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PT2865755T - Minicélulas intactas derivadas de bactéria compreendendo arn regulatório - Google Patents

Minicélulas intactas derivadas de bactéria compreendendo arn regulatório Download PDF

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PT2865755T
PT2865755T PT151501293T PT15150129T PT2865755T PT 2865755 T PT2865755 T PT 2865755T PT 151501293 T PT151501293 T PT 151501293T PT 15150129 T PT15150129 T PT 15150129T PT 2865755 T PT2865755 T PT 2865755T
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PT
Portugal
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minicells
rna
cells
regulatory rna
cell
Prior art date
Application number
PT151501293T
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English (en)
Inventor
Macdiarmid Jennifer
Hulf Toby
Brahmbatt Himanshu
Original Assignee
Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Description

DESCRIÇÃO
MINICÉLULAS INTACTAS DERIVADAS DE BACTÉRIA QUE COMPREENDE
ARN REGULATÓRIO
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Recentemente, tem sido desenvolvido um grande número de estratégias com base em ácidos nucleicos, com a finalidade de modular uma variedade de funções celulares (Opalinska e Gewirtz, 2002) . Classes de oligonucleótidos,
tais como aptâmeros, oligonucleótidos que atuam como iscos e que se ligam a fatores de transcrição, ribozimas, oligonucleótidos que formam tríplices, motivos CpG imunoestimuladores, oligonucleótidos antissentido (incluindo ácidos nucleicos peptídicos), pequenos ARNs de interferência e microARNs, têm chamado muito a atenção como ferramentas de investigação, devido ao seu modo de ação altamente específico. Estes ácidos nucleicos oligoméricos também têm um potencial considerável como agentes terapêuticos. No entanto, esses agentes terapêuticos enfrentam vários obstáculos, incluindo a instabilidade dos ácidos nucleicos livres, e a administração celular segura, eficaz e direcionada destas macromoléculas (Dykxhoorn e Lieberman, 2005) .
Um foco de muitas estratégias terapêuticas com base em ácidos nucleicos é o fenómeno dos ARNs de interferência (ARNi) , em que um ARN longo de fita dupla (dsARN) leva à degradação específica de sequências de transcritos de genes homólogos (complementares ou parcialmente complementares) numa célula. Mais particularmente, as moléculas de dsARN longas são processadas em ARNs menores por ribonuclease endógena chamada "Dicer" (Grishok et al., 2000; Zamore et al., 2000) . Os ARNs mais pequenos são conhecidos como "pequenos ARNs de interferência" (siARN) quando são derivados de fontes exógenas e como "microARN" (miARN) quando são produzidos a partir de genes que codificam ARN no próprio genoma das células. Estas duas classes de pequenos ARNs regulatorios (tipicamente, com 21 a 23 nucleótidos), também diferem na medida em que os miARNs apresentam apenas complementaridade parcial com os alvos de ARN mensageiro (mARN).
Estes pequenos ARNs regulatórios ligam-se ao chamado "RNA-induced silencing complex" (RISC), o qual contém uma atividade de helicase e uma atividade de endonuclease. A atividade de helicase desenrola as duas fitas de moléculas de ARN, permitindo que a fita antissentido se ligue à molécula de ARN direcionada (Zamore et al., 2000; Zamore, 2 002; Vickers et al., 2003) . A atividade de endonuclease hidrolisa o ARN alvo no local onde a cadeia antissentido está ligada.
Assim, em ARNi, uma molécula de ARN de fita simples (ssARN) liga-se à molécula de ARN alvo, seguindo as regras de emparelhamento de bases de Watson-Crick, e recruta uma ribonuclease que degrada o ARN alvo. Pelo contrário, a supressão antissentido da expressão de genes acarreta a ligação de ssARN a ARN, bloqueando a tradução sem catalisar a degradação do mRNA.
Como uma classe, os ARNs regulatórios têm uma meia-vida menor que uma hora em plasma humano (Layzer et al., 2004) e são rapidamente excretados pelos rins. Como consequência, vários grupos tentaram preparar ARNs regulatórios, incluindo siARNs, que são resistentes a nuclease. Os exemplos de tais esforços incluem modificar quimicamente os nucleótidos (por exemplo, 2' -F, 2'-OMe, Ácidos Nucleicos Bloqueados; ALN) ou a cadeia principal de fosfodiéster, por exemplo, ligações de fosforotioato (Chiu e Rana 2003; Choung et al., 2006; Czauderna et al., 2003 ,· Elmén et al., 2005; Layzer et al., 2004; Morrissey et al., 2005) . Igualmente, para minimizar o tempo que os siARNs ou outros ARNs regulatórios passam em circulação, os investigadores conjugaram as moléculas de ARN a proteínas e anticorpos, para atingir células de mamíferos desejadas. Como esforços adicionais para resolver as preocupações da baixa estabilidade e rápida excreção renal, os investigadores desenvolveram veículos para a administração de ARNs regulatórios. Poliplexos (formados pela automontagem de ácidos nucleicos com policatiões), lipopoliplexos (formados por condensação inicial do ácido nucleico com policatiões, seguido pela adição de lípidos catiónicos), lipossomas, e nanopartícuias sintéticas também têm sido explorados.
Estas estratégias também enfrentam vários problemas, tais como (a) a eliminação rápida das proteínas transportadoras do soro através de excreção renal, (b) número limitado de moléculas de ARN regulatórias que podem ser conjugadas com cada proteína transportadora, (c) dificuldade na dissociação intracelular de ARNs regulatórios intactos da proteína transportadora, (d) eliminação rápida devido a proteínas do soro que se ligam a poliplexos, e que podem atuar como opsoninas (Dash et al., 1999), e (e) instabilidade de lipossomas in vivo, causando a libertação de ácidos nucleicos do soro, e potencial transformação não específica.
Também foram desenvolvidos vetores virais para produzir ARNs regulatórios endogenamente. Veja-se, por exemplo, Devroe e Silver, 2004. Esses vetores virais apresentam, contudo, sérias preocupações de segurança. Exemplos ilustrativos incluem a recombinação com vírus tipo selvagem, o potencial de inserção e o potencial oncogénico, imunossupressão induzida por vírus, capacidade limitada dos vetores virais para transportar grandes segmentos de ADN, reversão para virulência de vírus atenuados, dificuldades na manufatura e distribuição, baixa estabilidade, e reações adversas (Hacein-Bey-Abina et al. , 2 003; Kootstra e Verma, 2 003; Raper et al., 2003; Verma e Weitzman, 2005; Check, 2005).
Também foram desenvolvidos sistemas com base em plasmídeos, para a expressão recombinante in situ de um ARN regulatório, tal como um siARN ou um precursor maior (aproximadamente 7 0 nt) , um ARN em forma de grampo (hairpin) curto (shARN). Um shARN contém sequências sentido e antissentido de um gene alvo, que estão ligadas por um laço em forma de grampo (hairpin). Veja-se, por exemplo, Paddison et al., 2002. Os shARNs podem ser expressos a partir de um promotor do tipo pol-III ou, no contexto de um miARN, por promotores pol II.
Tal como descrito no pedido internacional WO 03/033519, os plasmídeos que codificam um shARN, siARN ou outro ARN regulatório, podem ser transformados numa estirpe bacteriana parental, a qual produz minicélulas intactas, devido a uma mutação que causa divisão celular assimétrica. Esta transformação produz bactérias recombinantes, nas quais o plasmídeo replica intracelularmente, introduzindo um grande número de plasmídeos no citoplasma bacteriano. Durante a divisão assimétrica, alguns dos plasmídeos segregam para o citoplasma da minicélula. As minicélulas podem depois administrar o ADN plasmídico a uma célula de um mamífero, onde o ADN plasmídico migra para o núcleo da célula. No núcleo, o ADN plasmídico expressa o shRNA ou outro ARN regulatório, conforme o caso, e o ácido nucleico resultante migra depois para o citoplasma, onde pode atuar como ARNi ou supressão genética, dependendo da natureza do ARN regulatório envolvido.
Contudo, uma vez que este tipo de abordagens requer maquinaria da célula hospedeira, a administração de quantidades terapeuticamente eficazes de ácido nucleico, por intermédio de sistemas com base em expressão, envolve processos complexos e prolongados, o que limita a sua eficácia. Assim, é necessária uma metodologia mais eficaz para a administração de ácidos nucleicos funcionais, tais como ARNs regulatórios, a células-alvo. 0 documento WO 2006/021894 revela a utilização de vetores de minicélula bacteriana para entregar ácidos nucleicos funcionais a células de mamífero. 0 documento WO 2004/022771 revela composições e métodos para inibir a função de gene que utiliza ácido nucleico interferente curto ou híbridos análogos de ácido nucleico num organismo ou célula. Geller, B.L. et al, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, volume 55, 4 de maio de 2005, páginas 983 a 998 revela oligõmeros de fosforodiamidato e morfolino (PMOs) que inibem a expressão de genes de luciferase em Escherichia coli de uma maneira dependente de sequência.
Harth G. et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 4 de janeiro de 2000, volume 97, n° 1, 4 de janeiro de 2000, páginas 418 a 423, revela os efeitos sobre M. tuberculosis de oligodesoxiribonucleótidos antissentido modificados com fosforotioato (PS-ODNs) contra o mARN de glutamina sintetase, e com a formação de uma estrutura de parede celular de poli-L-glutamato/glutamina.
Yanagihara Katsunori et al, Journal of Antimcriobial Chemotherapy, janeiro de 2006, Volume 57, n° 1, janeiro de 2006, páginas 122 a 125, revela a eficácia de ARNs interferentes curtos (siARNs) sobre a expressão de coagulase.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Portanto, um aspeto da invenção refere-se a uma composição que compreende: (a) uma pluralidade de minicélulas derivadas de bactéria intactas, em que cada minicélula da pluralidade compreende ARN regulatório que está empacotado na minicélula, e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável para a mesma, em que (i) o ARN regulatório é selecionado a partir do grupo que consiste em ssARN antissentido, ribozima e ARN chamariz, (ii) há uma ausência das minicélulas de um construto para expressão in situ do ARN regulatório, e (iii) a pluralidade compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do ARN regulatório. 0 ácido nucleico funcional empacotado na minicélula pode ter como alvo os transcritos de ARN que codificam uma proteína que contribui para a resistência a drogas, para a resistência a apoptose, ou para neoplasticidade, entre outros. Uma composição da invenção também compreende ainda um ligando biespecífico, o qual consiste, por exemplo, num primeiro braço específico para uma estrutura de superfície da minicélula, e um segundo braço específico para um recetor de superfície de uma célula de mamífero não fagocítica.
Em outro aspeto, a invenção refere-se a um método para entregar ARN regulatório, que compreende as etapas de: (a) fornecer uma pluralidade de minicélulas derivadas de bactéria intactas num transportador f armac eut i c amente aceitável, em que cada minicélula da pluralidade compreende ARN regulatório; e (b) colocar as minicélulas da pluralidade em contacto com células de mamífero in vitro de modo que as células de mamífero englobem as minicélulas da pluralidade, de modo que o ARN regulatório seja libertado no citoplasma das células-alvo, em que (i) o ARN regulatório é selecionado a partir do grupo que consiste em ssARN antissentido, ribozima e ARN chamariz, (ii) há uma ausência das minicélulas de um construto para expressão in situ do ARN regulatório, e (iii) a pluralidade compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do ARN regulatório.
Tal como mencionado, os ARNs regulatórios, tal como siARN, miv e shARN podem ser dirigidos a transcritos de ARN que codificam uma proteína que contribui para a resistência a fármacos, resistência a apoptose ou neoplasticidade. Noutras formas de realização, a metodologia compreende ainda a administração de um fãrmaco diferente do ácido nucleico funcional, a uma célula de mamífero alvo. 0 fãrmaco pode ser administrado após ou em simultâneo, ou mesmo antes, da administração da composição de minicélulas.
Em conformidade com outro aspeto, a presente invenção fornece uma composição para utilização no tratamento de cancro, em que a composição compreende uma pluralidade de minicélulas derivadas de bactéria intactas num transportador farmaceuticamente aceitável, em que cada minicélula da pluralidade compreende ARN regulatório em que: (a) o ARN regulatório é selecionado a partir do grupo que consiste em ssARN antissentido, ribozima e ARN chamariz; (b) há uma ausência das minicélulas de um construto para expressão in situ do ARN regulatório, e (c) a pluralidade de minicélulas compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do ARN regulatório.
A invenção também possibilita um método para formular uma minicélula com um ácido nucleico funcional isento de plasmídeo. 0 método compreende coincubar uma pluralidade de minicélulas com um ácido nucleico funcional, tal como ARN regulatório como siARN, miARN ou shARN, num tampão. Em algumas modalidades, a coincubação pode envolver agitação suave, enquanto que, em outras, a coincubação é estática. Em alguns aspetos, a incubação simultânea dura cerca de meia hora, enquanto noutros, a incubação dura cerca de uma hora. numa forma de realização, o tampão compreende solução salina, por exemplo, solução de tampão fosfato IX. Noutra forma de realização, a coincubação é conduzida a uma temperatura de cerca de 4 °C a cerca de 37 °C, de cerca de 20 °C a cerca de 30 °C, cerca de 25 °C ou cerca de 37 °C. A incubação simultânea pode compreender 107, 1G8, 1Q9, IO10, ΙΟ11, 1012 ou !013 minicélulas.
