

Dissolvem-se o ingrediente activo e os agentes de conservação em água desmineralizada, filtra-se a solução e coloca-se em fracos de 100 ml cada.

Lisboa, 28 de Setembro de 2000 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL.

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Claims (9)

1. u REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula geral I (R2)

   em que A significa um grupo benzo, indolo ou tieno; em que, quando A é benzo m é 2 ou 3, e os substituintes R2 independentemente um do outro significam hidroxilo, alcooxilo-(^-04) , benziloxi, halogénio (F, Cl, Br, I), alquilo- (C]_-C4) , metanossulfoniloxi ou metanossulfonamido, ou dois substituintes R2 vizinhos podem formar em conjunto -O-CH2-O- ou -0-CH2-CH2-0-; e quando A é indolo ou tieno m é zero; B significa o grupo -0-, -S- ou -CHR5-, em que R5 é hidrogénio, alquilo-(Ci-Cg) / fenilo ou benzilo; R3 significa 2- ou 3-tienilo, cicloalquilo-(C4-C7) , cicloalquil-(C4-Cg) -alquilo- (C;]_—C5) ou (R)

   ou em que R é alquilo-(C]_-C4) , hidroxilo, -N3, halogénio (F, Cl, Br, I), CF3 ou alcooxilo- (C]_-C4) , u é 0, 1, 2 .ou 3, e R7, R8 e R9, independentemente uns dos outros, podem ser metilo, etilo, propilo, fenilo ou benzilo, em que não mais do que dois dos substituintes podem ser ao mesmo tempo fenilo ou benzilo; R4 significa (a) alcenilo ramificado ou não ramificado com 3 a 6 átomos de carbono, que pode estar substituído por fenilo, ou 1 V (b) alcinilo ramificado ou não ramificado com 3 a 6 átomos de carbono, que pode estar substituído por fenilo, ou (c) alquilo ramificado ou não ramificado com 1-13 átomos de carbono, em que o grupo alquilo pode estar substituído por hidroxilo, alcooxilo- (C]_-C4) , di-alquil- (C^-C^ -amino, furilo, piridilo, pirrolidinilo, N-metilpirrolidinilo, morfolino, indolilo, nitrilo, tienilo, adamantilo, ciclo-hexilo, ! fenoxi, benziloxi, naftiloxi ou fenilo, em que este grupo fenilo ou o grupo fenilo contido no grupo fenoxi ou benziloxi pode estar substituído uma, duas ou três vezes por hidroxilo, alcooxilo- (C1-C4) , benziloxi, halogénio (F, Cl, Br, I), CF3, N3, N02, alquilo- (C2-C4) , adamantilo, -S02NH2, NHCOCH3, -NHS02CH3 ou -C(0)0-R14 [em que R14 é cicloalquilo-(C3-C7) ou alquilo-(C1-C6) ramificado ou não ramificado, em que o grupo alquilo pode estar substituído uma a três vezes por fenilo, em que este grupo fenilo pode estar substituído por halogénio (F, Cl, Br, I), CF3, alquilo C1 ou C2, alcooxilo ^ ou c2] ou pode estar substituído pela ponte -0-CH2-0-, ou por dois grupos fenilo não substituídos; (d) é 2 Γ t

   (R6) ν

   V

   em que R6 é alquilo- (C^-C^) , hidroxilo, N3, halogénio (F, Cl, Br, I), CF3, N02 ou alcooxilo-(Cx-04) e v é 0, 1, 2 ou 3, ou os respectivos sais com ácidos fisiologicamente toleráveis ou complexantes.
2. 2. Composto de fórmula geral I, em que, quando A é benzo m é 2 e os dois grupos R2 se encontram nas posições 6 e 7.
3. 3. Composto de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que A significa benzo; m é 2, e os substituintes R2, independentemente um do outro, significam hidroxilo, alcooxilo- 3 [/ (Ci~C4), benziloxi, halogénio (F, Cl, Br, I) ou alquilo-(C1-C4) , ou dois substituintes R2 vizinhos formam em conjunto -0-CH2-0-; B significa o grupo -0-, -S- ou -CHR5, em que R5 é hidrogénio, metilo, fenilo ou benzilo; R3 significa 2- ou 3-tienilo, cicloalquilo-(C4-C7) ou

   R7

   ou -C-R8 9 R em que R é alquilo- (C^-C^ , halogénio (F, Cl, Br, I), CF3 ou alcooxilo-(^-¾) , uéO, 1, 2 ou 3, e R7, R8 e R9, independentemente uns dos outros, podem ser metilo, etilo, propilo, fenilo ou benzilo, em que não mais do que dois dos substituintes podem ser ao mesmo tempo fenilo ou benzilo; R4 é (a) alcenilo ramificado ou não ramificado com 3 a 6 átomos de carbono, que pode estar substituído por fenilo, ou (b) alcinilo ramificado ou não ramificado com 3 a 6 átomos de carbono, que pode estar substituído por fenilo, ou (c) alquilo ramificado ou não ramificado com 1 a 13 átomos de carbono, em que o grupo alquilo pode estar substituído por tienilo, adamantilo, ciclo-hexilo, fenoxi, benziloxi, ou fenilo, (em que este grupo fenilo ou o grupo fenilo contido no grupo fenoxi ou benziloxi pode estar substituído uma, duas ou três vezes por alcooxilo- (C1-C4) , halogénio (F, Cl, Br, I), CF3, N3, N02, alquilo-(C1-C4) ou -C(0)-0-(CH2)1_3-CH3 ou pela ponte -0-CH2-0-), ou por dois grupos fenilo não substituídos; (d) é 4 μ r Ν-(CH2) ο, ι

   ou

   em que R5 é alquilo-(C]_-C4) , hidroxilo, N3, halogénio (F, Cl, Br, I), CF3, N02 ou alcooxilo-(C1-C4) e v é 0, 1, 2 ou 3, ou os respectivos sais com ácidos fisiologicamente toleráveis ou complexantes. 5 L i .
4. 5. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em que A é 6,7-dimetoxibenzeno.
5. 6. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, em que R3 é fenilo ou ciclo-hexilo.
6. 7. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, em que B é 0 ou CH2.
7. 8. Processo para a preparação de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se ciclizar um composto de fórmula geral IV 6 Η (R2)

   C-CH„—NHCO-C-B-R4 H H em que R2, R3, R4, m e B se definem como numa das reivindicação 1 a 7 e Ar significa fenilo, indolilo ou 2- ou 3-tienilo, na presença de um agente de condensação e, se se desejar, transformá-lo num seu sal.
8. 9. Composição farmacêutica contendo um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 7.
9. 10. Utilização de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 7 para a preparação de uma composição farmacêutica para a protecção do cérebro, para o tratamento de processos inflamatórios crónicos, com efeito antiproliferativo ou para o tratamento da colite ulcerosa ou da doença de Morbus Crohn. Lisboa, 28 de Setembro de 2000 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL