PT2173379E

PT2173379E - Composições e métodos para o tratamento e diagnóstico de cancro

Info

Publication number: PT2173379E
Application number: PT87799342T
Authority: PT
Inventors: Austin Gurney
Original assignee: Oncomed Pharm Inc
Priority date: 2007-07-02
Filing date: 2008-07-02
Publication date: 2015-11-24
Also published as: SI2173379T1; US20090074782A1; US20170296658A1; JP2014144016A; US9040044B2; US20140134177A1; US8628774B2; US9610348B2; AU2008270972A1; ES2553169T5; PL2173379T3; EP3009148B1; AU2008270972B2; US9717794B2; EP2173379B2; ES2694018T3; US8158758B2; EP3424529A1; US20150337050A1; JP2016187356A

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO E DIAGNÓSTICO DE CANCRO ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção A presente invenção refere-se ao campo da oncologia e proporciona composições inovadoras e métodos para o diagnóstico e tratamento do cancro. Em particular, a invenção proporciona os meios e métodos para caracterizar, estudar, diagnosticar, proporcionar um prognóstico, e tratar cancros que compreendem células estaminais cancerosas de tumor sólido. Técnica Antecedente 0 cancro é uma das principais causas de morte no mundo desenvolvido, resultando em mais de 500.000 mortes por ano somente nos Estados Unidos. Mais de um milhão de pessoas são diagnosticadas com cancro nos Estados Unidos cada ano, e é globalmente estimado que mais de 1 em 3 pessoas desenvolverão alguma forma de cancro ao longo da sua vida. Embora existam mais de 200 tipos diferentes de cancro, quatro destes - mama, pulmão, colorretal, e próstata - representam mais de metade dos novos casos totais (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26) . O cancro da mama é o cancro mais comum em mulheres, com um 12% estimado de mulheres em risco de desenvolver a doença ao longo da sua vida. Embora as taxas de mortalidade tenham diminuído devido a deteção mais precoce e tratamentos melhorados, o cancro da mama permanece uma principal causa de morte em mulheres de meia-idade. Além disso, o cancro de mama metastático é ainda uma doença incurável. Na apresentação, a maioria dos pacientes com cancro de mama metastático têm apenas um ou dois sistemas de órgãos afetados, mas à medida que a doença progride, várias zonas vêm-se habitualmente envolvidas. As zonas mais comuns de envolvimento metastático são recorrências loco-regionais na pele e tecidos moles da parede torácica, bem como nas axilas e áreas supraclaviculares. A zona mais comum de metástase distante é o osso (30-40% de metástase distante), seguido de pulmões e fígado. E embora somente aproximadamente 1-5% das mulheres com cancro de mama recentemente diagnosticado tenham metástases distantes no momento do diagnóstico, aproximadamente 50% dos pacientes com doença local eventualmente sofrem recaída com metástases no prazo de cinco anos . Atualmente a sobrevivência média a partir da manifestação de metástases distantes é de cerca de três anos. Métodos atuais de diagnóstico e estadiamento do cancro da mama incluem o sistema de tumor-nódulo-metástase (TNM) que se baseia no tamanho do tumor, presença de tumor nos nódulos linfáticos, e a presença de metástases distantes conforme descrito no American Joint Committee on Cancer: AJCC Cancer Staging Manual. Filadélfia, Pa.: Lippincott-Raven Publishers, 5a ed., 1997, pp 171-180, e em Harris, J R: "Staging of breast carcinoma" in Harris, J. R., Heilman, S., Henderson, I. C., Kinne D. W. (eds.): Breast Diseases. Filadélfia, Lippincott, 1991. Estes parâmetros são utilizados para proporcionar um prognóstico e selecionar uma terapêutica adequada. A aparência morfológica do tumor pode também ser avaliada mas dado que tumores com aparência histopatológica semelhante podem exibir variabilidade clínica significativa, esta abordagem tem limitações sérias. Finalmente, podem ser utilizados ensaios para marcadores de superfície celular para dividir determinados tipos de tumores em subclasses. Por exemplo, um fator considerado no prognóstico e tratamento do cancro da mama é a presença do recetor de estrogénio (ER) já que cancros com ER positivo respondem tipicamente mais prontamente a terapêuticas hormonais tais como tamoxifeno ou inibidores da aromatase que tumores com ER negativo. No entanto estas análises, embora úteis, somente preveem parcialmente o comportamento clínico dos tumores da mama. e existe muita diversidade fenotípica presente nos cancros da mama que as ferramentas de diagnóstico atuais não detetam e as terapêuticas atuais não tratam. 0 cancro da próstata é o cancro mais comum em homens no mundo desenvolvido, representando 33% estimado de todos os novos casos de cancro nos Estados Unidos, e é a segunda causa de morte mais frequente (Jemal et al., 2003, CA Cancer J. Clin. 53:5-26). Desde a introdução do teste sanguíneo para o antigénio específico da próstata (PSA), a deteção precoce do cancro da próstata melhorou dramaticamente as taxas de sobrevivência, e a taxa de sobrevivência a cinco anos para pacientes com cancros da próstata de estádio local e regional no momento do diagnóstico aproxima-se a 100%. Contudo mais de 50% dos pacientes desenvolverão eventualmente doença avançada ou metastática (Muthuramalingam et al. , 2004, Clin. Oncol. 16:505-16).

Atualmente a prostatectomia e a terapêutica por radiação proporcionam tratamento curativo para a maioria dos tumores da próstata localizados. Contudo, as opções terapêuticas são muito limitadas para casos avançados. Para a doença metastática, a ablação de androgénios com agonista da hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH) por si só ou em combinação com anti-androgénios é o tratamento padrão. No entanto apesar do bloqueio máximo de androgénios, a doença quase sempre progride com a maioria desenvolvendo doença independente de androgénios. Atualmente não existe um tratamento uniformemente aceite para o cancro da próstata refratário a hormonas, e são comummente utilizados regimes quimioterapêuticos (Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16:505-16; Trojan et al., 2005, Anticancer Res. 25:551-61). O cancro pulmonar é o cancro mais comum mundialmente, o terceiro cancro mais comummente diagnosticado nos Estados Unidos, e de longe a causa mais frequente de mortes por cancro (Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166:1166-96; Jemal et al., 2003, CA Cancer J. Clin. 53:5-26). Acredita-se que o tabagismo é responsável por um 87% estimado de todos os cancros pulmonar tornando-o a doença evitável mais mortal. O cancro pulmonar é dividido em dois tipos principais que representam mais de 90% de todos os cancros pulmonares: cancro pulmonar de células pequenas (SCLC) e cancro pulmonar de células não pequenas (NSCLC). O SCLC representa 15-20% dos casos e é caracterizado através da sua origem em vias aéreas centrais de grande tamanho e da composição histológica de lâminas de células pequenas com pouco citoplasma. O SCLC é mais agressivo que o NSCLC, crescendo rapidamente e metastizando de forma precoce e frequente. O NSCLC representa 80-85% de todos os casos e é adicionalmente dividido em três principais subtipos com base na histologia: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermoide), e carcinoma indiferenciado de células grandes. O cancro pulmonar apresenta-se tipicamente tardiamente no seu curso, e como tal tem uma sobrevivência média de apenas 6-12 meses após o diagnóstico e uma taxa geral de sobrevivência a 5 anos de apenas 5-10%. Embora a cirurgia ofereça a melhor oportunidade de uma cura, somente uma pequena fração de pacientes de cancro pulmonar são candidatos com a maioria dependendo de quimioterapia e radioterapia. Apesar das tentativas de manipular o tempo e a intensidade da dose destas terapias, as taxas de sobrevivência aumentaram pouco ao longo dos últimos 15 anos (Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166:1166-96) . O cancro colorretal é o terceiro cancro mais comum e a quarta causa de mortes por cancro mundial mais frequente (Weitz et al., 2005, Lancet 365:153-65) . Aproximadamente 5-10% de todos os cancros colorretais são hereditários sendo uma das formas principais a polipose adenomatosa familiar (FAP), uma doença autossómica dominante na qual cerca de 80% dos indivíduos afetados contêm uma mutação na linha germinal do gene da polipose adenomatosa coli (APC) . O carcinoma colorretal tem uma tendência a invadir localmente através de crescimento circunferencial e noutros lugares através de disseminação linfática, hematogénica, transperitoneal, e perineural. O sítio mais comum de envolvimento extra-linfático é o fígado, sendo os pulmões o órgão extra-abdominal mais frequentemente afetado. Outros sítios de disseminação hematogénica incluem os ossos, rins, glândulas suprarrenais, e cérebro. 0 sistema atual de estadiamento para o cancro colorretal está baseado no grau de penetração tumoral através da parede intestinal e da presença ou ausência de envolvimento nodal. Este sistema de estadiamento é definido através de três principais classificações de Duke: A doença A de Duke está confinada às camadas da submucosa do cólon ou reto; A doença B de Duke tem tumores que invadem através da muscular is propria e podem penetrar a parede do cólon ou reto; e a doença C de Duke inclui qualquer grau de invasão da parede intestinal com metástases de nódulos linfáticos regionais. Enquanto a resseção cirúrgica é altamente eficaz para os cancros colorretais de estádio precoce, proporcionando taxas de cura de 95% em pacientes A de Duke, a taxa é reduzida a 75% em pacientes B de Duke e a presença de nódulos linfáticos positivos na doença C de Duke prevê uma probabilidade de 60% de recorrência no prazo de cinco anos. O tratamento de pacientes C de Duke com um curso de quimioterapia pós-cirúrgico reduz a taxa de recorrência para 40-50%, e é atualmente o padrão de tratamento para estes pacientes.

Os carcinomas epiteliais da cabeça e pescoço surgem a partir das superfícies mucosas na área da cabeça e pescoço e consistem, tipicamente, na sua origem em células escamosas. Esta categoria inclui tumores dos seios paranasais, da cavidade oral, e na nasofaringe, orofaringe, hipofaringe e laringe. O número anual de novos casos dos cancros da cabeça e pescoço nos Estados Unidos é de aproximadamente 40.000 por ano, sendo responsáveis por cerca de 5 porcento das neoplasias malignas em adultos. Os cancros da cabeça e pescoço são mais comuns em alguns outros países, e a incidência mundial provavelmente excede meio milhão de casos todos os anos. Na América do Norte e Europa, os tumores surgem, normalmente a partir da cavidade oral, orofaringe, ou laringe, enquanto o cancro nasofaríngeo é mais comum nos países Mediterrâneos e no Extremo Oriente.

Os modos tradicionais de terapêutica (terapêutica por radiação, quimioterapia, e terapêutica hormonal), enquanto úteis, têm sido limitados pela emergência de células cancerosas resistentes ao tratamento. Claramente, novas abordagens são necessárias para identificar alvos para o tratamento do cancro da cabeça e pescoço no geral. 0 cancro origina-se a partir da desregulação dos mecanismos que controlam o desenvolvimento e a manutenção teciduais normais, e cada vez mais se pensa que as células estaminais têm um papel central (Beachy et al. , 2004, Nature 432:324). Durante o desenvolvimento animal normal, as células de todos ou da maioria dos tecidos são derivadas a partir de precursores normais, chamados células estaminais (Morrison et al., 1997, Cell 88:287-98; Morrison et al., 1997, Curr. Opin. Immunol. 9:216-21; Morrison et al., 1995, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11:35-71) . As células estaminais são células que: (1) têm extensa capacidade proliferativa; (2) são capazes de divisão celular assimétrica para gerar um ou mais tipos de progénie com potencial proliferativo e/ou de desenvolvimento reduzidos; e (3) são capazes de divisões celulares simétricas para autorrenovação ou auto-manutenção. O exemplo mais bem conhecido de renovação celular adulta através da diferenciação de células estaminais é o sistema hematopoiético em que precursores imaturos em termos de desenvolvimento (células estaminais e progenitoras hematopoiéticas) respondem a sinais moleculares para formar os tipos celulares linfoide e sanguíneo variados. Outras células, incluindo células do intestino, sistema ductal da mama, e pele são constantemente reabastecidos a partir de uma pequena população de células estaminais em cada tecido, e estudos recentes sugerem que a maioria dos restantes tecidos adultos também abrangem células estaminais, incluindo o cérebro.

Os tumores sólidos são compostos por populações celulares heterogéneas. Por exemplo, os cancros da mama são uma mistura de células cancerígenas e células normais, incluindo células mesenquimáticas (do estroma), células inflamatórias, e células endoteliais. Modelos clássicos de cancro sustentam que populações celulares de cancro diferentes todas possuem a capacidade de proliferar e originar um novo tumor. No modelo clássico, a heterogeneidade tumoral celular resulta a partir de fatores ambientais bem como de mutações em curso nas células cancerosas resultando numa população diversa de células tumorigénicas. Este modelo apoia-se na ideia de que todas as populações de células tumorais teriam algum grau de potencial tumorigénico. (Pandis et al., 1998, Genes, Chromosomes & Cancer 12:122-129; Kuukas jrvi et al. , 1997, Cancer Re s. 57:1597-1604; Bonsing et al., 1993, Cancer 71:382-391; Bonsing et al. , 2000, Genes Chromosomes & Cancer 82: 173-183; Beerman H et al. , 1991, Cytometry. 12:147-54; Aubele M eWerner Μ, 1999, Analyt. Cell. Path. 19:53; Shen L et al., 2000, Cancer Res. 60:3884).

Um modelo alternativo para a heterogeneidade de células de tumor sólido observada consiste em que os tumores sólidos resultam a partir de uma "célula estaminal de tumor sólido" (ou "célula estaminal cancerosa" a partir de um tumor sólido) que, subsequentemente é submetida a desenvolvimento caótico através de ambos ciclos simétricos e assimétricos de divisão celular. Neste modelo de células estaminais, os tumores sólidos contêm um subconjunto distinto e limitado (possivelmente, mesmo raro) de células que partilham propriedades com "células estaminais" normais no sentido em que proliferam extensamente e dão origem tanto a células estaminais de tumor sólido adicionais (autorrenovação) como à maioria das células tumorais de um tumor sólido que carece de potencial tumorigénico. Com efeito, mutações numa população de células estaminais duradoura podem iniciar a formação de células estaminais cancerosas que são subjacentes ao crescimento e manutenção de tumores e cuja presença contribui à falência das abordagens terapêuticas atuais. A natureza de células estaminais do cancro foi inicialmente revelada no cancro do sangue, leucemia mieloide aguda (AML) (Lapidot et al. , 1994, Nature 17:645-8) . Mais recentemente foi demonstrado que tumores da mama humanos malignos abrangem de forma semelhante uma pequena e distinta população de células estaminais cancerosas enriquecidas na sua capacidade de formar tumores em ratinhos imunodeficientes. Foi constatado que uma população de células Lin ESA+, CD44+, CD24-/baixo estava enriquecida 50 vezes em células tumorigénicas em comparação com células tumorais não fracionadas (Al-Hajj et al., 2003, PNAS 100:3983-8) . Além disso, uma população semelhante está também presente nos cancros do cólon. A capacidade de isolar prospectivamente as células cancerosas tumorigénicas permitiu uma investigação precisa de vias biológicas críticas subjacentes à tumorigenicidade nestas células, e como tal promete o desenvolvimento de melhores ensaios e terapêuticas de diagnóstico para pacientes de cancro. É no sentido deste propósito e dos outros propósitos descritos no presente documento que esta invenção está direcionada.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições e métodos no campo da oncologia. Em particular, a presente invenção está baseada, em parte, na descoberta de que uma proteína LGR (recetor acoplado à proteína G, contendo repetições ricas em leucina), tais como LGR5 (recetor 5 acoplado à proteína G, contendo repetições ricas em leucina) é uma proteína sobre-expressa em células estaminais cancerosas de tumor sólido, e portanto é um marcador de células estaminais cancerosas útil na caracterização, estudo, diagnóstico e tratamento de cancro. A presente invenção identifica adicionalmente uma interação entre a R-espondina RSPOl e LGR5 como uma via alternativa para a ativação da sinalização de beta-catenina, sugerindo que o bloqueio funcional de LGR5 pode inibir o crescimento tumoral. As interações entre LGR5 e cada uma das proteínas RSPO adicionais RDP02, RSP03, e RSP04 foram agora igualmente identificadas.

Como tal, em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona biomoléculas que interrompem a sinalização funcional através de uma proteína LGR, incluindo, em determinadas formas de realização, moléculas que inibem a interação entre as proteínas R-espondina (RSPO) e uma proteína LGR tal como LGR5. Em determinadas formas de realização, as biomoléculas são anticorpos. Por exemplo, em determinadas formas de realização, as biomoléculas podem ser anticorpos que se ligam especificamente a pelo menos uma proteína RSPO humana ou anticorpos que se ligam especificamente ao domínio extracelular de pelo menos uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona anticorpos que se ligam especificamente a pelo menos uma proteína RSPO humana (por exemplo, uma, duas, três ou quatro proteínas RSPO humanas) e inibem o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido. Em determinadas formas de realização, a pelo menos uma proteína RSPO é RSP01. Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona anticorpos que se ligam especif icamente a um domínio extracelular de uma proteína LGR humana e inibem o crescimento de células tumorais. Em determinadas formas de realização, a proteína LGR é LGR5. Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um recetor de proteína LGR solúvel que inibe o crescimento de células tumorais. Em determinadas formas de realização, o recetor de proteína LGR solúvel é um recetor de LGR5 solúvel. Aspetos da invenção proporcionam um anticorpo monoclonal isolado conforme estabelecido na reivindicação 1 ou reivindicação 5. A presente divulgação proporciona adicionalmente métodos de tratamento de cancro compreendendo células estaminais cancerosas. Em determinadas formas de realização, o método de tratamento de cancro compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína RSPO humana. Em determinadas formas de realização, a pelo menos uma proteína RSPO é RSP01. Em determinadas formas de realização, o método de tratamento de cancro compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente um domínio extracelular de uma proteína LGR. Em determinadas formas de realização, a proteína LGR é LGR5. Em determinadas formas de realização, o método de tratamento de cancro compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um recetor de proteína LGR solúvel (por exemplo, associado à membrana de forma não transmembranar). Em determinadas formas de realização, o recetor de proteína LGR solúvel é um recetor de LGR5 solúvel. A presente divulgação proporciona adicionalmente um método de tratamento de cancro num ser humano e/ou de inibição do crescimento de um tumor num ser humano compreendendo administrar ao humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que (a) interrompe a ligação de uma proteína RSPO humana a uma proteína LGR humana e/ou (b) interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO. Nalgumas formas de realização, o agente é um anticorpo. Em determinadas formas de realização, o agente liga-se a uma proteína RSPO humana. Em determinadas formas de realização, o agente liga-se a uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização, o agente é um anticorpo que se liga especif icamente a pelo menos uma proteína RSPO humana. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente é um anticorpo que se liga especificamente a duas ou mais proteínas RSPO humanas. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente é um anticorpo que se liga especificamente ao domínio extracelular de pelo menos uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente é um anticorpo que se liga especificamente ao domínio extracelular de duas ou mais proteínas LGR humanas. Em determinadas formas de realização, o agente é um recetor solúvel que compreende o domínio extracelular de uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização, a proteína LGR é LGR5. Em determinadas formas de realização, o cancro ou tumor compreende células estaminais cancerosas.

Adicionalmente, a presente divulgação proporciona um método para inibir a sinalização de beta-catenina numa célula tumoral, compreendendo contactar a célula tumoral com um agente que (a) interrompe a ligação de uma proteína RSPO humana a uma proteína LGR humana e/ou (b) interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO. Em determinadas formas de realização, o agente liga-se a uma proteína RSPO humana. Em determinadas formas de realização, o agente liga-se a uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente é um anticorpo que se liga especificamente à pelo menos uma proteína RSPO humana. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente é um anticorpo que se liga especif icamente a duas ou mais proteínas RSPO humanas. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente é um anticorpo que se liga especificamente ao domínio extracelular de pelo menos uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente é um anticorpo que se liga especificamente ao domínio extracelular de duas ou mais proteínas LGR humanas. Em determinadas formas de realização, o agente é um recetor solúvel que compreende o domínio extracelular de uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização, a proteína LGR é LGR5. Em determinadas formas de realização, o método é um método in vitro. Em determinadas formas de realização, o método é um método in vivo. Outro aspeto da invenção proporciona um recetor solúvel para utilização conforme estabelecido na reivindicação 12. A presente divulgação proporciona adicionalmente anticorpos que se ligam a um domínio extracelular de uma proteína LGR humana e que são capazes de inibir o crescimento de um tumor sólido (por exemplo, um tumor sólido compreendendo células estaminais de tumor sólido) através de (a) ligação de interrupção de uma proteína RSPO humana a uma proteína LGR humana; (b) interrupção da ativação da sinalização de LGR através de RSPO; e/ou (c) inibição da sinalização de beta-catenina. A presente divulgação também proporciona anticorpos que (a) se ligam a um domínio extracelular de uma proteína LGR humana; (b) interrompem a ligação de uma proteína RSPO humana a uma proteína LGR humana; (c) interrompem a ativação da sinalização de LGR através de RSPO; (d) inibem a sinalização de beta-catenina; e/ou (e) são capazes de inibir o crescimento de um tumor sólido (por exemplo, um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido). Em determinadas formas de realização, os anticorpos ligam-se especificamente ao domínio extracelular de uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização, a proteína LGR humana é LGR5. Em determinadas formas de realização, a proteína RSPO é RSP01. Em determinadas formas de realização alternativas, a proteína RSPO humana é RSP02, RSP03, ou RSP04. As linhas celulares que produzem os anticorpos e composições que compreendem os anticorpos são adicionalmente proporcionadas. Métodos de utilização de quantidades terapeuticamente eficazes de composições que compreendem os anticorpos para o tratamento de cancro, incluindo, mas não limitados a, inibição do crescimento de um tumor são adicionalmente proporcionados. Métodos utilizando os anticorpos, in vivo ou in vitro, para inibir a sinalização de beta-catenina são também proporcionados.

Adicionalmente, a presente divulgação proporciona adicionalmente anticorpos que se ligam à proteína RPSO humana e são capazes de inibir o crescimento de um tumor sólido (por exemplo, um tumor sólido compreendendo células estaminais de tumor sólido) através de (a) ligação de interrupção de uma proteína RSPO humana a uma proteína LGR humana; (b) interrupção da ativação da sinalização de LGR através de RSPO; e/ou (c) inibição da sinalização de beta-catenina. Alternativamente, a presente divulgação proporciona adicionalmente anticorpos que (a) se ligam a uma proteína RSPO humana; (b) interrompem a ligação de uma proteína RSPO humana a uma proteína LGR humana; (c) interrompem a ativação da sinalização de LGR através de RSPO; (d) inibem a sinalização de beta-catenina; e/ou (e) são capazes de inibir o crescimento de um tumor sólido (por exemplo, um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido). Em determinadas formas de realização, os anticorpos ligam-se especificamente a uma proteína RSPO humana. Em determinadas formas de realização, a proteína RSPO é RSP01. Em determinadas formas de realização alternativas, a proteína RSPO humana é RSP02, RSP03, ou RSP04. Em determinadas formas de realização, a proteína LGR humana é LGR5 . As linhas celulares que produzem os anticorpos e composições que compreendem os anticorpos são adicionalmente proporcionadas. Métodos de utilização de quantidades terapeuticamente eficazes de composições que compreendem os anticorpos para o tratamento de cancro, incluindo, mas não limitada a, através da inibição do crescimento de um tumor, são adicionalmente proporcionados. Métodos de utilização dos anticorpos, in vivo ou in vitro, para inibir a sinalização de beta-catenina são também proporcionados. A divulgação proporciona adicionalmente um anticorpo anti-LGR5 monoclonal 88M1 produzido por uma linha celular de hibridoma tendo o número de depósito na ATCC PTA-9341. Também são proporcionados anticorpos que se ligam especificamente a LGR5 e (a) compreendem uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a região variável de cadeia pesada e/ou a região variável de cadeia leve (respetivamente) de 88M1; (b) compreendem as CDRs de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de 88M1; (c) ligam-se a um epítopo capaz de se ligar a 88M1; e/ou (d) competem com 88M1 num ensaio de ligação competitivo. As linhas celulares que produzem os anticorpos (incluindo, mas não limitadas a, a linha celular de hibridoma tendo o número de depósito na ATCC PTA-9341) e composições que compreendem os anticorpos são adicionalmente proporcionadas. Métodos de utilização de quantidades terapeuticamente eficazes de composições que compreendem os anticorpos para o tratamento de cancro, incluindo, mas não limitada a, através da inibição do crescimento de um tumor, são adicionalmente proporcionados. Métodos utilizando os anticorpos, in vivo ou in vitro, para inibir a sinalização de beta-catenina são também proporcionados. A presente invenção proporciona adicionalmente métodos de identificação e/ou isolamento de células estaminais cancerosas (por exemplo, com base na expressão de LGR5), rastreio quanto a agentes anti-cancro, e rastreio de pacientes quanto à adequação para o tratamento com os agentes descritos no presente documento.

Quando os aspetos ou formas de realização da invenção são descritos em termos de um grupo de Markush ou outro agrupamento de alternativas, a presente invenção engloba não apenas o grupo inteiro listado como um todo, mas também cada membro do grupo individualmente e todos os subgrupos possíveis do grupo principal, e também o grupo principal ausentes um ou mais dos membros do grupo. A presente invenção também contempla a exclusão explícita de um ou mais de qualquer dos membros do grupo na invenção reivindicada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. LGR5 é sobre-expressa em células estaminais cancerosas de tumor sólido. Células a partir de tumores do cólon humanos foram classificadas através de FACS numa fração tumorigénica "TG" (barras da direita) contendo células estaminais cancerosas e uma fração não tumorigénica "NTG" (barras da esquerda). ARNm foi isolado a partir desta fração e os dados de microarranjo foram gerados. LGR5 demonstrou uma expressão de ARNm mais elevada na fração de células estaminais cancerosas TG a partir de três tumores do cólon humanos independentes (barra da direita de cada conjunto).

Figura 2. LGR5 é sobre-expressa em tumores epiteliais humanos. São mostrados os dados de microarranjo para a expressão de ARNm de LGR5 a partir de um grande número de tumores humanos comparados com as amostras de tecido a partir de tecidos humanos normais. 0 nível de expressão de LGR5 em amostras de pacientes individuais é indicado pelas linhas descontínuas verticais dentro do eixo horizontal para cada tipo de tecido indicado. LGR5 é sobre-expressa na maioria das amostras tumorais em relação à expressão no tecido normal correspondente.

Figura 3. LGR6 apresenta expressão alterada em tumores epiteliais humanos. São mostrados os dados de microarranjo para a expressão de ARNm de LGR6 a partir de um grande número de tumores humanos comparados com as amostras de tecido a partir de tecidos humanos normais. 0 nível de expressão de LGR6 em amostras de pacientes individuais é indicado pelas linhas descontinuas verticais dentro do eixo horizontal para cada tipo de tecido indicado. A expressão de LGR6 demonstra expressão alterada em muitas amostras tumorais em relação à expressão no tecido normal correspondente.

Figura 4. RSP01 ativa a sinalização de beta-catenina. A atividade da luciferase (eixo do y) a partir de um repórter de luciferase 8xTCF foi medida após a exposição a RSP01-Fc na concentração indicada (eixo do x). RSP01-Fc induziu a atividade de luciferase a partir do promotor responsivo a beta-catenina de uma forma dependente da dose.

Figura 5. LGR5 solúvel (LGR5-Fc) inibe a indução da sinalização de beta-catenina por RSP01. A atividade de luciferase (eixo do y) a partir de células transfetadas com um repórter de luciferase 8xTCF foi medida em resposta à exposição a meio de controlo (quadrados, sem RSPO) ou RSPOl-Fc em combinação com concentrações crescentes de LGR5 solúvel (losangos, RSPO 2,5 ug).

Figura 6. LGR5 solúvel, mas não FZD10 solúvel, inibe a indução sinérgica da sinalização de beta-catenina por RSP01 e Wnt3A. A) LGR5 solúvel inibe a indução sinérgica de sinalização de beta-catenina por RSP01 e Wnt3A. A atividade de luciferase (eixo do y) a partir de células transfetadas com um repórter de luciferase 8xTCF foi medida em resposta à exposição a meio de controlo (losangos, LCM); RSP01 e LCM (quadrados, RSPO + LCM) ; Wnt3A (triângulos); e RSP01 mais Wnt3A (cruzes) . Concentrações crescentes de LGR5 solúvel (eixo do x) reduziu a indução sinérgica da atividade de luciferase por RSP01 e Wnt3A. B) FZD10 solúvel não inibe a indução sinérgica da sinalização de beta-catenina por RSP01 e Wnt3A. A atividade de luciferase (eixo do y) a partir de células transfetadas com um repórter de luciferase 8xTCF foi medida em resposta à exposição a meio de controlo (losangos, LCM); RSP01 e LCM (quadrados, RSPO + LCM); Wnt3A (triângulos); e RSP01 mais Wnt3A (cruzes) . Concentrações crescentes de LGR5 solúvel (eixo do x) reduziu a indução sinérgica da atividade de luciferase por RSP01 e Wnt3A.

Figura 7. RSP01 ativa a sinalização de beta-catenina através da ligação a LGR5. A) Células HEK 293 transitoriamente transfetadas com RSP01-CD4TM e GFP foram incubadas com LGR5-FC, LRP6FL-FC, LRP 6E1-2-FC, ou FZDl-10-Fc conforme indicado. FACS com base em GFP (eixo do x) e ligação de proteína de fusão Fc (eixo do y) demonstraram ligação entre RSP01 e LGR5 (superior esquerdo) . RSP01 apenas se ligou fracamente a LRP6 e não foi capaz de interagir com qualquer FZD. B) Células HEK 293 transitoriamente transfetadas com FLAG-LGR5-CD4TM e GFP foram incubadas na presença de heparina com (em duplicado) RSP01-Fc (superior), FZD8-Fc (centro), ou um anticorpo FLAG como um controlo positivo (inferior). FACS com base em GFP (eixo do x) e ligação de proteína de fusão Fc (eixo do y) demonstraram ligação entre RSP01 e LGR5 mas não FZD8. C) Todos os membros da família RSPO são capazes de se ligar a LGR5. Células HEK 293 transitoriamente transfetadas com FLAG-LGR5-CD4TM e GFP foram incubadas na presença de heparina com RSP01-Fc, RSP02-FC, RSP03-Fc, RSP04-FC, FZD8-Fc, ou um anticorpo FLAG como um controlo positivo conforme indicado. FACS com base em GFP (eixo do x) e ligação de proteína de fusão Fc (eixo do y) demonstraram ligação entre cada membro da família de RSPO e LGR5 conforme indicado por sinal de FACS dentro do quadrante em caixa do lado superior direito de cada traçado de FACS.

Figura 8. Identificação de mAbs para LGR5. Células HEK 293 transitoriamente transfetadas com FLAG-LGR5-CD4TM e GFP foram incubadas com um anticorpo irrelevante como um negativo (controlo de IgGl), ou com anticorpo anti-FLAG como controlo positivo para a expressão de LGR5, ou um mAb para LGR5 (88M1, 88M5), seguidas por incubação com reagente secundário anti-mAb fluorescente conjugado com PE. As amostras foram depois analisadas por citometria de fluxo. Foi verificado que 88M1 e 88M5 apresentam ligação específica a LGR5.