Outros objetos, características e vantagens serão aparentes a partir da descrição detalhada que se segue. A descrição detalhada e exemplos específicos são dados com fins ilustrativos apenas, uma vez que várias alterações e modificações dentro do âmbito da invenção serão evidentes para o perito na especialidade, a partir desta descrição detalhada. Adicionalmente, os exemplos demonstram o princípio da invenção e não pode ser esperado que os mesmos ilustrem especificamente a aplicação desta invenção a todos os exemplos em que seria obviamente útil para o perito no campo técnico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa minicélulas intactas, empacotadas com siARN marcado com fluorõforo Cy3. A Figura IA é de um microscópio de luz, e a Figura 1B mostra a mesma lâmina, embora observada com luz fluorescente, com um filtro de excitação 515-560, revelando moléculas de siARN fortemente fluorescentes, que coincidem com as minicélulas. A Figura 2 é uma imagem capturada por um microscópio confocal de fluorescência e mostra a adesão e internaiização de minicélulas empacotadas com siARN-Plkl, direcionado para EGFR, em células de cancro da mama humano, in vitro. A Figura 3 é uma representação gráfica do efeito antitumoral significativo, obtido através do tratamento de xenoenxertos de cancro da mama humano (I4DA-MB-468) em murganhos nus, com minicélulas empacotadas com siARN KSP direcionadas para EGFR. 0 grupo controlo 1(
recebeu solução salina estéril e o grupo experimental 2 ( O ) recebeu EGFRminicélulasSiARN-Ksp (109) , quatro vezes por semana. A Figura 4 é uma representação gráfica do significativo efeito antitumoral, conseguido através do tratamento de xenoenxertos de cancro do colon humano (HCT116) em murganhos nus, com minicélulas empacotadas com siARN KSP, direcionadas a EGFR, em conjunto com minicélulas empacotadas com carboplatina, direcionadas a EGFR. Os murganhos do grupo 1
receberam solução salina estéril, e os murganhos dos grupos 2
e 4 ( ) foram tratados para as primeiras 10 doses (veja-se a Figura 4) com 109 bGtRminicélulasSiAKN-piki, EGFRminicélulasSiRNA-Ksp-i e EGFRminicélulasSiRNA-Ksp-2, respetivamente. A Figura 5 fornece uma análise por FACS, de vários pontos temporais após a transfeção, de células de cancro de cólon (HCT116), tratadas com minicélulas experimentais, EGFRminicélulasSiARN-piki, ou EGFRminicélulassiARN_Ksp - As Figuras 5A a 5D fornecem análise por FACS de amostras recolhidas 4 horas após a transfeção, ao passo que as Figuras 5E a 5H mostram a análise de amostras 8 horas após a transfeção. As Figuras 5A e 5E mostram resultados de células apenas, enquanto as Figuras 5B e 5F dizem respeito a células + EGFRminicélulas vazias. As Figuras 5C e 5G mostram resultados de células + EGFRminicélulasSiARiÍ_Ksp, e as Figuras 5D e 5H dizem respeito a células + EGFRminicélulasSiARN-piki · A Figura 6 fornece uma análise por FACS, de vários pontos temporais após a transfeção, de células de cancro de cólon (HCT116), tratadas com minicélulas experimentais, EGFRminicélulaSsiARN-piki, ou EGFRminicélulasSiARN-Ksp - As Figuras 6A a 6D fornecem análise por FACS de amostras recolhidas 16 horas após a transfeção, ao passo que as Figuras 6E a 6H mostram a análise de amostras 24 horas após a transfeção. As Figuras 6A e 6E mostram resultados de células apenas, enquanto as Figuras 6B e 6F dizem respeito a células + EGFRminicélulas vazias. As Figuras 6C e 6G mostram resultados de células + EGFRminicélulasSiARN-.KSP/ e as Figuras 6D e 6H dizem respeito a células + EGFEminicélulasSiAEN-piki - A Figura 7 fornece uma análise por FACS, de vários pontos temporais após a transfeção, de células de cancro de cólon (HCT116), tratadas com minicélulas experimentais, EGFRminicélulaSsiARN-Piki, ou EGFRminicélulasSiAEN-Ksp · As Figuras 7A a 7D fornecem análise por FACS de amostras recolhidas 32 horas após a transfeção, ao passo que as Figuras 7E a 7H mostram a análise de amostras 48 horas após a transfeção. As
Figuras 7A e 7E mostram resultados de células apenas, enquanto as Figuras 7B e 7F dizem respeito a células + EGFRminicélulas vazias. As Figuras 7C e 7G mostram resultados de células + EGFRminicélulasSiARN-Ksp/ e as Figuras 7D e 7H dizem respeito a células + EGFRminicélulasSiARN-piki ·
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Em conformidade com a invenção, quantidades terapeuticamente eficazes de ARN regulatório podem ser empacotadas em minicélulas, sem o recurso a químicos agressivos ou eletroporação. Nesse sentido, foi desenvolvida uma simples metodologia para o empacotamento direto destas concentrações terapeuticamente eficazes de ARN regulatório em minicélulas intactas, metodologia essa que não envolve construtos de expressão com base em plasmídeos, nem a maquinaria de expressão de uma célula bacteriana hospedeira. Assim, um segmento polinucleotídico que codifica para o ARN regulatório não é clonado num ADN plasmídico nem num vetor virai. Em vez disso, os ácidos nucleicos funcionais livres de plasmídeos são empacotados diretamente nas minicélulas, passando através da membrana intacta das minicélulas. Além disso, uma composição à base de minicélulas da invenção pode administrar de forma segura e eficaz, quantidades terapeuticamente eficazes de ARNs regulatórios tais como siARNs, miARNs e shARNs, a células de mamífero alvo.
Definições A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados nesta descrição têm o mesmo significado que é normalmente entendido pelos peritos no campo da especialidade.
Por conveniência, o significado de certos termos e frases empregues na descrição, exemplo e reivindicações em anexo, é fornecido a seguir. Outros termos e frases são definidos através da descrição.
As formas singulares "um", "uma" e "o", "a", incluem a referência no plural, a menos que o contexto claramente implique de outro modo. "Oligonucleótido antissentido" refere-se a uma molécula de ácido nucleico, complementar a uma porção de um transcrito de um gene em particular, que pode hibridizar com o transcrito e assim bloquear a sua tradução. Um oligonucleótido antissentido pode compreender ARN ou ADN. "Sequência biomolecular" ou "sequência" refere-se à totalidade, ou a uma parte, de um polinucleótido ou sequência de polinucleótidos. "Cancro", "neoplasma", "tumor", "malignidade" e "carcinoma", utilizados como sinónimos, referem-se a células ou tecidos que exibem um fenótipo de crescimento aberrante, caracterizado por uma perda significativa de controlo da proliferação celular. Os métodos e composições desta invenção aplicam-se em particular a células malignas, pré-metastáticas, metastáticas e não metastáticas. "Complementar" refere-se à compatibilidade topológica ou correspondência das superfícies de interação de duas moléculas, tais como uma molécula de si ARN e o seu mARN alvo. As moléculas podem ser descritas como complementares, e ainda, as características das superfícies de contacto são complementares uma à outra. "Corresponde a" ou "representa", quando utilizados no contexto de, por exemplo, um polinucleótido ou uma sequência que "corresponde a" ou "representa" um gene, significa que uma sequência de polinucleótidos está presente no gene ou no produto do gene do ácido nucleico, por exemplo, mARN. 0 polinucleótido pode estar presente na sua totalidade dentro de um exão de uma sequência genómica do gene, ou diferentes porções da sequência do polinucleótido podem estar presentes em diferentes exões, por exemplo, de forma que a sequência de polinucleótidos contígua está presente num mARN, antes ou após o splicing, ou seja, um produto de expressão do gene.
Um "ARN chamariz" é uma molécula que pode adotar uma estrutura idêntica a uma região funcional importante do ARN alvo. 0 último ARN pode nativo a um hospedeiro mamífero ou um patógeno que infetou uma célula de mamífero, por exemplo, HIV. 0 ARN chamariz sequestra a proteína que normalmente interage com o ARN alvo, resultando numa rutura do processamento normal do hospedeiro mamífero ou agente patogénico. "Fármaco" diz respeito a uma qualquer substância ativa fisiologicamente ou farmaceuticamente, que produz um efeito sistémico ou local em animais, em particular em mamíferos e humanos. "Expressão" diz geralmente respeito ao processo pelo qual uma sequência de polinucleótidos é submetida a transcrição e tradução bem-sucedidas, de tal forma que sejam expressos níveis detetáveis de sequência de aminoácidos ou proteína. Em certos contextos aqui incluídos, expressão diz respeito à produção de mARN. Noutros contextos, a expressão diz respeito à produção de proteína. "Ácido nucleico funcional" diz respeito a uma molécula de ácido nucleico a qual, após introdução numa célula hospedeira, interfere de forma específica com a expressão de uma proteína. Em geral, as moléculas de ácido nucleico funcional têm a capacidade para reduzir a expressão de uma proteína, interagindo diretamente com um transcrito que codifica a proteína. ARNs regulatórios, tais como siARN, shARN, pequenos ARNs (tipicamente menos do que 400 bases de comprimento), micro-ARNs (miARNs), ribozimas e ARNs que atuam como isco, e ácidos nucleicos antissentido, constituem exemplos de ácidos nucleicos funcionais. "Gene" diz respeito a uma sequência de polinucleõtidos que compreende sequências controlo e codificantes, necessárias para a produção de um polipéptido ou precursor. 0 polipéptido pode ser codificado por uma sequência de codificação de tamanho completo ou por uma qualquer parte da sequência de codificação. Um gene pode constituir uma sequência de codificação ininterrupta, ou pode incluir um ou mais intrões, ligados através de junções de splicing apropriadas. Para além disso, um gene pode conter uma ou mais modificações na região de codificação ou na região não traduzida, as quais podem afetar a atividade biológica ou a estrutura química do produto de expressão, a taxa de expressão, ou a forma de controlo de expressão. Estas modificações incluem, porém, sem limitação, mutações, inserções, deleções e substituições de um ou mais nucleótidos. A esse respeito, estes genes modificados podem ser referidos como "variantes" do gene "nativo". "Célula hospedeira" diz respeito a uma célula que pode ser, ou que foi, utilizada como recipiente para um plasmídeo recombinante ou outra transferência de polinucleõtidos, e inclui a descendência da célula original que foi transfetada. A descendência de uma única célula pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou no ADN genómico ou total, complemento do progenitor original, devido a mutações naturais, acidentais ou deliberadas. "Hibridização" diz respeito a um qualquer processo, através do qual uma sequência de polinucleótidos se liga a uma sequência complementar, através de emparelhamento de bases. "Indivíduo", "sujeito", "hospedeiro" e "doente", utilizados como sinónimos nesta descrição, dizem respeito a um qualquer sujeito mamífero, para o qual é desejado um diagnóstico, tratamento ou terapia. numa modalidade preferencial, o indivíduo, sujeito, hospedeiro ou paciente é um ser humano. Outros indivíduos podem incluir, porém, sem limitação, gado, cavalos, cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, primatas e murganhos. "Marcador" diz respeito a agentes que são capazes de fornecer um sinal detetável, seja diretamente, ou através da interação com um ou mais membros adicionais de um sistema produtor de sinal. Os marcadores que são diretamente detetáveis e que podem ser utilizadas na invenção, incluem marcadores fluorescentes. Fluoróforos específicos incluem fluoresceína, rodamina, BODIPY, corantes de cianina e afins. A invenção também contempla a utilização de isótopos radioativos, tais como 35S, 32P, 3H, e afins como marcadores. Marcadores colorimétricos, tais como ouro coloidal ou esferas de vidro ou plástico colorido (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex) também podem ser utilizados. Ver, por exemplo, Patentes n° US 4,366,241, 4,277,437, 4,275,149, 3,996,345, 3,939,350, No. 3,850,752 e 3,817,837 μΟΙigonuc1eótidop se refere a um polinucleótido que compreende, por exemplo, de cerca de 10 nucleótidos (nt) a cerca de 1.000 nt. Os oligonucleótidos para utilização na invenção têm, de preferência, de cerca de 10 nt a cerca de 150 nt. 0 oligonucleótido pode ser um ol igonuc leót ido de ocorrência natural ou um oligonucleótido sintético. Os oligonucleótidos podem ser modificados. "Minicélula" diz respeito a formas não nucleadas de células bacterianas, produzidas através de uma perturbação na coordenação, durante a fissão binária da divisão celular, com segregação do ADN. As minicélulas são distintas de outras pequenas vesículas que são geradas e libertadas de forma espontânea em certas situações, e não são devidas a rearranjos genéticos específicos, ou expressão de genes epissomais. No contexto da presente invenção, as minicélulas são intactas, uma vez que outras formas "despidas", tais como esferoplastos, poroplastos, protoplastos, deixariam o ácido nucleico funcional empacotado extravasar, e não seriam eficazes do ponto de vista terapêutico. A membrana intacta da minicélula permite que a carga permaneça dentro da minicélula, e é libertada intracelularmente dentro da célula de mamífero hospedeira alvo.
Nesta descrição, "modificado" e "modificado quimicamente", dizem respeito a oligonucleótidos ou polinucleótidos com uma ou mais alterações químicas às estruturas moleculares naturais de todas ou de algumas das bases, grupos açúcar e ligações fosfato internucleósido, assim como a moléculas com substituições adicionadas, ou uma combinação de modificações nestes locais. As ligações de fosfato de internucleósido podem ser fosfodiéster, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato com ponte, fosfonato de metileno com ponte, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato com ponte ou ligações de internucleótido de sulfona ou ligações 3'-3', 5' - -3' ou 5'-5', e combinações de tais ligações similares. A ligação de fosfodiéster pode ser substituída por uma ligação substituta, tal como fosforotioato, metilamino, metilfosfonato, fosforamidato e guanidina, e a subunidade de ribose dos polinucleótidos pode ser também substituída (por exemplo, fosfodiéster de hexose; ácidos nucleicos peptídicos). As modificações podem ser internas (únicas ou repetidas) ou na extremidade (ou extremidades) da molécula de oligonucleótido e podem incluir adições à molécula das ligações de fosfato de internucleósido, tais como modificações de desoxirribose e fosfato que clivam ou reticulam às cadeias opostas ou às enzimas associadas ou outras proteínas. Os termos poligonucleótidos modificadosp e ppolinucleótidos modificadosp também incluem oligonucleótidos ou polinucleótidos que compreendem modificações às porções de açúcar (por exemplo, monómeros de ribonucleótidos ou desoxirribonucleótido substituídos em 3'), qualquer um dos quais está ligado por meio de ligações 5' a 3'. A frase "moléculas de ácido nucleico" e o termo "polinucleótidos" significam formas poliméricas de nucleótidos de qualquer comprimento, sejam eles ribonucleótidos ou desoxirribonucleótidos. Estas incluem ADN ou ARN, ADN genómico, cADN, híbridos de ADN-ARN, ou um polímero de cadeia simples, dupla ou múltipla, compreendendo bases de purina e pirimidina, ou outras bases de nucleótidos naturais, modificadas química ou bioquimicamente, não naturais, ou derivadas. A cadeia principal de um polinucleótido pode compreender açúcares e grupos fosfato (tal como pode, tipicamente, ser encontrado em ARN e ADN) ou grupos açúcar ou fosfato modificados ou substituídos. Alternativamente, a cadeia principal do polinucleótido pode compreender um polímero de subunidades sintéticas, tais como fósforoamidites e, assim, pode ser um oligodesoxinucleósido fósforoamidato ou um oligómero misto de fósforoamidato-fosfodiéster. Um polinucleótido pode compreender nucleótidos modificados, tais como nucleótidos metilados e análogos de nucleótidos, uracilo, outros açúcares, e grupos de ligação, tais como fluororribose e tioato, e ramificações de nucleótidos. Um polinucleótido pode ser ainda mais modificado, por exemplo, através de conjugação com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluem caps, substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural com um análogo, e introdução de meios para ligação do polinucleótido a proteínas, iões metálicos, componentes de marcação, outros polinucleótidos, ou um suporte sólido. pFarmaceuticamente aceitávelp refere-se à compatibilidade fisiológica. Um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável não anula a atividade biológica da composição que é administrada, é quimicamente inerte e não é tóxica ao organismo em que a mesma é administrada. 0 qualificador pisento de plasmídeop conota a ausência de um construto, tal como um plasmídeo ou vetor virai, para expressão in situ de um ácido nucleico funcional. "Polipéptido" e "proteína", aqui utilizados como sinónimos, dizem respeito a uma forma polimérica de aminoácidos de um qualquer comprimento, e a qual pode incluir aminoácidos traduzidos, não traduzidos, modificados quimicamente, modificados bioquimicamente e derivados. Um polinucleótido ou proteína pode ser de ocorrência natural, recombinante ou sintética, ou qualquer combinação desses. Além disso, um polipéptido ou proteína pode compreender um fragmento de uma proteína ou péptido de ocorrência natural. Um polipéptido ou proteína pode ser uma única molécula, ou pode tratar-se de um complexo multi-molecular. Adicionalmente, esses polipéptidos ou proteínas podem ter cadeias principais peptídicas modificadas. Os termos incluem proteínas de fusão, incluindo proteínas de fusão com uma sequência heteróloga de aminoácidos, fusões com sequências líder heterólogas ou homólogas, com ou sem resíduos de metionina N-terminais, proteínas marcadas imunologicamente, e afins. "Purificado" diz respeito a um composto que é removido do seu ambiente natural e está pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% ou 99,99% livre de outros componentes com os quais está naturalmente associado. pARN regulatóriop denota uma categoria inclusiva de ARNs que afetam a expressão por interferência de ARN, supressão de expressão génica ou outro mecanismo. De modo correspondente, adicionalmente a shARN, siARN, miARN e ssARN antissentido, a categoria de ARNs reguladores inclui ribozimas e ARNs chamariz, entre outros. pRibozimap refere-se a uma molécula de ARN que tem uma atividade enzimática que pode clivar repetidamente outras moléculas de ARN de uma maneira específica para sequências de bases de nucleótidos. "ARN de interferência" (ARNi) significa um mecanismo conduzido por ARN tal como descrito anteriormente, o qual envolve a degradação de um ARN alvo complementar ou parcialmente complementar, para a regulação específica de uma sequência ou gene, na expressão genética (síntese de proteínas). "Identidade de sequência" significa um grau de semelhança ou complementaridade. Pode existir uma identidade parcial ou uma identidade completa. Uma sequência parcialmente complementar é aquela que inibe pelo menos parcialmente que uma sequência idêntica se hibridize a um polinucletótido alvo; a mesma é referida ao utilizar o termo funcional "substancialmente idêntica". A inibição de hibridização da sequência completamente complementar à sequência alvo pode ser examinada ao utilizar um ensaio de hibridização (Southern ou Northern blot, hibridização de solução e afins) sob condições pouco rigorosas. Uma sequência ou sonda substancialmente idêntica irá competir pela ligação, e inibir a mesma (isto é, a hibridização) de uma sequência ou sonda completamente idêntica à sequência alvo, em condições pouco rigorosas. Isto não é o mesmo que dizer que condições pouco rigorosas são tais que é permitida uma ligação não específica; condições pouco rigorosas resultam em que sej a necessário que a ligação de duas sequências uma à outra seja uma interação específica (isto é, seletiva). A ausência de ligação não específica pode ser testada através da utilização de uma segunda sequência alvo, a qual não tem sequer um nível parcial de complementaridade (por exemplo, menos do que 30% de identidade); na ausência de ligação não específica, a sonda não irá hibridizar com a segunda sequência alvo não complementar.
