PT2780027T - Apoaequorina para redução de lesão neuronal devida a isquemia - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "APOAEQUORINA PARA REDUÇÃO DE LESÃO NEURONAL DEVIDA A ISQUEMIA"

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido US N° 61/559816, apresentado em 15 de novembro de 2011.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta divulgação refere-se a composições para reduzir lesão neuronal devida a isquemia. Em particular, esta divulgação é direcionada a apoaequorina e à sua utilização na redução de lesão neuronal devida a isquemia cerebral num indivíduo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

De acordo com a American Heart Association, a cada 40 segundos, alguém nos Estados Unidos sofre de uma apoplexia. Atualmente, existe apenas um tratamento aprovado da Food and Drug Administration para apoplexia, ativador do plasminogénio tecidual recombinante (rTPA). Embora o rTPA ajude muitas pessoas, pode também possuir efeitos secundários deletérios, tal como hemorragia. Durante a isquemia, os neurónios são submetidos a um excesso de cálcio intracelular. Apesar do cálcio intracelular ser necessário para funções neuronais normais, muito cálcio pode despoletar cascatas de acontecimentos, levando a e incluindo morte celular. Vários mecanismos permitem aos neurónios limitar ou controlar níveis de cálcio citosólico, incluindo proteínas de ligação de cálcio (CaBP). Tem sido mostrado que o tratamento com a CaBP calbindina D-28k reduz efeitos deletérios de isquemia. Infelizmente, existe uma falta de alternativas terapêuticas para evitar morte neuronal devido a isquemia e, como consequência, existe a necessidade para novas terapêuticas úteis no tratamento dos efeitos deletérios de isquemia em neurónios. A invenção é definida nas reivindicações.

Aqui, a requerente demonstra a utilização de apoaequorina para proporcionar proteção isquémica a neurónios. Como consequência, a divulgação abrange, num primeiro aspeto, apoaequorina para utilização no pré-condicionamento de neurónios num indivíduo, de um modo preferido, humano, para reduzir lesão neuronal devida a isquemia cerebral. Essa utilização inclui administrar apoaequorina ao indivíduo, em que a apoaequorina inicia uma alteração nos níveis de expressão de citocina nos neurónios que resulta numa redução na lesão neuronal devida a isquemia cerebral. A administração é realizada por injeção na área CAI do hipocampo dorsal, 48 horas antes de ocorrer isquemia cerebral.

Em determinadas formas de realização, a redução no efeito de lesão neuronal dura, pelo menos, 24 horas a partir do momento de administração de apoaequorina. Noutras formas de realização, a redução no efeito de lesão neuronal dura, pelo menos, 48 horas a partir do momento de administração de apoaequorina. É ainda divulgada a utilização de apoaequorina para o fabrico de um medicamento para pré-condicionamento de neurónios num indivíduo, para reduzir lesão neuronal devida a isquemia cerebral. A invenção abrange ainda uma composição para utilização no pré-condicionamento de neurónios num indivíduo para reduzir lesão neuronal devida a isquemia cerebral com as características da reivindicação 7. As composições preferidas são formuladas como dosagens injetáveis. É ainda divulgado um kit para pré-condicionamento de neurónios num indivíduo para reduzir lesão neuronal devida a isquemia cerebral. Esse kit inclui: (a) uma dosagem terapeuticamente eficaz de apoaequorina para pré-condicionar neurónios num indivíduo para reduzir lesão neuronal devida a isquemia cerebral; e (b) um dispositivo de distribuição configurado para administrar a quantidade de apoaequorina ao indivíduo.

Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes após revisão da descrição, reivindicações e desenhos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa um aumento dependente do tempo em ARNm de IL-10 após infusão (A) de apoaequorina como uma percentagem de controlo de veículo. Não foi observada alteração em ARNm de β-actina (B). (Apoaequorina está abreviada como "AQ"). A Figura 2 mostra (A) o efeito dependente de dose de AQ em resgate celular; (B) AQ a 4%, administrada 2 dias antes de isguemia é neuroprotetora (note-se a redução em neurónios marcados com azul de tripano a seguir a AQ) ; (C) a janela de neuroproteção proporcionada por AQ; (D) disponibilidade de AQ após injeção no hipocampo. A Figura 3 representa (A) expressão de ARNm de IL-10; (B) expressão de ARNm de β-actina; e (C) séries de PCR apresentando alterações em múltiplas citocinas e guimiocinas a seguir a administração de AQ. A Figura 4 representa um gráfico gue mostra como as citocinas são significativamente alteradas com injeção de AQ. A Figura 5 representa um esquema que mostra a interação de genes de resposta imunitária examinados pela Requerente. A Figura 6 representa gráficos que mostram (A) alteração em genes de resposta inflamatória aguda a seguir a injeção de AQ; (B) alteração em ativadores de célula T/B a seguir a injeção de AQ; (C) alteração em genes de angiogénese/proliferadores celulares a seguir a injeção de AQ; (D) padrão de alteração em genes que atraem macrófagos a seguir a injeção de AQ; (E) alteração em genes mediadores de cálcio a seguir a injeção de AQ; e (F) genes (agrupados por função) que alteram com injeção de AQ.

DECRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

I. EM GERAL

Antes dos presentes materiais e métodos serem descritos, é entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos, materiais e reagentes particulares descritos, uma vez que estes podem variar. É também para ser entendido que a terminologia aqui utilizada é com o objetivo de descrever apenas formas de realização particulares e não pretende limitar o âmbito da presente invenção, a qual será limitada apenas por quaisquer pedidos não provisórios apresentados posteriormente.

