PT627911E - Hidrogeis biodegradaveis fotopolimerizaveis como materiais de contacto de tecidos e veiculos de libertacao controlada - Google Patents

Description

- 1 - DESCRIÇÃO "HIDROGÉIS BIODEGRADÁVEIS FOTOPOLIMERIZÁVEIS COMO MATERIAIS DE CONTACTO DE TECIDOS E VEÍCULOS DE LIBERTAÇÃO CONTROLADA"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a hidrogéis biodegradáveis fotopo-limerizáveis para uso como adesivos de tecidos e na libertação controlada de fármacos.

Antecedentes da Invenção

Hidrogéis como veículos de libertação controlada

Hidrogéis biodegradáveis podem ser transportadores de materiais biologicamente activos tais como hormonas, enzimas, antibióticos, agentes antineoplásicos, e suspensões de células. São também possíveis a preservação temporária de propriedades funcionais de uma espécie transportada, bem como uma libertação controlada das espécies nos tecidos locais ou circulação sistémica. A selecção apropriada de macrómeros hidrogéis pode produzir membranas com uma gama de permeabilidade, tamanhos de poro e velocidades de degradação adequadas para uma variedade de aplicações na cirurgia, diagnóstico e tratamento médico. -2-

Adesivos e selantes Géis de fibrina têm sido usados largamente na Europa como selantes e adesivos em cirurgia (Thompson et al., 1988, "Fibrin Glue: A review of its preparation, efficacy, and adverse effects as a topic hemostat," Drug Intell. and Clin. Pharm., 22:946; Gibble aí ai, 1990, (1990), "Fibrin glue: the perfect operative sealant?" Transfusion, 30(8):741). Contudo, estes não foram grandemente utilizados nos Estados Unidos devido a preocupações manifestadas em relação à transmissão da doença a partir de produtos do sangue. Têm sido explorados os polímeros sintéticos como adesivos (Lipatova, 1986, "Medicai polymer adhesives," Advances in Polymer Science, 79:65-93), mas estes materiais têm sido associados ao local de inflamação, com efeitos de citotoxicidade, e biocompatibilidade fraca.

Prevenção de adesões pós-operatórias A formação de adesões pós-cirúrgicas envolvendo órgãos dea cavidade e eda parede peritoneal é um resultado frequente e indesejável dea cirurgia abdominal. O trauma cirúrgico para o tecido causado pelos resultados de manuseamento e secagem resulta na libertação de um exsudado sero-sanguíneo (proteico) que tende a acumular-se na cavidade pélvica (Holtz, G., 1984). Se o exsudado não é absorvido ou lisado dentro deste período, toma-se incluso com fibroblastos, e a deposição subsequente de colagénio conduz à formação da adesão.

Foram tentadas numerosas abordagens para eliminação da formação da adesão, com sucesso limitado na maioria dos casos. Essas tentativas incluíram lavagem da cavidade peritoneal, administração de agentes farmacológicos, e a aplicação de barreiras para separar os tecidos mecanicamente . Por -3- —* *-( exemplo, Boyers et al., (1988) "Reduction of postoperative pelvic adhesions in the rabbit with Gore-Tex surgical membrane," Fértil. Steríl., 49:1066, examinou membranas cirúrgicas Gore-Tex na prevenção de adesões. Para uma revisão da prevenção da adesão, ver Holtz (1984) "Prevention and management of peritoneal adhesions," Fértil. Steril., 41:497-507. Contudo, nenhuma destas abordagens tem sido económina do ponto de vista de custos e eficaz nos estudos in vivo.

Foram estudadas soluções de Poloxamer 407 para o tratamento de adesões, com algum sucesso. O Poloxamer é um copolímero de óxido de etileno e de óxido de propileno e é solúvel em água; as soluções são líquidos à temperatura ambiente. Steinleitner et al. (1991) "Poloxamer 407 como uma Material de Barreira Intraperitoneal para a Prevenção da Formação da Adesão e Reforma nos Modelos de Roedores para Cirurgia Reprodutiva," Obstretics and Gynecology, 77(1):48 e Leach et al. (1990) "Reduction of postoperative adhesions in the rat uterine fom model with poloxamer 407, Am. J. Obstet. Gynec., 162(5):1317, exeminaram soluções de Poloxamer em modelos de adesão peritoneal e observaram reduções estatisticamente significativas em adesões; contudo, foram incapazes de eliminar adesões, talvez devido à adesão limitada e retenção no local da lesão.

Foi largamente utilizada celulose oxidada regenerada para prevenir adesões a qual é um produto clínico aprovado, de nome comercial Interceed TC7. Mostrou-se que este material de barreira é de algum modo eficaz em coelhos (Linsky et al., 1987 "Adhesion reduction in a rabbit uterine trompa model using TC-7," J. Reprod. Med., 32:17; Diamond et al., 1987 "Pathogenesis of adhesions formation/reformation: applications to reproductive surgery," Microsurgeiy, 8:103) e em humanos (Interceed (TC7) Adhesion Barrier Study Group, 1989). Foi demonstrado que é mais eficaz se for pré-tratado com heparina, mas foi -4- concluído que é ainda incapaz de eliminar completamente as adesões (Diamond et al., 1991 "Synergistic effects of INTERCEED (TC7) and heparin in reducing adhesion formation in the rabbit uterine trompa model," Fertility and Sterility, 55(2): 389).

Em resumo, foram exploradas algumas abordagens de lavagem/fármaco/material, mas nenhuma destas estratégias foi capaz de eliminar adesões. Uma barreira de material ideal não evocaria uma resposta de adesão por si própria, ficaria no local sem suturar (Holtz et al., 1982 "Adhesion induction by suture of varying tissue reactivity and caliber," Int. J. Fert., 27: 134), degradam durante um período de algumas semanas, reduzindo efectivamente as adesões até muito pequena extensão, e são capazes de libertar um fármaco no local de aplicação durante um período de tempo de vários dias. Nenhuma das abordagens desenvolvidas e descritas até à data preenchem estes requisitos.

Polímeros biodegradáveis sintéticos O domínio dos polímeros biodegradáveis sintéticos desenvolveu-se rapidamente desde a síntese e biodegradabilidade do ácido poliláctico que foi pela primeira vez relatado por Kulkami et al., 1966 "Polylactic acid para implantes cirúrgicos," Arch. Surg., 93: 839. Conhecem-se diversos outros polímeros que são biodegradáveis, incluindo polianidridos e poliortoésteres, os quais têm ligações lábeis do esqueleto como vantagem, tal como referido por Domb et al., 1989, Macromelecules, 22: 3200; Heller et al., 1990, Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Chasin, M. And Langer, R., Eds., Dekker, New York, 121-161. Uma vez que é desejável ter polímeros que se degradam em materiais que ocorrem naturalmente , sintetizaram-se poliaminoácidos, tal como relatado por Miyake et al., 1974, para uso in vivo. Isto foi a base para usar poliésteres (Holland et al., 1986 Controlled Release, 4: 155-180) de a- -5- /^Ç. -c(«-Λ hidroxiácidos (v/z., ácido láctico, ácido glicólico), os quais permanecem os materiais biodegradáveis mais largamente utilizados para aplicações oscilando entre aparelhos de sutura (fios de sutura e ganchos) até sistemas de libertação de fármacos (Patente EUA No. 4,741,337 de Smith et al.\ Spilizewski et al., 1985 "The effect of hydrocortisone loaded poly(dl-lactide) films on the inflammatory response," J. Control. Rei, 2: 197-203). O tempo requerido para um polímero se degradar pode ser planeado através da selecção dos monómeros apropriados. Diferenças no grau cristalino alteram também as velocidades de degradação. Devido à natureza relativamente hidrofóbica destes polímeros, a perda real de massa apenas começa quando os fragmentos oligómeros são suficientemente pequenos para serem solúveis em água.Consequentemente, a massa molecular inicial do polímero influencia a velocidade de degradação. Têm sido descritos polímeros degradáveis contendo elementos do polímero solúveis em água. Sawhney et al., (1990) "Rapidly degraded terpolymers of dl-lactide, glycolide, and ε-caprolactone with increased hidrophilicity by copolymerisation with polyethers," J. Biomed. Mater. Res., 24: 1397-1411, copolimerizaram lactide, glicolídeo e ε-caprolactone com PEG para aumentar a sua hidrofilia e velocidade de degradação. A Patente U.S. No. 4,716,203 de Casey et al. (1987) sintetizaram um copolímero de bloco de PGA-PEG-PGA, com conteúdo de PEG oscilando entre 5-25% em massa. A Patente U.S. 4,716,203 de Casey et al. (1987) também refere a síntese de copolímeros de dibloco PGA-PEG, novamente com PEG oscilando entre 5-25%. A Patente U.S. No. 4,526,938 de Churchill et al. (1985) descreveu materiais caracterizados por ligações não cruzadas com PM em excesso de 5000, baseado em composições semelhantes com PEG; embora estes materiais sejam insolúveis em água. Cohn et al. (1988) J. Biomed. Mater. Res., 22: 993-1009 descreveram copolímeros de -6- (--- PLA-PEG que incham até cerca de 60%; estes polímeros sao também insolúveis em água, e não apresentam ligações cruzadas. As características que são comuns a estes materiais são as de utilizarem polímeros quer de matérias solúveis em água quer polímeros degradáveis, mas serem insolúveis em água, inchando colectivamente até cerca de 60%.

Materiais biodegradáveis de origem biológica são bem conhecidos, por exemplo, gelatina com ligações cruzadas. Ácido hialurónico foi ligado em ligações cruzadas e usado como um polímero degradável absorvente para aplicações biomédicas (Patente U.S. No. 4,987,744 de delia Valle et al., (1991) "Surface modification of polymeric biomaterials for reduced thrombogenicity," Polym. Mater. Sei. Eng., 62:731-7351).

Uso de materiais biodegradáveis para libertação controlada de fármacos A maioria dos fármacos hidrofílicos são dispersos mecanicamente como suspensões dentro de soluções de polímeros biodegradáveis em solventes orgânicos. Conformações moleculares de enzimas e proteínas são frequentemente diferentes nestas circunstâncias relativamente ao que seriam em meio aquoso. Um enzima disperso em tal matriz hidrofóbica está habitualmente presente numa conformação inactiva até que seja libertada no ambiente aquoso envolvente subsequente à degradação polimérica. Adicionalmente, algumas proteínas podem ser irreversivelmente desnaturadas por contacto com solventes orgânicos usados para dispersar a proteína dentro do polímero. Síntese de polímeros, degradação e síntese local

Polímeros rapidamente degradáveis sugeridos correntemente para libertação controlada a curto termo de macromoléculas fármacos pode atingir -7- ky. yfri *-j concentrações locais de subprodutos de degradação acídica potencialmeutc perigosos. Além disso, todos os polímeros sintéticos biodegradáveis assim referidos podem apenas ser processados em solventes orgânicos e todos os polímeros sintéticos biodegradáveis são sintetizados em condições que não são alcançáveis para polimerização in vivo. Assim, não tem sido possível fabricar materiais implantáveis tal como barreiras configuradas com precisão, artigos à medida, ou membranas capazes de libertar materiais bioactivos para o tecido local. É por isso um objecto da presente invenção para fomcer hidrogéis que são biocompatíveis, biodegradáveis, e podem ser rapidamente formados por polimerização in vivo. É objecto posterior da presente invenção para fornecer uma solução de macrómero a qual pode ser administrada durante procedimentos de cirurgia ou outpacient e polimerizado como um tecido adesivo, meio de encapsulamento de tecido, suporte de tecido, ou meio de libertação de fármaco. É ainda objecto posterior da presente invenção para fornecer uma solução de macrómero a qual pode ser polimerizada in vivo num curto período de tempo e em camadas muito finas ou ultrafinas.

Sumário da Invenção São aqui descritos macrómeros biocompatíveis, biodegradáveis, polimerizáveis substancialmente solúveis em água, tendo uma variedade de usos in vivo. De acordo com o primeiro aspecto, a presente invenção fornece um macrómero polimerizável, biodegradável tendo uma solubilidade de pelo menos lg/100 ml. mima solução aquosa compreendendo pelo menos uma região solúvel em água, pelo menos uma região, que é hidrolizável em condições in vivo, e -8- grupos terminais com a capacidade de formar ligações covalentes adicionais resultando nas ligações cruzadas de macrómero, em que os grupos terminais polimerizáveis são separados entre si por pelo menos uma região degradável e em que a região solúvel em água não é um hidrato de carbono, um polissacarido ou uma proteína. As regiões podem, em algumas formas de realização, ser tanto solúveis em água como biodegradáveis. Os macrómeros são polimerizados por exposição das regiões polimerizáveis a radicais livres gerados, por exemplo, por corantes e químicos fotosensíveis.

Um aspecto importante dos macrómeros é que as regiões polimerizáveis são separadas por pelo emnos um aregião degradável para facilitar a degradação uniforme in vivo. Há diversas variações destes polímeros. Por exemplo, as regiões polimerizáveis podem ser ligadas directamente a extensões degradáveis ou indirectamente via secções não degradáveis solúveis em água na medida em que as regiões polimerizáveis estejam separadas por uma secção degradável. Por exemplo, se o macrómero contém uma simples região solúvel em água acoplada a uma região degradável, uma região polimerizável pode ser ligada a uma região solúvel em água e a outra ligada a uma extensão ou região degradável. Noutra forma de realização, a região solúvel em água forma o núcleo central do macrómero e tem pelo menos duas regiões degradáveis ligadas ao núcleo. Pelo menos duas regiões polimerizáveis estão ligadas às regiões degradáveis de tal modo que, após degradação, as regiões polimerizáveis, particularmente na forma de gel polimerizado, são separadas. Do mesmo modo, se o núcleo central do macrómero é formado por uma região degradável, pelo menos duas regiões solúveis em água podem ser ligadas ao núcleo e as regiões polimerizáveis ligadas a cada região solúvel em água. O resultado global será o mesmo após formação de gel e exposição a condições de degradação in vivo. Ainda numa outra forma de realização, o macrómero tem uma região do esqueleto solúvel em água e uma região degradável justaposta ao esqueleto do cí -9- macrómero. Pelo menos duas regiões polimerizáveis estão ligadas às regiões degradáveis, de tal modo que são separáveis após degradação resultando na dissolução do produto gel. Numa forma de realização posterior, o esqueleto do macrómero é formado a partir de um esqueleto degradável contendo regiões solúveis em água tal como ramos ou enxertos/enxertos ligados ao esqueleto degradável. Duas ou mais regiões polimerizáveis são ligadas aos ramos ou enxertos solúveis em água. Noutra variação, o esqueleto pode estar à medida, o que pode incluir uma região solúvel em água, uma região biodegradável, ou uma região solúvel em água que é também biodegradável. Nesta forma de realização geral, a região da estrela contém quer ramos ou enxertos solúveis em água quer biodegradáveis com regiões polimerizáveis também ligadas. Novamente, as regiões polimerizáveis devm ser separadas em algum ponto por uma região degradável.

