PT625161E - Processo para a recuperacao de um complexo de factor viii/factor von willebrand com virus inactivados de pureza elevada, atraves de cromatografia de permuta aniotica - Google Patents

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ÍZS Ι&λ DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A RECUPERAÇÃO DE UM COMPLEXO DE FACTOR VIII/FACTOR VON WILLEBRAND COM VÍRUS INACTIVADOS DE PUREZA ELEVADA, ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE PERMUTA ANIÓNICA" A presente invenção refere-se a um processo para a recuperação de um complexo de factor VlII/factor von Willebrand com vírus inactivados altamente puro a partir de crioprecipitado por meio de cromatografia de permuta aniónica.

Em EP-A-0 238 701 foi descrito um processo para a produção de um factor anti-hemofilia não infeccioso de elevada pureza, em que fibrinogénio, globulinas, albuminas e outros componentes interferentes são removidos do crioprecipitado por intermédio de uma precipitação com etanol. A acumulação do crioprecipitado é necessária porque o factor VIII está contido no material apenas em quantidades muito baixas. Contudo, este passo de acumulação desequilibra o conteúdo em AHF no produto final. Os processos conhecidos até à data para a produção de factor VIII apenas produzem quantidades muito baixas da substância activa. Assim, através da aplicação do factor VIII produzido através da via convencional, o doente será sobrecarregado com grandes quantidades de substâncias antigénicas. Este processo não é isento de risco. Por isso, têm sido realizadas inúmeras tentativas para uma acumulação acrescida do factor VIII através de operações de separação. Assim, tem sido tentada a obtenção de produtos possuindo uma actividade especifica mais elevada por meio de cromatografia de afinidade utilizando anticorpos animais dirigidos contra o factor VIII. Contudo, esta técnica é muito dispendiosa e com elevados custos de manutenção. Por outro lado, esta técnica também não está completamente isenta de objecções porque também é sempre eluída da coluna uma certa quantidade de proteína animal em cada separação cromatográfica. 1 A EP-A-343 275 descreve um processo para produzir um factor anti-hemofilia de pureza elevada isento de vírus, em que um crioprecipitado compreendendo o factor VIII é tratado com hidróxido de alumínio e com solventes orgânicos/detergentes biologicamente compatíveis, numa realização preferida seguida ainda por cromatografia de permeação em gel utilizando um material de permuta iónica. A EP-A-0 367 840 descreve um material de cromatografia baseado em co-polímeros de oligoetilenoglicóis, metacrilatos de glicidilo e dimetacrilatos de pentaeritritol como sendo particularmente adequados para a produção de um factor VIII de elevada pureza isento de vírus. A WO 90/14886 descreve um meio para a separação de proteínas. O material aqui revelado descreve uma matriz solúvel em água contendo uma pluralidade de partes de poliamina, compreendendo as referidas partes de poliamina pelo menos 3 átomos de azoto básicos e estando os referidos átomos de azoto separados por uma cadeia de pelo menos dois átomos de carbono aí posicionados entre eles, estando pelo menos 5 desses átomos de carbono presentes no caso de cada grupo de poliamina possuir um total de 3 átomos de azoto. Este meio de separação é adequado para pelo menos uma purificação parcial do factor VIII. A EP-A-0 416 983 descreve um processo de preparação do complexo de factor VlII/factor von Willebrand através de cromatografia de permuta aniónica partindo de plasma de sangue humano. A EP 0 343 275 Al refere-se a um processo para produzir um factor anti-hemofilia de pureza elevada (AHF ou factor VIII) que, na purificação de um crioprecipitado, se tornou isento de vírus através de um tratamento com solventes orgânicos/detergentes biologicamente compatíveis. 0 processo é caracterizado por o crioprecipitado, antes da remoção dos vírus aí existentes, ser descongelado, ser extraído com água contendo 1 a 3 U/mL de heparina a pH 6,5-7,5, e então misturado com uma suspensão de hidróxido de alumínio e, após arrefecimento até de 2 10°C a 18°C e ajustado para o valor de pH de 6 a 7, sujeito a centrifugação e filtração e então ainda processado de um modo conhecido per se. É particularmente vantajoso que a amostra, após a remoção dos vírus, seja sujeita a cromatograf ia de permeação em gel em materiais de permuta iónica. É verdade que o processo descrito em EP-A-0 343 275 proporciona um aumento no rendimento do factor VIII; contudo, o rendimento do factor VIII biologicamente activo ainda não é óptimo.