Deve notar-se que como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o" "a" incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Do mesmo modo, as expressões "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser aqui utilizadas indiferentemente. É também de notar que os termos "compreendendo", "incluindo" e "possuindo" podem ser utilizados de modo indiferente. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem os mesmos significados como normalmente entendidos por um especialista comum na técnica ao qual pertence esta invenção. Apesar de quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos poderem ser utilizados na prática ou testando a presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as referências citadas nesta descrição são para serem consideradas como indicativas do nível de especialidade na técnica. Nada aqui é para ser interpretado como uma admissão de que a invenção não está habilitada para antecipar essa divulgação por virtude de invenção anterior.

II. A INVENÇÃO

Como aqui utilizado, "indivíduo" significa mamíferos e não mamíferos. "Mamíferos" significa qualquer elemento da classe Mammalia incluindo, mas não limitado a, humanos, primatas não humanos, tais como chimpanzés e outras espécies de símios e macacos; animais de quinta, tais como gado, cavalos, ovelhas, cabras e suínos; animais domésticos, tais como coelhos, cães e gatos; animais de laboratório incluindo roedores, tais como ratos, murganhos e cobaios; e semelhantes. Exemplos de não mamíferos incluem, mas não são limitados a, pássaros e semelhantes. 0 termo "indivíduo" não indica uma idade ou sexo particular.

Como aqui utilizado, "administrar" ou "administração" inclui quaisquer meios para introduzir apoaequorina no corpo, de um modo preferido, no cérebro do indivíduo, de um modo mais preferido, no hipocampo do indivíduo. Exemplos de administração incluem, mas não são limitados a oral, nasal, ótica, oftálmica, bocal, sublingual, pulmonar, transdérmica, transmucosal, assim como injeção subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, epidural e intramuscular.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de apoaequorina que, quando administrada a um indivíduo para tratar um distúrbio, estado ou doença, é suficiente para realizar esse tratamento para o distúrbio ou estado ou doença. A "quantidade terapeuticamente eficaz" variará dependendo da situação de distúrbio ou estado ou doença a tratar, da gravidade ou do distúrbio ou estado ou doença tratado, da idade e saúde relativa do indivíduo, da via e forma de administração, do parecer do médico assistente ou médico veterinário e outros fatores.

Para o objetivo da presente invenção, "tratar" ou "tratamento" descreve a gestão e cuidado de um doente com a finalidade de combater a doença, estado ou distúrbio. Os termos abrangem tratamentos preventivos, i. e., profiláticos e paliativos. Tratar inclui a administração de apoaequorina para prevenir o início dos sintomas ou complicações, aliviando os sintomas ou complicações ou eliminando a doença, estado ou distúrbio. 0 termo "apoaequorina" refere-se à porção de apoproteína da aequorina de proteína de ligação de cálcio. A aequorina é constituída por duas unidades distintas, a respetiva apoproteína, apoaequorina, com um peso molecular aproximado de 22 kDa e o grupo prostético coelenterazina, uma luciferina. A aequorina é uma fotoproteína isolada de medusa luminescente (tal como, espécie Aequorea, e. g., Aequorea victoria) e de uma variedade de outros organismos marinhos. Foi originalmente isolada a partir de coelenterato por Osamu Shimomura. A apoaequorina útil na presente invenção está disponível a partir da sua fonte natural, via esquemas de isolamento e purificação anteriormente conhecidos ou métodos recombinantes publicamente conhecidos, utilizando sistemas de expressão que utilizam, e. g., construtores de ADN recombinantes e células hospedeiras geneticamente modificadas úteis para expressão heteróloga de apoaequorina.

Como aqui utilizado, o termo "citocina" deve referir-se a moléculas de proteina de célula sinal pequenas que são secretadas pelas células gliais do sistema nervoso e por várias células do sistema imunitário e são uma categoria de moléculas sinal extensivamente utilizadas em comunicação intercelular. As citocinas podem ser classificadas como proteínas, péptidos ou glicoproteínas; como consequência, o termo "citocina" abrange uma grande e diversa família de reguladores produzidos por todo o corpo por células de diversa origem embriológica. 0 termo "citocina" deve abranger agentes imunomoduladores, tais como interleucinas e interferões.