Figura 9. Identificação de mAb que inibe a ligação de RSPO a LGR5. Células HEK 293 transitoriamente infetadas com FLAG-LGR5-CD4TM e GFP. A ligação de células transfetadas com proteína de fusão RSPOl-Fcto foi detetada por incubação com anticorpo anti-fc humana conjugado com PE. 0 impacto do anticorpo anti-LGR5 88M1 na ligação de RSPO foi avaliada através da incubação das células com 88M1 conforme indicado e análise com citometria de fluxo. A experiência mostra que 88M1 reduziu a ligação de RSP01 a LGR5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona composições e métodos para caracterizar, estudar, diagnosticar, e tratar o cancro. Em particular, a presente invenção proporciona LGR5 como um marcador de células estaminais cancerosas de tumor sólido e identifica uma nova interação entre LGR5 e uma proteína RSPO, RSP01, (bem como RSP02, RSP03, eRSP04) como uma via alternativa para a ativação da sinalização de beta-catenina. A manipulação desta via de sinalização de LGR5, incluindo a interrupção da sinalização de LGR5 funcional, proporciona novas composições e métodos para o tratamento do cancro.

Esta invenção baseia-se em parte na descoberta de células estaminais de tumor sólido (também referidas como células estaminais cancerosas ou células estaminais cancerosas de tumor sólido) como um subconjunto distinto e limitado de células dentro da população celular heterogénea de tumores sólidos estabelecidos. Estas células estaminais cancerosas partilham as propriedades de células estaminais normais no sentido em que proliferam extensamente e dão eficazmente origem tanto a células estaminais de tumor sólido adicionais (autorrenovação) como à maioria das células tumorais de um tumor sólido que carece de potencial tumorigénico. A identificação das células estaminais cancerosas depende tanto 1) da expressão de um padrão único de recetores da superfície celular utilizado para isolá-las a partir do total de células tumorais não tumorigénicas e 2) das suas propriedades de autorrenovação e proliferação conforme avaliado em modelos animais de xenoenxerto.

Em determinadas formas de realização, a divulgação proporciona assim um método para direcionar seletivamente agentes de diagnóstico ou terapêuticos contra células estaminais cancerosas. Em determinadas formas de realização, a divulgação também proporciona um agente, tal como uma biomolécula, que é seletivamente direcionado contra células estaminais cancerosas (por exemplo, direcionado contra um dos marcadores de cancro de células estaminais cancerosas de cólon divulgados no presente documento). Em determinadas formas de realização, o marcador de cancro de célula estaminal direcionado é parte de uma via de autorrenovação ou sobrevivência celular. Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona métodos para o rastreio de agentes anti-cancro; para a testagem de terapêuticas anti-cancro; para o desenvolvimento de fármacos direcionados a novas vias; para a identificação de novos alvos terapêuticos anti-cancro; a identificação e diagnóstico de células malignas em espécimes de patologia; para a testagem e ensaio de sensibilidade a fármacos de células estaminais de tumor sólido; para a medição de fatores específicos que preveem a sensibilidade a fármacos; e para o rastreio de pacientes (por exemplo, como um adjuvante para a mamografia).

Orientação adicional relacionada com células estaminais cancerosas é proporcionada no pedido de patente PCT publicado WO 02/12447 pelos Regentes da Universidade do Michigan e pedido de patente PCT PCT/US02/39191 pelos Regentes da Universidade do Michigan. A presente invenção identifica a expressão de células estaminais cancerosas como compreendendo níveis elevados de LGR5 (recetor 5 acoplado à proteína G contendo repetições ricas em leucina) em comparação com células tumorais não tumorigénicas. LGR5 é um membro de uma pequena família de proteínas de sete domínios transmembranares órfãs com domínios extracelulares relativamente grandes que inclui LGR4, LGR5, e LGR6 . A presente invenção identifica adicionalmente uma interação entre RSPOl e LGR5 que ativa uma via de sinalização de beta-catenina alternativa. As R-espondinas (RSPO) são uma família de quatro proteínas secretadas pequenas que foram recentemente reconhecidas como estimulando a beta-catenina de uma forma semelhante à sinalização de Wnt. De forma interessante, as proteínas Wnt e RSPO demonstram um profundo sinergismo. Recentemente, foi sugerido que a ativação de RSPO de beta-catenina é mediada através de membros da família de recetores Frizzled e da família de co-recetor LRP5/6 (Nam et al.f 2006, JBC 281:13247-57). A presente invenção identifica LGR5 como um recetor para RSPO. A via de sinalização de Wnt tem sido há muito implicada no cancro devido à presença de mutações ativando a via em determinados tumores (por exemplo, mutações de APC no cancro do cólon) e a capacidade de determinar WNTs para conduzir o cancro quando expressas como transgenes constitutivos ou após a inserção retroviral (por exemplo, o modelo de tumor da mama wWntl) . Contudo, provas concretas que as próprias proteínas Wnt conduzem quaisquer tumores humanos espontâneos provaram ser surpreendentemente elusivas. A presente invenção identifica uma via alternativa através das proteínas RSPO e proteínas LGR que pode levar a beta-catenina ativada em células tumorais. Sem estar ligado à teoria, o modelo sugere que os membros da família de recetores LGR podem funcionar como um "reóstato" que classifica o nível de beta-catenina em resposta a Wnt devido ao profundo sinergismo observado demonstrado por R-espondina e Wnt na indução de beta-catenina. Dado que os tumores exibem níveis marcadamente elevados de LGR5, eles podem consequentemente demonstrar beta-catenina elevada na face de níveis "normais" de proteínas Wnt.

Com base, em parte, nestas descobertas, a presente divulgação proporciona, em determinadas formas de realização, agentes que interrompem a ligação de, pelo menos, uma proteína RSPO humana a pelo menos uma proteína LGR (por exemplo, LGR5) . Em determinadas formas de realização, os agentes interrompem a ativação da sinalização de LGR através de RSPO. Em formas de realização adicionais, os agentes inibem o crescimento tumoral, incluindo o crescimento de tumores sólidos compreendendo células estaminais cancerosas. Em algumas formas de realização, os agentes são anticorpos que se ligam especificamente a, pelo menos, uma proteína RSPO ou que se ligam a, pelo menos, uma proteína LGR. Nalgumas formas de realização, os agentes são anticorpos que se ligam especificamente a duas ou mais proteínas RSPO ou que se ligam a duas ou mais proteínas LGR. Composições compreendendo estes agentes e a sua utilização no tratamento de cancros (especialmente, mas não limitados, àqueles que envolvem células estaminais cancerosas) são adicionalmente proporcionadas.

Outras características, objetos e vantagens da invenção serão aparentes a parti da descrição detalhada abaixo. Definições

Para facilitar uma compreensão da presente invenção, um número de termos e frases é definido abaixo:

Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina que reconhece e se liga especificamente a um alvo, tal como uma proteína, polipéptido, péptido, hidrato de carbono, polinucleótido, lípidos, etc., através de, pelo menos, um sítio de reconhecimento de antigénio dentro da região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme utilizado no presente documento, o termo é utilizado no sentido mais lato e engloba anticorpos policlonais intactos, anticorpos monoclonais intactos, fragmentos de anticorpo (tais como fragmentos Fab, Fab' , F (ab' ) 2, e Fv) , mutantes de Fv de cadeia simples (scFv) , os anticorpos multiespecíficos tais como anticorpos biespecíficos gerados a partir de, pelo menos, dois anticorpos intactos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada compreendendo um sítio de reconhecimento de antigénio desde que os anticorpos exibam a atividade biológica desejada. Um anticorpo pode ser de qualquer das cinco principais classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, ou subclasses (isotipos) das mesmas (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) , com base na identidade dos seus domínios constantes de cadeia pesada referidos como alfa, delta, épsilon, gama, e mu, respetivamente. As diferentes classes de imunoglobulinas possuem estruturas de subunidades diferentes e bem conhecidas e configurações tridimensionais. Os anticorpos podem ser nus ou conjugados com outras moléculas tais como toxinas, radioisótopos, etc.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "fragmentos de anticorpo" refere-se a uma porção de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia simples, péptidos Fc ou Fc', fragmentos Fab e Fab', e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

Conforme utilizado no presente documento, formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima, ou nenhuma sequência, derivada a partir de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejada. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) Fv da imunoglobulina são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recetor nem no anticorpo dador. Estas modificações são geralmente realizadas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas das ansas hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos dos resíduos FR são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de uma imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Exemplos de métodos utilizados para gerar anticorpos humanizados são descritos no documento de Patente U.S. 5.225.539 para Winter et al. 0 termo "anticorpo humano" conforme utilizado no presente documento significa um anticorpo produzido por um ser humano ou um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos que corresponde a um anticorpo produzido por um ser humano feito utilizando qualquer uma das técnicas conhecidas na técnica. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos intactos ou de comprimento completo, fragmentos dos mesmos, e/ou anticorpos que compreendem pelo menos um polipéptido de cadeia pesada e/ou leve humano tal como, por exemplo, um anticorpo que compreende polipéptidos de cadeia leve murina e cadeia pesada humana. "Anticorpos híbridos" são moléculas de imunoglobulinas nas quais pares de cadeias pesadas e leves a partir de anticorpos com diferentes regiões determinantes antigénicas são montados em conjunto de modo a que dois epítopos diferente ou dois antigénios diferentes possam ser reconhecidos e ligados pelo tetrâmero resultante. 0 termo "anticorpos quiméricos" refere-se a anticorpos em que a sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina é derivada a partir de duas ou mais espécies. Tipicamente, a região variável de ambas as cadeias pesadas e leves corresponde à região variável de anticorpos derivados a partir de uma espécie de mamífero (por exemplo, ratinho, rato, coelho, etc) com a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas enquanto as regiões constantes são homólogas às sequências em anticorpos derivados a partir de outro (normalmente humano) para evitar desencadear uma resposta imunitária nessa espécie. 0 termo "epítopo" ou "determinante antigénica" são utilizados indistintamente no presente documento e referem-se àquela porção de um antigénio capaz de ser reconhecido e ser ligado especificamente por um anticorpo particular. Quando o antigénio é um polipéptido, os epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos e como aminoácidos não contíguos justapostos através de dobragem terciária de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos após desnaturação proteica, enquanto os epítopos formados por dobragem terciária são tipicamente perdidos após desnaturação proteica. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, e mais normalmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos numa conformação espacial única. Uma determinante antigénica pode competir com o antigénio intacto (ou seja, o "imunogénio" utilizado para desencadear a resposta imunitária) para ligação a um anticorpo. 0 facto de que um anticorpo se "liga especificamente" a ou apresenta "ligação especifica" em relação a um epítopo, significa que o anticorpo reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração, e/ou com maior afinidade com o epítopo do que com substâncias alternativas. Conforme utilizado no presente documento, "liga-se especificamente" significa que o anticorpo se liga a uma proteína com uma KD de pelo menos cerca de 0, 1 mM, pelo menos cerca de 1 μΜ, pelo menos cerca de 0,1 μΜ ou melhor, ou 0,01 μΜ ou melhor. Entende-se que um anticorpo ou fração de ligação que se liga especificamente a um primeiro alvo pode ou não ligar-se especificamente a um segundo alvo. Como tal, "ligação específica" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva, ou seja, ligação a um alvo único. Geralmente, mas não necessariamente, a referência a ligação significa ligação especifica.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "ligação não específica" e "ligação de fundo" quando utilizados em referência à interação de um anticorpo e uma proteína ou péptido referem-se a uma interação que não é dependente da presença de uma estrutura particular (ou seja, o anticorpo está a ligar-se a proteínas em geral, em vez de a uma estrutura particular tal como um epítopo).

Conforme utilizado no presente documento, o termo "domínio de ligação de recetor" refere-se a qualquer ligando nativo para um recetor, incluindo moléculas de adesão celular, ou qualquer região ou derivado de tal ligando nativo retendo pelo menos uma capacidade de ligação de recetor qualitativa de um ligando nativo correspondente.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "quimera anticorpo-imunoadesina" compreende uma molécula que combina pelo menos um domínio de ligação de um anticorpo com pelo menos uma imunoadesina. Exemplos incluem, mas não estão limitados, às quimeras CD4-IgG biespecíficas descritas em Berg et al., PNAS (EUA) 88:4723-4727 (1991) e Charnow et al., J. Immunol., 153:4268 (1994). "Enriquecido", no sentido de uma população enriquecida de células, pode ser definido fenotipicamente com base no número aumentado de células tendo um marcador particular (por exemplo, conforme mostrado no Quadro 1) num conjunto fracionado de células em comparação com o número de células tendo o marcador no conjunto não fracionado de células. Contudo, o termo "enriquecido" pode ser definido funcionalmente através da função tumorigénica como o número mínimo de células que forma tumores em frequência de diluição limitada em ratinhos de teste. Por exemplo, se 500 células estaminais tumorais formam tumores em 63% de animais de teste, mas 5000 células tumorais não fracionadas são necessárias para formar tumores em 63% de animais de teste, então a população de células estaminais de tumor sólido é enriquecida 10 vezes quanto à atividade tumorigénica. Os marcadores de cancro de células estaminais da presente divulgação podem ser utilizados para gerar populações enriquecidas de células estaminais cancerosas. Nalgumas formas de realização, a população de células estaminais é enriquecida, pelo menos, 1,4 vezes em relação às células tumorais não fracionadas. Noutras formas de realização, a população de células estaminais é enriquecida 2 vezes a 10 vezes em relação às células tumorais não fracionadas. Em formas de realização adicionais, a população de células estaminais é enriquecida 20 vezes em relação às células tumorais não fracionadas. "Isolado" no que diz respeito às células, refere-se a uma célula que é removida a partir do seu ambiente natural (tal como num tumor sólido) e que é isolada ou separada, e é, pelo menos, cerca de 30%, 50%, 75% isenta, ou cerca de 90% isenta, de outras células com as quais está naturalmente presente, mas que carecem do marcador com base no qual as células foram isoladas. Os marcadores de cancro de células estaminais da presente invenção podem ser utilizadas para gerar populações isoladas de células estaminais cancerosas.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos na qual uma população de células é caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de cancro incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cancros incluem cancro de células escamosas, cancro pulmonar de células pequenas, cancro pulmonar de células não pequenas, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma de células pequenas do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro colorretal, carcinoma do endométrio ou do útero, carcinoma das glândulas salivares, cancro renal, cancro do fígado, cancro da próstata, cancro da vulva, cancro da tiroide, carcinoma hepático e vários tipos de cancro da cabeça e pescoço. "Metástase" conforme utilizado no presente documento refere-se ao processo através do qual um cancro se dissemina ou se transfere a partir do sítio de origem a outras regiões do corpo com o desenvolvimento de uma lesão cancerosa semelhante na nova localização. Uma célula "metastática" ou "metastizante" é uma que perde contactos adesivos com células vizinhas e migra através da corrente sanguínea ou linfa desde o sítio primário da doença para invadir estruturas corporais vi z inhas.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "sujeito" refere-se a qualquer animal (por exemplo, um mamífero), incluindo, mas não limitado a, seres humanos, primatas não humanos, roedores, e semelhantes, que se destina a ser o recetor de um tratamento particular. Tipicamente, os termos "sujeito" e "paciente" são utilizados indistintamente no presente documento em referência a um sujeito humano.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "sujeito suspeito de ter cancro" refere-se a um sujeito que apresenta um ou mais sintomas indicativos de cancro (por exemplo, um nódulo ou massa) ou que está a ser rastreado quanto a cancro (por exemplo, durante um exame físico de rotina) . Um sujeito suspeito de ter cancro também pode ter um ou mais fatores de risco. Um sujeito suspeito de ter cancro não foi, geralmente, testado quanto a cancro. Contudo, um "sujeito suspeito de ter cancro" engloba um indivíduo que recebeu um diagnóstico inicial mas para o qual o estádio de cancro não é conhecido. 0 termo inclui adicionalmente pessoas que já tiveram cancro (por exemplo, um indivíduo em remissão).

Conforme utilizado no presente documento, o termo "sujeito em risco de ter cancro" refere-se a um sujeito que possui um ou mais fatores de risco para desenvolver um cancro específico. Fatores de risco incluem, mas não estão limitados a, sexo, idade, predisposição genética, exposição ambiental, incidentes anteriores de cancro, doenças não-cancerosas preexistentes e estilo de vida.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "caracterizar cancro num sujeito" refere-se à identificação de uma ou mais propriedades de uma amostra de cancro num sujeito, incluindo mas não limitadas, à presença de tecido benigno, pré-canceroso ou canceroso, o estádio do cancro e o prognóstico do sujeito. Os cancros podem ser caracterizados pela identificação da expressão de um ou mais genes de marcadores de cancro, incluindo mas não limitados, aos marcadores de cancro divulgados no presente documento.

Os termos "célula estaminal cancerosa", "célula estaminal tumoral", ou "célula estaminal de tumor sólido" são utilizados indistintamente no presente documento e referem-se a uma população de células a partir de um tumor sólido que: (1) têm extensa capacidade proliferativa; (2) são capazes de divisão celular assimétrica para gerar um ou mais tipos de progénie diferenciada com potencial proliferativo ou de desenvolvimento reduzidos; (3) são capazes de divisões celulares simétricas para autorrenovação ou auto-manutenção; e, (4) são capazes de formar tumores palpáveis após transplante seriado num modelo de xenoenxerto. As propriedades de capacidade proliferativa melhorada e divisão celular assimétrica e simétrica das "células estaminais cancerosas", "células estaminais tumorais" ou "células estaminais de tumor sólido" conferem a estas células estaminais cancerosas a capacidade de formar tumores palpáveis após transplante seriado num ratinho imunocomprometido em comparação com a maioria de células tumorais que não formam tumores. As células estaminais cancerosas são submetidas a autorrenovação frente a diferenciação de uma forma caótica para formar tumores com tipo celulares anormais que se podem alterar ao longo do tempo à medida que ocorrem mutações. As células estaminais de tumor sólido da presente divulgação diferem da "linha estaminal cancerosa" proporcionada pelo documento de patente U.S. N.° 6.004.528. Neste documento de patente, a "linha estaminal cancerosa" é definida como um tipo celular progenitor de crescimento lento que em si tem poucas mutações mas que é submetido a divisões celulares simétricas em vez de assimétricas como resultado de alterações tumorigénicas que ocorrem no ambiente da célula. Esta hipótese de "linha estaminal cancerosa" propõe como tal que células tumorais altamente mutadas, de proliferação rápida se originam amplamente como resultado de um ambiente anormal, que faz com que células estaminais relativamente normais se acumulem e posteriormente sejam submetidas a mutações que causam a sua transformação em células tumorais. O documento de Patente U.S. N.° 6.004.528 propõe que um tal modelo pode ser utilizado para melhorar o diagnóstico do cancro. O modelo de células estaminais de tumor sólido é fundamentalmente diferente do modelo de "linha estaminal cancerosa" e como resultado exibe utilidades não proporcionadas por parte do modelo de "linha estaminal cancerosa". Em primeiro lugar, as células estaminais de tumor sólido não se encontram "isentas de mutação". A "linha estaminal cancerosa isenta de mutação" descrita no documento de patente US N.° 6.004.528 pode ser considerada uma lesão pré-cancerosa, enquanto as células estaminais de tumor sólido descritas nesta divulgação são células cancerosas que contêm em si mesmas as mutações que são responsáveis pela tumorigénese. Isto é, as células estaminais de tumor sólido ("células estaminais cancerosas") da divulgação estariam incluídas entre as células altamente mutadas que são distinguidas a partir da "linha estaminal cancerosa" do documento de patente US N.° 6.004.528. Em segundo lugar, as mutações genéticas que conduzem ao cancro podem ser amplamente intrínsecas nas células estaminais de tumor sólido bem como ser ambientais. O modelo de células estaminais de tumor sólido prevê que células estaminais de tumor sólido isoladas podem dar origem a tumores adicionais após transplante (como tal explicando a metástase) enquanto o modelo de "linha estaminal cancerosa" preveria que as células da "linha estaminal cancerosa" não seriam capazes de dar origem a um novo tumor, já que foi o seu ambiente anormal o fator tumorigénico. Com efeito, a capacidade de transplantar células estaminais de tumor sólido humanas dissociadas e fenotipicamente isoladas a ratinhos (a um ambiente que é muito diferente do ambiente tumoral normal), onde ainda formam novos tumores, distingue a presente divulgação do modelo de "linha estaminal cancerosa". Em terceiro lugar, as células estaminais de tumor sólido são propensas a dividir-se tanto simetricamente como assimetricamente, de tal forma que a divisão celular simétrica não é uma propriedade obrigatória. Em quarto lugar, es células estaminais de tumor sólido podem dividir-se rapidamente ou lentamente, dependendo de uma série de variáveis, de tal forma que uma taxa de proliferação lenta não é uma caracteristica definitiva.

Conforme utilizado no presente documento "tumorigénico" refere-se às caracteristicas funcionais de uma célula estaminal de tumor sólido incluindo as propriedades de autorrenovação (dando origem a células estaminais cancerígenas tumorigénicas adicionais) e proliferação para gerar todas as restantes células tumorais (dando origem a células tumorais diferenciadas e como tal não tumorigénicas) que permitem que as células estaminais de tumor sólido formem um tumor.

Estas propriedades de autorrenovação e proliferação para gerar todas as restantes células tumorais conferem às células estaminais cancerosas desta invenção a capacidade de formar tumores palpáveis após transplante seriado num ratinho imunocomprometido em comparação com a maioria de células tumorais que são incapazes de formar tumores após transplante seriado. As células tumorais, isto é, células tumorais não tumorigénicas, podem formar um tumor após transplante num ratinho imunocomprometido um número limitado de vezes (por exemplo uma ou duas vezes) após obter as células tumorais a partir de um tumor sólido.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "marcador(es) de cancro de células estaminais", "marcador(es) de células estaminais cancerosas", "marcador(es) de células estaminais tumorais", ou "marcador(es) de células estaminais de tumor sólido" referem-se a um gene ou genes ou uma proteína, polipéptido, ou péptido expresso por parte do gene ou genes cujo nível de expressão, por si só ou em combinação com outros genes, está correlacionado com a presença de células cancerosas tumorigénicas em comparação com células não tumorigénicas. A correlação pode estar relacionada com uma expressão do gene tanto aumentada como diminuída (por exemplo, níveis aumentados ou diminuídos de ARNm ou do péptido codificado pelo gene).

Conforme utilizado no presente documento, os termos "células tumorais não fracionadas", "células tumorais pré-classifiçadas", "células tumorais totais", e os seus equivalentes gramaticais são utilizados indistintamente para referir-se a uma população de células tumorais isolada a partir de uma amostra de um paciente (por exemplo, uma biópsia de tumor ou efusão pleural) que não foi segregada, ou fracionada, com base na expressão de marcadores de superfície celular.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "células tumorais não-ESA+CD44+", "não-ESA+44+", "células tumorais não tumorigénicas classificadas", "células não estaminais" e os seus equivalentes gramaticais são utilizados indistintamente para referir-se a uma população tumoral a partir da qual células estaminais cancerosas ESA+CD44+ foram segregadas, ou removidas, com base na expressão de marcadores de superfície celular.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "expressão génica" refere-se ao processo de converter informação genética codificada num gene em ARN (por exemplo, ARNm, ARNr, ARNt, ou ARNsn) através da "transcrição" do gene (por exemplo, através da ação enzimática de uma ARN polimerase), e para genes codificadores de proteínas, em proteínas através da "tradução" do ARNm. A expressão génica pode ser regulada em vários estádios do processo. A "regulação positiva" ou "ativação" refere-se a regulação que aumenta a produção de produtos de expressão génica (por exemplo, ARN ou proteínas), enquanto a "regulação negativa" ou "repressão" refere-se a regulação que diminui a produção. Moléculas (por exemplo, fatores de transcrição) que estão envolvidas na regulação positiva ou regulação negativa são frequentemente chamadas "ativadores" e "repressores", respetivamente.

Os termos "níveis elevados", "níveis aumentados", "expressão elevada", "expressão aumentada", "níveis elevados" ou "expressão regulada positivamente" no que diz respeito à expressão génica são utilizados no presente documento para referir-se à expressão de um gene numa célula ou população de células, particularmente uma célula estaminal cancerosa ou uma população de células estaminais cancerosas, em níveis mais elevados do que a expressão daquele gene numa segunda célula ou população de células, por exemplo, células de tumor de cólon não fracionadas ou células de tumor de cólon não-ESA+44+. "Níveis elevados" de expressão génica referem-se à expressão de um gene numa célula estaminal cancerosa ou população de células estaminais cancerosas a níveis que são o dobro ou mais dos níveis de expressão do mesmo gene em células de tumor de cólon não fracionadas ou células de tumor de cólon não-ESA+44+. "Níveis elevados" de expressão génica também se refere à expressão de um gene numa célula estaminal cancerosa ou população de células estaminais cancerosas a níveis seis vezes ou mais os níveis de expressão do mesmo gene em células de tumor de cólon não fracionadas ou células de tumor de cólon não-ESA+44+. "Níveis elevados" de expressão génica podem ser determinados através da deteção de quantidades aumentadas de um polinucleótido (ARNm, ADNc, etc.) em células estaminais cancerosas comparadas com células de tumor de cólon não fracionadas ou células de tumor de cólon não-ESA+44+ através de, por exemplo, análise de microarranjo ou RT-PCR quantitativa. Alternativamente "níveis elevados" de expressão génica podem ser determinados através da deteção de quantidades aumentas de uma proteína em células estaminais cancerosas comparadas com células de tumor de cólon não fracionadas ou células de tumor de cólon não-ESA+44+ através de, por exemplo, ELISA, Western blot, imunofluorescência quantitativa. 0 termo "níveis não detetáveis" ou "perda de expressão" no que diz respeito à expressão génica conforme utilizado no presente documento refere-se à expressão de um gene numa célula ou população de células, particularmente uma célula estaminal cancerosa ou uma população de células estaminais cancerosas, em níveis que não podem ser distinguidos do fundo utilizando técnicas convencionais de modo que não é identificada qualquer expressão. "Níveis não detetáveis" de expressão génica podem ser determinados pela incapacidade de detetar níveis de um polinucleótido (ARNm, ADNc, etc.) em células estaminais cancerosas por cima do fundo através de, por exemplo, análise de microarranjo ou RT-PCR quantitativa. Alternativamente, "níveis não detetáveis" de expressão génica podem ser determinados pela incapacidade de detetar níveis de uma proteína em células estaminais cancerosas por cima fundo através de, por exemplo, ELISA, Western blot, ou imunofluorescência.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "níveis baixos", "níveis diminuídos", "expressão baixa", "expressão reduzida" ou "expressão diminuída" no que diz respeito à expressão génica são utilizados no presente documento para referir-se à expressão de um gene numa célula ou população de células, particularmente numa célula estaminal cancerosa ou numa população de células estaminais cancerosas, em níveis menores do que a expressão daquele gene numa segunda célula ou população de células, por exemplo, células de tumor de cólon não fracionadas ou células de tumor de cólon não-ESA+44+. "Níveis baixos" de expressão génica refere-se à expressão de um gene numa célula estaminal cancerosa ou população de células estaminais cancerosas em níveis: 1) metade ou abaixo os níveis de expressão do mesmo gene em células de tumor de cólon não fracionadas ou células de tumor de cólon não-ESA+44+ e 2) no limite inferior de deteção utilizando técnicas convencionais. "Níveis baixos" de expressão génica podem ser determinados através da deteção de quantidades diminuídas ou praticamente não detetáveis de um polinucleótido (ARNm, ADNc, etc.) em células estaminais cancerosas comparadas com células de tumor de cólon não fracionadas ou células de tumor de cólon não-ESA+44+ através de, por exemplo, análise de microarranjo ou RT-PCR quantitativa. Alternativamente "níveis baixos" de expressão génica podem ser determinados através da deteção de quantidades diminuídas ou praticamente não detetáveis de uma proteína em células estaminais cancerosas comparadas com células de tumor de cólon não fracionadas ou células de tumor de cólon não-ESA+44+ através de, por exemplo, ELISA, Western blot, ou imunofluorescência quantitativa.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "um reagente que deteta especificamente níveis de expressão" refere-se a reagentes utilizados para detetar a expressão de um ou mais genes (por exemplo, incluindo mas não limitados a, marcados de cancro da presente divulgação) . Exemplos de reagentes adequados incluem, mas não estão limitados a, sondas de ácidos nucleicos capazes de hibridizar especificamente com o gene de interesse, aptâmeros, sondas de PCR capazes de amplificar especificamente o gene de interesse e anticorpos capazes de se ligarem especificamente a proteínas expressas pelo gene de interesse. Outros exemplos não limitantes podem ser encontrados na descrição e exemplos abaixo.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "detetar uma expressão diminuída ou aumentada em relação ao controlo não canceroso" refere-se a medir o nível de expressão de um gene (por exemplo, o nível de ARNm ou proteína) em relação ao nível numa amostra de controlo não cancerosa. A expressão génica pode ser medida utilizando qualquer método adequado, incluindo mas não limitado, àqueles descritos no presente documento.

Conforme utilizado no presente documento, "proporcionar um diagnóstico" ou "informação diagnóstica" refere-se a qualquer informação que é útil para determinar se um paciente tem uma doença ou condição e/ou para classificar a doença ou condição numa categoria fenotípica ou qualquer categoria tendo significação relativamente ao prognóstico ou resposta provável ao tratamento (tanto tratamento em geral como qualquer tratamento em particular) da doença ou condição. De forma semelhante, diagnóstico refere-se a proporcionar qualquer tipo de informação diagnóstica, incluindo, mas não limitada a, se é provável que um sujeito tenha uma condição (tal como um tumor), informação relacionada com a natureza ou classificação de um tumor como por exemplo um tumor de alto risco ou um tumor de baixo risco, informação relacionada com o prognóstico e/ou informação útil para a seleção de um tratamento adequado. A seleção do tratamento pode incluir a eleição de um agente quimioterapêutico particular ou outra modalidade de tratamento tal como cirurgia ou radiação ou uma eleição sobre se administrar ou não terapêutica.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "proporcionar um prognóstico", "informação prognóstica", ou "informação preditiva" referem-se a proporcionar informação relativamente ao impacto da presença do cancro (por exemplo, conforme determinado através dos métodos diagnósticos da presente divulgação) na saúde futura de um sujeito (por exemplo, morbilidade ou mortalidade esperadas, a probabilidade de contrair cancro e o risco de metástase).

Conforme utilizado no presente documento, o termo "tecido tumoral pós-cirúrgico" refere-se a tecido canceroso (por exemplo, tecido de biópsia) que foi removido a partir de um sujeito (por exemplo, durante a cirurgia).