Por isso, o problema técnico definindo o objectivo da invenção é proporcionar um processo que é capaz de melhorar a recuperação de um factor VIII biologicamente activo a partir de fontes de crioprecipitado e assegurar um procedimento mais económico.

Este problema é surpreendentemente resolvido através de um processo de acordo com as características da reivindicação 1. As sub-reivindicações referem-se a realizações preferidas do processo de acordo com a invenção.

Os materiais de separação a ser utilizados de acordo com a invenção consistem em partículas transportadores como revelado em EP-A-0 337 144. Estas são partículas transportadoras possuindo grupos hidroxilo aos quais foi enxertado um material polimérico através dos átomos de carbono nas posições α em relação aos grupos hidroxilo. Os materiais transportadores podem incluir qualquer dos suportes cromatográficos porosos e não porosos geralmente conhecidos possuindo funções hidroxilo alifáticas primárias ou secundárias presentes nas superfícies destes. Entre esses são preferidos polímeros hidrofílicos baseados em acrilatos e/ou metacrilatos, polímeros à base de álcool polivinílico, géis de sílica diol-substituídos, Γ

t polissacáridos à base de agarose, celulose, derivados de celulose ou polímeros à base de dextrano. Outros polímeros ou copolímeros à base de monómeros tais como compostos de vinilo, acrilamida, ésteres ácidos (met)acrílicos ou (met)acrilonitrilo na forma hidroxilada podem com certeza também ser empregues. O material polimérico de fórmula I de acordo com a reivindicação I ligado às partículas transportadoras através de átomos de carbono nas posições α em relação aos grupos hidroxilo é derivado de monómeros representados pelas fórmulas II e/ou III, em que os substituintes são como aqui definidos abaixo. cr7r8 = CR1-Y R7 R1 \ / c znC / \ 0 0 \ c/ 0

Estes monómeros representam ácido (met)acrílico (Y = -COOH), derivados de ácido (met)acrílico (Y = -C-X), 0 alilaminas (Y = -CH2NH2, -CH2NR2R3) , (met) acrilonitrilos (Y = -CN), acroleínas (Y = -CHO), carboxilatos de vinilo (Y = -OCOCHR5R6) ou carbonatos de vinileno de fórmula III.

Todos esses monómeros são substâncias que são polimerizáveis numa solução aquosa através de uma polimerização iniciada por radical livre e possuem grupos de ligação reversível que podem ser neutros, acídicos ou básicos.

Se são empregues carbonatos de vinileno da fórmula III ou carboxilatos de vinilo CR7R8=CR1-OCOCHR5R6 da fórmula II, então é 4 p L·, ^^ preferido que ο produto resultante seja convertido num material de separação possuindo grupos hidroxilo. Esta conversão numa fase hidroxílica é afectada por meio de uma saponificação alcalina suave ou acidica conhecida per se. Por exemplo, a reacção pode ser realizada com uma solução de metanol de K2CO3 à temperatura ambiente como descrito, por exemplo, por Y. Tezuka et a 1., em Macromol. Chem. 186, 685-694 (1985). R1 nas fórmulas I (cf. Reivindicação 1), II e III representa preferencialmente hidrogénio, i.e. são preferidos derivados de ácido acrílico. Y na fórmula II representa preferencialmente -C-X, 0 -CH2NH2, -CH2NR2R3 X na fórmula I bem como na fórmula II representa -NR2R3. São preferidos compostos nos quais X representa -NR2R3 e um de entre R2 e R3 é H.