Como aqui utilizado, o termo "pré-condicionamento" refere-se a uma técnica para produzir resistência à perda de fornecimento de sangue e, deste modo, oxigénio, aos tecidos do corpo. No presente caso, pré-condicionamento refere-se a produzir resistência à perda de fornecimento de sangue em neurónios, como medido por, e. g., percentagem de avaliação ou número de células resgatadas a seguir a administração de apoaequorina quando comparado a um controlo. A requerente mostrou que, quando injetada diretamente no hipocampo dorsal (dhpc) , a apoaequorina (AQ) de CaBP 22 kD derivada do coelenterato Aequoria victoria diminui significativamente a morte celular quando submetida a um insulto do tipo isquémico in vitro (Detert et al., 2009; 2011). Esta diminuição em morte celular estava presente às 24 e 48 horas, mas não 1 hora após injeção de AQ. De um modo interessante, a proteína AQ estava presente à 1 hora, com significativamente perda a 24 horas e pelas 48 horas após injeção, mal estava presente. O padrão inverso, entre o efeito da AQ e a sua presença, feito pela requerente, questiona se esta alteração foi ou não devida a uma resposta neuroimunomoduladora. Algumas formas de pré-condicionamento isquémico, tal como insultos isquémicos pequenos, reduzem enfartes que ocorreram antes de insultos globais maiores (Ara et ai., 2010; Jones & Bergeron, 2001). Os efeitos protetores do pré-condicionamento isquémico têm sido associados com a ativação de sistema imunitário (Rehni & Singh, 2012; Wei et ai., 2012). Embora não seja aqui adotado nenhum mecanismo de ação, é possível que se a AQ for citocinas de ativação, a morte celular diminua por um tipo de pré-condicionamento isquémico em que a resposta neuroprotetora observada a partir das injeções de apoaequorina possa ser devida a, em parte, uma resposta neuroimunomoduladora. A apoaequorina é administrada a um doente numa quantidade terapeuticamente eficaz. A apoaequorina pode ser administrada isolada ou como parte de uma composição farmaceuticamente aceitável. Além disso, a apoaequorina ou uma composição podem ser administradas todas de uma vez como, por exemplo, por uma injeção em bólus, várias vezes, tais como por uma série de comprimidos ou distribuídas substancialmente uniformemente ao longo de um período de tempo, como por exemplo, utilizando distribuição transdérmica. Mais, a dose do agente ativo pode ser variada ao longo do tempo. A apoaequorina pode ser administrada utilizando uma formulação de libertação imediata, uma formulação de libertação controlada ou suas combinações. A expressão "libertação controlada" inclui libertação prolongada, libertação atrasada e suas combinações.

Uma composição da invenção pode ser preparada, empacotada ou vendida em volume, como uma dose unitária única ou como uma pluralidade de doses unitárias únicas. Como aqui utilizada, uma "dose unitária" é a quantidade distinta da composição compreendendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo. A quantidade do ingrediente ativo é, de um modo geral, igual à dosagem do ingrediente ativo que seria administrado a um doente ou uma fração conveniente dessa dosagem, tal como, por exemplo, metade ou um terço dessa dosagem.

As quantidades relativas do ingrediente ativo, do transportador farmaceuticamente aceitável e de quaisquer ingredientes adicionais numa composição da invenção irão variar, dependendo da identidade, tamanho e estado do humano tratado e ainda dependendo da via pela qual a composição é para administrar.

Também aqui divulgado é um kit compreendendo uma composição da invenção e material instrutivo. 0 material instrutivo inclui uma publicação, uma gravação, um diagrama ou qualquer outro meio de expressão que é utilizado para comunicar a utilidade da composição da invenção para um dos objetivos aqui apresentados num humano. 0 material instrutivo pode também, por exemplo, descrever uma dose apropriada da composição farmacêutica da invenção. 0 material instrutivo do kit pode, por exemplo, ser afixado a um recipiente que contém uma composição farmacêutica da invenção ou ser enviado em conjunto com um recipiente que contém a composição farmacêutica. Em alternativa, o material instrutivo pode ser enviado separadamente do recipiente com a intenção de que o material instrutivo e a composição farmacêutica sejam utilizados cooperativamente pelo recipiente.

Também aqui divulgado é um kit compreendendo uma composição da invenção e um dispositivo de distribuição para distribuir a composição a um humano. A titulo de exemplo, o dispositivo de distribuição pode ser uma seringa, uma agulha ou recipiente de medição de dosagem. 0 kit pode ainda compreender um material instrutivo como aqui descrito. 0 kit também compreende um recipiente para as composições separadas, tais como uma garrafa dividida ou um pacote de aluminio dividido. Exemplos adicionais de recipientes incluem seringas, caixas, malas e semelhantes. Tipicamente, um kit compreende indicações para a administração dos componentes separados. A forma do kit é particularmente vantajosa quando os componentes separados são, de um modo preferido, administrados em formas de dosagem diferentes (e. g., oral e parentérica), são administrados em diferentes intervalos de dosagem ou quando a titulação dos componentes individuais da combinação é desejada pelo médico que prescreve. A administração parentérica de uma composição farmacêutica inclui qualquer via de administração caracterizada por abertura fisica de um tecido de um humano e administração da composição farmacêutica através da abertura no tecido. A administração parentérica, deste modo, inclui administração de uma composição farmacêutica por injeção da composição, por aplicação da composição através de uma incisão cirúrgica, por aplicação da composição através de uma ferida não cirúrgica que penetra o tecido e semelhantes. Em particular, a administração parentérica inclui injeção subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, intramuscular ou intra-esternal e técnicas de infusão intravenosa, intra-arterial ou dialítica renal. Por exemplo, as composições da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo por injeções cerebrais (via vPAG), injeções intratecais, injeções intraperitoneais ou injeções sanguíneas.

As composições adequadas para injeção parentérica compreendem o ingrediente ativo combinado com um transportador farmaceuticamente aceitável, tais como soluções aquosas ou não aquosas estéreis fisiologicamente aceitáveis, dispersões, suspensões ou emulsões, ou podem compreender pós estéreis para reconstituição em soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos, diluentes, solventes ou veiculos adequados incluem água, soluções salinas isotónicas, etanol, polióis (propilenoglicol, polietilenoglicol, glicerol e semelhantes), suas misturas adequadas, triglicéridos, incluindo óleos vegetais, tal como azeite ou ésteres orgânicos injetáveis, tal como etiloleato. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e/ou pela utilização de tensioativos. Essas formulações podem ser preparadas, empacotadas ou comercializadas numa forma adequada para administração em bólus ou para administração contínua. As formulações injetáveis podem ser preparadas, empacotadas ou vendidas numa forma de dosagem unitária, tal como em ampolas, em recipientes multidose contendo um conservante ou em dispositivos de utilização única para autoinjecção ou injeção por um médico.

