PT2211901E

PT2211901E - Vacinação com clades múltiplos do vírus h5 da gripe a

Info

Publication number: PT2211901E
Application number: PT88543384T
Authority: PT
Inventors: Audino Podda; Rino Rappuoli
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2007-11-26
Filing date: 2008-11-25
Publication date: 2013-07-10
Also published as: JP2014159454A; HK1146577A1; DK2211901T3; KR20160079140A; ES2417495T5; EP2614835A1; AU2014203436B2; CN101969995A; SI2211901T1; KR20100108527A; HRP20130634T1; AU2008331238B2; PL2614835T3; US20110189230A1; PL2211901T5; CY1114762T1; ES2755895T3; JP2016155867A; GB0810305D0; ES2417495T3

Description

DESCRIÇÃO

VACINAÇÃO COM CLADES MÚLTIPLOS DO VÍRUS H5 DA GRIPE A

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção está no campo das vacinas para proteger contra a infecção pelo virus da gripe, e em particular para a proteção contra as pandemias de gripe.

ESTADO DA TÉCNICA

As estirpes do virus da gripe para uso em vacinas mudam de estação para estação. Durante vários anos, as vacinas têm normalmente incluído duas estirpes de gripe A (H1N1 e H3N2) e uma estirpe de gripe B. Para lidar com a "deriva antigénica", as estirpes exatas usadas para a vacinação mudam de ano para ano.

Mais preocupante que a deriva antigénica é a "mudança antigénica", em que o subtipo de vírus da gripe A prevalecente muda do H1N1 e H3N2. Em particular, espera-se que o subtipo H5 do vírus da gripe A possa tornar-se predominante num futuro próximo. Como a população humana é imunologicamente débil para o novo subtipo de hemaglutinina, então esta mudança antigénica poderá causar um surto de pandemia de gripe. As características de uma estirpe da gripe que lhe dão o potencial para causar uma pandemia são as seguintes: (a) conter uma nova hemaglutinina em comparação com as hemaglutininas atualmente em circulação nas estirpes humanas, isto é, aquele que não tem sido evidente na população humana por mais de uma década, ou não tenha sido visto em toda a população humana; (b) ser capaz de ser transmitido horizontalmente na população humana; e (c), ser patogénico para o ser humano. 1

Na preparação para uma pandemia de gripe provocada por uma estirpe H5, tem sido proposta a utilização de uma estratégia de vacinação pré-pandemia [1]. Os pacientes são imunizados com a estirpe H5 atual (de aves) na esperança de que a imunidade resultante seja útil quando ocorrer a pandemia, apesar de qualquer deriva antigénica poder ocorrer no mesmo periodo.

Em Outubro de 2006, a Sanofi Pasteur anunciou os resultados da sua vacina pré-pandémica candidata, que foi testada em formas adjuvante e não-adjuvante em várias doses de antigeno. Em Novembro de 2006 a Novartis Vaccines anunciou que foi apresentado para aprovação um regulamento Europeu para uma vacina adjuvante contra a pré-pandemia. Em Junho de 2007 a GlaxoSmithKline anunciou sua intenção de doar 50 milhões de doses da vacina com adjuvante contra a pré-pandemia de H5N1 para a OMS e em Fevereiro de 2008 o seu produto PREPANDRIX™ recebeu um parecer positivo do Comité da EMEA para Produtos Medicinais para Uso Humano. Todos os três produtos foram baseados na estirpe H5Nl/A/Vietnam/1194/04.

Vaccine, vol. 21, 2003, 1687-1693 revela a administração de uma vacina baseada em H5N3 para aumentar a imunidade ao virus H5N1.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO O virus H5N1 isolado de animais e seres humanos desde 2003 separado em vários clades distintos (grupos genéticos) de virus estreitamente relacionados com base em sequências de aminoácidos de hemaglutinina. A estirpe H5Nl/A/Vietnam/1194/04 é classificada em cledo 1. 2

De acordo com a invenção, tal como definido nas reivindicações, são utilizados múltiplos clades na imunização contra a gripe.

Num primeiro aspecto da invenção (ver reivindicação 1), é utilizado um esquema de imunização de primeiro reforço quando um sujeito recebe uma dose de preparação de um primeiro clade do virus da gripe A H5 e uma dose de reforço de um segundo clade do virus da gripe A H5. Por exemplo, um paciente pode iniciar com o antigénio do clade I e reforçar com o clade 2, ou vice-versa.

Do mesmo modo (ver reivindicação 2), uma imunização de reforço pode ser administrada a um paciente que já tenha recebido uma vacina H5 a partir de um primeiro clade (por exemplo o clade 1) através de uma vacina H5 a partir de um clade diferente (por exemplo, clade 2) . 0 paciente geralmente recebe uma sequência primária completa (por exemplo, duas doses) do primeiro clade da vacina.

Num segundo aspecto, uma composição imunogénica pode compreender antigénios de hemaglutinina de vários clades do virus da gripe A H5, permitindo a imunização simultânea contra múltiplos clades de H5.

Clades de H5

Os antigénios de hemaglutinina dos virus usados com a invenção caem no subtipo H5, mas dentro do subtipo H5 caem em diferentes clades.

As sequências de hemaglutinina (HA) da maioria dos virus H5N1 que circulam em espécies de aves desde 2003 estão 3 separadas em clades filogenéticos distintos. 0 virus do clade I que circula no Camboja, Tailândia e Vietnam foi responsável por infecções em humanos nesses paises em 2004 e 2005, e na Tailândia em 2006. 0 virus do clade II tem circulado em aves na China e na Indonésia desde 2003; e espalhou-se para oeste ao longo de 2005 e 2006 para o Médio Oriente, Europa e África. Desde o final de 2005, o virus do clade 2 tem sido o principal responsável pela infecção humana. Têm sido distinguidos vários subclades do clade 2: três deles - subclades 1, 2 e 3 (Fig. 1) - diferem na distribuição geográfica e até agora têm sido em grande parte responsável pelos casos em seres humanos.

Entre Agosto de 2006 e Março de 2007, a maioria das sequências de HA do virus H5N1 que continuaram a circular ou ressurgiram em espécies de aves e têm sido associadas com infecções humanas esporádicas na África, Ásia e Europa, pertencem aos anteriormente designados clades filogenéticos e subclades. O virus do clade I foi responsável por surtos em aves na Tailândia e no Vietnam e em infecções humanas na Tailândia. O virus do clade 2.1 continua a circular em aves de capoeira e a causar infecções humanas na Indonésia. O virus do clade 2.2 causou surtos em aves em alguns paises da África, Ásia e Europa, e tem sido associado com infecções em seres humanos no Egito, Iraque e Nigéria. O virus do clade 2.3 foi isolado esporadicamente na Ásia e tem sido responsáveis por infecções humanas na China e na República Democrática Popular do Laos.

Além disso, alguns virus que estão fora destas classificações foram isolados em aves domésticas durante surtos localizados na Ásia. Estes dividem-se em clades emergentes, representados por A/goose/Guiyang/337/2006 4 (clade 4) e A/chicken/Shanxi/2/2006 (clade 7). No total, têm sido atualmente definidos 10 clades (Figura 2), numerados de 0 a 9.

Para referência, estirpes prototípicas para cada clade são como se segue, juntamente com a sequência de codificação dos genes de hemaglutinina:

Clade Estirpe SEQ ID N° 1 A/HongKong/213/03 1 2 A/Indonesia/5/05 2 3 A/Chicken/Hong Kong/SF219/01 3 4 A/Chicken/Guiyang/441/2 0 0 6 4 5 A/Duck/Guangxi/1681/2004 5 6 A/Tree sparrow/Henan/4/2004 6 7 A/Chicken/Shanxi/2/2006 7 8 A/Chicken/Henan/12/2004 8 9 A/Duck/Guangxi/2775/2005 9 0 A/Hong Kong/156/97 10

Um vírus H5 do clade 1 pode ser aqui definido em termos filogenéticos como um vírus da gripe A tendo uma sequência que codifica a hemaglutinina que está mais estreitamente relacionada com a sequência de codificação a partir da estirpe A/HongKong/213/03 (SEQ ID N° : 1) que com qualquer sequência de codificação de qualquer um dos clades 0 e 2 a 9 (SEQ ID N°s: 2-10), quando avaliado usando o algoritmo DNADIST como implementado no pacote Phylip [2] (por exemplo, usando dois parâmetros de distância Kimura e uma 5 matriz quadrada). Da mesma forma, um vírus do clade 2 tem uma sequência de codificação da hemaqlutinina que está mais estreitamente relacionada com a sequência de codificação a partir da estirpe A/Indonesia/5/05 (SEQ ID N°: 2) do que com qualquer sequência de codificação de qualquer um dos clades 0, 1 e 3 a 9 (SEQ ID N°s: 1 e 3 a 10) . Os outros clades são definidos filoqeneticamente da mesma forma - com uma sequência de codificação da hemaqlutinina que está mais estreitamente relacionada com a sequência de codificação relevante a partir das SEQ ID N°s: 1 a 10 do que com as outras sequências em SEQ ID N°s: 1 a 10.

Um vírus do clade 1 pode ser aqui definido em termos de sequência de ácidos nucleicos como um vírus da qripe A que tem uma sequência de codificação da hemaglutinina com uma maior identidade de sequência com a estirpe A/HongKong/213/03 (SEQ ID N°: 1) do que qualquer uma das SEQ ID N°s: 2 e 10. Os outros clades são definidos da mesma forma - com uma sequência de codificação da hemaglutinina que está mais estreitamente relacionada com a sequência de codificação relevante a partir das SEQ ID N°s: 1 a 10 do que para as outras sequências em SEQ ID N°s: 1 a 10 .

Um vírus H5 pode ser aqui definido como sendo um clade particular, em termos de sequência de aminoácidos, por referência a mutações de HA características [3] . Por exemplo, um vírus do clade 3 pode ter um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos, que são distintos dos clades 1 e 2: Asn-45; Ser-84; Asn-94; Asn-124; Leu-138;

Ser-144; Glu-212; Ser-223; e/ou Arg-325. Um vírus do clade pode ter Asp-124, que não é visto nos clades 1 e 3. Um vírus do clade 1 pode ter um ou mais dos seguintes residuos 6 de aminoácidos, que são distintos dos clades 2 e 3: Ser-124; Leu-129.

No clade 2, foram reconhecidas pelo menos três subclasses: 2.1, 2.2 e 2.3 (Figura 1) . Um virus do clade H5 2.1 pode ser aqui definido em termos filogenéticos como tendo uma sequência de codificação da hemaglutinina que está mais estreitamente relacionada com a estirpe A/Indonesia/5/05 (SEQ ID NO: 2) do que para tanto com a estirpe A/Anhui/1/2005 (SEQ ID N°: 11) ou a A/turkey/Turkey/1/05 (SEQ ID N°: 12). Da mesma forma, um virus do clade H5 2.2 pode ser aqui definido em termos filogenéticos como tendo uma sequência de codificação da hemaglutinina que está mais estreitamente relacionada com a estirpe A/turkey/Turkey/1/05 (SEQ ID N°: 12) do que tanto com a estirpe A/Anhui/1/2005 (SEQ ID N°: 11) como com a estirpe A/Indonesia/5/05 (SEQ ID N°: 2). Finalmente, um virus do clade H5 2.3 pode ser aqui definido em termos filogenéticos como tendo uma sequência de codificação da hemaglutinina que está mais estreitamente relacionada com a estirpe A/Anhui/1/05 (SEQ ID N°: 11) do que tanto com a estirpe A/turkey/Turkey/1/05 (SEQ ID N°: 12) ou a estirpe A/Indonesia/5/05 (SEQ ID N°: 2).

Em algumas formas de realização uma estirpe no subclade 2.2 pode ter HA, incluindo uma ou mais das seguintes sequências: Ile-223; Ile-230; Ser-294; Ile-517; ASer-133; um sitio de clivagem com a sequência REGRRRKR (SEQ ID N°: 13), um sitio de clivagem com a sequência GERRRRKR (SEQ ID N°: 16) . 0 gene HA pode incluir um ou mais dos nucleótideos: A-41; A-142; A-209; A-295; G-433; A-467; A-496; C-610; A-627; A-643; C-658; T-661; T-689; T-727; A-754; G-880; C-937; G-1006; T-1012; A-1019; T-1177; A-1235; T-1402; C-1415; T-1480; C-1510; T-1614; C-1615; A-1672; G-1708 (qualquer um dos quais podem ou não alterar o 7 aminoácido codificado pelo códão relevante). 0 gene de NA pode incluir nucleótideos A-743, o que não irá alterar o aminoácido codificado pelo códão relevante.

Em algumas formas de realização da invenção, o antigénio de imunização e/ou o antigénio de reforço não são do clade 0 por exemplo, não são a partir da estirpe A/HongKong/156/97. Por exemplo, se o segundo antigénio é do clade 1 (A/Vietnam/1203/2004 por exemplo), então o primeiro antigénio não é de preferência do clade 0 (por exemplo, A/Hong Kong/156/97).

Combinações de clade A invenção utiliza antigénios derivados de mais de um clade H5 para imunização.

Por exemplo, um paciente pode ser preparado com o antigénio de um virus H5 num primeiro clade, mas, em seguida, levar um reforço com o antigénio de um virus H5 num segundo clade. Combinações de clade úteis nesta estratégia iniciação/reforço incluem, mas não estão limitadas ao seguinte:

Preparação 1 2 1 1 2 2 1 1 1 2.1 2.2 2.3 Reforço 2 1 4 7 4 7 2.1 2.2 2.3 1 1 1 A invenção também proporciona na reivindicação 2 imunização de reforço para um paciente previamente imunizado com antigénio de um virus H5 num primeiro clade, em que o reforço é de um segundo clade (diferente). As combinações 8 acima podem também ser utilizadas nesta abordagem iniciação/reforço. A invenção também proporciona na reivindicação 8, uma composição imunogénica compreendendo antigénios de virus H5 em pelo menos dois clades diferentes. Combinações úteis de dois clades incluem, mas não estão limitados a:

Primeiro 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 Segundo 2 3 4 5 6 7 8 9 4 7 2.1 2.2 2.3 0 antigeno do virus da Influenza

As vacinas utilizadas com a invenção incluem um antigénio de um virus da gripe tendo um subtipo de hemaglutinina H5. A vacina vai compreender uma proteina que compreende pelo menos um epítopo da hemaglutinina H5, por exemplo, a vacina vai compreender hemaglutinina virai de um virus H5.

Vacinas preferidas da invenção incluem também uma proteina compreendendo pelo menos um epitopo da neuraminidase do virus da gripe, por exemplo a vacina inclui a neuraminidase virai de um virus H5. A invenção pode proteger contra um ou mais dos subtipos de NA Nl, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 ou N9 do virus da gripe A, mas, geralmente será contra o Nl (isto é, um virus H5N1) ou N3 (i.e. um virus H5N3) . 0 primeiro e segundo clade podem ter o mesmo subtipo de NA (por exemplo, ambos Nl ou ambos N3) , ou de diferentes subtipos de NA (por exemplo, Nl, em seguida, N3, ou N3 e em seguida Nl, etc.). Se apenas uma das doses de preparação e de reforço incluir neuraminidase, pode ser a dose de preparação. 9 0 antigénio será tipicamente preparado a partir de viriões da gripe, mas, em alternativa, os antigénios, tais como hemaglutinina e neuraminidase podem ser expressos num hospedeiro recombinante (por exemplo, uma linha de células de insecto utilizando um vector de baculovirus) e utilizados na forma purificada [4, 5, 6], ou sob a forma de partículas semelhantes a virus (VLPs, por exemplo, ver referências 7 e 8) . Em geral, no entanto, os antigénios serão de viriões.

Os antigénios podem tomar a forma de um virus vivo ou, mais preferencialmente, um virus inativado. Meios quimicos para inativar um virus incluem o tratamento com uma quantidade eficaz de um ou mais dos seguintes agentes: detergentes, formaldeido, formalina, β-propiolactona, ou luz UV. Meios adicionais para a inativação quimica incluem o tratamento com azul-de-metileno, psoraleno, carboxifulereno (C60) ou uma combinação de quaisquer destes. Outros métodos de inativação virai são conhecidos na técnica, tais como, por exemplo etilamina binária, etilenoimina acetilo ou por irradiação gama.

Sempre que um virus inativado é usado, a vacina pode compreender um virião inteiro, um virião fragmentado ou antigénios de superfície purificados (incluindo hemaglutinina e, normalmente, também incluindo a neuraminidase). 0 produto H5N1 DARONRIX™ é toda uma vacina de virião inativado. 0 produto H5N1 PREPANDRIX™ é uma vacina de virião fragmentado inativado. 0 virião fragmentado e os antigénios de superfície purificados (isto é, vacinas de subvirião) são particularmente úteis com a invenção. 10

Os viriões podem ser colhidos a partir de fluidos contendo vírus através de vários métodos. Por exemplo, um processo de purificação pode envolver centrifugação zonal utilizando uma solução gradiente de sacarose linear que inclui um detergente para romper os viriões. Os antigénios podem ser então purificados, após a diluição opcional, por diafiltração.