As partes R2 e/ou R3 representam cada um deles um grupo alquilo, fenilo, fenilalquilo ou alquilfenilo, em que os grupos alquilo e/ou fenilo são mono- ou poli-substituidos por amino, mono- ou dialquilamino, trialquilamónio- e podem ser mono- ou poli-substituídos preferencialmente mono- ou di-substituídos e é particularmente preferido serem mono-substituídos com um grupo alcoxilo, ciano, carboxilo, ácido sulfónico, acetoxi ou acetamino.

As partes R2 e/ou R3 representam preferencialmente alquilo, alcoxialquilo, cianoalquilo, aminoalquilo, mono- ou dialquilaminoalquilo, trialquilamonialquilo, carboxialquilo possuindo até 10 átomos de carbono, mais preferencialmente até 6 5

átomos de carbono, com preferência máxima até 6 átomos de carbono, e preferência especial até 4 átomos de carbono no grupo alquilo que pode ser linear ou ramificado. Assim, R2 e/ou R3 têm o significado preferido de metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, metoximetilo, etoximetilo, 2-metoxietilo, 2-, 3-, ou 4-oxapentilo, 2-, 3-, 4-, ou 5-oxahexilo, 2-, 3-, 4-, 5-, ou β-oxaheptilo, isopropilo, 2-butilo, isobutilo, 2-metilbutilo, isopentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2-oxa-3-metilbutilo, 3-oxa-4-metilbutilo, 2-metil-3-oxapentilo, 2-metil-3-oxahexilo, e também ainda heptilo, octilo, nonilo ou decilo. São ainda preferidos, também, grupos alquilo que foram substituídos com um grupo ciano, ácido carboxi- ou sulfónico. Assim, R2 e/ou R3 possuem o significado preferido de cianometilo, cianoetilo, cianopropilo, cianobutilo, cianopentilo, cianohexilo, 2-cianopropilo, 2-cíanobutilo, carboxilmetilo, carboxiletilo, carboxilpropilo, carboxilisopropilo, carboxilbutilo, carboxilpentilo, carboxilhexilo, carboxil-2-metilpropilo, carboxil-2-metilbutilo., ácido metilsulfónico, ácido etilsulfónico, ácido propilsulfónico, ácido butilsulfónico, ácido pentilsulfónico, ácido hexilsulfónico, ácido 2-metilpropilsulfónico, ácido 2-metilbutilsulfónico, ácido 3-metilbutilsulfónico, ácido 2-metilpentilsulfónico, ácido 3-metilhexilsulfónico ou ácido 2-etilpentilsulfónico. É ainda preferido que os grupos alquilo sejam mono-substituídos com um grupo amino, mono- ou dialquilamino ou trialquilamónio. Os grupos alquilo podem ser iguais ou diferentes e podem possuir até 10, preferencialmente até 6 átomos de carbono, e especialmente preferidos até 4 átomos de carbono. Assim, eles possuem os significados preferidos de dimetilaminoetilo, dietilaminoetilo, metilaminoetilo, metilaminopropilo, dimetilaminopropilo, etilaminoetilo, propilaminoetilo, propilaminopropilo, dipropilaminoetilo, 6

L-Cj dipropilaminobutilo, dietilaminoetilo, trimetilamóniometilo, trimetilamóniopropilo, trimetilamóniobutilo, trietilamónio-metilo, trietilamóniopropilo, trietilamónioetilo, aminoetilo, aminopropilo, aminobutilo ou aminopentilo. Todos estes grupos alquil- ou alquil-substituídos são também preferidos como substituintes do grupo fenilo.

De forma semelhante é preferido para R2 e/ou R3 um sulfureto de sulfona possuindo a estrutura - (0Η2) n-S02-(CH2) n-S-(CH2) n0H com n = 2, 3, 4, 5 ou 6, preferencialmente 2, 3 ou 4.