Exemplos destes macrómeros são os PEG-oligoglicolil-acrilatos. A escolha dos cobertura terminais apropriados permite a rápida polimerização e congelação; os acrilatos foram seleccionados porque podem ser polimerizados usando diversos sistemas iniciadores, e.g., um corante eosina, por exposição breve à luz ultravioleta ou visível. O poli(etilenoglicol) ou unidade estrutural central de PEG (núcleo) foi seleccionado com base na sua elevada hidrofxlia e solubilidade em água, acompanhada por excelente biocompatibilidade.Um ácido de cadeia oligo curta ou poli(a-hidroxiácido), tal como ácido poliglicólico, foi seleccionado como extensão de cadeia preferida porque rapidamente se degrada por hidrólise da ligação éster em ácido glicólico, um metabolito harmless. Embora o ácido glicólico altamente cristalino seja insolúvel em água e na maioria dos solventes orgânicos comuns, o macrómero inteiro é solúvel em água e pode ser rapidamente gelificado numa rede biodegradável enquanto em contacto com fluidos aquosos de tecidos. Tais redes podem ser usadas para reter e dispersar homogeneamente fármacos e enzimas solúveis em água e libertá-los a uma - 10-

Át h*.yfr CL—_J velocidade controlada. Além disso, podem ser usados para reter suspensões de partículas de fármacos insolúveis em água. Outras extensões de cadeia preferidas são de ácido poliláctico, policaprolactona, poliortoésteres, e polianidridos. Tais blocos "poliméricos" deveriam ser entendidos como incluindo blocos diméricos, triméricos, e oligoméricos.

Estes materiais são particularmente úteis para libertação controlada de fármacos, especialmente de materiais hidrofílicos, uma vez que as regiões do polímero solúveis em água permitem o acesso de água aos materiais retidos dentro do polímero. Além disso, é possível polimerizar o macrómero contendo o material a ser retido sem exposição do material aos solventes orgânicos. A libertação pode ocorrer por difusão do material a partir do polímero previamente à degradação e/ou por difusão do material a partir do polímero à medida que ele se degrada, dependendo das características de tamanho de poro dentro do polímero, que é controlado pela massa molecular entre ligações cruzadas e a densidade de ramificação por ligações cruzadas. A desactivação do material retido é reduzida devido à imobilização e efeito protector do gel e são evitados efeitos de rotura catastróficos associados a outros sistemas de libertação controlada. Quando o material retido é uma enzima, a enzima pode ser exposta ao substrato enquanto a enzima é retida, desde que as proporções de gel sejam escolhidas para permitir ao substrato permear o gel. Degradação do polímero facilita a libertação controlada eventual de macromoléculas livres in vivo por hidrólise gradual das ligações éster terminais.

Uma vantagem destes macrómeros são as de poderem ser polimerizados rapidamente num ambiente aquoso. Podem assim ser formados precisamente filmes ou membranas conformes, semi-permeáveis, biodegradáveis nos tecidos in situ para servirem como barreiras biodegradáveis, como veículos para células vivas ou outros materiais biologicamente activos, e como adesivos -11 -

At h*~yh cirúrgicos. Numa forma de realização particularmente preferida, os macrómeros são aplicados no tecido ao qual está também ligado um iniciador, e polimerizado para formar revestimentos ultrafinos. Isto é especialmente útil na formação de revestimentos no interior dos lúmens de tecido tais como de vasos sanguíneos onde há preocupações em relação à restenose, e na formação de barreiras de tecido durante a cirurgia assim prevenindo a formação de adesões.

Exemplos demonstram o uso de macrómeros e polímeros para a prevenção de adesões cirúrgicas pós-operatórias em modelos de ceco de ratazana e trompa uterina de coelha. O polímero mostra excelente biocompatibilidade, tal como visto por uma excrescência fibrosa mínima em amostras implantadas. Os hidrogéis para os modelos foram delificados in situ a partir de precursores solúveis em água por exposição breve à luz do comprimento de onda longo do ultravioleta distante (LWUV), resultando na formação de uma rede interpe-netrante do hidrogel com os componentes de proteína e glicosaminoglicano do tecido. O hidrogel degradável foi muito eficaz, tanto por si próprio como em combinação com tPA, para prevenção de adesões.

Descrição Breve dos Desenhos A Figura 1 mostra esquematicamente macrómeros ilustrados da presente invenção em que_é núcleo solúvel em água tal como PEG; -é uma extensão degradável hidrolizável tal como um poliglicolídeo; = = = = = é uma cobertura de terminação polimerizável ou cadeia lateral tal como acrilato; e------- é uma porção hidrolizável e solúvel em água tal como um hialuronato. A Figura IA mostra o grau de fotopolimerização (dp) calculado e encontrado por RMN. •4- - 12- A Figura 2A mostra os fibroblastos humanos de pele cultivados durante seis horas em placas cobertas com PEG 18,5 diacrilato de K-glicolídeo (18,5 KG). A Figura 2B mostra fibroblastos de Pele Humana cultivadas durante seis horas em placas de vidro não cobertas com PEG. A Figura 3A mostra a libertação de BSA a partir de um diacrilato glicolídeo de PEG 1K (PEG de massa molecular 1000) com extensões (1 KG) de hidrogel glicolídeo em PBS. A Figura 3B mostra a libertação de lisozima a partir de tetra-acrilato de PEG 18,5K-DL-lactídeo (18,5 KL) em PBS. A Figura 4A mostra mostra a libertação de tPA activo recombinante a partir de hidrogel diacrilato de PEG 1K lactídeo (1KL). A Figura 4B mostra mostra a libertação de tPA activo recombinante a partir de hidrogel diacrilato de PEG 4K glicolídeo (1KG). A Figura 4C mostra mostra a libertação de tPA activo recombinante a partir de hidrogel diacrilato de PEG 18,5K-lactídeo (18,5 KG) em PBS. A Figura 5A é uma vista superior da trompa uterina de coelha usado como controlo. É evidente a anatomia do trompa distorcido com 66% de adesões. As trompas são dobradas para si próprias. A Figura 5B é uma vista superior da trompa uterina de coelha -13-

tratado com hidrogel biodegradável fotopolimerizável, PEG 18,5 KL. A anatomia da trompa é normal, sem bandas de adesão visíveis. A Figura 6A é uma micrografia de varrimento electrónico ambiental (ESEM) de um vaso sanguíneo não tratado a seguir ao trauma. A Figura 6B é um ESEM de um vaso sanguíneo coberto por polímero a seguir a um trauma.

Descrição das Formas de Realização Preferidas São aqui revelados polímeros biodegradáveis solúveis em água, formados a partir de macrómeros contendo ambos regiões solúveis em água bem como regiões biodegradáveis e pelo menos duas regiões que são polimerizáveis por iniciação com radical livre, preferencialmente por fotopolimerização usando radiação visível ou ultravioleta de longo comprimento de onda.

Os macrómeros

Em termos gerais, os macrómeros reivindicados são polímeros que são solúveis em soluções aquosas, ou soluções aproximadamente aquosas, tal como água adicionada de dimetilssulfóxido. Incluem três componentes incluindo uma região biodegradável, hidrolizável em condições in vivo, uma região solúvel em água, e pelo menos duas regiões polimerizáveis. Exemplos destas estruturas são mostrados na Figura 1. A Estrutura A na Figura 1 mostra um macrómero contendo uma região solúvel em água (_), um componente degradável e solúvel em água (-------) anexas uma à outra. Cada um tem uma cobertura terminal - 14- C-cUi polimerizável (= = = = =). A Estrutura B mostra um componente maioritário solúvel em água ou região central (_) extendida a um dos terminais através de um componente hidrolizável e degradável (~~-) e terminado por, no outro terminal, um componente polimerizável (= = = = =). A Estrutura C mostra um componente central degradável ou hidrolizável (-) ligado a um componente solúvel em água (_) coberta em cada terminal por um componente polimerizável (= = = = =). A Estrutura D mostra um componente central solúvel em água (_) com numerosas ramificações de componentes hidrolizáveis (~~-), sendo cada componente hidrolizável coberta com um componente polimerizável (= = = = =). A Estrutura E mostra um componente central, hidrolizável (--) com três ramificações solúevis em água (_), sendo cada ramificação solúvel em água coberta por um componente polimerizável (= = = = =). A Estrutura F mostra um componente central longo solúvel em água e hidrolizável (......), sendo cada terminal coberta por um componente polimerizável (= = = = =). A Estrutura G mostra um componente com uma parte central solúvel em água e hidrolizável (--------) coberta em ambas as terminações por um componente hidrolizável (~—~-), sendo cada componente hidrolizável coberta por um componente polimerizável (= = = = =). A Estrutura H mostra um componente central solúvel em água hidrolizável e degradável (------) com caps de terminações ou ramificações de um componente polimerizável (= = = = =). A Estrutura I mostra um componente central solúvel em água (_) em forma circular com ramificações solúveis em água extendidas por um componente hidrolizável (~~~-—) coberta por um componente polimerizável (= = = = =). Finalmente, a Estrutura J na Figura 1 mostra um componente nuclear circular solúvel em água (_) com ramificações degradáveis (-componenete polimerizável (~ ~), sendo cada uma coberta por um “)·

As várias estruturas mostradas na Figura 1 são apenas -15- /Qt k*.rfr CL— exemplifícativas. Os peritos na arte compreenderão muitas outras combinações possíveis que poderiam ser utilizadas para os objectivos da presente invenção. É aqui usado o termo "pelo menos substancialmente solúvel em água." Este é indicativo de que a solubilidade deveria ser de pelo menos cerca de lg/100 mL de solução aquosa ou em solução aquosa contendo pequenas quantidades de solvenet orgânico, tal como dimetilssulfóxido. Através do termo "polimerizável" pretende-se significar que as regiões têm a capacidade de formar ligações covalentes adicionais resultando numa interligação do macrómero, por exemplo, ligações duplas carbono-carbono de moléculas do tipo acrilato. Tal polimerização é caracteristicamente iniciada por formação de radicais livres, por exemplo, resultando da absorção de fotões de certos corantes e compostos químicos para produzir radicais livres em último lugar.

Numa forma de realização preferida, um hidrogel começa com um macrómero biodegradável, polimerizável incluindo um núcleo, uma extensão em cada terminal do núcleo, e uma cobertura terminal em cada extensão. O núcleo é um polímero ou oligómero hidrofílico; cada extensão é mum polímero ou oligómero biodegradável; e cada cobertura terminal é um oligómero, dímero, ou monómero capaz de estabelecer ligações cruzadas nos macrómeros. Numa forma de realização particularmente preferida, o núcleo inclui oligómeros de poli(etilenoglicol) hidrofílicos de massa molecular entre cerca de 400 e 30,000 Da; cada extensão inclui oligómeros poli(a-hidroxiácidos) biodegradáveis de massa molecular entre cerca de 200 e 1200 Da; e cada cobertura terminal inclui um monómero ou oligómero do tipo acrilato (i.e., contendo ligações duplas carbono-carbono) de massa molecular entre cerca de 50 e 200 Da que são capazes de estabelecer ligações cruzadas e polimerização entre copolímeros. Mais espccificamente, uma forma de realização preferida incorpora um núcleo consistindo de oligómeros de poli(etilenoglicol) de massa molecular entre cerca -16- b*·^ CL-—_*.{ ci de 8000 e 10000 Da; extensões consistindo de oligómeros de ácido poliláctico de massa molecular de cerca de 250 Da; e coberturas terminais consistindo de metades acrilato de cerca de 100 Da de massa molecular.

Os peritos na arte reconhecerão que oligómeros do núcleo, extensões e cobertura terminais podem ter composições uniformes ou podem ser combinações de cadeias relativamente curtas de espécies individuais que conferem propriedades especificamente desejáveis no hidrogel final enquanto se retém as características gerais especificadas de cada secção do macrómero. Os comprimentos de oligómeros referidos aqui podem variar desde dois mers a vários, sendo o termo usado para distinguir subsecções ou componentes de cada macrómero a partir da entidade completa.

Regiões solúveis em água

Em formas de realização preferidas, uma região nuclear solúvel em água pode consistir de copolímeros de bloco de poli(etilenoglicol), poli(óxido de etileno), poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidona), poli(etiloxazolina), ou poli(óxido de etileno)-co-poli(óxido de propileno).

Regiões biodegradáveis A região biodegradável é preferencialmente hidrolizável em condições in vivo. Por exemplo, o grupo hidrolizável pode ser constituído por polímeros e oligómeros de glicolídeo, lactídeo, ε-caprolactona, outros hidro-xiácidos, e outros polímeros biologicamente degradáveis que originam materais que são não-tóxicos ou que se apresnetam como metabolitos normais no organismo. Poli(ot-bidroxiácidos) preferidos são o ácido poliglicólico, poli(ácido DL-láctico), e poli(ácido L-láctico). Outros materiais úteis incluem poli(amino- - 17- ácidos), poli(anidridos), poli(ortoésteres), poli(fosfazinas) e poli(fosfoésteres). Poli(lactonas) tais como poli(s-caprolactona), poli(y-valerolactona), e poli(y-caprolactona) e poli(gama-butirolactona), por exemplo, são também úteis.As regiões biodegradáveis podem ter um grau de polimerização oscilando desde um até valores que originariam um produto que não seja substancialmente solúvel em água. Assim, podem ser usadas regiões poliméricas, diméricas de triméricas.

Regiões biodegradáveis podem ser construídas a partir de polímeros ou monómeros usando ligações susceptíveis de biodegradação, tal como éster, peptido, anidrido, ortoéster, e ligações de fosfazina e fosfoéster.