Outra forma de ver a identidade das sequências, no contexto de duas sequências de ácidos nucleicos ou de polipéptidos, inclui a referenciação de resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para a correspondência máxima numa região especificada. Tal como aqui utilizado, "percentagem de identidade de sequência" significa o valor determinado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas, numa janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleótido na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos), em comparação com a sequência de referência (a qual não compreende adições nem deleções), para alinhamento ideal das duas sequências. A percentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais ocorrem as bases de ácido nucleico idênticas em ambas as sequências, para gerar o número de posições que coincidem, dividindo o número de posições que coincidem pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100, para obter a percentagem de identidade de sequência. "Pequenos ARNs de interferência" (siARN) diz respeito a moléculas de ARN de fita dupla, geralmente com um comprimento que varia entre 10 a 30 nucleótidos, que são capazes de mediar interferência de ARN (ARNi). Em geral, as moléculas de siARN têm a capacidade de reduzir a expressão de uma proteína, através da interação direta com um transcrito que codifica a proteína.
Uma quantidade "terapeuticamente eficaz" de um ácido nucleico funcional é uma dose da molécula em questão, por exemplo, siARN, miARN ou shARN livre, que resulta numa resposta farmacológica quando administrada a um sujeito, de acordo com a presente invenção. No entanto, no contexto da presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser aferida com referência à prevenção ou melhoria de uma condição ou sintoma associados com uma doença ou perturbação adversos num modelo animal ou num indivíduo humano, quando as minicélulas empacotadas com ácido nucleico funcional são administradas, tal como descrito em maior detalhe a seguir. Uma quantidade que se observa ser uma "quantidade terapeuticamente eficaz" numa dada circunstância, para um sujeito em particular, pode não ser eficaz para 100% dos indivíduos tratados de forma semelhante para a doença ou condição em consideração, apesar de a dose ser considerada "quantidade terapeuticamente eficaz" pelo perito na especialidade. A dosagem apropriada a este respeito também varia em função de, por exemplo, o tipo, estádio e gravidade da doença ou condição a ser afetada. Em todo o caso, a ilustração presente de ensaio de teste in vitro (Exemplo 2) e ensaio de teste in vivo (Exemplos 4, 5 e 6) de acordo com a presente invenção, assim como metodologia para a quantificação da quantidade de uma molécula de ácido nucleico funcional entregue pelas minicélulas (Exemplo 3), quando considerado à luz da totalidade da descrição, permite ao perito na especialidade, com experiência em testes pré-clínicos e clínicos de candidatos a fármacos, determinar, através de experimentação de rotina, uma quantidade terapeuticamente eficaz de ácido nucleico funcional para uma indicação em particular.
Os termos ptratamentop, pque tratap, ptratarp e similares se referem a obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico desej ado. 0 efeito pode ser profilático em termos de prevenir completa ou parcialmente uma doença ou um sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma estabilização ou cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. pTratamentop inclui qualquer tratamento de uma doença num mamífero, particularmente um ser humano, e inclui: (a) prevenir que a doença ou o sintoma ocorra num indivíduo que pode ser predisposto à doença ou ainda não foi diagnosticado como tendo a mesma; (b) inibir o sintoma da doença, isto é, parar seu desenvolvimento; ou (c) aliviar o sintoma da doença, isto é, causar a regressão da doença ou do sintoma.
Minicélulas
As minicélulas da invenção são formas sem núcleo de E. coli ou de outras células bacterianas, produzidas através de uma perturbação na coordenação, durante a fissão binária, da divisão celular com segregação do ADN. A replicação cromossómica em procariotas está associada a fissão binária normal, a qual envolve a formação de um septo no meio da célula. Em E. coli, por exemplo, a mutação de genes min, tal como minCD, pode remover a inibição de formiato de septo nos polos celulares durante a divisão celular, resultando em produção de uma célula-filha normal e uma minicélula anucleada. Veja-se de Boer et al., 1992; Raskin & de Boer, 1999; Hu & Lutkenhaus, 1999; Harry, 2001. As minicélulas são distintas de outras pequenas vesículas que são geradas e libertadas de forma espontânea em certas situações e, em contraste com as minicélulas, não são devidas a rearranjos genéticos específicos ou à expressão de genes epissomais. Numa forma de realização preferida, as minicélulas têm paredes celulares intactas ("minicélulas intactas").
Adicionalmente às mutações no operão min, as minicélulas sem núcleo também são geradas após uma variedade de outros rearranjos genéticos ou mutações, que afetam a formação do septo, por exemplo, no divIVBl em B. subtilis. Veja-se Reeve e Cornett, 1975. As minicélulas também podem ser formadas a seguir a uma perturbação dos níveis de expressão genética de proteínas envolvidas na divisão celular/segregação de cromossomas. Por exemplo, a superexpressão de minE leva à divisão polar e à produção de minicélulas. De modo similar, minicélulas sem cromossoma podem resultar em defeitos na segregação de cromossoma, por exemplo, a mutação de smc em Bacillus subtilis (Britton et al. , 1998), deleção de spoQJ em B. subtilis (Ireton et al., 1994), mutação de mukB em E. coli (Hiraga et al. , 1989) e mutação de parC em E. coli (Stewart e D'Ari, 1992) . Os produtos de gene podem ser supridos em trans. Quando superexpresso a partir de um plasmídeo com alto número de cópias, por exemplo, CafA pode acentuar a taxa de divisão celular e/ou inibir a partição de cromossoma após a replicação (Okada et al., 1994), resultando na formação de células em cadeia e minicélulas anucleadas (Wachi et al., 1989). As minicélulas podem ser preparadas a partir de uma qualquer célula bacteriana de origem Gram-negativa ou Grampositiva.
Num aspeto, as minicélulas podem conter um ou mais ácidos nucleicos funcionais sem plasmídeos, para os quais é desejado a entrega 0 ácido nucleico funcional da invenção tem a capacidade de reduzir a expressão de uma proteína, através da interação direta com um transcrito que codifica a proteína.
Empacotamento do Ácido Nucleico Funcional em Minicélulas Intactas 0 ácido nucleico funcional pode ser empacotado diretamente em minicélulas intactas. 0 processo pula as etapas anteriormente exigidas de, por exemplo, clonar ácidos nucleicos que codificam ácido nucleico funcional em plasmídeos de expressão, transformar bactérias parentais produtoras de minicélula com os plasmídeos e gerar minicélulas recombinantes. Em vez disso, o ácido nucleico funcional sem plasmídeo pode ser empacotado diretamente em minicélulas intactas através da incubação simultânea de uma diversidade de minicélulas intactas com ácido nucleico funcional num tampão. Em algumas modalidades, a coincubação pode envolver agitação suave, enquanto que, em outras, a coincubação é estática. Um período de coincubação de cerca de uma hora provou-se suficiente, porém, períodos mais curtos, tal como cerca de meia hora, também podem ser eficazes. numa forma de realização, o tampão compreende solução salina, por exemplo, solução de tampão fosfato IX. A solução salina tamponada pode estar na forma de gelatina. Em outra forma de realização, a coincubação a uma temperatura de cerca de 4 °C a cerca de 37 °C; cerca de 20 °C a cerca de 30 °C; cerca de 25 °C; ou cerca de 37 °C. Em outros aspetos, a coincubação pode compreender cerca de 107, 108, 109, ΙΟ10, 1011, 1012 ou 1013 células bacterianas exterminadas. Os parâmetros específicos de temperatura, tempo, tampão, concentração de minicélula, etc. podem ser otimizados para uma combinação particular de condições. 0 sucesso dessa estratégia surpreendente devido ao facto de que, ao longo de quatro décadas, os investigadores desenvolveram uma variedade de processos químicos e eletroquímicos (revisto por Miller, 1994), para transformar ácidos nucleicos em células bacterianas. Os investigadores utilizaram medidas agressivas devido ao facto de que o conhecimento convencional sempre partiu do princípio que os ácidos nucleicos tais como siARN, miARN ou shARN sem plasmídeo são demasiado grandes para entrarem de forma passiva no citoplasma das minicélulas. Por exemplo, as porinas, que são proteínas barril beta que funcionam tipicamente como poros de difusão, permitem transporte passivo ao longo da membrana exterior bacteriana, de moléculas com pesos moleculares de 600 dalton ou menos (Nikaido, 1994) . Entretanto, ADN plasmídico de fita dupla codificando shRNA excede o milhão de daltons, e o siARN ou mARN de fita dupla excedem os 15.000 daltons.
Além disso, uma vez empacotados, os ácidos nucleicos funcionais permanecem dentro da minicélula e estão protegidos de degradação. A esse respeito, estudos de incubação prolongada com minicélulas empacotadas com siARN em solução salina estéril, não mostraram vazamento de siARNs. Adicionalmente, a incubação simultânea de minicélulas empacotadas com siARNs com nucleases, confirmou que os siARNs tinham penetrado a membrana exterior das minicélulas intactas, e estavam protegidos de degradação. De forma semelhante, apesar do facto das minicélulas poderem transportar nucleases residuais do citoplasma bacteriano parental, os siARNs empacotados são estáveis no citoplasma da minicélula. Os siARNs empacotados também evitam a maquinaria de degradação presente nos fagolisossomas, tais como ácidos, radicais de oxigénio livres e hidrolases ácidas (Conner e Schmid, 2003), para o efeito de silenciamento do mARN alvo na célula de mamífero hospedeira.
Noutras formas de realização, ácidos nucleicos funcionais múltiplos dirigidos contra diferentes mARNs alvo, podem ser empacotados na mesma minicélula. Tal estratégia pode ser utilizada para combater a resistência a fármacos e a resistência a apoptose. Por exemplo, doentes com cancro exibem, por rotina, resistência a fármacos de quimioterapia. Essa resistência pode ser mediada pela superexpressão de genes tais como bombas de resistência a drogas múltiplas (MDR), e genes antiapoptóticos, entre outros. Para combater esta resistência, as minicélulas podem ser empacotadas com concentrações significativamente terapêuticas de ácidos nucleicos funcionais para genes associados a MDR, e administradas a um doente antes da quimioterapia. Além disso, o empacotamento na mesma minicélula, de ácidos nucleicos funcionais múltiplos para diferentes mRNAs alvo, pode melhorar o sucesso terapêutico, uma vez que a maioria dos alvos moleculares estão sujeitos a mutações e têm alelos múltiplos.
Assim, o empacotamento de ácidos nucleicos funcionais sem plasmídeos diretamente em minicélulas intactas, tal como descrito aqui, oferece inúmeras vantagens. Por exemplo, uma vez que a abordagem da invenção não necessita obrigatoriamente da modificação genética de bactérias parentais para acomodar a expressão de ácidos nucleicos funcionais, uma bactéria parental pode ser utilizada para produzir minicélulas, compreendendo muitos tipos de ácidos nucleicos, dirigidos para uma variedade de indicações. De igual modo, uma minicélula pode ser carregada com uma variedade de ARNs diferentes, para desse modo evitar ou superar mecanismos de resistência. Ácidos Nucleicos Funcionais
Tal como referido anteriormente, ácidos nucleicos funcionais significa uma categoria incluindo moléculas de ácido nucleico, que afetam a expressão por intermédio de ARN de interferência, supressão da expressão de genes, ou outro mecanismo. Essas moléculas são exemplificadas por ADN ou ARN de cadeia simples, dupla ou múltipla. Exemplos de ácidos nucleicos funcionais incluem, mas não estão limitados a ARN regulatório, como, por exemplo, shRNA, siARN, miARN e ssARN antissentido, por isso, ribozimas e ARNs chamariz e ácidos nucleicos antissentido.
Numa forma de realização preferida da invenção, as minicélulas intactas transportam moléculas de siARN. As moléculas de pequenos ARNs de interferência são úteis para realizar ARNi, um mecanismo de silenciamento genético pós-transcrição. Tal como observado, "siARN" refere-se geralmente a moléculas de ARN de fita dupla, com cerca de 10 a 30 nucleótidos de comprimento, que são designados pela sua capacidade para interferir de forma específica com a expressão de proteínas. De preferência, as moléculas de siARN têm 12 a 28 nucleótidos de comprimento, de maior preferência, 15 a 25 nucleótidos de comprimento, de preferência ainda maior, 19 a 23 nucleótidos de comprimento e de preferência máxima, 21 a 23 nucleótidos de comprimento. Portanto, as moléculas de siARN preferenciais têm 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28 ou 29 nucleótidos de comprimento. 0 comprimento de uma cadeia determina o comprimento de uma molécula de siARN. Por exemplo, um siARN que é descrito como tendo 21 ribonucleótidos de comprimento (21 mer) poderia compreender duas fitas opostas de ARN que se anelam juntas para 19 pareamentos de bases contíguas. Os dois ribonucleótidos remanescentes em cada fita poderiam formar uma pprojeçãop. Quando um siARN contém duas fitas de comprimentos diferentes, a mais longa das fitas designa o comprimento do siARN. Por exemplo, um dsARN contendo uma fita que tem 21 nucleótidos de comprimento e uma segunda fita que tem 20 nucleótidos de comprimento constitui um 21 mer. São desejáveis os siARNs que compreendem uma projeção. A projeção pode estar na extremidade 5' ou 3' de uma fita. De preferência, está na extremidade 3' da fita de ARN. 0 comprimento de uma projeção pode variar, mas, de preferência, tem cerca de 1 a cerca de 5 bases e, de maior preferência, tem cerca de 2 nucleótidos de comprimento. De preferência, o siARN da presente invenção compreende uma projeção em 3' de cerca de 2 a 4 bases. De maior preferência, a projeção em 3' tem 2 ribonucleótidos de comprimento. De preferência ainda maior, os 2 ribonucleótidos que compreendem a projeção em 3' são uridina (U).