Preferencialmente, R2 e/ou R3 também possui/possuem o(s) significado(s) de um grupo fenilo, que preferencialmente é mono-substituído com ciano, cianoalquilo, amino, aminoalquilo, mono-ou dialquilamino, alquilo, alcoxilo, alcoxialquilo, mono- ou dialquilaminoalquilo, trialquilamónio- ou trialquilamónioalquilo, carboxilo, carboxialquilo, ácido sulfónico ou ácido alquilsulfónico. Os significados preferidos destes substituintes correspondem a esses grupos alquilo e grupos alquilo substituídos aqui especificados acima como sendo preferidos. 0 substituinte do grupo fenilo substituído está preferencialmente ligado na posição p. São também significados preferidos para R2 e/ou R3 p-acetoxifenilo, p-aminofenilo ou p-acetaminofenilo. Ainda preferidos como as partes R2 e/ou R3 são um grupo alquilfenilo ou fenilalquilo, em que os significados especificados preferidos também se pretende que sejam aplicáveis aos grupos alquilo, alquilo substituídos ou fenilo substituídos.

De acordo com o referido, por exemplo, os seguintes grupos fenilo substituídos estão destinados a ser especialmente preferidos: 4-cianofenilo, 4-alquilfenilo, 4-(N,N-dimetilamino)-fenilo, 4-(N,N-dialquilaminoetil)-fenilo, 4-etoxifenilo, 4- 7

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U t etoxietilfenilo, 4-trialquilamóniofenilo, 4-carboxifenilo, ácido 4-fenilsulfónico, feniletilo, 4-(N-etilamino)fenilpropilo ou 4-cianofeniletilo.

Ainda preferidas são partes possuindo a fórmula I e/ou monómeros da fórmula II, em que R2 e/ou R3 representam um grupo cíclico ou bicíclico que pode ser aromático ou saturado e contém desde 5 a 10 átomos de carbono, em cujos anéis um ou mais grupos CH- ou CH2- foram substituídos por N ou NH, N ou NH e S, ou N ou NH e O.

Assim, R2 e R3 preferencialmente também representam uma parte de piridina, grupo imidazolilo, grupo indolilo, ainda preferido para uma parte pirrole, pirimidina, pirazina, quinolina ou isoquinolina. R2 e/ou R3 podem também representar, por exemplo, uma parte tiazole, tiadiazole, morfolina, triazina, piperazina, benzotiazole, purina, pirazole, triazole, pirrolidina ou isoxazole.

Entre estes, os grupos aromáticos heterocíclicos são particularmente preferidos.

De modo a produzir permutadores adequados, os grupos R2 e R3 devem ser ajustados um ao outro de um tal modo que ambas as partes ou contêm um grupo básico ou uma das partes é neutra. O técnico não terá qualquer dificuldade em reconhecer os grupos de acordo com o referido e, assim, combinar partes adequadas para R2 e R3, dependendo da função e do objectivo da permuta iónica desejada. É preferível que uma das duas partes R2 e R3 seja uma parte neutra. 8

U R7 e R8 nos monómeros de fórmula II representam preferencialmente H, de modo a que R' e R" na fórmula I também representem preferencialmente hidrogénio.

Também são preferidos materiais de separação em que na fórmula I Y representa -OH e uma das partes R' e R" também representa -OH. Então, tem de ser empregue um carbonato de vinileno da fórmula III como o monómero, e o produto resultante terá que ser subsequentemente convertido numa fase hidroxilo. R7 e R1 na fórmula III representam preferencialmente H. Na fórmula I, n representa o número de unidades de repetição e representa de 2 a 100 e preferencialmente de 5 a 60, sendo preferidas cadeias com comprimentos de 10 a 30.

Woods, K., e Orme, Th., em EP-A-0 239 859, descrevem que é vantajoso, após a remoção ou inactivação do virus e antes da separação cromatográfica, extrair a amostra com óleos, e preferencialmente com óleo de soja, óleo de rícino e/ou óleo de sementes de algodão.