Regiões polimerizáveis

As regiões polimerizáveis são potencialmente polimerizáveis por fotoionização através da geração de radicais livres, mais preferencialmente na região da radiação visível ou do ultravioleta de comprimento de onda distante. As regiões polimerizáveis preferidas são acrilatos, diacrilatos, oligoacrilatos, meta-crilatos, dimetacrilatos, oligometoacrilatos, ou outros grupos fotopolimerizáveis biologicamente aceitáveis.

Podem ser usadas outras químicas de iniciação além da fotoini-ciação. Estas incluem, por exemplo, esquemas de iniciação de água e amina com macrómeros contendo isocianato ou isocianato utilizados como regiões polimerizáveis.

Fotoiniciadores e/ou catalisadores

Fotoiniciadores úteis são aqueles que podem ser usados para iniciar a polimerização dos macrómeros através da geração de radicais livres sem -18- — *-( ci citotoxicidade e dentro de um período de tempo curto, na maioria minutos e inais preferencialmente segundos. Corantes preferidos como iniciadores de escolha para iniciação com LMUV ou luz visível são a etileosina, 2,2-dimetoxi-2-fenil-acetofenona, outros derivados de acetofenona, e canforquinona. Em todos os casos, as ramificações por ligações cruzadas e polimerização são iniciadas entre macrómeros por um iniciador de polimerização radicalar por radicais livres activados pela luz tal como 2,2-dimeroxi-2-fenilacetofenona ou uma combinação de etileosina (10'4 a 10'2 M) e trietanolamina (0,001 a 0,1 M), por exemplo. A escolha do fotoiniciador é grandemente dependente das regiões fotopolimerizáveis. Por exemplo, quando o macrómero inclui pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono, a absorção de luz pelo corante faz com que o corante assuma um estado de tripleto, podendo o estado de tripleto reagir subsequentemente com a amina para formar um radical livre que inicia a polimerização. Corantes preferidos para uso com estes materiais incluem corante de eosina e iniciadores tais como 2,2-dimetil-2-fenilacetofenona, 2-metoxi-2-fenilacetofenona, e canforoquinona. Usando tais iniciadores, podem ser polimerizados copolímeros in situ por luz ultravioleta de longo comprimento de onda ou através d eluz laser de cerca de 514 nm, por exemplo. A iniciação da polimerização é conseguida por irradiação com luz a um comprimento de onda entre cerca de 200-700 nm, mais preferencialmente no limite de ultravioleta de comprimento de onda longo ou limite do visível, 320 nm ou acima, mais preferencialmente cerca de 514 nm ou 365 nm.

Existem vários corantes fotoredutíveis e foto-oxidáveis que podem ser usados para iniciar a polimerização. Estes incluem corantes de acridina, por exemplo, acriblarina; corantes de tiazina, por exemplo, tionina; corantes de xantina, por exemplo, rosa de bengala; e corantes de fenazina, por exemplo, azul -19- /Qçt. h*. dL>*-—»_c ( de metileno. Estes são usados com co-catalisadores tais como as animas, por exemplo; compostos de enxofre, por exemplo, RSO2R1; heterociclos, por exemplo, imidazole; enolatos; organometálicos; e outros compostos tal como N-fenilglicina. Outros iniciadores incluem canforquinonas e derivados de acetofe-nona.

Podem também ser usados sistemas de iniciador da polimerização térmica. Tais sistemas que são instáveis a 37°C e estariam em condições de iniciar a polimerização com radicais livres a temperaturas fisiológicas incluem, por exemplo, persulfato de potássio, com ou sem tetrametiletilenodiamina; benzoilperóxido, com ou sem trietanolamina; e persulfato de amónio com bissulfito de sódio.

Aplicações para os Macrómeros

Prevenção de Adesões Cirúrgicas

Uma aplicação preferida é um método de reduzir a formação de adesões após um procedimento cirúrgico num paciente. O método inclui cobertura de superfícies de tecido danificado num paciente com uma solução aquosa de um iniciador de polimerização com radicais livres sensíveis à luz e uma solução de macrómero como descrito acima. As superfícies de tecido revestido são expostas a luz suficiente para polimerizar o macrómero. O iniciador de polimerização com radicais livres sensíveis à luz pode ser um composto único (e.g., 2,2-dimetoxi-2-fenil-acetofenona) ou uma combinação de um corante com um cocatalisador (e.g., etileosina e trietanolamina).

Libertação controlada de fármaco

Uma segunda aplicação preferida refere-se a um método de -20- aplicação local de uma substância biologicamente actíva às superfícies de tecido de um paciente. O método inclui os passos de mistura de uma substância biologicamente activa com muma solução aquosa incluindo um iniciador de polimerização com radicais livres sensíveis à luz e um macrómero como descrito acima para formar uma mistura de revestimento. As superfíceis de tecido são revestidas com a mistura de revestimento e exposta a luz suficiente para polimerizar o macrómero. A substância biologicamente activa pode ser qualquer de uma variedade de materiais, incluindo proteínas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, e moléculas biologicamente activas orgânicas e inorgânicas. Exemplos específicos incluem enzimas, antibióticos, agenets antineoplásicos, anestésicos locais, hormonas, agentes antiangiogénicos, anticorpos, neurotransmissores, fármacos psicoactivos, fármacos afectando órgãos reprodutivos, e oligonucleótidos tais como oligonucleótidos anti-senso.

Numa variação do método para libertação controlada de fármacos, os macrómeros são polimerizados com materiais biologicamente activos para formar microsferas ou nanopartículas contendo o material biologicamente activo. O macrómero, fotoiniciador, e agente a ser encapsulado, são misturados numa mistura aquosa. São formadas partículas usando técnicas padrão, por exemplo, por mistura em óleo usando um tubo de descarga, ou formando gotículas no ar usando um tubo de descarga. A suspensão ou gotículas são irradiadas com uma luz adequada para fotopolimerização do macrómero.

Tecidos adesivos

Outro uso dos polímeros é num método para provocar a adesão de superfícies de tecido num paciente. O macrómero é misturado com um fotoiniciador ou mistura de fotoiniciador/cocatalisador para formar uma mistura aquosa e a mistura é aplicada a uma superfície de tecido ao qual é desejada uma -21 - adesão de tecido. A superfície de tecido é contactada com o tecido com o qual a adesão é desejada, formando uma junção de tecido. A junção de tecido é então irradiada até os macrómeros estarem polimerizados.

Coberturas de tecido

Numa aplicação particularmente preferida destes macrómeros, é aplicado um revestimento ultrafino à superfície de um tecido, mais preferencialmente o lúmen de um tecido tal como um vaso sanguíneo. Um uso de tais revestimentos é no tratamento ou prevenção de restenose, reclosure abrupta, ou vasoespasmo após intervenção vascular. O fotoiniciador é aplicado na superfície do tecido, deixado a reagir, absorvido ou ligado ao tecido, sendo o fotoiniciador não ligado removido por diluição ou lavagem, e a solução do macrómero é aplicada e polimerizada. Tal como demonstrado abaixo, este método é capaz de criar um revestimento polimérico uniforme de entre um e 500 microns, que não evoca trombose ou inflamação localizada.

Suportes de tecido

Os macrómeros podem também ser usados para criar suportes de tecido formando artigos à medida dentro do corpo para servir uma tunção mecânica. Tais suportes incluem, por exemplo, selantes para órgãos a sangrar, selantes para defeitos ósseos e enchimentos de espaço para aneurismas vasculares. Além disso, tasi suportes incluem estruturas para segurar órgãos, vasos ou tubos numa posição particular para um período de tempo controlado.

Os seguintes exemplos são apresentados para descrever formas de realização preferidas e utilidades da presente invenção e não significam uma limitação da invenção a não ser que de outro modo estabelecido nas reivindi- -22- /4ft cações aqui anexas. Tomados em conjunto, os exemplos ilustram demonstrações representativas do melhor modo de implementar a invenção tal como correntemente entendido. A Tabela 1 mostra os nomes de código dos vários macrómeros sintetizados para uso nos exemplos, bem como a sua composição em termos da massa molecular do segmento PEG central e o grau de polimerização do comonómero degradável.

Tabela 1: Composição e Massa Molecular de Macrómero.

Massa Molecular Comonómero D.P. de monómero Código de de PEG per grupo OH Polímero 20000 glicolídeo 15 20 KG 18500 glicolídeo 2,5 18,5 K 10000 glicolídeo 7 10 KG 6000 glicolídeo 5 6 KG 4000 glicolídeo 5 4 KG 1000 glicolídeo 2 1 KG 20000 DL-lactídeo 10 20 KL 18500 DL-lactídeo 10 18,5KL 10000 DL-lactídeo 5 10 KL 6000 DL-lactídeo 5 6 KL 1000 DL-lactídeo 2 1 KL 600 DL-lactídeo 2 0,6 KL 600 DL-lactídeo + lactídeo 2 0,6KLCL Caprolactona (CL) 1 18500 caprolactona 2,5 18,5 KCL 18500 - - 18,5 KCO -23-

At b*.rfr C^(

Exemplo 1: Síntese de Hidrogéis Biodegradáveis Fotopolimerizados

Hidrogéis à Base de PEG

Hidrogéis Biodegradáveis à Base de PEG são obtidos por fotopolimerização rápida de laser ou UV de macrómeros solúveis em água. Macrómeros, por seu lado, são sintetizados por adição de oligótneros de ácido glicólico aos grupos terminais do PEG e então capeados com grupos terminais de ácido acrílico. As porções PEG dos macrómeros conferem propriedades de solubilidade em água, e resultados subsequentes de polimerização em hidrogéis de células não adesivas. Oligómeros de ácido glicólico servem como fracção hidrolizável da rede de polímero, enquanto os grupos terminais acrílicos facilitam a polimerização rápida e gelificação de macrómeros.

Na preparação para a síntese, glicolídeo (Dupont) ou DL-lactídeo (Aldrich) foram recristalizados na ocasião a partir de acetato de etilo. Oligómeros PEG de variadas massas moleculares (Fluka ou Polysciences) foram secos no vácuo a 110°C antes do uso. Cloreto de acriloilo (Aldrich) foi usado como recebido. Todos os outros químicos eram de grau analítico e usados sem posterior purificação. Síntese de Macrómeros

Um balão de fundo redondo de 250 mL foi seco à chama em ciclos de vácuo e árgon seco repetidos. 20 g de PEG (massa molecular 10000), 150 mL de xileno e 10 pg de octoato de estanho foram adicionados ao balão. O balão foi aquecido a 60°C em atmosfera de árgon para dissolver o PEG e de seguida arrefecido à temperatura ambiente. 1,16 g de glicolídeo foi adicionado ao balão e a mistura reaccional foi refluxada durante 16 horas. O copolímero foi separado -24- (q*. f ( por arrefecimento e ceduperado por filtração. Este copolímero (10K PEG-glicolídeo) foi usado directamente para reacções subsequentes. Outros polímeros foi sintetizados de modo semelhante usando DL-lactídeo ou ε-caprolactona em lugar de glicolídeo e usando PEG de diferentes massas moleculares. Síntese de oligómeros fotossensíveis fmacrómeros) 19 g de copolímero de glicolídeo-PEG 10K foi dissolvido em 150 mL de cloreto de metileno e submetido ao refluxo com 1 mL de cloreto de acriloilo e 1,2 mL de trietilamina durante 12 horas numa atmosfera de árgon. O hidrocloreto de trietilamina foi separado por filtração e o polímero foi precipitado por adição do filtrado a um grande excesso de hexano. O polímero (capeado por um acrilato em ambos os terminais) foi posteriormente purificado por dissoluções repetidas e precipitação em cloreto de metileno e hexano respectivamente. A Tabela 2 lista certos macrómeros sintetizados. O grau de polimerização do extensor da cadeia de glicolídeo foi conservado baixo de tal modo que todos os polímeros tenham aproximadamente 10 grupos éster por cadeia, ou cerca de 5 por terminal de cadeia. Quando estes polímeros são fotopolimerizados, é obtida uma rede tridimensional de ligações cruzadas. Contudo, cada segmento da cadeia na rede resultante necessita que se "degrade" precisamente uma ligação éster clivada em qualquer dos terminais. Estas clivagens da ligação éster permitem que a cadeia se dissolva no fluido fisiológico envolvente e sejam assim removidos do sítio de implantação. Os produtos de hidrólise resultantes, PEG e ácido glicólico, são solúveis em água e têm toxicidade muito baixa.

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Tabela 2: Macrómeros Sintetizados o o o o o o o o o o 1—I ϊ—i <—I i—i Ό w>

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M 3 B£xi W I I I I I 1 -26-

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Devido à presença de apenas algumas unidades de ácido glioólicu por cadeia oligomérica, as propriedades de solubilidade dos prepolímeros fotoactivados para ligação cruzada, são principalmente determinadas pela cadeia PEG central. A solubilidade dos macrómeros em água e cloreto de metileno, ambos os quais são solventes para PEG, não é afectada adversamente tanto quanto o segmento PEG central tem uma massa molecular de 1000 daltons ou mais. São apresentados dados de solubilidade para os pré-polímeros sintetizados na Tabela 3.

Tabela 3: DADOS D SOLUBILIDADE

Solvente 1KG 4KG 10KG 18,5KG TMP* DMSO — — Acetona - Metanol - - - Água - - - - Hexano Cloreto de Metileno - - - - - Xileno Frio - Xileno Quente - - - - - Benzeno — - Solúvel Não solúvel * Triacrilato de trimetilolpropanoglicolídeo

As cadeias de PEG com diferentes graus de polimerização de DL-Lactídeo foram sintetizadas para determinar o grau de substituição para o qual pode ser -27- b^rfr £ retida a solubilidade dos macrómeros. Os resultados s3o mostrados na Tabela 4. para além de uma substituição de cerca de 20% da cadeia de PEG hidrofílica com terminais de DL-Lactoilo hidrofóbico ou de acrilato conduz a uma situação de insolubilidade dos macrómeros em água, embora sejam ainda insolúveis em solventes orgânicos tais como cloreto d emetileno.