Os viriões fragmentados são obtidos pelo tratamento dos viriões com detergentes (por exemplo, éter etílico, polissorbato 80, desoxicolato, tri-n-butil fosfato, Triton X-100, Triton N101, brometo de cetiltrimetilamónio, Tergitol NP9, etc.), para produzir preparações de subvirião, incluindo o processo de divisão "Tween-éter". Métodos de separação do vírus da gripe são bem conhecidos na técnica ver, por exemplo as Referências 9-14, etc. A divisão do vírus é normalmente realizada através da ruptura ou fragmentação da totalidade do vírus, seja infeccioso ou não infeccioso, com uma concentração de ruptura de um agente de divisão. A ruptura resulta numa solubilização completa ou parcial das proteínas do vírus, alterando a integridade do vírus. Os agentes de divisão preferidos são agentes tensioativos não-iónicos e iónicos (por exemplo, catiónicos), por exemplo, alquilglicósidos, alquiltioglicósidos açúcares de acilo, sulfobetaínas, betaínas, polioxietilenealquiléteres, N,N-dialquil-glucamidas, Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanóis, compostos de amónio quaternário, sarcosilo, CTABs (brometos de cetil trimetil amónio), tri-n-butil fosfato, Cetavlon, sais de miristiltrimetilamónio, lipofectina, lipofectamina, e DOT-MA, os octil ou nonilfenoxi polioxietanóis (por exemplo, os agentes tensioativos Triton, tais como Triton X-100 ou Triton N101), ésteres de polioxietileno de sorbitano (os tensioativos Tween), éteres de 11 polioxietileno, ésteres de polioxietileno, etc. Um procedimento de divisão útil utiliza os efeitos consecutivos do desoxicolato de sódio e formaldeído, e a divisão pode ter lugar durante a purificação inicial do virião (por exemplo, numa solução de gradiente de densidade de sacarose) . Assim, um processo de divisão pode envolver a clarificação do material contendo os viriões (para remover o material não-virião), a concentração dos viriões colhidos (por exemplo, usando um método de adsorção, tal como adsorção por CaHP04) , a separação dos viriões inteiros a partir de material não-virião, a divisão dos viriões utilizando um agente de separação, num passo de centrifugação em gradiente de densidade (por exemplo, usando um gradiente de sacarose que contém um agente de separação, tal como desoxicolato de sódio), e depois filtração (por exemplo, ultrafiltração) para remover os materiais indesej ados. A divisão de viriões pode ser útil através da ressuspensão em solução isotónica de cloreto de sódio em tampão de fosfato de sódio. Os produtos BEGRIVAC™, FLUARIX™, Fluzone™ e FLUSHIELD™ são vacinas divididas.

Vacinas de antigénios de superfície purificados compreendem os antigénios de superfície de hemaglutinina da gripe e, normalmente, também a neuraminidase. Processos para a preparação dessas proteínas na forma purificada são bem conhecidos na técnica. Os produtos Fluvirin™, CHIROFLU™, FOCETRIA™ e Influvac™ são vacinas de subunidade.

Os antigénios da gripe podem também ser apresentados sob a forma de virossomas [15] (ácido nucleico livres de partículas virais, como lipossomas) , como nos produtos INFLEXAL V™ e INVAVAC™, mas é preferível não usar 12 virossomas com a presente invenção. Assim, em algumas concretizações, o antigénio da gripe não está na forma de um virossoma. A estirpe a partir do qual é preparado o virus será tipicamente um virus da gripe aviária ou um virus da gripe humana. Geralmente será capaz de infectar seres humanos, mas em alguns casos, uma estirpe que pode ser utilizada não pode infectar os seres humanos, por exemplo uma estirpe de gripe aviária que pode mais tarde adquir a capacidade de infectar seres humanos. A estirpe pode ser uma estirpe de HPAI (gripe aviária altamente patogénica) [16]. 0 virus da gripe pode ser atenuado. 0 virus da gripe pode ser sensível à temperatura. 0 vírus da gripe pode ser adaptado ao frio. Estas três características são particularmente úteis quando se utiliza o vírus vivo como um antigénio. 0 vírus da gripe pode ser resistente à terapêutica antiviral (por exemplo, resistente ao oseltamivir, [17] e/ou zanamivir).

As composições da invenção podem incluir o antigénio (s) de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) estirpes do vírus da gripe, incluindo o vírus da gripe A e/ou o vírus da gripe B, desde que incluam o antigénio de pelo menos uma estirpe H5. Assim, uma composição pode incluir o antigénio de uma ou mais características da estirpe de uma vacina sazonal normal e de pelo menos uma estirpe H5, por exemplo, uma vacina de valência 4 com três estirpes de vírus da gripe A (H1N1 e H3N2, além de uma estirpe H5 por exemplo 13 Η5Ν1), e uma estirpe da gripe B. Em outras formas de realização, pode-se incluir o antigénio de pelo menos duas estirpes H5 e, opcionalmente, uma estirpe Hl e/ou uma estirpe H3 e/ou uma estirpe do virus da gripe B. Quando uma vacina inclui mais de uma estirpe de gripe, as diferentes estirpes são normalmente cultivadas separadamente e são misturados após os virus terem sido colhidos e os antigénios preparados. Assim, um processo da invenção pode incluir o passo da mistura de antigénios a partir de mais do que uma estirpe de gripe. 0 virus da gripe pode ser uma estirpe recombinante, e pode ter sido obtido por meio de técnicas de genética inversa. Técnicas de genética reversa [por exemplo, 18-22] permitem que os virus da gripe com segmentos do genoma desejado possam ser preparados in vitro utilizando plasmideos. Normalmente, envolve expressar (a) moléculas de ADN que codificam as desejadas moléculas de ARN virai, por exemplo, de promotores individuais, e (b) moléculas de ADN que codificam as proteínas virais, por exemplo a partir de promotores individuais, de tal forma que a expressão de ambos os tipos de ADN numa célula conduz à montagem de um virião infeccioso completo intacto. 0 ADN, de preferência fornece todos os ARN virais e proteínas, mas também é possível a utilização de um vírus ajudante para proporcionar algum do ARN e proteínas. São preferidos os métodos baseados em plasmídeo, utilizando plasmideos separados para a produção de cada ARN virai [23-25] , e estes métodos também poderão envolver a utilização de plasmideos para expressar a totalidade ou parte (por exemplo, apenas proteínas PBl, PB2, PA e NP) das proteínas virais, com até 12 plasmideos a serem utilizadas em certos métodos. Se forem utilizadas células caninas, um promotor individual canino pode ser utilizado [26] . 14

Para reduzir o número de plasmídeos necessários, uma abordagem [27] combina uma pluralidade de cassetes de transcrição da polimerase I do ARN (para a síntese de ARN virai) no mesmo plasmídeo (por exemplo, sequências que codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 segmentos ARNv da gripe A), e uma pluralidade de regiões de codificação de proteínas com promotores de polimerase II de ARN em outro plasmídeo (por exemplo, sequências que codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 transcritos de ARNm da gripe A).

Os aspectos preferidos do método de referência 27, envolvem: (a) regiões de codificação de ARNm PB1, PB2 e PA num único plasmídeo; e (b) todos os 8 segmentos de codificação de vRNA num único plasmídeo. Incluindo os segmentos de NA e HA num plasmídeo e os outros seis segmentos noutro plasmídeo também pode facilitar as matérias.

Como uma alternativa ao uso de promotores individuais para codificar os segmentos de ARN virai, é possível utilizar os promotores da polimerase de bacteriófago [28]. Por exemplo, os promotores para as polimerases SP6, T3 ou T7 podem ser convenientemente utilizados. Devido à especificidade das espécies de promotores individuais, os promotores da polimerase de bacteriófago podem ser mais convenientes para muitos tipos de células (por exemplo MDCK), apesar de uma célula deva também ser transfectada com um plasmídeo que codifica a enzima de polimerase exógena.

Noutras técnicas, é possível utilizar promotores individuais duplos e simples que codificam simultaneamente os ARN virais e para mRNAs expressáveis a partir de um único modelo [29,30]. 15 0 vírus da gripe A pode incluir um ou mais segmentos de ARN de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6 segmentos de A/PR/8/34, com os segmentos HA e N sendo de uma estirpe de vacina, ou seja, um rearranjo 6:2), especialmente quando os vírus são produzidos em ovos. Também pode incluir um ou mais segmentos de ARN de um vírus A/WSN/33, ou de qualquer outra estirpe do vírus útil para gerar vírus recombinantes para a preparação da vacina. Tipicamente, a invenção protege contra uma estirpe que seja capaz de transmissão humano para humano, e assim o genoma da estirpe geralmente inclui pelo menos um segmento de ARN que se originou num vírus da gripe de um mamífero (por exemplo, num ser humano) . Pode incluir o segmento NS que se originou num vírus da gripe aviária.

Os vírus utilizados como a fonte dos antigénios podem ser cultivados nos ovos ou em cultura de células. 0 método padrão atual para o crescimento do vírus da gripe usa ovos de galinha embrionados específicos livres de patogéneos (SPF), com o vírus sendo purificado a partir do conteúdo dos ovos (fluído alantóide). Mais recentemente, no entanto, os vírus têm sido produzidos em cultura de células animais e, por razões de velocidade e de alergias do paciente, este método de crescimento é preferido. Se é utilizado o crescimento virai à base de ovo, em seguida, um ou mais aminoácidos podem ser introduzidos no fluído alantóide do ovo, juntamente com o vírus [14].

Quando a cultura de células é utilizada, o substrato de crescimento virai será tipicamente uma linha de células de origem em mamíferos. As células de origem de mamíferos adequadas incluem, mas não estão limitados a, células de 16 hamster, gado, primatas (incluindo seres humanos e macacos) e cão. Podem ser utilizados vários tipos de células, tais como células de rim, fibroblastos, células da retina, células do pulmão, etc. Exemplos de células de hamster adequadas são as linhas celulares com os nomes BHK21 ou HKCC. Células de macaco adequadas são, por exemplo, células de macaco verde africano, tais como células de rim como na linha celular Vero. Células de cão adequadas são, por exemplo, células do rim, como na linha de células MDCK. Assim, as linhas celulares adequadas incluem, mas não estão limitadas a: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. Linhas de células de mamíferos preferenciais para o cultivo do vírus da gripe incluem: células MDCK [31-34], derivados do rim canino Madin Darby; células Vero [35-37], derivadas do rim do macaco verde africano (Cercopithecus aethiops); ou células PER.C6 [38], derivadas de retinoblastos embrionários humanos. Estas linhas celulares estão amplamente disponíveis, por exemplo a partir da coleção da American Type Cell Culture (ATCC), a partir da Coriell Cell Repositories ou a partir da European Collection of Cell Cultures (ECACC) . Por exemplo, a ATCC fornece várias células Vero diferentes, com os números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 e CRL-1587, e fornece células MDCK com o número de catálogo CCL-34. PER.C6 está disponível a partir da ECACC com o número de depósito 96022940. Como uma alternativa menos preferida para as linhas de células de mamíferos, os vírus podem ser cultivados em linhas de células aviárias [por exemplo, referências 39-41], incluindo linhas celulares derivadas de patos (por exemplo, retina de pato) ou galinhas. Exemplos de linhas celulares de aves incluem células estaminais embrionárias aviárias [39,42] e as células da retina de pato. [40] As células estaminais embrionárias aviárias adequadas, incluem a linha de células EBx derivadas de células estaminais embrionárias de galinha, EB45, EB 14, e 17 ΕΒ14-074 [43]. Podem também ser utilizados fibroblastos de embrião de galinha (CEF).

As linhas de células mais preferidas para o cultivo do virus da gripe são linhas de células MDCK. A linha celular MDCK original está disponível a partir de ATCC como CCL-34, mas os derivados desta linha celular também podem ser utilizados. Por exemplo, a referência 31, divulga uma linha celular MDCK, que foi adaptada para crescimento em cultura de suspensão ("MDCK 33016", depositada como DSM ACC 2219) . Do mesmo modo, a referência 44 descreve uma linha de células MDCK derivada que cresce em cultura de suspensão isenta de soro ("B-702", depositada como FERM BP-7449) . A referência 45 divulga células MDCK não tumorogénicas, incluindo "MDCK-S" (ATCC PTA-6500), "MDCK-SF101" (ATCC PTA-6501), "MDCK-SF102" (ATCC PTA-6502) e "MDCK-SF103" (PTA-6503). A referência 46 descreve linhas de células MDCK com elevada susceptibilidade à infecção, incluindo células "MDCK.5F1" (ATCC CRL-12042). Qualquer uma destas linhas celulares MDCK pode ser usada.

Quando o vírus tiver sido cultivado numa linha de células de mamífero, em seguida, a composição irá estar vantajosamente livre de proteínas do ovo (por exemplo, ovalbumina e ovomucóide) e do ADN de frango, reduzindo assim os fatores alérgicos.

Quando o vírus foi cultivado numa linha de células, em seguida a cultura para o crescimento, e também o inoculo virai usado para iniciar a cultura, será, de preferência isento de (ou seja, terão sido testados para e dado um resultado negativo de contaminação por) vírus do herpes simplex, vírus sinovial respiratório, vírus paragripe 3, coronavírus SARS, adenovírus, rinovírus, reovirus, 18 poliomaviroses, birnaviroses circoviroses, e/ou parvovírus [47]. A ausência do vírus do herpes simplex é particularmente preferida.

Para o crescimento de uma linha celular, tal como em células MDCK, os vírus podem ser cultivados em células em suspensão [48-50] ou em cultura aderente. Uma linhagem de células MDCK adequada para cultura de suspensão é a MDCK 33016 (depositada como DSM ACC 2219). Como uma alternativa, a cultura micro-transportadora pode ser usada.

As linhas celulares que suportam a replicação do vírus da gripe são de preferência cultivadas em meio de cultura isento de soro e/ou meio livre de proteínas. Um meio é referido como um meio livre de soro, no contexto da presente invenção, quando no qual não há aditivos de soro de origem humana ou animal. Proteínas livres, entende-se culturas em que a multiplicação das células ocorre com exclusão de proteínas, factores de crescimento, outros aditivos de proteínas e proteínas não-serosas, mas pode incluir, opcionalmente, proteínas tais como a tripsina ou outras proteases que possam ser necessárias para o crescimento virai. As células que crescem em culturas contêm, elas próprias, naturalmente proteínas.

As linhas celulares que suportam a replicação do vírus da gripe crescem preferencialmente abaixo de 37°C [51] durante a replicação virai, por exemplo 30-36°C. O método para a propagação do vírus em cultura de células em geral, inclui os passos de inoculação das células de cultura com a estirpe a ser cultivada, cultivo das células 19 infectadas durante um período de tempo desejado para a propagação do vírus, tal como, por exemplo, como determinado pelo título do vírus ou a expressão do antigénio (por exemplo, entre 24 e 168 horas após a inoculação) e recolha do vírus propagado. As células de cultura são inoculadas com um vírus (medido por UFP ou TCID50) numa relação celular de 1:500 a 1:1, preferencialmente de 1:100 a 1:5, mais preferencialmente de 1:50-1:10. O vírus é adicionado a uma suspensão de células ou é aplicado a uma monocamada de células, e o vírus é absorvido nas células durante pelo menos 60 minutos, mas normalmente menos de 300 minutos, de preferência entre 90 e 240 minutos a 25°C a 40°C, preferivelmente 28°C a 37°C. A cultura de células infectadas (por exemplo, monocamadas) pode ser removida por meio de congelamento-descongelamento, ou por ação enzimática para aumentar o teor virai dos sobrenadantes de cultura colhidos. Os fluídos colhidos são então inativados ou armazenados congelados. As células cultivadas podem ser infectadas com uma multiplicidade de infecção ("m.o.i.") de cerca de 0,0001 a 10, preferivelmente de 0,002 a 5, mais preferivelmente de 0,001 a 2. Ainda mais preferencialmente, as células são infectadas a uma m.o.i. de aproximadamente 0,01. As células infectadas podem ser colhidas 30 a 60 horas após a infecção. De preferência, as células são colhidas 34-48 horas após a infecção. Ainda mais preferencialmente, as células são colhidas 38 a 40 horas após a infecção. As proteases (tripsina normalmente) são geralmente adicionadas durante a cultura de células para permitir a libertação virai, e as proteases podem ser adicionados em qualquer fase adequada durante a cultura.

Hemaglutinina (HA) é o principal imunogénio em vacinas contra a gripe inativadas, e as doses de vacina são 20 normalizadas por referência aos níveis de HA, normalmente medidos por ensaio de imunodifusão radial simples (SRID). As vacinas atuais tipicamente contêm cerca de 15pg de HA por estirpe, embora doses mais baixas também sejam utilizadas, por exemplo em crianças, ou em situações de pandemia. Doses fracionadas têm sido usadas tais como (isto é, 7,5 pg de HA por estirpe, como no FOCETRIA™) , H (isto é 3,75 pg por estirpe, como no PREPANDRIX™) e ^ [52,53], assim como doses mais elevadas (por exemplo, doses 3x ou 9x [54,55]) . Assim, as vacinas podem incluir entre 0,1 e 150 pg de HA por estirpe de gripe, preferencialmente, entre 0,1 e 50 pg, por exemplo, 0,1-20 pg, 0,1-15 pg, 0,Ι-ΙΟ pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5 pg, etc. Doses particulares incluem, por exemplo, cerca de 45, cerca de 30, cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5, cerca de 3,8, cerca de 3,75, cerca de 1,9, cerca de 1,5, etc. pg por estirpe. É típica uma massa idêntica de HA por estirpe. Para as composições, incluindo HA de estirpes de diferentes clades H5, é útil incluir 3,75 pg, 7,5 pg ou 15 pg por estirpe (por exemplo, 2 x 3,75 pg, dando um total de 7,5 pg de HA, normalmente em combinação com um adjuvante tal como uma emulsão de esqualeno-em-água). As doses mais baixas (isto é, <15pg/dose) são mais úteis quando um adjuvante está presente na vacina, tal como na invenção. Embora doses tão elevadas como 90 pg tenham sido utilizadas em alguns estudos (por exemplo, referência 56), as composições da invenção (particularmente na dose de reforço) incluem, normalmente, 15 pg/dose ou menos.

Para as vacinas vivas, a dosagem é medida pela mediana da dose infecciosa da cultura de tecidos (TCID50) em vez do teor de HA e é típico um TCID50 entre 106 e 108 (de preferência entre 106,5-107,5) por cada estirpe. 21 HA usada com na invenção ser uma HA natural, como encontrada em um vírus, ou pode ter sido modificada. Por exemplo, é sabido que para modificar HA para remover determinantes (por exemplo, regiões hiper-base ao redor do local de clivagem entre HA1 e HA2) que fazem com que um vírus seja altamente patogénico em espécies de aves, uma vez que estes determinantes podem eventualmente impedir um vírus de ser cultivadas em ovos.