Os shARNs compreendem uma fita simples de ARN que forma uma estrutura de haste e laço, em que a haste consiste nas fitas sentido e antissentido complementares que compreendem um siARN de fita dupla, e o laço é um ligante de tamanho variável. A estrutura de haste de shARNs, de modo geral, tem de cerca de 10 a cerca de 30 nucleõtidos de comprimento. De preferência, as moléculas de sliARN têm 12 a 2 8 nucleótidos de comprimento, de maior preferência, 15 a 25 nucleótidos de comprimento, de preferência ainda maior, 19 a 23 nucleótidos de comprimento e de preferência máxima, 21 a 23 nucleótidos de comprimento. Portanto, as moléculas de shARN preferenciais compreendem hastes que têm 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28 ou 29 nucleótidos de comprimento.
Os siARNs da invenção são projetados para interagir com uma sequência de ribonucleotides alvo, significando que os mesmos completem uma sequência alvo se hibridiza de modo suficiente à sequência alvo. numa modalidade, a invenção fornece uma molécula de siARN que compreende uma sequência de ribonucleótidos pelo menos 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% idêntica a uma sequência de ribonucleótidos alvo ou ao complemento de uma sequência de ribonucleótidos alvo. De preferência, a molécula de siARN é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ribonucleótidos alvo ou ao complemente da sequência de ribonucleótidos alvo. De preferência máxima, um siARN será 100% idêntico à sequência de nucleótidos alvo ou ao complemento da sequência de ribonucleótidos. Entretanto, as moléculas de siARN com inserções, deleções ou mutações pontuais únicas em relação a um alvo podem ser também eficazes.
Deste modo, num aspeto da invenção, as minicélulas intactas podem transportar uma ou mais sequências de siARN, destinadas ao silenciamento de genes envolvidos na resistência a fármacos, ou na resistência a apoptose. Ao utilizar minicélulas que codificam siARNs múltiplos, é possível tratar células que expressam múltiplos mecanismos de resistência a fármacos.
As ferramentas que auxiliam no desenho de siARN e ARNs regulatórios em geral, estão facilmente acessíveis ao público. Por exemplo, uma ferramenta de projeto de siARN baseada em computador está disponível na internet em www.dharmacon.com.
Alvos de ácido nucleico funcional
Os ácidos nucleicos funcionais de acordo com a invenção têm como alvo o gene ou o transcrito de uma proteína que promove a resistência a fármacos, inibe a apoptose, promove um fenótipo neoplásico, inibe a proliferação de agentes patogénicos, ou inibe a replicação ou proliferação de vírus. A aplicação bem-sucedida de estratégias de ácido nucleico funcional nesses contextos foi atingida na técnica, mas sem os benefícios de vetores de minicélula. Veja-se, por exemplo, Sioud (2004), Caplen (2003), Wu et al. (2003), Yague et al. (2004).
As proteínas que contribuem para a resistência a fármacos, ou promoção de um fenótipo neoplásico, constituem os alvos preferenciais de ácidos nucleicos funcionais. As proteínas podem contribuir para resistência a fármaco adquirida ou resistência a fármaco intrínseca. Quando células doentes, tais como células tumorais, inicialmente respondem aos fármacos, mas se tornam refratárias em ciclos de tratamento subsequentes, o fenótipo resistente é adquirido. Os alvos úteis envolvidos em resistência a fármacos adquirida ou intrínseca incluem, porém, sem limitação, transportadores de cassete que se ligam a ATP, tais como Pglicoproteína (P-gp, P-170, PGY1, MDR1, ABCB1, proteína associada a MDR, proteína de resistência a múltiplas drogas 1, MDR-2 e MDR-3, MRP2 (proteína associada a resistência a múltiplas drogas), BCR-ABL (região de aglomerados de quebras - protooncogene Abelson), proteína associada a resistência STI-571, proteína associada a resistência no pulmão, ciclo-oxigenase-2, fator nuclear kappa, XRCC1 (complemento cruzado de raios X grupo 1) , ERCCl (gene de complemento cruzado de excisão), GSTP1 (glutationa Stransferase), beta-tubulina mutante, Abcbla (ABCB4), Abccl, Abcc2, Abcc3 (MLP-2), Abcc5, Abcc6, Abcd2, Abcg2, Bax, Bcl2, Bcl21 (bcl-x), Mvp, Rbl, Topl, Top2a, Top2b, Trp53 (p53). Outros genes envolvidos na resistência a fármacos também incluem (a) genes envolvidos no metabolismo de fármacos, por exemplo, Arnt, Blmh, C130052I12Rik (CRR9p), Comt, Crabpl, Cyplal, Cypla2, Cyp2bl9, Cyp2b20, Cyp2c29, Cyp2c40, Cyp2c70, Cyp2d22, Cyp2el, Dhfr, Ephxl, Ephx2, Gstml (MGST1), Gstpl, Nat2, Nqol, Sodl, Ste, Tpmt, Tyms, Ugcg, (b) genes envolvidos na reparação de ADN, por exemplo, Apc, Atm, Brcal, Brca2, Ercc3 (XPB), Mgmt, Mlhl, Xpa, Xpc, (c) genes envolvidos no ciclo celular, por exemplo, Ccndl (ciclina Dl), Ccnel (ciclina El) , Cdkl, Cdk2, Cdk4, Cdknla (p21Wafl), Cdknlb (p27Kipl), Cdkn2a (pl6Ink4a), Cdkn2d (pl9), KSP., (d) genes envolvidos nos recetores do fator de crescimento, por exemplo, Egfr, Erbb2 (Neu, HER2), Erbb3, Erbb4, Fgf 2 (bFGF), Met, (e) genes envolvidos nos recetores de hormonas, por exemplo, Ar, Esrl, Esr2, Igf2r, Ppara, Ppard, Pparg, Ppargcl, Rara, Rarb, Rxra, Rxrb, Rxrg, Srd5a2, e (f) genes envolvidos em fatores de transcrição, por exemplo, Ahr, Aplsl, Apls2, Elkl, Fos (c-fos), Gabpa, Hifla, Mafb, Myc (c-myc), Nfkbl, Nfkb2, Nfkbib, Nfkbie, Relb (1-rel), Tnfrsf11A.
Os alvos úteis também incluem proteínas que contribuem para a resistência à apoptose. Os mesmos incluem Bcl-2 (leucemia / linfoma de células B), Bcl-XL, Al/Bfll, cinase de adesão focal e proteína p53 mutante.
Os alvos úteis incluem, ainda, proteínas supressoras de tumor mutante e oncogénico. Os exemplos incluem β-catenina, PKC-alfa (proteína cinase C), C-RAF, K-Ras (V12), h-Ras, DP97 Dead box ARN helicase, DNMT1 (ADN metiltransferase 1), FLIP (proteína inibitória do tipo Flice), C-Sfc, 53BPI, Polycomb group protein EZH2 (potenciador do homólogo de zeste), ErbBl, HPV-16 E5 e E7 (virus do papiloma humano early 5 e early 7), Fortilin & MCI1P (leucemia de células mieloides, proteína 1) , DIP13a (proteína 13a de interação com DCC 13a), MBD2 (domínio de ligação a CpG metilado) , p21, KLF4 (Kruppel-like fator 4), tpt/TCTP (proteína tumoral controlada por tradução), SPK1 & SPK2 (cinase esfingosina), P300, PLK1 (Polo-like kinase-1), Trp53, Ras, ErbBl, VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) e BAG-1 (BCL2-associated athanogene l).
Foi identificado urn grande número de alvos moleculares para o tratamento de cancro, e as plataformas de descoberta de ARNi estão a identificar, rapidamente, uma variedade de novos alvos diferentes. Exemplos desse tipo de alvos moleculares úteis nesta invenção incluem, tirosina cinases (variante), Akt (proteína cinase B, PKB) , Aktl, AlfaLbeta2 integrina, aminopeptidase, recetor de androgénio. Aurora A, Aurora B, recetor do fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) (bFGFr), BRaf, antigénio carcino-embriónico (CEA) , CD142, CD3 7, CD44, CDS, CD74, CD77, Chkl, CHK2, CHras, CSFlr, CXCR4, ciclina Dl (CCND1), cinase dependente de ciclina 1 (CDK1), cinase dependente de ciclina 2 (CDK2), inibidor de cinase dependente de ciclina IB (CDKN1B, p27, KIP1), CYP26, recetor do fator de crescimento de fibroblastos 3 (FGFr3), recetor do fator de crescimento de fibroblastos 4 (FGFr4), G250, via de sinalização hedgehog (Hh) , fator de crescimento de hepatócitos / scatter fator (HGF/SF ou SF/HGF), HEr4 (ErbB4), HIF, histona desacetilase 9 (HDAC9), Homeobox gene (H0XB7), hialuronano (HA), fator de crescimento semelhante â insulina (IGF) , recetor do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGFlr, IGFlr, IGFIr, IGFlr), proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGFBP2), proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 5 (IGFBP5), cinase semelhante a integrina (ILK), recetor de interleucina (IL6), recetor de interleucina 1 (IL1) do tipo II, interleucina 10 (IL10), recetor da interleucina 4 (IL4), interleucina 6 (IL6), interleucina 15 (IL15), cadeia alfa do recetor da interleucina 3 (IL3r alfa) , JAK, JAK3, JNK1, JNK2, Kinesin Spindle Protein (KSP), laminina 5, Lewis (b), recetor beta de linfotoxina (LT) (LTBr), recetores de ácido lisofosfatídico (LPA) (LPAr), acetiltransferase de ácido lisofosfatídico, fator inibitório de migração de macrófagos (MIF), MAGE3, microtúbulos, MUC2, Notch 1 (TAN1), proteína cinase ativada por mitogénio P38 (p38 MAPK), mediador de apoptose regulado por p53 (PUMA), via de sinalização de PDGF tirosina cinase (TK) , homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), fosfatidilinositol 3'cinase (PI3K), ativador de plasminogénio, recetor da urocinase (PLAU) (PLAUr), Pololike kinase 1 (Plkl), Poly (ADP ribose), polimerase (PARP), antigénio nuclear de proliferação celular (PCNA), antigénio de células estaminais da próstata (PSCA), antigénio específico da próstata (PSA) 773, proteína tirosina fosfatase (PTP), proteína Rad51, RAF1, recetor alfa do ácido retinóico (RAr), recetor gama do ácido retinóico (RAr), recetor beta de retinóide X (RXr), inibidor de serina (ou cisteína) proteinase, transcritase reversa de telomerase (TERT, hTERT), telómeros, antigénio Thomsen Friedenreich (TF), trombospondina 1 (TSP1), transferrina, fator de necrose tumoral alfa (TNFa, TNFA), recetor do fator de necrose tumoral alfa (TNFr, TNFr), anidrase carbónica associada a tumores (CA) IX (CA9), interferão tipo I, ligase de ubiquitina, molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM1, CD106), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF, VEGFA), fator de crescimento endotelial vascular D (VEGFD), vitronectina (VTN), Wilms' tumor 1 (WT1) etc.
Em relação à infeção por HIV, os alvos incluem HIV-Tat, HIV-Rev, HIV-Vif, HIV-Nef, HIV-Gag, HIV-Env, LTR, CD4, CXCR4 (recetor de quimiocina) e CCR5 (recetor de quimiocina).
Devido à heterogeneidade da célula tumoral, inúmeras trajetórias diferentes de resistência a fármaco ou resistência à apoptose podem ser operacionais em células-alvo, Por isso, os ácidos nucleicos funcionais utilizados nos métodos da invenção podem necessitar de ser alterados ao longo do tempo. Por exemplo, se amostras de biopsias revelarem novas mutações que resultam em resistência adquirida a fármacos, podem ser projetados ácidos nucleicos funcionais específicos, que são empacotados em minicélulas intactas, que são administradas ao hospedeiro mamífero para atacar a resistência adquirida a fármacos.
Administração de Ácidos Nucleicos Funcionais por intermédio de Minicélulas Intactas A invenção permite um método de administração de ácidos nucleicos funcionais, compreendendo (a) fornecer uma diversidade de minicélulas intactas num transportador farmaceuticamente aceitável, sendo que cada minicélula da diversidade compreende ácidos nucleicos funcionais livres de plasmídeos, e (b) colocar as minicélulas da diversidade em contacto com células de mamíferos, de tal modo que as células de mamífero engolfam minicélulas da diversidade, sendo os ácidos nucleicos libertados no citoplasma das células-alvo. As minicélulas são colocadas em contacto com a célula de mamífero por intermédio de ligandos biespecíficos, tal como descrito no pedido publicado PCT WO 05/056749. 0 contacto entre a minicélula e a célula-alvo de mamífero pode ser in vitro ou in vivo. Método para Superar a Resistência a Fármacos e Tratamento da Doença A invenção permite ainda um método para superar a resistência a fármacos e o tratamento de uma doença, como por exemplo, cancro ou SIDA, num indivíduo. 0 método compreende (a) empacotar um ou mais ácidos nucleicos dirigidos a genes ou transcritos de proteínas alvo, os quais promovem resistência a fármacos, em minicélulas purificadas intactas, (b) colocar as minicélulas contendo os ácidos nucleicos funcionais em contacto com uma célula de mamífero alvo, de tal modo que a célula de mamífero engolfa a minicélula, tal como descrito no pedido PCT 749 anteriormente citada, e (c) administrar um fãrmaco à célula de mamífero alvo, tal como descrito no pedido publicado PCT WO 05/079854. De preferência, a etapa (c) é realizada após as etapas (a) e (b) , para permitir que o ácido nucleico funcional diminua a resistência ao fãrmaco antes da administração do fármaco. A entrega do fármaco e a introdução do ácido nucleico funcional podem ocorrer consecutivamente, em qualquer ordem, ou simultaneamente.
Os fármacos podem ser entregues por quaisquer dos meios convencionais. Por exemplo, os fármacos podem ser entregues por via oral, por via parenteral (incluindo via subcutânea, via intravenosa, via intramuscular, via intraperitoneal e por infusão) , por via tópica, por via transdérmica ou por inalação. 0 modo adequado de entrega e dosagem de cada fármaco é facilmente verificável por aqueles peritos nas especialidades médicas.
Administração de Fármacos por Intermédio de Minicélulas
Apesar da administração dos fármacos poder ocorrer por vias convencionais, a administração por intermédio de minicélulas é preferida, tal como descrito no pedido publicado PCT WO 05/079854. Nesse sentido, os inventores constataram que as mesmas células de mamífero podem ser retransfetadas com sucesso por minicélulas intactas localizadas que estão envolvidas com cargas úteis diferentes. Por exemplo, minicélulas empacotadas com ácidos nucleicos funcionais podem transfetar uma célula de mamífero, após o que minicélulas empacotadas com fármaco podem entregar o fármaco à mesma célula de mamífero, para obter um efeito antitumoral complementar ou sinérgico. 0 fármaco pode ser empacotado numa minicélula diferente da que contém o ácido nucleico funcional. Em alternativa, o fármaco pode ser empacotado na mesma minicélula que o ácido nucleico funcional. Certos fãrmacos podem interagir com ácidos nucleicos e impedir o empacotamento simultâneo do fármaco e do ácido nucleico na mesma minicélula. Por exemplo, a Doxorubicina é conhecida por interagir com ADN.