Tabela 4: Solubilidade dos Macrómeros D.P.* de Óxido D.P.* de lactídeo % de extensão da Solubilidade de Etileno ou glicolídeo cadeia PEG em água 420 4 0,1 solúvel 420 10 2,4 solúvel 420 20 4,8 solúvel 420 40 9,5 solúvel 420 80 19 insolúvel 23 2 8,7 solúvel 23 4 17,4 solúvel 23 10 43,5 insolúvel 23 40 174 insolúvel 5 4 80 insolúvel 10 4 40 solúvel * grau de polimerização

Fotopolimerizacão

Os macrómeros podem ser gelificados por fotopolimerização usando iniciadores de radicais livres, com a presença de duas ligações duplas acrílicas por cadeia conduzindo a uma rápida gelificação. Foi usada uma solução -28-

Ai Wn m/m a 23% de vários polímeros degradáveis em soluções salinas tamponadas de HEPES contendo 3 pL de solução de iniciador (300 mg/mL de 2,2-diemtoxi-2-fenil-acetofenona em n-vinilpirrolidona). Foram de seguida colocados 100 pL numa placa de vidro e irradiados com uma lâmpada (Blak-Ray, modelo 3-100 A com projector) de comprimento de onda longo de baixa intensidade (LWUV). Foram anotados os tempos requeridos para a gelificação ocorrer e estão abaixo apresentados. Estes tempos são tipicamente no intervalo de 10 segundos. Este aspecto é muito significativo porque estas reacções são realizadas ao ar (fotopolimerizações iniciadas por UV são lentas ao ar em comparação com as que ocorrem numa atmosfera inerte) e usando uma fonte de emissão portável, comprimento de onda longo (LMUV). O oxigénio, que frequentemente inibe reacções de radicais livres formando espécies que inibem a propagação, não parece decrescer a polimerização. Tais polimerizações rápidas são particularmente úteis em aplicações requerendo gelificações in situ. Acredita-se que esta gelificação rápida seja devida à formação de estruturas semelhantes a micelas entre os grupos polimerizáveis relativamente hidrofóbicos no macrómero, consequentemente aumentando a concentração local das espécies polimerizáveis em solução aquosa e aumentando as velocidades de polimerização. A luz laser visível é também útil para polmerização. Tempos de exposição curta e de baixa intensidade proporcionam que a luz laser visível seja virtualmente inofensiva para as células vivas desde que a radiação não seja fortemente absorvida na ausência do cromóforo próprio. A luz laser pode também ser transportada usando fibras ópticas e pode ser focalizada para uma área muito pequena. Tal área pode ser usada para polimerização rápida em regiões altamente localizadas; são apresentados na Tabela 5 os tempos de gelificação para prcpolímeros seleccionados. Em cada caso, 0,2 mL de uma solução de oligómero fotosensível a 23% p/v é misturado com etileosina (10-4M) e -29-

Aí h*-yfr C—-J trietanolamina (0,01 a 0,1M) e a solução é irradiada com laser de iâo árgon (modelo de laser de ião árgon Americano modelo 905 emitindo a 514 nm) a uma potência de 0,2-0,5 W/cm . O feixe é expandido para um diâmetro de 3 mm e a amostra é lentamente varrido até que ocorra a gelificação.

Tabela 5: Tempos de Gelificação

Polímero Polimerização UV* Tempo de Gelificação (média ± D.P.) (s) Polimerizí Tempo de (s) 1 KG 5,3 ±4,1 < 1 4 KG 14,7 ±0,5 < 1 6 KG 9,3 ± 0,5 <1 10 KG 18, ±0,8 < 1 10 KL 7,7 ± 0,5 <1 18 KG 23,3 ±1,2 <1 20 KG 13,3 ± 0,5 < 1

Iniciador: 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona, concentração 900 ppm: 0,2 mL de solução de monómero a 23% em PBS.

Laser de ião árgon emitindo a 514 nm, potência 3 W/cm2: etileosina, sistema iniciador de trietanolamina; 0,2 mL de solução de monómero a 23% em PBS. -30-

Ath^rh C

Biodegradabilidade A biodegradação da rede de polímeros resultante é um critério importante em muitas aplicações biológicas. A degradação de poli(ácido glicólico) e de poli(ácido DL-láctico) tem sido bem documentada na literatura. A degradação ocorre principalmente através da hidrólise da ligação éster; a reacção é de segunda ordem e altamente dependente do pH. A contante de velocidade ao pH 10 é 7 vezes mais rápida que a que se observa ao pH 7,2.

Tal biodegradação fácil é surpreendente porque os poli(ésteres a-hidroxiácidos) são hidrofóbicos e altamente insolúveis em água. A acessibilidade da matriz do polímero para o ambiente aquoso cicundante é portanto limitado. Contudo, pelo facto de as redes serem hidrogéis que incham com água, todas as ligações éster na rede estão em contacto constante com água no ambiente aquoso envolvente. Isto resulta numa degradação em massa uniforme em vez de uma degradação de superfície destes géis. A Tabela 6 mostra os dados da hidrólise para algumas destas redes; os tempos listados são para completa dissolução de 60 mg de gel a pH 7,2 e 9,6. Tal como notado, a maioria dos géis dissolve dentro de 12 horas a pH 9,6. Um gel de 18,5 K dissolve dentro de 2,5 h a pH 9,6 enquanto um gel de 18,5 KCO não dissolve em 3 dias, indicando que as metades ésteres de lactoilo, glicoloilo, ou e-caprolactoilo é responsável pela degradação destas redes. Pode também ser visto que a hidrofilia reduzida e maior densidade de ligações cruzadas do último -31 -

At-ht-rt* C

-31 - C

Tabela 6: Dados de Hidrólise

Oligómero usado Tempo necessário para Tempo necessário para gelificação dissolver 0 gel a dissolver 0 gel a pH 9,6 (h) pH 7,2 (dias) 4 KG 6,2 5,5 10 KG 12,25 5,5 18,5 KG 2,25 >7 18,5 KC1 > 5 dias >7 18,5 KCO > 5 dias >7

Caracterização de macrómeros

Os espectros de FTIR dos prepolímeros foram registados num DIGILAB modelo FTS 15/90. A absorção a 1110 cm-1 (absorção característica C-O-C de PEG) mostra a presença de segmentos de PEG. A absorção forte a 1760 cm-1 mostra a presença de éster glicólico. A ausência de absorção devida ao grupo hidroxilo a cerca de 3400 cm-1 e uma absorção fraca devida à ligação dupla acrílica a 1590 cm-1 mostra a presença de ligações duplas acrílicas nos grupos terminais.

Foram registados espectros de protão de 500 MHz e espectros de carbono-13 de 125 MHz num instrumento GE 500. Podem ser vistos facilmente a presença de um pico muito forte a 4,9 ppm devido ao grupo metileno CH2 do segmento PEG, um pico a 5,09 ppm devido ao segmento éster glicólico e um singleto a 5,8 ppm de um protão acrílico. A massa molecular estimada do segmento PEG e do segmento ácido glicólico para diferentes copolímeros é apresentado na Tabela 2. O pico do carbonilo a 169,39 ppm atribuído ao ácido glicólico e o pico a 36,5 ppm atribuído aos carbonos metilénicos do PEG no -32- RMN de carbono-13 são consistentes com a composição química referida para estes copolímeros. A calorimetria de varrimento diferencial (Perkin Elmer DSC-7) foi usada para caracterizar os oligómeros para composições térmicas. Os oligómeros foram aquecidos desde 40°C a 200°C a uma velocidade de 20°C/min, causando presumivelmente polimerização. O polímero foi então arrefecido a —40°C a uma velocidade de 60°C/min e outra vez aquecido a 200°C a uma velocidade de 20°C/min. Os primeiros varrimentos de oligómero (18,5 KG) biodegradável de tetra-acrilato de glicolídeo de PEG 18,5 KG foram comparados com o varrimento de tetra-acrilato (18,5 KCO) de PEG 18,5 KG não degradável. Foi visto que uma transição vítrea aparece em 18,5 KG a -2aC enquanto tal transição não existe em 18,5 KCO. Um pequeno pico de fusão a 140°C era também evidente devido a alguns limites de ácido glicólico que podem cristalizar numa extensão limitada. O pico de fusão do PEG é deslocado para valores mais baixos em 18,5 KG a 57°C a partir de 60,7°C para 18,5 KCO. Este fenómeno acontece provavelmente devido à perturbação da estrutura cristalina do PEG de vido à presença de ligações do ácido glicólico. No terceiro ciclo, tempo ao qual os oligómeros já polimerizaram provavelmente, as transições Tm e Tg para os segmentos de glicolídeo podem não ser mais vistas, indicando que se formou uma rede de ligações cruzadas e que os segmentos de ácido glicólico já não são capazes de mobilidade. O grau de polimerização (D.P.) dos segmentos degradáveis adicionados à cadeia de PEG central solúvel em água foi determinado em vários casos usando ‘H-RMN. O valor de D.P. determinado experimentalmente foi considerado em concordância com o número calculado, tal como demonstrado na Figura IA. Assim, a reacção de abertura do anel iniciada pelos hidroxilos do PEG prossegue até estar completa, originando rendimentos quantitativos. -33-

Asf* CL-

Determinacão da água total, água livre e água ligada

Soluções dos vários macrómeros degradáveis foram preparadas como descrito acima. Foram preparados com a ajuda de um molde os géis em forma de discos. Usou-se 400 pL de solução para cada disco. As soluções foram irradiadas durante 2 minutos para assegurar a gelificação completa. Os géis em forma de disco foram removidos e secos sob vácuo a 60°C durante 2 dias. Os discos foram pesados (Wl) e de seguida extraídos repetidamente com clorofórmio durante 1 dia. Os discos foram secos novamente e pesados (W2). A fracção de gel foi calculada como W2/W1. Os dados são apresentados na Tabela 7. A seguir à extracção, os discos foram deixados a equilibrar com PBS durante 6 horas e pesados (W3 após ter sido cuidadosamente arrastado o excesso de água). O conteúdo total de água foi calculado como (W3-W2) x 100/W3. Foi usada calorimetria de varrimento diferencial (DSC) para determinar a quantidade de água livre que estava disponível nos géis (Hl). Foi usada uma velocidade de varrimento de 20°C/min e foi medida a capacidade calorífica para a endotermia da fusão da água (H2). A fracção de água livre foi calculada como H1/H2. Considerou-se que a água residual estava ligada devido a pontes de hidrogénio com os segmentos PEO. Os resultados indicaram a presença de água livre nos géis. Pode esperar-se que esta água livre ajude as proteínas e enzimas armadilhadas em tais géis a manter a sua confromação nativa e a reduzir a sua desactivação. Assim, estes géis apareceriam adequados para libertação controlada de micromoléculas biológicas. Estes dados para o conteúdo de água no gel estão resumidos na Tabela 7. -34-

Ai C-L(-.l

Tabela 7: Conteúdo de Água no Hidrogel Código de % de Água % de Água % de Água % Conteúdo Polímero Livre Ligada Total em Gel 1 kg 68,4 1,4 82,3±2,6 61,3±5,2 4 KG 78,0 9,3 87,3±1,9 56,3±2,6 6 KG 74,8 13,4 88,1+3,3 66,5±2,35 10 KG 83,7 10,8 94,5±0,5 54,3±2,6 10 KL 82,0 9,7 91,7±0,5 63,9±3,7 18,5 KG 71,8 22,3 94,0±0,4 47,0+4,9 20 KG 79,8 14,8 94,5+0,4 44,5+4,8

Exemplo 2: Uso de macrómeros multifuncionais 30 g de PEG solúvel em água tetrafuncional (PM 18,500) (PEG 18,5 KG) foi seco por dissolução do polímero em benzeno e destilando a água com azeótropo com benzeno. Numa caixa de luvas, 20 g de PEG 18,5 K, 1,881 de glicolídeo e 15 mg de octoato estanoso foram carregados num balão de 100 mL de fundo redondo. O balão foi tapado com uma rolha de vácuo, colocada num banho de óleo de silicone e ligada a uma linha de vácuo. A temperatura do banho foi aumentada até 200°C. A reacção foi realizada durante 4 horas a 200°C e 2 horas a 160°C. A mistura reaccional foi arrefecida , dissolvida em diclorometano e o copolímero foi precipitado por despejo num excesso de éter etílico seco. Foi de seguida redissolvido em 200 mL de diclorometano num balão de fundo redondo de 500 mL arrefecido a 0°C. A este balão, foram adicionados 0,854 g de trietilamina e 0,514 mL de cloreto de acriloilo sob atmosfera de azoto e a mistura reaccional foi agitada durante 12 h a 0°C. O cloridrato de trietilamina foi -35- separado por filtração e o copolímero foi recuperado a partir do filtrado por precipitação com éter dietílico. 0 polímero foi seco a 50° sob vácuo durante 1 dia.

Exemplo 3: Síntese de um macrómero fotossensível contendo DL-lactídeo PEG (PM) 20,000 (PEG 20 K) foi seco por dissolução em benzeno e destilação em benzeno e destilando a água com azeótropo com benzeno. Numa caixa de luvas, 32,43 g de PEG 20 K, 2,335 g de DL-lactídeo e 15 mg de octoato estanoso foram carregados num balão de 100 mL de fundo redondo. O balão foi tapado com uma rolha de vácuo, colocada num banho de óleo de silicone e ligada a uma linha de vácuo. A temperatura do banho foi aumentada até 200°C. A reacção foi realizada durante 4 horas a 200°C e 2 horas a 160°C. A mistura reaccional foi arrefecida , dissolvida em diclorometano e o copolímero foi precipitado por despejo num excesso de éter etílico seco. Foi de seguida redissolvido em 200 mL de diclorometano num balão de fundo redondo de 500 mL arrefecido a 0°C. A este balão, foram adicionados 0,854 g de trietilamina e 0,514 mL de cloreto de acriloilo sob atmosfera de azoto e a mistura reaccional foi agitada durante 12 h a 0°C. O cloridrato de trietilamina foi separado por filtração e o copolímero foi recuperado a partir do filtrado por precipitação com éter dietílico. O polímero foi seco a 50° sob vácuo durante 1 dia.