As composições da invenção podem incluir detergente, por exemplo, um éster de polioxietileno sorbitano tensioativo (conhecido como "Tweens", por exemplo, polissorbato 80), um octoxinol (tal como o octoxinol-9 (Triton X-100) ou 10, ou t-octilfenoxipolietoxietanol), um brometo de cetil trimetil de amónio ('CTAB'), ou desoxicolato de sódio, em particular para uma divisão ou vacina do antigénio de superfície. O detergente pode estar presente apenas em quantidades vestigiais. Assim, a vacina pode incluir menos de lmg/ml de cada octoxinol-10, α-tocoferol succinato de hidrogénio e polissorbato 80. Outros componentes residuais em quantidades vestigiais podem ser antibióticos (por exemplo, neomicina, canamicina, polimixina B). ADN da célula hospedeira

Quando o vírus foi cultivado numa linha de células, é prática padrão minimizar a quantidade residual de ADN da linha de células no final da vacina, de modo a minimizar qualquer atividade oncogénica do ADN. Assim, quando o vírus foi cultivado numa linha de células, a composição contém de preferência menos de 10 ng (de preferência menos do que, e mais de preferência inferior a lOOpg) de ADN residual da célula de hospedeira por dose, apesar de 22 quantidades vestigiais do ADN da célula hospedeira possam estar presentes. Prefere-se que o comprimento médio de um ADN residual da célula hospedeira seja inferior a 500pb, por exemplo, menos do que 400 pb, menos do que 300 pb, menos do que 200 pb, menos do que 100 pb, etc. Em geral, o ADN da célula hospedeira que é desejável excluir nas composições da invenção é o ADN que é maior do que 100 pb. A medição de ADN residual da célula hospedeira é agora um requisito regulamentar de rotina para os agentes biológicos e está dentro das capacidades normais do perito na técnica. O ensaio utilizado para medir o ADN será tipicamente um ensaio validado [57,58]. As caracteristicas de desempenho de um ensaio validado podem ser descritas em termos matemáticos e quantificáveis, e as suas possíveis fontes de erro foram identificados. O ensaio foi geralmente testado para caracteristicas, tais como exatidão, precisão, especificidade. Uma vez ensaio calibrado (por exemplo, contra as quantidades conhecidas padrão do ADN da célula hospedeira) , e, em seguida, testado, as medições quantitativas do ADN podem ser realizadas rotineiramente. Três técnicas principais para a quantificação de ADN podem ser usadas: métodos de hibridização, tais como "Southern blot" ou "slot blot" [59] ; os métodos de imunoensaio, tais como o Sistema Threshold™ [60], e PCR quantitativo [61]. Estes métodos são todos familiares para o perito na técnica, apesar das caracteristicas exatas de cada método possam depender da célula hospedeira em questão, por exemplo, a escolha de sondas para a hibridação, a escolha de iniciadores e/ou sondas para a amplificação, etc. O sistema Threshold™ a partir de Molecular Devices é um ensaio quantitativo para niveis de ADN total em picogramas, tendo sido utilizado para monitorizar niveis de contaminação de ADN em biofármacos [60]. Um ensaio tipico 23 envolve a formação não-específica da sequência de um complexo de reação entre uma proteína de ligação de ssADN biotinilado, um anticorpo anti-ssDNA urease conjugado e o ADN. Todos os componentes do ensaio são incluídos no kit de Ensaio Total DNA disponível a partir do fabricante. Vários fabricantes comerciais oferecem ensaios de PCR quantitativo para detecção residual ADN da célula hospedeira por exemplo AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies, etc. Uma comparação entre um ensaio de hibridação quimioluminescente e o sistema de medição da contaminação da célula hospedeira por ADN total de uma vacina virai humana Threshold™ pode ser encontrado na referência 62. 0 ADN contaminante pode ser removido durante a preparação da vacina utilizando processos de purificação convencionais, por exemplo cromatografia, etc. A remoção do resíduo de ADN da célula hospedeira pode ser melhorada por tratamento com nuclease, por exemplo, utilizando uma ADNase. Um método conveniente para a redução da contaminação do ADN da célula hospedeira é descrito nas referências 63 e 64, envolvendo um tratamento de duas etapas, primeiro usando um ADNase (por exemplo, Benzonase), o qual pode ser usado durante o crescimento virai, e, em seguida, um detergente catiónico (por exemplo, CTAB), o qual pode ser utilizado durante a interrupção do virião. 0 tratamento com um agente de alquilação, tal como β-propiolactona, também pode ser usado para remover o ADN da célula hospedeira, e, vantajosamente, também pode ser utilizado para inativar os viriões [65].

Vacinas contendo <10 ng (e.g. <lng <100pg) de ADN da célula hospedeira por 15 yg de hemaglutinina são as preferidas, 24 assim como as vacinas contendo <10 ng (e.g. <lng <100pg) de ADN da célula hospedeira por volume de 0,25 ml. Vacinas contendo <10 ng (e.g. <lng <100pg) de ADN da célula hospedeira por 50 yg de hemaglutinina são as mais preferidas, assim como as vacinas contendo <10 ng (e.g. <lng <100pg) de ADN da célula hospedeira por volume de 0,5 ml.

Adjuvante (s)

Uma composição da invenção pode incluir um adjuvante para melhorar as respostas imunes (humoral e/ou celular) produzidas num paciente que recebe a composição. É preferivel que o clade da primeira vacina e o clade da segunda vacina são vacinas com adjuvantes. Elas podem utilizar o mesmo adjuvante ou adjuvantes diferentes. Se apenas uma das duas vacinas tem adjuvante é, de preferência, a segunda.

Os adjuvantes adequados para utilização com a invenção incluem, mas não estão limitados a: • Uma composição mineral contendo, incluindo sais de cálcio e sais de alumínio (ou suas misturas) . Os sais de cálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, as partículas "CAP" divulgadas na referência 66). Os sais de alumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., com os seus sais, tendo qualquer forma adequada (por exemplo, em gel, cristalina, amorfa, etc.) . A adsorção para estes sais é o preferido. As composições contendo o mineral podem também ser formuladas como uma partícula de sal de metal [67]. Os adjuvantes de sais de alumínio estão descritos em maior detalhe abaixo. 25 • Uma emulsão de óleo em água, tal como descrito em mais detalhe abaixo. • Um oligonucleótido imunoestimulante, tal como descrito em mais detalhe abaixo. • 3-0-monofosforil desacilado lipido A ("3 DMPL" também conhecido como "MPL™") , tal como descrito em mais detalhe abaixo. • Um composto de imidazoquinolina, tal como Imiquimod ("R- 837") [68,69], Resiquimod ("R-848") [70], e os seus análogos; e os seus sais (por exemplo, os sais de cloridrato). Mais detalhes sobre imidazoquinolinas imunoestimulantes podem ser encontrados nas referências 71 a 75. • Um composto de tio-semicarbazona, tal como os descritos na referência 76. Os métodos de formulação, fabricação, e rastreio de compostos ativos são também descritos na referência 76. As tiosemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citocinas, tais como TNF-oí. • Um nucleósido análogo, tais como: (a) Isatorabina (ANA-245, 7-tia-8-oxoguanosina):

26 e pró-fármacos deste, (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) os compostos descritos nas referências 77 a 79, (f) um composto tendo a fórmula:

em que: R2 e R2 são cada um independentemente H, halo, -NRaRb, -OH, alcoxi C1-6, alcoxi substituído C1-6, heterociclilo, heterociclilo substituído, arilo C6-10, arilo substituído Ceio, C 1-6 alquilo, ou alquilo substituído C1-6; R3 está ausente, H, alquilo C1-6, alquilo substituído C1-6, arilo Cg-10, arilo substituído C6-10, heterocíclico ou heterocíclico substituído; R4 e R5 são cada um, independentemente, H, halo, heterociclilo, heterociclilo substituído, -C(0)-Rd, alquilo Cl-6, alquilo substituído C1-6, ou ligados em conjunto para formar um anel de 5 membros tal como em R4-5:

sendo a ligação alcançado nas ligações indicadas por

Xi e X2 são cada um independentemente N, C, 0 ou S; 27 R8 é H, halo,-OH, alquilo Ci_6, alcenilo C2-e, alcinilo C2-e, -OH,-NRaRb, - (CH2) n_0-Rc,-o-( alquilo Ci_6) ,-S (0) pRe ou -C (0)-Rd; R9 é H, alquilo C1-6, alquilo substituído C1-6, heterociclilo, heterociclilo substituído ou Rga, em que Rga é:

a ligação a ser alcançada na ligação indicada por

Rio e Rn são cada um independentemente H, halo, alcoxi C1-6, alcoxi substituído C1-6, - NRaRbí ou -OH; cada Ra e Rb é, independentemente, H, alquilo C1-6, alquilo substituído Ci_6,-C (0) Rd, arilo C6-io; cada Rc é independentemente H, fosfato, difosfato, trifosfato, alquilo C1-6, ou alquilo substituído C1-6; cada Rd é independentemente, H, halo, alquilo Ci_g, alquilo substituído Ci_6, alcoxi C1-6, alcoxi substituído Ci_6,-NH2,-NH (alquilo Ci_6) , -NH (alquilo substituído Ci_6) , -N (alquilo Ci-β) 2r —N (alquilo substituído 0ι-ε)2, arilo Οε-ιο, ou heterociclilo; cada Re é independentemente H, alquilo Ci_6, alquilo substituído Ci_6, arilo Cg-icu arilo substituído Cg-icu heterocíclico ou heterocíclico substituído; 28 cada Rf é independentemente H, alquilo Ci_6, alquilo substituído Ci-6,-C (0) Rd, fosfato, difosfato ou trifosfato; cada n é independentemente 0, 1, 2, ou 3; cada p é independentemente 0, 1 ou 2; ou (g) um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um de (a) a (f), um tautómero de qualquer um de (a) a (f), ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautómero. • Um composto de triftantrina, tais como os descritos na referência 80 Os métodos de formulação, fabricação, e rastreio de compostos ativos são também descritos na referência 80. As tiosemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citocinas, tais como TNF-oí . • Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) [81]. • Os compostos revelados na referência 82, incluindo: compostos de Acllpiperazina, compostos de Indolediona, compostos de Tetrahidraisoquinolina (THIQ), compostos de Benzociclodiona, compostos de Aminoazavinil, compostos aminobenzimidazola quinolinona (ABIQ) [83,84], compostos, de Hidraftalamida, compostos de Benzofenona, compostos de

Isoxazole, compostos de Esteróis, compostos de Quinazilinona, compostos de Pirrole [85] , compostos de Antraquinona, compostos de Quinoxalina, compostos de

Triazina, compostos de Pirazalopirimidina e compostos de Benzazole [86]. • Os compostos divulgados na referência 87, incluindo 3,4-di-(lH-indol-3-il)-lH-pirrole-2,5-dionas, análogos de estaurosporina, derivatizados de piridazinas, cromen-4-onas, indolinonas, quinazolinas e análogos de nucleosídeos. 29 • Um derivado fosfato de glucosaminide aminoalquilo, tal como RC-529 [88,89]. • Um fosfazeno, tal como poli [di (carboxilatofenóxilo) fosfazeno] ("PCPP") como descrito, por exemplo, nas referências 90 e 91. • Pequenas moléculas imunopotenciadoras (SMIPs), tais como: N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2,N2-dimetil-l-(2-metilpropil)-ΙΗ-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-etil-N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina 1- (2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-butil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-butil-N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-pentil-lH-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina N2-metil-l(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-lH-imidazo[4,5-c] quinolina-2,4-diamina 1- (2-metilpropil)-2-[(henilmetil)tio]-lH-imidazo[4,5-c] quinolina-4-amina 30 1- (2-metilpropil)-2-(propiltio)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-4-amina 2- [[4-amino-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2-il] (metil)amino]etanol 2-[[4-amino-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2-il] (metil)amino] acetato de etilo 4-amino-l-(2-metilpropil)-1,3-di-hidro-2H-imidazo[4,5-c] quinolina-2-ona N2-butil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-lH-imidazo [4,5-c] quinolina-2 ,4-diamina N2-butil-N2-metil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis (fenilmetil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-metil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-lH-imidazo [4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2, N2-dimetil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina 1-{4-amino-2-[metil(propil)amino]-lH-imidazo[4,5-c] quinolina-l-il}-2-metil-2-ol 1-[4-amino-2-(propilamino)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-l-il] -2-metil-2-ol N4,N4-dibenzil-l-(2-metoxi-2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina. • As saponinas [capitulo 22 da referência 133], os quais são um grupo heterólogo de glicósidos esteróides e glicósidos triterpenóides que são encontrados na casca, folhas, caules, raizes e até flores de uma ampla gama de espécies de plantas. A saponina da casca da árvore Molina 31

Quillaia saponaria, tem sido amplamente estudada como adjuvante. A saponina pode também ser obtida comercialmente da Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (véu de noiva) e Saponaria officianalis (raiz de sabão). Formulações de adjuvante de saponina incluem formulações purificadas, tais como QS21, bem como formulações de lipidos, tais como ISCOM. QS21 é comercializado como Stimulon™. As composições saponina foram purificadas utilizando HPLC e RP-HPLC. Fracções purificadas especificas usando estas técnicas têm sido identificadas, incluindo QS7, QS17, QS 18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. De preferência, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é divulgado na referência 92. Formulações de saponina podem também compreender um esterol, tal como colesterol [93]. Combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar partículas singulares chamadas de complexo imunoestimulante (ISCOM) [capitulo 23 da referência 133]. Os ISCOMs também incluem, tipicamente, um fosfolipido tal como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser utilizada em ISCOMs. Preferencialmente, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA & QHC. ISCOM são ainda descritos nas referências 93-95. Opcionalmente, os ISCOMS podem ser desprovidos de detergente adicional [96]. Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes com base em saponina pode ser encontrada nas referências 97 & 98. • Toxinas ribosilantes de ADP bacterianas (por exemplo, a enterotoxina termolábil de E. coli "LT", a toxina da cólera "CT" ou a toxina da tosse convulsa "PT") e seus derivados desintoxicados das mesmas, tais como as toxinas mutantes, conhecidas como LT-K63 e LT- R72 [99] . 0 uso de toxinas ribosilantes de ADP destoxifiçadas como adjuvantes das mucosas está descrito na referência 100 e como adjuvantes parenterais na referência 101. 32 • Bioadesivos e mucoadesivos, tais como microesferas de ácido hialurónico esterificado [102] ou quitosano e seus derivados [103]. • Microparticulas (por exemplo, uma partícula de ~ lOOnm a ~ 150nm de diâmetro, mais preferivelmente ~ 200nm a ~ 30pm de diâmetro, ou ~ 500nm a ~ 10 ym de diâmetro) , formadas a partir de materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um ácido poli(a -hidroxi), um ácido polihidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona, etc.), com poli (lactido-co-glicolido), sendo preferida, opcionalmente tratadas para ter uma superfície carregada negativamente (por exemplo, com SDS) ou uma superfície carregada positivamente (por exemplo, com um detergente catiónico, tal como CTAB). • Os lipossomas (Capítulos 13 e 14 da referência 133) . Exemplos de formulações de lipossomas adequados para utilização como adjuvantes encontram-se descritos nas referências 104-106. • Éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno [107]. Tais formulações incluem ainda tensioativos de éster de sorbitano de polioxietileno em combinação com um octoxinol [108], bem como os éteres alquílicos de polioxietileno ou tensioativos de éster, em combinação com pelo menos um tensioativo não iónico adicional, tal como um octoxinol [109]. Éteres de polioxietileno preferidos são selecionados a partir do seguinte grupo: éter de polioxietileno-9-laurilo (laureth 9) , éter de polioxietileno-9-steoril, éter de polioxiethileno-8-steoril, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo, e éter de polioxietileno-23-laurilo. 33 • Péptidos de muramilo, tais como N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP") , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida ("DTP-DPP", ou "Theramide™), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforoloxil-etilamina ("MTP-PE"). • Uma preparação de proteína da membrana exterior de proteassoma preparada a partir uma primeira bactéria Gram-negativa, em combinação com uma preparação liposacarídea (LPS) derivada a partir de uma segunda bactéria Gram-negativa, em que a membrana exterior de proteína de proteossoma e preparações de LPS formam um complexo adjuvante não covalente estável. Tais complexos incluem "IVX-908", um complexo composto da membrana exterior de Neisseria meningitidis e LPS. Têm sido utilizados como adjuvantes para vacinas contra a gripe [110]. • Um polímero polioxidonium [111,112] ou outro derivado de N-polietileno-piperazina oxidada. • Metil-5'-inosina-monofosfato ("MIMF") [113]. • Um compostode pirrolizidina polihidroxilatada [114], tal como uma que tem a fórmula:

onde R é selecionado de entre o grupo compreendendo hidrogénio, linear ou ramificado, não substituído ou substituído, acilo, saturado ou insaturado, alquilo (por exemplo, cicloalquilo), alcenilo, alcinilo e arilo, ou um 34 sal farmaceuticamente aceitável ou um seu derivado. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranose, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7-di-epi-casuarina, etc. • Um ligando CDld, tal como uma a-glicosilceramida [115 — 122] (por exemplo, α-galactosilceramida), fitoesfingosina contendo α-glicosilceramidas, OCH, KRN7000 [ (2S, 3S, 4R)-ΙΟ- (D-a-galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanetriol] , CRONY-101, 3"-0-sulfo-galactosilceramida, etc. • A inulina gamma [123] ou um seu derivado, como a algammulina. • Um composto de fórmula I, II ou III, ou um seu sal:

1 II III

definido na referência 124, como 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', 'ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', 'ER 803022' ou 'ER 804057', por exemplo: 35

ER-803022:

ο

O Na CnH» ER804057 "ΥΥ ο ο • Derivados de lípido A de Escherichia coli tais como 0M-174 (descrito nas referências 125 & 126.). • Uma formulação de um lipido catiónico e um (normalmente neutro) co-lipido, tal como dimetil-aminopropil-propanaminio-miristoleiloxi brometo difihitanoilfosfatidil-etanolamina ("Vaxfectin™") ou aminopropil-dimetil-bis-dodeciloxi-propanaminio brometo dioleoilfosfatidil-etanolamina ("GAP-DLRIE: DOPE"). Formulações contendo sais de (±)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9- tetradeceneiloxi)-1-propanaminio são preferidos [127]. 36 • Compostos contendo lípidos ligados a um esqueleto acíclico contendo fosfato, tal como o antagonista de TLR4 E5564 [128,129]:

Estas e outras substâncias adjuvantes ativas são discutidas com mais detalhe nas referências 133 e 134. 0 adjuvante (s) para utilização na presente invenção podem ser moduladores e/ou agonistas de receptores de tipo Toll (TLR) . Por exemplo, podem ser agonistas de um ou mais das proteínas humanas TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 e/ou TLR9. Os agentes preferidos são os agonistas de TLR7 (imidazoquinolines por exemplo) e/ou de TLR9 (por exemplo, oligonucleótidos CpG) . Estes agentes são úteis para ativar as vias da imunidade inata.