As formulações para administração parentérica incluem suspensões, soluções, emulsões em veículos oleosos ou aquosos, pastas e formulações de libertação prolongada implantáveis ou biodegradáveis. Essas formulações podem ainda compreender um ou mais ingredientes adicionais incluindo agentes de suspensão, estabilizantes ou dispersantes. Numa forma de realização de uma formulação para administração parentérica, o ingrediente ativo é proporcionado na forma seca (i. e., pó ou granular) para reconstituição com um veículo adequado (e. g., água sem pirogénio estéril) antes da administração parentérica da composição reconstituída.

As composições podem ser preparadas, empacotadas ou vendidas na forma de uma suspensão ou solução aquosa ou oleosa (emulsão) injetável estéril. Esta suspensão ou solução pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida e pode compreender, além do ingrediente ativo, ingredientes adicionais, tais como os agentes dispersantes, agentes molhantes ou agentes de suspensão aqui descritos. Essas formulações injetáveis estéreis podem ser preparadas utilizando um diluente ou solvente parentericamente aceitável não tóxico, tal como água ou 1,3-butanodiol, por exemplo. Outros diluentes e solventes aceitáveis incluem solução de Ringer, solução de cloreto de sódio isotónica e óleos fixos, tais como mono ou diglicéridos sintéticos. Outras formulações parentericamente administráveis que são úteis incluem as que compreendem o ingrediente ativo em forma microcristalina, numa preparação lipossomal ou como um componente de sistemas de polímeros biodegradáveis. As composições para libertação prolongada ou implantação podem compreender materiais poliméricos ou hidrofóbicos farmaceuticamente aceitáveis, tais como uma emulsão, uma resina de troca iónica, um polímero moderadamente solúvel ou um sal moderadamente solúvel.

As composições da invenção podem também conter adjuvantes, tais como agentes conservantes, molhantes, emulsionantes e/ou dispersantes, incluindo, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico e semelhantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio e semelhantes. A absorção prolongada de composições farmacêuticas injetáveis pode ser provocada pela utilização de agentes suscetíveis de absorção demorada, por exemplo, monoestearato de alumínio e/ou gelatina. Em particular, podem ser utilizados lipossomas, miossomas e emulsionantes para tornar os presentes compostos mais solúveis para distribuição.

As formas de dosagem podem incluir sólidos ou implantes injetáveis ou depósitos. Em formas de realização preferidas, o implante compreende uma quantidade eficaz de um agente ativo e um polimero biodegradável. Em formas de realização preferidas, um polimero biodegradável adequado pode ser selecionado do grupo consistindo num poliaspartato, poliglutamato, poli(L-lactido) , um poli(D,L-lactido), um poli(lactido-co-glicólido), um poli (ε-caprolactona), um polianidrido, um poli(beta-hidroxibutirato), um poli (ortoéster) e um polifosfazeno. Noutras formas de realização, o implante compreende uma quantidade eficaz de agente ativo e um polimero silástico. 0 implante proporciona a libertação de uma quantidade eficaz de

As soluções liquidas do ingrediente ativo em solventes aquosos ou oleosos podem ser preparadas substancialmente do mesmo modo que as suspensões liquidas, sendo a principal diferença a de o ingrediente ativo ser dissolvido em vez de suspenso no solvente. As soluções liquidas da composição da invenção podem compreender cada dos componentes descritos com vista às suspensões liquidas, sendo entendido que os agentes de suspensão não ajudarão necessariamente a dissolução do ingrediente ativo no solvente. Os solventes aquosos incluem, por exemplo, água e solução salina isotónica. Os solventes oleosos incluem, por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico, óleos vegetais, tais como óleo de amendoim, azeite, sésamo ou coco, óleos vegetais fracionados e óleos minerais, tal como parafina líquida.

As composições da presente invenção podem ainda incluir um componente de ciclodextrina de modo a, e. g., melhorar a solubilidade em água de um ingrediente farmacêutico ativo, prolongar a libertação de fármaco e melhorar as caracteristicas do comprimido. Em geral, oligómeros de estrutura ciclica de glicose ("ciclodextrina") são obtidos a partir da digestão de amido de determinadas bactérias. As ciclodextrinas mais abundantes são ciclodextrina alfa, beta e gama que possuem 6,7 e 8 unidades de glicose, respetivamente. A cavidade interior de uma ciclodextrina é hidrofóbica e a superfície exposta da molécula é hidrofílica. As ciclodextrinas são conhecidas por intensificarem a estabilidade de ingrediente farmacêutico ativo, solubilidade aquosa e volatilidade reduzida. Alguns exemplos de ciclodextrina comercialmente disponível ou seus derivados são os seguintes: alfa-Ciclodextrina (CAS N°: 10016-20-3); (2-Hidroxipropil)-alfa-ciclodextrina (CAS N°: 128446-33-3); beta-Ciclodextrina (CAS N°: 7585-39-9); 6-O-alfa-D-Glucosil-beta-ciclodextrina (CAS N°: 92517-02-7); gama-Ciclodextrina (CAS N°: 17465-86-0); e (2-Hidroxipropil)-gama-ciclodextrina (CAS N°: 128446-34-4). As ciclodextrinas particularmente úteis na formulação de um veículo de distribuição para administrar os presentes agentes ativos incluem: a sulfobutiléter beta-ciclodextrina (SBE-beta-CD) disponível de Cydex Pharmaceuticals, Inc. com a marca CAPTISOL; e a ciclodextrina e hidroxipropilbetaciclodextrinas disponíveis de Roquette Pharma com a marca KLEPTOSE.