Conforme utilizado no presente documento, o termo "sujeito diagnosticado com cancro" refere-se a um sujeito que foi testado e que se verificou possuir células cancerosas. 0 cancro pode ser diagnosticado utilizando qualquer método adequado, incluindo mas não limitado a, biópsia, raios-X, teste sanguíneo e os métodos de diagnóstico da presente divulgação.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "tecido de biópsia", "amostra de paciente", "amostra de tumor" e "amostra de cancro" referem-se a uma amostra de células, tecido ou fluido que é removida a partir de um sujeito para a finalidade de determinar se a amostra contém tecido canceroso, incluindo células estaminais cancerosas ou para determinar o perfil de expressão génica desse tecido canceroso. Em alguma forma de realização, é obtido fluido ou tecido de biópsia devido à suspeita de que um sujeito padece de cancro. 0 fluido ou tecido de biópsia é posteriormente examinado quanto à presença ou ausência de cancro, células estaminais cancerosas, e/ou expressão da assinatura génica de células estaminais cancerosas.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "sistema de transferência génica" refere-se a quaisquer meios de administrar uma composição que compreende uma sequência de ácidos nucleicos a uma célula ou tecido. Por exemplo, sistemas de transferência génica incluem, mas não estão limitados a, vetores (por exemplo, retrovirais, adenovirais, virais adeno-associados, e outros sistemas de administração baseados em ácidos nucleicos), microinjeção de ácido nucleico nu, sistemas de administração baseados em polímeros (por exemplo, sistemas baseados em partículas metálicas e baseados em lipossomas), injeção biolística e semelhantes. Conforme utilizado no presente documento, o termo "sistema de transferência génica virai" refere-se a sistemas de transferência génica que compreendem elementos virais (por exemplo, vírus intactos, vírus modificados e componentes virais tais como ácidos nucleicos ou proteínas) para facilitar a administração da amostra a uma célula ou tecido desejado. Conforme utilizado no presente documento, o termo "sistema de transferência génica de adenovirus" refere-se a sistemas de transferência génica que compreendem vírus intactos ou alterados que pertencem à família Adenoviridae.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "sequências alvo de recombinação sítio-específica" refere-se a sequências de ácidos nucleicos que proporcionam sequências de reconhecimento para fatores de recombinação e à localização onde ocorre a recombinação.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "molécula de ácido nucleico" refere-se a qualquer molécula que contenha ácidos nucleicos, incluindo mas não limitado a, ADN ou ARN. 0 termo abrange sequências que incluem qualquer dos análogos de bases conhecidos do ADN e ARN incluindo, mas não limitados a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometi1-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster de ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, e 2,6-diaminopurina. 0 termo "gene" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, ADN) que compreende sequências codificantes necessárias para a produção de um polipéptido, precursor, ou ARN (por exemplo, ARNr, ARNt) . 0 polipéptido pode ser codificado por uma sequência codificante de comprimento completo ou por qualquer porção da sequência codificante desde que a atividade desejada ou propriedades funcionais (por exemplo, atividade enzimática, ligação a ligandos, transdução de sinais, imunogenicidade, etc.) do comprimento completo ou fragmento sejam retidas. 0 termo também abrange a região codificante de um gene estrutural e as sequências situadas em posição adjacente à região codificante nas extremidades tanto 5' como 3' numa distância de cerca de 1 kb ou mais em cada lado de modo que o gene corresponda ao comprimento do ARNm de comprimento completo. As sequências situadas a 5' da região codificante e presentes no ARNm são referidas como sequências não traduzidas 5 ' . As sequências situadas a 3' ou a jusante da região codificante e presentes no ARNm são referidas como sequências não traduzidas 3' . 0 termo "gene" abrange tanto ADNc como formas genómicas de um gene. Uma forma genómica ou clone de um gene contém a região codificante interrompida com sequências não codificantes chamadas "intrões" ou "regiões intervenientes" ou "sequências intervenientes". Os intrões são segmentos de um gene que são transcritos em ARN nuclear (ARNhn) ; os intrões podem conter elementos de regulação tais como potenciadores. Os intrões são removidos ou separados por splicing a partir do transcrito nuclear ou primário; como tal os intrões estão ausentes no transcrito de ARN mensageiro (ARNm). 0 ARNm funciona durante a tradução para especificar a sequência ou ordem dos aminoácidos num polipéptido nascente.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "gene heterólogo" refere-se a um gene que não se encontra no seu ambiente natural. Por exemplo, um gene heterólogo inclui um gene a partir de uma espécie introduzido noutra espécie . Um gene heterólogo inclui também um gene nativo de um organismo que foi alterado de alguma forma (por exemplo, mutado, adicionado em cópias múltiplas, ligado a sequências de regulação não nativas, etc). Os genes heterólogos distinguem-se dos genes endógenos no sentido em que as sequências de genes heterólogos são tipicamente unidas a sequências de ADN que não são encontradas naturalmente associadas com as sequências génicas no cromossoma ou estão associadas com porções do cromossoma não encontradas na natureza (por exemplo, genes expressos em loci onde o gene não é normalmente expresso).

Conforme utilizado no presente documento, o termo "expressão génica" refere-se ao processo de converter informação genética codificada num gene em ARN (por exemplo, ARNm, ARNr, ARNt ou ARNsn) através da "transcrição" do gene (por exemplo, através da ação enzimática de uma ARN polimerase), e para genes codificadores de proteínas, em proteínas através da "tradução" do ARNm. A expressão génica pode ser regulada em vários estádios do processo. A "regulação positiva" ou "ativação" refere-se a regulação que aumenta a produção de produtos de expressão génica (por exemplo, ARN ou proteínas), enquanto a "regulação negativa" ou "repressão" refere-se a regulação que diminui a produção. Moléculas (por exemplo, fatores de transcrição) que estão envolvidas na regulação positiva ou regulação negativa são frequentemente chamadas "ativadores" e "repressores", respetivamente.

Adicionalmente a conter intrões, as formas genómicas de um gene podem também incluir sequências situadas nas extremidades tanto 5' como 3' das sequências que estão presentes no transcrito de ARN. Estas sequências são referidas como sequências ou regiões "flanqueantes" (estas sequências flanqueantes estão situadas a 5' ou 3' das sequências não traduzidas presentes no transcrito de ARNm). A região flanqueante 5' pode conter sequências reguladoras tais como promotores e potenciadores que controlam ou influenciam a transcrição do gene. A região flanqueante 3' pode conter sequências que dirigem a terminação da transcrição, clivagem pós-transcricional e poliadenilação. 0 termo "siARNs" refere-se a ARNs de interferência curtos. Nalgumas formas de realização, os siARNs compreendem um dúplex, ou região de cadeia dupla, de cerca de 18-25 nucleótidos de comprimento; frequentemente os siARNs contêm desde cerca de dois até quatro nucleótidos não emparelhados na extremidade 3' de cada cadeia. Pelo menos uma cadeia do dúplex ou região de cadeia dupla de um siARN é substancialmente homóloga a, ou substancialmente complementar a, uma molécula de ARN alvo. A cadeia complementar a uma molécula de ARN alvo é a "cadeia antissentido"; a cadeia homóloga à molécula de ARN alvo é a "cadeia de sentido" e também é complementar à cadeia antissentido de siARN. Os siARNs também podem conter sequências adicionais; exemplos não limitantes de tais sequências incluem sequências de ligação ou ansas, bem como em hairpin e outras estruturas dobradas. Os siARNs parecem funcionar como intermediários chave no desencadeamento da interferência de ARN em invertebrados e em vertebrados, e no desencadeamento da degradação de ARN especifica de sequência durante o silenciamento génico pós-transcricional em plantas. 0 termo "interferência de ARN" ou "iARN" refere-se ao silenciamento ou diminuição da expressão génica por siARNs. É o processo de silenciamento génico pós-transcricional e especifico de sequência em animais e plantas, iniciado por siARN que é homólogo na sua região de dúplex à sequência do gene silenciado. 0 gene pode ser endógeno ou exógeno ao organismo, presente integrado num cromossoma ou presente num vetor de transfeção que não está integrado no genoma. A expressão do gene é completamente ou parcialmente inibida. A iARN também pode ser considerada para inibir a função de um ARN alvo; a função do ARN alvo pode ser completa ou parcial.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "molécula de ácido nucleico que codifica", "sequência de ADN que codifica" e "ADN que codifica" referem-se à ordem ou sequência de desoxirribonucleótidos ao longo de uma cadeia de ácido desoxirribonucleico. A ordem destes desoxirribonucleótidos determina a ordem dos aminoácidos ao longo da cadeia de polipéptido (proteína) . A sequência de ADN codifica assim para a sequência de aminoácidos.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "um oligonucleótido tendo uma sequência nucleotidica que codifica um gene" e "polinucleótido tendo uma sequência nucleotidica que codifica um gene" significa uma sequência de ácidos nucleicos que compreende a região codificante de um gene ou, por outras palavras, a sequência de ácidos nucleicos que codifica um produto génico. A região codificante pode estar presente sob a forma de ADNc, ADN ou ARN genómico. Quando presente sob uma forma de ADN, o oligonucleótido ou polinucleótido pode ser de cadeia simples (ou seja, a cadeia de sentido) ou de cadeia dupla. Elementos de controlo adequados tais como potenciadores/promotores, junções de excisão-união, sinais de poliadenilação, etc. podem ser colocados em estreita proximidade com a região codificante do gene se necessário para permitir uma iniciação apropriada da transcrição e/ou processamento correto do transcrito de ARN primário. Alternativamente, a região codificante utilizada nos vetores de expressão da presente divulgação pode conter potenciadores/promotores endógenos, junções de excisão-união, sequências intervenientes, sinais de poliadenilação, etc. ou uma combinação de elementos de controlo tanto endógeno como exógeno.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "porção" quando em referência a uma sequência nucleotidica (como em "uma porção de uma dada sequência nucleotidica") refere-se a fragmentos dessa sequência. Os fragmentos podem variar em tamanho desde quatro nucleótidos até à sequência de nucleótidos inteira menos um nucleótido (10 nucleótidos, 20, 30, 40, 50, 100, 200, etc.).

As frases "híbrida", "híbrida seletivamente", ou "híbrida especificamente" referem-se à ligação ou duplexação de uma molécula apenas a uma sequência nucleotidica particular sob condições de hibridação restringentes quando essa sequência está presente numa mistura complexa (por exemplo, uma biblioteca de ADNs ou ARNs). Veja-se, por exemplo, Andersen (1998) Nucleic Acid Hybridization Springer-Verlag; Ross (ed. 1997) Nucleic Acid Hybridization Wiley. A frase "condições de hibridação restringentes" refere-se a condições sob as quais uma sonda irá hibridizar com a sua subsequência alvo, tipicamente numa mistura complexa de ácidos nucleicos, mas não com outras sequências. As condições restringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Sequências mais longas hibridam especificamente a temperaturas mais elevadas. Um guia extenso sobre a hibridação de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Geralmente, as condições restringentes são selecionadas para serem cerca de 5-10 °C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência especifica numa força iónica definida. O Tm é a temperatura (sob força iónica definida, pH, e concentração nucleica) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridam com a sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, no Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio) . As condições restringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,0 M de ião sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de ião sódio (ou outros sais) num pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleótidos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleótidos). As condições restringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes destabilizantes tais como formamida. Para hibridação de elevada restringência, um sinal positivo é, pelo menos, duas vezes o fundo, ou 10 vezes a hibridação de fundo. Condições de hibridação restringentes ou de elevada restringência incluem: formamida a 50%, 5x SSC, e SDS a 1% incubados a 42 °C ou 5x SSC e SDS a 1% incubados a 65 °C, com uma lavagem em 0,2x SSC e SDS a 0,1% a 65 °C. Para PCR, uma temperatura de cerca de 36 °C é típica para amplificação de baixa restringência, embora as temperaturas de hibridação possam variar desde cerca de 32 °C até cerca de 48 °C dependendo do comprimento do iniciador. Para amplificação por PCR de elevada restringência, uma temperatura de cerca de 62 °C é típica, embora temperaturas de hibridação de elevada restringência possam variante desde cerca de 50 °C até cerca de 65 °C, dependendo do comprimento e especificidade do iniciador. Condições de ciclo típicas para ambas as amplificações de elevada e baixa restringência incluem uma fase de desnaturação de 90 °C a 95 °C durante 30-120 segundos, uma fase de hibridação que dura 30-120 segundos, e uma fase de extensão de cerca de 72 °C durante 1-2 min.

Os termos "em combinação operável", "em ordem operável" e "operativamente ligado" conforme utilizados no presente documento referem-se à ligação de sequências de ácidos nucleicos de tal modo que uma molécula de ácido nucleico capaz de direcionar a transcrição de um dado gene e/ou a síntese de uma molécula proteica desejada é produzida. O termo também se refere à ligação de sequências de aminoácidos de tal modo que uma proteína funcional é produzida. 0 termo "isolado" quando utilizado em relação a um ácido nucleico, como em "um oligonucleótido isolado" ou "polinucleótido isolado" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que é identificada e separada a partir de, pelo menos, um componente ou contaminante com o qual está vulgarmente associada na sua fonte natural. Ácido nucleico isolado está assim presente sob uma forma ou situação que é diferente daquela na qual é encontrado na natureza. Em contraste, ácidos nucleicos não isolados tal como ácidos nucleicos tais como ADN ou ARN encontrados no estado em que existem na natureza. Por exemplo, uma dada sequência de ADN (por exemplo, um gene) é encontrada no cromossoma da célula hospedeira em proximidade com genes vizinhos; sequências de ARN, tais como uma sequência de ARNm específica que codifica uma proteína específica, são encontradas na célula como uma mistura com numerosos outros ARNms que codificam uma multitude de proteínas. Contudo, ácido nucleico isolado que codifica uma dada proteína inclui, por meio de exemplo, tal ácido nucleico nas células que expressa vulgarmente a dada proteína onde o ácido nucleico se encontra numa localização cromossómica diferente daquela das células naturais, ou que está, de outra forma, flanqueado por uma sequência de ácidos nucleicos diferente daquela encontrada na natureza. 0 ácido nucleico, oligonucleótido ou polinucleótido isolado pode estar presente sob a forma de cadeia simples ou cadeia dupla. Quando um ácido nucleico, oligonucleótido ou polinucleótido isolado deve ser utilizado para expressar uma proteína, o oligonucleótido ou polinucleótido irá conter, no mínimo, a cadeia de sentido ou codificante (ou seja, o oligonucleót ido ou polinucleót ido pode ser de cadeia simples) , mas pode conter tanto as cadeias de sentido como antissentido (ou seja, o oligonucleót ido ou polinucleót ido pode ser de cadeia dupla).

De forma semelhante, em determinadas formas de realização, o termo "isolado" quando utilizado em relação a um polipéptido, como em "um polipéptido isolado" ou "um anticorpo isolado" refere-se a um polipéptido (ou anticorpo) que é separado a partir de, pelo menos, um componente ou contaminante com o qual está vulgarmente associado na sua fonte natural. Anticorpos isolados ou outros polipéptidos isolados estão, portanto, presentes sob uma forma ou situação que é diferente daquela na qual são encontrados na natureza. Em determinadas formas de realização, um polipéptido isolado (por exemplo, anticorpo) é substancialmente puro.

Conforme utilizado no presente documento, "substancialmente puro" refere-se a material que é pelo menos 50% puro (ou seja, isento de contaminantes), preferivelmente pelo menos 90% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% puro, ou mais preferivelmente ainda pelo menos 99% puro. "Sequência de aminoácidos" e termos tais como "polipéptido", "proteína", ou "péptido" não se destinam a limitar a sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos nativa, completa associada com a molécula de proteína recitada. O termo "proteína nativa" é utilizado no presente documento para indicar que uma proteína não contém resíduos de aminoácidos codificados por sequências de vetor; ou seja, a proteína nativa contém apenas aqueles aminoácidos encontrados na proteína conforme ocorre na natureza. Uma proteína nativa pode ser produzida de forma recombinante ou pode ser isolada a partir de uma fonte de ocorrência natural.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "porção" quando em referência a uma proteína (como em "uma porção de uma dada proteína") refere-se a fragmentos dessa proteína. Os fragmentos podem variar em tamanho desde quatro resíduos de aminoácidos até à sequência de aminoácidos inteira menos um aminoácido. O termo "Southern blot", refere-se à análise de ADN em géis de agarose ou acrilamida para fracionar o ADN de acordo com o tamanho seguido por transferência do ADN a partir do gel para um suporte sólido, tal como uma membrana de nylon ou nitrocelulose. 0 ADN imobilizado é depois sondado com uma sonda marcada para detetar uma espécie de ADN complementar à sonda utilizada. 0 ADN pode ser clivado com enzimas de restrição antes da eletroforese. Após a eletroforese, o ADN pode ser parcialmente depurinado e desnaturado antes de, ou durante, a transferência para o suporte sólido. Os Southern blots são uma ferramenta padrão de biólogos moleculares (J. Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque, pp 9.31-9.58 [1989]). 0 termo "Northern blot", conforme utilizado no presente documento refere-se à análise de ARN através de eletroforese em géis de agarose para fracionar o ARN de acordo com o tamanho seguido por transferência do ARN a partir do gel para um suporte sólido, tal como uma membrana de nylon ou nitrocelulose. 0 ARN imobilizado é depois sondado com uma sonda marcada para detetar uma espécie de ARN complementar à sonda utilizada. Os Northern blots são uma ferramenta padrão de biólogos moleculares (J. Sambrook et al., supra, pp 7.39-7.52 [1989]). 0 termo " Western blot" refere-se à análise de proteína (s) (ou polipéptidos) imobilizadas num suporte tal como nitrocelulose ou uma membrana. As proteínas são feitas correr em géis de acrilamida para separar as proteínas, seguido de transferência da proteína a partir do gel para um suporte sólido, tal como uma membrana de nylon ou nitrocelulose. As proteínas imobilizadas são depois expostas a anticorpos com reatividade contra um antigénio de interesse. A ligação dos anticorpos pode ser detetada através de vários métodos, incluindo a utilização de anticorpos radiomarcados. 0 termo "transgene" conforme utilizado no presente documento refere-se a um gene exógeno que é colocado num organismo através de, por exemplo, introdução do gene exógeno em ovos recém-fertilizados ou embriões precoces. 0 termo "gene exógeno" refere-se a qualquer ácido nucleico (por exemplo, sequência génica) que é introduzida no genoma de um animal através de manipulações experimentais e pode incluir sequências génicas encontradas nesse animal desde que o gene introduzido não resida na mesma localização que o gene de ocorrência natural.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "vetor" é utilizado em referência a moléculas de ácidos nucleicos que transferem segmento (s) de ADN a partir de uma célula para outra. 0 termo "veiculo" é algumas vezes utilizando indistintamente com "vetor". Os vetores são frequentemente derivados a partir de plasmideos, bacteriófagos ou vírus vegetais ou animais. 0 termo "vetor de expressão" conforme utilizado no presente documento refere-se a uma molécula de ADN recombinante contendo uma sequência codificante desejada e sequências de ácidos nucleicos apropriadas necessárias para a expressão da sequência codificante operativamente ligada num organismos hospedeiro particular. Sequências de ácidos nucleicos necessárias para a expressão em procariotas incluem, normalmente, um promotor, um operador (opcional) e um sítio de ligação a ribossomas, frequentemente em conjunto com outras sequências. As células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, potenciadores e sinais de terminação e poliadenilação.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "in vitro" refere-se a um ambiente artificial e a processos ou reações que ocorrem dentro de um ambiente artificial. Os ambientes in vitro podem consistir em, mas não estão limitados a, tubos de ensaio e cultura celular. 0 termo "in vivo" refere-se ao ambiente natural (por exemplo, um animal ou uma célula) e a processos ou reações que ocorrem dentro de um ambiente natural.

Os termos "composto de teste" e "composto candidato" referem-se a qualquer entidade química, agente farmacêutico, fármaco, e semelhantes, que seja um candidato para utilização para tratar ou prevenir uma doença, enfermidade, moléstia, ou distúrbio da função corporal (por exemplo, cancro) . Os compostos de teste compreendem compostos terapêuticos tanto conhecidos como potenciais. Um composto de teste pode ser determinado como sendo terapêutico através de rastreio utilizando os métodos de rastreio da presente divulgação. Em algumas formas de realização da presente divulgação, os compostos de teste incluem compostos antissentido.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "amostra" é utilizado no seu sentido mais lato. Num sentido, destina-se a incluir um espécime ou cultura obtida a partir de qualquer fonte, bem como amostras biológicas e ambientais. As amostras biológicas podem ser obtidas a partir de animais (incluindo seres humanos) e englobam fluidos, sólidos, tecidos e gases. As amostras biológicas incluem produtos sanguíneos, tais como plasma, soro e semelhantes. As amostras ambientais incluem material ambiental tal como matéria superficial, solo, água, cristais e amostras industriais. Tais exemplos não devem, no entanto, ser considerados como limitantes dos tipos de amostras aplicáveis à presente divulgação.

Através de "ligação específica" ou "ligação única" pretende-se dizer quando um agente se liga apenas a um ligando, recetor ou antigénio particular. Através de "ligação seletiva" pretende-se dizer quando um agente se liga preferivelmente a um ligando, recetor, ou antigénio em detrimento de outros com uma magnitude de cerca de duas vezes ou mais, cerca de cinco vezes ou mais, cerca de oito vezes ou mais, ou cerca de dez vezes ou mais.

Conforme utilizado no presente documento, "cerca" refere-se a mais ou menos 1% do número indicado. Por exemplo, "cerca de 10%" indica um intervalo de 9% até 11%.

Diz-se que duas sequências de polinucleótidos ou polipéptidos são "idênticas" ou têm "identidade" se a sequência de nucleótidos ou aminoácidos nas duas sequências é a mesma quando alinhada para correspondência máxima conforme descrito abaixo. As comparações entre duas sequências são tipicamente realizadas através da comparação das sequências ao longo de uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de semelhança de sequência.

Nalgumas formas de realização, a "percentagem de identidade" é determinada através da comparação de duas sequências otimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a posição da sequência de polinucleótidos ou polipéptidos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, lacunas) de 20 porcento ou menos, normalmente 5 a 15 porcento, ou 10 a 12 porcento, em comparação com as sequências de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições nas quais as bases de ácidos nucleicos ou resíduos de aminoácidos idênticos ocorrem em ambas sequências para dar o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na sequência de referência (ou seja, o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para dar a percentagem da identidade de sequência. Nalgumas formas de realização, a janela de comparação pode ser mais pequena (por exemplo, 7 ou 10 aminoácidos).

O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser levado a cabo utilizando o programa Megalign no conjunto de aplicações Lasergene de software bioinformático (DNASTAR, Inc. , Madison, Wis.), utilizando parâmetros padrão. Alternativamente, a % (aminoácidos) de identidade pode ser obtida utilizando um dos programas disponíveis publicamente BLAST ou BLAST-2. O programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). A percentagem (aminoácidos) de identidade de sequência pode também ser determinada utilizando o programa de comparação de sequências NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). O programa BLAST está baseado no método de alinhamento de Karlin e Altschul. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 87:2264-2268 (1990) e como discutido em Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei . EUA 90:5873-5877 (1993); e Altschul et al. , Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997).

Em determinadas formas de realização, termos tais como "tratando" ou "tratamento" ou "para tratar" referem-se a ambos 1) medidas terapêuticas que curam, abrandam, reduzem os sintomas de, e/ou detêm a progressão de uma condição ou distúrbio patológico diagnosticado e 2) medidas profiláticas ou de prevenção que previnem ou abrandam o desenvolvimento de uma condição ou distúrbio patológico visado. Como tal, sujeitos com necessidade de tratamento incluem aqueles que já padecem do distúrbio; aqueles propensos a padecer do distúrbio; aqueles que podem ter tido o distúrbio e nos quais o distúrbio pode recorrer; e, aqueles nos quais o distúrbio deve ser prevenido. Em determinadas formas de realização, um sujeito é "tratado" com êxito se o paciente mostra um ou mais dos seguintes: uma redução do número de, ou ausência completa de, células cancerosas; uma redução do tamanho do tumor; inibição ou ausência de infiltração de células cancerosas nos órgãos periféricos incluindo a disseminação do cancro em tecido mole e osso; inibição de ou ausência de metástases tumorais; inibição de ou ausência de crescimento tumoral; alivio de um ou mais sintomas associados com o cancro especifico; morbilidade e/ou mortalidade reduzidas; melhoria da qualidade de vida; uma redução do número de, ou ausência completa de, células estaminais cancerosas; uma diminuição na proporção de células estaminais cancerosas num tumor sólido (em relação a células no tumor que não são células estaminais cancerosas); inibição da proliferação de células estaminais cancerosas; e um atraso, ou uma ausência, de relapso.

Em determinadas formas de realização, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo, polipéptido, polinucleótido, molécula orgânica pequena, ou outro fármaco eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio num sujeito. No caso do cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode, em determinadas formas de realização, reduzir o número de células cancerosas; reduzir o número de células estaminais cancerosas; reduzir a proporção de células estaminais cancerosas num tumor sólido (em relação a células que não são células estaminais cancerosas); reduzir o tamanho do tumor; inibir ou deter a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir e/ou deter metástases tumorais; inibir e deter o crescimento tumoral; e/ou aliviar em certa medida um ou mais dos sintomas associados com o cancro; inibir a proliferação de células estaminais cancerosas; ou resultar numa combinação de tais efeitos em células cancerosas.

Os termos "inibir" e "inibindo" são utilizando indistintamente no presente documento com "interromper" e "interrompendo".

Marcadores de Cancro de Células Estaminais de Tumor Sólido A presente divulgação proporciona marcadores cuja expressão é diferencialmente expressa em células estaminais de cancro do colón em comparação com células de tumor de cólon não fracionadas ou células de tumor de cólon não-ESA+44+. Tais marcadores encontram utilizada no diagnóstico e tratamento (por exemplo, direcionamento terapêutico) de vários cancros, incluindo cancro da mama e do cólon. Em determinadas formas de realização, o marcador de células estaminais de tumor sólido é LGR5.

Nalgumas formas de realização, a presente divulgação proporciona métodos para a deteção da expressão de marcadores de cancro de células estaminais (por exemplo, marcadores de cancro de células estaminais de cancro da mama). Nalgumas formas de realização, a expressão é medida diretamente (por exemplo, ao nível do ARN ou da proteína). Nalgumas formas de realização, a expressão é detetada em amostras de tecido (por exemplo, tecido de biópsia). Noutras formas de realização, a expressão é detetada em fluidos corporais (por exemplo, incluindo mas não limitados a, plasma, soro sangue total, muco e urina). A presente divulgação proporciona adicionalmente painéis e kits para a deteção de marcadores. Nalgumas formas de realização, a presença de um marcador de cancro de células estaminais é utilizada para proporcionar um prognóstico para um sujeito. A informação proporcionada também é utilizada para dirigir o curso do tratamento. Por exemplo, se se verifica que um sujeito possui um marcador indicativo de uma célula estaminal de tumor sólido, terapêuticas adicionais (por exemplo, terapêuticas hormonais ou de radiação) podem ser iniciadas num ponto mais precoce quando é mais provável que sejam eficazes (por exemplo, antes de metástases). Adicionalmente, se se verifica que um sujeito tem um tumor que não é responsivo à terapêutica hormonal, o custo e inconveniência de tais terapêuticas podem ser evitados. A presente divulgação não está limitada aos marcadores descritos acima. Qualquer marcador adequado que se correlaciona com cancro ou com a progressão de cancro pode ser utilizado. Marcadores adicionais também são contemplados como estando dentro do âmbito da presente divulgação. Qualquer método adequado pode ser utilizado para identificar e caracterizar marcadores de cancro adequados para utilização nos métodos da presente divulgação, incluindo mas não limitados, àqueles descritos no Exemplo 1 ilustrativo abaixo. Por exemplo, nalgumas formas de realização, os marcadores identificados como sendo regulados positiva ou negativamente em células estaminais de tumor sólido utilizando os métodos de microarranjo de expressão génica da presente divulgação são caracterizados adicionalmente utilizando microarranjo de tecido, imunohistoquimica, análise por Northern blot, siARN ou inibição de ARN antissentido, análise de mutação, investigação da expressão com resultado clinico, bem como outros métodos divulgados no presente documento.

Nalgumas formas de realização, a presente divulgação proporciona um painel para a análise de uma pluralidade de marcadores. 0 painel permite a análise simultânea de múltiplos marcadores correlacionando-se com carcinogénese e/ou metástases. Dependendo do sujeito, os painéis podem ser analisados isoladamente ou em combinação de modo a proporcionar o melhor diagnóstico e prognóstico possíveis. Os marcadores para inclusão num painel são selecionados através de rastreio quanto ao seu valor preditivo utilizando qualquer método adequado, incluindo mas não limitados, àqueles descritos nos exemplos ilustrativos abaixo.

1. Deteção de ARN

Nalgumas formas de realização, a deteção de marcadores de cancro de células estaminais de tumor sólido é realizada através da medição da expressão de ARNm correspondente numa amostra de tecido (por exemplo, tecido de cancro da mama). A expressão de ARNm pode ser medida através de qualquer método adequado, incluindo mas não limitados, àqueles divulgados abaixo.

Nalgumas formas de realização, o ARN é detetado através de análise de Northern blot. A análise de Northern blot envolve a separação de ARN e hibridação de uma sonda marcada de forma complementar.

Em ainda outras formas de realização, ARN (ou ADNc correspondente) é detetado através de hibridação com uma sonda oligonucleotídica). Uma variedade de ensaios de hibridação utilizando uma variedade de tecnologias para hibridação e deteção estão disponíveis. Por exemplo, nalgumas formas de realização, o ensaio TaqMan (PE Biosystems, Foster City, CA; Vejam-se por exemplo, os documentos de Patente U.S. N.°s 5.962.233 e 5.538.848) é utilizado. 0 ensaio é realizado durante uma reação de PCR. 0 ensaio TaqMan explora a atividade de exonuclease 5'-3' da ADN polimerase AMPLITAQ GOLD. Uma sonda consistindo num oligonucleótido com um corante repórter 5' (por exemplo, um corante fluorescente) e um corante silenciador 3' é incluído na reação de PCR. Durante a PCR, se a sonda se liga ao seu alvo, a atividade nucleotídica 5'-3' da polimerase AMPLITAQ GOLD cliva a sonda entre o corante repórter e o silenciador. A separação do corante repórter do corante silenciador resulta num aumento de fluorescência. 0 sinal acumula-se com cada ciclo de PCR e pode ser monitorizado com um fluorómetro.

Ainda noutras formas de realização, a PCR de transcriptase reversa (RT-PCR) é utilizada para detetar a expressão de ARN. Na RT-PCR, o ARN é enzimaticamente convertido em ADN complementar ou "ADNc" utilizando uma enzima transcriptase reversa. 0 ADNc é depois utilizado como um molde para uma reação de PCR. Os produtos de PCR podem ser detetados por qualquer método adequado, incluindo mas não limitados a, eletroforese em gel e coloração com um corante específico de ADN ou hibridação com uma sonda marcada. Nalgumas formas de realização, o método de PCR de transcriptase reversa quantitativa com misturas padronizadas de moldes competitivos descrito nos documentos de patente N.°s 5.639.606, 5.643.765 e 5.876.978 é utilizado. 2. Deteção de Proteína

Noutras formas de realização, a expressão génica de marcadores de cancro de células estaminais tais como LGR5 é detetada através da medição da expressão da proteína ou polipéptido correspondente. A expressão proteica pode ser detetada através de qualquer método adequado. Nalgumas formas de realização, as proteínas são detetadas por imunohistoquímica. Noutras formas de realização, as proteínas são detetadas através da sua ligação a um anticorpo produzido contra a proteína. A geração de anticorpos é descrita abaixo. A ligação de anticorpo é detetada através de técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, radioimunoensaio, ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática), imunoensaios do tipo "sanduíche", ensaios imunoradiométricos, reações de precipitação de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, imunoensaios in situ (por exemplo, utilizando ouro coloidal, marcadores enzimáticos ou de radioisótopos, por exemplo),

Western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutinação (por exemplo, ensaios de aglutinação em gel, ensaios de hemaglutinação, etc.), ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A, e ensaios de imunoeletroforese, etc.