Uma única vacina pode incluir dois ou mais dos referidos adj uvantes.

Os antigénios e adjuvantes numa composição estarão tipicamente na mistura.

Os adjuvantes de sais de alumínio

Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio podem ser usados. Estes nomes são 37 convencionais, mas são usados apenas por conveniência, como também não é uma descrição precisa do composto químico real que está presente (por exemplo, ver o capítulo 9 da referência 133) . A invenção pode usar qualquer um dos adjuvantes "hidróxido" ou "fosfato", que são de uso geral como adjuvantes.

Os adjuvantes conhecidos como "hidróxido de alumínio" são tipicamente sais de oxi-hidróxido de alumínio, que são normalmente pelo menos parcialmente cristalinos. Oxi-hidróxido de alumínio, que pode ser representado pela fórmula geral AIO(OH), pode ser distinguido de outros compostos de alumínio, tais como hidróxido de alumínio, AI(OH) 3, por espectroscopia de infravermelhos (IR), em particular pela presença de uma banda de adsorção em 1070cm_1 e um ombro forte em 3090-3100cm-1 [capítulo 9 da referência 133] . 0 grau de cristalinidade de um adjuvante de hidróxido de alumínio é reflectido pela largura da banda de difração a meia altura (WHH), com partículas pobremente cristalinas mostrando alargamento da linha maior devido a tamanhos de cristalitos menores. A área de superfície aumenta à medida que aumenta a WHH, e adjuvantes com valores de WHH superiores foram vistos como tendo uma maior capacidade de adsorção para o antigénio. Uma morfologia fibrosa (por exemplo, como pode ser vista no microscópio electrónico de transmissão) é típica para adjuvantes de hidróxido de alumínio. 0 pi de adjuvantes de hidróxido de alumínio é tipicamente cerca de 11, ou seja, o adjuvante em si tem uma carga de superfície positiva ao pH fisiológico. Capacidade adsortiva entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 foi relatada para adjuvantes de hidróxido de alumínio. 38

Os adjuvantes conhecidos como "fosfato de alumínio" são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio, muitas vezes, também contendo uma pequena quantidade de sulfato (isto é, sulfato de hidroxifosfato de alumínio). Podem ser obtidos por precipitação, e as condições de reação e concentrações durante a precipitação, influenciam o grau de substituição do fosfato pelo hidroxilo no sal. Os hidroxifosfatos têm, geralmente, uma razão molar de PCy/Al entre 0,3 e 1,2. Os hidroxifosfatos podem ser distinguidos do AIPO4 estrito pela presença de grupos hidroxilo. Por exemplo, uma banda de espectro de IR a 3164cm_1 (por exemplo, quando aquecido a 200°C) indica a presença de hidroxilos estruturais [capítulo 9 da referência 133]. A razão molar de PO4/AI3"1" de um adjuvante de fosfato de alumínio estará geralmente compreendida entre 0,3 e 1,2, de preferência entre 0,8 e 1,2, e mais preferencialmente de 0,95 ± 0,1. 0 fosfato de alumínio estará geralmente amorfo, particularmente para sais de hidroxifosfato. Um adjuvante típico é o hidroxifosfato de alumínio amorfo com razão molar de PO4/AI entre 0,84 e 0,92, incluído em 0,6mg de Al3+/ml. O fosfato de alumínio estará geralmente em partículas (por exemplo do tipo placa com a morfologia observada em micrografias electrónicas de transmissão). Diâmetros típicos das partículas estão na gama de 0,5-20 ym (por exemplo, cerca de 5-10 ym) depois de qualquer adsorção de antigénio. Capacidades adsortivas entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 foram relatadas para adjuvantes de fosfato de alumínio. O ponto de carga zero (PZC) do fosfato de alumínio está inversamente relacionado com o grau de substituição de fosfato por hidroxilo, e este grau de substituição pode 39 variar dependendo das condições de reação e concentração dos reagentes utilizados para preparar o sal por precipitação. 0 PZC também é alterado pela alteração da concentração de iões de fosfato livres na solução (mais fosfato = PZC mais ácido) ou por adição de um tampão tal como um tampão de histidina (torna o PZC mais básico) . Fosfatos de aluminio usados de acordo com a invenção terão geralmente um PZC entre 4,0 e 7,0, mais preferencialmente entre 5,0 e 6,5, por exemplo cerca de 5,7.

As suspensões de sais de aluminio usados para preparar as composições da invenção podem conter um tampão (por exemplo, um fosfato ou histidina ou tampão Tris), mas isso nem sempre é necessário. As suspensões são, de preferência estéreis e isentas de pirogénios. A suspensão pode incluir iões de fosfato aquoso livres, por exemplo, presentes numa concentração entre 1,0 e 20 mM, de preferência entre 5 e 15 mM e mais preferivelmente cerca de 10 mM. As suspensões podem também compreender cloreto de sódio. A invenção pode utilizar uma mistura de hidróxido de aluminio e de fosfato de aluminio, como no DARONRIX™. Neste caso, pode haver mais fosfato do que hidróxido de aluminio, por exemplo uma proporção em peso de pelo menos 2:1, por exemplo á 5:1, á 6:1, á 7:1, á 8:1, ^ 9:1, etc. A concentração de Al+++ numa composição para administração a um paciente é de preferência menor do que lOmg/ml < por exemplo 5 mg/ml, ^ 4 mg/ml, < 3 mg/ml, ^ 2 mg/ml, < 1 mg/ml, etc. Uma gama preferida situa-se entre 0,3 e 1 mg/ml. É preferido um máximo de 0,85mg/dose.

As emulsões adjuvantes óleo-em-água 40

As emulsões óleo-em-água têm sido consideradas particularmente adequadas para utilização no adjuvante de vacinas do virus da gripe. São conhecidas várias emulsões, e que incluem, tipicamente, pelo menos um óleo e pelo menos um agente tensioativo, sendo o óleo (s) e o tensioativo (s) biodegradável (metabolizável) e biocompativel. As goticulas de óleo na emulsão são geralmente inferiores a 5 ym de diâmetro, e podem mesmo ter um diâmetro sub-micrón, com estas pequenas dimensões a serem alcançadas com um microfluidizador para proporcionar emulsões estáveis. Gotas com um tamanho inferior a 220 nm são preferíveis uma vez que podem ser submetidas a uma filtragem de esterilização. A invenção pode ser usada com óleos, tais como aqueles a partir de um animal (tal como peixe) ou de origem vegetal. Fontes de óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos. O óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco e azeite de oliva, os mais comummente disponíveis, exemplificam os óleos de nozes. O óleo de jojoba pode ser utilizado, por exemplo obtido a partir do feijão de jojoba. Os óleos de sementes incluem óleo de cártamo, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de sésamo e semelhantes. No grupo de cereais, óleo de milho é o mais facilmente disponível, mas o óleo de outros grãos de cereais tais como trigo, aveia, centeio, arroz, teff, triticale e similares podem igualmente ser usados. 6-10 ésteres de ácidos gordos de carbono de glicerol e de 1,2-propanodiol, embora não ocorram naturalmente em óleos de sementes, podem ser preparados por hidrólise, separação e esterificação dos materiais adequados a partir dos óleos de nozes e sementes. Gorduras e óleos do leite de mamíferos são metabolizáveis e podem, portanto, ser utilizado na prática desta invenção. Os procedimentos para a separação, 41 purificação, saponificação e outros meios necessários para obtenção de óleos puros de origem animal são bem conhecidos na técnica. Muitos peixes contêm óleos metabolizáveis que podem ser facilmente recuperados. Por exemplo, o óleo de figado de bacalhau, óleo de figado de tubarão e o óleo de baleia como espermacete exemplificam vários óleos de peixe que podem ser usados aqui. Uma série de óleos de cadeia ramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades de isopreno de 5 carbonos e são geralmente referidos como terpenóides. Óleo de figado de tubarão contém terpenóides ramificados, insaturados conhecidos como esqualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaene, que é aqui particularmente preferido. O esqualano, o análogo saturado de esqualeno, também é um óleo preferido. Os óleos de peixe, incluindo esqualeno e esqualano, estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodos conhecidos na técnica. Outros óleos preferidos são os tocoferóis (ver abaixo). As misturas de óleos podem ser usadas.

Os tensioativos podem ser classificados pelo seu "HLB" (equilíbrio hidrófilo/lipófilo). Tensioativos preferidos da invenção têm um HLB de pelo menos 10, de preferência pelo menos 15, e mais preferencialmente de pelo menos 16. A invenção pode ser utilizada com tensioativos incluindo, mas não limitado a: os tensioctivos de ésteres de polioxietileno sorbitano (vulgarmente referidos como Tweens), especialmente o polisorbato 20 e o polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) , e/ou óxido de butileno (BO) , vendidos sob o nome comercial DOWFAX™, tal como copolímeros lineares EO/PO em bloco; octoxinóis, que podem variar no número de repetição dos grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) , com o octoxinol-9 (Triton X-100, ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de 42 particular interesse; (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipidos tais como a fosfatidilcolina (lecitina), etoxilatos de nonilfenol, tais como as séries de Tergitol™ NP; éteres gordos de polioxietileno derivados de álcoois de lauril, cetil, estearil e oleil (conhecidos como tensioativos Brij), tais como éter de trietilenoglicol monolauril (Brij 30) e ésteres de sorbitano (comummente conhecidos como SPANs), tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. São preferidos os tensioativos não iónicos. Os tensioativos preferidos para inclusão na emulsão são o Tween 80 (monoleato polioxietileno de sorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100.

Misturas de tensioativos podem ser utilizadas, por exemplo misturas de Tween 80/Span 85. Uma combinação de um éster de polioxietileno de sorbitano, tais como monooleato de polioxietileno de sorbitano (Tween 80) e um octoxinol, tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) é também adequado. Outra combinação útil compreende laureth 9 mais um éster de polioxietileno de sorbitano e/ou um octoxinol.

As quantidades preferidas de tensioativos (% em peso) são os seguintes: 0,01 a 1% de ésteres de polioxietileno de sorbitano (tal como Tween 80), em particular cerca de 0,1%; 0,001 a 0,1% de polioxietanóis octil-ou nonilfenoxi (como Triton X-100, ou outros detergentes da série de Triton), em particular 0,005-0,02%; 0,1 a 20% de éteres de polioxietileno (tal como laureth 9), de preferência de 0,1 a 10% e em particular 0,1 a 1% ou cerca de 0,5%.

Emulsões adjuvantes água-em-óleo especificas úteis com a invenção incluem, mas não estão limitadas a: 43 • Uma emulsão submicrónica de esqualeno, Tween 80 e Span 85. A composição da emulsão, em volume pode ser de cerca de 5% de esqualeno, cerca de 0,5% de polissorbato 80 e cerca de 0,5% de Span 85. Em termos de peso, essas proporções são de 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 e 0,48% de Span 85. Este adjuvante é conhecido como 'MF59' [130-132], tal como descrito em mais pormenor no capitulo 10 da referência 133 e capitulo 12 da referência 134. A emulsão MF59 inclui vantajosamente iões de de citrato, por exemplo, 10 mM de tampão de citrato de sódio. • Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e Tween 80. A emulsão pode incluir solução salina tamponada com fosfato. Também pode incluir Span 85 (por exemplo, a 1%) e/ou lecitina. Estas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de tocoferol e 0,3-3% de Tween 80, e a proporção de peso de esqualeno: tocoferol é de preferência ^ 1 (por exemplo, 0,90), pois isso proporciona uma emulsão mais estável. O esqualeno e o Tween 80 podem estar presentes na proporção de volume de cerca de 5:02, ou numa proporção em peso de cerca de 11:05. Uma tal emulsão pode ser efectuada por dissolução de Tween 80 em PBS para dar uma solução a 2%, seguida de mistura de 90 ml desta solução, com uma mistura de (5 g de DL-a-tocoferol e 5 mL de esqualeno) , em seguida, microfluidização da mistura. A emulsão resultante pode ter goticulas de óleo submicrométricas por exemplo, com um diâmetro médio de entre 100 e 250 nm, de preferência cerca de 180nm. • Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e um detergente de Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (ver abaixo). A emulsão pode conter um tampão fosfato. • Uma emulsão compreendendo um polisorbato (por exemplo, polissorbato 80), com um detergente de Triton (por exemplo, 44

Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo um a-tocoferol succinato) . A emulsão pode incluir os três componentes numa razão de massa de cerca de 75:11:10 (por exemplo, 750pg/ml de polissorbato 80, 110pg/ml de Triton X-100 e 100pg/ml α-tocoferol succinato), e as concentrações utilizadas devem incluir qualquer contribuição de estes componentes de antigénios. A emulsão pode também incluir esqualeno. A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (ver abaixo). A fase aquosa pode conter um tampão fosfato. • Uma emulsão de esqualano, polisorbato 80 e poloxamer 401 ("Pluronic™ L121"). A emulsão pode ser formulada em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. Esta emulsão é um veiculo útil para a entrega de dipéptidos de muramil, e tem sido utilizada com treonil-MDP no adjuvante "SAF-1" [135] (0,05-1% Thr-MDP, 5% de esqualano, 2,5% de Pluronic L121 e 0,2% de polissorbato 80). Também pode ser utilizada sem o Thr-MDP, como no adjuvante "AF" [136] (5% de esqualano, 1,25% de Pluronic L121 e 0,2% de polissorbato 80). A microfluidização é a preferida. • Uma emulsão compreendendo esqualeno, um solvente aquoso, um éter de alquilo polioxietileno de tensioativo não iónico hidrófilo (por exemplo, éter de polioxietileno (12) cetoestearílico) e um tensioativo não iónico hidrofóbico (por exemplo, um éster de sorbitano ou um éster manide, tal como monoleato de sorbitano ou 'Span 80'). A emulsão é, de preferência termo-reversivel e/ou tem, pelo menos, 90% das goticulas de óleo (por volume) com um tamanho inferior a 200 nm, [137] . A emulsão pode também incluir um ou mais dos seguintes: alditol; um agente crioprotector (por exemplo, um açúcar, tal como dodecilmaltoside e/ou sacarose) e/ou um alquilpoliglicosideo. Essas emulsões podem ser liofilizadas. 45 • Uma emulsão com 0,5-50% de um óleo, 0,1-10% de um fosfolípido, e 0,05-5% de um tensioativo não iónico. Tal como descrito na referência 138, os componentes de fosfolípidos preferidos são a fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatidico, esfingomielina e cardiolipina. Os tamanhos de gotas de submicrón são vantajosos. • Uma emulsão submicrónica água-em-óleo de um óleo não metabolizável (tais como óleo mineral leve) e pelo menos um tensioativo (como lecitina, Tween 80 ou Span 80) . Os aditivos podem ser incluídos, tais como saponina QuilA, colesterol, um conjugado saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito na referência 139, produzido por adição de uma amina alifática a desacilsaponina por meio do grupo carboxilo do ácido glucurónico) , brometo de dimethidioctadecilamónio e/ou N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil) propanodiamina. • Uma emulsão em que uma saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) estão associados como micelas helicoidais [140]. • Uma emulsão compreende um óleo mineral, um álcool gordo etoxilado não iónico lipofílico, e um agente tensioativo hidrófilo não iónico (por exemplo, um álcool gordo etoxilado e/ou um copolímero de bloco de polioxietileno-polioxipropileno) [141]. • Uma emulsão compreende um óleo mineral, um álcool gordo hidrofílico etoxilado não iónico e um agente tensioativo lipofílico não iónico (por exemplo, um álcool gordo etoxilado e/ou um copolímero de bloco de polioxietileno-polioxipropileno) [141]. 46

Emulsões da invenção de óleo em água preferidas compreendem esqualeno.

As emulsões podem ser misturadas com o antigénio extemporaneamente, no momento da entrega. Assim, o adjuvante e o antigénio podem ser mantidos em separado numa vacina embalada ou distribuída, pronta para a formulação final, no momento da utilização. 0 antigénio estará, geralmente, numa forma aquosa, de tal modo que a vacina seja finalmente preparada por mistura de dois líquidos. A razão entre os dois líquidos por volume de mistura pode variar (por exemplo, 5:01-1:05), mas geralmente é de cerca de 1:1. Se o antigénio e a emulsão são armazenadas separadamente no kit de multidose, em seguida, o produto pode ser apresentado como um frasco contendo 2,5 ml de emulsão e um frasco contendo 2,5 ml de antigénio aquoso, por mistura, para dar 5 ml de vacina com adjuvante, por exemplo de 10 x 0,5 ml por dose.

Após o antigénio e o adjuvante serem misturados, o antigénio hemaglutinina geralmente permanece em solução aquosa, mas pode-se distribuir por volta da interface óleo/água. Em geral, pouca ou nenhuma hemaglutinina vai entrar na fase oleosa da emulsão.