Os procedimentos de acordo com a invenção permitem pela primeira vez que um factor anti-hemofilia de pureza elevada seja preparado com rendimento elevado, cujo factor possua uma actividade específica que não foi atingida até à data.

Um crioprecipitado comercialmente disponível é dividido em pedaços de cerca de 1 a 2 cm de tamanho e é deixado a descongelar à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas. Estes pedaços são suspendidas enquanto são agitados em cerca de duas vezes o seu volume em água contendo 1 a 3 U/mL de heparina/sódio a temperaturas entre 10°C e 25°C. A suspensão é ajustada para um valor de pH de cerca de pelo menos 7,0 até 8,0 e preferencialmente de desde 7,0 a 7,1 com ácido acético a 0,1 M. 9 P U κ t A agitação é continuada à temperatura ambiente durante desde 15 a 60 minutos, e preferencialmente durante 30 minutos. Então, são adicionadas 108 g de uma suspensão de hidróxido de alumínio a 2% por 1 kg de crioprecipitado, e a mistura é agitada à temperatura ambiente durante 1 a 10 minutos, e preferencialmente durante 5 minutos. Então, a acidez é ajustada com ácido, preferencialmente ácido acético a 0,1 M, para um valor de pH de desde 6,0 até 7,0 e preferencialmente de desde 6,5 a 6,6. A amostra é arrefecida de 18°C a 10°C, e preferencialmente de 16°C a 14°C. A esta temperatura a mistura é sujeita a centrifugação, por exemplo numa centrífuga Sharples AS-16 (Cepa 61), a um fluxo de 1,0 L/min. Isto é seguido por filtração do sobrenadante através de um filtro Pall AB-1 UOIOZP. A inactivação do vírus é realizada preferencialmente após centrifugação e filtração. A inactivação dos vírus por meio de Tween/TNBP (fosfato de tri-n-butilo) demonstrou ser particularmente útil. Também são obtidos bons resultados utilizando colato de sódio/TNBP. A mistura de Tween/TNBP ou colato de sódio/TNBP pode por sua vez ser removida, por exemplo, através de uma extracção com óleo. A amostra é aplicada numa coluna de cromatografia contendo o material de permeação em gel conhecido pelo nome comercial de EMD-TMAE-Fractogel (M) 650, cujo material exibe actividade de permuta iónica. O EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 já aqui foi caracterizado acima. A capacidade da coluna é preferencialmente tal que esteja presente na coluna 0,5 kg do material da coluna por 1 kg do crioprecipitado. A amostra é aplicada na coluna e lavada com tampões. Após eluiçâo da amostra com um tampão de força iónica superior o produto resultante é diluído com um tampão possuindo um conteúdo em sal mais baixo e, se desejado, é ajustado para um valor de pH de cerca de 6,5 a 7,5, e preferencialmente de 6,9 até 7,1. Então, é realizada outra filtração, preferencialmente em filtros de nitrocelulose, que é seguida por filtração em condições de esterilidade. 10

Esses tampões de separação demonstraram ser particularmente vantajosos, a sua força iónica foi ajustada utilizando cloreto de sódio e/ou um sal de amónio quaternário possuindo pelo menos uma cadeia de hidrocarbilo possuindo de 1 a 6 átomos de carbono e contendo um substituinte hidrofilico, tal como cloreto de colina.

Assim, no processo de acordo com a invenção a coluna contendo o acima descrito Fractogel (M) 650 é lavada e equilibrada com um tampão A. 0 tampão A contém cloreto de sódio ou colina a uma concentração de cerca de 50 até 200 mM, e preferencialmente de 120 mM, e possui um valor de pH desde 5,8 até 7,8, e preferencialmente desde 6,5 até 7,0. A amostra é preferencialmente aplicada à coluna a partir de um tampão possuindo uma osmolaridade desde 200 a 600 mosm, e preferencialmente de 380 a 520 mosm, a um valor de pH desde 5,8 a 7,8, e preferencialmente desde 6,5 até 7,0. É recomendado que a capacidade da coluna não deva exceder cerca de 50 U.I. de factor VIII por 1 mL de gel. Após a coluna ter sido carregada é lavada com o tampão A.