Numa forma de realização, a ligação de anticorpo é detetada através da deteção de um marcador no anticorpo primário. Noutra forma de realização, o anticorpo primário é detetado através da deteção da ligação de um anticorpo secundário ou reagente ao anticorpo primário. Numa forma de realização adicional, o anticorpo secundário é marcado. Muitos métodos são conhecidos na técnica para deteção da ligação num imunoensaio e estão dentro do âmbito da presente divulgação.

Nalgumas formas de realização, um ensaio de deteção automatizado é utilizado. Métodos para a automatização de imunoensaios incluem aqueles descritos nos documentos de patente U.S. 5.885.530, 4.981.785, 6.159.750, e 5.358.691.

Nalgumas formas de realização, a análise e apresentação de resultados é também automatizada. Por exemplo, nalgumas formas de realização, software que gera um prognóstico baseado na presença ou ausência de uma série de proteínas correspondentes aos marcadores de cancro é utilizado.

Noutras formas de realização, o imunoensaio descrito nos documentos de Patente U.S. N°s 5.599.677 e 5.672.48. 3. Tecnologia de Microarranjo de ADNc

Os microarranjos de ADNc consistem em múltiplos (normalmente milhares) de diferentes ADNcs aplicados em manchas (normalmente utilizando um dispositivo robótico aplicador de manchas) em localizações conhecidas num suporte sólido, tal como uma lâmina de vidro de microscópio. Os ADNcs são tipicamente obtidos através de amplificação por PCR de insertos de bibliotecas de plasmídeos utilizando iniciadores complementares à porção de estrutura principal do vetor do plasmídeo ou ao próprio gene para genes onde a sequência é conhecida. Os produtos de PCR adequados para a produção de microarran jos têm, tipicamente, entre 0,5 e 2,5 kB de comprimento. ADNcs de comprimento completo, marcadores de sequência expressa (ESTs) , ou ADNcs escolhidos aleatoriamente a partir de qualquer biblioteca de interesse podem ser escolhidos. ESTs são ADNcs parcialmente sequenciados conforme descrito, por exemplo, em Hiller, et al.f 1996, 6:807-828. Embora alguns ESTs correspondam a genes conhecidos, frequentemente, muito pouca ou nenhuma informação relacionada com qualquer EST particular está disponível, exceto para uma pequena quantidade de sequência 3' e/ou 5' e, possivelmente, o tecido de origem do ARNm a partir do qual o EST foi derivado. Como será apreciado por um perito na especialidade, em geral, os ADNcs contêm informação de sequência suficiente para identificar unicamente um gene dentro do genoma humano. Além disso, em geral, os ADNcs são de comprimento suficiente para hibridar, seletivamente, especificamente ou unicamente, com ADNc obtido a partir de ARNm derivado a partir de um único gene sob as condições de hibridação da experiência.

Numa experiência de microarranjo típica, Um microarranjo é hibridado com ARN marcado diferencialmente, ADN, ou populações de ADNc derivadas a partir de duas amostras diferentes. Mais frequentemente, ARN (seja ARN total ou ARN poli A+) é isolado a partir de células ou tecidos de interesse e é inversamente transcrito para dar ADNc. A marcação é normalmente realizada durante a transcrição reversa através da incorporação de um nucleótido marcado na mistura de reação. Embora vários marcadores possam ser utilizados, mais frequentemente, o nucleótido é conjugado com os corantes fluorescentes Cy3 ou Cy5. Por exemplo, Cy5-dUTP e Cy3-dUTP podem ser utilizados. ADNc derivado a partir de uma amostra (representando, por exemplo, um tipo celular particular, tipo celular ou condição de crescimento) é marcado com um fluoróforo enquanto ADNc derivado a partir de uma amostra secundária (representando, por exemplo, um tipo celular, tipo tecidual, ou condição de crescimento diferente) é marcado com o segundo fluoróforo. Quantidades semelhantes de material marcado a partir das duas amostras são co-hibridadas com o microarranjo. No caso de uma experiência de microarranjo na qual as amostras são marcadas com Cy5 (que emite fluorescência vermelha) e Cy3 (que emite fluorescência verde), os dados primários (obtidos através de rastreio do microarranjo utilizando um detetor capaz de detetar quantitativamente intensidade de fluorescência) são razões de intensidade de fluorescência (vermelho (red)/verde (green), R/G) . Estas razões representam as concentrações relativas de moléculas de ADNc que hibridam com os ADNcs representados no microarranjo e que refletem assim os níveis de expressão relativos do ARNm correspondendo a cada ADNc/gene representado no microarranjo.

Cada experiência de microarranjo pode proporcionar dezenas de milhares de pontos de dados, cada representando a expressão relativa de um gene particular nas duas amostras. A organização e análise apropriada dos dados é de importância chave, e vários programas informáticos que incorporam ferramentas estatísticas padrão foram desenvolvidos para facilitar a análise dos dados. Uma base para organizar os dados de expressão génica é agrupar genes com padrões de expressão semelhantes em conjunto em agrupamentos. Um método para realizar a análise hierárquica de agrupamento e de exibição de dados derivados a partir de experiências de microarranjo é descrito em Eisen et al. , 1998, PNAS 95:14863-14868. Conforme aí descrito, o agrupamento pode ser combinado com uma representação gráfica dos dados primários nos quais cada ponto de dados é representado com uma cor que representa quantitativamente e qualitativamente aquele ponto de dados. Ao converter os dados a partir de um grande quadro de números num formato visual, este processo facilita uma análise intuitiva dos dados. Informações e detalhes adicionais com respeito às ferramentas matemáticas e/ou à própria abordagem de agrupamento podem ser encontrados, por exemplo, em Sokal e Sneath, Principles of numerical taxonomy, xvi, 359, W. H.

Freeman, San Francisco, 1963; Hartigan, Clustering algorithms, xiii, 351, Wiley, Nova Iorque, 1975; Pauli et al., 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81:1088-92; Weinstein et al. 1992, Science 258:447-51; van Osdol et al. , 1994, J. Natl. Cancer Inst. 86:1853-9; e Weinstein et al., 1997, Science, 275:343-9.

Detalhes adicionais dos métodos experimentais utilizados na presente divulgação são encontrados nos Exemplos. Informação adicional que descreve os métodos para fabrico e utilização dos microarranjos é encontrada no documento de Patente U.S. N.° 5.807.522. Instruções para a construção de hardware de microarranjos (por exemplo, dispositivos de arranjo e scanners) utilizando partes comercialmente disponíveis podem ser encontradas em http://cmgm.stanford.edu/pbr-own/ e em Cheung et al., 1999, Nat. Genet. Supplement 21:15-19. Discussões adicionais sobre tecnologia e protocolos de microarranjos para a preparação de amostras e realização de experiências de microarranjo são encontrados em, por exemplo, DNA arrays for analysis of gene expression, Methods Enzymol, 303:179-205, 1999; Fluorescence-based expression monitoring using microarrays, Methods Enzymol, 306: 3-18, 1999; e M. Schena (ed.), DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, RU, 1999. Descrições sobre como utilizar um dispositivo de arranjo e o software associado são encontradas em http://cmgm.Stanford.edu/pbrown/mguide/arrayerHTML/ArrayerD ocs.html. 4. Análise dos Dados

Nalgumas formas de realização, um programa de análise baseado em computador é utilizado para traduzir os dados não processados gerados pelo ensaio de deteção (por exemplo, a presença, ausência, ou quantidade de um dado marcador ou marcadores) em dados de valor preditivo para um clínico. 0 clínico pode aceder aos dados preditivos utilizando quaisquer métodos adequados. Como tal, nalgumas formas de realização, a presente divulgação proporciona o benefício adicional de que o clínico, que não é provável que tenha formação em genética ou biologia molecular, não necessite de compreender os dados não processados. Os dados são apresentados diretamente ao clínico na sua forma mais útil. 0 clínico é então capaz de utilizar imediatamente a informação de modo a otimizar o cuidado do sujeito. A presente divulgação contempla qualquer método capaz de receber, processar e transmitir a informação desde e para laboratórios que realizam os ensaios, proporcionar informação a pessoal médico e sujeitos. Por exemplo, em algumas formas de realização da presente divulgação, uma amostra (por exemplo, uma biópsia ou uma amostra de urina ou soro) é obtida a partir de um sujeito e é enviada a um serviço de estabelecimento de perfis (por exemplo, um laboratório clínico numa instalação médica, negócio de estabelecimento de perfis genómicos, etc.), localizado em qualquer parte do mundo (por exemplo, num país diferente do pais onde o sujeito reside ou onde a informação é finalmente utilizada) para gerar dados não processados. Quando a amostra compreende um tecido ou outra amostra biológica, o sujeito pode visitar um centro médico para que se obtenha a amostra e seja enviada ao centro de estabelecimento de perfis, ou os sujeitos podem recolher a amostra eles próprios e enviá-la diretamente a um centro de estabelecimento de perfis. Quando a amostra compreende informação biológica previamente determinada, as informações podem ser enviadas diretamente para o serviço de estabelecimento de perfis pelo sujeito (por exemplo, um cartão de informação contendo as informações pode ser digitalizado por um computador e os dados transmitidos para um computador do centro de estabelecimento de perfis usando um sistema de comunicação eletrónica). Uma vez recebido pelo serviço de estabelecimento de perfis, a amostra é processada e um perfil é produzido (por exemplo, dados de expressão), específico para as informações de diagnóstico ou prognóstico desejadas para o sujeito.

Os dados de perfil são então preparados num formato adequado para interpretação por um médico assistente. Por exemplo, em vez de fornecer dados de expressão não processados, o formato preparado pode representar um diagnóstico ou avaliação de riscos para o sujeito, juntamente com recomendações para determinadas opções de tratamento. Os dados podem ser exibidos ao clinico por qualquer método adequado. Por exemplo, nalgumas formas de realização, o serviço de estabelecimento de perfis gera um relatório que pode ser impresso para o clinico (por exemplo, no ponto de cuidados) ou exibido ao clinico num monitor de computador.

Nalgumas formas de realização, a informação é analisada primeiramente no ponto de cuidados ou numa instalação regional. Os dados não processados são então enviados a uma instalação de processamento central para análise posterior e/ou para converter os dados não processados em informação útil para um clinico ou paciente. A instalação de processamento central proporciona a vantagem de privacidade (todos os dados são armazenados numa instalação central, com protocolos de segurança uniformes), velocidade e uniformidade da análise de dados. A instalação de processamento central pode, em seguida, controlar o destino dos dados após o tratamento do sujeito. Por exemplo, utilizando um sistema de comunicação eletrónica, a instalação central pode proporcionar dados ao clinico, ao sujeito ou a investigadores.

Em algumas formas de realização, o sujeito é capaz de aceder diretamente aos dados usando o sistema de comunicação eletrónica. 0 sujeito pode escolher qualquer outra intervenção ou aconselhamento com base nos resultados. Em algumas formas de realização, os dados são utilizados para fins de investigação. Por exemplo, os dados podem ser utilizados para otimizar adicionalmente a inserção ou eliminação de marcadores como indicadores úteis de uma condição ou estádio da doença particular. 5. Kits

Ainda noutras formas de realização, a presente divulgação proporciona kits para a deteção e caracterização de cancro, ou para modular a atividade de um péptido expresso por um ou mais marcadores de células estaminais cancerosas, tal como LGR5. Em algumas formas de realização, os kits contêm anticorpos específicos para um marcador de cancro, em adição aos reagentes de deteção e tampões. Noutras formas de realização, os kits contêm reagentes específicos para a deteção de ARNm ou de ADNc (por exemplo, sondas ou iniciadores oligonucleotídicos). Em algumas formas de realização, os kits contêm todos os componentes necessários e/ou suficientes para realizar um ensaio de deteção, incluindo todos os controlos, orientações para realizar os ensaios e qualquer software necessário para a análise e apresentação de resultados.

Uma outra forma de realização da presente divulgação compreende um kit para testar quanto à presença de polinucleótidos ou proteínas, por exemplo, numa amostra de tecido ou num fluido corporal, de uma assinatura de gene de células estaminais de tumor sólido, tal como a assinatura de alfa-catenina. 0 kit pode compreender, por exemplo, um anticorpo para a deteção de um polipéptido ou uma sonda para a deteção de um polinucleótido. Adicionalmente, o kit pode compreender uma amostra de referência ou controlo; instruções para o processamento de amostras, realização do teste e interpretação dos resultados; e tampões e outros reagentes necessários para efetuar o teste. Em certas formas de realização o kit compreende um painel de anticorpos para a deteção da expressão de uma ou mais das proteínas codificadas pelos genes da assinatura alfa-catenina. Noutras formas de realização, o kit compreende pares de iniciadores para a deteção da expressão de um ou mais dos genes da assinatura do gene de células estaminais de tumor sólido. Noutras formas de realização o kit compreende um arranjo de ADNc ou de oligonucleot idos para a deteção da expressão de um ou mais dos genes da assinatura do gene de células estaminais de tumor sólido. 6. Produção de Imagens in vivo

Em algumas formas de realização, técnicas de produção de imagens in vivo são utilizadas para visualizar a expressão de marcadores de cancro num animal (por exemplo, um ser humano ou mamífero não humano) . Por exemplo, em algumas formas de realização, ARNm ou proteína de marcador de cancro é marcada, utilizando um anticorpo marcado específico para o marcador de cancro. Um anticorpo especificamente ligado e marcado pode ser detetado num indivíduo utilizando um método de produção de imagens in vivo, incluindo, mas não limitado a, produção de imagens com radionuclídeos, tomografia de emissão de positrões, tomografia axial computorizada, raios-X ou método de produção de imagens por ressonância magnética, deteção de fluorescência e deteção quimioluminescente. Métodos para a geração de anticorpos para os marcadores de cancro da presente divulgação são descritos abaixo.

Os métodos de produção de imagens in vivo da presente divulgação são úteis no diagnóstico de cancros que expressam os marcadores de cancro de células estaminais de tumor sólido da presente divulgação (por exemplo, no cancro da mama). A produção de imagens in vivo é utilizada para visualizar a presença de um marcador indicativo do cancro. Tais técnicas permitem o diagnóstico, sem a utilização de uma biópsia desagradável. Os métodos de produção de imagens in vivo da presente divulgação também são úteis para proporcionar prognósticos para os pacientes com cancro. Por exemplo, a presença de um marcador indicativo de células estaminais cancerosas pode ser detetada. Os métodos de produção de imagens in vivo da presente invenção podem ainda ser utilizados para detetar cancros metastáticos em outras partes do corpo.

Em algumas formas de realização, os reagentes (por exemplo, anticorpos) específicos para os marcadores de cancro da presente divulgação são marcados com fluorescência. Os anticorpos marcados são introduzidos num sujeito (por exemplo, por via oral ou parentérica). Anticorpos marcados com fluorescência são detetados utilizando qualquer método apropriado (por exemplo, utilizando o aparelho descrito no documento de Patente U.S. 6.198.107).

Noutras formas de realização, os anticorpos são marcados radioativamente. A utilização de anticorpos para o diagnóstico in vivo é bem conhecida na técnica. Sumerdon et ai., (Nucl Med Biol 17:247-254 [1990] descreveram um anticorpo-agente quelante otimizado para a produção de imagens radioimunocintográfica de tumores utilizando índio-111 como o marcador. Griffin et al., (J Clin One 9:631-640 [1991]) descreveram a utilização deste agente na deteção de tumores em pacientes com suspeita de cancro colorretal recorrente. A utilização de agentes semelhantes com iões paramagnéticos como marcadores para a produção de imagens por ressonância magnética é conhecida na técnica (Lauffer, Magnetic Resonance in Medicine 22:339-342 [1991]). O marcador utilizado vai depender da modalidade de produção de imagens escolhida. Marcadores radioativos, tais como o índio-111, Tecnécio-99m ou Iodo-131 podem ser utilizados para rastreios planares ou tomografia computorizada de emissão de fotão único (SPECT). Marcadores emissores de positrões tais como Flúor-19 também podem ser utilizados para tomografia de emissão de positrões (PET). Para MRI, iões paramagnéticos, tais como Gadolínio (III) ou Manganésio (II) podem ser utilizados.

Metais radioativos com semividas que variam desde 1 hora a 3,5 dias estão disponíveis para a conjugação com anticorpos, como o escândio-47 (3,5 dias), gálio-67 (2,8 dias), gálio-68 (68 minutos), tecnécio-99m (6 horas) e índio- 111 (3,2 dias), dos quais o gálio-67, tecnécio-99m e índio-111 são preferíveis para a produção de imagens de câmara gama, o gálio-68 é preferível para a tomografia de emissão de positrões.

Um método útil de marcação de anticorpos com tais radiometais é por meio de um agente quelante bifuncional, tal como o ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), conforme descrito, por exemplo, por Khaw et al. (Science 209:295 [1980]) para In-111 e Tc-99m e por Scheinberg et al. (Science 215:1511 [1982]) . Outros agentes quelantes podem também ser utilizados, mas o 1-(p-carboximetoxibenzil)EDTA e o anidrido carboxicarbónico de DTPA são vantajosos porque a sua utilização permite a conjugação sem afetar substancialmente a imunorreatividade do anticorpo.

Um outro método para o acoplamento de DPTA a proteínas é através da utilização do anidrido cíclico de DTPA, como descrito por Hnatowich et al. (Int. J. Appl. Radiat. Isto. 33: 327 [1982]) para marcação de albumina com In-111, mas que pode ser adaptado para a marcação de anticorpos. Um método adequado de marcação de anticorpos com Tc-99m que não utiliza a quelação com DPTA é o método de pré-estanhagem de Crockford et al. (documento de Patente U.S. N.° 4.323.546).

Um método de marcação de imunoglobulinas com Tc-99m é o descrito por Wong et al. (Int. J. Appl. Radiat. Isot., 29:251 [1978]) para proteínas do plasma, e recentemente aplicado com sucesso por Wong et al. (J. Nucl. Med., 23:229 [1981]) para marcação de anticorpos.

No caso dos radiometais conjugados com o anticorpo específico, é igualmente desejável introduzir uma proporção tão elevada de marcador radioativo quanto possível na molécula de anticorpo sem destruir a sua imunoespecificidade. Um melhoramento adicional pode ser conseguido, efetuando a radiomarcação na presença do marcador de cancro de células estaminais específico da presente divulgação, para assegurar que o sítio de ligação ao antigénio no anticorpo será protegido.

Em ainda outras formas de realização, a produção de imagens biofotónica in vivo (Xenogen, Almeda, CA) é utilizada para a produção de imagens in vivo. Esta produção de imagens in vivo em tempo real utiliza a luciferase. 0 gene da luciferase é incorporado nas células, microrganismos e animais (por exemplo, como uma proteína de fusão com um marcador de cancro da presente divulgação. Quando ativa, leva a uma reação que emite luz. Uma câmara e software CCD são utilizados para capturar a imagem e analisá-la.

Agentes terapêuticos A presente divulgação proporciona uma variedade de agentes terapêuticos. Em algumas formas de realização, os agentes ligam-se pelo menos a uma proteína RSPO humana. Em determinadas formas de realização alternativas, os agentes ligam-se a duas ou mais proteínas RSPO humanas. Em determinadas formas de realização alternativas, os agentes ligam-se a pelo menos uma proteína LGR humana. Em formas de realização alternativas os agentes ligam-se a duas ou mais proteínas LGR humanas. Em algumas formas de realização, os agentes interrompem (parcial ou totalmente) a ligação de pelo menos uma proteína RSPO (por exemplo, RSP01, RSP02, RSP03 e/ou RSP04) a pelo menos uma proteína LGR (por exemplo, LGR4, LGR5 e/ou LGR6) . Em determinadas formas de realização, os agentes interrompem a sinalização de LGR ativada por RSPO, tal como a sinalização de LGR5. Em determinadas formas de realização, os agentes interrompem a sinalização de beta-catenina.

Em certas formas de realização, o agente terapêutico é uma biomolécula. Em determinadas formas de realização, o agente terapêutico ou biomolécula é um anticorpo, tal como um anticorpo que se liga a pelo menos uma proteína RSPO ou pelo menos uma proteína LGR. Como tal, o agente terapêutico ou biomolécula pode ser um anticorpo que se liga especificamente a LGR5. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente terapêutico ou biomolécula é um anticorpo que se liga especificamente a LGR4 ou LGR6. Em determinadas formas de realização, o agente terapêutico ou biomolécula é um anticorpo que se liga especificamente a RSP01, RSP02, RSP03 e/ou RSP04 .

Em certas formas de realização, o agente terapêutico ou biomolécula é um recetor LGR solúvel (por exemplo, um recetor LGR5). Por exemplo, em algumas formas de realização, o agente terapêutico é uma proteína de fusão que compreende um fragmento do recetor LGR5 e a porção Fc de um anticorpo.

Em certas formas de realização alternativas, o agente terapêutico é um oligonucleótido antissentido, uma molécula de siARN ou uma ribozima.

Em algumas formas de realização, a presente divulgação proporciona terapêuticas para o cancro (por exemplo, cancro da mama). Em algumas formas de realização, as terapêuticas têm como alvo marcadores de cancro. A presente divulgação proporciona um anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização, o anticorpo liga-se especificamente a pelo menos uma proteína LGR humana selecionada a partir do grupo que consiste em LGR4, LGR5 e LGR6 . Em determinadas formas de realização, o anticorpo liga-se especificamente a LGR5. Em determinadas formas de realização, o anticorpo liga-se especificamente a duas ou mais proteínas LGR humanas selecionadas a partir do grupo que consiste em LGR4, LGR5 e LGR6. Em determinadas formas de realização, o anticorpo que se liga especif icamente a pelo menos uma proteína LGR humana, também interrompe a ligação de pelo menos uma proteína RSPO (por exemplo, RSP01, RSP02, RSP03 e/ou RSP04) para a pelo menos uma proteína LGR humana (por exemplo, LGR5). Em determinadas formas de realização, o anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína LGR humana é caracterizado por uma capacidade para interromper a ativação da sinalização de LGR através de RSPO e/ou uma capacidade de interromper a sinalização de beta-catenina. Em determinadas formas de realização, o anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína LGR humana é caracterizado pela capacidade de inibir o crescimento tumoral, tal como o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido. Por exemplo, em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína LGR humana, interrompe ou inibe a ligação de RSPO a LGR e inibe o crescimento tumoral. Em determinadas formas de realização alternativas, o anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína LGR, também interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO e inibe o crescimento tumoral. Em determinadas formas de realização alternativas, o anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína LGR, também interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO e/ou sinalização de beta-catenina e inibe o crescimento tumoral. (Em certas formas de realização, a inibição do crescimento tumoral proporcionada por um anticorpo pode, mas não tem de ser necessariamente, um resultado da ativação da sinalização de LGR através de RSPO. Em determinadas formas de realização, a inibição do crescimento tumoral proporcionada por um anticorpo pode, mas não tem de ser necessariamente, um resultado da inibição da ligação de uma proteína RSPO a uma proteína LGR) . A presente divulgação proporciona um anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína RSPO humana RSPO selecionada a partir do grupo que consiste em RSP01, RSP02, RSP03 e RSP04. Em determinadas formas de realização, o anticorpo liga-se especif icamente a duas ou mais proteínas RSPO humanas selecionadas a partir do grupo que consiste em RSP01, RSP02, RSP03 e RSP04. Em determinadas formas de realização, o anticorpo liga-se especificamente a RSP01. Em determinadas formas de realização, o anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína RSPO humana, também é capaz de interromper a ligação da pelo menos uma proteína RSPO (por exemplo, RSP01, RSP02, RSP03 e/ou RSP04) a pelo menos uma proteína LGR humana (por exemplo, LGR5) . Em determinadas formas de realização, o anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína RSPO humana é caracterizado por uma capacidade para interromper a ativação da sinalização de LGR através de RSPO e/ou uma capacidade de interromper a sinalização de beta-catenina. Em determinadas formas de realização, o anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína RSPO humana é caracterizado pela capacidade de inibir o crescimento tumoral, tal como o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido.

Por exemplo, em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína RSPO humana, interrompe ou inibe a ligação de RSPO a LGR, e inibe o crescimento tumoral. Em determinadas formas de realização alternativas, o anticorpo que se liga especificamente a pelo menos uma proteína RSPO, também interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO e inibe o crescimento tumoral. Em determinadas formas de realização, o anticorpo que se liga especif icamente a pelo menos uma proteína RSPO, interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO e/ou a sinalização de beta-catenina e inibe o crescimento tumoral.

Em certas formas de realização, um anticorpo anti-LGR ou anti-RSPO (ou outro agente) que interrompe a ligação de uma proteína RSPO a uma proteína LGR, interrompe pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90% da ligação da proteína RSPO a uma proteína LGR num ensaio in vitro ou in vivo.

Do mesmo modo, em determinadas formas de realização, um anticorpo anti-LGR ou anti-RSPO (ou outro agente) que interrompe (a) a ativação da sinalização de LGR através de RSPO e/ou (b) a sinalização de beta-catenina, interrompe pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90% da sinalização num ensaio in vitro ou in vivo. A presente divulgação proporciona, em determinadas formas de realização, um anticorpo isolado que se liga especif icamente a uma proteína R-espondina (RSPO) humana e inibe o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido. Em determinadas formas de realização, a RSPO humana é RSPOl. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma proteína RSPO humana e interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSP05. Em determinadas formas de realização, a RSPO humana é RSP01. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um anticorpo isolado que se liga especificamente a um domínio extracelular de uma proteína LGR humana e inibe o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido. Em determinadas formas de realização, o domínio extracelular compreende os aminoácidos 22-564 de LGR5 humana (SEQ ID NO: 1). Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um anticorpo isolado que se liga especificamente a um domínio extracelular de uma proteína LGR humana e interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO. Em determinadas formas de realização, o domínio extracelular compreende os aminoácidos 22-564 de LGR5 humana (SEQ ID NO: 1) . Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano. A divulgação proporciona adicionalmente um anticorpo monoclonal anti-LGR5, 88M1. 0 anticorpo monoclonal 88M1 é produzido por uma linha celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd, Manassas, Virginia, 20110, EUA, em 31 de julho, 2008, de acordo com o Tratado de Budapeste, sob o número de depósito na ATCC PTA-9342. Os anticorpos que se ligam especificamente a LGR5 humana e (a) compreendem uma região variável da cadeia pesada que tem pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 98% ou cerca de 100% de identidade de sequência) com a região variável de cadeia pesada de 88M1; (b) compreendem uma região variável da cadeia leve que tem pelo menos cerca de 95% (por exemplo, pelo menos cerca de 98% ou cerca de 100% de identidade de sequência) de identidade de sequência com a região variável de cadeia leve de 88M1; (c) compreendem as CDRs de cadeia pesada de 88M1; (d) compreendem as CDRs de cadeia leve de 88M1; (e) ligam-se a um epitopo capaz de se ligar 88M1; e/ou (f) competem com 88M1 num ensaio de ligação competitiva, também são fornecidos. Linhas celulares que produzem os anticorpos (incluindo, mas não limitada, à linha celular de hibridoma tendo o número de depósito na ATCC PTA-9342) e composições que compreendem os anticorpos são adicionalmente proporcionadas. Os polinucleótidos que codificam a região variável de cadeia leve e/ou a região variável de cadeia pesada dos anticorpos monoclonais, e vetores e células que compreendem os polinucleótidos são também fornecidos.

Os ensaios de competição podem ser utilizados para determinar se os dois anticorpos se ligam ao mesmo epitopo através do reconhecimento de epitopos idênticos ou sobrepostos estericamente. Qualquer método conhecido na técnica para a determinação da ligação competitiva (como, por exemplo, os imunoensaios descritos noutras partes deste documento) pode ser utilizado.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um recetor solúvel que compreende um domínio extracelular de uma proteína LGR humana que inibe o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido. Em determinadas formas de realização, o domínio extracelular compreende os aminoácidos 22-564 de LGR5 humana (SEQ ID NO: 1). Em determinadas formas de realização, o domínio extracelular de LGR5 humana está ligado em estrutura com uma sequência de proteína não-LGR. Em determinadas formas de realização, a proteína não-LGR é Fc humana.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um recetor solúvel que compreende um domínio extracelular de uma proteína LGR humana que interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO. Em determinadas formas de realização, o domínio extracelular compreende os aminoácidos 22-564 de LGR5 humana (SEQ ID NO: 1) . Em determinadas formas de realização, o domínio extracelular de LGR5 humana está ligado em estrutura com uma sequência de proteína não-LGR. Em determinadas formas de realização, a proteína não-LGR é Fc humana.

Ensaios in vitro e in vivo de rastreio quanto a agentes terapêuticos candidatos que têm a capacidade de se ligar especificamente a uma proteína RSPO ou LGR particular são bem conhecidos na técnica. Os imunoensaios que podem ser utilizados para avaliar a ligação por anticorpos inclui, por exemplo, os sistemas de ensaios competitivos e não competitivos utilizando técnicas tais como Western blot, radioimunoensaio, ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática), imunoensaios do tipo "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação do complemento, ensaios imunoradiométricos, imunoensaios fluorescentes e imunoensaios de proteína A. A utilização de análise FACS para determinar a ligação específica a uma proteína RSPO ou LGR alvo é delineada no exemplo específico, o Exemplo 3 abaixo.

Além disso, a afinidade de ligação de um anticorpo a uma proteína RSPO ou LGR e a taxa de dissociação do anticorpo para a interação de LGR ou RSPO pode ser determinada através de ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de proteína LGR ou RSPO marcada com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de proteína LGR ou RSPO não marcada, e a deteção do anticorpo ligado a proteína LGR ou RSPO marcada. A afinidade do anticorpo para a proteína LGR ou RSPO e as taxas de dissociação da ligação podem então ser determinadas a partir dos dados por análise do gráfico de Scatchard. A competição com um segundo anticorpo (por exemplo, 88M1) pode também ser determinada utilizando radioimunoensaios. Por exemplo, a proteína LGR ou RSPO é incubada com o anticorpo de interesse conjugado com um composto marcado, na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado. Alternativamente, a afinidade de ligação de um anticorpo a uma proteína LGR ou RSPO e as taxas de associação e dissociação de uma interação anticorpo-LGR ou anticorpo-RSPO podem ser determinadas por ressonância de plasmón de superfície, tal como BIAcore. Em determinadas formas de realização, os anticorpos anti-LGR podem ser direcionados para se acumularem na membrana de uma célula que expressa LGR.

Ensaios adicionais conhecidos na técnica para avaliar a ligação ou outra interação de um agente terapêutico candidato (incluindo aqueles que não são anticorpos) com uma proteína, tal como uma proteína LGR ou RSPO são descritos abaixo na secção intitulada "Rastreio de fármacos".