As minicélulas da invenção contêm, preferencialmente, uma quantidade suficiente de fármaco para exercer o efeito fisiológico ou farmacológico do fármaco numa célula-alvo. Também preferencialmente, os fármacos contidos dentro das minicélulas são heterólogos ou estranhos às minicélulas, o que significa que as células bacterianas parentais das minicélulas não produzem normalmente o fármaco.
Podem ser empacotados fármacos hidrofílicos e hidrofóbicos em minicélulas, criando um gradiente de concentração do fármaco entre um meio extracelular contendo minicélulas e o citoplasma das minicélulas. Quando o meio extracelular contém uma concentração de fármaco maior do que o citoplasma das minicélulas, o fármaco vai movimentar-se neste gradiente de concentração, no sentido da concentração mais baixa, para o citoplasma das minicélulas. Quando o gradiente de concentração é revertido, contudo, o fármaco não se movimenta para fora das minicélulas. 0 procedimento e mecanismos para o carregamento de fármacos em minicélulas corresponde ao descrito no pedido publicado PCT WO 05/079854.
Para carregar minicélulas com fármacos que normalmente não são solúveis em água, os fármacos inicialmente podem ser dissolvidos num solvente adequado. Por exemplo, Paclitaxel pode ser dissolvido numa mistura 1:1 de etanol e cremophor EL (óleo de rícino polietoxilado) , seguido por uma diluição em PBS para atingir uma solução de Paclitaxel que é parcialmente diluída em meios aquosos e transporta quantidades mínimas do solvente orgânico para garantir que o fãrmaco permaneça em solução. As minicélulas podem ser incubadas nesse meio final para o carregamento do fármaco. Assim, os inventores constataram que mesmo fãrmacos hidrofóbicos podem se difundir no citoplasma de minicélulas para atingir uma carga citoplasmática de fármaco alta e terapeuticamente significativa. Isso é inesperado devido ao facto de que a membrana da minicélula é composta por uma bicamada de fosfolípido hidrofóbica, o que seria esperado que impedisse a difusão de moléculas hidrofóbicas para o citoplasma.
Outro método para carregar minicélulas com um fármaco envolve cultivar uma célula bacteriana progenitora recombinante sob condições de modo que a célula bacteriana parental transcreva e traduza um ácido nucleico que codifica o fármaco e o fármaco seja libertado no citoplasma da célula bacteriana parental. Por exemplo, uma aglomeração de genes que codifica a trajetória biossintética celular para um fãrmaco desejado pode ser clonada e transferida para uma cepa bacteriana parental que tem capacidade de produzir minicélulas. A transcrição e a tradução genéticas da aglomeração de genes resultam na biossíntese do fármaco dentro do citoplasma das células bacterianas progenitoras, enchendo o citoplasma bacteriano com o fármaco. Quando a célula bacteriana parental se divide e forma minicélulas descendentes, as minicélulas também contêm o fãrmaco no seu citoplasma. As minicélulas pré-empacotadas podem ser purificadas através de qualquer processo de purificação de minicélulas, incluindo a metodologia descrita anteriormente.
De modo similar, outro método para o carregamento de minicélulas com um fármaco envolve o cultivo de uma minicélula recombinante, que contém um plasmídeo de expressão que codifica o fármaco, em condições tais que o gene que codifica o fármaco é transcrito e traduzido dentro da minicélula. Fármacos
Os fármacos úteis para a invenção podem ser uma qualquer substância fisiológica ou farmacologicamente ativa, a qual produz um efeito local ou sistémico em animais, em particular mamíferos e seres humanos. Os fãrmacos podem ser compostos inorgânicos ou orgânicos, sem limitação, incluindo péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, e pequenas moléculas, podendo qualquer uma destas estar caracterizada ou não. Os mesmos podem existir em várias formas, tais como moléculas não modificadas, complexos moleculares, sais farmacologicamente aceitáveis, tais como hidrocloreto, hidrobrometo, sulfato, laurato, palmitato, fosfato, nitrito, nitrato, borato, acetato, maleato, tartarato, oleato, salicilato e afins. Para fármacos ácidos, sais de metais, aminas ou catiões orgânicos, por exemplo, amónio quaternário, podem ser utilizados. Também podem ser utilizados derivados de fármacos, tais como bases, ésteres e amidas. Um fãrmaco que é insolúvel em água pode ser utilizado numa forma que é um derivado seu solúvel em água, ou uma base sua derivada, o que em qualquer caso, ou pela sua administração, é convertido por enzimas, hidrolisado pelo pH do corpo, ou por outros processos metabólicos para a forma terapeuticamente ativa original.
Os fãrmacos úteis incluem agentes quimioterápicos, agentes imunossupressores, citocinas, agentes citotóxicos, compostos nucleoliticos, isótopos radioativos, recetores, e enzimas que ativam prõ-drogas, os quais podem ocorrer naturalmente ou serem produzidos através de métodos recombinantes.
Os fãrmacos que são afetados pela resistência a múltiplas drogas têm uma utilidade especial na invenção; por exemplo vinca alcaloides (por exemplo, vinblastina e vincristina), as antraciclinas (por exemplo, doxorrubicina e daunorrubicina), inibidores de transcrição de ARN (por exemplo, actinomicina D) e fármacos estabilizantes de microtúbulos (por exemplo, paclitaxel).
Em geral, os agentes quimioterápicos para cancro são os fármacos preferenciais. Os fármacos quimioterápicos para cancro úteis incluem mostardas de azoto, nitrosoureias, etilenoimina, alcano sulfonatos, tetrazina, compostos de platina, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos, análogos de folato, antraciclinas, taxanos, vinca alcaloides, inibidores de topoisomerase e agentes hormonais. Os exemplos de fármacos quimioterápicos são actinomicina D, alkeran, ara-C, anastrozol, asparaginase, BiCNU, bicalutamida, bleomicina, busulfan, capecitabina, carboplatina, carboplatina, carmustina, CCNU, clorambucil, cisplatina, cladribina, CPT-11, ciclofosfamida, citarabina, citosina-arabinosídeo, citoxan, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, dexrazoxano, docetaxel, doxorrubicina, DTIC, epirrubicina, etilenoimina, etoposido, floxuridina, fludarabina, fluorourac ilo, flutamida, fotemustina, gemcitabina, herceptina, hexametilamina, hidroxiureia, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustine, mecloretamina, melfalano, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitotane, mi toxant rona, oxaliplatina, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, procarbaz ina, rituximab, esteroides, estreptozocina, STI-571, estreptozocina, tamoxifen, temozolomida, teniposide, tetrazina, tioguanina, tiotepa, tomudex, topotecano, treosulfano, trimetrexato, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, VP 16 e xeloda.
Os fármacos quimioterápicos para cancro úteis também incluem agentes alquilantes, como, por exemplo, tiotepa e ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; mostardas de azoto tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiehin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitroureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimustina; antibióticos, tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, Carminomicina, carzinofilina, cromoinicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idambicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, noga1amicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina e zorrubicina; antimetabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, e trimetrexato,- análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, e tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, e 5 - FU; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, Rnepitiostane, e Testolactona; ant i-adrenai s, tais como aminoglutetimida, mitotano, e trilostane; repositor de ácido fólico, tal como o ácido frolínico; aceglatone; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxate; defofamine; demecolcina; diaziquona; elfornitinea; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrine; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podof ilínico,· 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofran; spi roge rmanium; ácido tenuazónico; triaziquone; 2,2',2μ-triclorotrietilamina; uretano, vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol, mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosideo (pAra-Cp); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Pou1enc Rorer, Antony, França); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina,· metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina,· etoposido (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da tοροίsomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas,- capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos mesmos. Também estão incluídos agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação de hormonas em tumores, tais como anti-estrogénios incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazóis inibidores de aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifene, onapristona, e toremifeno (Fareston); e antiandrogénios, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide, e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos mesmos.
Os fármacos úteis também incluem citocinas. Os exemplos dessas citocinas são linfocinas, monocinas, e hormonas polipeptídicas tradicionais. Estão incluídos entre as citocinas os fatores de crescimento, tais como a hormona de crescimento humana, hormona de crescimento humana Nmetionil e hormona de crescimento bovina; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoproteína, tais como a hormona folículo-estimulante (FSH),· hormona tirostimulante (TSH) e hormona luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibrobastos,- prolactina; hormona lactogénio placentária; fator de necrose tumoral alfa e beta; substância muleriano-inibidora; péptido associado a gonadotrofina de rato,* inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento nervoso, tais como NGF-beta; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento transformador (TGFs), tais como TGF-alfa e TGF-beta; fator de crescimento semelhante a insulina I e II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutores; interferões, tais como interferão alfa, beta e gama; fatores de estimulação de colónias (CSFs), tais como CSF de macrófagos (M-CSF), CSF de granulócitos-macrófagos (GMCSF); e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (ILs), tais como IL-1, IL-Ia, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; um fator de necrose tumoral, como por exemplo TNF-alfa ou TNF-beta; e outros fatores polipeptídicos, incluindo LIF e o ligando kit (KL). Tal como aqui utilizado, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais, ou de culturas de células recombinantes, e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa.
Os fármacos podem ser pró-drogas, subsequentemente ativadas, por exemplo, por uma enzima ativadora de pródrogas, que converte uma pró-droga, como por exemplo, um agente quimioterapêutico peptidil, num fármaco anticancro ativo. Por exemplo, veja-se o documento WO 88/07378, o documento WO 81/01145 e a Patente n° US 4,975,278. Em geral, o componente enzimãtico inclui uma qualquer enzima capaz de atuar numa pró-droga, de tal modo que a converte na sua forma citotóxica mais ativa.
Dirigir as Minicélulas para Células de Mamífero Específicas
Num aspeto da invenção, uma minicélula é dirigida a uma célula de mamífero alvo por intermédio de um ligando biespecífico, tal como descrito nos pedidos publicados PCT WO 05/056749 e WO 05/079854. 0 ligando biespecífico, que apresenta especificidade tanto para o componente minicélula como para o componente célula de mamífero, leva a que a minicélula se ligue à célula de mamífero, de tal modo que a minicélula seja englobada pela célula de mamífero, e o ácido nucleico funcional é libertado no citoplasma da célula de mamífero. Esse método de entrega direcionada pode ser realizado in vivo ou in vitro ou tanto in vivo como in vi tro. 0 contacto entre o ligando biespecífico, a minicélula e a célula de mamífero pode ocorrer numa variedade de maneiras diferentes. Para entrega in vivo, é preferencial administrar uma minicélula que já tem o ligando biespecífico ligado à mesma. Assim, a minicélula, o ligando biespecífico e a célula-alvo são todos colocados em contacto quando a minicélula direcionada a ligando biespecífico atinge a célula-alvo in vivo. Alternativamente, o ligando biespecífico e a minicélula podem ser administrados separadamente in vivo. 0 contacto entre os ligandos biespecíficos, minicélulas e células de mamífero também pode ocorrer durante uma ou mais incubações ain vitro, numa modalidade, os três elementos são incubados juntos todos de uma vez. Alternativamente, incubações em série podem ser realizadas. Num exemplo de uma abordagem passo a passo, as minicélulas e os ligandos biespecíficos são incubados juntos em primeiro lugar para formar minicélulas direcionadas a ligando biespecífico, que são, então, incubadas com as células-alvo. Noutro exemplo, os ligandos biespecíficos são em primeiro lugar incubados com células-alvo, seguindo-se uma incubação com minicélulas. Uma combinação de uma ou mais incubações in vitro e administrações in vivo também pode colocar os ligandos biespecíficos, minicélulas e células-alvo de mamífero em contacto.
Os inventores concluíram que a abordagem de entrega localizada é amplamente aplicável a uma gama de células de mamífero, incluindo células que normalmente são refratárias à adesão específica e endocitose de minicélulas. Por exemplo, ligandos de anticorpos biespecíficos com especificidade anti -0-polissacarídeo num braço e especificidade anti-recetor de HER2 ou anti-recetor de EGFR no outro braço, ligam, de forma eficaz, minicélulas aos recetores respetivos, numa variedade de células não fagocíticas alvo. Essas células incluem células de cancro de pulmão, ovário, cérebro, mama, próstata e pele. Além disso, a ligação eficaz precede endocitose rápida das minicélulas por cada uma das células não fagocíticas.
As células-alvo da invenção incluem qualquer célula na qual um ácido nucleico funcional deve ser introduzido. As células-alvos desejáveis são caracterizadas por expressão de um recetor de superfície celular que, mediante de ligação de um ligando, facilita a endocitose. As células-alvos preferenciais são não fagocíticas, significando que as células são fagócitos não especializados, tais como os macrófagos, células dendríticas e células pnatural killerp (NK). As células-alvo preferenciais são de mamífero.
Os ligandos úteis aos métodos de administração dirigidos desta invenção, incluem qualquer agente que se liga a um componente da superfície numa célula-alvo e a um componente da superfície numa minicélula. De preferência, o componente superficial numa célula-alvo é um recetor, especialmente um recetor que tem capacidade de mediar a endocitose. Os ligandos podem compreender um polipéptido e/ou componente de hidrato de carbono. Anticorpos são os ligandos preferenciais. Por exemplo, um anticorpo biespecífico que porta especificidades duplas para um componente de superfície em minicélulas intactas derivadas de bactéria e "para um componente de superfície em células- alvo de mamífero, pode ser utilizado eficazmente para direcionar as minicélulas às células-alvo de mamífero in vitro e in vivo. Os ligandos úteis também incluem recetores, enzimas, péptidos de ligação, proteínas de fusão/quiméricas e moléculas pequenas. A seleção de um ligando particular é realizada com base em dois critérios principais: (i) a ligação específica a um ou mais domínios na superfície de minicélulas intactas e (ii) a ligação específica a um ou mais domínios na superfície das células-alvo. Assim, os ligandos, de preferência, têm um primeiro braço que porta especificidade para uma estrutura superficial de minicélula intacta derivada de bactéria e um segundo braço que porta especificidade para uma estrutura superficial de célula de mamífero. Cada um dentro o primeiro e o segundo braços pode ser multivalente. De preferência, cada braço é monoespecífico, mesmo se multivalente.
Para ligação a minicélulas derivadas de bactéria, é desejável que um braço do ligando seja específico para o componente O-polissacárido de um lipopolissacárido encontrado na célula bacteriana parental. Outras estruturas de superfície das minicélulas que podem ser exploradas para a ligação do ligando incluem polipéptidos e hidratos de carbono expostos na superfície das células, presentes nas membranas exteriores, tais como proteínas da membrana exterior, segmentos de péptidos expostos na superfície celular de pili, fímbrias e flagelos.