Quando uma composição inclui um tocoferol, qualquer um dos tocoferóis α, β, γ, δ, ε ou ξ podem ser usados, mas a-tocoferóis são preferidos. 0 tocoferol pode assumir diversas formas, por exemplo, diferentes sais e/ou isómeros. Sais incluem sais orgânicos, tais como succinato, acetato, nicotinato, etc. D-a-tocoferol e DL-a-tocoferol 47 podem ambos ser usados. Os tocoferóis são vantajosamente incluído nas vacinas para uso em pacientes idosos (por exemplo, com 60 anos ou mais) , porque a vitamina E foi reportada ter um efeito positivo sobre a resposta imune neste grupo de pacientes [142] . Eles também têm propriedades antioxidantes que podem ajudar a estabilizar as emulsões [143]. Um α-tocoferol preferido é DL-a-tocoferol, e o sal preferido deste tocoferol é o succinato. 0 sal de succinato foi encontrado cooperar com ligandos relacionados com TNF, in vivo. Além disso, o cx-tocoferol succinato é conhecido por ser compatível com as vacinas da gripe e um conservante para ser útil como uma alternativa aos compostos de mercúrio [13] .

Oligonucleotideos Imunoestimuladores

Oligonucleotídeos imunoestimuladores podem incluir modificações/análogos de nucleotídeos, como modificações osforotioato e podem ser de cadeia dupla ou (exceto para o ARN) de cadeia simples. As referências 144, 145 e 146 divulgam as substituições análogas possíveis, por exemplo a substituição de guanosina com 2'-desoxi-7-deazaguanosina. O efeito adjuvante de oligonucleidos CpG é mais discutido nas referências 147-152. Uma sequência de CpG pode ser dirigida para TLR9, tal como o motivo GTCGTT ou TTCGTT [153] . A sequência de CpG pode ser específica para a indução de uma resposta imune Thl, tal como um CpG-A ODN (oligodesoxinucleótido), ou pode ser mais específico para a indução de uma resposta de células B, como um CpG-B ODN. CpG-A e CpG-B ODNs são discutidos nas referências 154-156.

De preferência, o CpG é um CpG-A ODN. De preferência, o oligonucleótido CpG é construído de modo a que a extremidade 5' se j a acessível para o reconhecimento do receptor. Opcionalmente, duas sequências de oligonucleidos CpG podem estar ligadas nas suas extremidades 3' para 48 formar "imunómeros". Veja, por exemplo, as referências 153 e 157-159. Um adjuvante CpG útil é CpG7909, também conhecido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.).

Como uma alternativa, ou adicionalmente, à utilização de sequências CpG, podem ser usadas as sequências TPG [160] . Estes oligonucleótideos podem estar livres de motivos de CpG não metilados. O oligonucleótido imunoestimulante pode ser rico em pirimidina. Por exemplo, pode compreender mais do que um nucleótido de timidina consecutivo (por exemplo, TTTT, conforme descrito na referência 160), e/ou pode ter uma composição de nucleótideos com >25% de timidina (por exemplo >35%,> 40%,> 50 %,> 60%,> 80%, etc.) Por exemplo, pode compreender mais do que um nucleótideo de citosina consecutivo (por exemplo, CCCC, conforme descrito na referência 160), e/ou pode ter uma composição de nucleótideos com > 25 % citosina (por exemplo, > 35%, > 40%, > 50%,> 60%,> 80%, etc.) Estes oligonucleótideos podem estar livres de motivos de CpG não metilados.

Oligonucleótidos imunoestimulantes compreenderão, tipicamente, pelo menos, 20 nucleótideos. Podem compreender menos de 100 nucleótideos.

Um adjuvante particularmente baseado em oligonucleótidos imunoestimulantes é conhecido como IC31™ [161]. Assim, um adjuvante usado com ao invenção pode compreender uma mistura de (i) um oligonucleótideo (por exemplo, entre os nucleótideos 15-40), incluindo pelo menos um (e de preferência, múltiplos) motivos CPI, e (ii) um polímero policatiónico, tal como um oligopéptideo (por exemplo, 49 entre 5-20 aminoácidos) , incluindo pelo menos uma (e de preferência, múltiplas) sequência tripeptidica Lys-Arg-Lys (s) . O oligonucleótido pode ser um desoxinucleótido compreendendo a sequência 26-mero 5' (IC) 13—3' (SEQ ID N° : 14) . O polímero policatiónico pode ser um péptido que compreende a sequência de aminoácidos 11-mer KLKLLLLLKLK (SEQ ID N°: 15). Lípido A monofosforil 3 des-O-acilado 3dMPL (também conhecida como lípido A monofosforil 3 des-O-acilado ou o lípido A 3-0-desacilo-4'-monofosforil é um adjuvante em que a posição 3 da extremidade redutora da glucosamina no lípido A monofosforil foi de-acilado. 3dMPL foi preparado a partir de um mutante sem heptose de Salmonella minnesota, e é quimicamente similar ao lípido A, mas não tem um grupo fosforilo ácido-lábil e um grupo acilo de base-lábil. Ele ativa as células da linhagem monócito/macrófago e estimula a libertação de várias citocinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-α e GM-CSF (ver também a referência 162). A preparação de 3dMPL foi originalmente descrita na referência 163. 3dMPL pode assumir a forma de uma mistura de moléculas relacionadas, que variam pela sua acilação (por exemplo, tendo 3, 4, 5 ou 6 cadeias de acilo, que podem ser de comprimentos diferentes). Os dois monossacarídeos de glucosaminas (também conhecidos como 2-desoxi-2-amino-glicose) são N-acilados nos seus carbonos na posição 2 (ou seja, nas posições 2 e 2'), e também existe O-acilação na posição 3'. O grupo ligado ao carbono 2 tem a fórmula -NH-CO-CH2-CR1R1'. O grupo ligado ao carbono 2' tem a fórmula -NH-CO-CH2-CR2R2'. O grupo ligado ao carbono 3' tem a fórmula-0-C0-CH2CR3R3'. A estrutura representativa é: 50

Os grupos R1, R2 e R3 são cada um, independentemente -(CH2)n-CH3. 0 valor de n é de preferência entre 8 e 16, mais preferencialmente entre 9 e 12, e é mais preferencialmente de 10.

Os grupos R1', R2' e R3' podem ser cada um, independentemente: (a)-H; (b)-OH, ou (c)-O-CO-R4, em que R4 seja -H ou - CH2)m-CH3, em que o valor de m é de preferência entre 8 e 16, e é mais preferencialmente 10, 12 ou 14. Na posição 2, m é de preferência 14. Na posição 2' m é de preferência 10. Na posição 3' m é de preferência 12. Os grupos R1', R2' e R3'são, portanto, de preferência grupos-O-acilo de ácido dodecanóico, ácido tetradecanóico ou ácido hexadecanóico.

Quando todos os R1', R2' e R3’ são -H, então o 3dMPL possui apenas 3 cadeias acilo (uma em cada uma das posições 2, 2' e 3') . Quando somente dois de R1 , R2 e R3 são -H, então o 3dMPL pode ter 4 cadeias acilo. Quando apenas um de R1 , R2' e R3' são -H, então o 3dMPL pode ter 5 cadeias acilo. Quando nenhum de R1', R2' e R3' são -H, então o 3dMPL pode ter 6 cadeias acilo. O adjuvante 3dMPL utilizado de acordo com a invenção pode ser uma mistura dessas formas, com de 3 a 6 cadeias acilo, mas é preferível incluir o 3dMPL com 6 51 cadeias acil na mistura, e em particular para assegurar que a forma de cadeia hexaacil faz, pelo menos, 10% em peso do total de 3dMPL h por exemplo 20%, 30% h, ^ 40%, ^ 50% ou mais. 3dMPL com 6 cadeias acilo foi encontrado para ser a forma mais ativa de adjuvante.

Assim, a forma mais preferida de 3dMPL para inclusão nas composições da invenção é a seguinte:

Onde 3dMPL é utilizado sob a forma de uma mistura, em que as referências a quantidades ou concentrações de 3dMPL, em composições da invenção referem-se às espécies de 3dMPL combinadas na mistura.

Em condições aquosas, 3dMPL pode formar agregados micelares ou particulas com tamanhos diferentes, por exemplo com um 52 diâmetro <150 nm ou> 500 nm. Qualquer um ou ambos podem ser utilizados com a invenção, e as melhores partículas podem ser selecionadas por ensaio de rotina. As partículas mais pequenas (por exemplo, pequenas o suficiente para dar uma suspensão aquosa clara de 3dMPL) são preferidas para utilização de acordo com a invenção, por causa da sua atividade elevada [164]. Partículas preferidas possuem um diâmetro médio inferior a 220 nm, mais preferencialmente inferior a 200 nm ou inferior a 150 nm ou inferior a 120 nm, e podem mesmo ter um diâmetro médio inferior a 100 nm. Na maioria dos casos, porém, o diâmetro médio não será inferior a 50nm. Essas partículas são suficientemente pequenas para serem adequadas para esterilização por filtração. O diâmetro de partícula pode ser avaliado por meio da técnica de rotina de espalhamento de luz dinâmica, o que revela um diâmetro médio da partícula. Quando uma partícula é dita ter um diâmetro de x nm, geralmente haverá uma distribuição de partículas sobre este significativo, mas pelo menos 50% em número (por exemplo, A 60%, A 70%, h 80%, > 90%, ou mais) das partículas terá um diâmetro dentro do intervalo x ± 25%. O 3dMPL pode ser vantajosamente utilizada em combinação com uma emulsão de óleo em água. Substancialmente todo o 3dMPL pode estar localizado na fase aquosa da emulsão. O 3DMPL pode ser usado sozinho, ou em combinação com um ou mais compostos adicionais. Por exemplo, é conhecida a utilização de 3dMPL, em combinação com a saponina QS21 [165] (incluindo, em uma emulsão de óleo-em-água [166]), com um oligonucleótido imunoestimulante, tanto com QS21 e um oligonucleótido imunoestimulador, como com fosfato de 53 alumínio [167], com hidróxido de alumínio [168], ou com ambos os fosfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

Composições farmacêuticas

As composições da invenção são farmaceuticamente aceitáveis e estão tipicamente na forma aquosa. Podem incluir componentes para além do antigénio (e, se for caso disso, o adjuvante) por exemplo, que incluem tipicamente um ou mais veículo farmacêutico (s) e/ou excipiente (s). Uma discussão aprofundada dos componentes está disponível na referência 169. A composição pode incluir conservantes como o tiomersal (por exemplo, em 10pg/ml) ou 2-fenoxietanol. É preferido, no entanto, que a vacina deva estar substancialmente isenta de (ou seja, menos do que 5pg/ml) de material mercurial, por exemplo, livre de tiomersal [13,170]. As vacinas que não contêm mercúrio são as mais preferidas. Vacinas isenta de conservantes são particularmente preferidas.

Para controlar a tonicidade, é preferível incluir um sal fisiológico, tais como um sal de sódio. O cloreto de sódio (NaCl) é o preferido, que pode estar presente em entre 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, fosfato de potássio dibásico, fosfato dissódico desidratado, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.

As composições terão geralmente uma osmolaridade entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, de preferência entre 240-360 mOsm/kg, e mais preferencialmente irá cair dentro do intervalo de 290-310 mOsm/kg. A osmolaridade foi relatada 54 anteriormente como não tendo um impacto sobre a dor causada pela vacinação [171], mas manter a osmolalidade nesse intervalo, no entanto, é o preferido.

As composições podem incluir um ou mais tampões. Tampões típicos incluem: tampão fosfato; tampão de Tris; tampão de borato; tampão de succinato; tampão de histidina (em particular com um adjuvante de hidróxido de alumínio); ou tampão citrato. Os tampões estarão tipicamente incluídos na gama de 5-20mM. 0 pH da composição varia geralmente entre 5,0 e 8,1, e mais tipicamente entre 6,0 e 8,0, por exemplo entre 6,5 e 7,5, entre 7,0 e 7,8. Um processo pode, portanto, incluir um passo de ajuste do pH da vacina antes da embalagem a granel. A composição é de preferência estéril. A composição é, de preferência por exemplo, não-pirogénica, contendo <1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e de preferência <0,1 EU por dose. A composição é de preferência sem glúten. A composição pode incluir material para uma única imunização, ou pode incluir material para imunizações múltiplas (ou seja, um kit "multidose" por exemplo, para 10 doses). A inclusão de um conservante é preferida em regime de multidose. Como uma alternativa (ou em adição) a incluir um conservante em composições multidose, as composições podem estar contidas num recipiente que tem um adaptador de enchimento asséptico para a remoção de material. 55

As vacinas da gripe são tipicamente administradas num volume de dosagem de cerca de 0,5 ml, apesar de uma meia dose (isto é, cerca de 0,25 ml) pode ser administrada, por exemplo, a crianças (por exemplo até 36 meses de idade).

As composições e os kits são preferencialmente armazenados entre 2°C e 8°C. Eles não devem ser congelados. Eles devem, idealmente, ser mantidos fora da luz direta.

Kits

Os kits podem conter mais do que uma composição da invenção, por exemplo, uma composição de iniciação e uma composição de reforço. Os dois componentes do kit serão mantidos separadamente, uma vez que são administrados a um doente em tempos substancialmente diferentes.

Cada vacina individual num kit pode ser preparada para utilização, ou pode estar pronta para a preparação extemporânea no momento da entrega. Este arranjo extemporâneo permite que o adjuvante e o antigénio possam ser mantidos separadamente até ao momento da utilização, o que é particularmente útil quando se usa um adjuvante de emulsão água-em-óleo.

Quando uma vacina é preparada extemporaneamente, os seus componentes são fisicamente separados uma da outra dentro do kit, e esta separação pode ser conseguida de várias maneiras. Por exemplo, os dois componentes podem estar em dois recipientes separados, tais como frascos, por exemplo um frasco de antigénio e um frasco de emulsão. O conteúdo dos dois frascos pode ser, em seguida, por exemplo, misturado com a remoção do conteúdo de um frasco e 56 adicionando-o ao outro frasco, ou por remoção separadamente do conteúdo de ambos os frascos e sua mistura num terceiro recipiente. Numa disposição preferida, um dos componentes do kit é uma seringa e o outro é um recipiente tal como um frasco. A seringa pode ser utilizada (por exemplo, com uma agulha) para inserir o seu conteúdo no segundo recipiente para mistura, e a mistura pode então ser retirada para a seringa. Os conteúdos misturados da seringa podem, então, ser administrados a um doente, tipicamente por meio de uma nova agulha estéril. A embalagem de um componente numa seringa elimina a necessidade de utilização de uma seringa separada para a administração ao paciente.

Numa outra disposição preferida, os dois componentes de uma vacina são mantidos em conjunto, mas separados, na mesma seringa, por exemplo, uma seringa de câmara dupla, tais como as descritas nas referências 172-179 etc. Quando a seringa é acionada (por exemplo, durante a administração a um paciente) em seguida, os conteúdos das duas câmaras são misturados. Este arranjo evita a necessidade de um passo de mistura em separado no momento da utilização.

Quando uma vacina é preparada extemporaneamente, os seus componentes estarão geralmente em forma aquosa. Em algumas modalidades, um componente (tipicamente o componente antigénio em vez do componente adjuvante) é na forma seca (por exemplo, numa forma liofilizada), estando o outro componente na forma aquosa. Os dois componentes podem ser misturados de modo a reativar o componente seco e dar uma composição aquosa para administração a um paciente. Um componente liofilizado irá tipicamente estar localizado dentro de um frasco, em vez de na seringa. Componentes secos podem incluir estabilizantes, tais como lactose, 57 sacarose ou manitol, bem como suas misturas, por exemplo, misturas de lactose/sacarose, misturas de sacarose/manitol, etc. Uma disposição possivel utiliza um componente adjuvante aquoso numa seringa pré-cheia, e um componente antigénio liofilizado num frasco.

Embalagem de composições ou componentes do kit

Os recipientes adequados para as composições da invenção (ou dos componentes do kit) incluem frascos, seringas (por exemplo, seringas descartáveis), sprays nasais, etc. Estes recipientes devem ser estéreis.

Sempre que uma composição/componente está localizado num frasco, o frasco é de preferência feito de vidro ou de material plástico. 0 frasco é preferencialmente esterilizado antes da composição ser adicionada. Para evitar problemas com pacientes sensíveis ao látex, os frascos são preferencialmente selados com uma rolha sem látex, e é preferível a ausência de látex em todo o material de embalagem. 0 frasco pode incluir uma dose única de vacina, ou pode incluir mais de uma dose (um frasco de 'multidose'), por exemplo, 10 doses. Os frascos preferidos são feitos de vidro incolor. O frasco pode ter uma tampa (por exemplo, um cone Luer) adaptada de tal forma que uma seringa pré-cheia pode ser inserida na tampa, o conteúdo da seringa pode ser expelido no frasco (por exemplo, para reconstituir o material liofilizado), e os conteúdos do frasco pode ser removidos de volta para a seringa. Após a remoção da seringa do frasco, uma agulha pode então ser ligada e a composição pode ser administrada a um paciente. A tampa está de preferência localizada dentro de um selo ou cobertura, de 58 tal modo que o selo ou cobertura tenha que ser removido antes da tampa possa ser acedida. Um frasco pode ter uma tampa que permite a remoção asséptica do seu conteúdo, particularmente para frascos de múltiplas doses.

Sempre que uma composição/componente é embalado dentro de uma serinqa, a seringa pode ter uma agulha ligada a ela. Se uma agulha não está encaixada, pode ser fornecida com a seringa uma agulha separada para a montagem e utilização. Essa agulha pode ser revestida. São preferidas as agulhas de segurança. Agulhas de 1 polegada de calibre 23, de 1 polegada de calibre 25 e de 5/8 de polegada de calibre 25 são típicas. As seringas podem ser fornecidas com rótulos destacáveis em que o número de lote, estação da gripe e data de validade do conteúdo pode ser impresso, para facilitar a manutenção de registos. 0 êmbolo da seringa tem de preferência um batente para impedir que o êmbolo seja acidentalmente removido durante a aspiração. As seringas podem ter uma tampa e/ou êmbolo de borracha. As seringas descartáveis contêm uma dose única de vacina. A seringa ter geralmente uma tampa de ponta para selar a ponta antes da fixação de uma agulha, e a tampa da ponta é de preferência feito de uma borracha de butilo. Se a seringa e agulha são então embaladas separadamente a agulha está de preferência equipada com um retentor de borracha butílica. Seringas preferidas são aquelas comercializadas sob o nome comercial "Tip-Lok"™. A borracha butílica é também um material adequado para as rolhas dos frascos de doses múltiplas, por exemplo em kits.