Ensaios adequados para determinar se um agente terapêutico candidato (tal como um anticorpo anti-LGR ou anti-RSPO) é capaz de bloquear a ligação de uma proteína RSPO a uma proteína LGR são igualmente bem conhecidos na técnica. Exemplos de tais ensaios de ligação competitiva são descritos noutras partes deste documento. Um exemplo da utilização de um ensaio de ligação competitiva baseado em FACS para determinar a capacidade de um anticorpo contra LGR5 para, pelo menos, bloquear parcialmente a ligação de RSP01 a LGR5, é fornecido no exemplo específico, Exemplo 3, abaixo.

Adicionalmente, ensaios para determinar se um agente terapêutico candidato particular é capaz de interromper a ativação da sinalização de LGR através de RSPO (por exemplo, sinalização de LGR5) e/ou é capaz de interromper a sinalização de beta-catenina também são conhecidos na técnica. Para exemplos de ensaios que empreguem a utilização de genes repórter operativamente ligados a um promotor responsivo a beta-catenina podem ser utilizados para medir o nível de sinalização de beta-catenina, na presença de um anticorpo anti-RSPO ou anti-LGR. Vejam-se, por exemplo, os ensaios de luciferase descritos no exemplo específico, Exemplo 2, abaixo.

Ensaios in vitro e in vivo de rastreio de agentes terapêuticos candidatos que têm como alvo uma proteína RSPO ou LGR quanto à eficácia anti-tumoral e/ou anti-células estaminais cancerosas será evidente para um perito na especialidade. Ensaios exemplares conhecidos na técnica são fornecidos abaixo na secção intitulada "Rastreio de fármacos" e no exemplo específico, Exemplo 4, abaixo. Além disso, orientação adicional em relação à avaliação da eficácia anti-tumoral e anti-células estaminais cancerosas é fornecida na Publicação de Patente Internacional N.° WO 08/042236, Publicação de Patente US N.° US 2007/0117751 e Publicação de Patente US N.° US 2008/0131434.

Anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpos)

Conforme descrito acima, em determinadas formas de realização, os agentes terapêuticos são anticorpos, tais como anticorpos contra uma proteína LGR humana ou uma proteína RSPO humana. Adicionalmente, a presente divulgação proporciona anticorpos úteis para outros fins, tais como para efeitos de diagnóstico ou de rastreio. Em determinadas formas de realização, os anticorpos descritos no presente documento (incluindo, mas não limitados a, anticorpos terapêuticos) são isolados. Em determinadas formas de realização, os anticorpos descritos no presente documento são substancialmente puros.

Em algumas formas de realização os anticorpos (quer para utilização em terapêutica ou outras finalidades) são anticorpos monoclonais. Em determinadas formas de realização, os anticorpos são anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. A divulgação proporciona adicionalmente anticorpos biespecíficos. Em determinadas formas de realização, os anticorpos são fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos

Fab.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona anticorpos isolados contra um marcador de células estaminais cancerosas (por exemplo, LGR5). 0 anticorpo, ou fragmento de anticorpo, pode ser qualquer anticorpo monoclonal ou policlonal que reconhece especificamente o marcador de células estaminais do cancro do cólon descrito. Em algumas formas de realização, a presente divulgação proporciona anticorpos monoclonais, ou fragmentos dos mesmos, que se ligam especificamente a um polipéptido marcador de células estaminais de cancro do cólon descrito no presente documento. Em algumas formas de realização, os anticorpos monoclonais, ou fragmentos dos mesmos, são anticorpos quiméricos ou humanizados que se ligam especificamente ao domínio extracelular de um polipéptido marcador de células estaminais de cancro do cólon descrito no presente documento. Noutras formas de realização, os anticorpos monoclonais, ou fragmentos dos mesmos, são anticorpos humanos que se ligam especificamente ao domínio extracelular de um polipéptido marcador de células estaminais de cancro do cólon descrito no presente documento.

Os anticorpos contra um marcador de células estaminais cancerosas encontra utilidade nos métodos experimentais, diagnósticos e terapêuticos descritos no presente documento. Em determinadas formas de realização, os anticorpos da presente divulgação são utilizados para detetar a expressão de uma proteína de marcador de células estaminais de cancro do cólon em amostras biológicas tais como, por exemplo, uma biópsia de tecido de um paciente, efusão pleural, ou amostra de sangue. As biópsias de tecido podem ser seccionadas e a proteína detetada utilizando, por exemplo, imunofluorescência e imunohistoquímica. Alternativamente, células individuais a partir de uma amostra são isoladas, e a expressão proteica detetada em células fixadas ou vivas através de análise por FACS. Além disso, os anticorpos podem ser utilizados em arranjos de proteínas para detetar a expressão de um marcador de células estaminais de cancro do cólon, por exemplo, em células tumorais, em Usados de células, ou noutras amostras de proteínas. Noutras formas de realização, os anticorpos da presente divulgação são utilizados para inibir o crescimento de células tumorais através do contacto dos anticorpos com células tumorais seja em ensaios baseados em células in vitro ou em modelos animais in vivo. Ainda noutras formas de realização, os anticorpos são utilizados para tratar cancro num paciente humano através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contra um marcador de células estaminais de cancro do cólon.

Anticorpos policlonais podem ser preparados através de qualquer método conhecido. Os anticorpos policlonais podem ser criados através da imunização de um animal (por exemplo, um coelho, rato, ratinho, burro, etc) através de múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais do antigénio relevante (um fragmento peptídico purificado, proteína recombinante de comprimento completo, proteína de fusão, etc) opcionalmente conjugado com hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina sérica, etc. diluído em solução salina estéril e combinado com um adjuvante (por exemplo, Adjuvante Completo ou Incompleto de Freund) para formar uma emulsão estável. 0 anticorpo policlonal é depois recuperado a partir do sangue, ascites e semelhantes, de um animal assim imunizado. 0 sangue recolhido é coagulado, e o soro é decantado, clarificado por centrifugação, e testado quanto ao título de anticorpos. Os anticorpos policlonais podem ser purificados a partir de soro ou ascites de acordo com métodos padrão na técnica incluindo cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta iónica, eletroforese em gel, diálise, etc.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos de hibridoma, tal como aqueles descritos por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. Utilizando o método de hibridoma, um ratinho, hámster, ou outro animal hospedeiro apropriado, é imunizado conforme descrito acima para desencadear a produção de linfócitos de anticorpos que irão ligar-se especificamente a um antigénio imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após a imunização, os linfócitos são isolados e fusionados com uma linha celular de mieloma adequada utilizando, por exemplo, polietilenoglicol, para formar células de hibridoma que podem depois ser separadas por seleção a partir de linfócitos e células de mieloma não fusionadas. Os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais dirigidos especificamente contra um antigénio selecionado conforme determinado por imunoprecipitação, imunotransferência, ou através de um ensaio de ligação in vitro tal como um radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) podem depois ser propagados tanto em cultura in vitro utilizando métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1996) ou in vivo como tumores asciticos num animal. Os anticorpos monoclonais podem depois ser purificados a partir do meio de cultura ou fluido ascitico conforme descrito para os anticorpos policlonais acima.

Alternativamente, os anticorpos monoclonais também podem ser feitos utilizando métodos de ADN recombinante conforme descrito no documento de Patente U.S. 4.816.567. Os polinucleótidos que codificam um anticorpo monoclonal são isolados, tal como a partir de células B ou células de hibridoma, tal como através de RT-PCR utilizando iniciadores oligonucleot idicos que amplificam especif icamente os genes que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo, e a sua sequência é determinada utilizando procedimentos convencionais. Os polinucleótidos isolados que codificam as cadeias pesadas e leves são depois clonados em vetores de expressão adequados que, quando transfetados em células hospedeiras, tais como E. coli, células COS simias, células de ovário de hámster chinês (CHO), ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, anticorpos monoclonais são gerados pelas células hospedeiras. Além disso, os anticorpos monoclonais recombinantes ou fragmentos dos mesmos das espécies desejadas podem ser isolados a partir de bibliotecas de expressão em fagos conforme descrito (McCafferty et al. , 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al. , 1991, Nature, 352:624-628; e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222, 581-597). 0(s) polinucleótido(s) que codifica(m) o anticorpo monoclonal pode(m) ser adicionalmente modificado (s) de uma série de formas diferentes utilizando tecnologia de ADN recombinante para gerar anticorpos alternativos. Numa forma de realização, os domínios constantes das cadeias leves e pesadas de, por exemplo, um anticorpo monoclonal de ratinho podem ser substituídos 1) por aquelas regiões de, por exemplo, um anticorpo humano para gerar um anticorpo quimérico ou 2) por um polipéptido não-imunoglobulina para gerar um anticorpo de fusão. Noutras formas de realização, as regiões constantes são truncadas ou removidas para gerar o fragmento de anticorpo desejado de um anticorpo monoclonal. Além disso, a mutagénese sitio-dirigida ou de alta densidade da região variável pode ser utilizada para otimizar a especificidade, afinidade, etc. de um anticorpo monoclonal.

Em algumas formas de realização, da presente invenção o anticorpo monoclonal contra o marcador de células estaminais de cancro do cólon é um anticorpo humanizado. Os anticorpos humanizados são anticorpos que contêm sequências mínimas a partir de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) dentro das regiões variáveis. Tais anticorpos são utilizados terapeuticamente para reduzir a antigenicidade e respostas HAMA (anticorpo humano anti-ratinho) quando administrados a um sujeito humano. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos com sequências não humanas mínimas ou ausentes. Um anticorpo humano é um anticorpo produzido por um ser humano ou um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos que corresponde a um anticorpo produzido por um ser humano.

Os anticorpos humanizados podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica. Um anticorpo pode ser humanizado através da substituição da CDR de um anticorpo humano com aquela de um anticorpo não humano (por exemplo, de ratinho, rato, coelho, hámster, etc.) tendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejada (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). 0 anticorpo humanizado pode ser adicionalmente modificado através da substituição de um resíduo adicional tanto na região estrutural Fv e/ou dentro dos resíduos não humanos substituídos para refinar e otimizar a especificidade, afinidade, e/ou capacidade do anticorpo.

Os anticorpos humanos podem ser diretamente preparados utilizando várias técnicas conhecidas na técnica. Linfócitos B humanos imortalizados imunizados in vitro ou isolados a partir de um indivíduo imunizado que produzem um anticorpo dirigido contra um antigénio alvo podem ser gerados (veja-se, por exemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; e documento de patente U.S. N.° 5.750.373) . Além disso, o anticorpo humano pode ser selecionado a partir de uma biblioteca de fagos, onde a biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al. , 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom e Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Os anticorpos humanizados também podem ser produzidos em ratinhos transgénicos contendo loci de imunoglobulina humana que são capazes, após imunização, de produzir o repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógena. Esta abordagem é descrita nos documentos de Patente U.S. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016.

Esta divulgação também engloba anticorpos biespecificos que reconhecem especificamente um marcador de células estaminais de cancro do cólon. Os anticorpos biespecificos são anticorpos que são capazes de reconhecer e ligar-se especificamente a pelo menos dois epítopos diferentes. Os epitopos diferentes podem estar dentro da mesma molécula (por exemplo, o mesmo polipéptido marcador de células estaminais de cancro do cólon) ou em moléculas diferentes de modo que ambos, por exemplo, os anticorpos podem reconhecer e ligar-se especificamente a um marcador de células estaminais de cancro do cólon bem como a, por exemplo, 1) uma molécula efetora num leucócito tal como um recetor de células T (por exemplo, CD3) ou recetor Fc (por exemplo, CD64, CD32, ou CD16) ou 2) um agente citotóxico conforme descrito em detalhe abaixo. Os anticorpos biespecificos podem ser anticorpos intactos ou fragmentos de anticorpos. Técnicas para produzir anticorpos biespecificos são comuns na técnica (Millstein et ai., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al. , 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al. , 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al. , 1994, J. Immunol. 152:5368; e documento de patente U.S. 5.731.168).

Em determinadas formas de realização da divulgação, pode ser desejável utilizar um fragmento de anticorpo, em vez de um anticorpo intacto, para aumentar a penetração tumoral, por exemplo. Várias técnicas são conhecidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos são derivados através da digestão proteolítica de anticorpos intactos (por exemplo, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 e Brennan et al. , 1985, Science, 229:81) . No entanto, estes fragmentos são atualmente tipicamente produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes conforme descrito acima. Assim, os fragmentos de anticorpos Fab, Fv e scFv podem ser todos expressos em, e secretados a partir de, E. coli ou outras células hospedeiras, permitindo assim a produção de grandes quantidades destes fragmentos. Alternativamente, tais fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas em fagos de anticorpos discutidas acima. Os fragmentos de anticorpos também podem ser anticorpos lineares conforme descrito no documento de Patente U.S. 5.641.870, por exemplo, e podem ser monoespecificos ou biespecificos. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão aparentes.

Pode ainda ser desejável, particularmente no caso de fragmentos de anticorpos, modificar um anticorpo de modo a aumentar a sua semivida no soro. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por incorporação de um epitopo de ligação a recetor de salvamento no fragmento de anticorpo por mutação da região apropriada no fragmento de anticorpo ou por incorporação do epitopo numa etiqueta peptidica que é depois fusionada ao fragmento de anticorpo em qualquer das extremidades ou no meio (por exemplo, por síntese de ADN ou péptido). A presente divulgação abrange ainda as variantes e equivalentes, que são substancialmente homólogos aos anticorpos quiméricos, humanizados e humanos, ou fragmentos de anticorpos dos mesmos, estabelecidos no presente documento. Estes podem conter, por exemplo, mutações de substituição conservativa, isto é, a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos semelhantes. Por exemplo, substituição conservativa refere-se à substituição de um aminoácido por outro na mesma classe geral, tal como, por exemplo, um aminoácido acídico por outro aminoácido acídico, um aminoácido básico com um outro aminoácido básico, ou um aminoácido neutro por outro aminoácido neutro. O que se pretende com uma substituição de aminoácidos conservativa é bem conhecido na técnica. A divulgação também se refere a imunoconjugados compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico.

Os agentes citotóxicos incluem agentes quimioterapêuticos, agentes inibidores do crescimento, toxinas (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos da mesma), isótopos radioativos (ou seja, um radioconjugado), etc. Os agentes quimioterapêuticos úteis na geração de tais imunoconjugados incluem, por exemplo, metotrexato, adriamicina, doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes. As toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser utilizados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina, cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radiocon jugados incluindo 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re. Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico são produzidos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais, tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como HCL adipimidato de dimetilo), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeido), compostos bisazido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados bis-diazónio (tais como bis-(p-diazónio-azido)-etilenodiamina) , diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno) . Os conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas, tais como um caliqueamicina, maitansinoides, um tricoteno e CC1065, e os derivados destas toxinas que possuem atividade de toxina, podem também ser usados.

Em algumas formas de realização o anticorpo da divulgação contém regiões Fc humanas que são modificadas para melhorar a função efetora, por exemplo, citotoxicidade mediada por células dependente de antigénio (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Isto pode ser conseguido introduzindo uma ou mais substituições de aminoácidos numa região Fc do anticorpo. Por exemplo, resíduo(s) de cisteína podem ser introduzidos na região Fc para permitir a formação de ligações dissulfureto intercadeias nesta região para melhorar a morte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (Caron et al., 1992, J. Exp Med. 17 6:1191-1195; Shopes, 1992, Immunol 148:2918-2922). Os anticorpos homodiméricos com atividade antitumoral melhorada podem também ser preparados utilizando reticulantes heterobifuncionais como descrito em Wolff et al. , 1993, Cancer Research. 53:2560-2565. Alternativamente, pode ser manipulado um anticorpo que possui regiões Fc duplas (Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230) .

Em algumas formas de realização, a presente divulgação proporciona anticorpos que têm como alvo tumores que expressam um marcador de cancro de células estaminais da presente divulgação. Qualquer anticorpo apropriado (por exemplo, monoclonal, policlonal ou sintético) pode ser utilizado nos métodos terapêuticos descritos no presente documento. Em algumas formas de realização, os anticorpos usados para terapêutica contra o cancro são anticorpos humanizados. Os métodos para a humanização de anticorpos são bem conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, os documentos de Patente U.S. 6.180.370, 5.585.089, 6.054.297 e 5.565.332).

Em algumas formas de realização, os anticorpos terapêuticos compreendem um anticorpo gerado contra um marcador de cancro de células estaminais da presente divulgação, em que o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em tais formas de realização, é gerado um agente terapêutico específico de tumor que não tem como alvo as células normais, reduzindo assim, muitos dos efeitos secundários prejudiciais da quimioterapia tradicional. Para certas aplicações, prevê-se que os agentes terapêuticos serão agentes farmacológicos que vão servir como agentes úteis para ligação a anticorpos, em particular agentes citotóxicos ou, de outra forma, anticelulares que têm a capacidade de matar ou suprimir o crescimento ou a divisão celular de células endoteliais. A presente divulgação contempla a utilização de qualquer agente farmacológico que pode ser conjugado com um anticorpo e administrado sob a forma ativa. Agentes anticelulares exemplares incluem radioisótopos, agentes quimioterapêuticos e citotoxinas. Os anticorpos terapêuticos da presente divulgação podem incluir uma variedade de frações citotóxicas, incluindo mas não limitadas a, isótopos radioativos (por exemplo, iodo-131, iodo-123, tecnécio-99m, índio-111, rénio-188, rénio-186, gálio-67, cobre-67, ítrio-90, iodo-125 ou astatina-211), hormonas como um esteroide, antimetabolitos, tais como citocinas (por exemplo, arabinósido, fluorouracilo, metotrexato ou aminopterina; uma antraciclina; mitomicina C) , alcaloides da vinca (por exemplo, demecolcina; etopósido; mitramicina) e um agente antitumoral alquilante tal como clorambucilo ou melfalano. Outras formas de realização podem incluir agentes tais como um coagulante, uma citocina, fator de crescimento, endotoxina bacteriana ou a fração de lípido A de endotoxina bacteriana. Por exemplo, nalgumas formas de realização, os agentes terapêuticos irão incluir uma toxina derivada de plantas, fungos ou bactérias, tal como uma toxina de cadeia A, uma proteína de inativação de ribossomas, α-sarcina, aspergilina, restrictocina, uma ribonuclease, toxina da difteria ou exotoxina de Pseudomonas, para mencionar apenas alguns exemplos. Em algumas formas de realização, a cadeia A de ricina desglicosilada é utilizada.

De qualquer modo, propõe-se que agentes tais como estes podem, se desejado, ser conjugados com sucesso com um anticorpo, de uma maneira que vai permitir o seu direcionamento, internalização, libertação ou apresentação a componentes sanguíneos no local das células tumorais alvo, conforme necessário utilizando tecnologia de conjugação conhecida (veja-se, por exemplo, Ghose et al., Methods Enzymol, 93:280 [1983]).

Por exemplo, em algumas formas de realização, a presente divulgação proporciona imunotoxinas direcionadas a um marcador de cancro de células estaminais da presente divulgação. As imunotoxinas são conjugados de um agente de direcionamento específico, tipicamente um anticorpo ou um seu fragmento dirigido a um tumor, com um agente citotóxico, tal como uma fração de toxina. O agente de direcionamento dirige a toxina para, e mata assim seletivamente, as células que transportam o antigénio alvo. Em algumas formas de realização, os anticorpos terapêuticos empregam agentes de reticulação que fornecem elevada estabilidade in vivo (Thorpe et al., Cancer Res ., 48 : 6396 [1988] .

Em outras formas de realização, particularmente aquelas que envolvem o tratamento de tumores sólidos, os anticorpos são concebidos para terem um efeito citotóxico ou, de outro modo, anticelular contra a vasculatura tumoral, ao suprimir o crescimento ou a divisão celular das células endoteliais vasculares. Este ataque destina-se a levar a um colapso vascular localizado no tumor, privando as células tumorais, particularmente aquelas células tumorais distais à vasculatura, de oxigénio e de nutrientes levando, em última análise, à morte celular e necrose do tumor.

Em algumas formas de realização, terapêuticas baseadas em anticorpos são formuladas como composições farmacêuticas, tal como descrito abaixo. Em algumas formas de realização, a administração de uma composição de anticorpo da presente divulgação resulta numa diminuição mensurável no cancro (por exemplo, diminuição ou eliminação do tumor). A divulgação proporciona ainda kits e artigos de fabrico que compreendem um ou mais anticorpos. Em determinadas formas de realização, os kits compreendem pelo menos dois anticorpos. Em determinadas formas de realização, os kits compreendem, pelo menos, dois anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína RSPO humana ou uma proteína LGR humana.

Rastreio de fármacos

Em algumas formas de realização, a presente divulgação proporciona ensaios de rastreio de fármacos (por exemplo, para o rastreio de fármacos anti-cancro). Em determinadas formas de realização, os métodos de rastreio da presente divulgação utilizam marcadores de cancro de células estaminais identificados utilizando os métodos da presente divulgação. Por exemplo, em algumas formas de realização, a presente divulgação proporciona métodos de rastreio para compostos que alteram (por exemplo, aumentam ou diminuem) a expressão de genes marcadores de cancro de células estaminais. Em algumas formas de realização, os compostos candidatos são agentes antissentido ou agentes siARN (por exemplo, oligonucleótidos) dirigidos contra marcadores de cancro. Noutras formas de realização, os compostos candidatos são anticorpos que se ligam especificamente a um marcador de cancro de células estaminais da presente divulgação. Em determinadas formas de realização, bibliotecas de compostos de pequenas moléculas são rastreadas utilizando os métodos descritos no presente documento.

Num método de rastreio, os compostos candidatos são avaliados quanto à sua capacidade para alterar a expressão de marcadores de cancro de células estaminais por contacto de um composto com uma célula que expressa um marcador de cancro de células estaminais e, em seguida, testando quanto ao efeito dos compostos candidatos sobre a expressão. Em algumas formas de realização, o efeito dos compostos candidatos sobre a expressão de um gene marcador de cancro é testado através da deteção do nível de ARNm marcador de cancro expresso pela célula. A expressão de ARNm pode ser detetada por qualquer método adequado.

Noutras formas de realização, o efeito dos compostos candidatos sobre a expressão de genes marcadores de cancro é testada através da medição do nível de polipéptido codificado pelos marcadores de cancro. 0 nível de polipéptido expresso pode ser medido utilizando qualquer método adequado, incluindo mas não limitados a, aqueles divulgados no presente documento. Em algumas formas de realização, outras alterações na biologia celular (por exemplo, apoptose) são detetadas.

Especificamente, a presente divulgação proporciona métodos de rastreio para identificação de moduladores, ou seja, compostos ou agentes candidatos ou de teste (por exemplo, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, moléculas pequenas ou outros fármacos) que se ligam a, ou alteram a sinalização ou função associada com os marcadores de cancro da presente divulgação, têm um efeito inibitório (ou estimulador) sobre, por exemplo, a expressão de marcadores de cancro de células estaminais ou atividade de marcadores de cancro, ou têm um efeito estimulador ou inibitório sobre, por exemplo, a expressão ou a atividade de um substrato marcador de cancro. Os compostos assim identificados podem ser utilizados para modular a atividade de produtos génicos alvo (por exemplo, genes marcadores de cancro de células estaminais) quer direta ou indiretamente num protocolo terapêutico, para a elaboração da função biológica do produto génico alvo, ou para identificar compostos que interrompem as interações normais do gene alvo. Os compostos que inibem a atividade ou a expressão de marcadores de cancro são úteis no tratamento de distúrbios proliferativos, por exemplo, cancro, em particular cancro metastático ou na eliminação ou controlo das células estaminais tumorais para evitar ou reduzir o risco de cancro.

Numa forma de realização, a divulgação proporciona ensaios para o rastreio de compostos candidatos ou de teste que são substratos de uma proteína ou polipéptido marcador de cancro ou uma porção biologicamente ativa dos mesmos. Noutra forma de realização, a divulgação proporciona ensaios para o rastreio de compostos candidatos ou de teste que se ligam a, ou modulam, a atividade de uma proteína ou polipéptido marcador de cancro ou uma porção biologicamente ativa dos mesmos.

Os compostos de teste da presente divulgação podem ser obtidos utilizando qualquer uma das numerosas abordagens em métodos de bibliotecas combinatórias conhecidos na técnica, incluindo bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas possuindo as funcionalidades de péptidos, mas com uma estrutura principal nova e não peptídica, que são resistentes à degradação enzimática, mas que, no entanto, permanecem bioativas; veja-se, por exemplo, Zuckennann et al., J. Med. Chem. 37:2678-85 [1994]); bibliotecas de fase de solução ou fase sólida paralelas endereçáveis; métodos de bibliotecas sintéticas que requerem desconvolução; o método de biblioteca " one-bead one-compound"; e métodos de bibliotecas sintéticas que utilizam a seleção por cromatografia de afinidade. As abordagens de bibliotecas de peptoides e biológicas são preferidas para utilização com as bibliotecas peptídicas, enquanto as outras quatro abordagens são aplicáveis bibliotecas de compostos peptídicas, de oligómeros não peptídicas ou de pequenas moléculas (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145) .

Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados na técnica, por exemplo em: DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:6909 [1993]; Erb et al., Proc. Nad. Acad. Sei. EUA 91:11422 [1994]; Zuckermann et al. , J. Med. Chem. 37:2678 [1994]; Cho et al. , Science 261:1303 [1993]; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 [1994]; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 [1994]; and Gallop et al. , J.Med. Chem. 37:1233 [1994] .

As bibliotecas de compostos podem ser apresentadas em solução (por exemplo, Houghten, Biotechniques 13:412-421 [1992]), ou em esferas (Lam, Nature 354:82-84 [1991]), chips (Fodor, Nature 364:555-556 [1993]), bactérias ou esporos (documento de Patente US N.° 5.223.409), plasmídeos (Cull et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:18651869 [1992]) ou em fagos (Scott e Smith, Science 249:386-390 [1990]; Devlin, Science 249:404-406 [1990]; Cwirla et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87:6378-6382 [1990]; Felici, J. Mol Biol. 222:301 [1991]).

Numa forma de realização, um ensaio é um ensaio baseado em células, em que uma célula que expressa uma proteína de marcador de cancro de células estaminais ou porção biologicamente ativa da mesma é colocada em contacto com um composto de teste, e a capacidade do composto de teste para modular a atividade do marcador de cancro é determinada. A determinação da capacidade do composto de teste para modular a atividade de marcadores de cancro de células estaminais pode ser realizada por monitorização, por exemplo, das mudanças na atividade enzimática. A célula, por exemplo, pode ser de origem mamífera.

Também pode ser avaliada a capacidade do composto de teste para modular a ligação de um marcador de cancro a composto, por exemplo, um substrato marcador de cancro de células estaminais . Isto pode ser alcançado, por exemplo, por acoplamento do composto, por exemplo, do substrato, com um marcador enzimático ou de radioisótopo de modo que a ligação do composto, por exemplo, o substrato, a um marcador de cancro pode ser determinada através da deteção do composto marcado, por exemplo, do substrato, num complexo.

Em alternativa, o marcador de cancro de células estaminais é acoplado com um marcador enzimático ou de radioisótopo para monitorizar a capacidade de um composto de teste para modular a ligação de um marcador de cancro a um substrato de marcadores de cancro num complexo. Por exemplo, os compostos (por exemplo, substratos) podem ser marcados com 125I, 35S, 14C ou 3H, direta ou indiretamente, e o radioisótopo detetado por contagem direta da radioemissão ou por contagem de cintilação. Alternativamente, os compostos podem ser enzimaticamente marcados com, por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina ou luciferase, e o marcador enzimático detetado por determinação da conversão de um substrato apropriado em produto. A capacidade de um composto (por exemplo, um substrato marcador de cancro de células estaminais) para interagir com um marcador de cancro de células estaminais, com ou sem a marcação de qualquer dos interatuantes pode ser avaliada. Por exemplo, um microfisiómetro pode ser utilizado para detetar a interação de um composto com um marcador de cancro sem a marcação quer do composto ou do marcador de cancro (McConnell et ai., Science 257:190 6-1912 [1992]) . Conforme utilizado no presente documento, um "microfisiómetro" (por exemplo, Cytosensor) é um instrumento analítico que mede a taxa à qual uma célula acidifica o seu ambiente utilizando um sensor potenciométrico endereçável por luz (LAPS). As alterações nesta taxa de acidificação podem ser utilizadas como um indicador da interação entre um composto e marcadores de cancro.

Ainda noutra forma de realização, um ensaio livre de células é proporcionado no qual uma proteína de marcador de cancro ou porção biologicamente ativa da mesma é colocada em contacto com um composto de teste e a capacidade do composto de teste para se ligar à proteína de marcador de cancro de células estaminais ou porção biologicamente ativa da mesma, é avaliada. As porções biologicamente ativas das proteínas de marcadores de cancro a serem utilizadas em ensaios da presente divulgação incluem fragmentos que participam em interações com substratos ou outras proteínas, por exemplo, fragmentos com elevadas pontuações de probabilidade de superfície.

Os ensaios livres de células envolvem preparar uma mistura de reação da proteína do gene alvo e o composto de teste sob condições e durante um período de tempo suficiente para permitir que os dois componentes interajam e se liguem, formando assim um complexo que pode ser removido e/ou detetado. A interação entre duas moléculas também pode ser detetada, por exemplo, utilizando transferência de energia de fluorescência (FRET) (veja-se, por exemplo, Lakowicz et al., documento de Patente U. S . N° 5.631.169; Stavrianopoulos et al. , documento de patente U.S. N.° 4.968.103). Um marcador fluoróforo é selecionado de modo que a energia fluorescente emitida por uma primeira molécula dadora será absorvida por um marcador fluorescente numa segunda molécula "acetora", que por sua vez é capaz de emitir fluorescência devido à energia absorvida.

Alternativamente, a molécula de proteína "dadora" pode simplesmente utilizar a energia fluorescente natural de resíduos de triptofano. São escolhidos marcadores que emitem diferentes comprimentos de onda de luz, de modo que o marcador da molécula "acetora" pode ser diferenciado daquele da molécula "dadora". Uma vez que a eficiência da transferência de energia entre os marcadores está relacionada com a distância que separa as moléculas, a relação espacial entre as moléculas pode ser avaliada. Numa situação na qual ocorre a ligação entre as moléculas, a emissão de fluorescência do marcador da molécula "acetora" no ensaio, deverá ser máxima. Um evento de ligação FRET pode ser convenientemente medido através de meios de deteção fluorométricos bem conhecidos na técnica (por exemplo, utilizando um fluorómetro).

Noutra forma de realização, a determinação da capacidade da proteína de marcadores de cancro de células estaminais para se ligar a uma molécula alvo pode ser alcançada utilizando Análise de Interação Biomolecular (BIA) em tempo real (veja-se, por exemplo, Sjolander e Urbaniczky, Anal. Chem. 63:2338-2345 [1991] e Szabo et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 [1995]). A "ressonância de plasmón superficial" ou "BIA" detetam as interações bioespecíficas em tempo real, sem marcação de qualquer um dos interatuantes (por exemplo, BIAcore) . As alterações na massa na superfície de ligação (indicativas de um evento de ligação) resultam em alterações do índice de refração de luz próxima à superfície (o fenómeno ótico da ressonância de plasmón superficial (SPR)), resultando num sinal detetável que pode ser utilizado como uma indicação das reações em tempo real entre moléculas biológicas.