Para ligação a células-alvo, um braço do ligando é específico para um componente superficial de uma célula de mamífero. Tais componentes incluem proteínas de superfície celular, péptidos e hidratos de carbono, sejam caracterizados ou não caracterizados. Os recetores de superfície celular, especialmente aqueles com capacidade de ativar a endocitose mediada por recetor, são componentes superficiais desejáveis para localização. Tais recetores, se superexpressos na superfície da célula-alvo, conferem seletividade adicional para localizar as células a serem tratadas, reduzindo, assim, a possibilidade de entrega a células não alvo. A título de exemplo, se pode localizar células tumorais alvo, células metastáticas, células de vasculatura, tais como células endoteliais e células de músculo liso, células pulmonares, células renais, células sanguíneas, células da medula óssea, células cerebrais, células hepáticas, e assim por diante, ou precursores de qualquer célula selecionada por seleção de um ligando que se liga especif icamente a um motivo de recetor de superfície celular nas células desejadas. Os exemplos de recetores de superfície celular incluem antígeno carcinoembriónico (CEA), que é superexpresso na maioria dos carcinomas de cólon, reto, mama, pulmão, pâncreas e trato gastrointestinal (Marshall, 2003); recetores de heregulina (HER-2, neu ou c-erbB- 2), que são frequentemente superexpressos em cancros de mama, ovário, cólon, pulmão, próstata e cervical (Hung et al., 2000); recetor de fator de crescimento epidermal (EGFR), que é altamente expresso numa gama de tumores sólidos, incluindo aqueles da mama, cabeça e pescoço, pulmonar de células não pequenas e próstata (Salomon et al., 1995); recetor de asialoglicoproteína (Stockert, 1995); recetor de transferrina (Singh, 1999) ; recetor de complexo de enzima serpina, que é expresso em hepatócitos (Ziady et al., 1997); recetor de fator de crescimento de fibroblasto (FGFR), que é superexpresso em células de adenocarcinoma do duto pancreático (Kleeff et al., 2002); recetor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), para terapia génica antiangiogénese (Becker et al., 2002; Hoshida et al., 2002); recetor de folato, que é seletivamente superexpresso em 90% de carcinomas de ovário não mucinosos (Gosselin e Lee, 2002); glicocálix de superfície celular (Batra et al., 1994); recetores de hidrato de carbono (Thurnher et al., 1994); e recetor de imunoglobulina polimérica, que é útil para entrega de gene às células epiteliais respiratórias e atrativo para o tratamento de doenças pulmonares, tal como Fibrose Cística (Kaetzel et al., 1997).
Os ligandos preferenciais compreendem anticorpos e/ou derivados de anticorpo. Conforme utilizado no presente documento, o termo "anticorpo" abrange uma molécula de imunoglobulina obtida por uma geração in vitro ou in vivo de uma resposta imunogénica. 0 termo "anticorpo" inclui anticorpos policlonais, monoespecíficos e monoclonais, assim como derivados de anticorpo, tais como fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFv). Os anticorpos e derivados de anticorpo úteis na presente invenção também podem ser obtidos por técnicas de ADN recombinante.
Os anticorpos do tipo selvagem têm quatro cadeias de polipéptido, duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Ambos os tipos de cadeias de polipéptido têm regiões constantes, que não variam ou variam minimamente entre anticorpos da mesma classe e regiões variáveis. As regiões variáveis são exclusivas de um anticorpo particular e compreende um domínio de ligação a antígeno que reconhece um epítopo específico. As regiões do domínio de ligação a antígeno que estão mais diretamente envolvidas na ligação de anticorpo são as "regiões determinantes de complementaridade" (CDRs). 0 termo "anticorpo" também abrange derivados de anticorpos, tais como fragmentos de anticorpo que mantêm a capacidade de se ligar especificamente a antígenos. Tais fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab (um fragmento que contém o domínio de ligação a antígeno e compreende uma cadeia leve e parte de uma cadeia pesada ligada em porte por uma ligação de dissulfeto) , Fab' (um fragmento de anticorpo contendo um domínio de ligação a antígeno único compreendendo um Fab e uma porção adicional da cadeia pesada através da região de dobradiça, F(ab')2 (duas moléculas Fab' unidas por ligações de dissulfeto intercadeia nas regiões de dobradiça das cadeias pesadas), um Fab biespecífico (uma molécula de Fab que tem dois domínios de ligação a antígeno, cada um dos quais pode ser direcionado para um epítopo diferente) e um scFv (a região determinante de ligação a antígeno variável de uma cadeia pesada e leve única de um anticorpo ligado juntamente por uma cadeia de aminoácidos).
Quando os anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpo, constituem parte ou todos os ligandos, os mesmos, de preferência, são de origem humana ou são modificados para serem adequados para a utilização em seres humanos. Os assim chamados panticorpos humani z ado sp são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Osbourn et al., 2003. Os mesmos foram modificados por manipulação genética e/ou tratamento in vitro para reduzir sua antigenicidade num ser humano. Os métodos para humanizar os anticorpos são descritos, por exemplo, nas patentes nos US 6.639.055, 5.585.089 e 5.530.101. No caso mais simples, os anticorpos humanizados são formados por enxerto dos laços de ligação a antígeno, conhecidos como regiões determinantes de complementaridade (CDRs), de um mAb de murganho numa IgG de ser humano. Veja-se, Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; Verhoeyen et al., 1988. A geração de anticorpos humanizados de alta afinidade, entretanto, exige, de modo geral, a transferência de um ou mais resíduos adicionais das assim chamadas regiões de arcabouço (FRs) do mAb progenitor de murganho. Diversas variantes da tecnologia de humanização também foram desenvolvidas. Veja-se Vaughan et al., 1998.
Os anticorpos humanos, em vez de panticorpos humanizadosp, também podem ser empregados na invenção. Os mesmos têm alta afinidade para seus respetivos antígenos e são rotineiramente obtidos a partir de fragmentos variáveis de cadeia única muito grandes (scFvs) ou biblioteca de apresentação em fago de Fab. Veja-se Griffiths et al., 1994; Vaughan et al., 1996; Sheets et al., 1998; de Haard et al., 1999; e Knappik et al., 2000.
Os ligandos úteis também incluem anticorpos de cadeia única biespecíficos, que tipicamente são polipéptidos recombinantes que consistem numa porção de cadeia leve variável ligada covalentemente através de uma molécula de ligação a uma porção de cadeia pesada variável correspondente. Veja-se, as patentes nos US 5.455.030, 5.260.203 e 4.496.778. Os anticorpos biespecíficos também podem ser produzidos por outros métodos. Por exemplo, heteroconjugados podem ser criados por ligação química de anticorpos intactos ou fragmentos de anticorpo de especificidades diferentes. Veja-se Karpovsky et al., 1984. Entretanto, tais heteroconjugados são difíceis de produzir de uma maneira reproduzível e são pelo menos duas vezes maiores que anticorpos monoclonais normais. Os anticorpos biespecíficos também podem ser criados por troca de dissulfeto, que envolve a clivagem enzimática e a reassociação dos fragmentos de anticorpo. Veja-se Glennie et al., 1987 .
Devido ao facto de que os fragmentos Fab e scFv são monovalentes, os mesmos frequentemente têm baixa afinidade para estruturas alvo. Portanto, os ligando preferenciais produzidos a partir desses componentes são manipulados em conjugados diméricos, triméricos ou tetraméricos para aumetar a afinidade funcional. Veja-se Tomlinson e Holliger, 2000; Carter, 2001; Hudson e Souriau, 2001; e Todorovska et al., 2001. Tais estruturas conjugadas podem ser criadas por reticulações químicas e/ou genéticas.
Os ligandos biespecíficos da invenção, de preferência, são monoespecíficos em cada extremidade, isto é, específicos para um único componente em minicélulas numa extremidade e específicos para um único componente em células-alvo na outra extremidade. Os ligandos podem ser multivalentes numa ou ambas as extremidades, por exemplo, na forma de assim chamados diacorpos, triacorpos e tetracorpos. Veja-se Hudson e Souriau, 2003. Um diacorpo é um dímero bivalente formado por uma associação não covalente de dois scFvs, que rende dois sítios de ligação de Fv. Similarmente, um triacorpo resulta da formação de um trímero trivalente de três scFvs, rendendo três sítios de ligação, e um tetracorpo resulta da formação de um tetrâmero tetravalente de quatro scFvs, rendendo quatro sítios de ligação.
Diversos anticorpos monoclonais humanizados, humanos e de murganho e fragmentos dos mesmos que têm especificidade para recetores em células de mamífero foram aprovados para utilização terapêutica em ser humano, e a lista está a crescerrapidamente. Veja-se Hudson e Souriau, 2003. Um exemplo de tal anticorpo que pode ser utilizado para formar um braço de um ligando biespecífico tem especificidade para HER2: Herceptin™; Trastuzumabe.
As regiões variáveis de anticorpo também podem ser fundidas a uma ampla gama de domínios de proteína. A fusão a domínios de imunoglobulina de ser humano, tais como CH3 de IgGl, tanto adiciona massa como promove a dimerização. Veja-se Hu et al., 1996. A fusão a regiões Fc de dobradiça de Ig de ser humano pode adicionar funções efetoras. Além disso, a fusão a domínios de proteína heteróloga a partir de proteínas multiméricas promove a multimerização. Por exemplo, a fusão a um scFv curto para encurtar hélices anfipáticos tem sido utilizada para produzir minianticorpos. Veja-se Pack e Pluckthun, 1992. Os domínios de proteínas que formam heterodímeros, tais como fos/jun, podem ser utilizados para produzir moléculas biespecíficas (Kostelny et al., 1992) e, alternativamente, domínios de homodimerização podem ser manipulados para formar heterodímeros por estratégias de manipulação, tal como pknobs into holesp (Ridgway et al., 1996). Finalmente, os parceiros de proteína de fusão podem ser selecionados que fornecem tanto multimerização como uma função adicional, por exemplo, estreptavidina. Veja-se Dubel et al., 1995. Métodos de entrega a células competentes para fagocitose ou endocitose A invenção fornece ainda a administração ao colocar minicélulas derivadas de bactérias em contacto com células de mamífero que são competentes para fagocitose ou endocitose. Tais células de mamífero, que têm capacidade de englobar células bacterianas progenitoras da maneira de patógenos bacterianos intracelulares, similarmente englobam as minicélulas, que libertam a sua carga útil no citoplasma das células de mamífero. Essa abordagem de entrega pode ser efetuada sem a utilização de ligandos de localização.
Uma variedade de mecanismos pode estar envolvida no englobamento de minicélulas por um dado tipo de célula, e a presente invenção não depende de qualquer mecanismo particular nesse sentido. Por exemplo, a fagocitose é um processo bem documentado em que macrófagos e outras células fagocíticas, tais como neutrófilos, ingerem partículas estendendo os pseudópodes sobre a superfície de partícula até a partícula estar totalmente envolvida. Embora descrita como fagocitose pnão específicap, o envolvimento de recetores específicos no processo foi demonstrado. Veja-se Wright et al., (1986); Speert et al., (1988) .
Assim, uma forma de fagocitose envolve a interação entre ligandos de superfície e recetores de ligandos localizados nas membranas dos pseudópodes. Acredita-se que essa etapa de ligação, mediada pelos recetores específicos, seja dependente de adesinas superficiais bacterianas. Em relação a bactérias menos virulentas, tal como E. coli não enterotoxigénica, a fagocitose também pode ocorrer na ausência de ligandos superficiais para recetores de fagócitos. Veja-se Pikaar et al. (1995), por exemplo. Assim, a presente invenção, compreende, mas não está limitada à utilização de minicélulas que têm ou não adesinas de superfície, de acordo com a natureza das suas células bacterianas parentais, e são englobadas por fagócitos (isto é, células hospedeiras "competentes para fagocitose"), sendo neutrófilos e macrófagos os principais tipos em mamíferos.
Outros processo de englobamento é a endocitose, pelo qual patógenos intracelulares exemplificados por espécies de Salmonella, Escherichia, Shigella, Helicobacter, Pseudomonas e Lactobacilli ganham entrada em células epiteliais de mamífero e se replicam na mesma. Dois mecanismos básicos nesse sentido são endocitose mediada por recetor dependente de clatrina, também conhecido como pendocitose de poço revestidop (Riezman, 1993), e endocitose independente de clatrina (Sandvig & Deurs, 1994). Qualquer uma ou ambas podem estar envolvidas quando uma célula competente em englobamento (isto é, uma célula hospedeira pcompetente em endocitosep) engloba minicélulas em conformidade com a invenção. As células competentes em endocitose representativas são células epiteliais de mama, enterõcitos no trato gastrointestinal, células epiteliais estomacais, células epiteliais pulmonares e células epiteliais do trato urinário e bexiga.
Ao efetuar a entrega a uma célula de mamífero competente em englobamento sem a utilização de um ligando de localização, a natureza da aplicação contemplada influenciará a escolha de fonte bacteriana para as minicélulas empregadas. Por exemplo, espécies de Salmonella, Escherichia e Shigella portam adesinas que são reconhecidas por recetores mediadores de endocitose no trato gastrointestinal e podem ser adequadas para entregar um fãrmaco que é eficaz para células de cancro do cólon. Similarmente, as minicélulas derivadas de Helicobacter pylori, que portam adesinas específicas para células epiteliais estomacais, poderiam ser adequadas para entrega que visa células de cancro do estômago. A inalação ou insuflação pode ser ideal para a administração de minicélulas intactas derivadas de espécies de Pseudomonas, que têm adesinas reconhecidas por recetores nas células epiteliais do pulmão. As minicélulas derivadas de bactérias Lactobacilli, as quais têm adesinas específicas para o trato urinário e células epiteliais da bexiga, podem ser adequadas para administração intrauretal de um fármaco, num cancro do trato urinário ou da bexiga.
Formulações
Conforme indicado, é fornecida em um aspeto uma composição que compreende: (a) uma pluralidade de minicélulas derivadas de bactéria intactas, em que cada minicélula da pluralidade compreende ARN regulatório que está empacotado na minicélula, e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável para a mesma, em que (i) o ARN regulatório é selecionado a partir do grupo que consiste em s sARM antissentido, ribozima e ARN chamariz, (ii) há uma ausência das minicélulas de um construto para expressão in situ do ARN regulatório, e (iii) a pluralidade compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do ARN regulatório. A formulação compreende, opcionalmente, um fármaco. Num exemplo, a minicélula da formulação contém o fármaco, enquanto noutro exemplo, a minicélula pode conter uma molécula de ácido nucleico, tal como um plasmídeo, que codifica o fármaco.
As formulações também contêm, opcionalmente, um ligando biespecífico para dirigir a minicélula para uma célula-alvo. A minicélula e o ligando podem ser um qualquer dos que são aqui descritos. Assim, a minicélula contém um ácido nucleico que codifica um ácido nucleico funcional e o ligando biespecífico é preferencialmente capaz de se ligar a um componente da superfície da minicélula e a um componente da superfície de uma célula-alvo de mamífero.
As formulações podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou frascos, ou em recipientes de múltiplas doses, com ou sem um conservante adicionado. A formulação pode ser uma solução, uma suspensão ou uma emulsão em veículos oleosos ou aquosos e pode conter agentes formulantes, tais como agentes suspensores, estabilizantes e/ou dispersantes. Uma solução adequada é isotónica com o sangue do recetor é ilustrada por solução salina, solução de ringer e solução de dextrose. Alternativamente, as formulações podem estar na forma de pó liofilizado, para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, estéril, água livre de pirogénio ou solução salina fisiológica. As formulações também podem existir na forma de uma preparação de depósito. Tais formulações de longa atuação podem ser administradas por implantação (por exemplo, por via subcutânea ou por via intramuscular) ou por injeção intramuscular.