Para administração parentérica em animais não humanos, a apoaequorina pode ser preparada na forma de uma pasta ou um granulado e administrada como um implante. As formulações em pasta podem ser preparadas dispersando apoaequorina em óleo farmaceuticamente aceitável, tais como óleo de amendoim, óleo de sésamo, óleo de milho ou semelhantes. Os granulados contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz podem ser preparados misturando com um diluente, tais como uma carbowax, cera de carnaúba e semelhantes, e pode ser adicionado um lubrificante, tais como estearato de cálcio ou magnésio, para melhorar o processo de granulação. De facto, é reconhecido que mais do que um granulado pode ser administrado a um animal para conseguir o nivel de dose desejado. Além disso, verificou-se que esses implantes podem também ser administrados periodicamente durante o periodo de tratamento animal de modo a manter o nivel de agente ativo apropriado no corpo do animal.

As composições da presente invenção podem ser administradas a um doente em niveis de dosagem na gama de desde cerca de 0,01 a cerca de 100 mg/kg por dia. Para um humano adulto normal, uma dosagem na gama de desde cerca de 0,01 a cerca de 100 mg/kg é tipicamente suficiente, com uma dosagem preferida de 0,1 a 10 mg/kg por dia. No entanto, pode ser necessária alguma variabilidade na gama de dosagem geral dependendo da idade e peso do indivíduo a tratar, da via pretendida de administração, do composto particular a administrar e semelhantes. A determinação de gamas de dosagem e dosagens ótimas para um doente particular está bem dentro da capacidade de um especialista na técnica possuindo o beneficio da presente divulgação. É também notado que os compostos da presente invenção podem ser utilizados em formulações de libertação prolongada, libertação controlada e libertação retardada, cujas formas são também bem conhecidas de um especialista na técnica. A dosagem e gama de dosagem especifica que pode ser utilizada depende de um número de fatores, incluindo os requisitos do doente, a gravidade do estado a tratar e a atividade farmacológica do ingrediente ativo a administrar. A determinação de gamas de dosagem e dosagens ótimas para um doente particular está bem dentro do conhecimento comum de um especialista na técnica considerando esta divulgação. É entendido que o comum especialista médico, dentista ou veterinário determinarão e prescreverão facilmente uma quantidade da composição para provocar o tratamento desejado no indivíduo. Ao proceder assim, o médico ou veterinário pode, por exemplo, prescrever uma dose relativamente baixa em primeiro lugar, aumentando, subsequentemente, a dose até ser obtida uma resposta apropriada. É ainda entendido, no entanto, que o nivel de dose especifico para qualquer humano particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade da composição especifica empregue, da idade, peso corporal, saúde geral, género e dieta do humano, do tempo de administração, da via administração, da taxa de excreção, de qualquer combinação de fármaco e da gravidade de qualquer distúrbio a tratar.

Em determinadas formas de realização, a apoaequorina é formulada na forma de uma dosagem injetável farmacêutica, incluindo combinação de apoaequorina com um sistema de transportador injetável. Como aqui utilizado, formas de dosagem injetáveis e de infusão (i. e., formas de dosagem parentérica) incluem, mas não estão limitadas a, injetáveis lipossomais ou uma vesicula de bicamada lipidica possuindo fosfolipidos que encapsulam uma substância de fármaco ativo. A injeção inclui uma preparação estéril pretendida para utilização parentérica.