Numa forma de realização, o produto génico alvo ou a substância de teste é ancorada numa fase sólida. Os complexos de produto génico alvo/composto de teste ancorados na fase sólida podem ser detetados no final da reação. 0 produto génico alvo pode ser ancorado numa superfície sólida, e o composto de teste, (que não está ancorado), pode ser marcado, direta ou indiretamente, com marcadores detetáveis discutidos no presente documento.

Pode ser desejável imobilizar os marcadores de cancro de células estaminais, um anticorpo anti-marcador de cancro ou a sua molécula alvo para facilitar a separação de formas complexadas de não complexadas de uma ou ambas as proteínas, bem como para acomodar a automatização do ensaio. A ligação de um composto de teste a uma proteína de marcador de cancro de células estaminais, ou a interação de uma proteína de marcador de cancro com uma molécula alvo na presença e ausência de um composto candidato, pode ser conseguida em qualquer recipiente adequado para conter os reagentes. Exemplos de tais recipientes incluem placas de microtitulação, tubos de ensaio e tubos de microcentrífuga. Numa forma de realização, pode ser proporcionada uma proteína de fusão que adiciona um domínio que permite que uma ou ambas as proteínas se liguem a uma matriz. Por exemplo, proteínas de fusão marcadoras de cancro-glutationa-S-transferase ou proteínas de fusão alvo/glutationa-S-transferase podem ser adsorvidas a esferas de glutationa Sefarose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ou placas de microtitulação derivadas de glutationa, que são depois combinadas com o composto de teste ou o composto de teste e a proteína alvo não adsorvida ou proteína de marcador de cancro, e a mistura é incubada sob condições condutoras para a formação de complexos (por exemplo, em condições fisiológicas para sal e pH) . Após a incubação, as esferas ou poços das placas de microtitulação são lavados para remover quaisquer componentes não ligados, a matriz imobilizada no caso de esferas, os complexos determinados direta ou indiretamente, por exemplo, conforme descrito anteriormente.

Alternativamente, os complexos podem ser dissociados da matriz, e o nível de ligação ou atividade dos marcadores de cancro determinado utilizando técnicas padrão. Outras técnicas para a imobilização de proteína de marcadores de cancro ou uma molécula alvo em matrizes inclui a utilização da conjugação de biotina ou estreptavidina. A proteína de marcador de cancro ou moléculas alvo biotiniladas podem ser preparadas a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, kit de biotinilação, Pierce Chemicals, Rockford, IL) , e imobilizadas nos poços de placas de 96 poços revestidas com estreptavidina (Pierce Chemical).

De modo a levar a cabo um ensaio, o componente não imobilizado é adicionado à superfície revestida contendo o componente ancorado. Depois da reação estar completa, os componentes não reagidos são removidos (por exemplo, por lavagem) sob condições tais que quaisquer complexos formados permanecerão imobilizados na superfície sólida. A deteção dos complexos ancorados na superfície sólida pode ser alcançada de uma série de formas. Quando o componente não imobilizado anterior é pré-marcado, a deteção do marcador imobilizado na superfície indica que os complexos se formaram. Quando o componente não imobilizado anterior não é pré-marcado, um marcador indireto pode ser utilizado para detetar complexos ancorados na superfície; por exemplo, utilizando um anticorpo marcado específico para o componente imobilizado (o anticorpo, por sua vez, pode ser marcado diretamente ou marcado indiretamente com, por exemplo, um anticorpo anti-IgG marcado).

Este ensaio é realizado utilizando anticorpos reativos com a proteína de marcador de cancro de células estaminais ou moléculas alvo mas que não interferem com a ligação da proteína de marcador de cancro de células estaminais com a sua molécula alvo. Tais anticorpos podem ser derivados para os poços da placa, e a proteína de marcadores de cancro alvo não ligada capturada nos poços através de conjugação de anticorpos. Métodos para a deteção de tais complexos, em adição àqueles descritos acima para os complexos GST imobilizados, incluem a imunodeteção de complexos utilizando anticorpos reativos com a proteína de marcador de cancro ou molécula alvo, bem como ensaios ligados a enzimas que se baseiam na deteção de uma atividade enzimática associada com a proteína de marcador de cancro ou molécula alvo.

Alternativamente, os ensaios livres de células podem ser levados a cabo em fase líquida. Em tal ensaio, os produtos de reação são separados a partir de componentes não reagidos, através de uma série de técnicas padrão, incluindo, mas não limitadas a: centrifugação diferencial (veja-se, por exemplo, Rivas e Minton, Trends Biochem Sei 18:284-7 [1993]); cromatografia (cromatografia de filtração em gel, cromatografia de permuta iónica); eletroforese (veja-se, por exemplo, Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nova Iorque); e imunoprecipitação (veja-se, por exemplo, Ausubel et al. , eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nova Iorque) . Tais resinas e técnicas cromatográficas são conhecidas (veja-se, por exemplo, Heegaard J. Mol. Recognit 11:141-8 [1998]; Hageand Tweed J. Chromatogr. Biomed. Sei. Appl 699:499-525 [1997]) . Além disso, a transferência de energia de fluorescência também pode ser convenientemente utilizada, conforme descrito no presente documento, para detetar a ligação sem purificação adicional do complexo a partir de solução. 0 ensaio pode incluir colocar em contacto a proteína de marcadores de cancro de células estaminais ou porção biologicamente ativa da mesma com um composto conhecido que se liga ao marcador de cancro para formar uma mistura de ensaio, colocar a mistura de ensaio em contacto com um composto de teste, e determinar a capacidade do composto de teste para interagir com uma proteína de marcador de cancro, em que a determinação da capacidade do composto de teste para interagir com uma proteína de marcador de cancro inclui determinar a capacidade do composto de teste para se ligar, preferivelmente, a marcadores de cancro ou porções biologicamente ativas dos mesmos, ou para modular a atividade de uma molécula alvo, em comparação com o composto conhecido.

Na medida em que os marcadores de cancro de células estaminais podem, in vivo, interagir com uma ou mais macromoléculas celulares ou extracelulares, tais como proteínas, os inibidores de tal interação são úteis. Um ensaio homogéneo pode ser utilizado para identificar os inibidores.

Por exemplo, um complexo preformado do produto génico alvo e o produto de parceiro de ligação extracelular ou celular interativo é preparado de modo que tantos os produtos génicos alvo como os seus parceiros de ligação são marcados, mas o sinal gerado pelo marcador é extinto devido à formação de complexos (veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 4.109.496, que utiliza esta abordagem para imunoensaios) . A adição de uma substância de teste que compete com, e desloca uma das espécies a partir do complexo preformado resultará na geração de um sinal acima do fundo. Desta maneira, as substâncias de teste que interrompem a interação de produto génico alvo-parceiro de ligação podem ser identificadas. Alternativamente, as proteínas de marcadores de cancro podem ser utilizadas como uma "proteína isco" num ensaio de duplo híbrido ou triplo híbrido (veja-se, por exemplo, documento de Patente U.S. N° 5.283.317; Zervos et ai., Cell 72:223-232 [1993]; Madura et ai., J. Biol. Chem. 268.12046-12054 [1993]; Bartel et ai., Biotechniques 14:920-924 [1993]; Iwabuchi et ai., Oncogene 8:1693-1696 [1993]; e Brent WO 94/10300), para identificação de outras proteínas, que se ligam ou interagem com marcadores de cancro ("proteína de ligação a marcadores de cancro" ou "bp de marcadores de cancro") e estão envolvidas na atividade de marcadores de cancro. Tais bps de marcadores de cancro podem ser ativadoras ou inibidoras de sinais pelas proteínas de marcadores de cancro ou alvos como, por exemplo, elementos a jusante de uma via de sinalização mediada por marcadores de cancro.

Moduladores da expressão de marcadores de cancro também podem ser identificados. Por exemplo, uma célula ou mistura livre de células é colocada em contacto com um composto candidato e a expressão do ARNm ou proteína de marcadores de cancro é avaliada em relação ao nível de expressão de ARNm ou proteína de marcadores de cancro de células estaminais na ausência do composto candidato. Quando a expressão do ARNm ou proteína de marcadores do cancro é maior na presença do composto candidato do que na sua ausência, o composto candidato é identificada como um estimulador da expressão de ARNm ou proteína de marcadores de cancro. Alternativamente, quando a expressão de ARNm ou proteína de marcadores de cancro é menor (ou seja, menor de forma estatisticamente significativa) na presença do composto candidato do que na sua ausência, o composto candidato é identificada como um inibidor da expressão de ARNm ou proteína de marcadores de cancro. 0 nível de expressão de ARNm ou proteína de marcadores de cancro pode ser determinado através de métodos descritos no presente documento para deteção de ARNm ou proteína de marcadores de cancro.

Um agente de modulação pode ser identificado utilizando um ensaio baseado em células ou livre de células, e a capacidade do agente para modular a atividade de proteínas de marcadores de cancro pode ser confirmada in vivo, por exemplo, num animal tal como um modelo animal para uma doença (por exemplo, um animal com cancro da próstata ou cancro da próstata metastático; ou um animal que alberga um xenoenxerto de um cancro da próstata a partir de um animal (por exemplo, um ser humano) ou células a partir de um cancro que resultam de metástases de um cancro da próstata (por exemplo, num gânglio linfático, osso, ou fígado), ou células a partir de uma linha celular de cancro da próstata.

Esta divulgação refere-se adicionalmente a novos agentes identificados pelos ensaios de rastreio descritos acima (veja-se por exemplo, a descrição abaixo de terapêuticas contra o cancro). Consequentemente, encontra-se dentro do âmbito desta divulgação, utilizar adicionalmente um agente identificado conforme descrito no presente documento (por exemplo, um agente de modulação de marcador de cancro, uma molécula de ácido nucleico de marcador de cancro antissentido, uma molécula siARN, um anticorpo específico de marcador de cancro, ou um parceiro de ligação a marcador de cancro) num modelo animal apropriado (tal como aqueles descritos no presente documento) para determinar a eficácia, toxicidade, efeitos secundários, ou mecanismo de ação, do tratamento com tal agente. Além disso, os novos agentes identificados pelos ensaios de rastreio descritos acima podem ser, por exemplo, utilizados para tratamentos conforme descrito no presente documento (por exemplo, para tratar um paciente humano que tem cancro).

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona métodos para o rastreio de fármacos, incluindo, mas não limitado a, anticorpos, quanto à sua capacidade de (a) ligar-se especificamente a uma proteína RSPO humana ou uma proteína LGR humana; (b) interromper a ligação entre uma proteína RSPO humana e uma proteína LGR humana e/ou (c) interromper a ativação da sinalização de LGR através de RSPO.

Composições Farmacêuticas e Métodos A presente divulgação proporciona adicionalmente composições farmacêuticas (por exemplo, compreendendo uma molécula pequena, antissentido anticorpo, ou siARN que, por exemplo, têm como alvo os marcadores de cancro de células estaminais da presente divulgação) . Como tal, as composições farmacêuticas que compreendem um ou mais dos agentes terapêuticos descritos no presente documento, tais como os anticorpos direcionados a proteínas LGR ou RSPO, são proporcionadas. Em determinadas formas de realização, as composições farmacêuticas que compreendem o um ou mais agentes terapêuticos descritos no presente documento compreendem um portador farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas da presente divulgação podem ser administradas de uma série de formas dependendo de se é desejado tratamento local ou sistémico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica e a membranas mucosas incluindo administração vaginal e retal), pulmonar (por exemplo, através de inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo através de nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica ou transdérmica), oral ou parentérica. A administração parentérica inclui injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou intracranial, por exemplo, administração intratecal ou intraventricular.

As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir pensos transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizações, líquidos epós. Portadores farmacêuticos, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes convencionais podem ser necessários ou desejáveis.

As composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, saquetas ou comprimidos. Espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificantes, adjuvantes da dispersão ou aglutinantes podem ser desejáveis.

Composições e formulações para administração parentérica, intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados tais como, mas não limitados a, potenciadores da penetração, compostos portadores e outros portadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

As composições farmacêuticas da presente divulgação incluem, mas não estão limitadas a, soluções, emulsões, e formulações contendo lipossomas. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, mas não estão limitados a, líquidos preformados, sólidos auto-emulsificantes e semissólidos auto-emulsificantes.

As formulações farmacêuticas da presente divulgação, que podem ser convenientemente apresentadas numa forma farmacêutica unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de colocar em associação os ingredientes ativos com o(s) portador(es) ou excipiente(s) farmacêuticos. Em geral as formulações são preparadas por uniformemente e intimamente colocar em associação os ingredientes ativos com portadores líquidos ou portadores sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se for necessário, dar forma ao produto.

As composições da presente divulgação podem ser formuladas em qualquer de várias formas farmacêuticas possíveis tais como, mas não limitadas a, comprimidos, cápsulas, xaropes líquidos, géis moles, supositórios e enemas. As composições da presente divulgação também podem ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem conter adicionalmente substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão também pode conter estabilizantes.

Numa forma de realização da presente divulgação as composições farmacêuticas podem ser formuladas e utilizadas como espumas. As espumas farmacêuticas incluem formulações tais como, mas não limitadas a, emulsões, microemulsões, cremes, gelatinas e lipossomas. Enquanto são basicamente semelhantes em natureza, estas formulações variam nos componentes e na consistência do produto final.

Agentes que melhoram a absorção de oligonucleótidos ao nível celular também podem ser adicionados à composição farmacêutica e outras da presente divulgação. Por exemplo, lípidos catiónicos, tais como lipofectina (documento de Patente U. S . N.° 5.705.188), derivados de glicerol catiónicos, e moléculas policatiónicas, tais como polilisina (WO 97/30731), também melhoram a absorção celular de oligonucleótidos.

As composições da presente divulgação podem conter adicionalmente outros componentes adjuntos encontrados convencionalmente em composições farmacêuticas. Como tal, por exemplo, as composições podem conter materiais farmaceuticamente ativos adicionais e compatíveis, tais como, por exemplo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis na formulação física de várias formas farmacêuticas das composições da presente divulgação, tais como corantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espessantes e estabilizantes. Contudo, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente divulgação. As formulações podem ser esterilizadas e, se for desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e semelhantes que não interagem de forma deletéria com o(s) ácido(s) nucleico(s) da formulação. A presente divulgação proporciona composições farmacêuticas que compreendem (a) um ou mais dos agentes terapêuticos descritos no presente documento e (b) um segundo agente anti-cancro. Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti-cancro é um agente quimioterapêutico. Determinadas formas de realização da divulgação proporcionam composições farmacêuticas contendo (a) um ou mais compostos que modulam a atividade de marcadores de cancro de células estaminais (por exemplo, anticorpo, molécula pequena, siARN, antissentido, etc.) e (b) um ou mais outros agentes quimioterapêuticos.

Exemplos de tais agentes quimioterapêuticos incluem, mas não estão limitados a, fármacos anti-cancro tais como daunorrubicina, dactinomicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina, mostarda de azoto, clorambucilo, melfalano, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, vincristina, vinblastina, etopósido, tenipósido, cisplatina e dietilestilbestrol (DES). Em determinadas formas de realização, o agente quimioterapêutico é irinotecano ou paclitaxel. Fármacos anti-inflamatórios, incluindo mas não limitados a fármacos anti-inflamatórios não esteroides e corticosteroides, e fármacos antivirais, incluindo mas não limitados a ribavirina, vidarabina, aciclovir e ganciclovir, também podem ser combinados em composições da divulgação. Outros agentes quimioterapêuticos também estão dentro do âmbito desta divulgação.

Dois ou mais compostos combinados podem ser utilizados em conjunto ou sequencialmente. A dosagem é dependente da gravidade e responsividade do estado de doença a ser tratado, com o curso do tratamento durando desde vários dias a vários meses, ou até ser efetuada uma cura ou alcançada uma diminuição do estado da doença (por exemplo redução do tamanho tumoral) . Os esquemas de dosagem ótimos podem ser calculados a partir de medições de acumulação de fármaco no corpo do paciente. 0 médico administrador pode facilmente determinar as dosagens ótimas, metodologias de dosagem e taxas de repetição. As dosagens ótimas podem variar dependendo da potência relativa dos oligonucleótidos individuais, e podem, geralmente, ser estimadas com base nas CE50s que se verifica serem eficazes em modelos animais in vitro e in vivo ou com base nos exemplos descritos no presente documento. Em geral, a dosagem é desde 0,01 pg até 100 g por kg de peso corporal, e pode ser administrada uma vez ou mais por dia, por semana, por mês ou por ano. O médico assistente pode estimar as taxas de repetição para a dosagem com base nos tempos de residência e nas concentrações do fármaco medidos nos fluidos ou tecidos corporais. Após o tratamento bem-sucedido, pode ser desejável que o sujeito seja submetido a terapêutica de manutenção para prevenir a recorrência do estado de doença, em que o oligonucleótido é administrado em doses de manutenção, que variam desde 0,01 pg até 100 g por kg de peso corporal, uma ou mais vezes por dia, até uma vez cada 20 anos. A divulgação proporciona métodos de tratamento de cancro que compreendem administrar um ou mais dos agentes terapêuticos descritos no presente documento a um sujeito (por exemplo, um ser humano). Em determinadas formas de realização, o cancro envolve células estaminais cancerosas. Em determinadas formas de realização, o cancro tratado é cancro da mama ou cancro do cólon.

Em algumas formas de realização, o sujeito tratado através dos métodos descritos no presente documento tem um tumor sólido. Nalgumas formas de realização, ao sujeito tratado através dos métodos descritos no presente documento foi removido um tumor sólido. Em determinadas formas de realização, o tumor compreende células estaminais de tumor sólido. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor que sobre-expressa LGR5 (em relação a células normais do mesmo tipo de tecido). Em determinadas formas de realização, o tumor não sobre-expressa significativamente uma proteína Wnt em relação ao tecido normal, e o tumor exibe, portanto, uma expressão de Wnt normal. Em determinadas formas de realização alternativas, o tumor sobre-expressa pelo menos uma proteína Wnt.

Em determinadas formas de realização, um sujeito tendo um tumor é rastreado para identificar se o tumor sobre-expressa LGR5 ou compreende células estaminais cancerosas que sobre-expressam LGR5 antes da administração do agente terapêutico . A divulgação proporciona um método de tratar o cancro ou inibir o crescimento de um tumor num ser humano, que compreende administrar ao ser humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que (a) interrompe a ligação de uma proteína de R-espondina (RSPO) humana e um recetor acoplado a proteína G contendo repetições ricas em leucina (LGR); e/ou (b) interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO; A divulgação proporciona adicionalmente um método de tratar o cancro ou inibir o crescimento tumoral ao inibir a sinalização de beta-catenina numa célula tumoral, que compreende colocar em contacto a dita célula tumoral com um agente que (a) interrompe a ligação de uma proteína de R-espondina (RSPO) humana e um recetor acoplado a proteína G contendo repetições ricas em leucina (LGR); e/ou (b) interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO; Em determinadas formas de realização, o método é um método in vivo. Em formas de realização alternativas, o método é um método in vitro.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um método de tratar o cancro (por exemplo, um cancro que compreende células estaminais de cancro), o método que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína R-espondina (RSPO) humana. Em determinadas formas de realização, a proteína RSPO é RSP01. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano. Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um método de inibir o crescimento tumoral, o método que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína R-espondina (RSPO) humana. Em determinadas formas de realização, a proteína RSPO é RSP01. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor que compreende células estaminais de tumor sólido. Em determinadas formas de realização, o anticorpo interrompe a ligação da proteína RSPO humana a uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização alternativas, o anticorpo interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO e/ou interrompe a sinalização de beta-catenina.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um método de tratamento de cancro que compreende células estaminais cancerosas, o método que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especif icamente um domínio extracelular de uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização, o domínio extracelular compreende os aminoácidos 22-564 de LGR5 humana (SEQ ID NO: 1) . Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um método de inibir o crescimento tumoral, o método que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização, a proteína LGR humana é LGR5. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor que compreende células estaminais de tumor sólido. Em determinadas formas de realização, o anticorpo interrompe a ligação de uma proteína RSPO humana à proteína LGR humana. Em determinadas formas de realização alternativas, o anticorpo interrompe a ativação da sinalização de LGR através de RSPO e/ou interrompe a sinalização de beta-catenina.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona um método de tratamento de cancro que compreende células estaminais cancerosas, o método que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um recetor solúvel que compreende um domínio extracelular de LGR5 humana. Em determinadas formas de realização, o domínio extracelular compreende os aminoácidos 22-564 de LGR5 humana (SEQ ID NO: 1) . Em determinadas formas de realização, o domínio extracelular de LGR5 humana está ligado em estrutura com uma sequência de proteína não LGR. Em determinadas formas de realização, a proteína não LGR é Fc humana. A divulgação proporciona adicionalmente métodos de inibição da proliferação de células estaminais de cancro e/ou de diminuição do número ou proporção de células estaminais de cancro num sujeito compreendendo administrar ao sujeito um ou mais dos agentes terapêuticos descritos no presente documento, incluindo, mas não limitados a, anticorpos anti-LGR e anti-RSPO.

Em determinadas formas de realização, os métodos que compreendem a administração de um agente terapêutico a um sujeito compreendem adicionalmente a administração de um segundo agente anti-cancro ao sujeito. 0 agente terapêutico e segundo agente anti-cancro podem ser administrados ao mesmo tempo (concorrentemente) ou em momentos diferentes (por exemplo, sequencialmente). Em determinadas formas de realização, os dois agentes são administrados ao sujeito como parte da mesma composição. Em determinadas formas de realização, o agente terapêutico é administrado ao sujeito numa composição, enquanto o segundo agente anti-cancro é administrado ao sujeito numa segunda composição.

Em determinadas formas de realização, os sujeitos são mamíferos. Em determinadas formas de realização, os sujeitos aos quais os agentes terapêuticos são administrados são seres humanos. A presente divulgação proporciona adicionalmente kits e artigos de fabrico que compreendem tanto um agente terapêutico descrito no presente documento, bem como um segundo agente anti-cancro. Em determinadas formas de realização o segundo agente anti-cancro é um agente quimioterapêutico.

Animais Transgénicos que Expressam Genes Marcadores de Cancro A presente divulgação contempla a geração de animais transgénicos que compreendem um gene marcador de cancro exógeno da presente divulgação ou mutantes e variantes do mesmo (por exemplo, truncagens ou polimorfismos de nucleótido único) ou knock-outs do mesmo. Nalgumas formas de realização, o animal transgénico exibe um fenótipo alterado (por exemplo, presença de marcadores aumentada ou diminuída) em comparação com animais de tipo selvagem. Métodos para analisar a presença ou ausência de tais fenótipos incluem, mas não estão limitados, àqueles divulgados no presente documento. Nalgumas formas de realização, os animais transgénicos apresentam adicionalmente um crescimento de tumores aumentado ou diminuído ou evidência de cancro.

Os animais transgénicos da presente divulgação encontram utilidade em rastreios de fármacos (por exemplo, terapêutica contra o cancro) . Nalgumas formas de realização, os compostos de teste (por exemplo, um fármaco que se suspeita ser útil para o tratamento do cancro) e compostos de controlo (por exemplo, um placebo) são administrados aos animais transgénicos e aos animais de controlo e os efeitos são avaliados.

Os animais transgénicos podem ser gerados através de uma variedade de métodos. Nalgumas formas de realização, células embrionárias em vários estádios de desenvolvimento são utilizadas para introduzir transgenes para a produção de animais transgénicos. Diferentes métodos são utilizados dependendo do estádio de desenvolvimento da célula embrionária. 0 zigoto é o melhor alvo para a microinjeção. No ratinho, o pronúcleo do macho atinge o tamanho de aproximadamente 20 micrómetros de diâmetro que permite a injeção reproduzível de 1-2 picolitros (pl) de solução de ADN. A utilização de zigotos como um alvo para a transferência de genes tem uma grande vantagem no sentido em que na maioria dos casos o ADN injetado será incorporado no genoma do hospedeiro antes da primeira clivagem (Brinster et al. , 1985, PNAS 82:4438-4442). Como uma consequência, todas as células do animal não-humano transgénico portarão o transgene incorporado. Isto irá, no geral, ser também refletido na transmissão eficiente do transgene à descendência do fundador uma vez que 50% das células germinais irão albergar o transgene. O documento de Patente U.S. 4.873.191 descreve um método para a microinjeção de zigotos.

Noutras formas de realização, a infeção retroviral é utilizada para introduzir transgenes num animal não-humano. Nalgumas formas de realização, o vetor retroviral é utilizado para transfetar oócitos através da injeção do vetor retroviral no espaço perivitelino do oócito (documento de Patente U.S. N. 0 6.080.912). Noutras formas de realização, o desenvolvimento do embrião não humano pode ser cultivado in vitro até ao estádio de blastocisto. Durante este período de tempo, os blastómeros podem ser alvos para a infeção retroviral (Janenich, 1976, PNAS 73:1260) . A infeção eficiente dos blastómeros é obtida através do tratamento enzimático para remover a zona pelúcida (Hogan et al. , em Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. [1986]) . O sistema de vetor viral utilizado para introduzir o transgene é tipicamente um retrovirus de replicação defeituosa que porta o transgene (Jahner et al. , 1985, PNAS 82:6927) . A transfeção é fácil e eficientemente obtida através da cultura dos blastómeros numa monocamada de células que produzem vírus (Stewart, et al., 1987, EMBO J., 6:383).

Alternativamente, a infeção pode ser realizada num estádio posterior. Vírus ou células produtoras de vírus podem ser injetadas no blastocélio (Jahner et al. , 1982, Nature 298:623) . A maioria dos fundadores serão mosaicos para o transgene uma vez que a incorporação ocorre apenas num subconjunto de células que formam o animal transgénico. Além disso, o fundador pode conter várias inserções retrovirais do transgene em posições diferentes no genoma que, geralmente, irão ser segregadas na descendência. Adicionalmente, também é possível introduzir transgenes na linha germinal, embora com pouca eficiência, através de infeção retroviral intrauterina do embrião em meados da gestação (Jahner etal., supra [1982]). Meios adicionais de utilização de vetores retrovirais para criar animais transgénicos conhecidos na técnica envolvem a microinjeção de partículas retrovirais ou células tratadas com mitomicina C que produzem retrovirus no espaço perivitelino de ovos fertilizados ou embriões precoces (Pedido Internacional PCT WO 90/08832 [1990], e Haskell e Bowen, 1995, Mol. Reprod. Dev., 40:386) .

Noutras formas de realização, o transgene é introduzido em células estaminais embrionárias e as células estaminais transfetadas são utilizadas para formar um embrião. Células estaminais embrionárias são obtidas através de cultura de embriões e pré-implantação in vitro sob condições apropriadas (Evans et at., 1981, Nature 292:154; Bradley et al., 1984, Nature 309:255; Gossler et al., 1986, PNAS 83:9065; e Robertson et al. , 1986, Nature 322:445) . Os transgenes podem ser eficientemente introduzidos nas células estaminais embrionárias através de transfeção de ADN através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo co-precipitação com fosfato de cálcio, fusão com protoplasto ou esferoplasto, lipofeção e transfeção mediada por DEAE-dextrano. Os transgenes também podem ser introduzidos em células estaminais embrionárias através de transdução mediada por retrovirus ou por microinjeção. Tais células estaminais embrionárias transfetadas podem, posteriormente, colonizar um embrião após a sua introdução no blastocélio de um embrião em estádio de blastocisto e contribuem para a linha germinal do animal quimérico resultante (para revisão, veja-se, Jaenisch, Science, 1988, 240:1468) . Antes da introdução das células estaminais embrionárias transfetadas no blastocélio, as células estaminais embrionárias podem ser submetidas a vários protocolos de seleção para enriquecer quanto a células estaminais embrionárias que integraram o transgene assumindo que o transgene proporciona um meio para tal seleção. Alternativamente, a reação de polimerase em cadeia pode ser utilizada para rastrear quanto a células estaminais embrionárias que integraram o transgene. Esta técnica evita a necessidade de crescimento das células estaminais embrionárias transfetadas sob condições seletivas apropriadas antes de transferência para o blastocélio.

Em ainda outras formas de realização, a recombinação homóloga é utilizada para inativar a função génica ou criar mutantes de deleção (por exemplo, mutantes de truncagem). Métodos para recombinação homóloga são descritos no documento de Patente U.S. N.° 5.614.396.

EXPERIMENTAL

Os seguintes exemplos são proporcionados de modo a demonstrar e ilustrar adicionalmente determinadas formas de realização e aspetos da presente divulgação e não devem ser considerados como limitantes do âmbito da mesma.

Exemplo 1 LGR5 é sobre-expressa em células estaminais cancerosas em relação a células tumorais não tumorigénicas

Recentemente foi demonstrado que tumores da mama malignos humanos albergam uma população pequena e distinta de células estaminais cancerosas que são enriquecidas na sua capacidade de formar tumores em ratinhos imunodeficientes. Foi constatado que uma população de células Lin ESA+, CD44+, CD24-/baixo estava enriquecida 50 vezes em células de tumor de mama tumorigénicas em comparação com células tumorais não fracionadas (Al-Hajj et al., 2003, PNAS 100:3983-8). Uma população semelhante de células estaminais cancerosas ESA+ CD44+ foi identificada em cancros do cólon (Pedido de Patente U.S. N.° 11/591.019) . A análise de microarranjo de células estaminais cancerosas tumorigénicas classificadas por FACS comparada com células tumorais não tumorigénicas revelou um número de marcadores de células estaminais cancerosas regulados positivamente em células estaminais cancerosas em relação a células tumorais não tumorigénicas. (Pedido de Patente U.S. N.°s 10/864.207 e 11/050.282).