Os contentores podem ser marcados para mostrar um volume de meia dose, por exemplo, para facilitar a administração a 59 crianças. Por exemplo, uma seringa que contém uma dose de 0,5 ml pode ter uma marca que mostra um volume de 0,25 ml.

Se for utilizado um recipiente de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco), então é preferível utilizar um recipiente feito de um vidro de borossilicato em vez de um vidro de cal de soda.

Um kit ou a composição pode ser embalado (por exemplo, na mesma caixa) com um folheto incluindo detalhes das vacinas por exemplo, instruções para a administração, informações sobre os antígenos incluídos na vacina, etc. As instruções também podem conter advertências por exemplo, para manter uma solução de adrenalina prontamente disponível em caso de reação anafilática após a vacinação, etc.

Administração da vacina

As composições da invenção são adequadas para administração a pacientes humanos A resposta imune levantada de acordo com a invenção geralmente inclui uma resposta de anticorpos, de preferência, uma resposta de anticorpos protetora. Os métodos para avaliar as respostas dos anticorpos, a capacidade de neutralização e proteção após a vacinação com vírus são bem conhecidos na técnica. Estudos em humanos têm mostrado que os títulos de anticorpos contra a hemaglutinina do vírus da gripe humano estão correlacionados com a proteção (de uma amostra de título de soro de inibição da hemaglutinação de cerca de 30-40 a cerca de 50% proporciona proteção contra a infecção por um vírus homólogo) [180] . As respostas de anticorpos são 60 tipicamente medidas pela inibição da hemaglutinação, por microneutralização, por imunodifusão radial simples (SRID) e/ou pela hemólise radial simples (SRH). Estas técnicas de ensaio são bem conhecidas na técnica.

As composições da invenção podem ser administradas de várias maneiras. A rota de imunização mais preferida é através de injeção intramuscular (por exemplo, no braço ou na perna), mas outras rotas disponíveis incluem injeção subcutânea, intranasal [181-183], oral [184], intradérmica [185,186], transcutânea, transdérmica [187], etc.

As vacinas da invenção podem ser usadas tanto para tratar tanto as crianças como os adultos. Vacinas contra a gripe são atualmente recomendadas para uso em imunização pediátrica e adulta, a partir da idade de 6 meses. Assim, o paciente pode ser inferior a 1 ano de idade, 1-5 anos, 5-15 anos, 15-55 anos, ou pelo menos 55 anos de idade. Pacientes preferidos para receber as vacinas são os idosos (por exemplo, á 50 anos, á 60 anos, de preferência ^ 65 anos), os jovens (e.g. ^ 5 anos), os pacientes hospitalizados, trabalhadores da saúde, serviço armado e militares, mulheres grávidas, doentes crónicos, imunodeprimidos, pacientes que tomaram um composto antiviral (por exemplo, um composto de oseltamivir ou zanamivir, veja abaixo) nos 7 dias antes de receber a vacina, pessoas com alergias ao ovo e pessoas que viajam para o exterior. No entanto as vacinas não são adequadas apenas para estes grupos e podem ser utilizadas mais geralmente na população. Para as estirpes pandémicas, é preferida a administração a todos os grupos etários. 61

As composições preferidas da invenção satisfazem 1, 2 ou 3 dos critérios para a eficácia CPMP. Em adultos (18-60 anos), estes critérios são: (1) á 70% de seroproteção, (2) á 40% de soroconversão e/ou (3) um aumento GMT de á 2,5 vezes. Em idosos (> 60 anos), estes critérios são: (1) > 60% de seroproteção, (2) > 30% de soroconversão e/ou (3) um aumento GMT de A 2 vezes. Estes critérios são baseados em estudos abertos com pelo menos 50 pacientes.

Em formas de realização da invenção iniciação-reforço, um paciente for submetido a um calendário de dose múltipla. Num calendário de dose múltipla as várias doses podem ser administradas pela mesma via ou por vias diferentes, por exemplo, uma iniciação parentérica e um reforço mucosal, um uma iniciação mucosal e um reforço parentérico, etc. Doses múltiplas serão tipicamente administradas com pelo menos 1 semana de intervalo (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas, etc.).

Sempre que a invenção envolve imunizar (reforço), um paciente que tenha sido previamente imunizado contra um diferente clade H5, a dose de reforço pode ser administrada vários meses após a dose anterior, por exemplo, pelo menos, 6 meses, 9 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 36 meses, 48 meses, 60 meses ou mais.

Em concretizações em que a composição inclui um HA de mais de um clade do virus H5 da gripe A, esta composição pode ser administrada por uma única dose ou em dose múltipla. A administração de mais de uma dose (geralmente duas doses) é particularmente útil em pacientes imunologicamente fracos 62 por exemplo, para pessoas que nunca tenham recebido uma vacina da gripe antes, ou para a vacinação contra um novo subtipo de HA como H5. Como acima, doses múltiplas serão tipicamente administradas com pelo menos 1 semana de intervalo (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de oito semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

As composições da invenção podem ser administradas a pacientes substancialmente ao mesmo tempo que (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou de visita a um profissional de saúde ou centro de vacinação) com outras vacinas, por exemplo, substancialmente, ao mesmo tempo que uma vacina contra o sarampo, uma vacina da papeira, um vacina da rubéola, uma vacina MMR, uma vacina da varicela, uma vacina de MMRV, uma vacina de difteria, uma vacina do tétano, uma vacina contra a tosse convulsa, uma vacina DTP, uma vacina conjugada de gripe do tipo b, uma vacina de poliovirus inativado, uma vacina de virus da hepatite B, uma vacina meningocócica conjugada (tal como uma vacina de AC-W135-Y tetravalente) , uma vacina de virus sincicial respiratório, uma vacina conjugada pneumocócica, etc. A administração substancialmente ao mesmo tempo que uma vacina pneumocócica ou uma vacina meningocócica é particularmente útil em pacientes idosos.

Da mesma forma, as composições da invenção podem ser administradas a pacientes substancialmente ao mesmo tempo que (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou de visita a um profissional de saúde) um composto antiviral, e em particular um composto antiviral ativo contra o virus da gripe A (por exemplo o oseltamivir e/ou zanamivir). Estes 63 antivirais incluem inibidores da neuraminidase, como por exemplo um ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclo-hexeno-l-carboxílico ou ácido 5-(actilamino)-4-[(aminonoiminoetil)-amino]2, 6-anidro-3,4,5-trideoxi-D-glicero-D-galactonon-e-enonico, incluindo ésteres (por exemplo, os ésteres etilicos) e os seus sais (por exemplo, os sais de fosfato). Um antivirico preferido é o ácido (3R,4R,SS)-4-acetilamino-5-amino-3 (1-etilpropoxi)-1-ciclo-hexeno-l-carboxílico, éster etílico, fosfato (1:1), também conhecido como fosfato de seltamivir (Tamiflu™).

Geral 0 termo "que compreende" engloba "incluindo" bem como "consistindo" por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo X + Y. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente" por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Sempre que necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omissa da definição da invenção. 0 termo "sobre" em relação a um valor numérico de x significa, por exemplo, x ± 10%. A menos que especificado em contrário, um processo que compreende uma etapa de mistura de dois ou mais componentes não requer nenhuma ordem específica da mistura. Assim, os componentes podem ser misturados em qualquer ordem. Quando existem três componentes então dois componentes podem ser combinados um com o outro, e, em seguida, a combinação pode ser combinada com o terceiro componente, etc. 64

Onde materiais animais (e particularmente de bovinos) são utilizados na cultura de células, eles devem ser obtidos de fontes que sejam livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), e em particular livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE). Em geral, prefere-se a cultura de células na ausência total de materiais derivados de animais.

Quando um composto é administrado ao organismo, como parte de uma composição, em seguida, esse composto pode, alternativamente, ser substituído por um pró-fármaco adequado.

Quando um substrato de células é utilizada para o rearranjo ou procedimentos de genética inversa, é de preferência um que tenha sido aprovado para uso na produção de vacina humana como, por exemplo, em Ph Eur capítulo geral 5.2.3.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras 1 e 2 mostram as árvores filogenéticas de estirpes H5, feitas a partir das referências 3 e 189.

MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Estudo humano I

Os pacientes foram imunizados com uma vacina preparada a partir da estirpe da gripe H5N3 A/duck/Singapore/1997 (clade 0) . A vacina foi sem adjuvante (grupo 2) ou foi adjuvada com a emulsão de óleo-em-água MF59 (grupo 1). Um 65 terceiro grupo de pacientes (grupo 3) não recebeu a vacina H5N3 .

Numa estação de gripe mais tardia (depois de pelo menos 6 anos mais tarde), os pacientes foram imunizados com uma vacina contra a gripe preparada a partir de uma estirpe H5N1 (A/Vietnam/1194/2004 clade = 1; o clade 2 também pode ser utilizado). Duas doses foram administradas, nos dias 0 e 21, ambas contendo 7.5pg de hemaglutinina e adjuvante MF59. Anticorpos pré e pós-vacinação para virus H5 antigenicamente diferentes foram medidos por inibição da hemaglutinação (HAI), anticorpo neutralizante (MN) e hemólise radial simples (HRS).

Os resultados são apresentados na Tabela I. Em resumo, os pacientes que tinham sido previamente imunizados pela vacina de clade 0 mostraram uma resposta imune mais rápida e melhor contra o novo clade do que os doentes não- primários. Dentro do grupo primário, os pacientes que receberam uma dose inicial de adjuvante mostraram uma resposta imune melhor do que os pacientes que receberam uma dose inicial sem adjuvante. A média geométrica de títulos de anticorpos e sero-respostas foram significativamente maiores em indivíduos vacinados do que nos indivíduos não imunizados. Ao dia 7, após uma dose de vacina, á 80% dos pacientes do grupo 1 tinham atingido os títulos seroprotctores de HAI de h 1:40 para todos os clades 1, 2.1, 2.2, 2.3 e as variantes do vírus aviário H5 testado, bem como com o original antigeno do clade 0 A/Duck/Singapore/97. Além disso, não havia nenhuma evidência para sugerir que indivíduos vacinados inicialmente tenham respondido ao seu antigeno inicial 66 original, aliviando preocupações sobre "o pecado antigénico original" [190].

Assim, é possível induzir rapidamente as respostas de anticorpos protetores contra diversos vírus da gripe H5N1 após uma dose de vacina em indivíduos previamente preparados de vários anos antes com a vacina preparada a partir de uma estirpe de um diferente clade H5, antigenicamente e geneticamente distante.

Outros detalhes deste estudo clínico, estão disponíveis na referência 191. Como observado nele, os títulos médios geométricos de anticorpos contra uma estirpe de clade I ou uma estirpe de clade 2.2 foram significativamente maiores entre os indivíduos vacinados (grupos 1 e 2) do que entre os sujeitos não imunizados (grupo 0). Do dia 14 em diante, os títulos de anticorpos para ambos os vírus foram significativamente mais elevados no grupo de inicial com adjuvante (grupo 1) do que no grupo de inicial sem adjuvante (grupo 2) . Os maiores títulos foram observados no dia 14 no grupo 1. Não houve relação entre o título pós-vacinação e o número de doses anteriores da vacina H5N3 ou o seu conteúdo de antigénio. Ao dia 7, pelo menos 80% dos pacientes do grupo 1 apresentaram títulos de pelo menos 1:40 para todos os vírus de tipo selvagem testados no ensaio de inibição da hemaglutinação.

Modelagem de propagação pandémica mostra que a redução máxima de transmissão virai é alcançada através da indução de uma resposta dentro de 2 semanas após a eclosão da pandemia. Porque as duas doses da vacina seriam necessárias, a implantação rápida da vacina iria, assim, ser difícil. Este estudo em seres humanos indica, contudo, 67 que os indivíduos com iniciação do antigénio H5 (em particular, o antigénio H5 com adjuvante), induzem uma memória imunológica de longa duração, rapidamente mobilizada após a administração de uma vacina antigenicamente distinta de baixa dosagem (diferente HA do clade de H5).

Em estudos posteriores, as células B de memória com reatividade cruzada para o clade 1 H5N1 A/Vietnam/1194/2004 foram detectadas a frequência comparáveis no sangue de todos os três grupos de pacientes na linha de base. No entanto, três semanas após a primeira dose de reforço, os pacientes do grupo 1, apresentavam um número significativamente maior de células B de memória específicas para o vírus H5N1 do que os grupos 2 e 3, sugerindo que a iniciação com a vacina de H5N3 anterior com adjuvante tinha induzido uma quantidade de células B de memória com maior reatividade cruzada a H5N1. Consistentemente, os pacientes do grupo 1, tiveram respostas de anticorpos mais rápidas e maiores do que os pacientes dos grupos 2 e 3, e os pacientes dos grupos 1 e 2 responderam significativamente melhor e mais rápido do que os pacientes do grupo 3. No 7o dia após uma dose de vacina do clade 1, todos os pacientes do grupo 1 tinham alcançado a soroconversão para vários vírus patogénicos do tipo selvagem antigenicamente distintos dos clades 0, 1, 2.1.3, 2.2 e 2.3.4, enquanto no grupo 2 as taxas de soroconversão comparáveis foram observadas apenas no dia 14. Por outro lado, foram necessárias duas doses de uma vacina do clade 1 para os pacientes do grupo 3 alcançarem 80% das taxas de soroconversão para os vírus do clade 0 e clade 1.

Estudo humano II 68

Pacientes adultos e idosos receberam duas doses de iniciação (dia 0 e dia 21) de uma vacina H5N1 com adjuvante MF59. A estirpe do virus foi A/Vietnam/1194/2004, que é classificada no clade 1. As respostas imunitárias foram avaliadas no dia 43 e todos os três critérios CPMP foram satisfeitos: seroprotecção e seroconversão foram, pelo menos, de 80%, e o aumento de GMT foi de pelo menos cinco vezes.

Cerca de 18 meses após as duas doses de iniciação, até 60 pacientes receberam uma dose adicional de vacina contra H5N1 com adjuvante MF59, mas com base na estirpe A/turkey/Turkey/1/05, que é classificada no clade 2. As amostras de soro são colhidas imediatamente antes desta dose e, em seguida, a 7 e 21 dias mais tarde. A imunogenicidade é avaliada pelos Hl, SRH e MN nas amostras de soro.

Estudos humanos III e IV O ensaio NCT00703053 utiliza uma vacina do clade 1 (A/Vietnam/1203/04) e/ou uma vacina do clade 2 (A/Indonesia/05/05). Adultos sem exposição anterior às estirpes H5 receberam: (a) uma vacina do clade 1 no dia 0 e uma vacina do clade 2 no dia 28; (b) uma vacina do clade 1 no dia 0 e uma vacina do clade 2 no dia 180; ou (c) a combinação de vacinas do clade I e clade 2 nos dias 0 e 28. Controlos adequados também estão incluídos, recebendo apenas uma vacina do clade 1 ou uma vacina do clade 2, mas não de ambos. A dose de antigénio total de cada tempo é 90pg HA, que é ou 90pg partir de uma única estirpe para os grupos (a) e (b), ou a partir 2x45pg de cada estirpe para o grupo (c). O estudo utiliza as vacinas inativadas de subvirião sem adjuvante. O estudo não estará concluído antes de 2010. 69 0 ensaio NCT00680069 envolve a administração de uma dose única de uma vacina do clade 2 (A/Indonesia/05/05) para doentes que receberam previamente uma vacina do clade 1 (A/Vietnam/1203/04) . A dose de antigénio é de 15pg ou de 90pg de uma vacina de subvirião inativada. 0 estudo não estará concluído antes de 2009.

Estudos em Ratos I e II (imunização de ADN; para referência)

Em experiências independentes [192], foram construídos vetores adenovirus que expressam HA de virus A/Vietnam/1203/04 (clade 1) e A/Indonesia/05/05 (clade 2).

Os vectores foram utilizados tanto separadamente como em combinação para imunizar ratinhos BALB/c. A dose total foi de 108 pfu de vectores, com o grupo recebendo uma combinação de 5xl07 pfu de cada vector. Quatro semanas mais tarde os ratos receberam um reforço contendo a mesma construção de vacina (s) e o sangue foi obtido 3 semanas mais tarde para a detecção de anticorpos neutralizantes e anticorpos que inibem a hemaglutinação.

Os ratos vacinados com qualquer um dos vetores sozinho produziu anticorpos que inibem a hemaglutinação e a neutralização, mas nenhuma reatividade cruzada foi detectada. No entanto, os ratos vacinados com ambos os vetores provocaram titulos de anticorpos neutralizantes de proteção contra os virus de ambos os clades.

Num estudo similar [193] os ratos receberam uma combinação de cinco ou dez imunogenes de ADN de hemaglutinina como 70 vetores do plasmídeo de expressão. A primeira combinação de cinco HAs foi das estirpes em clades 0, 2,2 (três estirpes) e 2.5. A segunda combinação de cinco HAs era de estirpes em clades 0, 1, 2.1.3, 2.2 e 2.3.4. A valência 10 era uma combinação destas 10 estirpes. As vacinas induziram anticorpos que neutralizaram as várias estirpes de HPAI H5N1.

As galinhas também foram testadas usando vacinas de ADN de valência 3 deste tipo [193]. As estirpes foram A/Vietnam/1203/04 (clade 1), A/Anhui/1/05 (clade 2.3.4) e A/Indonésia/05/05 (clade 2.1.3). As galinhas ficaram protegidas contra a doença.