Existem cinco classes distintas de injeções como definidas pela USP: emulsões, lipidos, pós, soluções e suspensões. A injeção de emulsão inclui uma emulsão compreendendo uma preparação sem pirogénio, estéril pretendida para ser administrada parentericamente. 0 complexo de lipido e pó para injeção de solução são preparações estéreis pretendidas para reconstituição para formar uma solução para utilização parentérica. Pó para injeção de suspensão é uma preparação estéril pretendida para reconstituição para formar uma suspensão para utilização parentérica. Pó liofilizado para injeção de suspensão lipossomal é uma preparação liofilizada estéril pretendida para reconstituição para utilização parentérica que é formulada de um modo que permite a incorporação de lipossomas, tal como uma vesicula de bicamada lipídica possuindo fosfolipidos utilizados para encapsular uma substância de fármaco ativo dentro de uma bicamada lipídica ou num espaço aquoso, pelo que a formulação pode ser formada mediante reconstituição. 0 pó liofilizado para injeção de solução é uma forma de dosagem pretendida para a solução preparada por liofilização ("secagem por frio"), pelo que o processo envolve remover água dos produtos num estado congelado a pressões extremamente baixas e pelo que a subsequente adição de líquido cria uma solução que conforma em todos os aspetos aos requisitos para injeções. Pó liofilizado para injeção de suspensão é uma preparação líquida pretendida para utilização parentérica que contém sólidos suspensos num meio fluido adequado e está de acordo com todos os requisitos para Suspensões Estéreis, pelo que os agentes medicinais pretendidos para a suspensão são preparados por liofilização. A injeção de solução envolve uma preparação líquida contendo uma ou mais substâncias de fármaco dissolvidas num solvente adequado ou mistura de solventes mutuamente miscíveis que é adequada para injeção. A injeção de concentrado de solução envolve uma preparação estéril para utilização parentérica que, mediante adição de solventes adequados, produz uma solução de acordo com todos os aspetos para os requisitos para injeções. A injeção de suspensão envolve uma preparação líquida (adequada para injeção) contendo partículas sólidas dispersas por toda uma fase líquida, pelo que as partículas são insolúveis e pelo que uma fase oleosa está dispersa por toda uma fase aquosa ou vice-versa. A injeção lipossomal de suspensão é uma preparação líquida (adequada para injeção) possuindo uma fase oleosa dispersa por toda uma fase aquosa de modo que são formados lipossomas (uma vesícula de bicamada lipídica normalmente contendo fosfolípidos utilizados para encapsular uma substância de fármaco ativo dentro de uma bicamada lipídica ou num espaço aquoso). A injeção sonicada de suspensão é uma preparação líquida (adequada para injeção) contendo partículas sólidas dispersas por toda uma fase líquida, pelo que as partículas são insolúveis. Além disso, o produto pode ser sonicado como um gás é borbulhado através da suspensão resultando na formação de microsferas pelas partículas sólidas. 0 sistema de transportador parentérico inclui um ou mais excipientes farmaceuticamente adequados, tais como solventes e co-solventes, agentes solubilizantes, agentes molhantes, agentes de suspensão, agentes de espessamento, agentes emulsionantes, agentes quelantes, tampões, ajustadores de pH, antioxidantes, agentes de redução, conservantes antimicrobianos, agentes de carga, protetores, ajustadores de tonicidade e aditivos especiais. Várias formas de realização exemplificativas de composições de acordo com esta invenção e métodos aqui divulgados, são agora descritos nos seguintes exemplos. Os seguintes exemplos são oferecidos para fins ilustrativos apenas e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção de qualquer modo. De facto, várias modificações da invenção, além das aqui mostradas e descritas serão evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição anterior e dos seguintes exemplos e estão dentro do âmbito das reivindicações anexas.

III. EXEMPLOS

Exemplo 1: Periodo e eficácia de apoaequorlna na alteração de níveis de expressão de IL-10.

Neste exemplo, a requerente demonstra a eficácia de apoaequorina aumentando a expressão de ARNm da citocina anti-inflamatória IL-10. 0 pré-condicionamento é um fenómeno em que um breve episódio isquémico não letal atenua o dano causado por um subsequente insulto isquémico mais grave. 0 pré-condicionamento reduz a expressão de mediadores inflamatórios (e. g., IL-Ιβ e IL-6;) comparados aos observados na resposta a lesão cerebral. IL-10 é uma citocina anti-inflamatória e tem mostrado ser aumentada a seguir à administração de um bloqueador de canal Ca2+. 0 pré-condicionamento aumenta a produção de IL-10 e IL-10 está associada com neuroproteção. Um modo que pode ser neuroprotetor é reduzindo indiretamente IL-6 através da redução de produção de TNF-a.

MATERIAIS E MÉTODOS

Animais. Utilizaram-se 50 ratos adultos F344 machos (idade média = 3,4 ± 0,2 meses) . Os ratos foram mantidos num ciclo dia/noite 14/10 h acesso livre a comida e água.

Cirurgia. Os ratos foram anestesiados e montados num aparelho estereotáxico. Sob condições asséticas, o escalpe foi incisado e retraído para o lado e a cabeça foi nivelada entre bregma e lambda. Cada rato foi preparado com cânulas guia de aço inoxidável bilaterais voltadas para o hipocampo dorsal (dhpc) utilizando coordenadas estereotáxicas (3,5 mm posterior, ±2,6 mm lateral, 3,0 mm ventral) em relação ao bregma. As cânulas foram fixadas ao crânio com parafusos de aço inoxidável e epóxi. Uma tampa de aço inoxidável permaneceu no lugar quando os ratos não foram injetados para evitar as cânulas guia de ficarem oclusas. Fármacos. Preparou-se apoaequorina (AQ; 0, 0,4, 1, e 4%, Quincy Bioscience) em zero Ca2+-aCSF (fluido espinal cerebral artificial) com DMSO a 6% adicionado para facilitar a captação neuronal. Os ratos receberam uma infusão de AQ num hemisfério e veículo no outro hemisfério 1 h, 1 dia, 2 dias, 3 dias ou 5 dias antes da decapitação. As infusões bilaterais (0,5 pL/lado) foram dadas durante 60 s e as cânulas de injeção permaneceram no lugar durante 2 min adicionais para garantir difusão. As cânulas de injeção foram cortadas para alongar 0,5 mmm além das cânulas guia.

Privação de Oxigénio-Glicose. Prepararam-se cortes coronais (400 pm) utilizando procedimentos padrão. A seguir a 1 hora de recuperação de cortes num aCSF, induziu-se isquemia in vitro transferindo cortes para frutose-CSF (glicose substituída com frutose e borbulhada com 95% de N2 - 5% de CO2 em vez de 95% de O2 - 5% de CO2) durante 5 min. Os cortes foram então retornados a aCSF oxigenado contendo azul de tripano a 0,2% para reperfusão de 30 min. O azul de tripano penetra facilmente células mortas e cora-as de azul, enquanto deixa as células vivas limpas. Os cortes foram mergulhados em aCSF oxigenado, à temperatura ambiente, duas vezes, em seguida fixos em formalina tamponada neutral a 10%, de um dia para o outro no frigorífico. Os cortes foram então crioprotegidas, cortadas num criostato (40 ym) e montadas em lamelas substituídas.