Estes dados de microarranjo também revelaram que a LGR5 é sobre-expressa em células estaminais de cancro do cólon em comparação com células tumorais não tumorigénicas (Fig. 1). Células estaminais de cancro do cólon tumorigénicas (TG) foram isoladas a partir do total de células tumorais com base em marcadores de superfície celular utilizando FACS. Especificamente, as células foram contadas, lavadas duas vezes com HBSS contendo soro de bezerro inativado por calor (HICS) a 2% e HEPES a 25 mM, e ressuspendidas a 106 células por 100 ul. As células tumorais foram incubadas com anticorpos CD3, CD4, CD8, Terll9, Macl e Grl anti-ratinho conjugados com uma esfera magnética e feitas correr sobre uma coluna magnética para remover as células hematopoieticas de ratinho. As células tumorais foram depois incubadas com um anticorpo de ovelha anti-rato conjugado com Cy5.5-PE e o corante de viabilidade iodeto de propídio para detetar e remover as restantes células hematopoiéticas de ratinho e mortas, respetivamente. Depois do bloqueio, as células foram adicionalmente incubadas com anticorpos conjugados de forma fluorescente contra células H-2Kd de ratinho, ESA humano (Miltenyi Biotec; Auburn, CA) e CD44, (Bioscience, San Diego, CA) para remover células de ratinho e para selecionar positivamente células tumorais humanas que expressam ESA e CD44. Citometria de fluxo foi realizada num FACSAria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) com a utilização de perfis de dispersão lateral e dispersão frontal para selecionar quanto a células únicas. As células positivas para Cy5.5-PE+ e iodeto de propídio foram primeiramente excluídas e uma fração de células ESA+44+ foi isolada independentemente de uma fração de células tumorais não ESA+44+. A análise de microarranjo foi utilizada para identificar marcadores para células estaminais cancerosas frente a células tumorais não tumorigénicas. ARN total a partir de células estaminais cancerosas tumorigénicas e células tumorais sólidas não tumorigénicas classificadas por FACS foi isolado utilizando RNasy (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. As sondas para a análise de microarranjo foram preparadas e hibridadas em chips de gene HG-U133 Affymetrix de acordo com os protocolos da Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA) . Os arranjos foram rastreados com microscópio confocal de laser de árgon e a intensidade para cada sonda estabelecida no arranjo foi avaliada com o software Affymetrix Microarray Suite 4.0 de acordo com os procedimentos da Affymetrix. A análise de microarranjo dos três cancros do cólon diferentes (C4, C6, e C9) revelou a sobre-expressão de LGR5 em células estaminais de tumor sólido tumorigénicas em comparação com células de tumor sólido não tumorigénicas (Fig. D · A análise de microarranjo utilizando ARNm isolado a partir de tumores e tecido normal correspondente a partir de um grande número de pacientes humanos (GeneLogic BioExpress Datasuite) revelou adicionalmente uma expressão aumentada de LGR5 bem como LGR6 em tumores humanos de origem epitelial. A expressão de LGR5 em amostras de pacientes individuais a partir de uma ampla gama de tumores epiteliais foi comparada com a expressão em epitélios de órgãos normais. LGR5 no chip HG-U133_Plus_2, fragmentlD(ChiplD) 244395(51), apresentou uma expressão aumentada na maioria dos tumores mas especialmente em tumores do cólon, fígado, ovário, e pulmão (Fig. 2) . De forma semelhante, LGR6 no chip HG-U133_Plus_2, fragmentlD(ChiplD) 258288(51), apresentou uma expressão alterada na maioria dos tumores epiteliais (Fig. 3).

Exemplo 2 RSP01 ativa a sinalização de beta-catenina através de LGR5

Este exemplo descreve a ativação da sinalização de beta-catenina por RSP01 através de LGR5.

Em determinadas formas de realização, um ensaio repórter de 8xTCF luciferase demonstrou que RSP01 ativa a expressão de um promotor responsivo a beta-catenina. Uma construção de RSPOl-Fc foi gerada utilizando técnicas de ADN recombinante padrão. Especificamente, RSP01 humana de comprimento completo foi ligada em estrutura com Fc humana e a proteína RSPOl-Fc recombinante expressa em células de inseto utilizando baculovírus. RSPOl-Fc recombinante foi depois purificada a partir do meio de inseto condicionado utilizando cromatografia com proteína A. Células HEK 293 transfetadas de forma estável com repórter 8xTCF luciferase foram expostas a RSPOl-Fc em concentrações cada vez mais elevadas durante um total de doze horas. As células repórter apresentaram uma maior atividade de luciferase em resposta a concentrações crescentes de RSP01 (Fig. 4) . 0 efeito de LGR5 solúvel na ativação por RSP01 do promotor responsivo a beta-catenina 8xTCF foi avaliado (Fig. 5) . Uma construção de LGRó-Fc solúvel foi gerada utilizando técnicas de ADN recombinante padrão. Especificamente, os aminoácidos 1 a 564 de LGR5 humana foram ligados em estrutura a Fc humana e a LGR5-Fc recombinante foi expressa em células de inseto utilizando baculovírus. A clivagem da sequência de sinal de LGR5 resulta numa proteína de fusão LGR5-Fc madura contendo os aminoácidos 22-564 de LGR5. Células HEK 293 transfetadas de forma estável com uma construção de repórter 8xTCF luciferase foram cultivadas em placas de 96 poços e expostas a: meio de controlo; 2,5 ug RSPOl-Fc; ou RSPOl-Fc em combinação com concentrações crescentes de LGR5-FC solúvel durante 24 horas. LGR5 solúvel inibiu a ativação por RSPO da atividade de luciferase através do promotor responsivo a beta-catenina. LGR5 solúvel também inibe especificamente a ativação sinérgica da sinalização de beta-catenina por RSP01 e Wnt3B. Células HEK 293 transfetadas de forma estável com uma construção de repórter 8xTCF luciferase foram cultivadas em placas de 96 poços e expostas a: meio de controlo (LCM, meio condicionado de células L) ; 2,5 ug RSP01-Fc em LCM; Wnt3A (meio condicionado de células L contendo Wnt 3A) ; ou uma combinação de RSPOl-Fc e Wnt3A juntamente com concentrações crescentes de LGR5-Fc solúvel (Fig. 6A) ouFZDIO-Fc solúvel (Fig. 6B) durante 24 horas. RSPOl e Wnt3A atuam sinergicamente na ativação da atividade de luciferase a partir do promotor de beta-catenina, e LGR5 solúvel inibiu esta ativação (Fig. 6A). Em contraste, FZD10 solúvel não teve qualquer efeito (Fig. 6B).

Para determinar o mecanismo através do qual RSPOl ativa a sinalização de beta-catenina, a análise de FACS foi utilizada para avaliar a ligação entre RSPOl e LGR5. Em determinadas formas de realização, a ligação entre LGR5 solúvel e RSPOl da superfície celular foi determinada. Uma proteína RSPOl da superfície celular foi gerada através da ligação de RSPOl humana de comprimento completo com o domínio transmembranar de CD4 utilizando técnicas de ADN recombinante padrão (RSP01-CD4TM). Células HEK 293 foram transientemente transfetadas com RSP01-CD4TM e GFP. Após 48 horas, as células foram suspensas em PBS gelado contendo FCS a 2% e depois incubadas em gelo na presença de LGR5-FC, LRP6-ECD-Fc (contendo o domínio extracelular de LRP6 humana fusionado com um domínio Fc) , LRP6El-2-Fc (contendo os aminoácidos 1-629 de LRP6 humana fusionados a um domínio Fc), ou várias construções de FZD-Fc, incluindo FZD1-10. Células transfetadas com RSPOl interagiram com LGR5 mas não interagiram com qualquer construção de FZD (Fig. 7A) . Apenas uma fraca interação entre RSPOl e o co-recetor WNT LRP6 foi detetada.

Em determinadas formas de realização, a ligação entre RSPOl solúvel e LGR5 da superfície celular foi determinada. Uma proteína LGR5 da superfície celular variante foi gerada através da ligação dos aminoácidos 22-564 de LGR5 a uma etiqueta FLAG N-terminal e ao domínio transmembranar de CD4 utilizando técnicas de ADN recombinante padrão (FLAG-LGR5-CD4TM) . Células HEK 293 foram transientemente transfetadas com FLAG-LGR5-CD4TM e GFP . Após 48 horas, as células foram suspensas em PBS gelado contendo FCS a 2% e heparina e depois incubadas em gelo na presença de RSP01-Fc, FZD8-Fc, ou um anticorpo FLAG como um controlo positivo. RSP01 solúvel interage com células transfetadas com LGR5 mas FZD8 solúvel não (Fig. 7B).

Para determinar se outros membros da família de RSPO também eram capazes de ligar-se a LGR5, estudos adicionais foram realizados examinando a interação de cada membro da família de RSPO com LGR5 . Células HEK 293 foram transientemente transfetadas com FLAG-LGR5-CD4TM e GFP. Após 48 horas, as células foram suspensas em PBS gelado contendo FCS a 2% e heparina e depois incubadas em gelo na presença de RSP01-Fc, RSP02-Fc, RSP03-Fc, RSP04-Fc, FZD8-Fc, conforme indicado (Fig. 7C) ou um anticorpo FLAG como um controlo positivo. Cada membro da família de RSPO interagiu com células transfetadas com LGR5 . Exemplo 3

Geração de Anticorpos Anti-RSPOl ou Anti-LGR5

Exemplo 2 identifica uma via alternativa à ativação de beta-catenina através de RSP01 e LGR5. 0 bloqueio da interação entre as proteínas RSPO e LGR, como tal, poderia interromper a sobre-ativação da sinalização de beta-catenina associada com a tumorigenicidade. Em determinadas formas de realização, os anticorpos contra uma proteína RSPO atuam como uma terapêutica contra o cancro através da interrupção da sinalização de LGR. Em determinadas formas de realização, os anticorpos contra RSP01 interrompem a interação entre RSP01 e LGR5. Em determinadas formas de realização, os anticorpos contra uma proteína LGR atuam como uma terapêutica contra o cancro através da interrupção da sinalização de LGR. Em determinadas formas de realização, os anticorpos contra LGR5 interrompem a interação entre RSP01 e LGR5.

Este exemplo descreve a geração de anticorpos contra RSP01 e LGR5. Técnicas semelhantes são utilizadas para gerar anticorpos contra RSP02, RSP03, RSP04, LGR4, e LGR6.

Produção de Antigénios

Em determinadas formas de realização, fragmentos proteicos parciais ou de comprimento completo recombinantes de RSP01 humana ou um domínio extracelular de LGR5 humana são gerados como antigénios para a produção de anticorpos. Tecnologia de ADN recombinante padrão é utilizada para isolar polinucleótidos que codificam RSP01 ou LGR5. Estes polinucleótidos são depois ligados em estrutura à sequência de etiqueta da proteína, incluindo, por exemplo, uma Fc humana, uma etiqueta de histidina, uma etiqueta FLAG, ou outra etiqueta proteica adequada, e clonados num vetor plasmídico de transferência para expressão mediada por baculovirus em células de inseto. Protocolos de transfeção, infeção, e cultura celular padrão são depois utilizados para produzir células de inseto recombinantes que expressam os polipéptidos RSP01 e LGR5 correspondentes (0'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)) . A proteína antigénica é purificada a partir de lisados de células de inseto utilizando cromatografia de afinidade. A proteína antigénica purificada é submetida a diálise contra PBS (pH=7), concentrada até aproximadamente 1 mg/ml, e esterilizada por filtração em preparação para a imunização. Imunização

Ratinhos (n=3) são imunizados com proteína antigénica de RSP01 e LGR5 purificada (Antibody Solutions; Mountain View, CA) utilizando técnicas padrão. Sangue a partir de ratinhos individuais é rastreado aproximadamente 70 dias após a imunização inicial quanto ao reconhecimento de antigénios utilizando ELISA e análise por FACS. Os dois animais com os títulos de anticorpos mais elevados são selecionados para um reforço antigénico final após o qual células esplénicas são isoladas para a produção de hibridomas. Células de hibridoma são colocadas em placas em 1 célula por poço em placas de 96 poços, e o sobrenadante a partir de cada poço é rastreado por ELISA e análise por FACS contra proteína antigénica. Vários hibridomas com elevado título de anticorpos são selecionados e a escala aumentada em frascos de cultura estáticos. Os anticorpos são purificados a partir do sobrenadante de hibridomas utilizando cromatografia de agarose com proteína A ou proteína G e os anticorpos são testados por classificação por FACS de células que expressam RSP01 ou LGR5.

Análise por FACS

Para selecionar os anticorpos monoclonais produzidos por clones de hibridoma que reconhecem RSP01 nativa ou proteína LGR5 da superfície celular nativa, a análise por FACS é utilizada. Num exemplo, para facilitar o rastreio de células por FACS, um anticorpo IgGlx de ratinho de controlo de isotipo, anticorpos anti-RSPOl, e anti-LGR5 são conjugados com Alexa Fluor™ 647 (AF647) utilizando o kit da Invitrogen #A-20186. Células HEK 293 são transientemente co-transfetadas com vetores de expressão que codificam uma construção de RSP01 ou LGR5 associada à célula e GFP. Vinte e quatro a 48 horas após a transfeção as células são recolhidas em suspensão e incubadas em gelo com anticorpos anti-RSPOl ou anti-LGR5 e comparadas com anticorpos IgGl de controlo para detetar a ligação de anticorpos de fundo. As células são lavadas e depois classificadas por FACS para identificar a ligação de anticorpos a RSP01 ou LGR5 expressas na superfície celular, respetivamente.

Numa experiência, os anticorpos monoclonais produzidos por clones de hibridoma que reconhecem proteína LGR5 de superfície celular nativa foram selecionados utilizando análise por FACS. Células HEK 293 foram transientemente co-transfetadas com vetores de expressão que codificam uma construção de LGR5 associada à célula (FLAG-LGR5-CD4TM) e GFP. Vinte e quatro a 48 horas pós-transfeção, as células foram recolhidas em suspensão e incubadas em gelo com um anticorpo irrelevante como um controlo negativo (IgGl controlo), ou com anticorpo anti-FLAG como controlo positivo para a expressão de LGR5, ou com um mAb para LGR5 (88M1, 88M5) , seguidas por incubação com reagente secundário anti-mAb fluorescente conjugado com PE. As células foram lavadas e depois classificadas por FACS para identificar a ligação de anticorpos a LGR5 expressa na superfície celular, respetivamente. Desta forma, os anticorpos contra LGR5 foram identificados (Figura 8). Verificou-se que os anticorpos monoclonais 88M1 e 88M5 apresentam ligação específica a LGR5. Além disso, pode-se utilizar a análise por FACS para selecionar anticorpos que interrompem a interação entre uma proteína RSPO e uma proteína LGR (por exemplo, LGR5). Por exemplo, pode-se medir a ligação de uma RSPO a LGR5 através de citometria de fluxo na presença ou ausência de um anticorpo contra RSPO ou LGR5.

Conforme mostrado (Figura 9) , o anticorpo monoclonal 88M1 foi identificado como um anticorpo anti-LGR5 que inibe a ligação de RSPO a LGR5. Células HEK 293 foram transientemente transfetadas com FLAG-LGR5-CD4TM e GFP . A ligação da proteína de fusão RSPOl-Fc a células transfetadas foi detetada por incubação com anticorpo anti-fc humana conjugado com PE. 0 impacto do anticorpo anti-LGR5 88M1 na ligação de RSPOl-Fc foi avaliada através da incubação das células transfetadas com 88M1 conforme indicado e análise com citometria de fluxo. A experiência demonstra que 88M1 reduziu a ligação de RSPOl-Fc a LGR5 nas células transfetadas.

Anticorpos quiméricos

Depois de que os anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente RSP01 ou LGR5 sejam identificados, estes anticorpos são modificados para superar a resposta imunitária de anticorpo humano anti-ratinho (HAMA) quando anticorpos de roedor são utilizados como agentes terapêuticos. As regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo monoclonal selecionado são isoladas por RT-PCR a partir de células de hibridoma e ligadas em estrutura com regiões constantes de cadeia pesada e cadeia leve kapa de IgGl humana, respetivamente, em vetores de expressão mamíferos. Alternativamente, é utilizado um vetor de expressão de Ig humana tal como TCAE 5.3 que contém os genes de região constante de cadeia pesada e cadeia leve kapa de IgGl humana no mesmo plasmídeo (Preston et al., 1998, Infection & Immunity 66:4137-42). Os vetores de expressão que codificam cadeias pesadas e leves quiméricas são depois co-transfetados em células de ovário de hámster chinês (CHO) para a produção de anticorpos quiméricos. A imunorreatividade e afinidade dos anticorpos quiméricos são comparadas com anticorpos murinos parentais através de ELISA e FACS.

Anticorpos humanizados

Como as terapêuticas com anticorpos são ainda, frequentemente, antigénicas, produzindo uma resposta imunitária de anticorpo humano anti-ratinho (HAMA), os anticorpos quiméricos contra RSP01 ou LGR5 podem necessitar de humanização adicional. Para gerar anticorpos humanizados, as três sequências hipervariáveis curtas, ou regiões de determinação de complementaridade (CDRs), dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo quimérico descrito acima, são manipuladas utilizando tecnologia de ADN recombinante na estrutura de domínio variável de sequências de cadeia pesada e leve humanas, respetivamente, e depois clonadas num vetor de expressão mamífero para expressão em células CHO. A imunorreatividade e afinidade dos anticorpos humanizados são comparadas com anticorpos quiméricos parentais através de ELISA e FACS. Adicionalmente, a mutagénese sítio-dirigida ou de alta densidade da região variável pode ser utilizada para otimizar a especificidade, afinidade, etc. do anticorpo humanizado.

Anticorpos Humanos

Em formas de realização alternativas, os anticorpos humanos que reconhecem especificamente RSP01 ou um domínio extracelular de LGR5 são isolados utilizando tecnologia de apresentação de fagos. Uma biblioteca de anticorpos sintéticos contendo domínios variáveis de anticorpos humanos (MorphoSys, Munique, Alemanha) é rastreada quanto ao reconhecimento específico e de alta afinidade de um antigénio descrito acima. As cassetes de CDR na biblioteca são especificamente mudada através de sítios de restrição flanqueantes para a otimização de anticorpos. Regiões variáveis humanas otimizadas são depois clonadas num vetor de expressão de Ig contendo cadeia leve kapa e cadeia pesada de IgGl para a expressão de anticorpos humanos em células CHO.

Exemplo 4

Prevenção In Vivo do Crescimento Tumoral através de Direcionamento a RSP01 e LGR5

Este exemplo descreveu a utilização de biomoléculas direcionadas a RSP01 e LGR5 para afetar o crescimento de células tumorais, in vivo. Em determinadas formas de realização, os anticorpos contra RSP01 são utilizadas para inibir o crescimento de células tumorais in vivo. Em determinadas formas de realização, os anticorpos contra LGR5 são utilizadas para inibir o crescimento de células tumorais in vivo. Em determinadas formas de realização, um recetor LGR5 solúvel é utilizado para inibir o crescimento de células tumorais in vivo. Técnicas semelhantes são utilizadas com biomoléculas direcionadas a RSP02, RSP03, RSP04, LGR4 e LGR6.

As células tumorais a partir de amostras de pacientes que foram passadas como um xenoenxerto em ratinhos são preparadas para injeção em animais experimentais. 0 tecido tumoral é removido sob condições estéreis, cortado em pequenos pedaços, picadas completamente utilizando lâminas estéreis, e são obtidas suspensões de célula única através de digestão enzimática e interrupção mecânica. As peças de tumor resultantes são misturadas com colagenase III ultra pura em meio de cultura (200-250 unidade de colagenase por ml) e incubadas a 37 °C durante 3-4 horas com pipetagem para cima e para baixo através de uma pipeta de 10 ml cada 15-20 min. As células digeridas são filtradas através de uma malha de nylon de 45 ul, lavadas com RPMI/FBS a 20% e lavadas duas vezes com HBSS. As células tumorais dissociadas são depois injetadas em ratinhos NOD/SCID às 6-8 semanas para desencadear o crescimento tumoral. Em determinadas formas de realização, células de tumor da mama são injetadas a 50.000 células em 100 ul na almofada adiposa mamária direita (n=10) juntamente com o implante de um pélete de estrogénio. Em determinadas formas de realização, células de tumor de cólon são injetadas a 50.000 células em 100 ul na região do flanco direito (n=10).

Em formas de realização alternativas, as células tumorais dissociadas são primeiramente classificadas em células tumorigénicas e não tumorigénicas com base nos marcadores de superfície celular anteriormente à injeção em animais experimentais. Especificamente, as células tumorais dissociadas conforme descritas acima são lavadas duas vezes com HBSS contendo soro fetal bovino (HICS) inativado por calor a 2% e ressuspendidas a 106 células por 100 ul. São adicionados anticorpos e as células incubadas durante 20 minutos sobre gelo seguido por duas lavagens com HBSS/HICS a 2%. Os anticorpos incluem anti-ESA (Biomeda, Foster City, CA) . anti-CD44, anti-CD24, e os marcadores de linhagem anti-CD2, -CD3, -CD10,-CD16, -CD18, -CD31, -CD64, e -CD140b (coletivamente referidos como Lin; PharMingen, San Jose, CA). Os anticorpos são diretamente conjugados com fluorocromos para selecionar positivamente ou negativamente células expressando estes marcadores. As células de ratinho são eliminadas através de seleção frente a células H2Kd+, e as células mortas são eliminadas utilizando o corante de viabilidade 7AAD. É levada a cabo citometria de fluxo num FACSVantage (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . São utilizados perfis de dispersão lateral e dispersão frontal para eliminar os aglomerados. Células Lin ESA+, CD44 + , CD24-/baixo, células tumorigénicas Lin- são depois injetadas subcutaneamente em ratinhos NOD/SCID para desencadear o crescimento tumoral.

Em determinadas formas de realização, é permitido aos tumores crescerem até aproximadamente 75 mm2 antes de que se inicie o tratamento. Em determinadas formas de realização, o tratamento é iniciado dois dias após as injeções de células. Em determinadas formas de realização, cada animal injetado recebe 10 mg/kg de anticorpos anti-RSPOl ou de controlo por via intraperitoneal (i.p.). Em determinadas formas de realização, cada animal injetado recebe 10 mg/kg de um anticorpo anti-LGR5 (por exemplo, 88M1) ou um anticorpo de controlo. Os animais recebem o tratamento com anticorpos duas vezes por semana durante um total de 6 a 8 semanas, e o tamanho tumoral é avaliado duas vezes por semana. Espera-se que os animais tratados com anticorpos anti-RSPOl ou anti-LGR5 apresentem um crescimento tumoral significativamente reduzido em comparação com animais de controlo injetados. Em determinadas formas de realização, cada animal injetado recebe 10 mg/kg de uma proteína LGR5 solúvel (por exemplo, LGR5-Fc) . Os animais recebem o tratamento com proteína LGR5-Fc duas vezes por semana durante um total de 6 a 8 semanas, e o tamanho tumoral é avaliado duas vezes por semana. Espera-se que os animais tratados com proteína LGR5 solúvel apresentem um crescimento tumoral significativamente reduzido em comparação com animais de controlo injetados. Exemplo 5

Tratamento de Cancros Humanos através da Interrupção da Sinalização de LGR5

Este exemplo descreve métodos para o tratamento de cancro em paciente humanos utilizando biomoléculas que interrompem a sinalização de LGR5 funcional. Em determinadas formas de realização, anticorpos contra RSPOl são utilizados para inibir o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido. Em determinadas formas de realização, anticorpos contra LGR5 são utilizados para inibir o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido. Em determinadas formas de realização, um recetor LGR5 solúvel é utilizado para inibir o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido. Técnicas semelhantes são utilizadas com biomoléculas direcionadas a RSP02, RSP03, RSP04, LGR4 e LGR6.

Em determinadas formas de realização, a presença de expressão de marcadores de células estaminais cancerosas pode ser primeiramente determinada a partir de uma biópsia tumoral. São removidas células tumorais de uma biópsia a partir de um paciente diagnosticado com cancro sob condições estéreis. Em determinadas formas de realização, a biópsia tecidual é congelada fresca em azoto liquido, incorporada em O.C.T., e cortada num criostato em secções de 10 um em lâminas de vidro. Em determinadas formas de realização, a biópsia tecidual é fixada em formalina, incorporada em parafina, e cortada num micrótomo em seções de 10 um em lâminas de vidro. As secções são incubadas com anticorpos contra um marcador de células estaminais cancerosas tal como LGR5 para detetar a expressão proteica. Em determinadas formas de realização, a presença de células estaminais cancerosas é determinada por FACS . Amostras de biópsia tecidual são cortadas em pedaços pequenos, picadas completamente utilizando lâminas estéreis, e as células são submetidas a digestão enzimática e interrupção mecânica para obter uma suspensão de célula única. As células tumorais dissociadas são depois incubadas com anticorpos anti-ESA e -CD44 e a presença de células estaminais tumorais é determinada através de citometria de fluxo.

Os pacientes com cancro cujos tumores são diagnosticados como expressando um marcador de células estaminais cancerosas são tratados com uma molécula que interrompe a sinalização de LGR5 funcional. Em determinadas formas de realização, a molécula compreende anticorpos anti-RSPOl. Em determinadas formas de realização, a molécula compreende anticorpos anti-LGR5. Anticorpos monoclonais humanizados ou humanos anti-RSPOl ou LGR5 gerados conforme descrito acima são purificados e formulados com um portador farmacêutico adequado em PBS para injeção. Em determinadas formas de realização, a molécula compreende uma proteína LGR5 solúvel. Os pacientes são tratados uma vez por semana durante pelo menos 10 semanas, mas em determinados casos uma vez por semana durante pelo menos 14 semanas. Cada administração deverá ser uma dose farmaceuticamente eficaz de cerca de 2 a cerca de 100 mg/ml e em determinados casos entre cerca de 5 e cerca de 40 mg/ml. O tratamento pode ser administrado anteriormente a, simultaneamente com, ou após regimes de radioterapia padrão ou regimes de quimioterapia utilizando um ou mais agentes quimioterapêuticos, tais como oxaliplatina, fluorouracilo, leucovorina, ou estreptozocina. Os pacientes são monitorizados para determinar se tal tratamento resultou numa resposta anti-tumoral, por exemplo, com base na regressão tumoral, redução das incidências de novos tumores, menor expressão de antigénio tumoral, diminuição dos números de células estaminais cancerígenas, ou outros meios de avaliar o prognóstico da doença.

Sequências

Aminoácidos 22-564 de ECD de LGR5 (SEQ ID NO: 1):

GSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFL EELRIAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHS LRHLWLDDNAI/TE IPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLS S LWLHLHNNRIΗΞ LGKKCFDGLH SLETEDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLP ELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKL QKIDLRHNEIYEIKTOTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTH LKLTGNHALQSLISSEWFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQD ERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGV

Sequência de ADN de RSPOl humana (SEQ ID NO:2): atgcggcttgggctgtgtgtggtggccctggttctgagctggacgcacctcaccatcagc

AG CCGGGGGATCAAGGGGAAAAGG CAGAGGCGG AT CAGTG C CGAGGGGAGCCAGGC C TGT GC CAAAGGCTGTGAGCT CTGCTCT GAAGTCAACGG CTG CCTCAAGTG CTCACCCAAG CTG TT CATC CTG CTGGAGAGGAACGACAT CCGCCAGGTGGGCGTC TGC TTGCCGTCCTG CC CA CCTGGATAC TTCGACGC CCGCAACCC CGACATGAACAAGTG CATCAAATG CAAGAT CGAG CA CTGTGAGG CCTGCTT CAGC CATAACTTCTGCAC CAAGTGTAAGGAGGG CTTGTACCTG C ACAAGGGC CGCTGCTATCCAG CTTG TCCCGAGGG CT C CT CAG CTGC CAATGGCAC CATG gagtgcagtagtcctgcgcaatgtgaaatgagcgagtggtctccgtgggggccctgctcc aagaagcagcagctctgtggtttccggaggggctccgaggagcggacacgcagggtgcta catgcccctgtgggggaccatgctgcctgctctgacaccaaggagacccggaggtgcaca

GTGAGGAGAGTGCCGTGTCCTGAGGGGCAGAAGAGGAGGAAGGGAGGCCAGGGCCGGCGG

GAGAATGCCAACAGGAACCTGGCCAGGAAGGAGAGCAAGGAGGCGGGTGCTGGCTCTCGA

AGACGCAAGGGGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAAGGGACAGTGGGGCCACTCACATCTGCA

GGGCCTGCCTAG

Sequência proteica de RSP01 humana (SEQ ID NO:3): HRLGLCWALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKL FILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYL HKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVL HAPVGDHAAC SDT KETRRCTVRRVPC PEGQKRRKGGQGRRENAMRNLARKE S KEAGAGSR RRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA

Sequência de ADN de RSP02 humana (SEQ ID NO:4): ATGCAGTTTCGCCTTTTCTCCTTTGCCCTCATCATTCTGAACTGCATGGATTACAGCCAC TGCCAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTATCAAATCCCATTTGC AAGGGT TGT T TGTCT TGTT CAAAGGA CAATGGGTGT AGCCGATGT CAACAGAAGTTGTTC TTCTTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTATGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCCCATCC GGG TAC TAT GGACACCGAGCC C CAGAT ATGAACAGATGTG CAAGATG CAGAATAGAAAAC TGTGATTCTTGCTTTAGCAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAAAGTAGGCTTTTATTTGCAT AGAGGCCGTTGCTTTGATGAATGTCCAGATGGTTTTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAA TGTGTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCATTGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAAATAAT CGCACATG TGGATTT AAATGGGGT CTGGAAACCAGAACACGG CAAATTGTTAAAAAGCCA GTGAAAGACACAATACCGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAGGAGATGCAAGATGACAATG AGGCATTGTCCAGGAGGGAAGAGAACACCAAAGGCGAAGGAGAAGAGGAACAAGAAAAAG AAAAGGAAGCTGATAGAAAGGGCCCAGGAGCAACACAGCGTCTTCCTAGCTACAGACAGA GCTAACCAATAA

Sequência proteica de RSP02 humana (SEQ ID NO:5): MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLF FFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLH RGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKP VKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDR ANO

Sequência de ADN de RSP03 humana (SEQ ID NO:6): atgcacttgcgactgatttcttggctttttatcattttgaactttatggaatacatcggc agccaaaacgcctcccggggaaggcgccagcgaagaatgcatcctaacgttagtcaaggc tgccaaggaggctgtgcaacatgctcagattacaatggatgtttgtcatgtaagcccaga ctattttttgctctggaaagaattggcatgaagcagattggagtatgtctctcttcatgt ccaagtggatattatggaactcgatatccagatataaataagtgtacaaaatgcaaagct gactgtgatacctgtttcaacaaaaatttctgcacaaaatgtaaaagtggattttactta CAC C T tggaaagtg c c tt gacaat tg c c cagaagggttggaagc caacaaccatac tatg gagtgtgtcagtattgtgcactgtgaggtcagtgaatggaatccttggagtccatgcacg aagaagggaaaaacatgtggcttcaaaagagggactgaaacacgggtccgagaaataata cagcatccttcagcaaagggtaacctgtgtcccccaacaaatgagacaagaaagtgtaca gtgcaaaggaagaagtgtcagaagggagaacgaggaaaaaaaggaagggagaggaaaaga aaaaaacctaataaaggagaaagtaaagaagcaatacctgacagcaaaagtctggaatcc agcaaagaaatcccagagcaacgagaaaacaaacagcagcagaagaagcgaaaagtccaa gataaacagaaatcggtatcagtcagcactgtacactag

Sequência proteica de RSP03 humana (SEQ ID NO: 7):

MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPR LFFALERIGMKQIGVCLS SCPSGYYGTRY PDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYL HLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREII QHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLES SKEIPEQRE NKQQQ KKR KVQD KQKSV SV S TVH

Sequência de ADN de RSPQ4 humana (SEQ ID NO:8):