Vias de Administração
As formulações aqui descritas podem ser administradas por intermédio de várias vias e em vários locais, no corpo de um mamífero, de forma a atingir o ou os efeitos terapêuticos desejados, local ou sistemicamente. A entrega pode ser realizada, por exemplo, por administração oral, por aplicação da formulação a uma cavidade corporal, por inalação ou insuflação ou por administração parenteral, intramuscular, intravenosa, intraportal, intra-hepática, peritoneal, subcutânea, intratumoral ou intradérmica. 0 modo e o sítio de administração dependem da localização das células-alvos. Por exemplo, células cístico-fibróticas podem ser atingidas através da administração por inalação das minicélulas direcionadas. Do mesmo modo, células de metástases de tumores podem ser tratadas de forma mais eficaz, através de administração intravenosa de minicélulas direcionadas. Cancros do ovário primários podem ser tratados através de administração intraperitoneal de minicélulas direcionadas.
Pureza
Num aspeto, as minicélulas estão substancialmente isentas de células bacterianas parentais contaminantes. Assim, as formulações que contêm minicélulas, contêm preferencialmente menos do que cerca de 1 célula bacteriana parental contaminante por 107 minicélulas, mais preferencialmente, menos do que cerca de 1 célula bacteriana parental contaminante por 10B minicélulas, ainda mais preferencialmente, menos do que cerca de 1 célula bacteriana parental contaminante por 109 minicélulas, e ainda mais preferencialmente, menos do que cerca de 1 célula bacteriana parental contaminante por IO10 minicélulas, sendo absolutamente preferido que elas contenham menos do que cerca de 1 célula bacteriana parental contaminante por 1011 minicélulas.
Os métodos que podem ser utilizados para a purificação de minicélulas são conhecidos na técnica e estão descritos na publicação internacional número WO 03/033519. Um destes métodos combina a filtração por fluxo cruzado (fluxo de alimentação é paralelo a uma superfície de membrana; Forbes, 1987) e filtração convencional (fluxo de alimentação é perpendicular à superfície da membrana). Opcionalmente, a combinação de filtrações pode ser precedida por uma centrifugação diferencial, a uma força de centrifugação baixa, para remover alguma porção das células bacterianas, enriquecendo assim o sobrenadante para as minicélulas.
Outro método de purificação emprega uma centrifugação em gradiente de densidade num meio biologicamente compatível. Após a centrifugação, uma banda de minicélulas é recolhida do gradiente e, opcionalmente, as minicélulas são submetidas a uma série de centrifugações em gradiente de densidade adicionais, para maximizar a pureza. 0 método pode ainda incluir uma etapa preliminar de realização de uma centrifugação diferencial numa amostra contendo minicélulas. Quando realizado a uma força centrífuga baixa, a centrifugação diferencial irá remover alguma parte das células bacterianas parentais, enriquecendo deste modo o sobrenadante para as minicélulas.
Os métodos de purificação particularmente eficazes exploram a filamentação bacteriana, para aumentar a pureza das minicélulas. Assim, um método para a purificação das minicélulas pode incluir as etapas de (a) submeter uma amostra contendo minicélulas a uma condição que induz as células bacterianas parentais a adotar uma forma filamentosa, seguido por (b) filtrar a amostra para obter uma preparação de minicélulas purificada.
Também podem ser combinados métodos de purificação de minicélulas conhecidos. Uma combinação altamente eficaz de métodos é a seguinte:
Etapa A: Centrifugação diferencial de uma cultura de células bacterianas produtoras de minicélulas. Essa etapa, que pode ser realizada a 2.000 g durante cerca de 20 minutos, remove a maior parte das células bacterianas, deixando, contudo, as minicélulas no sobrenadante.
Etapa B: Centrifugação em gradiente de densidade, utilizando um meio em gradiente de densidade, não tóxico e isotónico. Essa etapa separa as minicélulas de muitos contaminantes, incluindo células bacterianas parentais, com perdas mínimas de minicélulas. Essa etapa é preferencialmente repetida dentro de um método de purificação.
Etapa C: Filtração de fluxo cruzado através de um filtro de 0,45 pm, para reduzir ainda mais a contaminação de células bacterianas parentais.
Etapa D: Filamentação induzida por stress de células bacterianas parentais residuais. Isso pode ser conseguido submetendo-se a suspensão de minicélulas a uma qualquer condição ambiental que induz estresse.
Etapa E: Tratamento com antibiótico para matar as células bacterianas parentais.
Etapa F: Filtração por fluxo cruzado, para remover pequenos contaminantes, tais como bolhas de membranas, fragmentos de membranas, restos de bactérias, ácidos nucleicos, componentes do meio, etc., e para concentrar as minicélulas. Um filtro de 0,2 mm pode ser empregado para separar as minicélulas de contaminantes pequenos, e um filtro de 0,1 mm pode ser empregado para concentrar as minicélulas.
Etapa G: Filtração terminal para eliminar células bacterianas filamentosas mortas. Pode ser utilizado para essa etapa um filtro de 0,45 um.
Etapa H: Remoção de endotoxinas da preparação de minicélulas. Podem ser utilizadas para essa etapa esferas magnéticas revestidas com antilípido A. Cronogramas de administração
Em geral, as formulações aqui divulgadas podem ser utilizadas em dosagens apropriadas, definidas por testes de rotina, por forma a obter um efeito fisiológico ideal, ao mesmo tempo que quaisquer toxicidades possíveis são minimizadas. O regime de dosagem pode ser selecionado em conformidade com uma variedade de fatores, incluindo idade, peso, sexo, condição médica do paciente; a gravidade da afeção a ser tratada, a via de administração e a função renal e hepática do paciente.
Uma precisão ideal para atingir concentrações de minicélulas e de fármaco dentro do intervalo que produz uma eficácia máxima, com efeitos secundários mínimos, pode requerer um regime com base na cinética do ácido nucleico funcional e di sponibi1idade do fármaco em locais-alvo e células-alvo. A distribuição, equilíbrio e eliminação de uma minicélula ou fãrmaco podem ser considerados, quando se determina a concentração ideal necessária para um regime de tratamento. As dosagens de minicélulas e dos fãrmacos podem ser ajustadas quando utilizadas em combinação, para atingir os efeitos desejados.
Adicionalmente, a administração de dosagem das formulações pode ser otimizada ao utilizar um sistema de modelação farmacocinético/farmacodinâmico. Por exemplo, podem ser escolhidos um ou mais regimes de dosagem, e pode ser utilizado um modelo farmacocinético/farmacodinâmico, para determinar o perfil farmacocinético/farmacodinâmico de um ou mais regimes de dosagem. Em seguida, pode ser selecionado um dos regimes de dosagem para administração que atinge a resposta farmacocinética/farmacodinâmica baseada no perfil farmacocinético/farmacodinâmico particular. Veja-se, por exemplo, o documento WO 00/67776. A este respeito, um regime de dosagem para uma qualquer indicação pode ser determinado ao utilizar a abordagem e o modelo aqui descritos no Exemplo 6, modificados para a célula de interesse em particular.
Em particular, as formulações podem ser administradas pelo menos uma vez por semana, ao longo de várias semanas. Numa forma de realização, as formulações são administradas pelo menos uma vez por semana, ao longo de várias semanas a vários meses.
Mais especificamente, as formulações podem ser administradas pelo menos uma vez por dia, durante cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31 dias. Em alternativa, as formulações podem ser administradas cerca de uma vez por dia, uma vez a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31 dias ou mais.
Em alternativa, as formulações podem ser administradas cerca de uma vez a cada semana, cerca de uma vez a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 semanas ou mais. Em alternativa, as formulações podem ser administradas pelo menos uma vez por semana durante cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 semanas ou mais.
Em alternativa, as formulações podem ser administradas cerca de uma vez por mês, cerca de uma vez a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses ou mais.
As formulações podem ser administradas numa dose diária única, ou a dose diária total pode ser administrada em doses divididas duas, três ou quatro vezes por dia.
Num método no qual as minicélulas são administradas antes de um fármaco, a administração do fármaco pode ocorrer em qualquer altura, desde alguns minutos a algumas horas após a administração das minicélulas. O fármaco pode, em alternativa, ser administrado em qualquer altura, desde várias horas a vários dias, possivelmente várias semanas até vários meses após as minicélulas.
Mais especificamente, as minicélulas empacotadas com ácidos nucleicos funcionais podem ser administradas pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas antes do fármaco. Adicionalmente, as minicélulas podem ser administradas pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31 dias antes da administração do fármaco. Ainda noutra forma de realização, as minicélulas podem ser administradas pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 semanas ou mais antes do fármaco. Numa outra forma de realização, as minicélulas podem ser administradas pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses antes do fármaco.
Numa outra forma de realização, as minicélulas são administradas após o fármaco. A administração da minicélula pode ocorrer a qualquer momento, desde vários minutos a várias horas após a administração do fãrmaco. A minicélula pode, em alternativa, ser administrada a qualquer momento, desde várias horas a vários dias, possivelmente várias semanas a vários meses após o fãrmaco.
Os Exemplos seguintes são meramente ilustrativos, e não são limitativos, e permitem uma compreensão mais completa da invenção.
Exemplos 1. Empacotamento direto de ARN regulatório em minicélulas intactas in vitro
As minicélulas intactas derivadas de bactérias, foram preparadas e purificadas tal como descrito no Pedido Publicado de Patente n° US 2004/0265994. 0 siARN de gliceraldeídoS- fosfato desidrogenase (GAPDH) marcado com Cy3 foi obtido (excitação máx. (λ^χ) 547 nm, emissão máx. (Xmáx) 563 nm) , produto de Ambion (Austin, Texas, EUA) , e foi reconstituído em água isenta de nucleases, para uma concentração final de 50 μΜ.
Aproximadamente 107 minicélulas foram suspensas em solução de tampão fosfato IX (PBS) (Gibco), e foram incubadas juntamente com 1 μΜ de siARN GAPDH marcado com Cy3. A incubação foi realizada durante 2 horas a 37 °C, com mistura suave. As minicélulas de controlo foram incubadas apenas com PBS IX. Após o carregamento, as minicélulas foram lavadas duas vezes com PBS IX, através de centrifugação durante 10 minutos a 16.200 x g. As minicélulas experimentais e de controlo foram observadas num microscópio de fluorescência DMLB, produto da Leica (Alemanha), com uma câmara D70 acoplada, produto de Olympus Microscopes (Alemanha). As imagens foram adquiridas ao utilizar uma lente de imersão em óleo de lOOx.
As experiências de incubação simultânea anteriores também foram realizadas em condições experimentais diferentes, tais como incubação à temperatura ambiente, 37 °C, e 4 °C. Adicionalmente, os tempos de coincubação variaram para incluir 1 hora, 2 horas, 4 horas e 12 horas, respetivamente.
Tal como mostrado na Figura 1B, as moléculas de siARN difundem rapidamente para as minicélulas intactas. A incubação de 2 horas a 37 °C foi suficiente para atingir um empacotamento altamente significativo das minicélulas.
De forma a determinar se as moléculas de siARN se encontravam dentro das minicélulas ou aderentes à superfície das minicélulas, as minicélulas com siARN marcado com Cy3 foram incubadas com exonuclease durante a noite, seguindo-se uma nova análise com microscópio de fluorescência. Os resultados foram idênticos aos apresentados na Figura 1B, indicando que os siARNs foram internaiizados pelas minicélulas e não se encontram aderentes à superfície das mesmas. 2. Transfeção in vitro de células de cancro de mama humano com minicélulas direcionadas para anticorpo biespecífico empacotadas por ARN regulatório
Para demonstrar que as minicélulas que portam ARN regulatório são estáveis em soro in vitro e que podem ser internaiizadas por células de mamífero direcionadas especificamente, o experimento a seguir foi executado.
Um siARN dirigido para a polo cinase 1 (Plkl) foi sintetizado com uma sequência alvo 5'-GGTGGATGTGTGGTCCATTTT-3' e marcado com um marcador de fluorescência, AlexaFluor 488. As polio cinases têm múltiplas funções durante a entrada em mitose, a maturação de centrossoma, a formação de fuso bipolar, a segregação de cromossomas e citocinese e, crucialmente, a monitorização de fidelidade de controlo de ponto de verificação (Glover et al., 1998; Barr et al., 2004; van de Weerdt e Medema 2006) . Em humanos, a Plkl é o membro dessa família que se encontra mais bem caracterizado. A Plkl está associada a tumorigénese e pertence à família das serina/treonina cinases, o que representa um alvo interessante para novos agentes de quimioterapia. Assim, a Plkl é considerada como um alvo promissor para o desenvolvimento de fãrmacos anticancro (Strebhardt e Ullrich, 2006).
As minicélulas foram purificadas, e 109 minicélulas foram empacotadas com siARN anti-AF488Plkl, tal como descrito no Exemplo 1. Um anticorpo biespecífico (BsAb) foi preparado, portanto antígeno O anti-S, typhimurium e especificidades de EGFR anti-humano e foi ligado as minicélulasAF488-piki-siAEN conforme descrito no pedido publicado PCT WO 05/056749. As minicélulas resultantes foram designadas EGFRminicélulasAF488_Pikl_E!iAEN. Essas minicélulas (109) foram incubadas com células de cancro de mama humanas, em cultura de tecidos, a uma densidade de 10.000 minicélulas:1 célula tumoral. A incubação foi realizada durante 1 hora, 2 horas, 4 horas e 24 horas. A cada ponto no tempo, as células foram recolhidas e manchadas com DAPI (coloração nuclear, fluorescência azul). As células foram observadas ao utilizar o microscópio confocal 1X81 (Olympus) e o software CellR.
Após 1 hora, as minicélulas, portanto, siARNs fluorescentes, tinham aderido às células MDA-MB-468 (veja-se a Figura 2) . Essa ligação foi devido, acredita-se, â ligação ao BsAb ligado à minicélula, o qual é dirigido para o recetor do EGFR nas células MDA-MB-468, uma vez que a incubação de controlo com as minicélulasAF488-piki-siARN sem BsAb mostrou que estas foram removidas e não mostraram qualquer fluorescência verde associada com as células MDA-MB-468. 2 horas após a incubação, as EGFRminicélulasAF483-piki-síarn foram internalizadas dentro das células MDA-MB-468 e exibiram fluorescência verde intensa. Após 24 horas, a maior parte da fluorescência verde tinha desaparecido, o que indica que as minicélulas internalizadas tinham sido destruídas, presumivelmente, dentro de fagolisossomas. 3. Extração e quantificação de siARN de minicélulas intactas
Uma vez que os siARNs não ocorrem na natureza em células bacterianas ou minicélulas derivadas de bactérias, não é surpreendente que não exista metodologia estabelecida para a extração de siARNs deste tipo de partículas. Assim, os presentes inventores desenvolveram um método para a extração quantitativa de siARNs que se encontram empacotados em minicélulas intactas, em conformidade com a invenção. A proteína cinesina do fuso (KSP), também conhecida como "cinesina-5" e "Eg5", é uma proteína motora dos microtúbulos. Essa proteína é essencial para a formação de fusos bipolares e segregação correta de cromatídeos irmãos durante a mitose (Enos e Morris, 1990; Blangy et al., 1995; Sawin e Mitchison, 1995; Dagenbach e Endow, 2004). A inibição da KSP provoca a formação de fusos mitóticos monopolares, ativa o ponto de verificação da formação do fuso, e retém as células em mitose, o que leva à subsequente morte celular (Blangy et al., 1995, Caner et al. , 1999; Kapoor et al., 2000; Tao et al., 2005).