Exemplo 4: Síntese de um Precursor Fotossensível contendo DL-lactídeo e ε-Caprolactona, PEG (PM 600) (PEG 0,6 K) foi seco por dissolução em benzeno e destilação em benzeno e destilando a água com azeótropo com benzeno. Numa -36- caixa dc luvas, 0,973 g de PEG 0,6 K, 0,467 g de DL-lactídeo e 0,185 mg de octoato estanoso foram carregados num balão de 50 mL de fundo redondo. O balão foi tapado com uma rolha de vácuo, colocada num banho de óleo de silicone e ligada a uma linha de vácuo. A temperatura do banho foi aumentada até 200°C. A reacção foi realizada durante 4 horas a 200°C e 2 horas a 160°C. A mistura reaccional foi arrefecida , dissolvida em diclorometano e o copolímero foi precipitado por despejo num excesso de éter etílico seco. Foi de seguida redissolvido em 200 mL de diclorometano num balão de fundo redondo de 500 mL arrefecido a 0°C. A este balão, foram adicionados 0,854 g de trietilamina e 0,514 mL de cloreto de acriloilo sob atmosfera de azoto e a mistura reaccional foi agitada durante 12 h a 0°C. O cloridrato de trietilamina foi separado por filtração e o copolímero foi recuperado a partir do filtrado por precipitação com éter dietílico. O polímero foi seco a 50°C sob vácuo durante 1 dia, sendo liquido à temperatura ambiente.

Exemplo 5: Selecção de corantes para uso em fotopolimerização É posível iniciar a fotopolimerização com um agrande variedade de corantes como iniciadores e numerosos dadores de electrões como cocatalisa-dores eficazes. A Tabela 8 ilustra a fotopolimerização iniciada por vários outros corantes que possuem cromóforos absorvendo a comprimentos de onda bastante diversos. Todas as gelificações foram realizadas usando uma solução 23% p/p de 18,5 KG em solução salina tamponada com HEPES. Estes sistemas iniciadores comparam favoravelmente com sistemas iniciadores térmicos convencionais, tal como também pode ser visto da Tabela 8. Outros fotoiniciadores que podem ser particularmente úteis são 2-metoxi-2-fenil-acetofenona e canforquinona. -37-

Tabela 8. iniciação da Folimerlzação de 18,5 KG PEG INICIADOR FONTE TEMPERATURA DE LUZ1 0°C TEMPO DE GEL (SEG.) Eosina Y, 0,00015M; Trietanolamina 0,65M SI com filtro UV 25 10 Eosina Y, 0,00015M; Trietanolamina 0,65M S4 25 0,1 Azul de Metileno, 0,00024M; S3 Acido p-toluenossulfmico, 0,0048M 25 120 2,2-dimetoxi-2-fenil--acetofenona 900 ppm S2 25 8 Persulfato de potássio 0,0168M - 75 180 Persulfato de potássio 0,0168M; tetrametil -etileno-diamina 0,039M - 25 120 Tetrametiletileno-diamina SI com filtro UV 25 300

0,039M; Riboflavina 0,00047M 1

LISTA DE FONTES DE LUZ USADAS CÓDIGO FONTE

51 Lâmpada de mercúrio, LEITZ WETSLER Tipo 307- 148.002, 100W

52 Lâmpada de UV de longo compriemnto de onda Black Ray, modelo B-100 A W/FLOOD 53 Laser He-Ne MELLES GRIOT, 10 raW saída, λ=632 nm 54 American Laser Corporation, laser de ião árgon, modelo 09BP-15-01001; λ=488 e 514 nm -38-

Ai h^rfr CL_u (ci

Numerosos outros corantes podem ser usados para fotopolimeriza-ção. Estes corantes incluem mas não estão limitados a: Eritrosina, floxina, rosa de bengala, tíoneína, canforquinona, etileosina, eosina, azul de metileno e riboflavina. Os vários cocatalisadores possíveis podem ser usados, incluindo mas não limitados a: N-metil-dietanolamina, Ν,Ν-diemtil-benzilamina, trietanolamina, trietilamina, dibenzilamina, N-benziletanolamina, N-isopropilbenzilamina, e N-vinilpirrolidinona.

Exemplo 6: Géis Termosensíveis Biodegradáveis a partir de N-isopropilacrilamida Síntese de poli-isopropil-acrilamida de baixa massa molecular A N-isopropil-acrilamida (NIPAAm) foi recristalizada de uma mistura de hexano e benzeno, 65:35. O Azobisisobutirinitrilo (AIBN) foi recristalizado de metanol. Polimerizou-se 1,5 g de NIPAAm usando 3 mg de AIBN e 150 mg de mercaptoetanol numa mistura de acetona e água 1:1 (24 h a 65°C). O liquido viscoso obtido após polimerização foi purificado por disolução em acetona e precipitação com éter dietílico. Rendimento 80%.

Este poli(NIPAAm) de baixa massa molecular com terminação hidroxilo foi usado em reacções de extensão da cadeia utilizando glicolídeo e a reacção subsequente de endcapping com cloreto de acriloílo tal como descrito niutros exemplos. 1 g de oligómero baseado em poli(NIPAAm) modificado e 0,2 g 1KL foram dissolvidos em água a 0°C e polimerizados a 0°C usando 2-2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (900 ppm). -39-

-39- 1 KG • 4 KG 6 KG

10 KL 20 KG

Exemplo 7: Degradação In Vitro

Os géis foram extraídos tal como descrito no Exemplo 1 para remover a ffacção de macrómero não polimerizado e de seguida os géis foram colocados em solução salina tamponada com HEPES 50 mM (0,0% NaCl), pH 7,4 a 37°C. Foram periodicamente retiradas amostars em duplicado, lavadas com HBS fresco e secas a 100°C durante 1 dia e pesadas para determinar a perda de masa no gel. As composições dos vários géis usados foram as mesmas tal como descrito nos exemplos anteriores. A Tabela 9 mostra a extensão da degradação destes géis dada como percentagem de perda de masa ao longo do tempo. Os tempos respectivos são dados em parêntesis em conjunto com os dados de perda de massa.

Tabela 9: Degradação do gel 20,1% (ld), 20,36±0,6 (2d), 21,7±(6d), 28,8±16,6(10d). Tempo de Degradação total estimado 45 dias. 38,9 (ld), 60,3±4,2 (2d), 78,9 (3d), 99,3+4,7 (6d). Tempo de Degradação total estimado 5,5 dias. 18,3+6,8 (ld), 27,4 ±1,0 (2d), 32,8+11,3 (3d), 104,8+3,2 (5d). Tempo de Degradação total estimado 4,5 dias 10KG 0,6+ (8h), 100 (ld). Tempo de Degradação Total ldia. 10,0+4,84 (2d), 6,8+1,7 (3d), 4,5+3,1 (6d), 8,0+0,2 (lOd). Tempo de Degradação total estimado em 20 dias. 68,1+4,2 (8 h), 99,7+0,3 (ld). Tempo de Degradação total estimado 15 horas. -40- /4^ h^rh ^11·· ^ (

Exemplo 8: Adesão de fibroblasto e espalhamento A resposta in vitro das células do fibroblasto humano de pele (HFF) aos géis fotopolimerizados foi avaliada através da cultura de células em redes de polímeros. Foi polimerizada ao UV 0,2 mL de uma solução de monómero e em placas de vidro de 18x18 mm em condições estéreis. As células HFF foram alimentadas nestes géis a uma densidade de células de 1,8 x 104 células /cm quadrado (sq) de área em placa coberta num Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro de vitela 10%. Os géis foram incubados durante 6 h a 37°C numa atmosfera com 5% de CO2, tempo ao fim do qual foram lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células aderentes foram fixadas usando uma solução a 2% de glutaraldeído em PBS. Os géis foram examinados num microscópio de contraste de fase com uma ampliação de 200x, e avaliou-se o número de células aderentes e espalhadas através do exame de 5 campos seleccionados a localizações predeterminadas nas placas. O número de células aderentes é apresentado na Tabela 10 bem como os valores para as superfícies de controlo do vidro. A adesão celular é dramaticamente reduzida no vidro coberto com gel.

Tabela 10: Adesão Celular

Superfície Células ligadas /cm2 Vidro 13220± 3730 18,5 KG 250+240 18,5 KC1 1170+1020 18,5 KCO 390+ 150 -41 - h^rh C*~

Fotografias típicas destas células nas superfícies de gel de 18,5 KC1 e em superfícies de vidro de controlo são apresentadas nas Figuras 2A e 2B. Pode ser facilmente observado a partir da Tabela 10 que estes géis são altamente resistentes ao crescimento celular. Mesmo o de 18,5 KC1 é ainda menos de 10% do vidro. As células ligadas à superfície do vidro mostram uma morfologia aplanada e bem espalhada enquanto algumas células que estãoligadas ao gel são arredendadas e loosely ligadas. Este fenómeno pode resultar do facto de as cadeias de PEG hidratadas tenham mobilidade elevada e têm mostrado ser eficazes na minimização da adsorção de proteína. Um dos mecanismos pelos quais a adesão celular é mediada é através da interacção dos receptores da superfície celular com proteínas de adesão celular adsorvidas. Assim a redução na adsorção global de proteína resulta em adsorção de proteínas da adesão celular.

Exemplo 9: Libertação de Proteína (Albumina de Soro Bovino) a partir de Polímeros

Foi usado 1 KG para este estudo. Este macrómero era liquido à temperatura ambiente e foi utilizado tal e qual. 1 mg de albumina de soro bovino (BSA) foi adicionado por mLde solução de monómero e também 0,9 mg (mL de 2,2-dimetoxi-2-fenil-acetofenona como iniciador. A proteína foi dissolvida na solução de monómeroe formaram-se géis em forma de disco por exposição de 0,2 g de mistura de macrómero ao LMUV durante 1 min. Dois de tais discos foram colocados num balão contendo 20 mL de PBS e incubados a 37°C. Foram então removidas periodicamente duas alíquotas de 20 pL cada a partir destes balões e a quantidade de BSA libertada foi determinada utilizando o ensaio da detrminação de proteína total da Bio-Rad. O perfil de libertação para BSA é mostrado na Figura 3 A. Pode ser observado que a libertação de BSA é relativamente estacionária durante mais de um mês. -42- -42- c

h*.rfr CL

Exemplo 10: Ensaio de Libertação de Enzima A determinação da solubilidade em água dos meiso de gelificação dos macrómeros pode ser realizada num ambiente não-tóxico. Isto faz com que estes materiais se tomem adequados para usos intraoperativos quando seja necessária a gelificação in situ. Uma vez que os precursores são solúveis em água, os géis podem ser usados como veículos de libertação de fármacos para fármacos solúveis em água, especialmente fármacos macromoleculares tais como enzimas, as quais de outro modo seriam desnaturadas e perderiam a sua actividade. A libertação de lisozima e tPA a partir dos polímeros foi usada para ilustrar a exequibilidade do uso de hidrogéis biodegradável para libertação controlada de biomoléculas.

Libertação de lisozima A enzima lisozima (M: 14,400) é um modelo conveniente para libertação de uma proteína de massa molecular baixa a partir de um gel biodegradável. O ensaio de proteína total pelo método Biorad foi usado para quantificar a enzima libertada. A enzima foi dissolvida cilíndrico em PBS a uma concentração de 20 mg/mL. O monómero diacrilato de ácido PEG-dl-láctico foi dissolvido em PBS para produzir uma solução a 40%. A solução de lisozima foi adicionada à solução de monómero até atingir uma solução de monómero a 24%. A solução de monómero/lisozima foi polimerizada sob luz ultravioleta num molde, usando 30 pL do iniciador 2,2-dimetoxi-2-fenil-acetofenona em l-vinil-2-pirrolidona (30 mg/mL) como iniciador. O polímero foi cortado em 10 pedaços de igual tamanho e imerso em 10 mL de PBS. As amostras do PBS foram retiradas a determinados intervalos e avaliadas as libertações de lisozima para dentro do PBS. A lisozima foi libertada a partir de gel de diacrilato de ácido -43- PEG-DL-láctico sobre um intervalo de 8 dias, com a velocidade máxima de libertação ocorrendo dentro dos primeiros 2 dias, tal como demonstrado pela Figura 3 B.

Libertação de tPA recombinante

Foram usados três macrómeros para estes estudos: 1 KL, 4 KG, e 18,5 KG. O macrómero 1KL era liquido à temperatura ambiente e foi usado tal e qual. O segundo macrómero, 4 KG, foi usado como uma solução a 75% m/m em PBS. A terceira composição foi uma mistura de partes iguais de 1 KL e uma solução a 50% m/m de 18,5 KG. Adicionou-se 3,37 mg de activador de plasminogénio de tecido (cadeia simples, recombinante, M 71 000) por cada grama de solução de macrómero simultaneamente com 0,9 mg/mL de 2,2-dimetoxi-2-fenil-acetofenona como iniciador. A proteína foi dissolvida com o macrómero e os géis em forma de disco foram feitos por exposição de 0,2 g de mistura de macrómero ao LMUV durante 1 minuto. Dois de tais discos foram lavados com PBS, colocados num balão contendo 5 mL de PBS e incubados a 37°C. Duas alíquotas de 100 pL cada foram removidas destes balões periodicamente e a quantidade de t-PA activo libertado foi determinado usando um ensaio com substrato cromogénico (Kabi-vitrum). Os perfis de libertação a partir dos géis de lactídeo lK/glicolídeo 18,5K são apresentados nas Figuras 4a-4C. Podem ser libertados tPA completamente activos durante períodos até pelo menos dois meses.

Seleccionando uma formulação apropriada, a velocidade de libertação pode ser adaptada para uma aplicação em particular. E também possível combinar formulações com diferentes massas moleculares de modo a conseguir sinergisticamente atributos apropriados para a libertação e -44- Aí características mecânicas.

Para prevenção de adesões pós-operativas, em adição ao efeito de barreira dos géis, os géis podem ser fixados com um agente fíbrinolítico para lisar adesões incipientes tipo filme que escapam o efeito da barreira. Isto aumenta posteriormente a eficácia de géis biodegradáveis na prevenção da adesão.

Exemplo 11: Toxicidade de Polímeros e Adesivos Comerciais

Para avaliar a toxicidade da polimerização in situ das soluções de macrómeros aqui descritas, tal como comparado com adesivos comerciais, 100 μι de slução de pré-polímero 18,5KCO foi colocada no lobo direito do fígado de ratazana e gelificada por exposição ao LMUV durante 15 segundos; de modo semelhante, algumas gotas de cola baseada em cianoacrilato em n-butilo foram colocadas no lobo esquerdo. Após excisão do fígado uma semana depois, seguida de fixação em formalina a 10% neutra tamponada, foi bloqueado em parafina, seccionado e tingido usando hematoxilina e eosina. Não foi evidente qualquer reacção adversa de tecido na superfície do lobo exposto ao gel biodegradável.Também não foi detectada qualquer reacção inflamatória para o processo de polimerização. O epitélio tem uma aparência normal, sem reacção a corpos estranhos.