Então a coluna é lavada com tampão B que também contém citrato de sódio, cloreto de cálcio, glicina, mas possui uma força iónica superior à do tampão A. A concentração do sal de amónio quaternário do tipo acima descrito e/ou do cloreto de sódio deve estar entre 150 mM e 250 mM, e preferencialmente entre 180 e 200 mM, e o valor de pH deve ser entre 5,8 e 7,8, e preferencialmente cerca de 7,0. A eluição da coluna do produto é realizada com um tampão C que possui uma força iónica ainda mais aumentada em relação à do tampão B. O conteúdo em sal de amónio quaternário do tipo acima descrito, especialmente cloreto de colina, e/ou em cloreto de 11

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sódio deve estar dentro do intervalo entre 200 mM e 500 mM, e preferencialmente conter até cerca de 400 mM, a um valor de pH desde 5,8 até 7,8, e preferencialmente de cerca de 7,0.

Através do processo de acordo com a invenção, a recuperação do factor VIII é realizada num rendimento superior e com estabilidade de produto superior. É vantajoso que no processo de acordo com a invenção o denominado factor von-Willebrand não seja removido, mas permaneça nas fracções do factor VIII. Assim, é possível utilizar as preparações do factor VIII também para doentes que sofrem de uma deficiência no factor von-Willebrand. Além disso, o factor VIII também pode ser empregue em técnicas de infusão continua devido à presença do factor von-Willebrand que facilita uma estabilização natural do factor VIII. O processo é ainda ilustrado através dos seguintes exemplos. EXEMPLO 1

Acumulação de factor VIII a partir de crioprecipitado

Um crioprecipitado comercialmente disponível é dividido em pedaços de cerca de 1 a 2 cm em tamanho e é deixado descongelar à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas. Estes pedaços são suspendidos enquanto são agitados em cerca de duas vezes o seu volume em água contendo 2 U/mL de heparina-sódio a temperaturas entre 20°C e 25°C. A suspensão é ajustada para um pH de cerca de 7,0 a 7,1 com ácido acético a 0,1 Μ. A agitação é continuada entre 20°C e 25°C durante 30 minutos. São adicionadas 108 g de uma suspensão de hidróxido de aluminio por 1 kg de crioprecipitado, e a mistura é agitada à temperatura ambiente durante 5 minutos. Então, o valor de pH é ajustado com ácido acético a 0,1 M para desde 6,5 a 6,6. A amostra é arrefecida de 12 16°C a 14°C, sujeita a centrifugação numa centrífuga Sharples AS-16 (Cepa 61) a um fluxo de 1,0 L/min. 0 sobrenadante é filtrado através de um filtro Pall AB-1 U010ZP. EXEMPLO 2

Preparação da coluna de cromatografia

Uma coluna contendo pelo menos 0,5 L de resina de permuta iónica por 1 kg do crioprecipitado é utilizada para a separação do crioprecipitado extraído. A altura da coluna deve ser < o diâmetro. Após a coluna ter sido carregada com a resina, a coluna de cromatografia é primeiro lavada com 5 volumes de solução de cloreto de sódio a 0,1 M. Isto é seguido por lavagem com um tampão A possuindo a seguinte composição: cloreto de sódio a 120 mM, citrato de sódio-5 H20 a 10 mM, glicina a 120 mM, cloreto de cálcio-2 H20 a 1 mM, valor de pH de 6,5 a 7,0, ajustado com HC1 a 1 M.