Contagens celulares. Os cortes foram examinados sob um microscópio Olympus (equipado com uma câmara digital) a 10X e foram captadas fotografias. Os neurónios corados com azul de tripano dentro de CAI (aproximadamente uma secção de 800 ym) foram contados por um experimentador cego às condições experimentais. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Statview (v 5.0; SAS Institute, Inc., Cary, NC) . Utilizou-se uma ANOVA para avaliar um efeito de fármaco. O asterisco indica p < ,05.

Transferências de Western. Os ratos receberam uma injeção bilateral de 4% de AQ e os cérebros foram removidos num dos seguintes momentos: 1 hora, 1 dia, 2 dias ou 3 dias. Os cérebros foram rapidamente congelados e armazenados a -80 °C. O dhpc e hipocampo ventral (vhpc) foram removidos por dissecção e homogeneizados separadamente. As amostras foram centrifugadas e o sobrenadante removido e medido utilizando um kit de ensaio de proteína Bradford (Bio-Rad). As amostras de proteína foram normalizadas e carregadas para SDS-PAGE (10%) . As proteínas foram transferidas sobre membranas PVDF utilizando um aparelho de transferência semi-seco (Bio-Rad). As membranas foram, em seguida, incubadas em tampão de bloqueio (2 horas), anticorpo primário (de um dia para o outro a 4 °C; 1:5000 anti-aequorina de rato [Chemicon] ou 1:1000 anti^-actina de coelho [Cell Signaling Technology]) e anticorpo secundário (90 min; anti-rato de cabra 1:5000 [Santa Cruz Biotechnology] ou anti-coelho de cabra 1:5000 [Millipore] ) . As membranas foram, em seguida, lavadas, colocadas numa solução quimiluminescente (Santa Cruz Biotechnology) e expostas a uma película autorradiográfica (Hyperfilm MP) . As imagens foram captadas e a densitometria realizada utilizando Software NIH Image J. Uma banda era considerada positiva se o valor de densidade ótica da banda (menos o ruido para cada linha) fosse superior a 2 desvios padrão acima da média das bandas de vhpc. PCR. Para RT-PCR, os ratos receberam uma infusão de AQ a 4% num hemisfério e veiculo no outro hemisfério. Uma hora, 1 dia ou 2 dias pós infusão, os hipocampos foram removidos e imediatamente colocados em Trizol. 0 tecido foi homogeneizado utilizando uma agulha de calibre 25 e seringa e as amostras foram congeladas e armazenadas a -80°C até isolamento de ARN. 0 ARN foi isolado utilizando o protocolo de mini kit Qiagen RNeasy. 0 ARN isolado foi dissolvido em 50 yL de ARNase sem H20. A pureza de ARN foi calculada com base na razão de absorvância de 260 e 280 nm e uma leitura de absorvância entre 1,8 e 2,1 foi considerada ARN puro. A transcrição reversa foi conduzida para produzir ADNc utilizando o Kit HT First Stand Qiagen RT2. Os iniciadores de IL-10 e β-actina foram comprados à Qiagen e utilizados de acordo com o Ensaio Primer qPCR Qiagen RT2. A amplificação de ADNc foi medida por fluorescência de SYBR verde (corante de ADN não especifico). As amostras foram corridas em triplicado em placas de 96 poços utilizando o sistema e software de PCR StepOne Real Time. A expressão génica da proteína β-actina normalizado serviu como linha de base de quantificação para expressão de citocina. As alterações de expressão génica foram analisadas utilizando o método Pfaffl. A eficácia do iniciador foi calculada com base em duas amostras aleatoriamente selecionadas para cada de β-actina e IL-10.

Sumário

Como mostrado na Figura 1, as citocinas anti-inflamatórias aumentaram a seguir a infusão de apoaequorina. Em particular, o ARNm de IL-10 foi elevado tão cedo quanto 1 hora pós infusão. Não foi detetada alteração na expressão de β-actina entre grupos. Em face das relações bem conhecidas entre o nivel aumentado de citocinas anti-inflamatórias e a redução de inflamação, pode ser concluído que a apoaequorina é um agente útil para reduzir inflamação num sistema de modelo animal medicamente relevante, um que é relevante e imediatamente aplicável à configuração humana.

Exemplo 2: Apoaequorina protege neurónios de isquemia e altera niveis de ARNm de citocina em hipocampo de rato.

Com referência à Fig. 2A, a requerente demonstrou que uma injeção intra-hipocampal de apoaequorina (AQ, o componente CaBP de aequorina) protege significativamente neurónios hipocampais de morte celular isquémica. Os efeitos neuroprotetores de AQ foram primeiro observados às 24 horas e suportados até às 48 horas (Fig. 2B and 2C). De um modo interessante, a análise de transferência de western sugeriu que os níveis de proteína AQ diminuem dramaticamente ao longo deste período de tempo (Fig. 2D) . Embora os efeitos neuroprotetores de AQ fossem mais fortes às 48 horas, o nível relativamente baixo de proteína AQ presente nesse momento sugere que outros fatores podem desempenhar um papel na capacidade de AQ para proteger neurónios de morte celular isquémica.