Estudo em ratos III

Tal como descrito em detalhe na referência 8, os ratinhos receberam uma vacina bivalente incluindo hemaglutinina H5, a partir das estirpes A/Vietnam/1203/2004 (clade 1) ou A/Indonésia/05/2005 (claeo 2) . Foram testados dois tipos de vacina bivalente: uma baseada em hemaglutinina H5 recombinante e uma baseada em VLPs. Nenhuma vacina incluiu um adjuvante extrínseco, mas, em comparação com as proteínas recombinantes, a VLP pode proporcionar um efeito adjuvante intrínseco devido à sua natureza de partículas. Cada VLP monovalente foi utilizada como controlo. Os antigenos foram expressas em células de inseto Sf9 de bacmids. Os antigénios nas vacinas bivalentes foram misturados a uma proporção em peso de HA de 1:1.

As respostas imunitárias foram avaliadas por ELISA quantitativa e HAI. Todos os ratinhos vacinados com a mistura de VLP bivalente induziram anticorpos HAI contra ambos o virus VietNam/1203/2004 (GMT 115 ± 36) e o virus 71

Indonesia/05/2005 (80 ± 0). Em contraste, apenas 33% dos ratinhos vacinados com uma mistura de proteinas recombinantes sem adjuvante teve um titulo de HAI contra o virus Indonesia/05/2005 (36 ± 12).

As respostas imunes também foram avaliadas num estudo de desafio letal. As estirpes do desafio foram PR8/34 reformuladas das duas estirpes vacinais. Ratos não vacinados que foram desafiados com o virus perderam > 20% do peso original no dia 6 pós-infecção. Os ratinhos vacinados com a mistura bivalente de proteinas recombinantes HA perderam -15% do seu peso corporal original, quando desafiados quer pela estirpe de desafio do clade I ou do clade 2. Os ratos vacinados com os VLPs do clade 1, VLPs do clade 2, ou mistura de VLP e desafiados com o clade 1 do virus não tinham perda de peso e nem sinais clínicos de infecção. Os ratos vacinados com VLPs do clade 1 e desafiados com o vírus do clade 2 não estavam protegidos do desafio, morrendo pelo dia 6 pós-desafio. Os ratinhos vacinados com VLP clade 2 ou a mistura de VLP foram todos protegidos do desafio com o vírus do clade 2.

Assim, os VLPs dos clades 1 e 2 foram ambos imunogénicos em ratos e protegeram contra o desafio com o vírus da estirpe homóloga. A imunogenicidade foi retida caso tenha sido usada uma mistura bivalente das VLPs. Além disso, os ratos que receberam as VLPs bivalentes foram protegidos contra o desafio por os vírus do clade 1 ou clade 2. Conforme relatado na referência 8: "Estes resultados são altamente significativos e demonstram que uma vacina multivalente contra ο H5N1 parece ser uma estratégia plausível para combater a diversidade de clades e subclades da gripe H5N1." 72

Será entendido que a invenção tenha sido descrita por meio apenas de exemplos e modificações podem ser feitas enquanto permanecendo dentro do escopo da invenção. 73

Tabela 1

Medida G 1 G 2 G 3 % de pacientes com o título Hl ^40 no dia 0 0 0 3 no dia 8 75 56 12 no dia 15 90 60 9 no dia 22 75 58 13 no dia 43 75 58 45 % de pacientes com o seroconversão no dia 8 75 56 8 no dia 15 90 60 10 no dia 22 75 58 14 no dia 43 75 58 45 Meios geométricos de Hl no dia 1 4 4 4,9 no dia 8 72 51 5,9 no dia 15 256 79 7,3 no dia 22 112 52 O co no dia 43 95 44 26 Relação relativa de Hl no dia 1 no dia 8 18 13 1,3 no dia 15 6 4 20 1,56 no dia 22 28 13 1,8 no dia 43 24 11 5,9 % de pacientes com o título MN ^80 no dia 0 0 0 0 no dia 8 9 5 1 no dia 15 9 9 1 no dia 22 12 9 1 no dia 43 12 10 5 Meios geométricos do título MN no dia 1 10 10 10 no dia 8 219 151 11 no dia 15 1145 473 12 no dia 22 375 324 12 no dia 43 415 241 33 Relação relativa de MN no dia 1 no dia 8 22 15 1,1 no dia 15 115 47 1,2 no dia 22 37 32 1,2 no dia 43 41 24 3,3 74

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> NOVARTIS AG

<120> VACINAÇÃO COM CLADES MÚLTIPLOS DO VÍRUS H5 DA GRIPE A <130> P049768W0 <140>PCT/I82008/ <141> 2008-11-25 <150> US 61/004334 <151> 2007-11-26 <150> GB 0810305.3 <151> 2008-06-05 <160> 16 <170> SeqWin99, versão 1.02

<210>1 <211>1707 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/Hong Kong/213/03) 85 <400> 1 atggagaaaa attggttacc actgttacac gatggagtga ccaatgtgtg ccagccaatg ttgagcagaa catgaagcct aggaatgtgg aataatacca gcagagcaga ctaaaccaga aggatggagt ggaaatttca atgaaaagtg ataaactcta tatgtgaaat agaagaagaa cagggaatgg gctgcagaca atcattgaca aggagaatag aatgctgaac gtcaagaacc aacggttgtt ggaacgtatg ggagtaaaat agttccctag tcgttacaat tagtgcttct atgcaaacaa atgcccaaga agcctctaat acgaattcat acctctgfcta taaaccattt cattaggggt tatggcttat accaagaaga ctaggctcta gattggtacc tcttctggac ttgctccaga aattggaata gtatgccatt caaacagatt aaaagagagg tagatggttg aagaatccac aaatgaacac agaatttaaa ttctggttct tttacgacaa tcgagttcta actacccgca tggagtcaat cactggcaat gcagaatttg ttttgcaata ctcgacagag catactggaa tttgagagat caatgtgccg cccaggggat tgagaaaatt gagctcagca caaaaagaac tcttttggta tcaaaaccca aaaaatagct aattttaaaa atatgcatac tggtaactgc ccacaatata agtccttgcg attatttgga gtatgggtac tcaaaaggca tcagtttgag caagaagatg catggaaaat ggtccgacta tcacaaatgt gtattcagaa aggaacttac catggtagct catttaa gtcagtcttg caggttgaca aagacacaca tgtagtgtag gaatggtctt ttcaacgact cagatcatcc tgtccatacc aatgcatacc ttgtggggga accacctaca actagatcca ccgaatgatg aaaactgtca aacaccaagt caccctctca actgggctca gctatagcag caccatagca atagatggag gccgttggaa gaagacggat gagagaactc cagcttaggg gataatgaat gaagcaagac caaatactgt ggtctatctt ttaaaagtga caataatgga acgggaagct ctggatggct acatagtgga atgaagaatt ccaaaaattc aaggaaagtc caacaataaa ttcaccatcc tttccgttgg aagtaaacgg caatcaactt agaaagggga gtcaaactcc ccatcgggga gaaatagccc gttttataga atgagcaggg tcaccaataa gggaatttaa tcctagatgt tagactttca ataatgcaaa gtatggaaag taaaaagaga caatttattc tatggatgtg tcagatttgc aaagaacgtt ctgcgatcta cctcggaaac gaaggccaat gaaacaccta ttggtccagt ctcctttttc gaggagctac taatgatgcg gacatcaaca gcaaaatgga cgagagcaat ctcageaatt aatgggggcg atgccccaaa tcaaagagag 9S9âggatgg gagtgggtac ggtcaactcg taacttagaa ctggacttat tgactcaaat ggagctgggt tgtaagaaac ggaaataagt tacagtggcg ctccaatggg 1*0 ieo 130 240 300 3bB 420 430 S4D bQO bbO 720 760 340 *100 **bO 1020 1030 1140 1200 121,0 1320 1330 1440 1500 lSbO lb2Q lb30 1707 <210>2

<211>17,07 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/Indonesia/5/05) <400> 2 atggagaaaa attggttacc actgttacac tagtgcttct atgcaaacaa atgcccaaga tcttgcaata ttcaacagag catactggaa gtcagtcttg caggttgaca aagacacaca ttaaaagtga caatcatgga acgggaagct tcagatttgc aaagaacgtt ctgcgatcta bQ 120 130 86 gatggagtga agcctetaat ttfcaagagat tgtagtgtag ctggatggct cctegggaac 210 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtaccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300

ccaaccaatg acctctgtta cccagggagt ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 3bQ ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt caaatcatcc ccaaaagttc ttggtccgat 4 20 catgaagcct catcaggagt gagctcagca tgtccatacc tgggaagtcc ctcctttttt 430 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaaaagctac 540

aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggaa ttcaccatcc taatgatgcg bOQ

gcagagcaga caaggctata tcaaaaccca accacctata tttccattgg gacatcaaca bbQ ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttctggac aattttaaaa cctaatgatg caatcaactt cgagagtaat 730 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 340

atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 'JQQ

ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 'JbO tatgtgaaat caaacagatt agtccttgca acagggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 agcagaagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1020

cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac UfO gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactca 1200

atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa 12bO aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt ttctagatgt ctggacttat 1320 aatgccgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1330 gttaagaacc tctacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440 aacggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tataagaaac 1500 ggaacgtaca actatccgca gtattcagaa gaagcaagat taaaaagaga ggaaataagt 15b0

ggggtaaaat tggaatcaat aggaacttac caaatactgt caatttattc aacagtggcg lb2Q

agttccctag cactggcaat catgatggct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatgga IbfiO tcgttacaat gcagaatttg catttaa 1707 <210>3 <211>1654

<212>ADN <213> vírus da gripe A (A/Chicken/Hong Kong/SF219/01) <400> 3

agtcttgtta aaagtgatca gatttgcatt ggttaceatg caaacaactc gacagagcag bQ gttgacacaa taatggaaaa gaacgttact gfctacacatg cccaagacat attggaaaag 120

acacacaatg ggaagctctg cgatctagat ggagtgaagc ctctaatttt gagagattgt lâO agtgtagctg gatggctcct cggaaaccca atgtgtgacg aattcatcaa tgtgccggaa 240 tggtcttaca tagtggagaa ggceagtcca gccaatgacc tctgttaccc aggggatttc 300

aacgactatg aagaactgaa acacctattg agcagaataa accattttga gaaaattcag 3bD

atcatcccca aaagttcttg gtccaatcat gaagcctcat caggggtgag ctcagcatgt M2D ccataccttg ggaagtcctc ctttttcaga aatgtggtat ggçttatcaa aaagaacagt 430 acatacccaa caataaagag gagctataat aataccaacc aagaagatct tttggtactg 540

tgggggattc accatcctaa tgatgcggca gagcagacaa agctctatca aaacccaacc bOO

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cctctcacca tcggggaatg ccccaaatat gtgaaatcaa acagattagt ccttgcgact 4bQ ggactcagaa atacccctca aagagagaga agaagaaaaa agagaggact atttggagct 1020 atagcaggtt ttatagaggg aggatggcag ggaatggtag atggttggta tgggtaccac 1030 catagcaatg agcaggggag tggatacgct gcagacaaag aatccactca aaaggcaata 1140 gatggagtta ccaataaggt caactcgatc attgacaaaa tgaacactca gtttgaggcc 1200

gttggaaggg aatttaataa cfctagaaagg agaatagaaa atttaaacaa gaagatggaa 12bQ gacggattcc tagatgtctg gecttataat gctgaacttc tggttctcat ggaaaatgag 1320 agaactctag actttcacga ctcaaatgtc aagaaccttt acgaeaaggt ccgaetacag 1330 cttagggata atgcaaagga.gctgggtaae ggctgtttcg agttctatca caaatgtgat 1440 aatgaatgta tggaaagtgt aaaaaacgga acgtatgact acecgeagta ttcagaagaa 1500

gcaagactaa acagsgagga aataagtgga gtaaaattgg aatcaatggg aacttaccaa 15bQ

atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt tccctageac tggcaatcat ggtagctggt lb2Q ctatctttat ggatgtgcte caatggatcg ttac lb54 87

< 210 > 4 <211>1668 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/chicken/Guiyang/441/2006) <400> 4 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata attggttacc atgcaaacaa ctcgacagtg actgtaacac atgcccaaga catactggaa gatggagtga agcctctaat tttaagagat ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccc ccagccaatg acctctgtta cccaggggat ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt catgaagcct cactaggggt gagctcagca agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aataatacca accaagaaga tcttttagta gcagagcaga taaagcttta tcaaaaccca ctaaaccaga ggttggtacc aacaatagct aggatggagt tcttctggac aattttaaag ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc ataaactcta gtatgccatt ccacaacata tatgtgaaat caaacagatt agtccttgca agaaggagaa aaaagagagg acfcatttgga cagggaatgg tagacggttg gtatgggtac gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atcattaaca aaatgaacac tcagtttgag aggagaatag aaaatttaaa caagaagatg aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gtcaagaacc tttacgacaa agtccgacta aacggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt ggaaegtatg actacccgca gtatteagaa ggagtaaaet tggaatcaat gggaacctac agttccctag cactggeaat catggtagct atcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc caggttgaca cgataatgga aaagaatgtt aagaeacaca atgggaagct ctgcagtcta tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt ttcaacgact acgaagaact gaaacaccta cagatcatcc ccaaaagttc ttggcccaat tgtccatacc tgggggagtc ctcctttttc agttcatacc caacaataaa gaggagctac ttgtggggga tccatcaccc taatgatgcg aacacctata tttccgttgg aacatcaaca actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga ccgaatgata ctatcaattt cgagagtaat aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg caccctctca ccatcgggga atgccccaaa actggactca gaaataccct tcaaagagag gccatagcag gttttattga gggaggatgg caccatagca atgagcaggg gagtggatac atagatggaa tcaccaataa ggtcaactcg gccgttggac gggaatttag taacttagaa gaagacggat tcctagatgt ctggacttat gaaagaactc tagactttca tgactcaaat cagcttaggg ataatgcaaa agagctgggt gatgatgaat gtatggaaag tgtaaaaaac gaagctagac taaacagaga ggagataaat caaatactgt caatttactc aacagtggcg ggtctatctt tatggatg bO ISO 180 240 300 31*0 430 430 S40 (>00 (>{>0 ?30 ?â0 840 <100 1030 1080 1140 1300 131.0 1330 1380 1440 1500 151.0 11.30 1U.8

<210>5 <211>1698 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/duck/Guangxi/1681/2004) <400> 5 88 atggagaaaa attggttacc actgttacac gatggagtga ccaatgtgtg ccagccaatg ttgagcagaa catgaagect aggaatgtgg sataatacca gcagagcaga ctaaaccaga agaatggagt ggaaatttca atgaaaagtg ataaactcta tatgtgaaat ataagaagaa cagggaatgg gctgcagaca atcattgaca aggagaatag aatgctgaac gtcaagaaec aacggttgtt ggaacgtatg ggagtaaaat tagtgcttct atgcaaacaa atgcccaaga agcctctaat atgaattcat acctctgtta taaatcattt catcaggggt tatggcttat gtcaagaaga caaagctcta gatfcggtacc tcttctggac ttgctccaga aattggaata gtatgccafct caagcagatt aaaagagagg tagatggttg aagaatccac aaatgaacac agaatttaaa ttctggttct tttacgacag tcgagtteta actacccgea tggaatcgat tcttgcaate ctcgacagag catactggaa tttgagagat caatgtgccg cccaggagat tgagaaaafct gagctcagca caaaaagaac tcttttggta tcaaaaccca aaaaatagct aattttaaag atafcgcctac tggtaactgc ccacaacata agtccttgcg actatttgga gtatgggtac tcaaaaggca tcaatttgag caaaaagatg catggaaaat ggtccgacta tcacaagtgt gtattcagaa aggaacttac gtcagtcttg caggttgata aagacacaca tgtagtgttg gaatggtctt ttcaacgact cagatcatcc tgtccatacc agtgcatacc ctgtggggga actacctata actagatcca ccgaatgatg aaaattgfcca aacaccaaat caccctctca acagggctca gctatagcag caccatagca atagatggag gccgttggaa gaggacggat gagagaactc cagcttaggg gacaatgaat gaagcaagac caaatattgt ttaaaagtga caataatgga acgggaaact cgggatggct acatagtgga atgaagaact ccaaaagttc aggggaggcc ctacaataaa ttcaccatcc tttcegttgg aagtaaacgg ctatcaactt agaaagggga gtcaaactcc ccatcgggga ggaatagccc gctttataga acgagcaggg tcaccaataa gggaatttaa tcctagatgt tagactttca ataatgcaaa gcatggaaag taaagagaga caatttattc tcagatttgc aaagaatgtt ctgcgatcta cctcggaaac gaaggccagt aaaacaccta ttggtccaat ctcctttttc gaggagctac taatgatgcg aacatcaaca gcagagtgga cgagagtaat ctcagcaatt aatgggggcg atgccccaag tcaaagagag gggaggatgg gagtggatac agtcaattcg taatttagaa ctggacttat tgactcaaat ggagctgggg tgtaagaaac ggaaataagt aacagtggcg

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IbôQ lb4â

<210>6 <211>1707 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/tree sparrow/Henan/4/2004) <40 0> 6 89

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<210>7 <211>1707 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/chicken/Shanxi/2/2006) <400> 7

atggagaaaa tagtgcttet tcttgcaata atcggtcttg ttaaaagtga tcagatttgc bO gttggttacc atgcaaacaa ctcaacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgctcaaga catactggag aagacacaca acgggaagct ctgcgaccta 180 gatggagtga agcctctcat tttgaaagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac 240 cctatgtgtg acgaatttat caatgtgtcg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt 300