Todos os tampões devem ser isentos de vírus, dado que as seguintes operações são realizadas com extractos do crioprecipitado livres de vírus. EXEMPLO 3 A amostra é aplicada à coluna e a absorção do caudal é observada a um comprimento de onda de 280 nm. O filtrado é recolhido e investigado quanto à actividade do factor VIII, assim como o produto o foi antes de sofrer a separação em coluna. Então, a coluna é lavada com tampão A até que a absorção tenha atingido novamente o seu valor inicial. A coluna é então 13

Γ ^ lavada com tampão B até que a absorção tenha regressado novamente à linha de base. 0 tampão B possui a seguinte composição: cloreto de sódio de 180 a 200 mM, citrato de sódio-5 H20 a 10 mM, glicina a 120 mM, cloreto de cálcio-2 H20 a 1 mM, valor de pH de 6,9 a 7,0. A eluição do produto é realizada com tampão C. A fracção de proteína que aparece após a adição de tampão C é recolhida. O tampão C possui a seguinte composição: cloreto de sódio a 400 mM, citrato de sódio-5 H20 a 10 mM, glicina a 120 mM, cloreto de cálcio-2 H20 a 1 mM, valor de pH de 6,9 a 7,0.

Após o produto desejado ter sido eluído, a coluna é lavada com 5 volumes de tampão D, que contém uma solução de cloreto de sódio a 1 M. A regeneração da coluna é realizada através de lavagem da mesma com NaOH a 0,1 N (3 volumes de coluna), seguida por lavagem da coluna com ácido clorídrico a 0,1 N (3 volumes de coluna e lavagem da coluna com 5 volumes da coluna de álcool a 25% em água. 14 ^ tampão E,

EXEMPLO 4

As fracções recolhidas são diluídas com consistindo em citrato de sódio a 20 mM, glicina a 80 mM, cloreto de cálcio®2 H20 a 2,5 mM, valor de pH de 6,9 a 7,1, até que tenham uma actividade de 26 ou 35 U/mL aufweisen. Então o valor de pH é ajustado, se desejado, de 6,9 a 7,1, sendo seguido por filtração através de um Filtro Sealklean de 0,45 μπι. É realizada ainda uma filtração estéril subsequente. EXEMPLO 5 - Experiência Comparativa

Em cada uma de duas experiências é processado 0,3 kg de um crioprecipitado obtido a partir de um plasma idêntico, estando um procedimento de acordo com a presente invenção e estando o outro de acordo com o processo de EP 0 343 275 AI. As fracções estão sujeitas a análise e os resultados que se relacionam com os ingredientes são apresentados na seguinte Tabela.

Tabela

Comparação de purificações cromatográficas de uma solução de crioprecipitado através do processo de acordo com a invenção (I) e através do processo de EP 0 343 275 AI (II). 15

Resultados analíticos I II Actividade de factor VIII [U.I./mL] 27 27 VWF-AG [U.I./mL] 66 23 VWF-AG/Actividade de factor VIII 2,4 0,85 Fibrinogénio [mg/mL] < 0,01 0,01 Fibronectina [mg/mL] 0,08 0,07 IgG [mg/mL] <0,08 < 0,08 IgM [mg/mL] < 0,03 0,2 Proteína Total [mg/mL] 0,4 0, 3 Rendimento de Factor VlII/kg de plasma 297 207 A realização do processo de acordo com a invenção resulta em 33 porções dispensadas contendo cada uma 270 U.I. de factor VIII, em conformidade com um rendimento de 29 700 U.I. de factor VlII/kg de crioprecípitado ou 297 U.I./kg de plasma. A realização através do processo de acordo com a EP 0 343 275 AI resulta em apenas 23 porções dispensadas contendo cada uma 270 U.I de factor VIII, correspondendo a um rendimento de 20 700 U.I. de factor VlII/kg de crioprecípitado ou 207 U.I./kg de plasma. Surge daqui uma vantagem em relação ao rendimento de quase 51% em relação à realização do método da EP 0 343 275 AI.

As proteínas indesejáveis tais como fibrinogénio e imunoglobulina M (IgM) são removidas mais eficientemente no processo de acordo com a invenção.