ATGCGGGCGCCACTCTGCCTGCTCCTGCTCGTCGCCCACGCCGTGGACATGCTCGCCCTG AACCGAAGGAAGAAGCAAGTGGGCACTGGCCTGGGGGGCAACTGCACAGGCTGTATCATC TGCTCAGAGGAGAACGGCTGTTCCACCTGCCAGCAGAGGCTCTTCCTGTTCATCCGCCGG GAAGGCATCCGCCAGTACGGCAAGTGCCTGCACGACTGTCCCCCTGGGTACTTCGGCATC CGCGGCCAGGAGGTCAACAGGTGCAAAAAATGTGGGGCCACTTGTGAGAGCTGCTTCAGC CAGGACTTCTGCATCCGGTGCAAGAGGCAGTTTTACTTGTACAAGGGGAAGTGTCTGCCC ACCTGCCCGCCGGGCACTTTGGCCCACCAGAACACACGGGAGTGCCAGGGGGAGTGTGAA CTGGG TCCCTGGGGCGGCTGGAGC CCC TGCACACACAATGGAAAGACCTGCGGCT CGGCT TGGGGCCTGGAGAGCCGGGTACGAGAGGCTGGCCGGGCTGGGCATGAGGAGGCAGCCACC TGCCAGGTGCTTTCTGAGTCAAGGAAATGTCCCATCCAGAGGCCCTGCCCAGGAGAGAGG AGCCCCGGCCAGAAGAAGGGCAGGAAGGACCGGCGCCCACGCAAGGACAGGAAGCTGGAC CGCAGGCTGGACGTGAGGCCGCGCCAGCCCGGCCTGCAGCCCTGA

Sequência proteica de RSP04 humana (SEQ ID NO:9): MRAPLCLLLLVAHAVEMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCI1CSEENGCSTCQQRLFLFIRR EGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLP TCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAAT CQVLS ES R KC PIORPCPGERS PGQKKGR KDRR PRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQP

Sequência proteica de LGR4 humana (NM_18490; SEQ ID NO:10) :

MPGPLGLLCFLALGLLGSAGPSGAAPPLCAAPCSCDGDRRVDCS GKGLTAVPEGLSAFTQALDISMNNITQLPEDAFKNFPFLEELQLAGNDLSFIHPKALS GLKELKVLTLQNNQLKTVPS EAIRGLSALQS LRLDANHITSVPEDS FEGLVQLRHLWL DDNSLTEVPVHPLSNLPTLQALTLALNKI SSIPDFAFTNLSSLVVLHLHNNKIRSLSQ HCFDGLDMLETLDLHYMNLGEFPQAIKALPS LKELGFHSNSISVIPDGAFDGNPLLRT IHLYDN PLS FVGNSAFHNLSDLHS LVIRGASMVQQFPNLTGTVHLESLTLTGTKISSI PNNLCQEQKMLRTLDLSYNNIRDLPSFNGCHALEE IS LQRNQIYQIKEGTFQGLI SLR ILDLSRNLI HE IHSRAFATLGPITNLDVS FNELTS FPTEGLNGLNQLKLVGNFKLKEA LAAKDFVNLRSLSVPYAYQCCAFWGCDSYANLNTEDNSLQDHSVAQEKGTADAANVTS TLENEEHSQIIIHCTPSTGAFKPCEYLLGSWMIRLTVWFIFLVALFFNLLVILTTFAS CTSLPSSKLFIGLISVSNLFMGIYTGILTFLDAVSWGRFAEFGIWWETGSGCKVAGFL AVFS S ESAIFLLMLATVERS LSAKDIMKNGKSNHLKQFRVAALLAFLGATVAGC FPLF HRGEYSASPLCLPFPTGETPSLGFTVTLVLLNSLAFLLMAVIYTKLYCNLEKEDLSEN SQSSMIKHVAWLIFTNCIFFCPVAFFSFAPLITAISISPEIMKSVTLIFFPLPACLNP VLYVFFNPKFKEDWKLLKRRVTKKSGSVSVSISSQGGCLEQDFYYDCGMYSHLQGNLT VCDCCESFLLTKPVSCKHLIKSHSC PALAVASCQRPEGYWSDCGTQSAHSDYADEEDS FVSDS SDQVQACGRACFYQSRGFPLVRYAYNLPRVKD

Sequência proteica de LGR6 humana (BC047905; SEQ ID NO :11) :

MGRPRLTLVCQVS III S ARDLSMNNLTE LQ PGLFHH LRFLEELR

LSGNHLSHI PGQAFSGL·YSLKIIiML·QNNQLGGI PAEALWELPSLQSLRLDANLI SLVP

ERSFEGLSS LRH LWLD DNALTEIPVRALNNL PALQAMT LALNRIS ΗIPDYAFQNLTS L

WLHLHNNRIQHLGTHSFEGLHNLETLDLNYNKLQEFPVAIRTLGRLQELGFHNNNIK

AIPEKAFMGNPLLQTIHFYDNPIQFVGRSAFQYLPKLHTLSLNGAMDIQEFPDLKGTT

SLEILTLTRAGIRLLPSGMCQQLPRLRVLEI.SHNQIEELPSLHRCQKLEEIGLQHNRI

WEIGADTFSQLSSLQALDLSWNAIRSIHPEAFSTLHS LVKLDLTDNQLTTL PLAGLGG

LMHLKLKGNLALSQAFSKDSFPKLRILEVPYAYQCCPYGMCASFFKASGQWEAEDLHL

DDEE S S KR PLGLLARQAENHYDQDLDE LQLEMEDS KPH PSVQCS PTPGPFKPCEYLFE SWGIRLAVWAIVLLSVLCNGLVLLTVFAGGPVPLPPVKFWGAIAGANTLTGISCGLL ASVDALTFGQFSEYGARWETGLGCRATGFLAVLGSEASVL.LLTLAAVQCSVSVSCVRA YGKSPSLGSVRAGVLGCLALAGLAAALPLASVGEYGASPLCLPYAPPEGQPAALGFTV ALVMMNSFCFLWAGAYIKLYCDLPRGDFEAVWDCAMVRHVAWLIFADGLLYCPVAFL SFASMLGLFPVTPEAVKSVLLWLPLPACLNPLLYLLFNPHFRDDLRRLRPRAGDSGP LAYAAAGELEKSSCDSTQALVAFSDVDLILEASEAGRPPGLETYGFPSVTLISCQQPG APRLEGSHCVEPEGNHFGNPQPSMDGELLLRAEGSTPAGGGLSGGGGFQPSGLAFASH V

Sequência de ADN de LGR5 humana (SEQ ID NO: 12):

ATGGACACCT C CCGGCTCGGTGTG CTCCTGT C CTTG C CTGTGC TGCTGCAG CTGGCGAC C

GGGGGCAGCTCTCCCAGGTCTGGTGTGTTGCTGAGGGGCTGCCCCACACACTGTCATTGC GAGCC CGACGGCAGGATGT TGCT CAGGGTGGACTGCT CCGACCTGGGGC T CTCGGAGCTG CCTTCCAACCT CAGCGTCTT CAC CTCCT ACCTAGAC CTCAGTATGAACAACATC AGTCAG CTGCT CC CGAATC CCCTG CC CAGTCTC CGCTTCCTGGAGGAGT TACGTCTTGCGGG AAAC GCTCTGACATACATTCCCAAGGGAGCATTCACTGGCCTTTACAGTCTTAAAGTTCTTATG CTGCAGAATAATCAGCTAAGACACGTACCCACAGAAGCTCTGCAGAATTTGCGAAGCCTT CAATCCCTGCGTCTGGATGCTAACCACATCAGCTATGTGCCCCCAAGCTGTTTCAGTGGC CTGCATTCCCTGAGGCACCTGTGGCTGGATGACAATGCGTTAACAGAAATCCCCGTCCAG GCTTTTAGAAGTTTATCGGCATTGCAAGCCATGACCTTGGCCCTGAACAAAATACACCAC ATACCAGACTATGCCTTTGGAAACCTCTCCAGCTTGGTAGTTCTACATCTCCATAACAAT AGAATC CACTC CCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGG CTCCACAGCCTAGAGAC TTTAGAT TTAAATTACAATAACCTTGATGAATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAA GAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTCGATACCTGAGAAAGCATTTGTAGGCAAC ccttctcttattacaatacatttctatgacaatcccatccaatttgttgggagatctgct

TTT CAACATTTACCTGAACTAAGAACACTG ACTCTGAATGGTGC CT CAC AAATAACTGAA TTTCCTGATTTAACTGGAACTGCAAACCTGGAGAGTCTGACTTTAACTGGAGCACAGATC TCATCTCTTCCTCAAACCGTCTGCAATCAGTTACCTAATCTCCAAGTGCTAGATCTGTCT TACAACCTATTAGAAGATTTACCCAGTTTTTCAGTCTGCCAAAAGCTTCAGAAAATTGAC CTAAGACATAATGAAATCTACGAAATTAAAGTTGACACTTTCCAGCAGTTGCTTAGCCTC CGATCGCTGAATTTGGCTTGGAACAAAATTGCTATTATTCACCCCAATGCATTTTCCACT TTGCCATCCCTAATAAAGCTGGACCTATCGTCCAACCTCCTGTCGTCTTTTCCTATAACT GGGTTACATGGT TTAACTCACTTAAAATTAACAGGAAATCATG CCTTACAGAG CTTGATA TGATCTGAAAACTTTCCAGAACTCAAGGTTATAGAAATG CCTTATG CTTACCAGTGCTGT GCATTTGGAGTGTGTGAGAATGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAAC

AGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAGATGCTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGT GACCTTGAAGATTTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAAAGCCCTTCATTCAGTGCAG TGTTCACCTTCCCCAGGCCCCTTCAAACCCTGTGAACACCTGCTTGATGGCTGGCTGATC AGAATTGGAGTGTGGACCATAGCAGTTCTGGCACTTAÇTTGTAATGCTTTGGTGACTTCA ACAGTTTTCAGATCCCCTCTGTACATTTCCCCCATTAAACTGTTAATTGGGGTCATCGCA GCAGTGAACATGCTCACGGGAGTCTCCAGTGCCGTGCTGGCTGGTGTGGATGCGTTCACT TTTGGCAGCTTTGCACGACATGGTGCCTGGTGGGAGAATGGGGTTGGTTGCCATGTCATT GGTTTTTTGTCCATTTTTGCTTCAGAATCATCTGTTTTCCTGCTTACTCTGGCAGCCCTG GAGCGTGGGTTCTCTGTGAAATATTCTGCAAAATTTGAAACGAAAGCTCCATTTTCTAGC CTGAAAGTAATCATTTTGCTCTGTGCCCTGCTGGCCTTGACCATGGCCGCAGTTCCCCTG CTGGGTGGCAGCAAGTATGGCGCCTCCCCTCTCTGCCTGCCTTTGCCTTTTGGGGAGCCC AGCACCATGGGCTACATGGTCGCTCTCATCTTGCTCAATTCCCTTTGCTTCCTCATGATG ACCATTGC CTAC ACCAAGCT CTACTGCAATTTGGACAAGGGAGACCTGGAGAATATTTGG GACTGCTCTATGGTAAAACACATTGCCCTGTTGCTCTTCACCAACTGCATCCTAAACTGC CCTGTGGCTTTCTTGTCCTTCTCCTCTTTAATAAACCTTACATTTATCAGTCCTGAAGTA ATTAAGTTTATCCTTCTGGTGGTAGTCCCACTTCCTGCATGTCTCAATCCCCTTCTCTAC ATCTTGTTCAATCCTCACTTTAAGGAGGATCTGGTGAGCCTGAGAAAGCAAACCTACGTC TGGACAAGATCAAAACACCCAAGCTTGATGTCAATTAACTCTGATGATGTCGAAAAACAG TCCTGTGACTCAACTCAAGCCTTGGTAACCTTTACCAGCTCCAGCATCACTTATGACCTG CCTCCCAGTTCCGTGCCATCACCAGOTTATCCAGTGACTGAGAGCTGCCATCTTTCCTCT GTGGCATTTGTCCCATGTCTCTAA

Sequência proteica de LGR5 humana (SEQ ID NO:13):

MDTSRLGVLLSLPVLLQLATGGSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSEL

PS ML S VFT S YLDLSMNNISQLL PN PLPSLRFLE ELRLAGNALTY Ϊ PKGAFTGL Y S LKVLM LQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWIjDDNALTEIPVQ AFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLWLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHS LETLD LNYWNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSA FQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLS YNLLEDL PS FSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFST LPSLIKLDLS SNLLSS FPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLIS SENFPELKVIEM PYAYQCC AFGVC ENAYKISNQWNKGDNSSMDDLH KKDAGM FQAQDERD LEDFLLDFEEDL KALH S VQ CS PS PGP FKPCEHLLDGWLIRIGVWTIAVLALTCNALVTSTVFRSPLYIS PI KLLIGVIA AVWMLTGVSSAVLAGVDAFTFGSFARHGAWWENGVGCHVIGFLSI FASES SVFLLTLAAL E RGFSVKY S AKFETKAP F S S LKVIILLCALLALTMAAVPLLGGS KYGAS PLCL PL PFGE P STMGYMVALILLNSLCFLMHTIAYTKLYCNLDKGDLENX WDCSMVKHIALLLFTNCILNC

PVAFLS PS SLINLTFISPEVIKFILLWVPL PACLNPLLYILFNPHFKEDLVSLRKQTYV WTRSKHPSLMSINSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSSITYDLPPSSVPSPAYPVTESCHLSS VAFVPCL

Sequência de ADN de LGR5-Fc (SEQ ID N0:14): ATGGACACCTCCCGGCTCGGTGTGCTCCTGTCCTTGCCTGTGCTGCTGCAGCTGGCGACC

GGGGGCAGCTCTCCCAGGTCTGGTGTGTTGCTGAGGGGCTGCCCCACACACTGTCATTGC GAG C C CGACGGCAGGATGTTGC TCAGGGTGGACTGC T CCGACCTGGGGCTCTCGGAGC TG C CTT C CAACCTCAG CGT CTTC AC CTCCTAC CTAGAC CTCAGTATGAACAAC ATCAGTCAG CTGCTCCCGAATCCCCTGCCCAGTCTCCGCTTCCTGGAGGAGTTACGTCTTGCGGGAAAC G CTCTGACAT ACATTC C CAAGGGAGCATTCACTGGC CTTTAC AGTCTTAAAGTT CTTATG CTGCAGAATAATCAGCTAAGACACGTACCCACAGAAGCTCTGCAGAATTTGCGAAGCCTT caatccctgcgtctggatgctaaccacatcagctatgtgcccccaagctgtttcagtggc

CTGCATTCCCTGAGGCACCTGTGGCTGGATGACAATGCGTTAACAGAAATCCCCGTCCAG GCTTTTAGAAGTTTATCGGCATTGCAAGCCATGACCTTGGCCCTGAACAAAATACACCAC ATACCAGACTATGCCTTTGGAAACCTCTCCAGCTTGGTAGTTCTACATCTCCATAACAAT AGAATCCACTCCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGCTCCACAGCCTAGAGACTTTAGAT TTAAAT TACAATAAC CTTGATGAATTCCCCACTGCAATT AGGACACT C TC CAAC CTTAAA GAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTCGATACCTGAGAAAGCATTTGTAGGCAAC C CTTC T CTTATTACAATACATTT CTATGACAATCCCATC CAATTTGTTGGGAGATCTG C T TTTCAACATTTACCTGAACTAAGAACACTGACTCTGAATGGTGCCTCACAAATAACTGAA TTTCCTGATTTAACTGGAACTGCAAACCTGGAGAGTCTGACTTTAACTGGAGCACAGATC TCATCTCTTCCTCAAACCGTCTGCAATCAGTTACCTAATCTCCAAGTGCTAGATCTGTCT TACAACCTATTAGAAGATTTACCCAGTTTTTCAGTCTGCCAAAAGCTTCAGAAAATTGAC ctaagacataatgaaatctacgaaattaaagttgacactttccagcagttgcttagcctc cgatcg CTGAATTTGGCTTGGAACAAAATTGCTATTATTCACCC caatgcattttcc act ttgccatccctaataaagctggacctatcgtccaacctcctgtcgtcttttcctataact gggt tacatggtttaactcacttaaaattaacaggaaat catgccttacagagcttgata TCATCTGAAAACT TTCCAGAACT CAAGGTTATAGAAATGCCTTATGCTTACCAGTGCTGT gcatttggagtgtgtgagaatgc c tataagatttctaat caatggaataaaggtgacaac agcagtatggacgaccttcataagaaagatgctggaatgtttcaggctcaagatgaacgt

GACCTTGAAGATTTCCTGCTTGAC TTTGAGGAAGACCTGAAAG C C CTTCATTCAGTGCAG TGTTCACCTTCCCCAGGCCCCTTCAAACCCTGTGAACACCTGCTTGATGGCTGGCTGATC AGAATTGGAGTGGGG CGCG CCGACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCA CCTGAA CTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC

AAGTT CAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGC C AAGAC AAAG C CGCGGGAG GAG CAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTC AG CGTCC TCAC CGT C CTG CAC CAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAG TACAAGTGCAAGGTCT C CAACAAAG C CC T C C CAGCC C C CAT CGAG AAAAC CATCT C CAAAG C CAAAGGG CAG C CC C GAGAAC CACAGGTGTACACC C TGC C C CCA TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC AAGAG CAGGTGG CAG CAG GG GAACGTCT TCT CAT GCT C CGTG AT G CATG AGGC TC TGC AC AACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGT CTCCGGGTAAATGA

Sequência proteica de LGR5-Fc (SEQ ID NO: 15):

MDTS RLGVLLS L PVLLQLATGGSS PRSGVLLRGC PTHCHCE PDGRMLLRVDCSDLGLS EL PSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLM LQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVP PS C FSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQ AFRS LS ALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLS SLWLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHS LETLD LNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSA FQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLS YNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFST LPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCC AFGVCENAYKISNQWNKGDNS SMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQ CSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGVGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK

Sequência de ADN de RSPOl-Fc (SEQ ID NO:16):

ATG CGGCTTGGG CTGTGTGTGG TGGCC C TGGTTCTGAGCTGGACG CACCTCAC CATCAGC AG C CGGGGGATCAAGGGGAAAAGG CAGAGG CGGATCAGTGC CGAGGGGAGCCAGG CCTGT GCCAAAGGCTGTGAGCTCTGCTCTGAAGTCAACGGCTGCCTCAAGTGCTCACCCAAGCTG TTCATCCTGC TGGAGAGGAACGACATC CGC CAGGTGGG CGT C TG CTTGCCGTCCTGC CCA CCTGGATACTTCGACGCCCGCAACCCCGACATCAACAAGTGCATCAAATGCAAGATCGAG CACTGTGAGG CCTGCTT CAGC CATAAC TT CTGCACCAAGTGT AAGGAGGGCTTGT AC CTG CACAAGGG CCG CTGCTAT C CAG CTTGT C C CGAGGGCTC CTC AGCTG C CAATGG C ACCATG GAGTGCAGTAGTCCTGCGCAATGTGAAATGAGCGAGTGGTCTCCGTGGGGGCCCTGCTCC AAGAAGC AGCAG CTC TGTGGTTT C CGG AGGGGCT CCG AGG AGCGGAC ACGCAGGGTGCTA

CATGCCCCTGTGGGGGACCATGCTGCCTGCTCTGACACCAAGGAGACCCGGAGGTGCACA gtgaggagagtgccgtgtcctgaggggcagaagaggaggaagggaggccagggccggcgg

GAGAATGCCAACAGGAACCTGGCCAGGAAGGAGAGCAAGGAGGCGGGTGCTGGCTCTCGA AGACGCAAGGGGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAAGGGACAGTGGGGCCACTCACATCTGCA GGGCCTGCCGGGCGCGCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGT ACCGTGTGGTCAG CGT COT CACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA ÂCCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCC CGTG CTGGACTCCGACGG CTCCTT CTT COT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACACAGAAGAGCCT CTCC CTGT CT C CGGGTAAATGA

Sequência proteica de RSP01-Fc (SEQ ID NO: 17): MRLGLCWALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRIS AEGS QACAKGCE LC Ξ EVNGC LKC S P KL FI LLERNDIRQVGVCLPS C PPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYL HKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVL HAPV GDHAAC S DT KETRR C TVRRV PC P EGQ KRR KGGQGRRENANRNLARKE S KEAGAG S R RRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPAGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTIiMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWE SNGQP ENNYKTTP PVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK

Sequência de ADN de RSP02-FC (SEQ ID NO: 18): ATGCAGTTTCGCCTTTTCTCCTTTGCCCTCATCATTCTGAACTGCATGGATTACAGCCAC TGCCAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTATCAAATCCCATTTGC AAGGGTTGTTTGTCTTGTTCAAAGGACAATGGGTGTAGCCGATGTCAACAGAAGTTGTTC TTCTTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTATGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCCCATCC GGGTACTATGGACACCGAGCCCCAGATATGAACAGATGTGCAAGATGCAGAATAGAAAAC TGTGATTCTTGCTTTAGCAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAAAGTAGGCTTTTATTTGCAT AGAGGCCGTTGCTTTGATGAATGTCCAGATGGTTTTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAA

TGTGTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCATTGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAAATAAT CGCACATGTGGATTTAAATGGGGTCTGGAAACCAGAACACGGCAAATTGTTAAAAAGCCA GTGAAAGACACAATACTGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAGGAGATGCAAGATGACAATG AGGCATTGTCCAGGAGGGAAGAGAACACCAAAGGCGAAGGAGAAGAGGAACAAGAAAAAG AAAAGGAAGCTGATAGAAAGGGCCCAGGAGCAACACAGCGTCTTCCTAGCTACAGACAGA GCTAACCAAGGG CGCG CCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTG CCCAGCAC CTGAACT C CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG

ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggag CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTT C CTCTAC AGCAAGCTCACCGTGGACAAG AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

Sequência proteica de RSP02-FC (SEQ ID NO: 19): MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLF F FLRREGMRQY GECLHSCPS G Y Y GHRAPDMNRCARCRIENCDSCFS KD FCTKC KVG F YLH RGRC FDE C FDGFAPLE E TMECVEGC E VGHW SE WGTC S RNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKP VKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDR ANQGRADKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYMST YRWS VLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAP IEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEMNYKTT P P VLDS DGS FFLYS KLTVD KSRWQQGKV FS C S VMH EALHNHYTQKSLS LS PGK

Sequência de ADN de RSP03-Fc (SEQ ID NO:20): ATGCACTTGCGACTGATTTCTTGGCTTTTTATCATTTTGAACTTTATGGAATACATCGGC AGCCAAAACGCCTCCCGGGGAAGGCGCCAGCGAAGAATGCATCCTAACGTTAGTCAAGGC TGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGA C TATTTTTTG CT CTGGAAAGAAT TGGC ATG AAGC AGATTGGAGTAT GTCTCTCTTCATGT CCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCT GACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTA CACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATG

GAGT GTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGT CAGTGAATGGAAT C CTTGG AGT CCATGCAC G AAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATA CAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACA GTG C AAAGG AAGAAGT GTCAGAAGG GAG AACGAGG AAAAAAAGGAAGGGAG AGG AAAAGA AAAAAAC CTAAT AAAGG AG AAAGT AAAGAAG C AAT AC CT GAC AG CAAAAGT CTGGAAT C C AGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAA GATAAACAGAAATCGGTAT CAGTCAG CACT GTACACGGGCGCG C CGACAAAAC T CACAC A TOCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCA AAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC GTGAGCCACGAAGAC C CTGAGGTCAAGTT CAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTG CAT AATG C CAAGACAAAG C CG C GGGAGGAGCAGT AC AACAG CACGTAC CGTGTGGT CAG CGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG CAGCCGGAGAACAACTACAAGAC CACG CCTC C CGTGC TGGAC T C CGACGGCT CCTTCTTC CT CTA CAGCAAG C TCACCG TGGA CAAG AG CAGGTGGC AG C AGGGGAACGTCTT C TCATG C TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG GGTAAATGA

Sequência proteica de RSP03-Fc (SEQ ID N0:21):

MHLRLISWLF11LNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPR LFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYL HLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWS PCTKKGKTCGFKRGTETRVRE11 QHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLES SKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVHGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS V LTVLHQDWLHGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVS L TCLVKGFY PSD IAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDS DGS F FLYS KLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Sequência de ADN de RSP04-FC (SEQ ID NO:22): ATGCGGGCGCCACTCTGCCTGCTCCTGCTCGTCGCCCACGCCGTGGACATGCTCGCCCTG AACCGAAGGAAGAAGCAAGTGGGCACTGGCCTGGGGGGCAACTGCACAGGCTGTATCATC TGCTCAGAGGAGAACGGCTGTTCCACCTGCCAGCAGAGGCTCTTCCTGTTCATCCGCCGG GAAGGCATCCGCCAGTACGGCAAGTGCCTGCACGACTGTCCCCCTGGGTACTTCGGCATC

CG CGGCCAGGAGGTCAACAGGTGCAAAAAATGTGGGGCC ACTTGTGAGAGCTG CTT CAG C CAGGACTTCTGCATCCGGTGCAAGAGGCAGTTTTACTTGTACAAGGGGAAGTGTCTGCCC ACCTGCCCGCCGGGCACTTTGGCCCACCAGAACACACGGGAGTGCCAGGGGGAGTGTGAA CTGGGT C CCTGGGG CGGCTGGAGCCCCTG CACACACAATGGAAAGACCTGCGG CTCGGCT TGGGG C CTGGAGAG C CGGGTACG AGAGGC TGGCCGGG CTGGGC ATG AGGAGG C AGC C AC C TG CC AGGTGCTTT CTG AGT CAAGGAAATG T C CCATC C AGAGGC CCTGCC CAGGAG AGAGG AG CC CCGGCCAG AAGAAGGG CAGG AAGG AC CG GCGC C CACG CAAGGACAGG AAG CTGGAC CG CAGG CTGGACGTG AGGC CG CGC CAGCCCGGCCTG C AGCCCGGG CGCG CCGACAAAA CT CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC T C CCGGACCCCTGAGGT CACATGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTC C T CACCGTC CTGC ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTC TC CAACAAAG CCC TC C CAGCCCCCAT CGAGAAAACCATCT CCAAAGCCAAAGGGCAGC CC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTG C C C CCAT CCCGGGATGiAG CTGAC CAAGAAC CAGGTC AGC CTGAC CTGCCTGGT CAAAGGCTT CTATC CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTG CACAAC CACTACACACAGAAGAGCCT C TCC CTG TCTCCGGGTAAATGA

Sequência de ADN de RSP04-FC (SEQ ID NO:23): MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRR EG IRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVKRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLP TCP PGTLAH QNTRE CQGE C E LG PWGGW S P CTHNG KT CGS AWG L E S RVR EAGRAGHE EAAT CQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQPGRADKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQ YNSTYR WS VLTVLHQDWLKGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS F FLY S KLTVDKS R WQQGNV F S C S VMHEALHNH YTQ KSLSLSPGK

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 0212447 A [0032] • US 0239191 W [0032] • US 5225539 A, Winter [0042] • US 6004528 A [0059] • US 5962233 A [0119] • US 5538848 A [0119] • US 5639606 A [0120] • US 5643765 A [0120] • US 5876978 A [0120] • US 5885530 A [0124] • US 4981785 A [0124] • US 6159750 A [0124] • US 5358691 A [0124] • US 5599677 A [0125] • US 567248 A [0125] • US 5807522 A [0129] • US 6198107 B [0139] • US 4323546 A, Crockford [0143] • WO 08042236 A [0169] • US 20070117751 A [0169] • US 20080131434 A [0169] • US 4816567 A [0176] • US 5750373 A [0180] • US 5545807 A [0180] • US 5545806 A [0180] • US 5569825 A [0180] • US 5625126 A [0180] • US 5633425 A [0180] • US 5661016 A [0180] • US 5731168 A [0181] • US 5641870 A [0182] • US 6180370 B [0187] • US 5585089 A [0187] • US 6054297 A [0187] • US 5565332 A [0187] • US 5223409 A [0201] • US 5631169 A, Lakowicz [0208] • US 4968103 A, Stavrianopoulos [0208] • US 4109496 A [0219] • US 5283317 A [0219] • WO 9410300 A, Brent [0219] • US 5705188 A [0233] • WO 9730731 A [0233] • US 4873191 A [0254] • US 6080912 A [0255] • WO 9008832 A [0256] • US 5614396 A [0258] • US 591019 A [0260] • US 864207 A [0260] • US 11050282 A [0260]

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Lisboa, 10 de Novembro de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente a uma proteína R-espondina (RSPO) humana e que inibe o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido, em que o anticorpo, interrompe a ligação da proteína RSPO a uma proteína de recetor acoplado a proteína G contendo repetições ricas em leucina (LGR), em que a proteína LGR é LGR5; e/ou interrompe a ativação da sinalização de LGR5 por RSPO.
2. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína RSPO é RSPO-1, RSPO-2 ou RSPO-3.
3. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 2, em que a proteína RSPO é RSPO-1,
4. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína RSPO é RSPO-4.
5. Um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente a um domínio extracelular de uma proteína de recetor acoplado a proteína G contendo repetições ricas em leucina (LGR) , em que a proteína LGR é LGR5, e inibe o crescimento de um tumor sólido que compreende células estaminais de tumor sólido, em que o anticorpo interrompe a ligação de RSPO a LGR5; e/ou interrompe a ativação da sinalização de LGR5 por RSPO.
6. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 5, em que o domínio extracelular compreende os aminoácidos 22-564 de LGR5 humana (SEQ ID NO: 1).
7. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 5, em que o 1 anticorpo é (a) o anticorpo monoclonal 88M1 produzido por uma linha celular de hibridoma tendo o número de depósito na ATCC PTA-9342; ou (b) um anticorpo isolado que compreende as CDRs de cadeia pesada e/ou as CDRs de cadeia leve de um anticorpo monoclonal 88M1 produzido por uma linha celular de hibridoma tendo o número de depósito na ATCC PTA-9342; ou (c) um anticorpo isolado que compete com um anticorpo monoclonal 88M1 produzido por uma célula de hibridoma tendo o número de depósito na ATCC PTA-9342 num ensaio de ligação competitiva.
8. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano, um anticorpo biespecifico ou um fragmento de anticorpo.
9. Uma linha celular que produz o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. Uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um portador farmaceuticamente aceitável.
11. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, que compreende adicionalmente um segundo agente anti-cancro.
12. Um recetor solúvel que compreende um domínio extracelular de uma proteína LGR5 humana para utilização num método de tratamento de cancro que compreende células estaminais de cancro.
13. O recetor solúvel da reivindicação 12, em que o domínio extracelular compreende os aminoácidos 22-564 de LGR5 humana 2 (SEQ ID NO: 1).
14. O recetor solúvel da reivindicação 13, que compreende adicionalmente uma sequência de proteína não LGR.
15. 0 recetor solúvel da reivindicação 14, em que a sequência da proteína não LGR compreende Fc humana.
16. Um agente para utilização no tratamento de cancro que compreende células estaminais cancerosas num ser humano ou inibição do crescimento de um tumor num ser humano, o método que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que (a) interrompe a ligação de uma proteína R-espondina (RSPO) humana e um recetor acoplado a proteína G contendo repetições ricas em leucina (LGR), em que a proteína LGR é LGR5; e/ou (b) interrompe a ativação da sinalização de LGR5 por RSPO, em que o agente é um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou um recetor solúvel de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15.
17. 0 agente para utilização de acordo com a reivindicação 16 que é o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
18. 0 agente para utilização de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, em que o ser humano compreende um tumor que compreende células estaminais cancerosas ou ao qual foi removido um tumor compreendendo células estaminais cancerosas .
19. 0 agente para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, em que o método de tratamento de um cancro e/ou de inibição do crescimento de um tumor compreende adicionalmente administrar uma quantidade eficaz de um segundo agente anti-cancro. 3 4