Foi selecionado um siARN contra a KSP para o empacotamento em minicélulas, para fornecer informações acerca da otimização da extração de siARNs de minicélulas, de acordo com a invenção. Mais especif icamente, as sequências de oligonucleõtidos de fita dupla KSP-l-siARN (cadeia sentido; 5' -AAC TGG ATC GTA AGA AGG CAG-3' ) foram sintetizadas e empacotadas em minicélulas, em conformidade com os procedimentos apresentados no Exemplo 1, supra.
As minicélulaSsiRNA-Ksp (1010) e um número comparável de minicélulas vazias de controlo foram processadas, ao utilizar uma variedade de kits de extração de ácidos nucleicos, disponíveis comercialmente. Os resultados mostraram que o kit de isolamento de miARN mirVana (Ambion) forneceu extração quantitativa dos siARN-KSP de minicélulas intactas. 0 procedimento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.
Os siARNs purificados foram, em primeiro lugar, corados com um corante fluorescente de ácidos nucleicos, ultrassensível, RiboGreen™, produto de Molecular Probes Inc. (Eugene, Oregon, EUA), seguindo-se quantificação utilizando o espectrómetro NanoDrop ND-3300 Fluoro, produto de NanoDrop Technologies Inc. (Wilmington, Delaware, EUA), também de acordo com as instruções do fabricante. O RiboGreen™ ligado ao ARN tem uma excitação máxima de aproximadamente 500 nm e uma emissão máxima de aproximadamente 525 nm.
Os resultados mostram que as minicélulas tiveram a capacidade de transportar os siARNs. IO10 minicélulas vazias continham aproximadamente 1,4 pg de ARN, possivelmente um nível basal de ARN bacteriano formado endogenamente. 0 mesmo número de mini célulasSiRNA-KPs continham -2,7 pg de ARN, que compreende ARN bacteriano endógeno mais siARNKPS exógeno empacotado. Assim, estes dados demonstram que 10lu minicélulas podem empacotar pelo menos aproximadamente 1,3 pg de siARN empacotado exogenamente. 4. Demonstração in vivo de efeitos antitumorais atingidos por minicélulas empacotadas com ARN regulatório
Os estudos seguintes foram conduzidos para mostrar que minicélulas empacotadas com ARN regulatório podem administrar ARN regulatório intacto, em concentrações terapeuticamente eficazes, a células tumorais in vivo.
Foi selecionado um siARN contra KSP, tal como descrito no Exemplo 3, para empacotar nas minicélulas de acordo com a presente invenção. As minicélulas foram purificadas, e 109 minicélulas foram empacotadas com siARN anti-KSP, tal como descrito no Exemplo 1. Foi preparado um BsAb, o qual foi ligado às minicélulassiRNA_Ksp; tal como descrito no Exemplo 2, para produzir EGFRminicélulasSiRKA-Ksp·
Os murganhos utilizados nesse Exemplo foram comprados junto ao Animal Resources Centre (Perth, WA, Austrália) , e todas as experiências animais foram realizadas em conformidade com o guia de cuidado e utilização de animais de laboratório com a aprovação do Animal Ethics Committee. As experiências foram realizadas nas instalações de pequenos animais acreditada pelo NSG Agriculture, na EnGeneIC Pty Ltd (Sydney, New South Wales, Austrália).
As células de cancro da mama humanas (MDA-MB-468, ATCC) foram cultivadas em cultura de tecidos, em meio RPMI 1640, sup1ementado com 5% de soro bovino GIBCO-BRL, produto da Invitrogen Corporation (Carlsbad, Califórnia, EUA), e glutamina (Invitrogen), numa atmosfera humedecida de 95% ar e 5% C02, a 37 °C. 1 x 106 células em 50 mL de meio sem soro, foram misturadas com 50 mL de matrigel com teor reduzido de fator de crescimento, produto de BD Biosciences (Franklin Laques, New Jersey, EUA) . Através de uma agulha de calibre 23, as células foram injetadas subcutaneamente entre as omoplatas de cada murganho. Os tumores foram medidos duas vezes por semana, ao utilizar um paquímetro digital eletrónico (precisão a 0,001), produto de Mitutoyo (Japão), e o volume tumoral médio foi calculado utilizando a seguinte fórmula: comprimento (mm) x largura2 (mm) x 0,5 = volume (mm3) .
Os vários tratamentos começaram quando os tumores atingiram volumes entre 170 mm3 e 200 mm3, e os murganhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos diferentes de oito por grupo. O grupo de controlo 1 recebeu solução salina estéril e o grupo experimental 2 recebeu tGFRminicélulasSiRNA-Ksp (109) , quatro vezes por semana.
Tal como mostrado na Figura 3, as EGFRminicélulasSiRNA-Ksp resultaram num efeito antitumoral muito significativo, em comparação com os controlos de solução salina. Os resultados demonstram que (a) siARNs foram estáveis dentro das minicélulas in vivo, (b) siARNs completamente funcionais e intactos foram entregues às células tumorais in vivo, e (c) a minicélula entregou concentrações terapeuticamente significativas de siARN às células tumorais in vivo. 5. Demonstração de terapia para cancro feita à medida, por intermédio de tratamento com minicélulas empacotadas com ARN regulatório, seguido por minicélulas empacotadas com fármaco A maioria das terapias anticancro está associada com resistência a fãrmacos. 0 mesmo é verdade para o tratamento com ARN regulatórios, uma vez que as mutações genéticas em células tumorais podem tornar os ARNs regulatórios ineficazes, se o gene alvo sofrer mutação dentro da sequência que é alvo dos ARNs regulatórios. Não tem existido uma estratégia eficaz para resolver o problema da resistência a fármacos em doentes com cancro. Em vez disso, têm de ser administrados novos fãrmacos para ultrapassar a mutação. No entanto, essa abordagem enfrenta dificuldades sérias, uma vez que a maior parte dos fãrmacos anticancro são altamente tóxicos, e terapias combinadas aumentam esta toxicidade, o que resulta numa limitação das doses e frequente abandono da terapia quando o paciente já não consegue suportar a toxicidade. 0 estudo seguinte foi conduzido para determinar a eficácia de minicélulas empacotadas com ARN regulatório na resolução desse tipo de resistência.
Tal como descrito anteriormente, as minicélulas foram purificadas e empacotadas (109) com siARN anti-KSP ou anti-Plkl. Também conforme anteriormente descrito, o anticorpo biespecífico foi preparado, portanto antígeno 0 anti-S. typhimurium e especificidades para EGFR anti-humano e foi ligado às minicélulasSiRKa- Ksp para gerar as ^^minicélulaSsiRNA-Ksp ·
Xenoenxertos de cancro de cólon humano (HCT116; ATCC) foram estabelecidos em murganhos nus, conforme descrito no Exemplo 3 e foram tratados i.v. conforme o seguinte: 0 grupo 1 recebeu solução salina estéril, e os murganhos do grupo 2, 3 e 4 foram tratados para as primeiras 10 doses (veja-se a Figura 4) com 109 EGFRminicélulaSsiARN-piki, EGFRminicelulasSiARN-Ksp-i, e EGFRminicélulasSiARN-Ksp-2 respetivamente. As sequências Plkl e KSP-1 são descritas nos Exemplos anteriores. 0 siARN-KSP-2 (fita sentido; 5' CTGAAGACC TGAAGACAAT 3') é dirigido a um segmento diferente do mRNA de KSP. Após o dia 33, os murganhos nos grupos 2, 3 e 4 foram tratados com duas doses de * minicelulaScarboplatina ·
Os resultados mostraram (Figura 4) que após o dia 26, os tumores tornaram-se resistentes aos tratamentos com o siARN. Assim, os murganhos nos grupos 2, 3 e 4 foram tratados para as quatro doses subsequentes, com as três doses de EUFRminicélulasSiRNA-piki + EGFRminicélulasSiRNA-Ksp-i + EGFRminicélulassiRNA-Ksp~2/ combinados em doses iguais, isto é, ~3 x 108 de cada tipo de minicélula. Adicionalmente, ao dia 33, os tumores eram altamente resistentes a todos os siARNs (Figura 4) . Após a administração de EGFRminicélulascarbopiatina, o crescimento tumoral nos murganhos dos grupos 3 e 4 foi retardado significativamente. Após a administração de EGFRminicélulascarbopiatina; os murganhos do grupo 3 mostraram uma regressão significativa do volume tumoral.
Esses resultados mostram que as células tumorais resistentes a fãrmacos podem ser tratadas de forma eficaz in vivo, em conformidade com a presente invenção. Em particular, (1) as administrações sequenciais de minicélulas-alvo, contendo sequências de ARN regulatório projetadas para reduzir a carga tumoral de forma significativa são seguidas, quando as células tumorais se tornam resistentes ao efeito antitumoral mediado por siARN, por (2) minicélulas-alvo contendo um fármaco que não atua na mesma proteína alvo que o ARN regulatório. 6. Demonstração de knockdown da proteína alvo em células tumorais, e consequente paragem do crescimento celular, subsequente à administração dirigida de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ARN regulatório empacotado em minicélulas intactas
Para demonstrar que o método da invenção permite o empacotamento de quantidades terapeuticamente eficazes de ARN regulatório em minicélulas intactas, foi necessário demonstrar que minicélulas empacotadas com ARN regulatório, alvos de anticorpos biespecíficos, eram capazes de parar o crescimento celular de forma eficaz e eficaz, e induzir morte celular por apoptose.
Numa atmosfera humedecida de 95% ar e 5% C02, a 37 °C, foram cultivadas células de cancro do cólon humano (HCT116), em cultura de tecidos, em meio RPMI 1640, suplementado com 5% de soro bovino e glutamina. Conforme descrito acima, as minicélulas foram purificadas, foram empacotadas com siARN direcionado contra Plkl ou KSP e foram ligadas a um BsAb que portava antígeno 0 anti-S. typhimurium e especificidades para EGFR anti-humano. Assim, a partir das minicélulasSiARN-Ksp, das minicélulasSiRNA-piki e das minicélulas (controlo) foram geradas EGFRminicélulasSiAsN-ksp, EGFRminicélulasSiARN-piki e EGFRminicélulas. As células HCT116 foram semeadas em placas de 6 poços, e os grupos de controlo e experimental foram transfetados a uma razão de 5.000 minicélulas: 1 célula HCT116. Foi incluído um controlo adicional, consistindo em apenas células.
Após 2 horas de incubação com minicélulas, os poços foram lavados três vezes com PBS fresco. As células foram removidas dos poços 4 horas, 8 horas, 16 horas, 24 horas, 32 horas e 48 horas após a transfeção, e as células foram fixadas com etanol frio a 70% e incubadas a 4 °C durante 30 minutos. As células foram depois lavadas duas vezes em tampão citrato-fosfato (pH 7,8) e foram tratadas com 100 mg/mL de RNAse, para garantir que apenas o ADN fosse manchado. As células foram manchadas com iodeto de propídio (corante de ácidos nucleicos) e foram analisadas com um citómetro de fluxo FACSCalibur™, produto da Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, EUA), na Universidade de Macquarie (Sydney, Austrália) e o software de aquisição e análise CELL Quest, também um produto da Becton Dickinson. A análise das células por FACS mostrou que, a 4 e 8 horas após a transfeção (Figura 5A) , as células tratadas com EGFRminicélulas sírna-kspr ou EGFRminicélulasclRNA plK1 eram caracterizadas por uma paragem robusta no ciclo celular, na fase G2. As células de controlo, quer sejam células apenas ou células tratadas com EGFRminicélulas, não mostraram quaisquer efeitos adversos. Essas células mostraram fases Gl, S e G2 do ciclo celular normais. A 16 e 24 horas, as células experimentais apresentaram não apenas uma paragem robusta em G2, mas também um número elevado de células apoptóticas (Figura 6). A 32 e 48 horas, a maior parte das células nos grupos experimentais era apoptótica e tinham se transformado em restos de células (veja-se, em particular, colchetes na Figura 7).
Esses resultados demonstram que as minicélulas intactas alvo foram empacotadas com uma quantidade terapeuticamente eficaz de ARN regulatório, e que as minicélulas da invenção foram altamente eficientes em atingir knockdown de proteínas em células tumorais, o que resultou em morte celular por apoptose.
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Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composição que compreende: (a) uma pluralidade de minicélulas derivadas de bactéria intactas, em que cada minicélula da pluralidade compreende ARN regulatório que está empacotado na minicélula, e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável para a mesma, em que (i) o ARN regulatório é selecionado a partir do grupo que consiste em ssARN antissentido, ribozima e ARN chamariz, (ii) há uma ausência das minicélulas de um construto para expressão in situ do ARN regulatório, e (iii) a pluralidade compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do ARN regulatório.
  2. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o ARN regulatório não é modificado quimicamente.
  3. 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o ARN regulatório interfere especificamente na expressão de uma proteína que contribui para a resistência a fármacos.
  4. 4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína é P-glicoproteína, MDR-2 ou MDR-3.
  5. 5. Composição, de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína é MRP2, BCR-ABL, proteína associada à resistência a STI-571, proteína relacionada à resistência do pulmão, ciclo-oxigenase-2, fator kappa nuclear, XRCC1, ERCC1, GSTP1, β-tubulina mutante ou um fator de crescimento.
  6. 6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, que compreende adicionalmente um ligante biespecífico.
  7. 7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, em que o ligante biespecífico compreende um primeiro braço, que possui especificidade para uma estrutura na superfície de minicélula, e um segundo braço que possui especificidade para um recetor de superfície de uma célula de mamífero não fagocítica.
  8. 8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, em que o recetor de superfície de uma célula de mamífero tem capacidade para ativar a endocitose mediada por recetor da minicélula.
  9. 9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende menos de cerca de 1 célula bacteriana parental contaminante por IO10 minicélulas.
  10. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende menos de cerca de 1 célula bacteriana parental contaminante por 1011 minicélulas.
  11. 11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o ARN regulatório é ssARN antissentido.
  12. 12. Composição para utilização no tratamento de cancro, em que a composição compreende uma pluralidade de minicélulas derivadas de bactéria intactas num transportador farmaceuticamente aceitável, em que cada minicélula da pluralidade compreende ARN regulatório em que: (a) o ARN regulatório é selecionado a partir do grupo que consiste em ssARN antissentido, ribozima e ARN chamariz; (b) há uma ausência das minicélulas de um construto para expressão in situ do ARN regulatório, e (c) a pluralidade de minicélulas compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do ARN regulatório.
  13. 13. Método para entregar ARN regulatório que compreende as etapas de: (a) fornecer uma pluralidade de minicélulas derivadas de bactéria intactas num transportador farmaceuticamente aceitável, em que cada minicélula da pluralidade compreende ARN regulatório; e (b) colocar as minicélulas da pluralidade em contacto com células de mamífero in vitro de modo que as células de mamífero englobem as minicélulas da pluralidade, de modo que o ARN regulatório seja libertado no citoplasma das células-alvo, em que (i) o ARN regulatório é selecionado a partir do grupo que consiste em ssARN antissentido, ribozima e ARN chamariz, (ii) há uma ausência das minicélulas de um construto para expressão in situ do ARN regulatório, e (iii) a pluralidade compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do ARN regulatório.
  14. 14. Método para formular a composição, conforme definido na reivindicação 1, que compreende coincubar uma pluralidade de minicélulas derivadas de bactéria intactas e o ARN regulatório num tampão.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que o referido ARN regulatório é ssARN antissentido.
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