Lisboa, 20 de Julho de 2001

Ο AGENTE OTICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL V ^ 16

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES Processo para a recuperação de complexo de factor VlII/factor von Willebrand com vírus inactivado altamente puro, a partir de crioprecipitado por meio de cromatografia de permuta aniónica, caracterizado por se utilizar, como o material de permuta aniónica, um material de separação baseado em transportadores contendo grupos hidroxilo, cujas superfícies foram revestidas com polímeros ligados covalentemente, contendo os referidos polímeros unidades repetidas que são as mesmas ou diferentes e estão representadas pela fórmula I CR'R

   I, n em que R1 representa H ou CH3 Y representa —C—X, -CH2-NH2 ou -CH2NR2R3, 0 R' e R" representam cada um H ou CH3, X representa -NR2R3 R2 e R3 cada um representa um grupo alquilo, fenilo, fenilalquilo ou alquilfenilo possuindo até 10 átomos de carbono na parte alquilo, cujos grupos são mono- ou poli-substituídos com partes amino, mono- ou dialquilamino, trialquilamónio, carboxilo e podem ser mono- ou poli-substituídos com alcoxilo, ciano, ácido sulfónico, acetoxilo ou acetamino, uma parte cíclica ou bicíclica possuindo desde 5 a 10 átomos de carbono em que um ou mais grupos CH- ou CH2- foram substituídos por N ou NH, N ou NH e S, ou N ou NH e O, um de entre R2 e R3 também podem representar H, enquanto que R2 e R3 foram ajustados um ao outro de (j ^ -C. modo a que ambas as partes ou contêm grupos básicos ou uma das duas partes é neutra, e n representa desde 2 a 100.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que Y na fórmula I da reivindicação 1 representa —C—X, II O com X = -NR2R1, em que R2 e R1 representam cada um aminoalquilo, mono- ou dialquilaminoalquilo, trialquilamónioalquilo possuindo cada um até 10 átomos de carbono na parte alquilo, fenilo que não é substituído ou foi mono- ou poli- substituído com alquilo, alcoxilo, alcoxialquilo, ciano, caianoalquilo, aminoalquilo, amino, mono- ou dialquilamino, mono- ou dialquilaminoalquilo, trialquilamónio, trialquilamónioalquilo, carboxilo, carboxialquilo, ácido sulfónico, ácido alquilsulfónico, acetoxilo ou outro(s) grupo(s) acetamino possuindo até 10 átomos de carbono na parte alquilo, uma parte cíclica ou bicíclica possuindo desde 5 a 10 átomos de carbono em que um ou mais grupos CH- ou CH2- foram substituídos por N ou NH, N ou NH e S, ou N ou NH e O, um de entre R2 e R1 também podem representar H, enquanto que R2 e R1 foram ajustados um ao outro de modo a que ambas as partes ou contêm grupos básicos ou uma das duas partes é neutra. 2 1 Processo de acordo com a reivindicação 1, em que Y na fórmula I da reivindicação 1 representa -CH2NH2 ou -CH2NR2R1, sendo R2 e R1 definidos de acordo com a reivindicação 1. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1 para a recuperação de um complexo de factor VlII/factor von Willebrand com vírus inactivados altamente puro, a partir de crioprecipitado através de cromatografia de permuta aniónica utilizando um material de permuta aniónica de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 3, em que a purificação do factor VIII é realizada através de lavagem e eluição com tampões possuindo forças iónicas subsequentemente aumentadas, caracterizado por a força iónica do tampão ser ajustada por meio de sais de amónio quaternários possuindo pelo menos uma cadeia hidrocarbilo possuindo de 1 a 6 átomos de carbono e contendo um substituinte hidrofilico isolado ou em combinação com sal comum.
3. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por o sal de amónio quaternário ser cloreto de colina.
4. 6. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o gradiente de sal, estabelecido pelo sistema de tampão empregue, ser de 0,1 a 1 M como o total das concentrações de cloreto de sódio e/ou o sal de amónio quaternário de acordo com as reivindicações 4 e/ou 5. Lisboa, 20 de Julho de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE IND1 ISTRIAl

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