Em comparação, o lobo exposto à cola de cianoacrilato mostra necrose de tecido extensa e escariação com tecido necrótico de 10-30 células de profundidade. A fibrose é evidente nas porções necróticas próximas do tecido normal underlying. -45-

C.--J

Exemplo 12: Prevenção de AdesOe:s Pós-clrúrgicas com Polímero Biodegradável

Foi preparado um material viscoso estéril numa solução a 23 % em solução salina tamponada com fosfato (8,0 g(L NaCl, 0,0201 g/L, 0,611 g/L Na2HP04, 0,191 g/L KH2P04, pH 7,4de polietilenoglicol (M 18 500 ) o qual foi objecto de entensão a cadeia em ambas as terminações com uma unidade repetitiva de poliglicolídeo (número médio de resíduos de glicolidilo: 10 em cada terminação) e que foi subsequentemente terminado com um grupo acrilato. Foi adicionado o iniciador necessário para a reacção de ligações cruzadas, foi adicionado 2,2-dimetoxi-2-fenil-acetofenona, ao macrómero em solução para conseguir uma concentração de iniciador de 900 ppm. Uma segunda exposição subsequente de 30 segundos à lâmpada de UV próximo (Blak Ray) é suficiente para causar polimerização.

Avaliação de Modelos Animais

Os modelos animais avaliados incluíram um modelo de ceco da ratazana ceco e um modelo de horm uterino de coelha. No modelo de ceco de ratazana, 6 em 7 animais tratados com a solução de macrómero não mostraram quaisquer adesões, enquanto os animais não tratados mostraram formação consistente de adesão densa. No modelo da trompa uterina de coelha, foi observada uma redução significativa (p<0,01) na formação da adesão nos animais tratados com o gel. Estudos conduzidos em ratazanas usando somente a solução viscosa precursora não gelificada (sem LMUV) falharam na prevenção da formação de adesões. -46-

Mh^rb C

Modelo do ceco de ratazana

Foram divididos em 3 grupos de 21 ratazanas macho Sprague-Dawley tendo um peso médio de 250mg, sendo dois grupos para tratamento e dois controlos. O abdómen foi barbeado e preparado com uma solução de betadine. Uma incisão na linha média foi feita sob condições de anestesia com Equithesin. O ceco foi localizado e foram preparadas 4 a 5 scrapes numa região a cerca de 2x1 cm num dos lados do ceco, usando uma caneleira de tela metálica para produzir lesões e de seguida poder fazer a punção. As incisões abdominais nestes animais foram fechadas utilizando uma sutura 4,0 de seda para a camada musculoperitoneal e 7,5 mm de grampos de aço inoxidável para a camada cutânea. Foi aplicado um antibiótico tópico no local da incisão. O primeiro grupo consistiu de 7 animais servindo como controlos sem tratamento para confirmar a validade do modelo. O segundo grupo serviu como controlo, com a aplicação do precursor mas sem fotopolimerização para formar o hidrogel. Após indução da lesão cecal, cerca de 0,25 mL da solução do precursor foi aplicada no local de lesão usando uma pipeta. A incisão abdominal foi então fechada como acima. O terceiro grupo serviu como grupo de tratamento com gel e foi preparado como o segundo grupo excepto que o filme de precursor foi exposto a uma lâmpada de LMUV durante 45 segundos para provocar a gelificação. Tanto o lado obverso como o inverso do ceco foram tratados de modo semelhante com precursor e luz. Nenhuma tentativa foi feita para secar a superfície do tecido, para remover o sangue, ou para irrigar a área antes do tratmento.

Os animais foram sacrificados ao final de duas semanas por asfixia -47- CL·· com CO2. As incisões foram reabertas e as adesões foram scoted em relação à localização, extensão, e tenacidade. A extensão de lesões foi referida como uma percentagem da área traumatizada do ceco que forma adesões com órgãos adrenais ou da parede peritoneal. A tenacidade das adesões foi pontuada numa escala de 0 a 4; sem adesões- grau 0; tentativa de adesões transparentes preliminares que frequentemente se separam por si próprias- grau 1; adesões que conferem alguma resistência mas podem ser separadas à mão - grau 2; adesões que requerem a dissecação com um instrumento de agulha curta e grossa para separar- grau 3; e adesões espessas densas que requerem um dissecação fina com instrumento no plano da adesão a separar- grau 4.

Resultados do modelo do ceco de ratazana O grupo de controlo sem tratamento mostra consistentemente adesões densas e extensas. Verificou-se que a extensão da área esfolada coberta com adesões é de 73±21% (média ± D.P., n=7). A severidade de adesões foi classificada entre 3,5+0,4, A maioria das adesões era densa e fibrosa, envolvendo o ceco consigo próprio, com a parede peritoneal e com outros órgãos tais como o fígado, intestino delgado, e intestino grosso. Observou-se frequentemente o envolvimento do mesentério com as adesões. No grupo de controlo com ma aplicação de solução de precursor mas sem gelificação por exposição à lâmpada de LMUV, a extensão da adesão foi de 60+24% (n=7), e a severidade de adesões foi de 3,1± 0,4. No grupo tratado com o gel, o ceco estava completamente livre de adesões nos 6 em cada 7 animais. Num caso, uma adesão de grau 2 foi observada com o mesentério acima de 10% da área e um grau de adesão de 2,5 foi observado em mais de 15% da área, estabelecendo uma ponte do ceco às suturas no local da incisão na parede peritoneal. A extensão global de adesão para o grupo foi de 4%, e a severidade global fo 0,32. Não houve evidência de gel residual visível, tendo o gel ficado degradado dentro das primeiras duas semanas. A aparência do ceco era de cor esbranquiçada com uma camada fibrosa na superfície no grupo de controlo, mas o tecido tinha aspecto saudável e normal em animais tratados com o gel.

Modelo da trompa uterina de coelha

Seis coelhas fêmeas sexualmente maduras da Nova Zelândia pesando entre 2 e 3 kg foram preparadas para cirurgia. Fez-se uma incisão no eixo central na região abdominal mais baixa sob anestesia de Acepromazine, Rompun e Cetamina.As trompas uterinas foram localizadas e a vasculatura de ambas as trompas foi sistematicamente cauterizada para induzir uma doença isquémica. Um animal foi rejeitado do estudo devido a trompas uterinas imaturas. Sete coelhas foram seleccionadas para o tratamento com apenas hidrogel fotopolimerizável e foram seleccionados dois animais para avaliação da eficácia combinada do hidrogel com um agente fibrinolítico, activador de plasminogénio de tecido (tPA). Usou-se solução de macrómero de 5 mg tPA/mL no último caso. Após cauterização, as soluções de macrómero (0,5 mL) foram aplicadas ao longo da trompa e deixadas a revestir a superfície onde foi induzida a cauterização da lesão. Após estar completa a aplicação uniforme da solução, as trompas foram expostos a uma lâmpada LMUV durante 1 min para induzir a gelificação. O procedimento foi repetido no sítio inverso das trompas. As incisões foram então fechadas usando uma sutura de Vicryl (Ethicon) contínua 2-0 para a camada musculoperitoneal e uma sutura Vicryl (Ethicon) para a camada cutânea. Não foram administrados antibióticos profilácticos. Não foram observadas complicações ou infecções pós-operatórias.Foram usados cinco animais no grupo de controlo. A lesão isquémica foi feita como descrito e a incisão foi fechada sem -49-

Af-b^rb C-J a aplicação do precursor; todas as tccnicas foram idênticas entre o grupo de tratamento e o grupo de controlo.

Foram utilizados controlos em que os mesmos modelos animais foram submetidos a cirurgia sem aplicação do macrómero; todas as técnicas cirúrgicas foram idênticas entre o grupo de tratamento e os controlos históricos.

As coelhas foram reoperadas sob anestesia de cetamina ao fim de duas semanas para avaliar a formação da adesão; foram depois sacrificadas por injecção de KC1 intracardíaca. A formação da adesão foi avaliada através da sua extensão e tenacidade. A extensão da formação da adesão foi avaliada por medição do comprimento do trompa uterina que formava adesões consigo próprio ou com a parede peritoneal ou outros órgãos. A tenacidade da adesão foi classificada quer como tipo filme ou fibroso. Adesões tipo filme foram habitualmente transparentes, menos fortes e podia ser libertadas manualmente. As adesões fibrosas foram densas, esbranquiçadas, e habitualmente requerendo dissecação fina com instrumento para serem libertadas. Em casos em que apenas uma banda de adesão única do tipo filme era evidente, foi atribuída uma pontuação de 5%.

Amostras típicas do trompa foram submetidas a excisão para histologia e foram fixadas num tampão de solução de formalina neutra a 10%. Secções de parafina das amostras foram fixadas usando hematoxilina e eosina.

Resultados do modelo de trompa uterino de coelha A pontuação da adesão consiste na % de área afectada ocupada -50- pelas adesões, com graduação de cada uma como sendo tipo filme ou fibrosa. Foram observadas anatomias de trompa distorcidas em animais controlo. A pontuação média no grupo de controlo foi de 50±15% da área afectada do trompa ocupada por adesões sendo 10% destas tipo filme e 90% do tipo fibroso. Foram observadas anatomias de trompa distorcidas, tal como pode ser visto a partir da Figura 5A o qual apresenta uma vista superior da trompa uterina num animal usado como controlo, o qual mostrou adesões em acima de 66% da superfície da trompa. O grupo de animais tratado apenas com o macrómero fotopolimerizado mostrou uma pontuação de adesão de 13+11,4% (n=10). Entre estas, 4 animais mostraram menos de 5% de adesões com apenas uma banda do tipo filme ocasionalmente visível.

Os animais tratados com gel fotopolimerizado contendo tPA mostraram resultados melhorados sobre os animais com "gel apenas." Alguns animais mostraram uma banda do tipo filme em ambas as trompas esquerdo e direito. Foi-lhes atribuída uma pontuação de 5% com uma pontuação total de 10%. Os outros animais não mostraram quaisquer adesões. Assim, a pontuação total para estes animais foi de 5±5%. A Figura 5B mostra a anatomia normal do trompa numa trompa tipica que foi submetida a tratamento com gel. As adesões são do tipo filme em todos os casos e não são observadas bandas densas. Não foram detectados vestígios do gel remanescente. Amostras típicas de trompas mostrando adesões do tipo filme mostraram alguns tecidos fibrosos com camadas espessas de 6-15 células de fibroblastos evidenciando algumas fibrilhas de colagénio mas sem formação de fibras de colagénio densas. As trompas não apresentavam adesões mas possuíam ocasionalmente uma camada espessa de fibroblastos de 1-4 células, e principalmente um epitélio normal sem evidência de células inflamatórias.

Este mesmo procedimento foi ligeiramente modificado como descrito abaixo como um modo melhor de usar os polímeros para prevenir adesões pós-operativas usando o modelo de trompa uterina de ratazana.

As ratazanas fêmeas foram anestesiadas com pentobarbital (50 mg/kg, intraperitonealmente), e de seguida foir efectuada uma laparatomia na linha média. As trompas uterinas foram expostos, e a vasculatura na arcada alimentando as trompas foi sistematicamente cauterizada usando cauterização bipolar; não foram cauterizados o vaso grande mais distai e o vaso grande mais proximal em cada trompa. De seguida, a superfície antimesentérica de cada trompa foi cauterizada a duas manchas de 1 mm de diâmetro em cada trompa, cada um aseparada por uma distância de 2 cm, estando o par centrado ao longo do comprimento de cada trompa. A seguir à lesão, 0,5 mL de solução de macrómero foi aplicado per trompa e foi gelificado por exposição à luz ultravioleta de longo comprimento de onda (365 nm, aproximadamente 20 mW/cm2) durante 15 segundos por superfície no lado da frente e no lado de trás de cada. O útero foi substituído na cavidade peritoneal, e foram fechadas as camadas de pele e musculoperitoneal. O macrómero consistia de uma cadeia de PEG de M 8,000 daltons, extendidaem ambos os lados com um oligómero de ácido láctico possuindo um grau de polimerização médio de 5 grupos lactidilo, e posteriormente acrilado nominalmente em ambas as extremidades por reacção com cloreto de acriloilo.Num lote, lote A, o grau de acrilação foi determinado por RMN como -52- CL— sendo aproximadamente 75%, e em outro, lote B, foi determinado como sendo superior a aproximadamente 95%. O macrómero foi dissolvido em solução salina a uma concentração especificada, e o sistema de iniciação usado foi 2,2-dimetoxi-2-fenil-acetofenona a partir de uma solução de reserva em N-vinil-pirrolidinona, sendo a concentração final de 2,2-dimetoxi-2-fenil-acetofenona de 900 ppm e a concentração final de N-vinil-pirrolidinona com valor de 0,15%.

Num conjunto de experiências, o macrómero do lote A foi aplicado em concentrações variadas, e as adesões foram pontuadas aos 7 dias pós-operatório. A pontuação foi realizada por dois meios. O comprimento das trompas envolvidas nas adesões foi medido com uma régua, e foi calculada a fracção do compriemnto total. A natureza das adesões foi também pontuada numa escala subjectiva, significando 0 ausência de adesão, 1 equivale a adesões do tipo filme que são facilmente separadas manualmente, e 2 equivalendo a adesões densas que podem apenas ser separadas por dissecação instrumental fina. Além disso, uma das amostras continha activador do plasminogénio de tecido (t-PA), que se sabe ser capaz de reduzir adesões, a uma concentração de 0,5 mg/mL (0,5%) de solução de macrómero. Os resultados são apresentados na Tabela 11 para a porção A e para a porção B de macrómero.