Uma possibilidade é que a administração de AQ conduz a uma alteração de niveis de citocinas anti-inflamatórias. A Interleucina-10 (IL-10), uma citocina anti-inflamatória, demonstrou previamente a capacidade para proteger neurónios de hipoxia in vitro. Para testar a hipótese de que a expressão de citocina pode desempenhar um papel nos efeitos neuroprotetores de AQ, mediram-se os niveis de ARNm de citocina em diferentes momentos a seguir a uma administração intra-hipocampal, única de AQ. Doze ratos macho F344 foram bilateralmente canulados no hipocampo dorsal. A seguir a recuperação, injetaram-se 4% de AQ unilateralmente (veículo no outro lado, contrabalançado) e após 1, 24 ou 48 h, os cérebros foram removidos e os hipocampos dissecados, colocados em gelo seco e homogeneizados. 0 ARN foi isolado utilizando mini kit RNeasy da Qiagen. A transcrição reversa foi realizada utilizando Kit-96 RT2 HT First Strand da Qiagen e utilizou-se qPCR para quantificar IL-10 e β-actina. Como mostrado na Fig. 3A, a IL-10 estava significativamente aumentada nos hemisférios tratados com AQ a 1 hora (t (14) = 5,30, p < ,05), mas não 24 ou 48 horas (p > ,05) pós injeção. O tratamento de AQ não afetou os níveis de ARNm de β-actina (Fig. 3B).

Foram realizadas análises de série de PCR adicionais com RT2 Profiler Arrays da Qiagen para citocinas e quimiocinas num esforço para avaliar se outras citocinas e quimiocinas estão ativadas nestes momentos (Fig. 3C) . Os resultados ilustrativos são representados na Fig. 4 e sugerem que múltiplos niveis de ARNm de citocina e quimiocina anti-inflamatórios alteram num modo dependente de tempo a seguir à administração de AQ. A Fig. 5 representa um esquema que mostra a interligação dos genes de resposta imunitária examinados pela requerente. Como consequência, a requerente analisou os genes testados pela função e a Figura 6 representa gráficos que mostram (A) alteração nos genes de resposta inflamatória aguda a seguir a injeção de AQ; (B) alteração em ativadores de células T/B a seguir a injeção de AQ; (C) alteração em genes de angiogénese/proliferadores de células a seguir a injeção de AQ; (D) padrão de alteração em genes de atração de macrófagos a seguir a injeção de AQ; (E) alteração em genes mediadores de cálcio a seguir a injeção de AQ; e (F) genes agrupados por alteração de função com injeção de AQ. A tabela 1 apresenta estes dados em forma tabular. Coletivamente, estes resultados sugerem que AQ é neuroprotetora e que esta neuroproteção envolve um mecanismo neuroimunomodulador.

Sumário

Os dados apresentados neste exemplo demonstram que os efeitos neuroprotetores de apoaequorina são dependentes do tempo. Uma injeção de AQ na área CAI do hipocampo dorsal diminui significativamente a morte celular quando administrada 24 e 48, mas não 1 hora antes do insulto isquémico. De modo interessante, a AQ mostra uma relação inversa entre disponibilidade e eficácia.

Os presentes dados demonstram ainda que os efeitos neuroprotetores de apoaequorina podem envolver um mecanismo neuroimunomodulador. A ativação de IL-10 pós injeção sugere que o Sistema imunitário desempenha um papel no seu efeito protetor. A ativação dependente do tempo de outras citocinas e quimiocinas suporta esta hipótese.

Outras formas de realização e utilizações da invenção serão evidentes para os especialistas na técnica considerando a descrição e prática da invenção aqui divulgada. Todas as referências aqui citadas por qualquer razão, incluindo todas as citações de jornais e patentes e pedidos de patente US/estrangeiros são especificamente e totalmente incorporadas aqui por referência. É entendido que a invenção não está confinada aos reagentes, formulações, condições reacionais, etc., específicos aqui ilustrados e descritos, mas abrange essas suas formas modificadas como estando dentro do âmbito das reivindicações seguintes.

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Lisboa, 22 de setembro de 2017

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Apoaequorina para utilização no pré-condicionamento de neurónios para reduzir lesão neuronal devida a isquemia cerebral num indivíduo, administrando a apoaequorina ao indivíduo através de injeção numa área CAI do hipocampo dorsal 48 horas antes de ocorrer a isquemia cerebral.
2. 2. Apoaequorina para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a apoaequorina é administrada através de injeção.
3. 3. Apoaequorina para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a injeção é uma injeção intra-hipocampal.
4. 4. Apoaequorina para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduo é humano.
5. 5. Apoaequorina para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a redução na lesão neuronal dura, pelo menos, 48 horas a partir do momento de administração de apoaequorina.
6. 6. Composição para utilização no pré-condicionamento de neurónios num indivíduo para reduzir lesão neuronal devida a isquemia cerebral, administrando a composição ao indivíduo por injeção numa área CAI do hipocampo dorsal 48 horas antes de ocorrer a isquemia cerebral, compreendendo: (a) uma dosagem terapeuticamente eficaz de apoaequorina para precondicionar neurónios num indivíduo para reduzir lesão neuronal devida a isquemia cerebral; e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a composição é formulada como uma dosagem injetável. Lisboa, 22 de setembro de 2017