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<211>1707 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/Chicken/Henan/12/2004) <400> 8 atggagaaaa attggttacc actgttacac gatggagtga ccaatgtgtg ccagccaatg ttgagcagaa catgaagcct agaaatgtgg aataatacca gcagagcaga ctaaaccaga aggatggagt ggaaatttca atgaaaagtg ataaactcta tatgtgaaat agaagaagaa cagggaatgg gctgcagaca atcattgaca aggagaatag aatgctgaac gtcaagaacc aacggttgtt ggaacgtatg ggagtaaaat agttccctag tcgttacaat tagtgcttct atgcaaacaa atgcccaaga agcctctaat acgaattcat gcctctgtta taaaccattt catcaggggt tatggcttat accaagaaga caaggctcta gattggtacc tcttctggac ttgctccaga aattggaata gtatgccatt caaacagatt aaaagagagg tagatggttg aagaatccác aaatgaacac agaatttaaa ttctggttct tttacgacaa tcgagttcta actacccgca tggaatcaat cactggcaat gcagaatttg tcttgcaata ctcgacagag catactggaa tttgagagat caatgtgccg cccaggggat tgagaaaatt gagctcagca caaaaagaac tcttttggta tcaaaaccca aaaaatagct aattttaaaa atatgcatac tggtaactgc ccacaacata agtccttgcg actatttgga gtatgggtac tcaaaaggca tcagtttgag caagaagatg catggaaaat ggtccgacta tcacaaatgt gtattcagaa aggaacttac catggtagct catttaa gtcagtcttg caggttgaca aagacacaca tgtagtgtag gaatggtctt ttcaacgact cagatcatcc tgcceatacc agtacatacc ctgtggggga accaectata actagatcca ecgaatgatg aaaattgtca aacaccaagt caccctctca actgggctca gctatagcag caccatagca atagatggag gccgttggaa gaagacggat gagagaactc cagcttaggg gataatgaat gaagcaagac caaatactgt ggtctatctt ttaaaagtga teagatttgc caataatgga aaagaacgtt acgggaagct ctgcgatcta ctggatggct cctcggaaac acatagtgga gaaggccagt atgaagaact gaaacsccta ccaaaagttc ttggtccaat agggaaagtc ctcctttttc caacaataaa gaggagctac ttcaccatcc taatgatgeg tttccgttgg aacatcaaca aagtaaacgg gcaaagtgga caatcaactt cgagagtaat agaaagggga ctcagcaatt gtcaaactcc aatgggggca ccatcgggga atgccccaaa gaaatagccc tcaaagagag gttttataga gggaggatgg atgagcaggg gagtggatac tcaccaataa ggtcaaetcg gggaatttaa taacttagaa tcctagatgt ctggacttat tagactttca tgactcaaat ataatgcaaa ggagctgggt gtatggaaag tgtaagaaac taaaaagaga ggaaataagt caatttattc aacagtggcg tatggatgtg ctccaatgga LD 120 180 240 300 3b0 420 480 540 bQQ bbO 720 780 840 100 *?b0 1020 1080 1140 1200 IHbO 1320 1380 1440 1500 ISbO lb2Q lb8Q 1707 <210>9 <211>1695 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/duck/Guangxi/2775/2005) <400> 9 91 atggagaaaa tagtgcttct attggttacc atgcaaacaa actgttacac atgcccaaga gatggggtga agcctctaat ccaatgtgtg acgaattcat ccagceaatg acctctgtta ttgagcagaa taaaccattt catgaagcct catcaggggt agaaatgtgg Catggcttat aataatacca accaagaaga acagagcaga caaagctcta ctaaaccaga gattggtacc aggatggagt tcttctggac tcttgcaata gtcagtcttg ctcgacagag caggttgaca catactggaa aagacacaca tttgagagat tgtagtgtag caatgtaçcg gaatggtctt cccaggcgat ttcaacgatt tgagaaaatt cagatcatcc gagctcagca tgtccatacc caaaaagaac agtgcatacc tcttttggta ctgtggggga tcaaaaccca accacttata aaaaatagct accagatcca aattttaaaa ccgaatgatg ttaaaagtga tcagatttgc caataatgga aaagaacgtt atgggaagct ctgcgaecta ctggatggct cctcgggaac acatagtgga gaaggccagt atgaagaact gaaacaccta ccaaaagttc ttggcccaac tgggaaagcc ctcctttttc caaeaataaa gaggagctac ttcaccatcc taatgatgag tttccgttgg aacatcaaca aagtaaacgg gcaaagtgga caatcaactt cgagagtaat t»0 120 ISO 240 300 3bQ 420 460 S4Q bOO bbO 720 7S0 ggaaatttca ttgctccaga atatgcctac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaaat gtcaaactcc aatgggggcg ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagecc tcaaagggag agaagaagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg cagggaatgg tagatggttg gtacggatac caccatagca atgagcaggg gagtggatac gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt tectagatgt ctggacttat aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagcgaactc tagactttca tgactcaaat gtcaagaaec tttacgacaa ggtccgacta cagctfcaggg ataatgcaaa agagctgggt aacggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gcafcggaaag tgtaagaaac ggaacgtatg actacccgca ttattcagaa gaagcaaggc taaaaagaga ggaaataagt ggagtaaaat tggaatcaat aggaacttac caaatactgt caatttattc aacagtggca agttccctag cgctggcaat catggtagct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatggt tcgttacaat gcaga

<210>10 <211>1707 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/Hong Kong/156/97) <4 0 0> 10 640 400 uq 1020 1060 1140 1200 121.0 1320 1360 1440 1500 ISfeO 1É.20 IbãO lt.45 92 atggaaagaa attggttacc actgttacac aatggagtga cctatgtgtg ccagccaatg ttgagcagaa catgatgcct agaaatgtgg aataatacca gcagagcaga ctgaaccaga agaatggagt ggaaatttca atgaaaagtg ataaactcta tatgtgaaat agaagaagaa cagggaatgg tctgcagaca atcattaaca aggaggatag aatgctgaac gtcaagaacc aatggttgtt ggaacgtatg ggagtaaaat agttccctag tcgttacaat cagtgcttct atgcaaacaa atgcccaaga agcctctcat acgaattcat acctctgtta taaaccattt catcaggggt tatggcttat accaagaaga caaagctcta gattggttcc tcttctggac ttgctccaga aattggaata gtatgccatt caaacagatt tagatggttg aagaatccac aaatgaacac agaatttaaa ttctggttct tttacgacaa ccgaattcta actacccgca tggaatcaat cactggcaat gcagaatttg tcttgcaaca ctcgacagag catactggaa tttgagggat caatgtgccg tccagggaat tgagaeaatt gagctcagca caaaaagaac tcttttggta tcaaaatcca agaaatagct aattttaaag atatgcatac tggtaactgc ccacaacata agtccttgcg actatttgga gtatgggtac tcaaaaggca tcagtttgag caagaagatg catggaaaat ggtccgacta tcacaaatgt gtattcagaa gggaacttac catggtagct catttaa gtcagtcttg caggttgaca aggacacaca tgtagtgtag gaatggtctt ttcaacgact cagatcatce tgtccatacc agtgcatacc ctgtgggggg accacctaca actagaccca ccgaatgatg aaaattgtca aacaccaagt caccccctca actggactca gctatagcag caccatagca atagatggag gccgttggaa gaagacggat gagagaactc cagcttaggg gátaatgaat gaagcaagac caaatactgt ggtctatctt ttaeaagtga caataatgga acgggaagct ctggatggct acatagtgga atgaagaact ccaaaagttc ttgggaggtc caacaataaa ttcaccatcc tttccgttgg aagtaaacgg ccatcaattt agaaagggga gtcaaactcc ccatcgggga gaaatacccc gttttataga atgagcaggg tcaccaataa gggaatttaa tcctagatgt tcgactttca ataatgcaaa gtatggaaag taaacagaga caatttattc tatggatgtg tcagatttgc aaagaatgtt ctgcgatcta cctcggaaac gaaggccagt gaaacaccta ttggtccaat ctcctttttc gaggagctac taatgatgcg aacatcaaca gcaaagtgga cgagagtaat ctcaacaatt aatgggggcg atgccccaaa tcaaagagag gggaggatgg gagttgctac ggtcaactcg taacttggaa ctggacttac tgactcaaat ggagctgggt tgtaaaaaac ggaaataagt aacagtggeg ctccaatgga bQ 120 ião 2*40 300 3b0 >420 *4ÔD SHO bOO bbO 720 760 ego ‘ISO ibO 1020 íaao 11*40 1200 12b0 1320 13SQ 1*4*40 1SQ0 15bQ lb20 IbâO 1707

<210>11 <211>1704 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/Anhui/1/2005) <400> 11 atggagaaaa tagtgcttct attggttacc atgcaaacaa actgttacac atgcccaaga gatggagtga agcctctgat ccaatgtgtg acgaattcat ccagccaatg acctctgtta tcttgcaata gtcagccttg ctcgacagag caggttgaca catactggaa aagacacaca tttaagagat tgtagtgtag caatgtgccg gaatggtctt cccagggaat ttcaacgact ttaaaagtga tcagatttgc caataatgga aaagaacgtt acgggaagct ctgcgatcta ctggatggct cctcggaaac acatagtgga gaaggccaae atgaagaact gaaacaccta bO 120 160 2M0 3DQ 3b0 93 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaafct cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccgat 430 catgaagcct catcaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaacgcc ctcctttttc 4S0 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatacatacc caacaataaa gagaagctac 540 aataatacca accaggaaga tcttttgata ctgtggggga ttcatcattc taatgatgcg 500 gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 550 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggatt tcttctggac aattttaaaa ccgastgatg caatcaactt cgagagtaat 7S0 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatae aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt Ô40 gttaaaagtg aagtggaata tggtaactgc aacacaaagt gtcaaactcc aataggggcg 400 ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 450 tatgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaatagtcc tctaagagaa 1020 agaagaagaa aaagaggact atfctggagct atagcagggt ttatagaggg aggatggcag 1QS0 ggaatggtag atggttggta tgggtaccac catagcaatg agcaggggag tgggtacgct 1140

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gctgaacttc tggttctcat ggaaaatgag agaactctag acttccatga ttcaaatgtc 13SD ggttgtttcg agttctatca caaatgtgat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaacgga 1500 acgtatgact acccgcagta ttcagaagaa gcaagattaa aaagagagga aataagtgga 1550 gtaaaattgg aatcaatagg aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agttgcgagt 1520 tctctagcac tggcaatcat ggtggctggt ctatctttgt ggatgtgctc caatgggtcg 1580 ttacaatgca gaatttgcat ttaa 1704 aagaaccttt acgacaaggt ccgactacag ctfcagggata atgcaaagga gcCgggtaac 1440

<210>12 <211>1707 <212>ADN <213> vírus da gripe A (A/turkey/Turkey/1/05) <4 0 0> 12 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagccttg ttaaaagtga tcagatttgc 50 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtc 120

actgttacac acgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaaact ctgcgatcta ISO gatggagtga agcctctaat tttaagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcgggaac 240 ccaatgtgtg acgaattcct caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaagatcaat 300 ccagccaatg acctctgtta cccagggaat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 350 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtcagat 420 catgaagcct cagcaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaggtc ctcctttttt 4S0 agaaatgtgg tatggcttat caaaaaggac aatgcatacc caacaataaa gagaagttac 540 aataatacca accaagaaga tcttttggta ttgtggggga ttcaccatcc aaatgatgcg 500 gcagagcaga caaggctcta tcaaaaccca actacctata tttccgttgg gacatcaaca 550 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagcc actagatcta aggtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttttggac aattttaaaa ccgaatgatg caataaactt tgagagtaat 7S0 ggaaatttca ttgctccaga aaatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt S40 atgaaaagtg agttggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aataggggcg 400 ataaactcta gtatgccatt ccacaacatc caccctctca ccatcgggga atgccccaaa *150 tatgtgaaat caagcagatt agtccttgct actgggctca gaaatagccc tcaaggagag 1020 agaagaagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 10S0 cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca acgagcaggg gagtgggtac 1140 gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200 atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gctgttggaa gggaatttaa taacttagaa 1250 aggagaatag aaaatttaaa caagaagatg gaagacggat tcctagatgt ctggacttat 1320 aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 13S0 gtcaagaacc tttacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagcttggt 1440 ggaacgtatg actacccgca gtattcagaa gaagcaagat taaaaagaga ggaaataagt 1550 ggagtaaaat tggaatcaat aggaacttac caaatactgt caatttattc aacagtggcg 1520 agctccctag cactggcaat catggtggct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatgga 15S0 tcgttacaat gcagaatttg catttaa 170? aacggttgtt tcgagttcta tcacagatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaac 1500 94

<210>13 <211>8 <212>PRT <213> vírus da gripe A <4 0 0> 13

Arg filu Gly Arg Arg Arg Lys Arg 1 S

<210>14 <211>2 6 <212>ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótideo Adjuvante <22 0>

<221>N <222> 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 <223> N é inosina <400>14 ncncncncnc ncncncncnc ncncnc 26

<210>15 <211>11 <212>PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> adjuvante de péptido policatiónico <4 0 0> 15 95

Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys 1 S 10

<210>16 <211>8 <212>PRT <213> vírus da gripe A <4 0 0> 16

Gly Glu Arg Arg Ang Arg Lys Arg 1 5 96

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica compreendendo o antigénio de hemaglutinina de um primeiro clade do virus H5 da gripe A, para utilização num método para imunizar um sujeito contra o virus da gripe que compreende os passos de (i) administrar ao individuo a composição imunogénica que compreende o antigénio da hemaglutinina do primeiro cladeo do virus H5 da gripe A, e depois (ii) a administração a um sujeito de uma composição imunogénica compreendendo o antigénio de hemaglutinina de um segundo clade do virus H5 da gripe A, em que os primeiro e segundo clades são diferentes uns dos outros, e em que: (a) a composição compreendendo o primeiro antigénio do clade é adjuvada e/ou a composição compreendendo o segundo antigénio do clade é adjuvada; (b) o antigénio a partir do primeiro clade e/ou a partir do segundo clade compreende neuraminidase do virus H5, (c) o primeiro clade não é o clade 0; ou (d) a composição que compreende o primeiro antigénio do clade contém 0,1- 15pg de hemaglutinina do primeiro clade de H5 do virus da gripe A e / ou a composição compreendendo o segundo antigénio do clade contém 0,1-15pg de hemaglutinina do segundo clade do virus da gripe A.
2. Composição imunogénica compreendendo o antigénio de hemaglutinina de um segundo clade do virus H5 da gripe A, para utilização num método para imunizar um sujeito contra o vírus da gripe que compreende os passos de (i) a administração a um sujeito de uma composição imunogénica compreendendo o antigénio de hemaglutinina de um primeiro clade do vírus H5 da gripe A, e depois (ii) a administração ao sujeito de uma composição imunogénica compreendendo o antigénio hemaglutinina do 1 segundo clade do vírus H5 da gripe A, em que os primeiro e segundo clades são diferentes, e em que: (a) a composição que compreende o primeiro antigénio do clade é adjuvada e/ou a composição compreendendo o segundo antigénio do clade é adjuvada; (b) o antigénio a partir do primeiro clade e/ou a partir do segundo clade compreende neuraminidase do vírus H5, (c) o primeiro clade não é o clade 0; ou (d) a composição que compreende o primeiro antigénio do clade contém 0,1- 15pg de hemaglutinina do primeiro clade do vírus H5 da gripe A e/ou a composição compreendendo o segundo antigénio do clade contém 0,1-15pg de hemaglutinina do segundo clade do vírus H5 A da gripe A.
3. Composição imunogénica da reivindicação 1 ou 2, onde: • o primeira clade é o clade 1 e o segundo clade é o clade 2. • o primeiro clade é o clade 2 e o segundo clade é o clade 1. • o primeiro clade é o clade 1 e o segundo clade não é o clade 2. • o primeiro clade é o clade 2 e o segundo clade não é o clade 1.
4. Composição imunogénica de qualquer reivindicação precedente, em que pelo menos uma das composições imunogénicas é um virus virião fragmentado.
5. Composição imunogénica de qualquer reivindicação precedente, em que pelo menos uma das composições imunogénicas inclui neuraminidase do virus da gripe A. 2
6. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, em que a composição que compreende o primeiro antigénio do clade é adjuvada.
7. Composição imunogénica de qualquer reivindicação anterior, em que a composição que compreende o segundo antigénio do clade é adjuvada por exemplo em que a composição que compreende o primeiro antigénio do clade é adjuvada e a composição compreendendo o segundo antigénio do clade é adjuvada.
8. Composição imunogénica que compreende antigénios de hemaglutinina de mais de clade do virus H5 da gripe A.
9. Composição da reivindicação 8, compreendendo hemaglutinina dos clades 1 e 2 do virus H5 da gripe A.
10. Composição da reivindicação 8 ou reivindicação 9, em que a composição é como adjuvada (por exemplo, com uma emulsão submicrónica óleo-em-água).
11. Composição de qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que a composição contém entre 0,1 e 50 ug de hemaglutinina por clade de H5.
12. Composição da reivindicação 11, em que a composição contém 0,l-15pg de hemaglutinina por clade de H5, por exemplo, 7.5pg por clade ou 3.75pg por clade.
13. Composição de qualquer uma das reivindicações 10 a 12, que contém os antigénios de viriões inteiros e um adjuvante de sal de aluminio (por exemplo, um hidróxido de aluminio e/ou um fosfato de aluminio).
14. Composição da reivindicação 13, em que os virus utilizados como fonte de antigénios são cultivados em 3 cultura de células (por exemplo, células Vero) e a composição está isenta de ovalbumina e ovomucóide.
15. Composição de qualquer uma das reivindicações 10 a 12, contendo: antigénio virião fragmentado ou antigénio de superfície purificado e uma emulsão adjuvante submicrónica óleo-em-água.
16. Composição da reivindicação 10 ou reivindicação 15, em que a emulsão compreende esqualeno.
17. Composição da reivindicação 16, em que a composição contém 7.5pg de HA por clade de H5 ou 3.75pg de HA por clade de H5.
18. Composição de qualquer uma das reivindicações 8-17, que é uma composição de vacina de 2 valências. 4