Num terceiro conjunto de experiências, formaram-se adesões em ratazanas fêmea tal como descrito acima, e as adesões foram cirurgicamente Usadas 7 dias após a cirurgia inicial. A extensão e grau de adesões foi pontuada durante a lise. Os animais foram divididos em dois grupos, e um grupo foi tratado com macrómero de lote B a uma concentração de 10%. Os resultados são apresentados na Tabela 11 como lote B, 10%. -53- £3*. γ í—~~

Tabela 11: Red lição de AdesOes eom Polímero

Concentração Extensão de Grau de Número de de Macrómero Adesões Adesões Animais % fD.P.l £0-2).,_ - Polímero A 15% 24,6 (3,1) 1,1 (0,1) 7 20% 33,6 (9,8) 1,2(0,3) 7 25% 37,5(11,1) 1,2(0,1) 7 30% 54,2 (12,0) 1,6(0,4) 6 20% + T-PA 18,3 (6,4) 1,1 (0,1) 6 Controlo (solução salina) 72,6(18,7) 1,5 (0,2) 7 Polímero B 5% 22,1 (4,2) 1,2 (0,1) 7 10% 10,0 (5,1) 1,0(0) 7 15% 17,8 (5,7) 1,0(0) 7 20% 26,3 (11,4) 1,4(0,2) 7 Controlo (solução salina) 75,9 (4,4) 1,8 (0,3) 7 Polímero B, 10% Pontuação Grupo que Realizada a: se ensaiou: Tempo de lise Controlos 85,9 (9,7) 1,8(0,1) 7 Tempo de lise Tratamento 79,4(6,8) 1,7 (0,2) 7 7 dias após lise Controlos 78,8(11,3) 1,8 (0,1) 7 7 dias após lise Tratamento 28,2 (5,1) 1,0 (0) 7 -54- -54-

At b^rfr

Os resultados acima descritos ilustram que o macrómcro fotopolimerizado pode reduzir ou prevenir adesões pós-operatórias em ambos os modelos de adesões primárias e de adesiolise, e também que o gel pode ser usado para libertar localmente o fármaco de modo a exercer um efeito benéfico combinado.

Exemplo 13: Anastomose do Nervo O nervo ciático de uma ratazana foi primeiro arrancado asseptica-mente usando um escalpelo e forçado a afastar-se. As dus extremidades do nervo foram colocadas em posições opostas usando fórceps estéreis, e uma solução a 50% em tampão de polímero 1 KL, um macrómero preparado a partir de PEG 1K com extensão de cadeia de lactídeo e terminação de acrilato, com 0,1 % de 2,2-dimetoxi-2-fenoxi-acetofenona foi aplicada às pontas do nervo. A área afectada foi iluminada com uma lâmpada de LMUV de 100 W durante 60 segundos, e foi observada a formação de uma banda adesiva entre as pontas de nervos proximal e distai.

Com o objectivo de assegurar a biocompatibilidade do material aplicado com o tecido do nervo, a mesma solução de macrómero foi aplicada a nervos ciáticos de ratazana não arrancados, e a área da incisão foi fechada usando técnicas cirúrgicas de referência para animais de pequeno porte. A área foi reaberta ao fim de 1 hora e 24 h após operação, e a área afectada do nervo foi removida em bloco e preparada para microscopia de transmissão electrónica. Não foram observadas quaisquer diferenças morfológicas entre os nervos tratados em qualquer ponto quando comparado com os nervos ciáticos da ratazana de controlo que de outro modo não foram manipulados, embora tenham sido traumatizados e manipulados. -55-

Exemplo 14: Avaliação de Géis Degradáveis Baseados em PEG como Adesivos de Tecidos

Abas de músculo abdominal de coelhas fêmeas brancas da Nova Zelândia foram excisadas e cortadas em tiras de 1 cm x 5 cm. As abas foram de uma espessura de aproximadamente 0,5 a 0,8 cm de espessura. Foi feita uma aba sobreposta, 1 cm x 1 cm, usando duas de tais abas. Duas composições diferentes, 0,6 KL e 1 KL, foram avaliadas nestes tecidos. Ambas estas composições eram líquidos viscosos e foram usadas sem diluição posterior. Foram adicionados 125 pL de solução de etileosina em N-vinilpirrolidona (20 mg/mL) e também 50 pL de trietanolamina a cada mL de desta solução de adesivo. De seguida foi aplicado 100 mL de solução de adesivo a cada uma das abas sobrepostas. A aba sobreposta foi então irradiada por varrimento com um feixe de laser de ião Árgon 2W durante 30 segundos a partir de cada lado. A força das juntas resultantes foi avaliada através da medição da força requerida para penetrar a aba sobreposta. Uma extremidade da aba sobreposta foi presa e uma carga crescente foi aplicada à outra extremidade, enquanto se fixava a junta horizontalmente até falhar. Foram testadas quatro juntas para cada composição. As juntas 1 KL apresentavam uma força de 6,6 ± 1,0 Kpa (média ± D.P.), enquanto as juntas 0,6 KL apresentavam uma força de 11,42 ± 2,9 Kpa. É significativo notar que é possível conseguir a fotopolimerização e uma força de junta razoável apesar da espessura de 6-8 mm do tecido. Uma estimativa espectrofotométrica usando luz de 524 nm mostrou menos de 1% da transmissão através do tecido de tal músculo.

Exemplo 15: Cadeia de PEG extendida com Poliortocarbonatos e Coberta com Metacrilato de Uretano 3,9-bis(metileno)-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5,5]undecano (1 g) e polietilenoglicol (massa molecular, 1000, 7,059 g) foram pesados num tubo de -56-

Schlcnk de 250 mL sob atmosfera de azoto seco numa caiha de luvas. Introduziu-se a seguir 50 mL de tetra-hidrofurano sob atmosfera de azoto e a mistura reaccional foi agitada durante 6 horas a 50°C. Este é um passo típico de desenvolvimento da reacção com uma estequiometria perturbada, resultando um poliortocarbonato de baixa massa molecular com grupos hidroxilo terminais. O oligómero foi separado por precipitação em hexano e seco sob vácuo. Redissolveu-se 5 g de oligómero em THF seco no qual foi lentamente introduzido 20 pL de dilaurato de dibutilestanho e 2 mL de metacrilato de 2-isocianatoetilo e a temperatura foi aumentada até 50°C. Foi mantida a temperatura durante 6 horas e de seguida arrefeceu-se a mistura reaccional. O produto foi separado por precipitação em hexano. Neste gel, a região degradável é um poliortocarbonato.

Exemplo 16: Microencapsulação de Células Animais

Uma solução a 23% m/m de 18,5 KG em solução salina tamponada com HEPES (5 mL) foi usada para ressuspender 106 células. CEM-SS. Usou-se etileosina (10'4 M) como uma solução em N-vinilpirrolidona como iniciador e trietanolamina (0,01 M) foi utilizada como co-iniciador. A solução foi então exposta a um laser de ião árgon (514 nm, 2 Watts) através de um aparelho de coextrusão. O aparelho de coextrusão continha óleo mineral como fluido circulante anelado (velocidade de fluxo de 4mL/min) ao redor de uma corrente de extrusão da suspensão de célula precursora (velocidade de fluxo 0,5 mL/min). As microgotas gelificaxam rapidamente ao serem expostos à radiação laser e foram recolhidos no PBS abaixo. As microsferas formadas foram amplamente lavadas com tampão PBS para remover monómero por reagir e iniciador residual. O tamanho e forma das microsferas era dependente da velocidade de extrusão e do diâmetro do capilar de extrusão (18 Ga a 25 Ga). Os tempos de polimerização foram dependentes da concentração do iniciador (etileosina 5 μΜ a 0,5 mM, -57- C- vinilpirrolidona (0,001% a 0,1%), e trietanolamina (5 mM a 0,1 M), poder laser (120 mW a 2 W), e concentração de monómero (>10% m/v). Esferas preparadas usando este método apresentavam um diâmetro de 500 pm a 1200 pm. As polimerizações foram realizadas a pH fisiológico em presença de ar. Isto é significativo uma vez que as polimerizações radicalares podem ser afectadas pela presença de oxigénio. A viabilidade celular subsequente à encapsulação foi testada pelo ensaio de exclusão com azul de tripan e verificou-se que as células encapsuladas são amis de 95% viáveis após encapsulação.

Exemplo 17: Várias Formulações para a Prevenção de Adesões Pós-Operatórias A utilidade de diacrilatos e tetra-acrilatos de PEG-oligo(cc-hidroxi-ácido) para prevenir adesões pós-operatórias foi avaliada no modelo de trompa uterino de coelha como descrito acima. Foram sintetizados os polímeros seguintes, tal como descrito acima: diacrilato de lactídeo de PEG 6K (6 KL), diacrílato de lactídeo de PEG 10K (10 KL), lactídeo de PEG 18,5 K (18,5 KL), lactídeo de PEG 20 K (20 KL). Soluções com 24% de polímero em PBS com 900 ppm de 2,2-diemtoxi-2-fenil-acetofenona, foram preparados como descrito acima. As soluções foram aplicadas ao trompa uterino após cauterização da arcada vascular e irradiadas com uma lâmpada LMUV de 365 nm, tal como descrito acima. Numa formulação, 18,5 KL, 5 mg de t-PA foram misturados numa solução antes da aplicação. Os controlos consistiram de animasi manipulados e cauterizados mas não tratados com solução de macrómero. As medidas foram realizadas no 14° ± 1 dia. A extensão da adesão foi estimada a partir da fracção do trompa que foi envolvida em adesões , e a tenacidade de adesões foi pontuada como 0, sem adesões; 1, adesões do tipo filme que não oferecem resistência à dissecação; 2, adesões fibrosas que são dissectáveis á mão; 3, adesões fibrosas que são dissectáveis com instrumentos de blunt; e 4, adesões -58- fibrosas que 3ão disscctávcis por instrumentos finos. Os resultados obtidos são a seguir apresentados, em que são mostradas a extensão das adesões e a tenacidade.

Tabela 12: Eficácia do Polímero na Prevenção de Adesões

Formulação Número de Extensão, %, Tenacidade, 0-4 Animais ± S. D. ±S. D. 6 KL 7 0,9 ± 1,7 0,9 ± 0,7 10KL 7 0 +0 0 + 0 20 KL 6 4,4 ± 5,0 0,9 ± 0,7 18,5 KL 7 8,9 ± 13,1 1,6 ±1,3 t-PA Controlo 7 35 ±22 3,3 ± 0,6

Exemplo 18: Polimerização de Camadas Ultrafinas de Polímero na superfície dos vasos sanguíneos para reduzir a trombose após lesão nos vasos

Foram recolhidos vasos sanguíneos de ratazanas e lavados até não conterem sangue. O endotélio do vaso foi removido por inserção de um prego de madeira e rodando o vaso sobre o prego. Foi utilizado um vaso como controlo, o qual foi exposto a corrente de sangue tal como descrito abaixo sem posterior modificação. Outro vaso foi tratado primeiro por exposição a eosina Y à concentração de 1 mM em solução salina, depois lavado em solução salina tamponada com HEPES, de seguida preenchido com uma solução de PEG-MA, PEG 10K com acrilato e PEG 10K com acrilato de oligómeros cobertos de DL lactídeo nas extremidades, contendo trietanolamina (TEA) (100 mM) e N-vinilpirrolidona (VP) (0,15%) e depois irradiada por exposição a laser de ião árgon a 0,5 W/cm2 durante 15 segundos. A mistura de prepolímero não polimerizado no lúmen do vaso foi lavada e retirada com solução salina. O -59- /Qt ^ rb CL—( sangue humano foi recolhido de uma veia do antecúbito e foi anticoagulado com heparina a 2 unidades/mL. Este sangue foi perfundido através de cada vaso por uma bomba de seringa a uma velocidade de fluxo correspondendo a uma velocidade de penetração de parede de aproximadamente 200/s durante 7 min. 0 vaso foi então superficialmente lavado em solução salina e fixado com formaldeído. 0 vaso tratado não apareceu colorido de cores diferentes após perfusão quando comparado com a sua cor antes da perfusão, enquanto o vaso de controlo não tratado apareceu vermelho cor de sangue. Foram cortados segmentos finos de cada vaso e reunidos e examinados por microscopia de varrimento electrónico ambiental (ESEM). ESEM foi realizado em amostras hidratadas sob vácuo ralativamente baixo. Estas condições permitem a visualização da cobertura fina de polímero no estado inchado e húmido. São condições importantes para obter medidas que podem ser rapidamente interpretadas, uma vez que o filme de polímero é constituído por aproximadamente 95% de água. Foi observado um grau elevado de trombose no vaso de controlo. O lúmen deste vaso estava mais estreito até menos de um terço do seu diâmetro de pre-perfusão devido à acumulação de trombos, tal como mostrado na Figura 6 A. Pelo contrário, não se observou nenhum trombo no lúmen do vaso tratado, tal como mostrado na figura 6 B. Uma ampliação maior da parede do vaso demosntrou a inexistência de trombos aderentes. Uma ampliação ainda maior mostra uma estrutura branca que é o filme de polímero, que é diferente em contraste com o tecido devido à carga diferencial sob o feixe de electrões do ESEM. O filme pode ser visto com a sua forma precisamente em conformidade com a forma do vaso e com espessura de aproximadamente 5-8 pm. A região de polimerização foi restrita à vizinhança da superfície da parede do vaso sanguíneo. O corante fotossensível foi adsorvido à parede do -60- fj*. C' 1 — ( ''i vaso. O corante não ligado foi lavado e retirado. Todo o lúmen foi preenchido com prepolímero, mas após a irradiação a formação de gel ficou restringida à parede do vaso em que o corante e o prepolímero se encontravam. Este processo de polimerização interfacial pode ser conduzido para produzir camadas de superfícies aderentes cuja espessura varia desde menos de 7 pm a mais de 500 pm. O procedimento acima descrito foi realizado em artérias de 8 ratazanas de controlo, e 8 artérias tratadas, com resultados histológicos equivalenets observados à luz do microscópio como descrito acima. Tal como demonstardo neste estudo, os prepolímeros PEG podem ser polimerizados na própria superfície do lúmen dos vasos sanguíneos. O efeito imediato desta modificação é reduzir a capacidade trombogénica de uma superfície de vaso sanguíneo lesionada. Este efeito tem uma utilidade indiscutível na melhoria do efeito de uma angioplastia de balão por reduzir a capacidade trombogénica do vaso e a ferida da lesão por dilatação de balão. Outro efeito desta modificação é o de reduzir a hiperplasia da célula de músculo liso. Este resultado pode ser esperado por duas razões. Em primeiro lugar, as plaquetas contém um factor de crescimento potente, o factor de crescimento plaquetário (PDGF, platelet-derived growth factor), que se sabe estar envolvido na hiperplasia pós-angioplástica. A interrupção da libertação do próprio PDGF suscita uma intervenção farmacológica, na medidad em que é inibida libertação de um "fármaco" que teria sido libertado pelas plaquetas. A trombose provoca a libertação de trombina, que é um mitogénico conhecido da célula de músculo liso. A interrupção da geração de trombina e sua libertação para a parede do vaso também suscita uma intervenção farmacológica. Existem outros factores de crescimento solúveis no plasma que também são conhecidos como mitogenes da célula de músculo liso. Sabe-se que a camada de gel apresenta uma barreira permeosselectiva na superfície do tecido, e por isso é razoável esperar que a camada de gel possa -61 - reduzir a hipcrplasia após aiigioplastia. A inibição de trombose na própria parede do vaso pode também reduzir a incidência de fecho abrupto e vasoespasmo, ambos ocorrendo algumas vezes a seguir a uma intervenção vascular.

Exemplo 19: Polimerização Interfacial de Macrómeros Dentro dos Vasos Sanguíneos para Prevenir a Trombose

Soluções de macrómero foram polimerizadas interfacialmente dentro dos vasos sanguíneos previamente lesionados in vivo para prevenir a trombose. A artéria carótida foi exposta, e foi usado um tubo de polietileno (PEIO) para canular o exterior da artéria carótida. A artéria foi presa com ganchos arteriais finas na posição proximal ínterior/exterior em relação à bifurcação da artéria carótida e aproximadamente 2 cm distai da bifurcação. Uma seringa de 1 mL de tuberculina foi usada para lavar o sangue do lúmen da zona isolada através de sucessivo enchimento e esvaziamento da zona do vaso. O vaso foi lesionado através de trituração com um hemostático. A zona isolada foi preenchida com uma solução 10 mM de eosina Y durante 2 minutos, após o que foi lavada e preenchida com solução a 20% de um macrómero em solução salina com 0,1 mM de trietanolamina e 0,15% de N-vinilpirrolidona. O macrómero consistia de uma cadeia PEG de M 8000 daltons, extendida em ambos os lados com oligómero de ácido láctico caracterizado por um grau médio de polimerização de 5 grupos lactidilo, e posteriorment acrilado nominalmente em ambas as extremidades por reacção com cloreto de acriloilo. O vaso foi irradiado transmuralmente usando laser de ião árgon (514 nm) a uma intensidade de aproximadamente 1 mW/cm durante 5 segundos. A seguir, a cânula foi removida da artéria carótida externa e a artéria foi ligada no local da bifurcação. Os ganchos arteriais foram removidas para permitir o reestabelecimento do fluxo sanguíneo. A perfusão foi realizada durante 20 minutos, sendo de seguida o vaso isolado novamente, removido do corpo, lavado suavemente, fixado, e preparado para análsie histológica por irradiação microscópica. A olho nu, os segmentos esmagados de animais de controlo, que não estavam submetidos a irradiação, estavam vermelhos, indicando um trombo interno com células vermelhas do sangue armadilhadas. Em contraste, não foi observada vermelhidão no local da ferida esmagada nos vasos tratados. A histologia mostrou trombos extensos, fibrina, e células vermelhas armadilhadas nos vasos não tartados. Em contraste, não foram observadas nos vasos tratados quaisquer trombos ou fibrina ou células vermelhas armadilhadas.O procedimento foi conduzido em quatro animais de controlo e em três animais tratados.

Este exemplo demonstra que a polimerização pode ser realizada in si tu no animal vivo, que o polímero de revestimento permanece aderente à parede do vaso durante o fluxo de sangue arterial, e que o polímero de revestimento pode prevenir a trombose in vivo em animais não anti-coagulados. Esta aproximação ao tratamento apresenta benefícios evidentes na prevenção do fecho abrupto, vasoespasmo, e restenose após procedimentos de intervenção intravascular. Além disso, é mais geralmente aplicável a outros órgãos de superfície exposta e intraluminais a serem tratados.

Lisboa, 8 de Janeiro de 2001

ALBERTO CANELAS

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (35)

1. -í - REIVINDICAÇÕES 1. Um macrómero polimerizável, biodegradável tendo uma solubilidade de pelo menos lg/100 mL numa solução aquosa compreendendo pelo menos uma região solúvel em água, pelo menos uma região degradável que é hidrolizável sob condições in vivo, e grupos terminais de radicais livres polime-rizáveis tendo a capacidade de formar ligações covalentes adicionais resultando na interligação de macrómero, em que os grupos terminais polimerizáveis são separados entre si por pelo menos uma região degradável.
2. 2. O macrómero da reivindicação 1, em que a região solúvel em água está ligada a uma região degradável, pelo menos um grupo terminal polimerizável está ligado à região solúvel em água, e pelo emnos um grupo terminal polimerizável está ligado à região degradável.
3. 3. O macrómero da reivindicação 1, em que a região solúvel em água foram um núcleo central, pelo menos duas regiões degradáveis estão ligadas ao núcleo, e os grupos terminais polimerizáveis estão ligados às regiões degradáveis.
4. 4. 0 macrómero da reivindicação 2, em que a região degradável é o núcleo central, pelo menos duas regiões solúveis em água estão ligadas ao núcleo, e um grupo terminal polimerizável está ligado a cada região solúvel em água.
5. 5. 0 macrómero da reivindicação 1, em que a região solúvel em água é um esqueleto do macrómero, a região degradável é um ramo ou enxerto ligado ao esqueleto do macrómero, e os grupos terminais estão ligados às regiões degradáveis. -2-
6. 6. O macrómero da reivindicação 1, em que a região degradá-vel é um esqueleto de macrómero, a região solúvel em água é um ramo ou enxerto ligado ao esqueleto degradável, e grupos termianis polimerizáveis estão ligados aos ramos ou enxertos solúveis em água.
7. 7. O macrómero da reivindicação 1, em que a região solúvel em água é um esqueleto em forma de estrela, sendo a região degradável im ramo ou enxerto ligado ao esqueleto em forma de estrela solúvel em água, e pelo menos dois grupos terminais polimerizáveis estão ligados a um ramo ou enxerto degradável.
8. 8. O macrómero da reivindicação 1, em que a região degradável é um esqueleto em forma de estrela, a região solúvel em água é um ramo ou enxerto ligado ao esqueleto degradável em forma de estrela, e dois ou mais grupos terminais polimerizáveis estão ligados ao ramo ou enxerto solúvel em água.
9. 9. O macrómero da reivindicação 1, em que a região solúvel em água é também a região degradável.
10. 10. O macrómero da reivindicação 1, em que a região slúvel em água é também a região degradável, uma ou mais regiões degradáveis adicionais são enxertos ou ramos na região solúvel em água.
11. 11. O macrómero da reivindicação 1 compreendendo uma região central solúvel em água, pelo menos duas extensões degradáveis no núcleo, e uma extremidade em pelo menos duas das extensões degradáveis, em que o centro compreende poli(etilenoglicol), cada extensão compreende poli(a-hidroxi-ácido) biodegradável; e cada terminação compreende um oligómero acrilato ou -3- C- monómero.
12. 12. O macrómero da reivindicação 11, em que o poli(etileno-glicol) tem uma massa molecular entre cerca de 400 e 30000 Da; os oligómeros poli((a-hidroxiácido) têm uma massa molecular entre cerca de 200 e 1200 Da; e o oligómero acrilato ou monómero tem uma massa molecular entre cerca de 50 e 200 Da.
13. 13. O macrómero da reivindicação 12, em que oligómeros de poli(etilenoglicol) t~em um amassa molecular de cerca de 10000 Da; os oligómeros de poli(ácido láctico) têm uma massa molecular de cerca de 250 Da; e os oligómeros acrilato têm uma massa molecular de cerca de 100 Da.
14. 14. O macrómero da reivindicação 1, em que os grupos terminais polimerizáveis contêm uma ligação dupla carbono-carbono capaz de estabelecer ligações cruzadas e macrómeros polimerizáveis.
15. 15. O macrómero da reivindicação 1, em que a ligação cruzada e a polimerização do macrómero pode ser iniciada por um iniciador de polimerização por radicais livres sensível à luz com ou sem cocatalisador, compreendendo ainda um radical livre iniciador de polimerização.
16. 16. O macrómero da reivindicação 15, em que o iniciador é seleccionado de um grupo consistindo de aminas, corantes, canforquinonas, e acetofenonas.
17. 17. O macrómero da reivindicação 16, em que o iniciador é seleccionado do grupo consistindo de corante eosina com trietanolamina, corante etileosina com trietanolamina, 2,2-dimetoxi-2-fenil-acetofenona, e 2-metoxi-2- -4- Áí b<rh fenil-acetofenona.
18. 18. O macrómero da reivindicação 1, em que a ligação cruzada ou polimerizações podem ser iniciadas in situ por radiação tendo um comprimento de onda de 320 nm ou mais longo.
19. 19. O macrómero da reivindicação 1 ou 11, em que a região degradável é seleccionada do grupo consistindo de poli(a-hidroxiácidos), poli-(lactonas), poli(aminoácidos) poli(anidridos), poli(ortoésteres) e poli(fosfo-ésteres).
20. 20. O macrómero da reivindicação 19, em que o poli((a-hidroxi-ácido) é seleccionadodo gruo consistindo de poli(ácido glicólico), poli(ácido DL-láctico) e poli(ácido L-láctico).
21. 21. O macrómero da reivindicação 19, em que a poli(lactona) é seleccionada do grupo consistindo de poli(6-caprolactona), poli(ô-valerolactona) ou poli^-butirolactona).
22. 22. O macrómero da reivindicação 1, em que a região solúvel em água é seleccionada do grupo consistindo de poli(etilenoglicol), poli(óxido de etileno), poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidona), poli(etiloxazolina), copolí-meros de bloco de poli(óxido de etileno)-co-poli(óxido de propileno) e combinações resultantes.
23. 23. O macrómero da reivindicação 1 compreende ainda moléculas biologicamente activas seleccionadas do grupo consistindo de proteínas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas biologicamente activas, células, tecidos e agregados de tecidos. - 5- ^¢. Iq*. YH C-' ^-4. («Ί
24. 24. O uso de uma solução aquosa compreendendo um iniciador de polimerização por radicais livres sensível à luz e um macrómero polime-rizável, biodegradável, solúvel em água tal como reivindicado na reivindicação 1 na preparação de um medicamento para uso num método de redução da formação de adesões após um procediemnto cirúrgico num paciente, compreendendo o método uma cobertura de superfícies de tecido num paciente com a solução; e expondo superfícies de tecido revestido a luz suficiente para polimerizar o referido macrómero.
25. 25. O uso de acordo com a reivindicação 24, em que o macrómero biodegradável, polimerizável compreende um núcleo, pelo menos duas extensões no núcleo, e uma extremidade cobertura terminal em pelo emnos duas extensões; em que o núcleo é um polímero hidrofílico ou oligómero; cada extensão é um oligómero ou monómero biodegradável; e cada extremidade é um oligómero ou monómero capaz de estabelecer ligações cruzadas e macrómeros polimerizantes.
26. 26. 0 uso tal como reivindicado na reivindicação 24, em que o macrómero polimerizável, biodegradável, solúvel em água, é um hidrato de carbono ou proteína compreendendo um composto unido tendo uma ligação dupla carbono.
27. 27. O uso tal como reivindicado na reivindicação 26, em que o macrómero polimerizável, biodegradável, solúvel em água é um ácido hialuró-nico ou um sulfato de condroitina ou sulfato de heparína ou um dextrano compreendendo em cada caso um composto unido tendo uma ligação dupla carbono-carbono.
28. 28. 0 uso de uma solução aquosa compreendendo um iniciador -6- de polimerização por radicais livres sensível à luz e um macrómero, solúvel em água, biodegradável, polimerizável tal como reivindicado na reivindicação 1 para formar uma mistura de revestimento na preparação de um medicamento para aplicação local e/ou libertação controlável de uma substância biologicamente activa para as superfícies de tecido de um paciente e expondo as superfícies de tecido coberto a luz suficiente para polimerizar o referido macrómero.
29. 29. O uso tal como reivindicado na reivindicação 28, em que a substância bilogicamente activa é uma enzima, antibiótico, agente antineoplásico, neurotransmissor, anestésico local, hormona, anticorpo, droga psicoactiva, droga afectando um órgão reprodutivo ou um oligonucleótido antisenso.
30. 30. O uso de uma mistura aquosa de um macrómero, solúvel em água, biodegradável, polimerizável tal como reivindicado na reivindicação 1, um fotoiniciador ou mistura de fotoiniciador/cocatalisador na preparação de um medicamento capaz de provocar a adesão de tecidos ou selagem de uma superfície de tecido num paciente por aplicação da mistura a uma superfície de tecido com o tecido com o qual é desejada a adesão, através do contacto da superfície de tecido com o tecido com mo qual a desão é desejada, formando uma junção de tecido, e irradiando a junção de tecdido com luz.
31. 31. O uso tal como reivindicado na reivindicação 30, em que o macrómero compreende colagénio e uma cobertura terminal polimerizável ou gelatina e uma cobertura terminal polimerizável.
32. 32. Um método de encapsulamento de uma substância biologicamente activa para libertação controlada ou contenção para tratamento de um paciente, compreendendo o método a mistura de uma substância biologicamente activa com uma solução aquosa compreendendo um iniciador de polimerização -7- por radicais livres sensível à luz e um macrómero, solúvel em água, biodegradável, polimerizável tal como reivindicado na reivindicação 1; e expondo a referida solução como folhas, varas, esferas, micropartículas, ou nanopartículas a luz suficiente para polimerizar o referido macrómero.
33. 33. O método da reivindicação 32, em que o macrómero solúvel em água, biodegradável, polimerizável é um hidrato de carbono ou proteína compreendendo um composto unido tendo uma ligação dupla carbono-carbono.
34. 34. O método das reivindicações 32 ou 33, em que o macrómero tem um núcleo hidrofílico de poli(etilenoglicol).
35. 35. O método da reivindicação 34, em que o macrómero é extendido com dois oligómeros de um alfa-hidroxiácido que tem terminações cobertura terminais de acrilato ou metacrilato. Lisboa, 8 de Janeiro de 2001 A'-*·***·* <— ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA