JP6967853B2

JP6967853B2 - ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に結合する抗体

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Publication number: JP6967853B2
Application number: JP2016554189A
Authority: JP
Inventors: セシリアアンナウィルヘルミナフーイエン，; クライフ，コルネリスアドリアーンデ; マルクトロスビー，; トンロフテンベルフ，; アレクサンデルベルトルドヘンドリクバッケル，
Original assignee: メルスナムローゼフェンノートシャップ
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2015-02-27
Publication date: 2021-11-17
Anticipated expiration: 2035-02-27
Also published as: SI3805268T1; KR102849905B1; WO2015130173A1; LT3805268T; US20170037145A1; RS66392B1; EP3110849A1; JP2020097590A; US20230242669A1; AU2015223567A1; MX383829B; EP3805268B1; SI3110849T1; JP2017507944A; ES2833599T3; EP3110849B1; US12139548B2; US20240158531A1; SMT202500020T1; MX2016011155A

Description

本発明は、抗体の分野に関する。詳細には、本発明は、異常な細胞を伴う疾患の処置のための治療的（ヒト）抗体の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に結合する抗体、ならびにＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞、特に腫瘍細胞との結合におけるそれらの使用に関する。

ヒト上皮増殖因子受容体ファミリー（ＨＥＲ、集合的に、ＥｒｂＢシグナル伝達ネットワークとも呼ばれる）は、膜貫通受容体チロシン・キナーゼ（ＲＴＫ）のファミリーである。このファミリーは、ＥｒｂＢ−１（またはＨＥＲｌ）としても公知の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ならびに相同受容体ＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ−３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ−４（ＨＥＲ４）を含む。これらの受容体（ＹａｒｄｅｎおよびＰｉｎｅｓ、２０１２において概説される）は、上皮細胞上で広く発現される。ＨＥＲ受容体またはそれらのリガンド、例えばヘレグリン（ＨＲＧ）もしくは上皮増殖因子（ＥＧＦ）の上方調節は、ヒト癌において頻繁な事象である（Ｗｉｌｓｏｎ、Ｆｒｉｄｌｙａｎｄら、２０１２）。特に、ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２の過剰発現は、上皮腫瘍において生じ、腫瘍浸潤、転移、化学療法に対する耐性、および予後不良と関連する（Ｚｈａｎｇ、Ｂｅｒｅｚｏｖら、２００７）。正常乳房では、ＥｒｂＢ−３は、管腔上皮の成長および分化において重要であることが示されている。例えば、ＥｒｂＢ−３の欠失／阻害は、管腔上皮よりも基底側の選択的増大を生じる（Ｂａｌｋｏ、Ｍｉｌｌｅｒら、２０１２）。ＲＴＫの細胞外ドメインへのリガンドの結合は、同じ（ホモ二量体化）受容体サブタイプ間および異なる（ヘテロ二量体化）受容体サブタイプ間の両方で、受容体二量体化を誘導する。二量体化は、自己リン酸化を受ける細胞内チロシン・キナーゼ・ドメインを活性化でき、次に、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）および生存促進性経路Ａｋｔによって媒介されるものを含むいくつもの下流の増殖促進性シグナル伝達経路を活性化できる（ＹａｒｄｅｎおよびＰｉｎｅｓ、２０１２に概説される）。特異的内因性リガンドは、ＥｒｂＢ−２については同定されておらず、従って、これは通常、ヘテロ二量体化を介してシグナル伝達すると仮定される（Ｓｅｒｇｉｎａ、Ｒａｕｓｃｈら、２００７）。ＥｒｂＢ−３は、そのリガンドの会合によって活性化され得る。これらのリガンドには、ニューレグリン（ＮＲＧ）およびヘレグリン（ＨＲＧ）が含まれるがこれらに限定されない。

ＥｒｂＢ受容体ファミリーのシグナル伝達の活性化の種々の様式が同定されている。これらには、シグナル伝達のリガンド依存的およびリガンド非依存的な活性化がある。過剰発現されたＥｒｂＢ−２は、ＥｒｂＢ−３リガンドの非存在下であっても、ＥｒｂＢ−２：ＥｒｂＢ−３ヘテロ二量体を介した発癌性シグナル伝達を生成することができる（Ｊｕｎｔｔｉｌａ、Ａｋｉｔａら、２００９）。ＥｒｂＢ−２活性は、ＥｒｂＢ−２特異的抗体によって阻害され得る。かかるＥｒｂＢ−２特異的抗体は、例えば、ＥｒｂＢ−２陽性（ＨＥＲ２＋）腫瘍の処置において使用される。かかる処置に伴う問題は、腫瘍がしばしばＥｒｂＢ−２特異的処置を逃避し、阻害抗体の存在下であっても成長し続けることである。ＥｒｂＢ−２陽性腫瘍、例えば、乳房、卵巣、子宮頸部および胃の腫瘍は、上方調節されたＥｒｂＢ−３発現（Ｏｃａｎａ、Ｖｅｒａ−Ｂａｄｉｌｌｏら、２０１３）および／またはＥｒｂＢ−３リガンド発現（Ｗｉｌｓｏｎ、Ｆｒｉｄｌｙａｎｄら、２０１２）を示す腫瘍細胞の部位集団が選択的により早く成長することによって、処置を逃避し得ることが観察されている。また、ＥｒｂＢ−３受容体における活性化変異が同定されている。

臨床適用のために承認されたいくつかのモノクローナル抗体の中に、抗ＥｒｂＢ−２モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）およびＥｒｂＢ−１特異的セツキシマブ（アービタックス）がある。トラスツズマブは、転移性乳癌において証明された延命効果を有する（Ａｒｔｅａｇａ、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら、２０１１）。トラスツズマブの正確な作用機構は、はっきりとは確立されていない。作用の示唆された様式は、ＲＴＫシグナル伝達の阻害および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の動員である。記載されてきた他の作用機構には、ＥｒｂＢ−２細胞外ドメインのタンパク質分解性切断を遮断すること、血管新生因子の阻害、および受容体エンドサイトーシスの増強が含まれる。ＥｒｂＢ−２シグナル伝達を妨害する他の薬剤は、乳房および他のＥｒｂＢ−２過剰発現癌の処置のために承認されているか、または開発中である。例えば、化学化合物ラパチニブは、ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２の両方のチロシン・キナーゼ活性を阻害し、ＥｒｂＢ−２増幅された乳癌の第１選択の処置において使用される。

ＨＥＲ２＋転移性乳癌を有する患者では、単剤としてのまたは化学療法と組み合わせたトラスツズマブに対する耐性が、通常治療を開始して数カ月以内に生じる。ＨＥＲ２＋転移性乳癌を有する患者のごく一部だけが、単剤トラスツズマブに応答し、進行癌における耐性のｄｅｎｏｖｏ機構を示唆している。これらの機構には、とりわけ、他のＨＥＲファミリーの受容体からのシグナル伝達、およびＨＥＲファミリーではないＲＴＫからの代償的シグナル伝達が含まれる（Ｔｈｅｒｙら、Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅ２−ｔａｒｇｅｔｅｄｔｈｅｒａｐｉｅｓ、ＥｕｒＪＣａｎｃｅｒ（２０１４）、第５０巻、第５号、８９２〜９０１頁（ｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｊｃａ．２０１４．０１．００３））。例えば、ＨＥＲ２と併せたＨＥＲ３またはそのリガンドの過剰発現は、ＨＥＲ−２／ＨＥＲ−３ヘテロ二量体の形成、およびトラスツズマブに対する耐性の獲得をもたらす。従って、抗体トラスツズマブは、ＥｒｂＢ−３リガンドによって駆動されるシグナル伝達を遮断することにおいては無効であると考えられる（Ｗｅｈｒｍａｎ、Ｒａａｂら、２００６、Ｊｕｎｔｔｉｌａ、Ａｋｉｔａら、２００９、Ｔｈｅｒｙら、２０１４）。

最近、モノクローナル抗体ペルツズマブが、無増悪生存期間がさらに５カ月延長されることに基づいて、トラスツズマブと組み合わせた使用について承認された（Ｂａｓｅｌｇａ、Ｃｏｒｔｅｓら、２０１２）。ペルツズマブもまた、トラスツズマブとは異なる位置においてであるが、ＥｒｂＢ−２に結合する。

ＥｒｂＢ−２陽性腫瘍を処置するための他の戦略は、ＥｒｂＢ−３を対象とする。ＥｒｂＢ−３結合モノクローナル抗体は、前臨床研究においてその活性が実証されている（Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ、Ｆａｂｅｒら、２０１０）。一部のＥｒｂＢ−３結合モノクローナル抗体は、種々の癌の増殖および成長を阻害できる。

別の戦略は、ＥｒｂＢ−２受容体およびＥｒｂＢ−３受容体の両方の結合を伴う。分子ＭＭ−１１１は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に結合する２つの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む人工の生物学的分子である。２つのｓｃＦｖは、分子の半減期を増加させるために、変異したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質と会合される。予備試験において、この分子は、ＥｒｂＢ−３シグナル伝達および増殖を阻害することが示された。この効果は、比較的高い量のＥｒｂＢ−２を発現したＥｒｂＢ−３陽性細胞株において主に測定された。

本発明は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減できる。上記第１の抗原結合部位は、好ましくは、図１６Ａまたは図１６Ｅに示されるＶＨ鎖ＭＦ２９２６；ＭＦ２９３０；ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３；ＭＦ３００４；ＭＦ３９５８（ヒト化ＭＦ２９７１である）；ＭＦ２９７１；ＭＦ３０２５；ＭＦ２９１６；ＭＦ３９９１（ヒト化ＭＦ３００４である）；ＭＦ３０３１；ＭＦ２８８９；ＭＦ２９１３；ＭＦ１８４７；ＭＦ３００１；ＭＦ３００３またはＭＦ１８９８のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖を含む可変ドメイン中に存在する。上記第２の抗原結合部位は、好ましくは、図１６Ｂまたは図１６Ｅまたは図３７に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３またはＭＦ６０７４のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖を含む可変ドメイン中に存在する。可変ドメイン中の免疫グロブリン軽鎖は、好ましくは、図１６Ｃのアミノ酸配列を含む。

本発明の抗体は、特記しない限り、好ましくは、二重特異性抗体である。

本発明はさらに、本発明に従う抗体を含む医薬組成物を提供する。

標識、好ましくは、ｉｎｖｉｖｏ画像化のための標識をさらに含む、本発明に従う抗体がさらに提供される。

本発明は、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法もまた提供し、この方法は、本発明に従う二重特異性抗体を対象に投与することを含む。ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、または有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体もまた提供される。

ＰＧ３１７８の１つのアームと組み合わせた、活性ＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体中にも存在するＨＥＲ２アームのパネルの単量体ＨＥＲ２に対する抗原滴定を示す図である。ＰＧ３０２５を除くＨＥＲ２×ＨＥＲ３パネルの全てのＨＥＲ２モノクローナルを、ＨＥＲ２抗原滴定ＥＬＩＳＡで試験した。リガンド刺激ありまたはなしの、ＢｘＰＣ３細胞に対するＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体の機能的活性を示す図である。点線は、リガンド刺激ありまたはなしの、このアッセイにおける参照抗体トラスツズマブの活性を示す。ＭＣＦ−７アッセイにおける、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３モノクローナル抗体（上のパネル）ならびにそのＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体（下のパネル）の滴定曲線を示す図である。同所性マウス・モデルにおける３１日目のＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２腫瘍サイズに対する抗体処置の効果を示す図である。ＢＬＩ、バイオルミネセンスによって測定された腫瘍成長。同所性マウス・モデルにおける３１日目のＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２腫瘍サイズに対する抗体処置の効果を示す図である。ＢＬＩ、バイオルミネセンスによって測定された腫瘍成長。ＭＣＦ−７およびＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２のＨＥＲ２発現細胞上の、二重特異性ＨＥＲ２×ＨＥＲ３抗体およびその親モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析を示す図である。ＭＦＩ、平均蛍光強度。ＰＢ４１８８のＨＰ−ＳＥＣによる分析的特徴付けを示す図である。ＰＢ４１８８のＣＩＥＸ−ＨＰＬＣによる分析的特徴付けを示す図である。抗ＨＥＲ２親モノクローナル抗体のＨＰ−ＳＥＣによる分析的特徴付けを示す図である。抗ＨＥＲ２親モノクローナル抗体のＣＩＥＸ−ＨＰＬＣによる分析的特徴付けを示す図である。抗ＲＳＶモノクローナル参照ＩｇＧのＨＰ−ＳＥＣによる分析的特徴付けを示す図である。抗ＲＳＶモノクローナル参照ＩｇＧのＣＩＥＸ−ＨＰＬＣによる分析的特徴付けを示す図である。抗体の連続滴定による、軟寒天におけるＪＩＭＴ−１細胞増殖の阻害を示す図である。抗体の連続滴定による、マトリゲルにおけるＢＴ−４７４細胞増殖の阻害を示す図である。抗体の連続滴定による、マトリゲルにおけるＳＫＢＲ３細胞増殖の阻害を示す図である。マトリゲルにおけるＳＫＢＲ−３細胞のＨＲＧ誘導性の増殖および分岐／浸潤を示す図である。親モノクローナル抗体とは対照的な、ＰＢ４１８８による、マトリゲルにおけるＳＫＢＲ−３細胞のＨＲＧ誘導性の増殖および分岐／浸潤の阻害を示す図である。抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体とは対照的な、ＰＢ４１８８による、マトリゲルにおけるＳＫＢＲ−３細胞のＨＲＧ誘導性の増殖および分岐／浸潤の阻害を示す図である。抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体とトラスツズマブとの組み合わせとは対照的な、ＰＢ４１８８による、マトリゲルにおけるＳＫＢＲ−３細胞のＨＲＧ誘導性の増殖および分岐／浸潤の阻害を示す図である。ＰＢ４１８８および、ＰＢ４１８８＋トラスツズマブの組合せによる、マトリゲルにおけるＳＫＢＲ−３細胞のＨＲＧ誘導性の増殖および分岐／浸潤の阻害を示す図である。１００ｎｇ／ｍｌのＨＲＧの存在下での、ＨＥＲ２＋＋＋Ｎ８７細胞におけるＰＢ４１８８の優れた阻害活性を示す図である。１００ｎｇ／ｍｌのＨＲＧの存在下での、ＨＥＲ２^＋＋＋Ｎ８７細胞におけるＰＢ４１８８の優れた阻害活性を示す図である。用量滴定におけるＰＢ４１８８およびＰＢ３４４８のＡＤＣＣ活性を示す図である。モノクローナル親抗体またはそれらの組み合わせと比較した、二重特異性抗体の増加したＡＤＣＣ活性を示す図である。低（上のパネル）および高（下のパネル）ＨＥＲ２発現細胞に対する、トラスツズマブと比較した、非フコシル化されたＰＢ４１８８のＡＤＣＣ活性を示す図である。高ＦｃγＲバリアントを発現するレポーター細胞の存在下での、ＳＫＢＲ−３ＨＥＲ２^＋＋＋細胞に対する非フコシル化されたＰＢ４１８８のＡＤＣＣ活性を示す図である。低ＦｃγＲバリアントを発現するレポーター細胞の存在下での、ＳＫＢＲ−３ＨＥＲ２^＋＋＋細胞に対する非フコシル化されたＰＢ４１８８のＡＤＣＣ活性を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。図１６Ａ（図１６ＡＡ〜図１６ＡＫ）中にリーダー配列が示される場合、これは、ＶＨ鎖の一部でも抗体の一部でもなく、典型的には、タンパク質を産生する細胞におけるタンパク質のプロセシングの間に切断される。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。この図１６Ｂ（図１６ＢＡ〜図１６ＢＥ）中にリーダー配列が示される場合、これは、ＶＨ鎖の一部でも抗体の一部でもなく、典型的には、タンパク質を産生する細胞におけるタンパク質のプロセシングの間に切断される。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体の共通の軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖、共通の軽鎖および重鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。この図１６Ｅ（図１６ＥＡ〜図１６ＥＩ）中にリーダー配列が示される場合、これは、ＶＨ鎖の一部でも抗体の一部でもなく、典型的には、タンパク質を産生する細胞におけるタンパク質のプロセシングの間に切断される。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。ＪＩＭＴ−１マウス異種移植モデルにおける腫瘍サイズに対する抗体処置の効果を示す図である。異なる処置群の腫瘍体積ノギス測定によって測定された６０日間の腫瘍成長。ＪＩＭＴ−１マウス異種移植モデルにおける腫瘍サイズに対する抗体処置の処置期間（２９日間）の最後における腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）。ＪＩＭＴ−１マウス異種移植モデルにおける異なる処置群のカプラン・マイヤー生存曲線を示す図である。Ｎ８７のリガンド駆動される成長の阻害を示す図である。Ｎ８７のＨＲＧ駆動される増殖は、親抗ＨＥＲ３抗体とは対照的に、ＰＢ４１８８によって、広範なＨＲＧにわたって克服され得る。４０ｎｇ／ｍｌの抗体濃度で示されたデータ。ＢＴ−４７４細胞（３つの独立したアッセイ）に対する^１２５Ｉ標識されたＩｇＧＨＥＲ２×ＨＥＲ３（ＰＢ４１８８）の定常状態細胞親和性測定を示す図である。非特異的結合は、１００倍過剰の未標識ＨＥＲ２×ＨＥＲ３を使用して決定した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞（３つの独立したアッセイ）に対する１２５Ｉ標識されたＩｇＧＨＥＲ２×ＨＥＲ３（ＰＢ４１８８）の定常状態細胞親和性測定を示す図である。非特異的結合は、１００倍過剰の未標識ＨＥＲ２×ＨＥＲ３を使用して決定した。ＨＥＲ２のエピトープ・マッピングを示す図である。同定された重要残基は、ＨＥＲ２結晶構造上に黒色球として示され、同定された二次的重要残基は、灰色球として示される（ＰＤＢＩＤ＃１Ｓ７８）。ａ）検証されたＰＧ３９５８エピトープ残基を薄い灰色の球として示し、周囲の残基（＋／−５アミノ酸残基）を暗い灰色の球として示す、ＨＥＲ２結晶構造（ＰＤＢ＃１Ｓ７８）を示す図である。ｂ）検証されたエピトープ残基を灰色で示し、周囲の残基（＋／−５残基）を黒色で示す、エピトープ領域の溶媒に露出した表面を示す図である。ｃ）薄い灰色の検証されたエピトープ残基、および暗い灰色の周囲の残基（＋／−５残基）を用いた、エピトープ領域の詳細な表示を示す図である。ｄ）検証されたエピトープ残基（灰色下線）、周囲の残基（黒色）および遠位残基（灰色イタリック、ａ、ｂおよびｃには示されていない）を示す、ＨＥＲ２ＰＧ３９５８エピトープ領域の一次アミノ酸配列を示す図である。図２１ＢＡ〜図２１ＢＤに関する図および分析は、Ｙａｓａｒａ（ｗｗｗ．ｙａｓａｒａ．ｏｒｇ）で行った。ａ）灰色球のエピトープ残基Ａｒｇ４２６、および黒色球の、Ａｒｇ４２６から１１．２オングストローム半径以内の全ての、表面に露出した残基を示す、ＨＥＲ３結晶構造（ＰＤＢ＃４Ｐ５９）を示す図である。ｂ）灰色で示されるＡｒｇ４２６および遠位残基、および黒色で示されるＡｒｇ４２６から１１．２オングストローム半径以内の全ての、表面に露出した残基を用いた、エピトープ領域の溶媒に露出した表面を示す図である。ｃ）薄い灰色のエピトープ領域中の残基Ａｒｇ４２６および暗い灰色の周囲の残基（全て標識されている）を示す図である。図２１ＣＡ〜図２１ＣＣに関する図および分析は、Ｙａｓａｒａ（ｗｗｗ．ｙａｓａｒａ．ｏｒｇ）で行った。ＨＥＲ２に対するＦａｂアーム３９５８のための重要結合残基の確認を示す図である。トラスツズマブを、コントロール抗体として含めた。結合を、ＦＡＣＳ滴定において決定し、結合は、トラスツズマブ結合と比較したＡＵＣとして表現される。Ｄ１４３Ｙは、この変異体へのトラスツズマブの結合もまた遮断されるので、３９５８エピトープの一部とはみなされない。ＨＥＲ３結晶構造中に示される、ＰＧ３１７８結合のための重要残基を示す図である。ＰＧ３１７８結合について同定された重要残基は、ＨＥＲ３結晶構造上で黒色球として示される（ＰＤＢＩＤ＃４Ｐ５９）。ＨＥＲ３に対するＰＧ３１７５のための重要結合残基としてのＲ４２６の確認を示す図である。２つの抗ＨＥＲ３抗体を、コントロール抗体として含めた。結合を、ＦＡＣＳ滴定において決定し、結合を、ＷＴＨＥＲ３に対する結合と比較したＡＵＣとして表現する。ｉｎｖｉｔｒｏの心臓負荷下でのＰＢ４１８８毒性の非存在を示す図である。３μＭのアントラサイクリン・ドキソルビシンの存在下での、心筋細胞とＰＢ４１８８または単一特異性ベンチマーク抗体とのインキュベーション。心筋細胞の生存度を、ＡＴＰの定量化によって決定し、相対的光単位（ＲＬＵ）で表現した。Ｔ、トラスツズマブ；Ｐ、ペルツズマブ。トラスツズマブおよびＨＥＲ３抗体と比較した、ＨＥＲ２増幅された細胞へのＰＢ４１８８の結合を示す図である。ＦＡＣＳ滴定を、異なるＨＥＲ２レベルを発現する示された細胞株に対して実施した。中央値ＰＥシグナル値の曲線下面積を、細胞株ごとにプロットした。飽和濃度のＰＢ４１８８、トラスツズマブまたは陰性コントロール抗体と共に事前インキュベートしたＳＫＢＲ−３細胞への、ＰＢ４１８８^ＦＩＴＣの連続滴定の結合を示す図である。ＰＢ４１８８^ＦＩＴＣは、トラスツズマブまたはコントロール抗体の存在下で、ＳＫＢＲ−３に効率的に結合する。同じＨＥＲ３Ｆａｂアームおよび４つのＨＥＲ２ドメインに対する異なるＨＥＲ２アームから構成されたＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体による、ＨＲＧストレス条件下での細胞増殖の阻害を示す図である。同じＨＥＲ３Ｆａｂアームおよび４つのＨＥＲ２ドメインに対する異なるＨＥＲ２アームから構成されたＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体による、ＨＲＧストレス条件下での細胞増殖の阻害を示す図である。ＳＫＢＲ−３細胞の成長および形態学に対する、ＰＢ４１８８とラパチニブとの相乗的組み合わせを示す図である。上、異なる条件下で処置した細胞の顕微鏡図；下、処置条件に関してグラフ的にプロットした形態学的変化。時間経過実験における、ＰＢ４１８８による、Ｎ８７細胞のＨＲＧ媒介性リン酸化の阻害を示す図である。トラスツズマブ＋ペルツズマブおよびＨＲＧ単独を、コントロールとして含めた。時間経過実験における、ＰＢ４１８８による、Ｎ８７細胞のＨＲＧ媒介性リン酸化の阻害を示す図である。トラスツズマブ＋ペルツズマブおよびＨＲＧ単独を、コントロールとして含めた。時間経過実験における、ＰＢ４１８８による、Ｎ８７細胞のＨＲＧ媒介性リン酸化の阻害を示す図である。トラスツズマブ＋ペルツズマブおよびＨＲＧ単独を、コントロールとして含めた。時間経過実験における、ＰＢ４１８８による、ＳＫＢＲ−３細胞のＨＲＧ媒介性リン酸化の阻害を示す図である。トラスツズマブ＋ペルツズマブおよびＨＲＧ単独を、コントロールとして含めた。時間経過実験における、ＰＢ４１８８による、ＳＫＢＲ−３細胞のＨＲＧ媒介性リン酸化の阻害を示す図である。トラスツズマブ＋ペルツズマブおよびＨＲＧ単独を、コントロールとして含めた。時間経過実験における、ＰＢ４１８８による、ＳＫＢＲ−３細胞のＨＲＧ媒介性リン酸化の阻害を示す図である。トラスツズマブ＋ペルツズマブおよびＨＲＧ単独を、コントロールとして含めた。時間経過実験における、ＰＢ４１８８による、Ｎ８７細胞のＨＲＧ媒介性リン酸化の阻害を示す図である。トラスツズマブ＋ペルツズマブおよびラパチニブを、コントロールとして含めた。ＡｋｔレベルおよびＡｋｔリン酸化における変化を、ＰＢ４１８８の２回の週１回の用量または４回の週１回の用量の４時間後に評価したことを示す図である。腫瘍溶解物中のリン酸化レベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価した。分析を、２連で実施し、１群当たり５つの腫瘍を分析した。ＪＩＭＴ−１腫瘍材料に対するＶｅｒａＴａｇ分析によって分析した、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達に対するＰＢ４１８８のｉｎｖｉｖｏ媒介性効果を示す図である。腫瘍を、投薬の４時間後に分析し、ＰＢＳ処置動物由来の腫瘍を、コントロールとして含めた。ＰＢ４１８８が細胞周期進行を低減することを示す図である。アッセイ培地中に播種した細胞を、標準的（１ｎｇ／ｍｌ）または高い（１００ｎｇ／ｍｌ）濃度のＨＲＧの存在下で、抗体の滴定と共にインキュベートした。２４時間後（またはＭＣＦ−７細胞については４８時間後）、細胞を、細胞周期の異なる期（Ｇ０／Ｇ１、ＳまたはＧ２／Ｍ期）におけるそれらの分布について分析した。増殖指数を、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期にある細胞の百分率と、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の百分率との間の比率として計算した。Ｐ＋Ｔ、ペルツズマブ＋トラスツズマブ。ＰＢ４１８８が細胞周期進行を低減することを示す図である。アッセイ培地中に播種した細胞を、標準的（１ｎｇ／ｍｌ）または高い（１００ｎｇ／ｍｌ）濃度のＨＲＧの存在下で、抗体の滴定と共にインキュベートした。２４時間後（またはＭＣＦ−７細胞については４８時間後）、細胞を、細胞周期の異なる期（Ｇ０／Ｇ１、ＳまたはＧ２／Ｍ期）におけるそれらの分布について分析した。増殖指数を、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期にある細胞の百分率と、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の百分率との間の比率として計算した。Ｐ＋Ｔ、ペルツズマブ＋トラスツズマブ。ＨＥＲ２過剰発現性癌細胞における、ｐＨ感受性色素で標識した抗体の内部移行を示す図である。１ｎｇ／ｍｌのＨＲＧを補充したアッセイ培地中に播種したＮ８７を、１００ｎＭのｐＨ感受性色素標識した抗体と共に、２４時間インキュベートした。回収後、細胞を、ＡＰＣ標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体で染色して、細胞表面結合した抗体を検出した。細胞を、内部移行を決定するためにＰＥにおいて、蛍光についてのＦＡＣＳによって分析した。ＨＥＲ２過剰発現性癌細胞における、ｐＨ感受性色素で標識した抗体の内部移行を示す図である。１ｎｇ／ｍｌのＨＲＧを補充したアッセイ培地中に播種したＮ８７を、１００ｎＭのｐＨ感受性色素標識した抗体と共に、２４時間インキュベートした。回収後、細胞を、ＡＰＣ標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体で染色して、細胞表面結合した抗体を検出した。細胞を、抗体の表面結合を決定するためにＡＰＣチャネルにおいて、蛍光についてのＦＡＣＳによって分析した。ＨＥＲ２過剰発現性癌細胞における、ｐＨ感受性色素で標識した抗体の内部移行を示す図である。１ｎｇ／ｍｌのＨＲＧを補充したアッセイ培地中に播種したＳＫＢＲ−３を、１００ｎＭのｐＨ感受性色素標識した抗体と共に、２４時間インキュベートした。回収後、細胞を、ＡＰＣ標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体で染色して、細胞表面結合した抗体を検出した。細胞を、内部移行を決定するためにＰＥにおいて、蛍光についてのＦＡＣＳによって分析した。ＨＥＲ２過剰発現性癌細胞における、ｐＨ感受性色素で標識した抗体の内部移行を示す図である。１ｎｇ／ｍｌのＨＲＧを補充したアッセイ培地中に播種したＳＫＢＲ−３を、１００ｎＭのｐＨ感受性色素標識した抗体と共に、２４時間インキュベートした。回収後、細胞を、ＡＰＣ標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体で染色して、細胞表面結合した抗体を検出した。細胞を、抗体の表面結合を決定するためにＡＰＣチャネルにおいて、蛍光についてのＦＡＣＳによって分析した。２つの異なるドナー由来の細胞を用いた、トラスツズマブ対トラスツズマブ＋ペルツズマブのＡＤＣＣ活性を示す図である。Ｆ３１７８バリアントのアミノ酸およびヌクレオチド・アラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域が示される。Ｆ３１７８バリアントのアミノ酸およびヌクレオチド・アラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域が示される。Ｆ３１７８バリアントのアミノ酸およびヌクレオチド・アラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域が示される。Ｆ３１７８バリアントのアミノ酸およびヌクレオチド・アラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域が示される。Ｆ３１７８バリアントのアミノ酸およびヌクレオチド・アラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域が示される。Ｆ３１７８バリアントのアミノ酸およびヌクレオチド・アラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域が示される。Ｆ３１７８バリアントのアミノ酸およびヌクレオチド・アラインメントを示す図である。ＣＤＲ領域が示される。ＨＲＧ依存的Ｎ８７アッセイにおけるＨＥＲ３モノクローナル抗体の滴定曲線を示す図である。ＰＧ６０５８、ＰＧ６０６１およびＰＧ６０６５は、ＰＧ３１７８のバリアントである。ＰＧ１３３７は、破傷風トキソイドに特異的な陰性コントロールである。データは、各プレート上に存在するリガンドを用いた基底増殖に対して標準化した。ＨＥＲ３モノクローナル抗体のＣＩＥＸ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。ＰＧ６０６５は、ＰＧ３１７８のバリアントである。ＶＨ領域の計算された等電点（ｐＩ）および主要ピークの保持時間（ｔＲ）が、各抗体について与えられる。ＨＥＲ３モノクローナル抗体のＣＩＥＸ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。ＰＧ６０５８およびＰＧ６０６１は、ＰＧ３１７８のバリアントである。ＶＨ領域の計算された等電点（ｐＩ）および主要ピークの保持時間（ｔＲ）が、各抗体について与えられる。ＨＲＧストレス濃度にあるＨＥＲ２増幅された細胞株に対する、ＰＢ４１８８とのｉｎｖｉｔｒｏ薬物組み合わせアイソボログラムを示す図である。ＨＲＧストレス濃度にあるＨＥＲ２増幅された細胞株に対する、ＰＢ４１８８とのｉｎｖｉｔｒｏ薬物組み合わせアイソボログラムを示す図である。ＨＲＧストレス濃度にあるＨＥＲ２増幅された細胞株に対する、ＰＢ４１８８とのｉｎｖｉｔｒｏ薬物組み合わせアイソボログラムを示す図である。ＨＲＧストレス濃度にあるＨＥＲ２増幅された細胞株に対する、ＰＢ４１８８とのｉｎｖｉｔｒｏ薬物組み合わせアイソボログラムを示す図である。マトリゲル中で成長させたＨＥＲ２増幅された細胞株に対する、ＰＢ４１８８とのｉｎｖｉｔｒｏ薬物組み合わせアイソボログラムを示す図である。

本発明は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減する、または低減できる。

本明細書で使用する場合、用語「抗原結合部位」とは、抗原に結合することが可能な、二重特異性抗体に由来する部位、好ましくはかかる二重特異性抗体上に存在する部位を指す。未改変の抗原結合部位は、典型的には、抗体の可変ドメインによって形成され、かかる抗体の可変ドメイン中に存在する。可変ドメインは、上記抗原結合部位を含む。抗原に結合する可変ドメインは、抗原に結合する抗原結合部位を含む可変ドメインである。

一実施形態では、本発明の抗体可変ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。抗原結合部位は、組み合わされたＶＨ／ＶＬ可変ドメイン中に、またはＶＨ領域中にだけ、もしくはＶＬ領域中にだけ、存在し得る。抗原結合部位が、可変ドメインの２つの領域のうち一方中にだけ存在する場合、対応物の可変領域は、結合性可変領域のフォールディングおよび／または安定性に寄与し得るが、抗原の結合自体には顕著には寄与しない。

本明細書で使用する場合、抗原結合とは、その抗原への抗体の典型的結合能力を指す。ＥｒｂＢ−２に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ＥｒｂＢ−２に結合し、他の点は同一の条件下で、同じ種の相同受容体ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−４に、少なくとも１００分の１低く結合する。ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ＥｒｂＢ−３に結合し、他の点は同一の条件下で、同じ種の相同受容体ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−４には結合しない。ＥｒｂＢファミリーが細胞表面受容体のファミリーであることを考慮すると、結合は、典型的には、受容体（複数可）を発現する細胞に関して評価される。抗原への抗体の結合は、種々の方法で評価され得る。１つの方法は、抗体を抗原（好ましくは、抗原を発現する細胞）と共にインキュベートし、未結合の抗体を除去し（好ましくは、洗浄工程によって）、結合した抗体に結合する標識された抗体によって、結合した抗体を検出することである。

抗体による抗原結合は、典型的には、抗体のランダムな非特異的付着とは対照的に、これら２つの構造を正確に一緒に結合させる、抗体の相補性領域ならびに抗原および可変ドメインの両方の特異的三次元構造を介して媒介される（錠および鍵と類似の相互作用）。抗体は、典型的には、抗原のエピトープを認識し、かかるエピトープは、他の化合物中にも同様に存在し得るので、ＥｒｂＢ−２および／またはＥｒｂＢ−３に結合する本発明に従う抗体は、かかる他の化合物が同じエピトープを含む場合、他のタンパク質も同様に認識し得る。従って、用語「結合」は、別のタンパク質または同じエピトープを含むタンパク質（複数可）への抗体の結合を排除しない。かかる他のタンパク質（複数可）は、好ましくは、ヒト・タンパク質ではない。本発明において定義されるＥｒｂＢ−２抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３抗原結合部位は、典型的には、出生後の、好ましくは成人のヒトでは、細胞の膜上の他のタンパク質に結合しない。本発明に従う二重特異性抗体は、典型的には、以下により詳細に概説されるように、少なくとも１×１０ｅ−６Ｍの結合親和性で、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に結合することが可能である。

用語「結合を妨害する」とは、本明細書で使用する場合、抗体が、ＥｒｂＢ−３上のエピトープに対するものであり、抗体が、ＥｒｂＢ−３への結合についてリガンドと競合することを意味する。抗体は、リガンド結合を減退させ得、リガンドがＥｒｂＢ−３に既に結合している場合にはこれを置き換え得、または、例えば立体障害を介して、リガンドがＥｒｂＢ−３に結合する可能性を少なくとも部分的に防止し得る。

用語「抗体」とは、本明細書で使用する場合、タンパク質性分子、好ましくは、抗原上のエピトープに結合する１または複数の可変ドメインを含む免疫グロブリン・クラスのタンパク質に属するものを意味し、ここで、かかるドメインは、抗体の可変ドメイン由来であるか、またはかかる可変ドメインと配列相同性を共有する。治療的使用のための抗体は、好ましくは、処置される対象の天然抗体に可能な限り近い（例えば、ヒト対象に対してヒト抗体）。抗体結合は、特異性および親和性に関して表現され得る。特異性は、どの抗原またはそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されるかを決定する。親和性は、特定の抗原またはエピトープへの結合の強さについての尺度である。特異的結合は、少なくとも１×１０ｅ−６Ｍの、より好ましくは１×１０ｅ−７Ｍの、より好ましくは１×１０ｅ−９Ｍよりも高い親和性（ＫＤ）での結合として定義される。典型的には、治療的適用のための抗体は、最大で１×１０ｅ−１０Ｍまたはそれより高い親和性を有する。本発明の二重特異性抗体などの抗体は、天然抗体の定常ドメイン（Ｆｃ部分）を含む。本発明の抗体は、典型的には、好ましくはヒトＩｇＧサブクラスの、二重特異性全長抗体である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体である。本発明のかかる抗体は、良好なＡＤＣＣ特性を有し、ヒトへのｉｎｖｉｖｏ投与の際に好ましい半減期を有し、クローナル細胞における共発現の際にホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成する改変された重鎖を提供できるＣＨ３操作テクノロジーが存在する。

本発明の抗体は、好ましくは、「全長」抗体である。本発明に従う用語「全長」は、本質的に完全な抗体を含むと定義されるが、かかる抗体は、インタクトな抗体の全ての機能を有する必要はない。誤解を避けるために、全長抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各鎖は、定常（Ｃ）領域および可変（Ｖ）領域を含み、これらは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、およびＣＬ、ＶＬと称されるドメインへと解体され得る。抗体は、Ｆａｂ部分中に含まれる可変ドメインを介して抗原に結合し、結合後、定常ドメインを介して、主にＦｃ部分を介して、免疫系の分子および細胞と相互作用できる。用語「可変ドメイン」、「ＶＨ／ＶＬ対」、「ＶＨ／ＶＬ」は、本明細書で相互交換可能に使用される。本発明に従う全長抗体は、所望の特徴を提供する変異が存在し得る抗体を包含する。かかる変異は、これらの領域のいずれかの多くの部分の欠失であるべきではない。しかし、得られた抗体の結合特徴を本質的に変更することなしに１またはいくつかのアミノ酸残基が欠失されている抗体は、用語「全長抗体」内に包含される。例えば、ＩｇＧ抗体は、定常領域中に、１〜２０アミノ酸残基の挿入、欠失またはそれらの組み合わせを有し得る。例えば、抗体自体が低いＡＤＣＣ活性を有する場合、抗体の定常領域を僅かに改変することによって、抗体のＡＤＣＣ活性は改善され得る（Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．、Ｋ．Ｐａｒｓｏｎｓら（２０１０）、「ＳｕｐｅｒｉｏｒＩｎｖｉｖｏＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＡｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂｉｎｔｈｅＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＨＥＲ２−ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ」、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ７０（１１）：４４８１〜４４８９）。

全長ＩｇＧ抗体は、それらの好ましい半減期、および免疫原性を理由として完全な自己の（ヒト）分子に近いものである必要性に起因して、好ましい。本発明の抗体は、好ましくは、二重特異性ＩｇＧ抗体、好ましくは、二重特異性全長ＩｇＧ１抗体である。ＩｇＧ１は、ヒトにおけるその長い循環半減期に基づいて好ましい。ヒトにおけるいずれの免疫原性をも防止するために、本発明に従う二重特異性ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧ１であることが好ましい。

用語「二重特異性」（ｂｓ）とは、抗体の１つの部分（上に定義される）が抗原上の１つのエピトープに結合する一方で、第２の部分が異なるエピトープに結合することを意味する。この異なるエピトープは、典型的には、異なる抗原上に存在する。本発明によれば、この第１および第２の抗原は、事実上、２つの異なるタンパク質である。好ましい二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体の部分を含む抗体であり、結果として、２つの異なる型の抗原に結合する。二重特異性抗体の一方のアームは、典型的には、１つの抗体の可変ドメインを含み、他方のアームは、別の抗体の可変ドメインを含む。本発明の二重特異性抗体の重鎖可変領域は、典型的には互いに異なるが、軽鎖可変領域は、好ましくは、本発明の二重特異性抗体において同じである。異なる重鎖可変領域が同じまたは共通の軽鎖と結び付けられている二重特異性抗体は、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体とも呼ばれる。従って、両方のアームが共通の軽鎖を含む、本発明に従う二重特異性抗体が、さらに提供される。

好ましい二重特異性抗体は、単一細胞における２つの異なる重鎖および１つの共通の軽鎖の共発現によって得ることができる。野生型ＣＨ３ドメインが使用される場合、２つの異なる重鎖および１つの共通の軽鎖の共発現は、３つの異なる種、ＡＡ、ＡＢおよびＢＢを生じる。所望の二重特異性産物（ＡＢ）の百分率を増加させるために、ＣＨ３操作が使用でき、または言い換えれば、本明細書の以下に定義されるような、適合的な（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を使用できる。

用語「適合的なヘテロ二量体化ドメイン」とは、本明細書で使用する場合、操作されたドメインＡ’が、操作されたドメインＢ’とのヘテロ二量体を優先的に形成し、逆もまた然りであるが、Ａ’−Ａ’間およびＢ’−Ｂ’間のホモ二量体化は減退されるように操作されている、タンパク質ドメインを指す。

本発明に従う用語「共通の軽鎖」とは、同一であり得るか、またはいくらかのアミノ酸配列差異を有し得る軽鎖を指すが、全長抗体の結合特異性は影響されないものを指す。例えば、本明細書で使用する場合、共通の軽鎖の定義の範囲内で、例えば、保存的アミノ酸変化、重鎖とペアリングした場合に結合特異性に寄与しないまたは部分的にのみ寄与する領域中のアミノ酸の変化を導入および試験することなどによって、同一ではないがなおも機能的に等価物である軽鎖を調製および見出すことが可能である。用語「共通の軽鎖」、「共通のＶＬ」、「単一軽鎖」、「単一ＶＬ」は、全て、用語「再編成された」の付加ありまたはなしで、本明細書で相互交換可能に使用される。機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成するために異なる重鎖と結びつき得るヒト軽鎖を共通の軽鎖として使用することは、本発明の一態様である（ＷＯ２００４／００９６１８、ＷＯ２００９／１５７７７１、Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８およびＮｉｓｓｉｍら、１９９４）。好ましくは、共通の軽鎖は、生殖系列配列を有する。好ましい生殖系列配列は、ヒト・レパートリーにおいて頻繁に使用され、良好な熱力学的安定性、収量および溶解度を有する軽鎖可変領域である。好ましい生殖系列軽鎖は、Ｏ１２、好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１またはその断片もしくは機能的等価物（即ち、同じＩｇＶκ１−３９遺伝子セグメントであるが、異なるＩＧＪκ遺伝子セグメント）である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおけるＩＭＧＴデータベース・ワールドワイド・ウェブに従う命名法）。従って、共通の軽鎖が、生殖系列軽鎖、好ましくは、ＩｇＶＫｌ−３９遺伝子セグメントを含む再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖、最も好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶＫｌ−３９^＊０１／ＩＧＪＫｌ^＊０１である、本発明に従う二重特異性抗体が、さらに提供される。用語、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１、ＩＧＫＶ１−３９／ＩＧＫＪ１、ｈｕＶκ１−３９軽鎖、または短くｈｕＶκ１−３９は、本出願を通じて相互交換可能に使用される。明らかに、当業者は、「共通の」が、そのアミノ酸配列が同一でない軽鎖の機能的等価物もまた指すことを認識する。機能的結合領域の形成に実質的に影響しない変異（欠失、置換、付加）が存在する、上記軽鎖の多くのバリアントが存在する。本発明の軽鎖はまた、１〜５アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有する、本明細書の上で特定した軽鎖であり得る。

ＶＨが、第１の抗原を特異的に認識することが可能であり、免疫グロブリン可変ドメイン中のＶＨとペアリングしたＶＬが、第２の抗原を特異的に認識することが可能である抗体もまた、企図される。得られたＶＨ／ＶＬ対は、抗原１または抗原２のいずれかに結合する。例えばＷＯ２００８／０２７２３６、ＷＯ２０１０／１０８１２７およびＳｃｈａｅｆｅｒら（ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ２０、４７２〜４８６、２０１１年１０月）に記載される、かかるいわゆる「ツー・イン・ワン抗体」は、本発明の二重特異性抗体とは異なるが、さらに「ツー・イン・ワン」抗体と呼ぶ。かかる「ツー・イン・ワン」抗体は、同一のアームを有し、本発明の抗体ではない。

用語「ＥｒｂＢ−２」とは、本明細書で使用する場合、ヒトにおける、ＥＲＢＢ−２遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。この遺伝子またはタンパク質の代替名には、ＣＤ３４０；ＨＥＲ−２；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；ＭＬＮ１９；ＮＥＵ；ＮＧＬ；ＴＫＲ１が含まれる。このＥＲＢＢ−２遺伝子は、しばしばＨＥＲ２と呼ばれる（ヒト上皮増殖因子受容体２から）。本明細書でＥｒｂＢ−２に対する言及がなされる場合、この言及は、ヒトＥｒｂＢ−２を指す。ＥｒｂＢ−２に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトＥｒｂＢ−２に結合する。ＥｒｂＢ−２抗原結合部位は、ヒト・オルソログと他の哺乳動物オルソログとの間の配列および三次構造の類似性に起因して、かかるオルソログにも結合し得るが、必ずしも結合しなくともよい。ヒトＥｒｂＢ−２タンパク質およびそれをコードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、（ＮＰ＿００１００５８６２．１、ＮＰ＿００４４３９．２ＮＣ＿００００１７．１０ＮＴ＿０１０７８３．１５ＮＣ＿０１８９２８．２）である。これらの登録番号は、標的としてのＥｒｂＢ−２の同定のさらなる方法を提供するために主に与えられ、抗体によって結合されるＥｒｂＢ−２タンパク質の実際の配列は、例えば、一部の癌において生じるものなどの、コード遺伝子中の変異などに起因して、変動し得る。ＥｒｂＢ−２抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−２およびそれらの種々のバリアント、例えば、一部のＥｒｂＢ−２陽性腫瘍細胞によって発現されるものに結合する。

用語「ＥｒｂＢ−３」とは、本明細書で使用する場合、ヒトにおける、ＥＲＢＢ−３遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。この遺伝子またはタンパク質の代替名は、ＨＥＲ３；ＬＣＣＳ２；ＭＤＡ−ＢＦ−１；ｃ−ＥｒｂＢ−３；ｃ−ｅｒｂｂ−３；ｅｒｂｂ−３−Ｓ；ｐ１８０−Ｅｒｂｂ−３；ｐ４５−ｓＥｒｂｂ−３；およびｐ８５−ｓＥｒｂｂ−３である。本明細書でＥｒｂＢ−３に対する言及がなされる場合、この言及は、ヒトＥｒｂＢ−３を指す。ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトＥｒｂＢ−３に結合する。ＥｒｂＢ−３抗原結合部位は、ヒト・オルソログと他の哺乳動物オルソログとの間の配列および三次構造の類似性に起因して、かかるオルソログにも結合し得るが、必ず結合するわけではない。ヒトＥｒｂＢ−３タンパク質およびそれをコードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、（ＮＰ＿００１００５９１５．１ＮＰ＿００１９７３．２、ＮＣ＿００００１２．１１ＮＣ＿０１８９２３．２ＮＴ＿０２９４１９．１２）である。これらの登録番号は、標的としてのＥｒｂＢ−３の同定のさらなる方法を提供するために主に与えられ、抗体によって結合されるＥｒｂＢ−３タンパク質の実際の配列は、例えば、一部の癌において生じるものなどの、コード遺伝子中の変異などに起因して、変動し得る。ＥｒｂＢ−３抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−３およびそれらの種々のバリアント、例えば、一部のＥｒｂＢ−２陽性腫瘍細胞によって発現されるものに結合する。

ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む本発明の二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減できるまたは低減する。過剰なＥｒｂＢ−２の存在下では、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロ二量体は、ヘテロ二量体中のＥｒｂＢ−３鎖に対する検出可能なリガンドの非存在下で、発現細胞に成長シグナルを提供し得る。このＥｒｂＢ−３受容体機能は、本明細書で、ＥｒｂＢ−３のリガンド非依存的受容体機能と呼ばれる。このＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロ二量体は、ＥｒｂＢ−３リガンドの存在下でも、発現細胞に成長シグナルを提供する。このＥｒｂＢ−３受容体機能は、本明細書で、ＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能と呼ばれる。

用語「ＥｒｂＢ−３リガンド」とは、本明細書で使用する場合、ＥｒｂＢ−３に結合および活性化するポリペプチドを指す。ＥｒｂＢ−３リガンドの例には、ニューレグリン１（ＮＲＧ）およびニューレグリン２、ベータセルリン、ヘパリン結合性上皮増殖因子ならびにエピレグリンが含まれるがこれらに限定されない。この用語は、天然に存在するポリペプチドの生物学的に活性のある断片および／またはバリアントを含む。

本発明の好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞のＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長である。好ましい一実施形態では、この細胞は、ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２２（商標））；ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−３０（商標））細胞；ＮＣＩ−８７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−５８２２（商標））細胞；ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２細胞（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ１２５０５８）、ＢＴ−４７４細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２０（商標））またはＪＩＭＴ−１細胞（ＤＳＭＺ番号：ＡＣＣ５８９）である。

好ましい一実施形態では、このＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞は、細胞表面上に、少なくとも５０．０００のＥｒｂＢ−２受容体を含む。好ましい一実施形態では、少なくとも１００．０００のＥｒｂＢ−２受容体。好ましい一実施形態では、このＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞は、細胞表面上に、少なくとも１．０００．０００のＥｒｂＢ−２受容体を含む。別の好ましい一実施形態では、このＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞は、細胞表面上に、１．０００．０００以下のＥｒｂＢ−２受容体を含む。現在使用されている治療、例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン）およびペルツズマブは、臨床応答を得るために、その細胞表面上に１．０００．０００超のＥｒｂＢ−２受容体を有する悪性ＥｒｂＢ−２陽性細胞を有する患者のみに処方される。その細胞表面上に１．０００．０００超のＥｒｂＢ−２受容体を有するＥｒｂＢ−２陽性腫瘍細胞を有する患者は、典型的には、ＥｒｂＢ−２［＋＋＋］と分類される。患者は、例えば、共にＤａｋｏＤｅｎｍａｒｋＡ／Ｓによって市販されるＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）および／もしくはＨＥＲ２ＦＩＳＨ（ｐｈａｒｍＤｘ（商標））を使用して、ならびに／またはＭｏｎｏｇｒａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって市販されるＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）アッセイを使用して、分類される。トラスツズマブおよびペルツズマブは、ＥｒｂＢ−２［＋＋＋］患者のみに処方されるが、それは、より低いＥｒｂＢ−２濃度を有する患者は、典型的には、トラスツズマブおよびペルツズマブで処置した場合に十分な臨床応答を示さないからである。しかし、本発明は、トラスツズマブと比較して、より低いＥｒｂＢ−２受容体濃度を有する細胞に対する改善された結合親和性もまた有する二重特異性抗体を提供する。実施例に示されるように、より低いＥｒｂＢ２発現を有するかかる細胞の増殖は、本発明に従う抗体により効率的に対抗される。かかるより低いＥｒｂＢ−２受容体濃度は、ＥｒｂＢ−２［＋＋］またはＥｒｂＢ−２［＋］と分類された患者の悪性細胞上に存在する。また、再発したＥｒｂＢ−２陽性腫瘍は、細胞１つ当たり１．０００．０００未満の受容体のＥｒｂＢ−２受容体濃度を有する場合が多い。従って、かかるＥｒｂＢ−２［＋＋］またはＥｒｂＢ−２［＋］患者、ならびに再発したＥｒｂＢ−２陽性腫瘍を有する患者は、好ましくは、本発明に従う二重特異性抗体で処置される。従って、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体がさらに提供され、この抗体は、１．０００．０００未満のＥｒｂＢ−２細胞表面受容体を有するＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる。ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法もまた提供され、この腫瘍は、細胞１つ当たり１．０００．０００未満のＥｒｂＢ−２細胞表面受容体を有し、この方法は、本発明に従う二重特異性抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体もまた、本明細書で提供され、この腫瘍は、細胞１つ当たり１．０００．０００未満のＥｒｂＢ−２細胞表面受容体を有する。本発明に従う抗体は、典型的には、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、本明細書で以下により詳細に説明するように、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、好ましくは２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性は、好ましくは５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、好ましくは４．０ｎＭ以下である。

好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、Ｔ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０およびＲ１８１、ならびにＴ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０またはＲ１８１から約５アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−２のドメインＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。

好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、好ましくは、Ｒ４２６およびネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。

腫瘍がＥｒｂＢ−３について陽性かどうかを確立するために、当業者は、例えば、ＥｒｂＢ−３増幅および／または免疫組織化学における染色を行うことできる。生検中に少なくとも１０％の腫瘍細胞がある場合、陽性とすべきである。生検はまた、２０％、３０％４０％５０％６０％７０％またはそれ超の陽性細胞を含み得る。

本明細書で使用する場合、リガンド誘導性受容体機能は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０、４０、５０６０または少なくとも７０％低減され、特に好ましい一実施形態では、このリガンド誘導性受容体機能は、８０％、より好ましくは９０％低減される。この低減は、好ましくは、本発明の二重特異性抗体の存在下でリガンド誘導性受容体機能を決定し、それを、他の点では同一の条件下で当該抗体の非存在下での同じ機能と比較することによって、決定される。これらの条件は、ＥｒｂＢ−３リガンドの存在を少なくとも含む。存在するリガンドの量は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞株の最大成長の半分を誘導する量である。この試験のためのＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞株は、好ましくは、ＭＣＦ−７細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２２（商標））、ＳＫＢＲ３細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−３０（商標））細胞、ＪＩＭＴ−１細胞株（ＤＳＭＺＡＣＣ５８９）またはＮＣＩ−８７細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−５８２２（商標））である。ＥｒｂＢ−３リガンド誘導性受容体機能を決定するための試験および／またはリガンドは、好ましくは、実施例に特定されるような、ＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長低減についての試験である。

ＥｒｂＢ−２タンパク質は、いくつかのドメインを含む（Ｌａｎｄｇｒａｆ，ＲＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７；９（１）：２０２〜の図１を、参考のために参照のこと）。これらの細胞外ドメインは、ドメインＩ〜ＩＶと呼ばれる。本明細書に記載される抗体の抗原結合部位のそれぞれのドメインへの結合の場所は、マッピングされている（実施例を参照のこと）。ＥｒｂＢ−２のドメインＩまたはドメインＩＶに結合する抗原結合部位（第１の抗原結合部位）（第１の抗原結合部位）を有する本発明の二重特異性抗体は、種々の軽鎖と組み合わせた場合に、ＥｒｂＢ−２に対する顕著な結合特異性および親和性を維持する重鎖可変領域を含む。ＥｒｂＢ−２のドメインＩまたはドメインＩＶに結合する抗原結合部位（第１の抗原結合部位）（第１の抗原結合部位）およびＥｒｂＢ−３に対する抗原結合部位（第２の抗原結合部位）を有する二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ−２の別の細胞外ドメインに結合する抗原結合部位（第１の抗原結合部位）を含む二重特異性抗体と比較した場合、ＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減させるのにより有効であることが見出された。ＥｒｂＢ−２に結合する抗原結合部位（第１の抗原結合部位）を含む二重特異性抗体であって、この抗原結合部位が、ＥｒｂＢ−２のドメインＩまたはドメインＩＶに結合する抗体が、好ましい。好ましくは、この抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩＶに結合する。ＥｒｂＢ−２に結合し、ＡＤＣＣをさらに含む抗原結合部位（第１の抗原結合部位）を有する二重特異性抗体は、特にｉｎｖｉｖｏで顕著なＡＤＣＣ活性を有さなかった他のＥｒｂＢ−２結合抗体よりも、有効であることが見出された。従って、ＡＤＣＣを示す本発明に従う二重特異性抗体が好ましい。第１の抗原結合部位がＥｒｂＢ−２のドメインＩＶに結合する抗体は、固有のＡＤＣＣ活性を有することが見出された。低い固有のＡＤＣＣ活性を有する、ドメインＩ結合性のＥｒｂＢ−２結合抗体は、ＡＤＣＣ活性を増強するために操作され得る。Ｆｃ領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、マクロファージ、ナチュラル・キラー細胞、Ｂ細胞および好中球上の異なる受容体に結合することによって、抗体機能を媒介する。これらの受容体の一部、例えば、ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）およびＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）は、細胞を活性化して、抗原に対する応答を構築させる。他の受容体、例えばＣＤ３２Ｂは、免疫細胞の活性化を阻害する。（アミノ酸置換を導入することによって）より高い選択性で活性化受容体に結合するＦｃ領域を操作することによって、抗癌Ｍａｂによる所望の細胞傷害活性を媒介するより高い能力を有する抗体が創出され得る。

抗体のＡＤＣＣを増強するための１つの技術は、非フコシル化である（例えば、Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．、Ｋ．Ｐａｒｓｏｎｓら（２０１０）、「ＳｕｐｅｒｉｏｒＩｎｖｉｖｏＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＡｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂｉｎｔｈｅＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＨＥＲ２−ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ」、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ７０（１１）：４４８１〜４４８９を参照のこと）。従って、非フコシル化されている、本発明に従う二重特異性抗体が、さらに提供される。あるいは、またはさらに、例えば糖鎖工学（ＫｙｏｗａＨａｋｋｏ／Ｂｉｏｗａ、ＧｌｙｃＡｒｔ（Ｒｏｃｈｅ）およびＥｕｒｅｋａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）および変異誘発（ＸｅｎｃｏｒおよびＭａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）を含む複数の他の戦略が、ＡＤＣＣ増強を達成するために使用され得、これらの戦略は全て、低親和性活性化ＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃ結合を改善し、および／または低親和性阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの結合を低減させようとするものである。

ＡＤＣＣを惹起することにおける抗体またはエフェクター細胞の効力を決定するための、いくつかのｉｎｖｉｔｒｏ方法が存在する。これらには、クロム−５１［Ｃｒ５１］放出アッセイ、ユーロピウム［Ｅｕ］放出アッセイおよび硫黄−３５［Ｓ３５］放出アッセイがある。通常、表面に露出した特定の抗原を発現する標識された標的細胞株は、その抗原に特異的な抗体と共にインキュベートされる。洗浄後、Ｆｃ受容体ＣＤ１６を発現するエフェクター細胞は、典型的には、抗体標識された標的細胞と共に共インキュベートされる。標的細胞溶解は、引き続いて、典型的には、例えば、シンチレーション・カウンターまたは分光光度法によって、細胞内標識の放出によって測定される。好ましい試験は、実施例中に詳述される。

本発明の１つの利点は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞への、例えばＰＢ４１８８などの本発明に従う抗体の結合が、トラスツズマブと比較して同じ程度までの内部移行を生じるという事実である。トラスツズマブおよびペルツズマブの組み合わせが使用される場合、これらの抗体の内部移行が増強される。しかし、この増強された内部移行は、低減されたＡＤＣＣを生じる。従って、トラスツズマブと比較して本質的に同じ程度までの内部移行を生じる本発明に従う抗体は、トラスツズマブおよびペルツズマブの組み合わせよりも好ましいが、それは、かかる抗体を用いると、ＡＤＣＣ活性がより良く維持されるからである。

ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む本発明の抗体は、ＥｒｂＢ−３へのＥｒｂＢ−３リガンドの結合を妨害する。かかる抗体は、特に、ＥｒｂＢ−２に結合する抗原結合部位も含む二重特異性抗体において、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞株上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減させるのに、より有効である。

本発明の好ましい実施形態は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する。実施例に示されるように、これらの特徴を有する二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞に結合し、それらの活性（例えば、ＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能ならびにＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ３陽性細胞のリガンド誘導性成長）に対抗することが十分に可能である。さらに、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位を含む本発明に従う二重特異性抗体は、トラスツズマブおよびペルツズマブなどの既存の抗ＥｒｂＢ−２治療と組み合わせた使用のために特に適切であるが、それは、トラスツズマブおよびペルツズマブが、ＥｒｂＢ−２の異なるドメインに結合するからである。トラスツズマブは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩＶに結合し、ペルツズマブは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩＩに結合する。従って、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する本発明に従う二重特異性抗体が好ましいが、それは、これらが、同じエピトープについてトラスツズマブおよびペルツズマブと競合しないからである。

別の好ましい一実施形態は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第２の抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する。本発明に従うかかる抗体は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合しない現在使用されている抗ＥｒｂＢ−３結合分子、例えば、ＥｒｂＢ−３のドメインＩに結合するＭＭ−１２１（ＭｅｒｒｉｍａｃｋＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；＃Ａｂ６とも呼ばれる）およびＲＧ７１１６（Ｒｏｃｈｅ）との組み合わせ治療に特に適切であるが、それは、これらの異なる結合分子が、同じエピトープについて互いと競合しないからである。

好ましくは、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体が提供され、この第１の抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合し、第２の抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する。かかる抗体は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合しない抗ＥｒｂＢ−２結合分子、例えば、トラスツズマブおよびペルツズマブとの、ならびにＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合しない抗ＥｒｂＢ−３結合分子、例えば、ＭＭ−１２１（＃Ａｂ６）およびＲＧ７１１６との組み合わせ治療に特に適切である。

好ましい一実施形態は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合し、第２の抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合し、この抗体は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減できる。この抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる。

本発明のさらなる実施形態は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。例えば、ＥｒｂＢ−３に対してよりもＥｒｂＢ−２に対してより高い親和性を有する、ＭｅｒｒｉｍａｃｋＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＭＭ−１１１などの先行技術の二重特異性化合物とは対照的に、本発明は、細胞上のＥｒｂＢ−２に対するＥｒｂＢ−２特異的アームの親和性よりも高い、細胞上のＥｒｂＢ−３に対する親和性を有するＥｒｂＢ−３特異的アームを有する二重特異性抗体を提供する。かかる二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ−３の低い細胞表面濃度にもかかわらず、ＥｒｂＢ−３をより良く結合することが可能である。これは、ＥｒｂＢ−３に対する機能的活性が、先行技術の化合物と比較して増強されるという利点を提供し、これは、本発明に従うこれらの二重特異性抗体が、ＥｒｂＢ−３活性（例えば、リガンド誘導性成長）により良く対抗することが可能であることを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「親和性」とは、ＫＤ値を指す。

ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する上記第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、好ましくは２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。好ましい一実施形態では、ＳＫ−ＢＲ−３細胞上のＥｒｂＢ−３に対するこの第２の抗原結合部位の親和性は、２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、好ましくは０．９９ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、１．３９〜０．５９ｎＭの範囲内である。好ましい一実施形態では、ＢＴ−４７４細胞上のＥｒｂＢ−３に対するこの第２の抗原結合部位の親和性は、２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１．０ｎＭ以下、より好ましくは０．５ｎＭ未満、より好ましくは０．３１ｎＭ以下、より好ましくは０．２３ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、０．３１〜０．１５ｎＭの範囲内である。上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して４℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。

ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する上記第１の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、好ましくは５．０ｎＭ以下、より好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは３．９ｎＭ以下である。好ましい一実施形態では、ＳＫ−ＢＲ−３細胞上のＥｒｂＢ−２に対するこの第１の抗原結合部位の親和性は、５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは４．０ｎＭ以下、より好ましくは３．５ｎＭ以下、より好ましくは３．０ｎＭ以下、より好ましくは２．３ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、３．０〜１．６ｎＭの範囲内である。好ましい一実施形態では、ＢＴ−４７４細胞上のＥｒｂＢ−２に対するこの第１の抗原結合部位の親和性は、５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは３．９ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、４．５〜３．３ｎＭの範囲内である。上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して４℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。

好ましい一実施形態では、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、ＢＴ−４７４細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性（ＫＤ）は、５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは４．０ｎＭ以下、より好ましくは３．５ｎＭ以下、より好ましくは３．７ｎＭ以下、好ましくは３．２ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、３．７〜２．７ｎＭの範囲内である。好ましい一実施形態では、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性は、５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは４．０ｎＭ以下、より好ましくは３．５ｎＭ以下、より好ましくは３．０ｎＭ以下、好ましくは２．５ｎＭ以下、より好ましくは２．０ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、２．４〜１．６ｎＭの範囲内である。重ねて、上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して４℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。

本発明のさらに好ましい実施形態は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高く、この抗体は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減できる。この抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる。

上述の、ＥｒｂＢ−３に対する高い親和性を有する本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ２のドメインＩおよび／またはＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する。従って、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体がさらに提供され、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体もまた提供され、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。特に好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。

この第２の抗原結合部位は、好ましくは、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合し、２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．５ｎＭ以下、好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する親和性（ＫＤ）を有する。好ましい一実施形態では、この第２の抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合し、２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．５ｎＭ以下、好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である、ＳＫ−ＢＲ−３細胞上のＥｒｂＢ−３に対する親和性を有する。一実施形態では、この親和性は、１．３９〜０．５９ｎＭの範囲内である。好ましい一実施形態では、この第２の抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合し、２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１．０ｎＭ以下、より好ましくは０．５ｎＭ以下、より好ましくは０．３１ｎＭ以下、より好ましくは０．２３ｎＭ以下である、ＢＴ−４７４細胞上のＥｒｂＢ−３に対する親和性を有する。一実施形態では、この親和性は、０．３１〜０．１５ｎＭの範囲内である。

この第１の抗原結合部位は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合し、５．０ｎＭ以下、より好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは３．９ｎＭ以下である、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する親和性（ＫＤ）を有する。好ましい一実施形態では、この第１の抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合し、５．０ｎＭ以下、より好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは４．０ｎＭ以下、より好ましくは３．５ｎＭ以下、より好ましくは３．０ｎＭ以下、より好ましくは２．５ｎＭ以下、より好ましくは２．３ｎＭ以下である、ＳＫ−ＢＲ−３細胞上のＥｒｂＢ−２に対する親和性を有する。一実施形態では、この親和性は、３．０〜１．６ｎＭの範囲内である。ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性は、好ましくは５．０ｎＭ以下、より好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは４．０ｎＭ以下、より好ましくは３．５ｎＭ以下、より好ましくは３．０ｎＭ以下、より好ましくは２．５ｎＭ以下、より好ましくは２．４ｎＭ以下、より好ましくは２．０ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、２．４〜１．６ｎＭの範囲内である。

好ましい一実施形態では、この第１の抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合し、５．０ｎＭ以下、より好ましくは４．５ｎＭ以下、好ましくは３．９ｎＭ以下である、ＢＴ−４７４細胞上のＥｒｂＢ−２に対する親和性（ＫＤ）を有する。一実施形態では、この親和性は、４．５〜３．３ｎＭの範囲内である。ＢＴ−４７４細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性は、好ましくは５．０ｎＭ以下、より好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは４．０ｎＭ以下、より好ましくは３．７ｎＭ以下、より好ましくは３．２ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、３．７〜２．７ｎＭの範囲内である。

重ねて、上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して４℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。

別の好ましい一実施形態は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減でき、この二重特異性抗体は、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない。心臓毒性は、ＥｒｂＢ−２標的化治療における公知の危険因子であり、合併症の頻度は、トラスツズマブがアントラサイクリンと併せて使用され、それによって、心臓負荷を誘導する場合に、増加する。例えば、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）とトラスツズマブとの組み合わせは、重症の心臓副作用を誘導する。臨床研究により、乳癌のアジュバント設定においてトラスツズマブを投与される患者の５％〜１０％が、心機能不全を発症すると推定されている（Ｇｕａｒｎｅｒｉら、ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．、１９８５、３：８１８〜２６；ＥｗｅｒＭＳら、ＮａｔＲｅｖＣａｒｄｉｏｌ２０１０；７：５６４〜７５）。しかし、レトロスペクティブ研究において、無症候性心機能不全を発症するリスクが、実際には、トラスツズマブがＤＯＸと共にアジュバント設定において使用される場合、約２５％もの高さであることが実証された（Ｗａｄｈｗａら、ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓＴｒｅａｔ２００９；１１７：３５７〜６４）。実施例に示されるように、本発明は、ＥｒｂＢ−２を標的化し、心筋細胞の生存に影響を与えない、またはトラスツズマブおよびペルツズマブと比較して、顕著に低い程度までしか影響を与えない、抗体を提供する。心臓毒性が低減されるので、これは、重要な利点を提供する。これは、障害された心機能に罹患していない人々にとって既に有利であり、障害された心機能に罹患している人々またはそのリスクがある人々、例えば、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、左室機能不全（ＬＶＤ）および／もしくは１０％以上減少した左室駆出分画（ＬＶＥＦ）に罹患している対象、ならびに／または心筋梗塞を有している対象などにとっては、さらにいっそう有利である。従って、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない本発明に従う抗体が、好ましい。ｉｎｖｉｔｒｏでは、心筋細胞の機能は、例えば、心筋細胞の生存度を決定することによって、ＢＮＰ（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、心バイオマーカーである）を決定することによって、ＱＴ延長を決定することによって、および／またはミトコンドリア膜電位を決定することによって、測定される。

本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む。一実施形態は、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む、本発明に従う抗体を提供し、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、好ましくは２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性は、好ましくは５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、好ましくは４．０ｎＭ以下である。

好ましい一実施形態では、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない抗体は、以下を含む：
− 図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８からなる群から選択されるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域の、少なくともＣＤＲ３配列、好ましくは、少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、もしくは少なくとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領域配列と多くて１５アミノ酸、好ましくは多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列；ならびに／あるいは
− 図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域の、少なくともＣＤＲ３配列、好ましくは少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、もしくは少なくとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領域配列と多くて１５アミノ酸、好ましくは多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列。好ましい一実施形態では、この抗体は、ＰＢ４１８８である。

本発明の別の一態様は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む、本発明に従う抗体を提供し、この抗体は、Ｔ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０およびＲ１８１、ならびにＴ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０またはＲ１８１から約５アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−２のドメインＩの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する抗原結合部位を含む。アミノ酸残基番号付けは、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）ＩＤ＃１Ｓ７８のものである。実施例に示されるように、ＥｒｂＢ−２のドメインＩのこの領域に結合する抗体は、特に良好な結合特徴を示し、これらは、ＥｒｂＢ−２陽性細胞の活性（例えば、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能ならびに／またはかかる細胞のリガンド誘導性成長）に対抗することが可能である。さらに、かかる抗体は、トラスツズマブ（ＥｒｂＢ−２のドメインＩＶに結合する）およびペルツズマブ（ＥｒｂＢ−２のドメインＩＩに結合する）などの現在公知の抗ＥｒｂＢ−２モノクローナル抗体との組み合わせ治療に特に適切であるが、それは、これらが、ＥｒｂＢ−２の異なるドメインに結合するからである。従って、これらの抗体は、同じエピトープについての競合なしに、同時に使用できる。用語「Ｔ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０またはＲ１８１から約５アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基」とは、列挙された残基に隣接する最初の約５つのアミノ酸残基以内に位置する一次アミノ酸配列中にあり、タンパク質の外側に少なくとも一部露出しており、その結果、抗体によって結合され得る、アミノ酸残基を指す（例えば図２１Ｂを参照のこと）。好ましくは、Ｔ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０またはＲ１８１から約５アミノ酸位置以内に位置するアミノ酸残基は、Ｌ１３９、Ｃ１４０、Ｙ１４１、Ｑ１４２、Ｄ１４３、Ｉ１４５、Ｌ１４６、Ｗ１４７、Ｋ１４８、Ｄ１４９、Ｌ１５９、Ｔ１６０、Ｌ１６１、Ｉ１６２、Ｄ１６３、Ｎ１６５、Ｓ１６７、Ｒ１６８、Ａ１６９、Ｃ１７０、Ｈ１７１、Ｃ１７３、Ｓ１７４、Ｐ１７５、Ｍ１７６、Ｃ１７７、Ｋ１７８、Ｃ１８２、Ｗ１８３、Ｇ１８４、Ｅ１８５およびＳ１８６からなる群から選択される。好ましくは、この抗体は、Ｔ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０およびＲ１８１、ならびにＴ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０またはＲ１８１から約５アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−２のドメインＩの少なくとも２つまたは少なくとも３つのアミノ酸残基に結合する抗原結合部位を含む。

好ましい一実施形態では、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、この抗体は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩのＴ１４４、Ｒ１６６およびＲ１８１を少なくとも結合する抗原結合部位を含む。別の一実施形態は、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩのＴ１４４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９およびＲ１８１を少なくとも結合する抗原結合部位を含む。別の一実施形態は、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩのＴ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０およびＲ１８１を少なくとも結合する抗原結合部位を含む。

本発明の別の一態様は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む抗体を提供し、この抗体は、Ｒ４２６およびネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。アミノ酸残基番号付けは、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）ＩＤ＃４Ｐ５９のものである。実施例に示されるように、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩのこの領域に結合する抗体は、特に良好な結合特徴を示し、これらは、ＥｒｂＢ−３陽性細胞の活性（例えば、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能ならびに／またはかかる細胞のリガンド誘導性成長）に対抗することが可能である。用語「ネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基」とは、Ｒ４２６から１１．２Å以内に空間的に位置するＥｒｂＢ−３タンパク質の三次構造中にあり、タンパク質の外側に少なくとも一部露出しており、その結果、抗体によって結合され得る、アミノ酸残基を指す。好ましくは、ネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置するアミノ酸残基は、Ｌ４２３、Ｙ４２４、Ｎ４２５、Ｇ４２７、Ｇ４５２、Ｒ４５３、Ｙ４５５、Ｅ４８０、Ｒ４８１、Ｌ４８２、Ｄ４８３およびＫ４８５からなる群から選択される（例えば、図２１Ｃおよび表１５を参照のこと）。好ましい一実施形態では、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、この抗体は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩのＲ４２６と少なくとも結合する抗原結合部位を含む。好ましくは、この抗体は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩのＲ４２６と少なくとも結合する抗原結合部位を含む。

本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、ＡＤＣＣ活性を増強するために非フコシル化されている。本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、正常ＣＨＯ細胞中で産生される同じ抗体と比較した場合、Ｆｃ領域中に、Ｎ結合型炭水化物構造の、低減された量のフコシル化を含む。

本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、ヒトにおいて使用される。この目的のために、本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。

ポリペプチドに対するヒトの寛容は、多くの異なる局面によって支配される。Ｔ細胞媒介性、Ｂ細胞媒介性などである免疫は、ポリペプチドに対するヒトの寛容に包含される変数の１つである。本発明の二重特異性抗体の定常領域は、好ましくは、ヒト定常領域である。この定常領域は、天然に存在するヒト抗体の定常領域と、１または複数の、好ましくは１０以下の、好ましくは５アミノ酸以下の差異を含み得る。定常部分が、天然に存在するヒト抗体に完全に由来することが好ましい。本明細書で産生される種々の抗体は、ヒト抗体可変ドメイン・ライブラリーに由来する。かかるこれらの可変ドメインは、ヒトのものである。ユニークなＣＤＲ領域は、ヒト由来、合成、または別の生物由来であり得る。可変領域は、ＣＤＲ領域を別にして、天然に存在するヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する場合、ヒト可変領域とみなされる。本発明の抗体中のＥｒｂＢ−２に結合するＶＨ、ＥｒｂＢ−３に結合するＶＨまたは軽鎖の可変領域は、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列中の潜在的差異を数に入れずに、天然に存在するヒト抗体の可変領域と、１または複数の、好ましくは１０以下の、好ましくは５アミノ酸以下の差異を含み得る。かかる変異は、体細胞超変異に関しても天然に存在する。

抗体は、重鎖可変領域に関しては少なくとも、種々の動物種由来であり得る。例えば、マウス重鎖可変領域などをヒト化することは、一般的実務である。マウス重鎖可変領域の３Ｄ構造とマッチする３Ｄ構造を有するヒト重鎖可変領域中へのＣＤＲ移植；マウス重鎖可変領域から既知のまたは疑わしいＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープを除去することによって好ましくは実施される、マウス重鎖可変領域の脱免疫化がその中にある、これが達成され得る種々の方法が存在する。この除去は、典型的には、エピトープ中のアミノ酸のうちの１または複数を、別の（典型的には保存的）アミノ酸に置換することによるものであり、その結果、エピトープの配列は、もはやＴ細胞エピトープでもＢ細胞エピトープでもないように、改変される。

かかる脱免疫化されたマウス重鎖可変領域は、元のマウス重鎖可変領域よりも、ヒトにおいて免疫原性が低い。好ましくは、本発明の可変領域またはドメインは、さらにヒト化、例えば、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）などされる。ベニヤ化技術を使用することによって、免疫系が容易に遭遇する外面残基は、弱い免疫原性のベニヤ化表面または実質的に非免疫原性のベニヤ化表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供するために、ヒト残基で選択的に置き換えられる。本発明において使用される動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。

本発明に従う二重特異性抗体は、好ましくは、ヒト抗体の定常領域を含む。重鎖定常ドメインにおける差異に従って、抗体は、５つのクラスまたはアイソタイプにグループ分けされる：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ。これらのクラスまたはアイソタイプは、対応するギリシャ文字を用いて名付けられた、上記重鎖のうち少なくとも１つを含む。好ましい一実施形態では、本発明は、本発明に従う抗体を提供し、その定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥの定常領域の群から選択され、より好ましくは、この定常領域は、ＩｇＧ定常領域、より好ましくはＩｇＧ１定常領域、好ましくは変異したＩｇＧ１定常領域を含む。例えば、アロタイプＧ１ｍ１、１７およびＧ１ｍ３などの、ＩｇＧ１の定常領域におけるいくつかのバリエーションが、天然に存在し、ならびに／または得られた抗体の免疫学的特性を変化させることなしに許容される。典型的には、約１〜１０のアミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせが、定常領域において許容される。

本発明は、一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、この抗体は、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８からなる群から選択されるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を少なくとも含み、またはこの抗体は、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む。この抗体は、好ましくは、ＭＦ１８４９、ＭＦ２９７１、ＭＦ３９５８、ＭＦ３００４またはＭＦ３９９１の少なくともＣＤＲ３配列を含み、最も好ましくはＭＦ３９５８の少なくともＣＤＲ３配列を含む。

この抗体は、好ましくは、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８からなる群から選択されるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、またはＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３もしくはＭＦ１８９８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なる、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。この抗体は、好ましくは、ＭＦ１８４９、ＭＦ２９７１、ＭＦ３９５８、ＭＦ３００４またはＭＦ３９９１の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、最も好ましくはＭＦ３９５８の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

本発明は、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体もまた提供し、この抗体は、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を少なくとも含み、またはこの抗体は、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む。この抗体は、好ましくは、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１またはＭＦ６０６５の少なくともＣＤＲ３配列を含み、最も好ましくはＭＦ３１７８の少なくともＣＤＲ３配列を含む。

この抗体は、好ましくは、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、またはＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なる、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を、少なくとも含む。この抗体は、好ましくは、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１またはＭＦ６０６５の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、最も好ましくは、ＭＦ３１７８の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

本発明は、一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８からなる群から選択されるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列、または図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なる、重鎖ＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列、または図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なる重鎖ＣＤＲ３配列を少なくとも含む。この第１の抗原結合部位は、好ましくは、ＭＦ１８４９、ＭＦ２９７１、ＭＦ３９５８、ＭＦ３００４またはＭＦ３９９１の少なくともＣＤＲ３配列、最も好ましくは、ＭＦ３９５８の少なくともＣＤＲ３配列を含み、第２の抗原結合部位は、好ましくは、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１またはＭＦ６０６５の少なくともＣＤＲ３配列、最も好ましくは、ＭＦ３１７８の少なくともＣＤＲ３配列を含む。

この第１の抗原結合部位は、好ましくは、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８からなる群から選択されるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、またはＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３もしくはＭＦ１８９８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なる、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、好ましくは、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なる、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含む。この第１の抗原結合部位は、好ましくは、ＭＦ１８４９、ＭＦ２９７１、ＭＦ３９５８、ＭＦ３００４またはＭＦ３９９１の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、最も好ましくは、ＭＦ３９５８の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、第２の抗原結合部位は、好ましくは、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１またはＭＦ６０６５の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、最も好ましくは、ＭＦ３１７８の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

好ましい一実施形態は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＭＦ３９５８のＣＤＲ３配列、またはＭＦ３９５８のＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なるＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、ＭＦ３１７８のＣＤＲ３配列、またはＭＦ３１７８のＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なるＣＤＲ３配列を少なくとも含む。

本発明は、一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＭＦ３９５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、またはＭＦ３９５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、ＭＦ３１７８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、またはＭＦ３１７８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含む。

本発明は、一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＭＦ３９５８のＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、ＭＦ３１７８のＣＤＲ３配列を少なくとも含む。

本発明は、一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＭＦ３９５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、ＭＦ３１７８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含む。

ＣＤＲ配列は、好ましくは、抗体の結合効力または安定性を改善するために、例えば、最適化目的のために変化させられる。最適化は、例えば変異誘発手順によって実施され、その後、得られた抗体の安定性および／または結合親和性が好ましくは試験され、改善されたＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３特異的ＣＤＲ配列が好ましくは選択される。当業者は、本発明に従う少なくとも１つの変更されたＣＤＲ配列を含む抗体バリアントを作製することが十分に可能である。例えば、保存的アミノ酸置換が適用される。保存的アミノ酸置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの疎水性残基の、別の疎水性残基への置換、および１つの極性残基の別の極性残基への置換、例えば、アルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、またはグルタミンのアスパラギンへの置換が含まれる。

本発明は、一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、この可変ドメインのＶＨ鎖は、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＶＨ鎖ＭＦ２９２６；ＭＦ２９３０；ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３；ＭＦ３００４；ＭＦ３９５８（ヒト化ＭＦ２９７１である）；ＭＦ２９７１；ＭＦ３０２５；ＭＦ２９１６；ＭＦ３９９１（ヒト化ＭＦ３００４である）；ＭＦ３０３１；ＭＦ２８８９；ＭＦ２９１３；ＭＦ１８４７；ＭＦ３００１、ＭＦ３００３もしくはＭＦ１８９８のアミノ酸配列を含み、または図１６Ａもしくは図１６Ｅの上述のＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＶＨ鎖ＭＦ２９２６；ＭＦ２９３０；ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３；ＭＦ３００４；ＭＦ３９５８（ヒト化ＭＦ２９７１である）；ＭＦ２９７１；ＭＦ３０２５；ＭＦ２９１６；ＭＦ３９９１（ヒト化ＭＦ３００４である）；ＭＦ３０３１；ＭＦ２８８９；ＭＦ２９１３；ＭＦ１８４７；ＭＦ３００１、ＭＦ３００３もしくはＭＦ１８９８のアミノ酸配列を含む。ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、図１６Ａに示されるように、以下のアミノ酸配列を含む：
− ＭＦ１８４９；または
− ＭＦ２９７１もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含む；または
− ＭＦ３００４もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、ＭＦ３９９１のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、以下のアミノ酸配列を含む：ＶＨ鎖ＭＦ１８４９；またはＭＦ２９７１もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含む；またはＭＦ３００４もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、ＭＦ３９９１のアミノ酸配列を含み、ここで、列挙されたＶＨ配列は、図１６Ａに示されるそれぞれの配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、より好ましくは多くて１、２、３、４または５アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有する。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含み、またはこのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ａに示されるＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含む。ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインを含む抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを好ましくはさらに含む二重特異性抗体である。Ｅｒｂ−Ｂ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４のアミノ酸配列を含み、または図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７のＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４のアミノ酸配列を含む。Ｅｒｂ−Ｂ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のアミノ酸配列を含み、または図１６Ｂもしくは図３７のそれぞれのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含み、またはこのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ｂに示されるＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含む。好ましくは、上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、ＣＤＲ３領域中には存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域中にも存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、ＦＲ４領域中にも存在しない。

本発明は、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体をさらに提供し、この可変領域のＶＨ鎖は、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４のアミノ酸配列を含み、またはこのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４のアミノ酸配列を含む。ＥｒｂＢ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、ＶＨ鎖ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のアミノ酸配列を含み、またはこのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、ＶＨ鎖ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、図１６Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含み、またはこのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含む。ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインを好ましくはさらに含む二重特異性抗体である。ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、図１６Ａもしくは図１６ＥのＶＨ鎖のアミノ酸配列を含む。ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、図１６Ａに示されるように、以下のアミノ酸配列を含む：ＭＦ１８４９；またはＭＦ２９７１もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含む；またはＭＦ３００４もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、ＭＦ３９９１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、列挙されたＥｒｂ−Ｂ２結合ＶＨ配列は、図１６Ａに示されるそれぞれの配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、より好ましくは多くて１、２、３、４または５アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有する。好ましい一実施形態では、図１６ＡのＥｒｂＢ−２結合ＶＨ鎖は、ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含み、またはこのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含む。好ましくは、上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、ＣＤＲ３領域中には存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域中にも存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、ＦＲ４領域中にも存在しない。

本発明に従う抗体がさらに提供され、この抗体は、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域配列を含み、またはこの抗体は、ＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３もしくはＭＦ１８９８の重鎖可変領域配列と、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸が異なる、重鎖可変領域配列を含む。

本発明に従う抗体がさらに提供され、この抗体は、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域配列を含み、またはこの抗体は、ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４の重鎖可変領域配列と、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸が異なる、重鎖可変領域配列を含む。

本発明は、一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する２つの抗原結合部位を含む抗体を提供し、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する。本発明に従うかかる抗体は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合しない現在使用されている抗ＥｒｂＢ−２結合分子、例えば、ＥｒｂＢ−２のドメインＩＶに結合するトラスツズマブおよびＥｒｂＢ−２のドメインＩＩに結合するペルツズマブとの組み合わせ治療に特に適切であるが、それは、これらの異なる結合分子が、同じエピトープについて互いと競合しないからである。

ＥｒｂＢ−２に結合する２つの抗原結合部位を含む抗体がさらに提供され、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方は、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合し、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは３．９ｎＭ以下である。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する。好ましい一実施形態では、ＳＫ−ＢＲ−３細胞上のＥｒｂＢ−２に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性は、５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは４．０ｎＭ以下、より好ましくは３．５ｎＭ以下、より好ましくは３．０ｎＭ以下、より好ましくは２．３ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、３．０〜１．６ｎＭの範囲内である。好ましい一実施形態では、ＢＴ−４７４細胞上のＥｒｂＢ−２に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性は、５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、より好ましくは３．９ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、４．５〜３．３ｎＭの範囲内である。

上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して４℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。

本発明は、ＥｒｂＢ−２に結合する２つの可変ドメインを含む抗体をさらに提供し、これらの可変ドメインのＶＨ鎖は、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＶＨ鎖ＭＦ２９２６；ＭＦ２９３０；ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３；ＭＦ３００４；ＭＦ３９５８（ヒト化ＭＦ２９７１である）；ＭＦ２９７１；ＭＦ３０２５；ＭＦ２９１６；ＭＦ３９９１（ヒト化ＭＦ３００４である）；ＭＦ３０３１；ＭＦ２８８９；ＭＦ２９１３；ＭＦ１８４７；ＭＦ３００１、ＭＦ３００３もしくはＭＦ１８９８のアミノ酸配列、または図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるそれぞれの配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＶＨ鎖ＭＦ２９２６；ＭＦ２９３０；ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３；ＭＦ３００４；ＭＦ３９５８（ヒト化ＭＦ２９７１である）；ＭＦ２９７１；ＭＦ３０２５；ＭＦ２９１６；ＭＦ３９９１（ヒト化ＭＦ３００４である）；ＭＦ３０３１；ＭＦ２８８９；ＭＦ２９１３；ＭＦ１８４７；ＭＦ３００１、ＭＦ３００３もしくはＭＦ１８９８のアミノ酸配列を含む。このＶＨは、好ましくは、以下のアミノ酸配列を含む：ＶＨ鎖ＭＦ１８４９；またはＭＦ２９７１もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含む；またはＭＦ３００４もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、図１６Ａに示されるＭＦ３９９１のアミノ酸配列を含む、；あるいは、このＶＨは、以下のアミノ酸配列を含む：ＶＨ鎖ＭＦ１８４９；またはＭＦ２９７１もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含む；またはＭＦ３００４もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、図１６Ａに示されるそれぞれの配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ａに示されるＭＦ３９９１のアミノ酸配列を含む。抗体のこれらの可変ドメインは、好ましくは、図１６Ａまたは図１６Ｅに示される配列を好ましくは有する、同一のＶＨ鎖を含む。同一のＶＨ鎖を有する可変ドメインを有する抗体は、二重特異性抗体ではない。ＶＨ鎖は、図１６Ａもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるのと同じＶＨ鎖配列、または図１６Ａもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるそれぞれの配列に関して、１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを別にして同じＶＨ鎖配列を含む場合、本発明にとって同一である。

本発明は、一実施形態では、ＥｒｂＢ−３に結合する２つの抗原結合部位を含む抗体を提供し、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する。本発明に従うかかる抗体は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合しない現在使用されている抗ＥｒｂＢ−３結合分子、例えば、ＥｒｂＢ−３のドメインＩに結合するＭＭ−１２１（＃Ａｂ６）およびＲＧ７１１６との組み合わせ治療に特に適切であるが、それは、これらの異なる結合分子が、同じエピトープについて互いと競合しないからである。

ＥｒｂＢ−３に結合する２つの抗原結合部位を含む抗体がさらに提供され、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合し、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、２．０ｎＭ以下、好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する。好ましい一実施形態では、ＳＫ−ＢＲ−３細胞上のＥｒｂＢ−３に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性は、２．０ｎＭ以下、好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、１．３９〜０．５９ｎＭの範囲内である。好ましい一実施形態では、ＢＴ−４７４細胞上のＥｒｂＢ−３に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性は、２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１．０ｎＭ以下、より好ましくは０．５ｎＭ以下、より好ましくは０．３１ｎＭ以下、より好ましくは０．２３ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性は、０．３１〜０．１５ｎＭの範囲内である。

本発明は、各々がＥｒｂＢ３に結合する２つの可変ドメインを含む抗体をさらに提供し、これらの可変ドメインのＶＨは、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４のアミノ酸配列を含み、またはこれらのＶＨ鎖配列のいずれかに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、ＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４のアミノ酸配列を含む。このＶＨは、好ましくは、ＶＨ鎖ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のアミノ酸配列を含み、またはこれらのＶＨ鎖配列のいずれかに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、ＶＨ鎖ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のアミノ酸配列を含む。このＶＨは、好ましくは、ＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含み、またはＭＦ３１７８のＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含む。抗体のこれらの可変ドメインは、好ましくは、図１６Ｂまたは図１６Ｅまたは図３７に示される配列を好ましくは有する、同一のＶＨ鎖を含む。同一のＶＨ鎖を有する可変ドメインを有する抗体は、二重特異性抗体ではない。ＶＨ鎖は、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるのと同じＶＨ鎖配列、または図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７のＶＨ鎖配列に関して、１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを別にして同じＶＨ鎖配列を含む場合、同一とする。

ＥｒｂＢ−３に特異的な、本発明に従う単一特異性抗体は、例えばＭＭ−１２１（＃Ａｂ６）などの先行技術の化合物と比較して、ＥｒｂＢ−３に対してより優れた機能的活性を有するという利点を有し、これは、本発明に従うこれらの抗体が、ＥｒｂＢ−３活性（例えば、ＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能ならびに／またはＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞のリガンド誘導性成長）により良く対抗することが可能であることを意味する。これは、例えば、表７および図３８に示される。

好ましい一実施形態では、本発明は、ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体を提供し、この可変ドメインのＶＨ鎖は、以下のアミノ酸配列を含む：
− ＶＨ鎖ＭＦ１８４９；またはＭＦ２９７１もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含む；またはＭＦ３００４もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、図１６Ａに示されるＭＦ３９９１のアミノ酸配列を含む；あるいは
− ＶＨ鎖ＭＦ１８４９またはＭＦ２９７１もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含む；またはＭＦ３００４もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ａに示されるＭＦ３９９１のアミノ酸配列を含む。この実施形態に従うかかる二重特異性抗体は、さらに好ましくは、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む。ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４のアミノ酸配列を含み、または最も好ましくは、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７のＶＨ鎖配列のいずれかに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４のアミノ酸配列を含む。ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、図１６Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含み、または図１６ＢのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含む。

本発明は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインおよびＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体を提供し、
ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１６Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９５８のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９５８のアミノ酸配列を含み、ならびに
ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１６Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列；または
− 図１６ＢのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含む。

本発明は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインおよびＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体を提供し、
ＥｒｂＢ−２に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１６Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９１のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９１のアミノ酸配列を含み；ならびに
ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１６Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、または
− 図１６ＢのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含む。

図１６中の配列と比較した場合、ＶＨ鎖の挙動は、典型的には、このＶＨ鎖が、図１６に示されるＶＨ鎖のアミノ酸配列に関して、１５アミノ酸超の変化を有する場合、著しく異なり始める。図１６に示されるＶＨ鎖に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有するＶＨ鎖は、図１６に示されるＶＨ鎖に関して、１、２、３、４または５アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、図１６に示されるＶＨ鎖に関して、好ましくは１、２、３または４の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、好ましくは１、２または３の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、より好ましくは１または２の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、好ましくは１の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを、好ましくは有する。この１または複数のアミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせは、好ましくは、ＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域中には存在しない。これらは、好ましくは、ＦＲ４領域中にも存在しない。アミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。

好ましい一実施形態では、本発明は、図１６Ｄに示されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体、または図１６Ｄの配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ｄの二重特異性抗体を提供し、この多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。この挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせは、好ましくは、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域中には存在せず、好ましくは、ＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域中には存在せず、好ましくは、ＦＲ４領域中には存在しない。

ヒト背景において非ヒト残基の含量を最小化することに向け、合理的方法が進化している。種々の方法が、二重特異性抗体の抗原結合特性を別の抗体に首尾よく移植するために利用可能である。抗体の結合特性は、圧倒的に、まさにＣＤＲ３領域の配列にあり、これは、全体としての可変ドメインの適切な構造と組み合わせた、可変ドメイン中のＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域の配列によってしばしば支持される。種々の方法が、ＣＤＲ領域を別の抗体の適切な可変ドメインに移植するために、現在利用可能である。これらの方法の一部は、本明細書に参照により含まれる、Ｊ．Ｃ．Ａｌｍａｇｒｏ１およびＪ．Ｆｒａｎｓｓｏｎ（２００８）ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ１３、１６１９〜１６３３において概説されている。従って、本発明は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含むヒトまたはヒト化二重特異性抗体をさらに提供し、ＥｒｂＢ−２結合部位を含む可変ドメインは、図１６Ａまたは図１６Ｅに示されるＶＨＣＤＲ３配列を含み、ＥｒｂＢ−３結合部位を含む可変ドメインは、図１６Ｂまたは図１６Ｅまたは図３７に示されるＶＨＣＤＲ３領域を含む。ＥｒｂＢ−２結合部位を含むＶＨ可変領域は、好ましくは、図１６Ａまたは図１６Ｅ中のＶＨ鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域の配列を含む。ＥｒｂＢ−３結合部位を含むＶＨ可変領域は、好ましくは、図１６Ｂまたは図１６Ｅまたは図３７中のＶＨ鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域の配列を含む。ＣＤＲ移植は、図１６または図３７のＶＨのＣＤＲ領域を有するが、異なるフレームワークを有する、ＶＨ鎖を産生するためにも使用され得る。異なるフレームワークは、別のヒトＶＨまたは異なる哺乳動物のものであり得る。

上述の多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせは、好ましくは、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域中には存在せず、好ましくは、ＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３領域中には存在せず、好ましくは、ＦＲ４領域中には存在しない。

図１６または図３７に示される可変重鎖配列を含む可変ドメインの軽鎖は、好ましくは、生殖系列軽鎖Ｏ１２、好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１またはその断片もしくは機能的誘導体である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおけるＩＭＧＴデータベース・ワールドワイド・ウェブに従う命名法）。用語、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１、ＩＧＫＶ１−３９／ＩＧＫＪ１、ｈｕＶκ１−３９軽鎖または短くｈｕＶκ１−３９が使用される。この軽鎖は、１、２、３、４または５アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有し得る。上述の１、２、３、４または５アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせは、好ましくは、ＶＬ鎖のＣＤＲ３領域中には存在せず、好ましくは、ＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３領域またはＦＲ４領域中には存在しない。

種々の方法が、二重特異性抗体を産生するために利用可能である。１つの方法には、１つの細胞における２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖の発現、ならびに細胞によって産生される抗体を収集することを伴う。この方法で産生された抗体は、典型的には、重鎖および軽鎖の異なる組み合わせを有する一群の抗体を含み、その一部は、所望の二重特異性抗体である。この二重特異性抗体は、引き続いて、この一群の抗体から精製され得る。細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性抗体の比率は、種々の方法で増加され得る。本発明の好ましい一実施形態では、この比率は、細胞において、２つの異なる軽鎖を発現させず、２つの本質的に同一の軽鎖を発現させることによって、増加される。この概念は、当技術分野で、「共通の軽鎖」方法とも呼ばれる。本質的に同一な軽鎖が、２つの異なる重鎖と一緒に機能して、異なる抗原結合部位および付随する異なる結合特性を有する可変ドメインの形成を可能にする場合、その細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性抗体の比率は、２つの異なる軽鎖の発現よりも顕著に改善される。細胞によって産生される二重特異性抗体の比率は、２つの同一の重鎖のペアリングよりも、２つの異なる重鎖の互いとのペアリングを刺激することによって、さらに改善され得る。当技術分野は、重鎖のかかるヘテロ二量体化が達成され得る種々の方法を記載している。１つの方法は、「ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂｉｎｔｏｈｏｌｅ）」二重特異性抗体を作製することである。米国特許出願公開第２００３００７８３８５号（Ａｒａｔｈｏｏｎら、−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を参照のこと。別の好ましい方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６１／６３５，９３５号とそれに続く米国特許出願第１３／８６６，７４７およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４（ＷＯ２０１３／１５７９５４Ａ１）に記載されている。単一細胞から二重特異性抗体を産生するための方法および手段は、開示されており、それによって、単一特異性抗体の形成よりも、二重特異性抗体の形成が優先される手段が提供される。これらの方法は、本発明においても好ましく使用され得る。従って、本発明は、（単一細胞から）本発明に従う二重特異性抗体を産生するための方法を提供し、この二重特異性抗体は、接触面を形成することが可能な２つのＣＨ３ドメインを含み、この方法は、この細胞に、ａ）第１のＣＨ３ドメイン含有重鎖をコードする第１の核酸分子、ｂ）第２のＣＨ３ドメイン含有重鎖をコードする第２の核酸分子を用意することを含み、これらの核酸分子には、第１および第２のＣＨ３ドメイン含有重鎖の優先的ペアリングのための手段が提供され、この方法は、宿主細胞を培養するステップ、およびこれら２つの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性抗体を回収するステップをさらに含む。この第１および第２の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクターまたは遺伝子導入ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同じ部位において組み込まれ得る。あるいは、この第１および第２の核酸分子は、上記細胞に別々に提供される。

好ましい一実施形態は、（単一細胞から）本発明に従う二重特異性抗体を産生するための方法を提供し、この二重特異性抗体は、接触面を形成することが可能な２つのＣＨ３ドメインを含み、この方法は、
− ａ）ＥｒｂＢ−２に結合し、第１のＣＨ３ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第１の核酸分子、およびｂ）ＥｒｂＢ−３に結合し、第２のＣＨ３ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第２の核酸分子を有する細胞を用意するステップを含み、これらの核酸分子には、これら第１および第２のＣＨ３ドメインの優先的ペアリングのための手段が提供され、
この方法は、上記細胞を培養するステップ、およびこれら２つの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性ＩｇＧ抗体を回収するステップをさらに含む。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、共通の軽鎖をコードする第３の核酸分子もまた有する。この第１、第２および第３の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクターまたは遺伝子導入ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同じ部位において組み込まれ得る。あるいは、この第１、第２および第３の核酸分子は、上記細胞に別々に提供される。好ましい共通の軽鎖は、上記のように、Ｏ１２、好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶκ１３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１である。この第１および第２のＣＨ３ドメインの優先的ペアリングのための手段は、好ましくは、重鎖コード領域のＣＨ３ドメイン中の、対応する変異である。本質的に二重特異性抗体のみを産生するための好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１ＫおよびＴ３６６Ｋ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、ならびに第２のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅであり、または逆もまた然りである。従って、二重特異性抗体を産生するための本発明に従う方法がさらに提供され、上記第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１ＫおよびＴ３６６Ｋ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、この方法は、上記細胞を培養するステップ、およびこれらの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性抗体を回収するステップをさらに含む。二重特異性抗体を産生するための本発明に従う方法もまた提供され、上記第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１ＫおよびＴ３６６Ｋを含み、この方法は、上記細胞を培養するステップ、およびこれらの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性抗体を回収するステップをさらに含む。これらの方法によって産生され得る抗体もまた、本発明の一部である。これらのＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、ＩｇＧ１ヘテロ二量体化ドメインである。これらのＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくは、ＩｇＧ１定常領域である。

一実施形態では、本発明は、本発明に従う抗体重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。核酸分子（典型的には、ｉｎｖｉｔｒｏの、単離されたまたは組換え核酸）は、好ましくは、図１６Ａもしくは図１６Ｂもしくは図３７に示される重鎖可変領域、または１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１６Ａもしくは図１６Ｂもしくは図３７に示される重鎖可変領域をコードする。好ましい一実施形態では、この核酸分子は、図１６または図３７に示される配列を含む。別の好ましい一実施形態では、この核酸分子は、図１６または図３７に示される核酸と同じアミノ酸配列をコードするが、１または複数の異なるコドンをコードするので、異なる配列を有する。例えば、かかる核酸分子は、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞またはＰＥＲ−Ｃ６（商標）細胞などの抗体産生細胞のためにコドン最適化される。本発明は、図１６Ｄまたは図３７の重鎖をコードする核酸配列をさらに提供する。

本発明で使用される核酸分子は、排他的ではないが典型的には、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。代替的な核酸は、当業者に入手可能である。本発明に従う核酸は、例えば、細胞中に含まれる。この核酸が細胞において発現される場合、この細胞は、本発明に従う抗体を産生する。従って、本発明は、一実施形態では、本発明に従う抗体および／または本発明に従う核酸を含む細胞を提供する。この細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の目的のために、適切な細胞は、本発明に従う抗体および／または本発明に従う核酸を含むことが可能な、好ましくはそれを産生することが可能な、任意の細胞である。

本発明は、本発明に従う抗体を含む細胞をさらに提供する。好ましくは、この細胞（典型的には、ｉｎｖｉｔｒｏの、単離されたまたは組換え細胞）は、この抗体を産生する。好ましい一実施形態では、この細胞は、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞またはＰＥＲ−Ｃ６（商標）細胞である。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明に従う細胞を含む細胞培養物がさらに提供される。種々の機関および会社が、例えば臨床使用のために、抗体の大規模産生のための細胞株を開発している。かかる細胞株の非限定的な例は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞またはＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞である。これらの細胞は、タンパク質の産生などの他の目的のためにも使用される。タンパク質および抗体の産業規模産生のために開発された細胞株は、本明細書で、産業的細胞株とさらに呼ばれる。従って、好ましい一実施形態では、本発明は、本発明の抗体の産生のための、抗体の大規模産生のために開発された細胞株の使用を提供する。

本発明は、本発明の細胞を培養すること、およびこの培養物から抗体を回収することを含む、抗体の生産方法をさらに提供する。好ましくは、この細胞は、無血清培地中で培養される。好ましくは、この細胞は、浮遊成長（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｇｒｏｗｔｈ）に適応される。本発明に従う抗体の生産方法によって得ることができる抗体が、さらに提供される。この抗体は、好ましくは、培養の培地から精製される。好ましくは、この抗体は、アフィニティ精製される。

本発明の細胞は、例えば、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、または臨床目的のための抗体産生についてのその適切性が既知の別の細胞型である。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、ヒト細胞である。好ましくは、アデノウイルスＥ１領域またはその機能的等価物によって形質転換された細胞。かかる細胞株の好ましい例は、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞株またはその等価物である。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、ＣＨＯ細胞またはそのバリアントである。好ましくは、抗体の発現のためにグルタミン・シンテターゼ（ＧＳ）ベクター系を使用するバリアント。

本発明は、本発明に従う抗体を含む、組成物、好ましくは医薬組成物をさらに提供する。この医薬組成物は、好ましくは、（医薬的に許容される）賦形剤または担体を含む。好ましい一実施形態では、この医薬組成物は、５〜５０ｍＭのヒスチジン、１００〜３００ｍＭのトレハロース、０．１〜０３ｇ／Ｌのポリソルベート２０またはそれらの組み合わせを含む。ｐＨは、好ましくは、ｐＨ＝５．５〜６．５に設定される。好ましい一実施形態では、この医薬組成物は、２５ｍＭのヒスチジン、２２０ｍＭのトレハロース、０．２ｇ／Ｌのポリソルベート２０またはそれらの組み合わせを含む。ｐＨは、好ましくはｐＨ＝５．５〜６．５、最も好ましくはｐＨ＝６に設定される。

本発明の抗体は、好ましくは、標識、好ましくは、ｉｎｖｉｖｏ画像化のための標識をさらに含む。かかる標識は、典型的には、治療的適用には必要でない。例えば診断設定では、例えば、身体中の標的細胞を可視化する際に、標識は有用であり得る。種々の標識が適しており、多くが当技術分野で周知である。好ましい一実施形態では、この標識は、検出のための放射活性標識である。別の好ましい一実施形態では、この標識は、赤外標識である。好ましくは、この赤外標識は、ｉｎｖｉｖｏ画像化に適している。種々の赤外標識が、当業者に入手可能である。好ましい赤外標識は、例えば、ＩＲＤｙｅ８００；ＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ；ＩＲＤｙｅ６８０ＬＴ；ＩＲＤｙｅ７５０；ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ；ＩＲＤｙｅ８００ＲＳＩＲＤｙｅ６５０；ＩＲＤｙｅ７００ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）；ＩＲＤｙｅ８００ホスホロアミダイト（ＬＩ−ＣＯＲＵＳＡ；４６４７ＳｕｐｅｒｉｏｒＳｔｒｅｅｔ；Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）である。

本発明は、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、本発明に従う抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。この処置の開始前に、この方法は、好ましくは、対象が、かかるＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有するかどうか、またはそのリスクがあるかどうかを決定することを含む。一部の実施形態では、この対象は、ＥｒｂＢ−２について［＋］または［＋＋］と分類される。別の一実施形態では、この対象は、ＥｒｂＢ−２について［＋＋＋］と分類される。本発明は、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明の抗体をさらに提供する。代替的に考案すると、本発明は、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍の処置のための医薬または予防剤の製造のための、本発明に従う抗体の使用を提供する。本明細書で使用する場合、用語、処置は、予防を包含する。

この腫瘍は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性癌である。好ましくは、この陽性癌は、乳癌、例えば、早期乳癌である。しかし、本発明は、広範なＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性癌、例えば、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、黒色腫などに適用され得る。本発明に従う抗体は、典型的には、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。従って、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌もしくは黒色腫を有する、またはそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む抗体がさらに提供され、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。このＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、好ましくは２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性は、好ましくは５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、好ましくは４．０ｎＭ以下である。好ましい一実施形態では、この抗体は、抗体ＰＢ４１８８である。

従って、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌もしくは黒色腫を有する、またはそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む抗体がさらに提供され、本発明に従うこの抗体は、Ｔ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０およびＲ１８１、ならびにＴ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０もしくはＲ１８１から約５アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−２のドメインＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含み、ならびに／または本発明に従うこの抗体は、好ましくは、Ｒ４２６およびネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。

この対象は、好ましくはヒト対象である。この対象は、好ましくは、トラスツズマブなどのＥｒｂＢ−２特異的抗体を使用したモノクローナル抗体治療に適格な対象である。好ましい一実施形態では、この対象は、腫瘍、好ましくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性癌、好ましくはＥｒｂＢ−２治療耐性表現型および／またはヘレグリン耐性表現型、好ましくはモノクローナル抗体耐性表現型を有する腫瘍／癌を含む。かかる表現型を伴う腫瘍は、現在の抗ＨＥＲ２レジメン、例えば（それらに限定されないが）ＥｒｂＢ−２に対するモノクローナル抗体治療を用いた処置を逃避し得る。

患者に投与される本発明に従う抗体の量は、典型的には、治療濃度域中にあり、これは、治療効果を得るために十分な量が使用されるが、その量は、許容できない程度の副作用をもたらす閾値を超えないことを意味する。所望の治療効果を得るために必要とされる抗体の量が低くなるほど、治療濃度域は典型的には大きくなる。従って、低い投薬量で十分な治療効果を発揮する本発明に従う抗体が好ましい。投薬量は、トラスツズマブについての投薬レジームの範囲中にあり得るか、またはより低くてよい。

本発明は、とりわけ、例えばＮＲＧ１−β１の上方調節などの逃避機構の存在下であっても、ＥｒｂＢ−２受容体およびＥｒｂＢ−３受容体を標的化し、癌細胞株のｉｎｖｉｔｒｏでの強力な増殖阻害およびｉｎｖｉｖｏでの腫瘍成長阻害を生じる抗体を記載する。ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３のいずれかに特異的なヒトおよびマウスＦａｂ結合アームの多様なパネルが同定された。これらは、重鎖のヘテロ二量体化を駆動するＣＨ３領域中の変異を含む相補的発現ベクター中にそれらをクローニングすることによって、二重特異性抗体として産生された。５００超の二重特異性抗体を、小規模で産生し、３つの異なる癌細胞株に対する結合アッセイおよび機能的アッセイにおいて試験した。種々の二重特異性抗体を選択し、ＢｘＰＣ３細胞株を使用する同所性異種移植モデルにおいて試験した。この細胞株は、ＥｒｂＢ−２受容体およびＥｒｂＢ−３受容体の両方を発現し、成長についてＥｒｂＢ−３リガンドに部分的に依存する。ＢｘＰＣ３モデルは、堅固でストリンジェントなスクリーニング・モデルである。さらに、ｉｎｖｉｖｏでの強い抗腫瘍活性は、ＪＩＭＴ−１細胞株を使用する異種移植モデルを使用して確認されている。ＪＩＭＴ−１細胞は、トラスツズマブに対して臨床的に耐性であった、乳癌を有する６２歳の患者の胸膜転移に由来する。ＪＩＭＴ−１細胞は、接着性単層として成長し、ヌード・マウスにおいて異種移植腫瘍を形成する。ＪＩＭＴ−１細胞は、そのコード配列中に同定可能な変異を示さなかった、増幅されたＨＥＲ−２癌遺伝子を有する。ＪＩＭＴ−１細胞は、ＨＥＲ−２のｍＲＮＡおよびタンパク質を過剰発現し、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３およびＨＥＲ−４のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、トラスツズマブ感受性細胞株ＳＫＢＲ−３と類似である（Ｔａｎｎｅｒら、ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ２００４）。

重要なことに、現在使用されているモノクローナル抗体トラスツズマブおよびペルツズマブ、ならびに化学化合物ラパチニブと比較して、より良い抗腫瘍効果が、本発明に従う抗体を使用して得られた。

本発明の抗体は、懸濁（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）２９３Ｆ細胞における一過的トランスフェクション後に、＞５０ｍｇ／Ｌの水準で産生され得る。これらの二重特異性抗体は、７０％超の収率で、９８％よりも高い純度に精製され得る。分析的特徴付け研究は、二価単一特異性ｌｇＧ１と匹敵する、二重特異性ｌｇＧｌ抗体プロファイルを示している。機能的活性に関して、本発明の二重特異性抗体は、トラスツズマブ＋ペルツズマブと比較して、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで優れた強度（ｐｏｔｅｎｃｙ）を実証できる。

本発明の好ましい実施形態は、組み合わせ治療を提供する。一実施形態では、本発明に従う抗体は、トラスツズマブまたはペルツズマブと組み合わされるが、それは、これらの抗体が、異なるＥｒｂＢ−２エピトープに結合し、その結果、実施例に示されるように、同じエピトープについて本発明に従う抗体と競合しないからである。別の一実施形態では、本発明に従う抗体は、ＭＭ−１２１（＃Ａｂ６）またはＲＧ７１１６（Ｒｏｃｈｅ）と組み合わされるが、それは、これらの抗体が、異なるＥｒｂＢ−３エピトープに結合し、その結果、実施例に示されるように、同じエピトープについて本発明に従う抗体と競合しないからである。

別の好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に特異的な結合化合物は、ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤および／またはＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、例えば、チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはＳｒｃ阻害剤などと組み合わされる。一実施形態では、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に特異的な結合化合物は、微小管破壊薬物、またはヒストン・デアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤と組み合わされる。驚くべきことに、本発明者らは、これらの組み合わせが使用される場合に、相乗効果を見出した。従って、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法がさらに提供され、この方法は、
− ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に特異的な結合化合物、ならびに
− ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物、およびヒストン・デアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤からなる群から選択される１または複数の化合物を対象に投与することを含む。この阻害剤は、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはＳｒｃ阻害剤を含む。このチロシン・キナーゼ阻害剤は、好ましくは、アファチニブ、ラパチニブおよび／またはネラチニブである。このＰＩ３Ｋａ阻害剤は、好ましくはＢＹＬ７１９である。一実施形態では、このＡｋｔ阻害剤は、ＭＫ−２２０６である。好ましい一実施形態では、このｍＴＯＲ阻害剤は、エベロリムスである。好ましい一実施形態では、このＳｒｃ阻害剤は、サラカチニブである。好ましい一実施形態では、この微小管破壊薬物は、パクリタキセルである。好ましい一実施形態では、このＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタットである。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に特異的な結合化合物は、ＭＭ−１１１（ＭｅｒｒｉｍａｃｋＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）である。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に特異的な結合化合物は、二重特異性抗体である。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に特異的な結合化合物は、本発明に従う二重特異性抗体である。

従って、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法がさらに提供され、この方法は、
− ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体、ならびに
− ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される１または複数の化合物を対象に投与することを含む。

ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍の処置における使用のための、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供され、この処置は、この二重特異性抗体、ならびにＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象に投与することを含む。好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を有する本発明に従う二重特異性抗体は、ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される１または複数の化合物と組み合わされる。この阻害剤は、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはＳｒｃ阻害剤を含む。このチロシン・キナーゼ阻害剤は、好ましくは、アファチニブ、ラパチニブおよび／またはネラチニブである。このＰＩ３Ｋａ阻害剤は、好ましくはＢＹＬ７１９である。一実施形態では、このＡｋｔ阻害剤は、ＭＫ−２２０６である。好ましい一実施形態では、このｍＴＯＲ阻害剤は、エベロリムスである。好ましい一実施形態では、このＳｒｃ阻害剤は、サラカチニブである。好ましい一実施形態では、この微小管破壊薬物は、パクリタキセルである。好ましい一実施形態では、このＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタットである。

このＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。一実施形態では、このＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍は、腫瘍細胞１つ当たり１．０００．０００未満のＥｒｂＢ−２細胞表面受容体を有する。

一実施形態では、ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される１または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ＢＹＬ７１９、ＭＫ−２２０６、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と組み合わされる、本発明に従う抗体は、典型的には、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。この本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、好ましくは２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性は、好ましくは５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、好ましくは４．０ｎＭ以下である。

好ましい一実施形態では、ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される１または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ＢＹＬ７１９、ＭＫ−２２０６、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と組み合わされる、本発明に従う抗体は、Ｔ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０およびＲ１８１、ならびにＴ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０またはＲ１８１から約５アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−２のドメインＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。

好ましい一実施形態では、ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される１または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ＢＹＬ７１９、ＭＫ−２２０６、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と組み合わされる、本発明に従う抗体は、Ｒ４２６およびネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。

好ましくは、図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８からなる群から選択されるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３配列、好ましくは少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、ならびに／または図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３配列、好ましくは少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、本発明に従う二重特異性抗体は、ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される１または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ＢＹＬ７１９、ＭＫ−２２０６、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と組み合わされる。

好ましい一実施形態では、
− 図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域配列、またはＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３もしくはＭＦ１８９８の重鎖可変領域配列と多くて１５アミノ酸、好ましくは多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸が異なるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域配列を含み、ならびに
− 図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域配列、またはＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３もしくはＭＦ６０７４の重鎖可変領域配列と多くて１５アミノ酸、好ましくは多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸が異なるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域配列を含む、本発明に従う二重特異性抗体は、ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される１または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ＢＹＬ７１９、ＭＫ−２２０６、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と組み合わされる。好ましい一実施形態では、抗体ＰＢ４１８８は、ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される１または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ＢＹＬ７１９、ＭＫ−２２０６、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と組み合わされる。

本発明の好ましい実施形態は、ヘレグリン・ストレス条件下での、本発明に従う抗体の使用を提供する。ヘレグリンは、ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞の成長に関与する増殖因子である。典型的には、腫瘍細胞が高レベルのヘレグリン（ヘレグリン・ストレスと呼ばれる）を発現する場合、トラスツズマブ、ペルツズマブおよびラパチニブなどの現在公知の治療は、腫瘍成長を阻害することがもはや可能ではない。この現象は、ヘレグリン耐性と呼ばれる。しかし、驚くべきことに、本発明に従う抗体は、高レベルのヘレグリンを発現する腫瘍細胞の成長に対抗することも可能である。本明細書で使用する場合、ヘレグリンの発現レベルは、細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する場合、高いとみなされる。ヘレグリン発現レベルは、例えば、腫瘍ＲＮＡを用いたｑＰＣＲを使用して（例えば、Ｓｈａｍｅｓら、ＰＬＯＳＯＮＥ、２０１３年２月、第８巻、第２号、１〜１０頁およびＹｏｎｅｓａｋａら、Ｓｃｉ．ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、第３巻、第９９号（２０１１）；１〜１１頁などに記載されている）、または血液、血漿もしくは血清サンプルを好ましくは使用する、例えばＥＬＩＳＡなどのタンパク質検出方法を使用して（例えば、Ｙｏｎｅｓａｋａら、Ｓｃｉ．ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、第３巻、第９９号（２０１１）；１〜１１頁などに記載されている）、測定される。従って、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う抗体がさらに提供され、この腫瘍の細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。この本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位を含む。ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象の処置のための方法もまた提供され、この腫瘍の細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有し、この方法は、本発明に従う抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。好ましい一実施形態は、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍の処置のための医薬の調製のための本発明に従う抗体の使用を提供し、この腫瘍の細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。このＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。従って、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌もしくは黒色腫、好ましくは乳癌、を有するまたは有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う抗体がさらに提供され、この癌の細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位を含む。

高いヘレグリン・レベルは、典型的には、転移の形成（即ち、腫瘍細胞または腫瘍開始細胞の遊走、浸潤、成長および／または分化）の間に存在する。典型的には、腫瘍開始細胞は、例えばＣＤ４４、ＣＤ２４、ＣＤ１３３および／またはＡＬＤＨ１などの幹細胞マーカーに基づいて同定される。従って、これらのプロセスは、トラスツズマブおよびペルツズマブなどの現在公知の治療によって、ほとんど対抗されない。本発明に従う抗体は、高レベルのヘレグリンを発現する腫瘍細胞または腫瘍開始細胞の成長および／または分化に対抗することが可能であるので、本発明に従うかかる抗体は、転移の形成に対抗するのにも特に適切である。従って、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象における転移の形成に対抗するための方法が、さらに提供され、このＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有し、この方法は、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を対象に投与することを含む。転移の形成の処置または予防における使用のための、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供され、このＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。転移の形成の処置または予防のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特異性抗体の使用がさらに提供され、このＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。このＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。従って、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫の細胞、好ましくは乳癌細胞の転移の形成の処置または予防における使用のための、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体がさらに提供され、これらの細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。この本発明に従う抗体は、典型的には、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。この本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、好ましくは２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。ＥｒｂＢ−２陽性細胞に対する第１の抗原結合部位の親和性は、好ましくは５．０ｎＭ以下、好ましくは４．５ｎＭ以下、好ましくは４．０ｎＭ以下である。

好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、Ｔ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０およびＲ１８１、ならびにＴ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０またはＲ１８１から約５アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−２のドメインＩの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する抗原結合部位を含む。

好ましい一実施形態は、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象の処置のための、本発明に従う方法であって、この腫瘍の細胞は、ＢＸＰＣ３もしくはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％であるヘレグリン発現レベルを有する、方法、またはかかる処置における使用のための本発明に従う抗体を提供し、この抗体は、図１６Ａまたは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８からなる群から選択されるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３配列、好ましくは少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または少なくとも重鎖可変領域配列を含む。

好ましい一実施形態は、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象の処置のための、本発明に従う方法であって、この腫瘍の細胞は、ＢＸＰＣ３もしくはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％であるヘレグリン発現レベルを有する、方法、またはかかる処置における使用のための本発明に従う抗体を提供し、この抗体は、図１６Ｂまたは図１６Ｅまたは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３配列、好ましくは少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または少なくとも重鎖可変領域配列を含む。一実施形態は、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象の処置における使用のための、抗体ＰＢ４１８８を提供し、この腫瘍の細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。

既に記載したように、本発明に従う抗体は、その細胞表面上に１．０００．０００未満のＥｒｂＢ−２受容体を有するＥｒｂＢ−２陽性腫瘍細胞を処置するために、特に適切である。典型的にはＥｒｂＢ−２［＋＋］またはＥｒｂＢ−２［＋］と分類される、かかる腫瘍を有する患者には、原発性腫瘍を有する患者ならびに再発したＥｒｂＢ−２陽性腫瘍を有する患者が含まれる。トラスツズマブ（ハーセプチン）およびペルツズマブなどの現在使用されている治療は、ＥｒｂＢ−２［＋＋＋］と分類される、その細胞表面上に１．０００．０００超のＥｒｂＢ−２受容体を有する悪性ＥｒｂＢ−２陽性細胞を有する患者のみに処方される。従って、ＥｒｂＢ−２［＋＋］またはＥｒｂＢ−２［＋］と分類される患者は、好ましくは、本発明に従う抗体で処置される。従って、本発明に従う使用のための方法または抗体がさらに提供され、その対象は、腫瘍細胞１つ当たり１．０００．０００未満のＥｒｂＢ−２細胞表面受容体を有するＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する。好ましい一実施形態は、転移の形成の処置または予防における使用のための、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、このＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有し、この腫瘍細胞は、１．０００．０００未満のＥｒｂＢ−２細胞表面受容体を有する。

別の好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、障害された心機能を有する、またはそのリスクがある対象において、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍に対抗するために使用される。障害された心機能とは、その対象が、健康な心機能と比較して、９０％未満、好ましくは８５％未満または８０％未満、好ましくは７５％未満または７０％未満である、例えば左室駆出分画（ＬＶＥＦ）などの心機能を有することを意味する。この健康な心機能は、例えば、健康な集団の平均心機能（例えば、平均ＬＶＥＦなど）である。あるいは、この健康な心機能は、本発明に従う抗体を用いた抗腫瘍治療の開始前に患者において測定される機能（例えば、ＬＶＥＦ）である。

心機能は、例えば、対象の身体診察、および心エコー図またはＭＵＧＡスキャンなどを使用したＬＶＥＦの試験によってモニタリングされる。

ＥｒｂＢ−２は、ヘレグリン受容体複合体ＨＥＲ２：ＨＥＲ４が関与するシグナル伝達ネットワークの一部として、成体の心筋細胞の成長、修復および生存に関与する。本明細書で上に記載したように、心臓毒性は、ＥｒｂＢ−２標的化治療における公知の危険因子であり、合併症の頻度は、トラスツズマブがアントラサイクリンと併せて使用される場合に増加し、それによって、心臓負荷を誘導する。例えば、ドキシサイクリンとトラスツズマブとの組み合わせは、重症の心臓副作用を誘導する。トラスツズマブ誘導性心機能不全の臨床症例の漸増する数にもかかわらず、その作用機構は未知である。ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍に対する現在公知の治療の心臓毒性の観点から、本発明に従う抗体を使用することが特に有利である。実施例に示されるように、心筋細胞の生存に影響を与えないか、またはトラスツズマブおよびペルツズマブと比較して、顕著に低い程度までしか影響を与えない抗体が、ここで提供されている。心臓毒性が低減されるので、これは、重要な利点を提供する。これは、障害された心機能に罹患していない人々にとって既に有利であり、障害された心機能に罹患している人々、例えば、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、左室機能不全（ＬＶＤ）および／もしくは減少した左室駆出分画（ＬＶＥＦ）に罹患している対象、ならびに／または心筋梗塞を有している対象などにとっては、さらにいっそう有利である。従って、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体がさらに提供され、この対象は、健康な心機能と比較して、９０％未満、好ましくは８５％未満または８０％未満または７５％未満または７０％未満である心機能を有する。この心機能は、好ましくは、ＬＶＥＦを含む。このＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態は、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象の処置のための、本発明に従う方法であって、この対象は、健康な心機能と比較して、９０％未満、好ましくは８５％未満、好ましくは８０％未満、好ましくは７５％未満もしくは７０％未満である心機能を有する、方法、またはかかる処置における使用のための本発明に従う抗体を提供し、この抗体は、
− 図１６Ａもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ２９２６、ＭＦ２９３０、ＭＦ１８４９；ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９７１、ＭＦ３０２５、ＭＦ２９１６、ＭＦ３９９１、ＭＦ３０３１、ＭＦ２８８９、ＭＦ２９１３、ＭＦ１８４７、ＭＦ３００１、ＭＦ３００３およびＭＦ１８９８からなる群から選択されるＥｒｂＢ−２特異的重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３配列、好ましくは少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、もしくは少なくとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領域配列と多くて１５アミノ酸、好ましくは多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含み、ならびに／あるいは
− 図１６Ｂもしくは図１６Ｅもしくは図３７に示されるＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３０９９；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５；ＭＦ６０５６；ＭＦ６０５７；ＭＦ６０５８；ＭＦ６０５９；ＭＦ６０６０；ＭＦ６０６１；ＭＦ６０６２；ＭＦ６０６３；ＭＦ６０６４；ＭＦ６０６５；ＭＦ６０６６；ＭＦ６０６７；ＭＦ６０６８；ＭＦ６０６９；ＭＦ６０７０；ＭＦ６０７１；ＭＦ６０７２；ＭＦ６０７３およびＭＦ６０７４からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３配列、好ましくは少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、もしくは少なくとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領域配列と多くて１５アミノ酸、好ましくは多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸、より好ましくは多くて１、２、３、４もしくは５アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含む。好ましい一実施形態では、この抗体は、ＰＢ４１８８である。

一実施形態では、この二重特異性抗体は、別の場所において詳細に説明されるように、ヘレグリン・ストレス条件下での対象の処置における使用のためのものである。従って、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体がさらに提供され、この対象は、健康な心機能と比較して、９０％未満、好ましくは８５％未満、好ましくは８０％未満、好ましくは７５％未満または７０％未満である心機能を有し、この腫瘍の細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。この心機能は、好ましくは、ＬＶＥＦを含む。ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象の処置のための方法もまた提供され、この対象は、健康な心機能と比較して、９０％未満、好ましくは８５％未満、好ましくは８０％未満、好ましくは７５％未満、好ましくは７０％未満である心機能を有し、この腫瘍の細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有し、この方法は、本発明に従う二重特異性抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。好ましい一実施形態は、健康な心機能、好ましくは健康なＬＶＥＦと比較して、９０％未満、好ましくは８５％未満、好ましくは８０％未満、好ましくは７５％未満または７０％未満である心機能、好ましくはＬＶＥＦを有する対象における、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍の処置のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特異性抗体の使用を提供し、この腫瘍の細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。

転移の形成の処置または予防における使用のための、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供され、その対象は、健康な心機能と比較して、９０％未満、好ましくは８５％未満、好ましくは８０％未満、好ましくは７５％未満、好ましくは７０％未満である心機能を有する。転移の形成の処置または予防のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特異性抗体の使用がさらに提供され、その対象は、健康な心機能と比較して、９０％未満、好ましくは８５％未満、好ましくは８０％未満、好ましくは７５％未満、好ましくは７０％未満である心機能を有する。このＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。この心機能は、好ましくは、ＬＶＥＦを含む。好ましい一実施形態では、この抗体は、抗体ＰＢ４１８８である。

別の実施形態では、生存促進性経路Ａｋｔ（ＰＩ３キナーゼ経路とも呼ばれる）およびＭＡＰキナーゼ経路の種々の因子のリン酸化に対抗するための本発明に従う抗体の使用が行われる。これらは、ＨＥＲ３の下流の増殖促進性シグナル伝達経路である。驚くべきことに、本発明者らは、本発明に従う抗体を用いて、Ａｋｔ、ＥＲＫ１／２およびＳ６リボソーム・タンパク質（Ｓ６−ＲＰ）のリン酸化を顕著に阻害することに成功したが、トラスツズマブおよびペルツズマブは、これらの強い抗リン酸化効果を有さない。増殖促進ＰＩ３キナーゼおよびＭＡＰキナーゼ経路の因子のリン酸化に対抗することは有利であるが、それは、これが、ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞の成長に対抗するからである。従って、Ａｋｔ、ＥＲＫ１／２および／またはＳ６−ＲＰのリン酸化に対抗する、好ましくはそれを阻害するための、本発明に従う抗体の使用がさらに提供される。重要なことに、Ａｋｔのリン酸化は、実施例に示されるように、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方で、本発明の抗体によって顕著に低減され得、またはさらには完全に遮断され得る。従って、好ましい一実施形態は、Ａｋｔのリン酸化に対抗する、好ましくはそれを阻害するための、本発明に従う抗体の使用を提供する。ＨＥＲ３−ｐ８５複合体の形成に対抗するための、本発明に従う抗体の使用もまた提供される。ＨＥＲ３−ｐ８５複合体の形成は、Ａｋｔ活性化における第１段階であるので、このＨＥＲ３−ｐ８５複合体の形成に対抗することが有利である。この本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体である。この抗体は、好ましくは、Ｔ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０およびＲ１８１、ならびにＴ１４４、Ｔ１６４、Ｒ１６６、Ｐ１７２、Ｇ１７９、Ｓ１８０またはＲ１８１から約５アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−２のドメインＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。さらに、または代替的に、この抗体は、好ましくは、Ｆ４０９およびＲ４２６、ならびにネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。一実施形態では、この抗体は、図１６または図３７に示される、少なくとも１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または少なくとも１つのＶＨ配列を含む。一実施形態では、この抗体は、ＰＢ４１８８である。

明確さおよび簡潔な記述を目的として、特徴は、同じまたは別々の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、本発明の範囲は、記載された特徴の全てまたは一部の組み合わせを有する実施形態を含み得ることが理解される。

（実施例）
方法、材料および抗体についてのスクリーニング
細胞株：
ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ１２５０５８）、Ｎ８７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−５８２２（商標））、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−３０（商標））、ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２０（商標））、ＪＩＭＴ−１（ＤＳＭＺＡＣＣ５８９）、Ｌ９２９（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ８５０１１４２５）、Ｋ５６２（ＤＳＭＺＡＣＣ１０）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）−ＣＲＬ−１１２６８（商標））、ＣＨＯ−Ｋ１（ＤＳＭＺＡＣＣ１１０）、ＭＣＦ−７（ＤＳＭＺＡＣＣ１１５）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（＃３００２７９−５１３、Ｃｅｌｌｌｉｎｅｓｅｒｖｉｃｅｓ）ＳＫ−ＯＶ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−７７（商標））、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−２５）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−１３１）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−２７）、ＺＲ−７５−１（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１５００）およびＭＫＮ−４５（ＤＳＭＺＡＣＣ４０９）細胞株を、ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺまたはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから購入し、１０％熱不活化胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補充した成長培地中で慣用的に維持した。ＨＥＫ２９３ＦＦｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから取得し、２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中で慣用的に維持した。

組換えヒト、ニワトリ、ラットおよび交換（ｓｗａｐｐｅｄ）ドメイン・ベクターの作製（ＨＥＲのクローニング）
（ヒトＨＥＲ２。）全長ヒトＨＥＲ２を、乳癌細胞株ＪＩＭＴ−１から単離したＲＮＡ由来のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ヒトＨＥＲ２の増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった。フォワード・プライマー：ＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣ、リバースド・プライマー：ＡＡＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＣＡＣＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧ。全長増幅産物を、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩで消化し、引き続いて、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の対応する部位中にクローニングした。

配列を、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００４４４８．２との比較によって検証した。トランスフェクションおよび免疫化の目的のためにヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をもっぱら発現する構築物を作製するために、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインおよびＥＣＤを、ＰＣＲ増幅し、ｐＶａｘ１中に再クローニングした。トランスフェクション目的のために、別の構築物を、ＨＥＲ２ＥＣＤドメインを増幅することによってｐＤｉｓｐｌａｙにおいて作製し、この構築物中では、ＨＥＲ２ＥＣＤドメインは、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインと融合される。

（ヒトＨＥＲ３。）ＨＥＲ３の全長ヒトｃＤＮＡクローンを、Ｏｒｉｇｅｎｅから取得した。トランスフェクションおよび免疫化の目的のためにヒトＨＥＲ３ＥＣＤをもっぱら発現する構築物を作製するために、ＨＥＲ３の膜貫通ドメインおよびＥＣＤを、ＰＣＲ増幅し、ｐＶａｘ１中に再クローニングした。さらに、別の構築物を、ｐＶａｘ１において作製し、ここで、ＨＥＲ３ＥＣＤドメインを、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインに融合させた。全ての配列を、ＮＣＢＩ参照ＮＭ＿００１９８２．３との比較によって検証した。

カニクイザルＨＥＲ２細胞外ドメインを、カニクイザルｃＤＮＡ−Ｍｏｎｋｅｙ）ＮｏｒｍａｌＣｏｌｏｎＴｉｓｓｕｅ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）からＰＣＲ増幅した。カニクイザルＨＥＲ２の増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった：
フォワード・プライマー：ＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣ、リバースド・プライマー：ＡＡＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＣＡＣＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧ。全長増幅産物を、ＮｈｅＩ−ＸｂａＩで消化し、引き続いて、ｐｃＤＮＡ３．１の対応する部位中にクローニングした。このクローンを配列決定し、アカゲザルの利用可能な配列（ＸＭ＿００２８００４５１）とアラインして、ＥｒｂＢ−２クローンの正確さをチェックした。

カニクイザルＨＥＲ３細胞外ドメインを、カニクイザルｃＤＮＡ−Ｍｏｎｋｅｙ）ＮｏｒｍａｌＣｏｌｏｎＴｉｓｓｕｅ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）からＰＣＲ増幅した。カニクイザルＨＥＲ３の増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった：
フォワード・プライマー：ＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＣＧＡＡＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧ、リバースド・プライマー：ＡＡＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣ。全長増幅産物を、ＮｈｅＩ−ＸｂａＩで消化し、引き続いて、ｐｃＤＮＡ３．１の対応する部位中にクローニングした。このクローンを配列決定し、アカゲザルの利用可能な配列（ＥＮＳＭＭＵＰ００００００２７３２１）とアラインして、ＨＥＲ３クローンの正確さをチェックした。

ニワトリＨＥＲ２配列は、参照配列ＮＭ＿００１０４４６６１．１に基づいた。キメラ交換ドメイン構築物を、ニワトリＨＥＲ２配列のドメインＩからＩＶを、ヒトＩのドメインＩからＩＶに交換することによって作製した。ｍｙｃタグを含む配列を、哺乳動物細胞における発現のために最適化し、Ｇｅｎｅａｒｔにおいて合成した。

ラットＨＥＲ３配列は、参照配列ＮＭ＿００１０４４６６１．１に基づいた。キメラ交換ドメイン構築物を、ラットＨＥＲ３配列のドメインＩからＩＶを、ヒトＩのドメインＩからＩＶに交換することによって作製した。ｍｙｃタグを含む配列を、哺乳動物細胞における発現のために最適化し、Ｇｅｎｅａｒｔにおいて合成した。

ＨＥＲ２およびＨＥＲ３過剰発現性細胞株の作製
細胞表面上に高レベルのＨＥＲ３を発現する細胞株を作製するために、哺乳動物発現ベクターを、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩ消化によって全長ＨＥＲ３を切り出すことによって作製した。引き続いて、この断片を、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ｈｙｇｒｏベクターの対応する部位中にクローニングした。ネオマイシン耐性遺伝子をコードする全長ＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現ベクターを使用して、細胞表面上に高レベルのＨＥＲ２を発現する細胞株を作製した。トランスフェクション前に、プラスミドを、ＳＳｐＩおよびＦｓｐＩ消化によって線状化した。両方のベクターを、Ｋ５６２細胞中に別々にトランスフェクトし、安定なプールを、抗生物質選択後に作製した。得られた細胞株（Ｋ５６２−ＨＥＲ２およびＫ５６２−ＨＥＲ３）は、それらの細胞表面上に高レベルのＨＥＲ２およびＨＥＲ３を発現した。

免疫化
（ＨＥＲ２免疫化。）４つの異なる免疫化戦略を適用した。コホート＃Ａについて、６匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、腹腔内注射によって、２００μｌ中２×１０^６の、ＨＥＲ２を一過的にトランスフェクトしたＬ９２９細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、１４日目に腹腔内注射によって、１２５μｌのＴｉｔｅｒｍａｘＧｏｌｄ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−２−Ｆｃ（ＲＮＤｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質で追加免疫し、その後、２８日目および４２日目に、２００μｌ中２×１０^６の、ＨＥＲ２を一過的にトランスフェクトしたＬ９２９細胞で追加免疫した。コホート＃Ｃについて、６匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、腹腔内注射によって、２×１０^６の、ＨＥＲ２を一過的にトランスフェクトしたＬ９２９細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、１４日目に腹腔内注射によって、２００μｌ中２×１０^６の、ＨＥＲ２を一過的にトランスフェクトしたＬ９２９細胞で追加免疫し、その後、３５日目に腹腔内注射によって、１２５μｌのＴｉｔｅｒｍａｘＧｏｌｄ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−２−Ｆｃタンパク質でタンパク質追加免疫し、４９日目に腹腔内注射によって、２００μｌのＰＢＳ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−２−Ｆｃタンパク質で最終追加免疫した。コホート＃Ｅについて、６匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、腹腔内注射によって、１２５μｌのＴｉｔｅｒｍａｘＧｏｌｄ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−２−Ｆｃタンパク質で免疫化した。引き続いて、腹腔内注射を介した、１２５μｌのＴｉｔｅｒｍａｘＧｏｌｄ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−２−Ｆｃタンパク質によるタンパク質追加免疫を、１４日目および２８日目に実施し、４２日目に腹腔内注射によって、２００μｌのＰＢＳ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−２−Ｆｃタンパク質で最終追加免疫した。コホート＃Ｇについて、６匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、そのプロトコールに従って、Ｇｅｎｏｖａｃ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）においてＤＮＡワクチン接種によって免疫化した。ＤＮＡワクチン接種に使用した、エンドトキシン・フリーの提供されたベクターは、ｐＶａｘ１中にクローニングされたＨＥＲ２の膜貫通部分および細胞外部分をコードしていた。引き続いて、ＤＮＡ追加免疫を、１４日目、２８日目および６６日目に与えた。

（ＨＥＲ３免疫化。）４つの異なる免疫化戦略を適用した。コホート＃Ｂについて、６匹の（Ｃ５７Ｂｌ／６）マウスを、腹腔内注射によって、２００μｌ中２×１０^６の、ＨＥＲ３を一過的にトランスフェクトしたＬ９２９細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、１４日目、２８日目、４９日目および６３日目に、２００μｌ中２×１０^６の、ＨＥＲ３で一過的にトランスフェクトされたＬ９２９細胞で追加免疫した。コホート＃Ｄについて、６匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、０日目、１４日目および２８日目に腹腔内注射によって、２×１０^６の、ＨＥＲ３を一過的にトランスフェクトしたＬ９２９細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、４９日目に腹腔内注射によって、１２５μｌのＴｉｔｅｒｍａｘＧｏｌｄ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−３−Ｆｃタンパク質で追加免疫し、６６日目に腹腔内注射によって、２００μｌのＰＢＳ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−３−Ｆｃタンパク質で最終追加免疫した。コホート＃Ｆについて、６匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、腹腔内注射によって、１２５μｌのＴｉｔｅｒｍａｘＧｏｌｄ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−３−Ｆｃタンパク質で免疫化した。引き続いて、マウスを、１４日目および２８日目に腹腔内注射によって、１２５μｌのＴｉｔｅｒｍａｘＧｏｌｄ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−３−Ｆｃタンパク質で追加免疫し、４２日目に腹腔内注射によって、２００μｌのＰＢＳ中に溶解させた２０μｇのＥｒｂｂ−３−Ｆｃタンパク質による最終追加免疫を与えた。コホート＃Ｈについて、６匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、そのプロトコールに従って、Ｇｅｎｏｖａｃ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）においてＤＮＡワクチン接種によって免疫化した。ＤＮＡワクチン接種に使用した、エンドトキシン・フリーの提供されたベクターは、ｐＶａｘ１中にクローニングされたＰＤＧＦＲの膜貫通部分およびＨＥＲ３の細胞外部分をコードしていた。引き続いて、ＤＮＡ追加免疫を、１４日目、２８日目および６６日目に与えた。

抗体力価の決定。
免疫化されたＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の血清中の抗ＨＥＲ２力価を、ＥＣＤ−Ｅｒｂｂ−２タンパク質（Ｂｅｎｄｅｒｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）に対するＥＬＩＳＡ、ならびにＨＥＲ２陰性Ｋ５６２、ＨＥＲ２低発現性細胞株ＭＣＦ−７ならびにＨＥＲ２増幅されたＳＫＢＲ−３およびＢＴ−４７４細胞に対するＦＡＣＳ分析によって、決定した。免疫化されたＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の血清中の抗ＨＥＲ３力価を、Ｅｒｂｂ−３−Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡ、ならびにＨＥＲ３陰性Ｋ５６２、ＨＥＲ２低発現性細胞株ＭＣＦ−７ならびにＨＥＲ２増幅されたＳＫＢＲ−３およびＢＴ−４７４細胞に対するＦＡＣＳ分析によって、決定した。

動物を屠殺する前のＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する血清力価は、それぞれ、表１および表２に記載されている。全てのコホート中の動物は、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３に対する抗体応答を発達させた。

リンパ組織の回収。
脾臓および流入領域リンパ節を、ＤＮＡでワクチン接種した全てのマウス（コホート＃Ｇおよび＃Ｈ）から取り出した。単一細胞浮遊液を、全ての組織から作製し、引き続いて、組織を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬中で溶解した。コホート＃Ａから＃Ｆまで、脾臓を、最初の追加免疫後に死亡したコホート＃Ｃの１匹のマウスを除く全てのマウスから取り出した。単一細胞浮遊液を、全ての脾臓から作製し、総Ｂ細胞画分を、ＣＤ１９富化（コホート＃Ａ、Ｅ、Ｆ）または非Ｂ細胞の枯渇（コホート＃Ｂ、Ｃ、Ｄ）のいずれかによって、ＭＡＣＳ分離手順を使用して単離した。

免疫化したマウスからのファージ・ディスプレイ・ライブラリーの作製
１つのファージ・ライブラリーを、各マウスについて構築した。この目的のために、１群ごとの全てのマウス（１群につき５または６匹のマウス）からの材料を使用して、以下のアプローチを使用してファージ・ライブラリーを調製した。各個々のマウスから、ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ＶＨファミリー特異的ＰＣＲを実施した。引き続いて、マウス１匹当たりの全てのＶＨファミリーＰＣＲ産物を精製し、ＤＮＡ濃度を決定し、消化し、共通の軽鎖を含むファージ・ディスプレイ・ベクター中にライゲーションして、マウス−ヒト・キメラ・ファージ・ライブラリーを作製した。全てのファージ・ライブラリーは、８５％超の挿入頻度で、１０^６超のクローンを含んだ。

ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に特異的に結合するＦａｂ断片を保有するファージの選択
抗体断片を、抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを使用して選択した。免疫化ライブラリーおよび合成ライブラリー（ｄｅＫｒｕｉｆら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９５）、２４８、９７〜１０５に記載される通り）を、選択に使用した。

ＨＥＲ２ファージの選択およびスクリーニング
ファージ・ライブラリーを、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパー・ファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてレスキューし、組換えタンパク質でコートされたイムノチューブ（Ｎｕｎｃ）中で、２ラウンドにわたって選択した。第１ラウンドでは、ＥＣＤ−Ｅｒｂｂ−２タンパク質（Ｂｅｎｄｅｒｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）を、イムノチューブ上にコートし、第２ラウンドでは、Ｅｒｂｂ−２−Ｆｃ（ＲＮＤｓｙｓｔｅｍｓ）を、イムノチューブ上にコートした。これらのイムノチューブを、４％脱脂粉乳（ＥＬＫ）中でブロッキングした。ファージ抗体ライブラリーもまた、４％ＥＬＫでブロッキングし、その後、イムノチューブにファージ・ライブラリーを添加した。免疫チューブ中での、ファージ・ライブラリーとコートされたタンパク質とのインキュベーションを、回転条件下、室温で２時間実施した。次いで、イムノチューブを、ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で５〜１０回洗浄し、その後、ＰＢＳ中で５〜１０回洗浄した。結合したファージを、５０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．２）を使用して溶出し、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ−１Ｂｌｕｅに添加し、ファージ感染のために３７℃でインキュベートした。引き続いて、感染した細菌を、アンピシリン、テトラサイクリンおよびグルコースを含む寒天プレート上にプレートし、３７℃で終夜インキュベートした。第１ラウンドの後、コロニーをプレートから掻き取り、合わせ、その後、レスキューし、増幅して、富化された第１ラウンド・ライブラリーを調製した。次いで、富化されたライブラリーを、上記プロトコールを使用して、Ｅｒｂｂ−２−Ｆｃ（ＲＮＤｓｙｓｔｅｍｓ）に対して選択した。第２ラウンドの選択後、個々のクローンを取り、レスキューして、ファージ・モノクローナル・ミニプレップを調製した。次いで、Ｅｒｂｂ２と結合している陽性ファージ・クローンを、乳癌細胞株ＢＴ−４７４への結合についてＦＡＣＳにおいて同定した。全てのＥｒｂｂ２特異的クローンのＶＨ遺伝子を配列決定した。ＶＨ遺伝子再編成を、ＶＢＡＳＥ２ソフトウェアを用いて確立して、ユニーククローンを同定した。次いで、全てのユニーククローンを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（陰性コントロール）、ＥｒｂＢ−２で一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、およびＢＴ−４７４細胞への結合について、ＦＡＣＳにおいてファージ形式で試験した。

ＨＥＲ３ファージの選択およびスクリーニング
ファージ・ライブラリーを、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパー・ファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でレスキューし、組換えタンパク質でコートされたイムノチューブ（Ｎｕｎｃ）中で、２ラウンドにわたって選択した。両方の選択ラウンドで、Ｅｒｂｂ−３−Ｆｃ（ＲＮＤｓｙｓｔｅｍｓ）を、イムノチューブ上にコートした。融合タンパク質のＦｃ部分に向かう選択バイアスを克服するために、Ｅｒｂｂ−３−Ｆｃに対する両方の選択ラウンドを、１５０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧの存在下で実施した。これらのイムノチューブを、４％ＥＬＫでブロッキングした。ファージ抗体ライブラリーを、４％ＥＬＫでブロッキングし、その後、イムノチューブにファージ・ライブラリーを添加した。ファージ・ライブラリーとのインキュベーションを、回転条件下、２時間実施した。次いで、イムノチューブを、ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で５〜１０回洗浄し、その後、ＰＢＳ中で５〜１０回洗浄した。結合したファージを、５０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．２）を使用して溶出し、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ−１Ｂｌｕｅに添加し、ファージ感染のためにインキュベートした。引き続いて、感染した細菌を、アンピシリン、テトラサイクリンおよびグルコースを含む寒天プレート上にプレートし、３７℃で終夜インキュベートした。第１ラウンドの後、コロニーをプレートから掻き取り、合わせ、ファージをレスキューし、増幅して、富化された第１ラウンド・ライブラリーを調製した。次いで、富化されたライブラリーを、上記プロトコールを使用して、Ｅｒｂｂ−３−Ｆｃ（ＲＮＤｓｙｓｔｅｍｓ）に対して選択した。第２ラウンドの選択後、個々のクローンを取り、レスキューして、ファージ・モノクローナル・ミニプレップを調製した。陽性ファージ・クローンを、乳癌細胞株ＢＴ−４７４への結合についてＦＡＣＳにおいて同定した。全ての陽性クローンのＶＨ遺伝子を配列決定した。ＶＨ遺伝子再編成を、ＶＢＡＳＥ２ソフトウェアを用いて確立して、ユニーククローンを同定した。全てのユニーククローンを、Ｋ５６２細胞（陰性コントロール）、安定なＫ５６２−ＨＥＲ３細胞およびＢＴ−４７４細胞への結合について、ＦＡＣＳにおいてファージ形式で試験した。

合計３６回の選択を、Ｅｒｂｂ２およびＥｒｂｂ３抗原形式で実施した。全ての選択スクリーニング手順は、ＨＥＲ２に対する８９のユニークＦａｂクローンおよびＨＥＲ３に対する１３７のユニークＦａｂクローンを生じた。Ｆａｂを、ユニークＶＤＪ組換え事象を示すそのユニークＨＣＤＲ３配列に基づいて、ユニークであるとみなした。一部の場合には、同一のＨＣＤＲ３を有するが、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２中に差異を有する、クローナル・バリアントが得られた。免疫化マウス・ライブラリーから、親和性バリアントを反映するＶＨ遺伝子中の置換を含むクローナル・バリアントのクラスターを選択した。

抗体の選択／特徴付け
モノクローナル抗体の作製
免疫化マウス・ファージ・ライブラリー由来の、ＶＨ遺伝子配列およびそのいくつかの配列バリアントによって判断される、ユニーク抗体のＶＨ遺伝子を、骨格ＩｇＧ１ベクター中にクローニングした。２つの異なる産生細胞株を、プロセスの間に使用した；ＨＥＫ２９３Ｔおよび２９３ＦＦｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞。接着性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ウェル・プレート中で、８０％のコンフルエンシーまで培養した。これらの細胞を、個々のＤＮＡ−ＦＵＧＥＮＥ混合物で一過的にトランスフェクトし、さらに培養した。トランスフェクションの７日後、上清を回収し、培地をリフレッシュした。トランスフェクションの１４日後、上清を合わせ、０．２２μＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通じて濾過した。無菌上清を４℃で貯蔵した。

懸濁適応させた２９３ＦＦｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を、Ｔ１２５フラスコ中で、３．０×１０^６細胞／ｍｌの密度まで、シェーカー・プラトーで培養した。細胞を、２４深ウェル・プレートの各ウェル中に、０．３〜０．５×１０^６の生存細胞／ｍｌの密度で播種した。これらの細胞を、個々の無菌ＤＮＡ：ＰＥｌ混合物で一過的にトランスフェクトし、さらに培養した。トランスフェクションの７日後、上清を回収し、０．２２μＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通じて濾過した。無菌上清を４℃で貯蔵した。

二重特異性抗体の作製
二重特異性抗体を、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化および形成を確実にするために、所有のＣＨ３テクノロジーを使用して作製した。このＣＨ３テクノロジーは、２つの異なる重鎖分子の効率的ペアリングを可能にするために、上に記載されたように（ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４；ＷＯ２０１３／１５７９５４Ａ１として公開）、ＣＨ３領域中の荷電ベースの点変異を使用する。

機能的スクリーニングのためのＩｇＧ精製
ＩｇＧの精製を、アフィニティ・クロマトグラフィーを使用して、小規模（＜５００μｇ）、中規模（＜１０ｍｇ）および大規模（＞１０ｍｇ）で実施した。小規模精製を、減圧濾過を使用して、２４ウェル・フィルター・プレートにおいて無菌条件下で実施した。最初に、培地のｐＨを、ｐＨ８．０に調整し、引き続いて、小規模産生物を、６００ｒｐｍの振盪プラットフォーム（Ｈｅｉｄｏｌｐｈプレート・シェーカー）上で２５℃で２時間、プロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂビーズ（５０％ｖ／ｖ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と共にインキュベートした。次に、ビーズを、減圧濾過によって回収した。ビーズを、ＰＢＳｐＨ７．４で２回洗浄した。ＩｇＧを、０．１Ｍクエン酸塩緩衝液を用いてｐＨ３．０において溶出し、ＩｇＧ画分を、ＴｒｉｓｐＨ８．０で即座に中和した。緩衝液交換を、マルチスクリーンＵｌｔｒａｃｅｌ１０マルチプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する遠心分離によって実施した。これらのサンプルは、ＰＢＳｐＨ７．４の最終緩衝液中で終わった。

ＨＥＲ２／ＨＥＲ３特異的ＩｇＧの検証
抗体を、ＢＴ−４７４、ＨＥＫ２９３Ｔ、およびＨＥＲ２またはＨＥＲ３を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔへの結合について、ＦＡＣＳにおいて試験した。従って、細胞を、トリプシンを使用して回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．５ｍＭＥＤＴＡ）中１０^６細胞／ｍｌに希釈した。１〜２×１０^５細胞を、Ｕ底９６ウェル・プレート中の各ウェルに添加した。細胞を、４℃で３００ｇで２分間遠心分離した。上清を、プレート（複数可）を反転させることによって廃棄した。５０μｌの各ＩｇＧサンプルを、１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞を、１回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。５０μｌの１：１００希釈したマウス抗ヒトＩｇＧＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、暗中で氷上で３０〜６０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を添加した後、細胞を、１回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＨＴＳ設定のＦＡＣＳＣａｎｔｏフロー・サイトメーターで分析した。細胞への抗体の結合を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって評価した。

非特異的結合について試験するために、反応性ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ＨＥＲ２抗体およびＨＥＲ３抗体を、抗原フィブリノーゲン、ヘモグロビンおよび破傷風毒素に対する反応性について試験した。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３への特異的結合を試験するために、これらの抗体を、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の精製された組換え細胞外ドメインへの結合について試験した。抗原を、ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）ＥＬＩＳＡプレートに終夜コートした。ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３７℃で１時間ブロッキングした。選択された抗体を、ＰＢＳ−２％ＢＳＡ中に希釈した１０μｇ／ｍｌの濃度で２連で試験し、２５℃で２時間結合させた。コントロールとして、この手順を、コートされた抗原に特異的な抗体および陰性コントロール抗体を用いて、同時に実施した。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）で５回洗浄した。結合したＩｇＧを、１：２０００希釈したＨＲＰコンジュゲート（ヤギ抗マウスＢＤ）を用いて検出し、２５℃で２時間結合させた。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、結合したＩｇＧを、ＯＤ４９２ｎｍ測定によって検出した。

ＨＥＲ２／ＨＥＲ３特異的ＩｇＧのエピトープ・グループ分け
抗ＨＥＲ２抗体のパネルを、キメラ構築物を使用して、他の種（マウス、ニワトリ）由来のＨＥＲ２ＥＣＤに対するそれらの反応性、ならびにＨＥＲ２分子中の特定のドメイン、即ち、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶへのそれらの結合に基づいて、ビニングした。

抗ＨＥＲ３抗体のパネルを、キメラ構築物を使用して、他の種（カニクイザル、ラット）由来のＨＥＲ３ＥＣＤに対するそれらの反応性、ならびにＨＥＲ３分子中の特定のドメイン、即ち、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶへのそれらの結合に基づいて、ビニングした。

この目的のために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、リポフェクタミン／ＤＮＡミックスを使用して、適切な構築物で一過的にトランスフェクトした。キメラ交換ドメイン構築物において、ニワトリＨＥＲ２またはラットＨＥＲ３のドメインを、ヒト対応物によって置き換える。特異的抗体の結合を、ＦＡＣＳによって測定した。構築物の発現を、抗ｍｙｃ抗体を使用して確認した。トラスツズマブによるＦＡＣＳ染色を、ドメインＩＶへの特異的結合についてのコントロールとして含めた。各群中の抗体を、染色の強度（ＭＦＩ）に基づいてランク付けできた。

６５の抗体のＨＥＲ２パネルが、７つのビンにマッピングできた（表３）。
１．ドメインＩ特異的（２５）
２．ドメインＩＩ特異的（２）
３．ドメインＩＩＩ特異的（２３）
４．ドメインＩＶ特異的（７）
５．ドメインＩＶ特異的およびマウスと交差反応性（２）
６．全ての構築物と反応性（２）
７．ヒトＨＥＲ２とだけ反応性（４）

トラスツズマブとの競合
ＨＥＲ２ドメインＩＶにマッピングされた２つの抗体は、ＳＫＢＲ−３細胞の増殖を阻害した。両方の抗体が、１アミノ酸の差異を除き、類似のＣＤＲ３を共有していた。１つの抗体ＰＧ１８４９を、競合ＥＬＩＳＡにおいてトラスツズマブと競合するその能力について調査した。このＥＬＩＳＡでは、Ｆｃ−ＨＥＲ２をコートし、１５μｇ／ｍｌの濃度のＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。１５分間のインキュベーション後、ファージを、もう１時間インキュベートした。その後、ファージを検出した。表４は、ＰＧ１８４９およびトラスツズマブが、ＨＥＲ２に同時に結合できたことを実証しているが、それは、ＥＬＩＳＡの間にシグナルの喪失が現れなかったからである。真の競合は、同じファージおよび抗体をこのアッセイにおいて組み合わせた時にだけ観察された。

１２４の抗体のＨＥＲ３パネルが、５つのビンにマッピングできた（表５）：
１．高いドメインＩＩＩ反応性、ラットおよびマウス反応性、ならびにドメインＩＶへの軽微な反応性（８）
２．高いドメインＩＩＩ反応性、ラット、ヒトおよびカニクイザル反応性、ドメインＩＶへの軽微な反応性（８）
３．ラット、カニクイザルおよびヒトＨＥＲ３とだけ反応性（４３）
４．ヒトＨＥＲ３とだけ反応性（３２）
５．全ての構築物と反応性（３３）

細胞株増殖アッセイ
ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、Ｌ−グルタミンおよび１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ−Ｆ／１２中で培養した。ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ＭＣＦ−７細胞を、１００μＭ、ＮＥＡＡ１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４μｇ／ｍｌのインスリンおよび１０％の熱不活化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。

ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖アッセイのために、コンフルエント未満の細胞培養物を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、培養培地中６×１０^４細胞／ｍｌに希釈した。抗体を、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェル黒底プレート（ＡＢｇｅｎｅＡＢ−０９３２）中に１００μｌの体積で添加した。細胞を、６０００細胞／ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯで３日間培養した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って添加し、暗中で９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯで６時間インキュベートした。蛍光を、５５０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で測定した。成長阻害の程度を、同じ濃度のトラスツズマブのものと比較した（表６）。

ＭＣＦ−７およびＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２細胞の増殖アッセイのために、コンフルエント未満の細胞培養物を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地（０．０５％ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌのホロ・トランスフェリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）で２回洗浄した。

ＭＣＦ−７細胞を、培養培地中５×１０^４細胞／ｍｌに希釈した。抗体を、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェル黒底プレート（ＡＢｇｅｎｅＡＢ−０９３２）中に１００μｌの体積で添加した。細胞を、１ｎｇ／ｍｌの最終濃度のヒト組換えヒトＮＲＧ１−ベータ１／ＨＲＧ１−ベータ１ＥＧＦドメイン（３９６−ＨＢ−０５０ＲＮＤ）の存在下で、５０００細胞／ウェルの密度で添加した。ヒトＮＲＧ１−ベータ１／ＨＲＧ１−ベータ１ＥＧＦドメインを、本明細書で以下、ＨＲＧと呼ぶ。これらの細胞を、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯで５日間培養した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って添加し、暗中で９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。蛍光を、５５０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で測定した。成長阻害の程度を、同じ濃度の＃Ａｂ６のものと比較した（表７）。

ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ−２増殖アッセイを使用して、二重特異性抗体をスクリーニングした。ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ−２細胞を、培養培地中８×１０^４細胞／ｍｌに希釈した。抗体を、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェル黒底プレート（ＡＢｇｅｎｅＡＢ−０９３２）中に１００μｌの体積で添加した。細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のヒトＨＲＧの非存在下または存在下で、８０００細胞／ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯで４日間培養した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って添加し、暗中で９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯで４時間インキュベートした。蛍光を、５５０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で測定した。

エッジ効果を最小化するために、９６ウェル・プレートの外側ウェルを、ＰＢＳで完全に満たした。

ＨＥＲ２特異的ＩｇＧの親和性ランキング
本発明者らは、Ｄｅｖａｓｈ（ＰＮＡＳ、１９９０）によって記載される方法を使用して、限定抗原−ＥＬＩＳＡにおいて抗体をランク付けした。減少した抗原コーティング濃度の使用は、観察された交差反応性反応を排除し、高親和性／結合力の抗体を検出するために使用され得る。従って、固体支持体上の抗原濃度を徐々に減少させて、弱い免疫反応性を調査した。２．５μｇ／ｍｌから開始して０．０１９μｇ／ｍｌまでのＥＣＤ−Ｅｒｂｂ−２タンパク質の連続滴定を、ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）ＥＬＩＳＡプレートに終夜コートした。ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で３７℃で１時間ブロッキングした。選択された抗体を、ＰＢＳ−２％ＢＳＡ中に希釈した１０μｇ／ｍｌの濃度で２連で試験し、２５℃で２時間結合させた。コントロールとして、この手順を、コートされた抗原に特異的な抗体および陰性コントロール抗体を用いて、同時に実施した。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）で５回洗浄した。結合したＩｇＧを、１：２０００希釈したＨＲＰコンジュゲート（ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出し、２５℃で２時間結合させた。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、結合したＩｇＧを、ＯＤ４９２ｎｍ測定によって検出した。ＰＧ１８４９、ＰＧ２９１６、ＰＧ２９２６、ＰＧ２９３０、ＰＧ２９７１、ＰＧ２９７３、ＰＧ３００４およびＰＧ３０３１を、ＨＥＲ２抗原滴定ＥＬＩＳＡにおいて試験した（図１）。

種々のカッパ軽鎖とのＨＥＲ２ＶＨ遺伝子の結合
異なるファージ・ディスプレイ・ライブラリー由来のＨＥＲ２ＶＨの結合を調査するために、ＨＥＲ２抗体のパネルを、クローニングし、別のＶＫカッパ鎖、即ち、ＭＥＨＤ７９４５ＡのＶＬの背景で発現させた。産生されたＩｇＧを、Ｋ５６２細胞および安定なＫ５６２−ＨＥＲ２細胞に対するＦＡＣＳ分析に供した。コンビナトリアル・ライブラリーおよび非コンビナトリアル・ライブラリー由来のＶＨ遺伝子を、表８に列挙する。ＶＨ鎖ＭＦ２９７１、ＭＦ３９５８、ＭＦ２９１６、ＭＦ２９７３、ＭＦ３００４、ＭＦ３０２５、ＭＦ３０３１は全て、共通の軽鎖ＩＧＫＶ１−３９と組み合わせた場合に観察されたように顕著な抗原特異性および結合を喪失することなくＭＥＨＤ７９４５Ａ軽鎖と組み合わせることができた。ＶＨ鎖ＭＦ１８４９は、バリアント・カッパ軽鎖と組み合わせることはできず、抗原特異性および結合を保持できなかった。

他のＨＥＲ２およびＨＥＲ３抗体
ＨＥＲ２またはＨＥＲ３の機能を阻害する抗体は、当技術分野で公知である。さらなる抗体を、公開された情報に従って構築し、２９３ＦＦｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞において発現させた。抗ＨＥＲ２抗体ペルツズマブおよびトラスツズマブを、米国特許出願公開第２００６／０２１２９５６号Ａ１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示された情報に基づいて作製した。抗ＨＥＲ３抗体＃Ａｂ６は、ＷＯ２００８／１００６２４（ＭｅｒｒｉｍａｃｋＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）に開示された情報に基づき、ＩｇＧ１骨格ベクター中に再クローニングした。１−５３およびＵ１−５９抗ＨＥＲ３抗体の情報は、米国特許第７，７０５，１０３号Ｂ２（Ｕ３ＰｈａｒｍａＡＧ）から得た。抗ＨＥＲ３ＬＪＭ７１６抗体の情報は、米国特許出願公開第２０１２／０１０７３０６号から得た。ツー・イン・ワン抗ＥＧＦＲ抗ＨＥＲ３抗体ＭＥＨＤ７９４５Ａの構築のための情報は、ＷＯ２０１０／１０８１２７から得た。

ＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体のスクリーニング
ＨＥＲ２およびＨＥＲ３抗体パネル由来のＶＨを、荷電した操作されたベクター中に再クローニングし、その結果、抗体重鎖の発現の際に、重鎖のヘテロ二量体化が強制され、トランスフェクション後に二重特異性抗体を生じる。３つの異なる戦略を、二重特異性ＩｇＧ形式でＨＥＲ２およびＨＥＲ３アームを組み合わせる際に使用した：
１．ＨＥＲ２（リガンド非依存的成長を遮断する）×ＨＥＲ３（リガンド非依存的成長を遮断する）
２．ＨＥＲ２（リガンド非依存的成長を遮断する）×ＨＥＲ３（リガンド依存的成長を遮断する）
３．異なるエピトープ・ビン由来のＨＥＲ２×ＨＥＲ３（リガンド依存的成長を遮断する）

一部の二重特異性組み合わせでは、群２および３において作製した抗体は、群１と重複した。

合計４９５の二重特異性抗体を、２４ウェル形式で産生し、精製した。全ての抗体を、ＨＥＲ２発現性およびＨＥＲ３発現性膵臓ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ−２細胞株（Ｃａｌｉｐｅｒ）の増殖を阻害する能力について試験した。抗体の強度を、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度で存在する抗体を用いた黒色および白色スクリーニングにおいて、ＨＲＧ依存的およびＨＲＧ非依存的設定で決定した。トラスツズマブを、同じ濃度で参照抗体および陰性コントロール抗体として含めた。１μｇ／ｍｌにおける上位８０のＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性（組み合わされた阻害に基づく）の機能的活性を、図２に示す。

陽性コントロール抗体と比較して高い阻害活性を示した抗体（合計で４０）を、２４ウェル形式で選択、再産生および精製し、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度で黒色および白色ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ−２スクリーニングにおいて再度試験した。これらの抗体を、ＨＲＧ依存的ＭＣＦ−７アッセイにおいてさらに滴定し、トラスツズマブおよびペルツズマブの組み合わせ（１：１）ならびに陰性コントロール抗体に対して比較した。図３は、親ＨＥＲ３抗体およびトラスツズマブ＋ペルツズマブの組み合わせと比較した、３つの二重特異性抗体の滴定曲線の一例を示す。親モノクローナル抗体は、上のパネルに示され、二重特異性抗体は、下のパネルに示される（図３）。

二重特異性抗体、モノクローナルおよびコンパレーター抗体についてのＩＣ_５０を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた非線形回帰分析を使用して計算した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアは、ＭＣＦ−７アッセイにおける二重特異性抗体のＩＣ_５０値、およびＢｘＰＣ３アッセイにおけるそれらの阻害活性を、比較のために列挙する。１２のＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体のパネルは、トラスツズマブ＋ペルツズマブと比較して、より強力な阻害活性を有していた。さらに、これらの二重特異性抗体は、親モノクローナルＰＧ３１７８と等しく強力またはより強力であった（表９）。

リガンド依存的細胞成長を阻害した二重特異性抗体は、ＨＥＲ３アーム３１７８、３１６３、３０９９および３１７６と組み合わせたＨＥＲ２アームから構成された。最も強力な二重特異性のＨＥＲ２アームおよびＨＥＲ３アームの両方は、二価モノクローナルとして、リガンド非依存的ＳＫＢＲ−３増殖（ＨＥＲ２アームおよびＨＥＲ３アームの両方）（表６）またはリガンド依存的ＭＣＦ−７増殖（ＨＥＲ３アーム）（表７）を阻害することも可能であった。強力な抗体の大部分は、抗ＨＥＲ３抗体３１７８と組み合わせた、ドメインＩを認識するＨＥＲ２アームから構成された。

ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２腫瘍成長の阻害
表９に記載される抗体を、ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２膵臓異種移植モデルにおいて試験した。ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２細胞株は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の両方を発現し、ＨＥＲ２低発現性細胞株とみなされる。研究の開始時に８〜１０週齢のＣＢ１７ＳＣＩＤ雌性マウスに、２０μｌ中１×１０^６の腫瘍細胞を、膵臓中に同所性に移植した。この目的のために、マウスを麻酔し、右側を下にして寝かせて左側を露出させ、０．５ｃｍの切開を左側腹領域に作製した。膵臓および脾臓を剥き出しにし、２０μｌ中１×１０^６の腫瘍細胞を、膵尾部の嚢下（ｓｕｂ−ｃａｐｓｕｌａｒｙ）空間中に注射した。移植の１週間後、バイオルミネセンス（ＢＬＩ）データを生成した。画像化の１５分前に、全てのマウスが、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン（Ｄ−ルシフェリン−ＥＦカリウム塩、カタログ番号Ｅ６５５２、Ｐｒｏｍｅｇａ）の腹腔内注射を受けた。ＢＬＩ画像化を、左側面からの表示を使用して、１週間に１回または２回実施した。異常値動物−ＢＬＩ／腫瘍体積に基づく−を除去し、マウスを、各々７匹のマウスの群中にランダムに分配した。実験８日目に、処置を開始した。抗体処置群中の動物に、３連続週にわたって毎週（０日目、７日目、１４日目および２１日目）、３０ｍｇ／ｋｇの抗体を投薬した。処置の０日目に、これらの動物は、２回分の負荷量、即ち、６０ｍｇ／ｋｇの抗体を投与された。最終画像化を、３１日目に実施した。

２つのＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２異種移植モデルを、二重特異性抗体および親抗体の異なるパネルを用いて実行した。第１のＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２異種移植モデル（図４）では、１つの群が陰性コントロール抗ＲＳＶ抗体（コントロールＩｇＧ）を投与され、１つの群がコントロール抗体トラスツズマブを投与され、１つの群が陽性コントロール抗体トラスツズマブ＋ペルツズマブ（１：１ｖ／ｖ）を投与された。残り７つの群は、モノクローナル（ＰＧ）または二重特異性（ＰＢ）抗体ＰＧ３００４、ＰＧ３１７８、ＰＢ３５６６、ＰＢ３７１０、ＰＢ３４４３、ＰＢ３４４８およびＰＢ３４４１のうちの１つを投与された。二重特異性抗体の組成の詳細は、表９に示される。

試験した５つ全ての二重特異性抗体は、腫瘍成長を阻害することができた。二重特異性ＨＥＲ２×ＨＥＲ３抗体処置した動物の平均腫瘍量（ＢＬＩ）は、トラスツズマブ＋ペルツズマブの組み合わせで処置した動物のものと類似であった（図４）。

第２のＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２異種移植モデル（図５）では、１つの群が陰性コントロール抗ＲＳＶ抗体（コントロールＩｇＧ）を投与され、１つの群が陽性コントロール抗体の組み合わせトラスツズマブ＋ペルツズマブ（１：１ｖ／ｖ）を投与された。残り５つの群は、抗体ＰＧ３１６３、ＰＢ３９８６、ＰＢ３９９０、ＰＢ４０１１およびＰＢ３８８３のうちの１つを投与された。二重特異性ＰＢ抗体の詳細について：表９。これらの二重特異性抗体は、同じＨＥＲ２アームＭＦ２９７１と組み合わされた３つの異なるＨＥＲ３結合アーム、およびＨＥＲ３結合アームＭＦ３１６３と組み合わされたさらなるＨＥＲ２アームを含んだ。この実験では、コントロール群中の腫瘍は、第１の実験と同じレベルの加速された成長を示さず、結果の解釈を複雑化した。それにもかかわらず、トラスツズマブ＋ペルツズマブと比較して、ＰＢ３８８３およびＰＢ３９９０ＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性は、類似の阻害活性を有していた（図５）。

ｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏのデータに基づいて、そのＨＥＲ２アームがＭＦ２９７１、ＭＦ３００４、ＭＦ１８４９から構成され、ＨＥＲ３アームがＭＦ３１７８から構成される、二重特異性パネルの抗体を選択した。ＭＦ２９７１およびＭＦ３００４アームは、マウス起源のものであり、それらをヒト化した。

親モノクローナル抗体と比較した二重特異性ＨＥＲ２×ＨＥＲ３抗体の結合
それらの親対応物と比較した、ＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体の結合を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。ＦＡＣＳを、ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２細胞およびＭＣＦ−７細胞に対して実施し、抗体の連続滴定は、２，５μｇｇ／ｍｌ〜０，０１μｇｇ／ｍｌの範囲であった。試験した抗体パネルは、二重特異性抗体ＰＢ３５６６ならびにその親抗体、抗ＨＥＲ３抗体ＰＧ３１７８および抗ＨＥＲ２抗体ＰＧ３００４から構成された。ＭＦＩデータをプロットしたところ、両方の細胞株についてのグラフは、二重特異性ＰＢ３５６６が、抗ＨＥＲ３抗体ＰＧ３１７８および抗ＨＥＲ２抗体ＰＧ３００４と比較して、両方の腫瘍細胞株により効率的に結合することを示す（図６）。

ＭＦ２９７１およびＭＦ３００４のヒト化
ＭＦ２９７１およびＭＦ３００４を、当技術分野で公知のテクノロジーに従ってヒト化した。ＭＦ２９７１の合計７つのヒト化／脱免疫化バリアント配列を発現させ、検証し、ｉｎｖｉｔｒｏでモノクローナルとして、ＨＥＲ３特異的抗体ＭＦ３１７８と二重特異性形式で組み合わせて特徴付けた。７つのＭＦ２９７１バリアント中のＭＦ２９７１のＨＣＤＲ３をＭＦ３００４のＨＣＤＲ３で置き換えることによって創出したＭＦ３００４の７つのバリアント配列について、同じことを行った。全てのヒト化バリアントの発現、完全性、熱安定性および機能的活性を分析した。産生、完全性、安定性および機能性完全性に基づいて、ＭＦ２９７１のバリアント（２９７１−ｖａｒ２）を、ＭＦ３１７８と二重特異性形式で使用されるＶＨの最適なヒト化バリアントとして選択した。この２９７１−ｖａｒ２を、ＭＦ３９５８と改名した。二重特異性ＨＥＲ２×ＨＥＲ３組み合わせＭＦ３９５８×ＭＦ３１７８は、ＰＢ４１８８を生じた。

ＰＢ４１８８の大規模産生、精製および分析的研究
懸濁適応させた２９３ＦＦｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を、エルレンマイヤー・フラスコ中で、３．０×１０^６細胞／ｍｌの密度まで、シェーカー・プラトーで培養した。細胞を、４Ｌエルレン・フラスコ中に、０．３〜０．５×１０^６生存細胞／ｍｌの密度で播種した。これらの細胞を、個々の無菌ＤＮＡ：ＰＥｌ混合物で一過的にトランスフェクトし、さらに培養した。トランスフェクションの７日後、二重特異性抗体を含む馴化培地を、低速遠心分離、５分間１０００ｇによって、その後、高速遠心分離、４０００ｇで５分間によって回収した。収集された馴化培地を、５ｋＤａＳａｔｏｒｉｕｓｈｙｄｒｏｓａｒｔカセットで約６００ｍｌに濃縮し、引き続いて、４ＬのＰＢＳに対して透析濾過した。抗体を、約３５ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅＸＬ（１１℃）に対して、カラム上に結合させた。非特異的（Ａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）に結合したタンパク質を、１５０ｍｌＰＢＳ、１ＭＮａＣｌ含有１５０ｍｌＰＢＳ、１００ｍｌＰＢＳを用いて逆流様式でカラムを洗浄することによって除去した。結合した抗体を、１００ｍＭクエン酸塩ｐＨ３．０を使用して逆流様式で溶出させ、５ｍｌの画分を、中和のために、４ｍｌの１ＴｒｉｓｐＨ８．０を含む１０ｍｌチューブ中に収集した。溶出した抗体を、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００５０／１０００を使用するゲル濾過によって、さらに精製した。この精製された抗体を、０．２２μｍシリンジ・フィルターを使用してフィルター滅菌した。ＩｇＧ濃度を、ＯＤ２８０測定によって決定し、タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算した。タンパク質を、凝集（ＨＰＳＥＣ）、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｎＭＳ、ＩＥＸおよびＩＥＦ）について試験した。タンパク質サンプルを−８０℃で貯蔵した。

分析研究および異種移植研究のためのＩｇＧ精製
中規模精製を、ＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラムおよびＨｉＴｒａｐ脱塩カラムを使用して、ＡＫＴＡ１００Ｅｘｐｌｏｒｅｒで実施した。サンプルを、５ｍｌ／分でロードした。カラムを、２カラム体積のＰＢＳで洗浄した。ＩｇＧを、０．１Ｍクエン酸塩緩衝液を用いてｐＨ３．０で溶出した。次に、サンプルを脱塩し、ＰＢＳｐＨ７．４の最終緩衝液中で終えた。ＩｇＧを、０．４５μＭフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して濾過した。ＩｇＧ濃度を、プロテインＡセンサーを用いてＯｃｔｅｔを使用して測定した。タンパク質を、凝集（ＨＰＳＥＣ）、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｎＭＳ、ＩＥＸおよびＩＥＦ）について試験した。タンパク質サンプルを−８０℃で貯蔵した。

ＰＢ４１８８の分析的特徴付け
ＰＢ４１８８（ＭＦ３９５８×ＭＦ３１７８）を、ＨＰ−ＳＥＣおよびＣＩＥＸ−ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル−ＳＴＡＴ７μｍカラム、４．６ｍｍＩＤ×１０ｃｍＬ）による分析に供した。ＰＢ４１８８の分析プロファイルは、通常の単一特異性ＩｇＧ１、例えば、親ＨＥＲ２アームＰＧ３９５８および抗ＲＳＶモノクローナル・コントロール抗体の挙動と、概して一致していた（図７）。

親和性決定
組換えＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対するＰＢ４１８８およびＰＢ３４４８の一価結合親和性を、ＳＰＲ（ＢｉａｃｏｒｅＴ１００）によって決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、記載された全ての実験を実施した。センサー表面準備および相互作用分析を、２５℃で実施した。緩衝液およびＢｉａｃｏｒｅ試薬は、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。ＥｒｂＢ２−ＦｃおよびＥＲｂＢ３−Ｆｃ（ＲＮＤ）を、５００ＲＵの標的固定化レベルで、酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中でＣＭ５センサー・チップの表面にコートした。ランニング緩衝液は、フィルター滅菌したＨＢＳ（ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水）：１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０；０．２μｍ）であった。これらの二重特異性抗体を、ＨＢＳ中１００、５０、２０、１０、１および０．１ｎＭに希釈し、ＣＭ５センサー・チップの抗原カップリングした表面上に高い（３０μｌ／分）流速で実行した。ＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて、１：１の一価相互作用についての曲線適合モデルは、ＨＥＲ２アームの親和性（一価相互作用）の決定を可能にし、ＨＥＲ２アームの親和性が決定できた。ＨＥＲ３アームの低オフ・レートに起因して、その親和性は決定できなかった。ＨＥＲ３アームの親和性を決定するために、ＰＢ４１８８を、５００ＲＵの標的固定化レベルでＣＭ５センサー・チップにコートした。Ｈｅｒ２−ＦｃおよびＨｅｒ３−Ｆｃ抗原を、ＨＢＳ中１００、５０、２０、１０、１および０．１ｎＭに希釈し、ＰＢ４１８８表面上に高い流速（４０μｌ／分）で実行した。ｋ_オンおよびｋ_オフ値を決定するために、ＢＩＡ評価ソフトウェアを、一価分子をセンサー・チップ表面にコートしたことおよびＥｒｂＢ３−Ｆｃ抗原が二価分子であることを考慮に入れるモデルと併せて使用した。ＰＢ４１８８およびＰＢ３４４８の親和性を、表１０に示す。

細胞上でのＰＢ４１８８親和性決定
結合親和性もまた、ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３細胞を使用し、定常状態細胞親和性測定によって決定した。４つのＩｇＧを分析した：１）抗ＨＥＲ２抗体３９５８および抗ＨＥＲ３抗体３１７８を含む、ＰＢ４１８８（二重特異性ＨＥＲ２×ＨＥＲ３）；２）抗ＨＥＲ３抗体３１７８および抗ＴＴ（破傷風トキソイド）抗体１３３７を含む、ＰＢ９２１５（二重特異性ＨＥＲ３×ＴＴ）；３）抗ＨＥＲ２抗体３９５８および抗ＴＴ抗体１３３７を含む、ＰＢ９２１６（二重特異性ＨＥＲ２×ＴＴ）；４）ハーセプチン（単一特異性ＨＥＲ２）。ＩｇＧを、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）ＰｒｅｃｏａｔｅｄＩｏｄｏｎａｔｉｏｎＴｕｂｅｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）および付随の指示書を使用して、^１２５Ｉで放射活性標識した。標識されたＩｇＧを、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．４ＭＮａＣｌ、０．２５％ＢＳＡ、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ_３中で、約１〜２×１０^８ｃｐｍ／ｍｌの活性に希釈した。タンパク質濃度を、ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３細胞を使用した、標識されたＩｇＧおよび非標識ＩｇＧのフロー・サイトメトリー分析は、標識化後に、結合における低減の徴候を示さなかったか、または軽微な徴候のみを示した。定常状態細胞親和性測定を、以下のように実施した。細胞を、９６ウェル・プレート中に播種し、種々の濃度の標識されたＩｇＧと共に４℃でインキュベートした。未結合の放射活性を、４時間後に除去し、細胞結合した放射活性を、ガンマ・ウェル・カウンターを使用して測定した。非特異的結合を、受容体遮断濃度（１００倍過剰）の未標識の抗体を添加することによって測定した。各条件を、３連で試験し、抗体１つにつき３つの独立した実験を実施した。Ｋ_Ｄ値を、Ｐｒｉｓｍ６．０ｄ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、非特異的結合について補償する非線形回帰モデルに基づいて計算した。適合された曲線を含むグラフを、両方の細胞株へのＨＥＲ２×ＨＥＲ３ＩｇＧ（ＰＢ４１８８）の結合について、図２０に示す。平均値を含む２４全てのアッセイについてのＫ_Ｄデータを、表１２に示す。まとめると、ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３細胞を使用して決定した平均ＫＤ値は、それぞれ、ＨＥＲ２×ＨＥＲ３について３．２および２．０ｎＭ、ハーセプチンについて３．７および１．３ｎＭ、ＨＥＲ２×ＴＴについて３．９および２．３ｎＭ、ならびにＨＥＲ３×ＴＴについて０．２３および０．９９ｎＭであった。従って、ＰＢ４１８８は、ＨＥＲ３と比較してより高い親和性でＨＥＲ２を標的化するＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性分子ＭＭ−１１１とは対照的に、ＨＥＲ２と比較してＨＥＲ３に対してより高い親和性を示す。

ＨＥＲ２増幅された乳癌細胞に対する抗増殖活性
軟寒天におけるＪＩＭＴ−１
ＰＢ３４４８およびＰＢ４１８８を、軟寒天におけるトラスツズマブ耐性ＪＩＭＴ−１細胞の成長を阻害する強度について試験した。この目的のために、９６ウェル懸濁細胞培養物プレートを準備した。１００μＬの軟寒天下層（完全培地中０，６％の最終濃度）を注ぎ、凝固させた。次いで、１０．０００のＪＩＭＴ−１細胞／ウェルを含む５０μＬの軟寒天上層（０，４％の最終濃度）を、上に添加し、凝固させ、かかる９６ウェル・プレートを、３７℃、１０％ＣＯ２で終夜インキュベートした。次の日、陰性コントロール抗体、ペルツズマブ＋トラスツズマブ（１：１ｖ／ｖ）、ＰＢ３４４８およびＰＢ４１８８を、１０〜０，００３μｇ／ｍｌの範囲の片対数滴定で、ＤＭＥＭ培地中に添加した。引き続いて、アッセイを、細胞培養インキュベーター中で８日間インキュベートした。最後に、細胞を、３７℃でＡｌａｍａｒＢｌｕｅと共に３〜５時間インキュベートし、蛍光強度を決定した（励起：５６０ｎｍ；発光：５９０ｎｍ）。ＰＢ３４４８およびＰＢ４１８８によるＪＩＭＴ−１増殖の用量依存的阻害の一例が示される（図８）。

マトリゲルにおけるＢＴ−４７４およびＳＫＢＲ−３
ＰＢ３４４８およびＰＢ４１８８を、ＢＴ−４７４およびＳＫＢＲ−３細胞の成長を阻害する強度について試験した。３次元マトリゲルにおいて細胞を増殖させ、処置された細胞と非処置の細胞を識別するために主成分分析を使用する、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを本拠とするＯｃｅｌｌｏ社で、細胞を試験した。２０００のＳＫ−ＢＲ−３細胞または２２５０のＢＴ４７４細胞を、３８４ウェル・プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ７８１０９１）のウェル１つ当たり１５μｌのマトリゲル中に播種した。次の日、１０〜０．００３μｇ／ｍｌの範囲の抗体の片対数滴定を、５ｎｇ／ｍｌのＨＲＧの非存在下または存在下で培養培地中に添加した。試験抗体は、陰性コントロール抗体、ペルツズマブ＋トラスツズマブ（１：１ｖ／ｖ）、ＰＢ３４４８、ＰＢ４１８８および二重特異性抗ＥＧＦＲ×ＨＥＲ３ツー・イン・ワン抗体ＭＥＨＤ７９４５Ａを含んだ。さらに、ＨＲＧの用量依存的滴定を、陽性コントロールとして含めた。各用量を、４連で試験した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で細胞培養インキュベーター中において７日間インキュベートした。次に、細胞を固定し、細胞のアクチン細胞骨格をファロイジンで染色し、核をヘキストで染色した。次に、蛍光画像を、ゲル（Ｚ−スタック）を通じて異なるレベルで撮影し、画像を重ねた。広い範囲の形態学的特徴を測定した（合計で８００）。培地処置とＨＲＧ処置との間で異なった特徴だけを、分析のために選択した。成長と関連した特徴、平均球状体面積および球状体当たりの核は、培地処置とＨＲＧ処置との間で、最も顕著に異なっていた。マルチパラメーター分析および単一パラメーター分析の両方を行った。単一パラメーター測定のために、ｔ検定を実施して、培地に対して処置（ＨＲＧまたは抗体）を比較した。各点についてのＰ値を決定した。変動性のほとんどを捕捉する、高次元データの低次元組み合わせを見出すための方法である主成分分析（ＰＣＡ）を、抗体濃度との関連で使用して、データをプロットした。図９は、ＨＲＧの存在下での、ペルツズマブ＋トラスツズマブ（１：１ｖ／ｖ）、ＰＢ３４４８およびＰＢ４１８８の効果を実証している。両方のＨＥＲ２増幅された乳癌細胞株において、ＰＢ４１８８は、ＨＲＧの存在下で、ペルツズマブ＋トラスツズマブ、ＰＢ３４４８およびツー・イン・ワン抗体ＭＥＨＤ７９４５Ａと比較して、優れた活性を示した。

ＨＥＲ２増幅された乳癌細胞に対する、ＨＲＧの存在下でのＰＢ４１８８の優れた抗増殖活性
ＳＫＢＲ−３およびＢＴ−４７４に対する、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧの存在下でのＰＢ４１８８の活性を、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３抗体およびそれらの組み合わせのパネルと比較した。アッセイを、上記のようにマトリゲルにおいて実施し、形態学的特徴を分析した。図１０ａ中にプロットしたＰＣＡデータは、マトリゲルにおけるＳＫＢＲ−３細胞のＨＲＧ誘導性の増殖および分岐／浸潤を示している。図１０ｂは、抗体ＰＢ４１８８が、ＨＲＧ誘導性表現型を完全に復帰させることができるが、親モノクローナル抗体の組み合わせ（ＰＧ３９５８＋ＰＧ３１７８）は効果を有さないことを示している。さらに、ＰＢ４１８８は、試験した全ての抗ＨＥＲ３抗体と比較して、はるかに効果的であった（図１０ｃ）。さらに、個々の抗ＨＥＲ３抗体とトラスツズマブとの組み合わせ（転移性乳癌（ｍＢＣ）の治療における現在の標準）は、ＨＲＧ誘導性表現型を復帰させることができなかった（図１０ｄ）。ＨＲＧの存在下でＰＢ４１８８にトラスツズマブを追加することで、ＰＢ４１８８単独と比較して、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖および分岐／浸潤は低減された（図１０ｅ）。

ＨＥＲ２およびＨＥＲ３モノクローナル抗体と比較した、ＨＥＲ２増幅された胃癌細胞に対するＰＢ４１８８の優れた抗増殖活性。
ＮＲＧ１−β１の上方調節は、ＨＥＲ２標的化治療に対する重要な耐性機構である（Ｗｉｌｓｏｎ、２０１２）。ＮＲＧ１−β１の上方調節がＰＢ４１８８による抗増殖の強度を妨害するかどうかを評価するために、抗体のパネルを、Ｎ８７（ＨＥＲ２増幅された）胃癌細胞株に対して、１００ｎｇ／ｍｌのＨＲＧで試験した。Ｎ８７細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。増殖アッセイのために、Ｎ８７細胞のコンフルエント未満の細胞培養物を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地（０．０５％ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌのホロ・トランスフェリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）中で２回洗浄した。抗体を、１〜０，０００１μｇ／ｍｌで変動する片対数滴定で希釈した。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＨＲＧの存在下で１００００細胞／ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って添加し、暗中で９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。蛍光を、５５０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で測定した。ＰＢ４１８８は、抗ＨＥＲ２または抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体よりも優れた活性を示した（図１１）。

ＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体は、ＡＤＣＣを誘導する
ＡＤＣＣ活性は、癌における、治療的抗体にとって重要な抗腫瘍作用機構である。セツキシマブおよびトラスツズマブなどの、ＨＥＲファミリーの受容体に対するヒト・モノクローナル抗体は、ＡＤＣＣを誘導する。ＰＢ４１８８およびＰＢ３４４８のベースラインおよび増強されたＡＤＣＣ活性を、検証されたｉｎｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイにおいて決定した。トラスツズマブおよび陰性コントロール抗体を、実験中にコントロール抗体として含めた。全血およびＰＢＭＣ画分を、健康なドナーから取得した。各抗体を、ＨＥＲ２高（ＳＫ−ＢＲ−３）およびＨＥＲ２低（ＭＣＦ−７）発現性の標的細胞に対して試験した。標的細胞に、^５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をロードし、示された濃度の抗体でオプソニン化した。全血またはＰＢＭＣ画分を、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％熱不活化ＦＣＳ中２００μＬの反応において、エフェクター細胞として使用した。細胞を、４時間一緒にインキュベートし、溶解を、γ−シンチレーターを使用して上清中の放射活性を測定することによって推定した。特異的溶解の百分率を、以下のように計算し：（実験的ｃｐｍ−基底ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−基底ｃｐｍ）×１００、ここで、最大溶解を、抗体およびエフェクターの非存在下で５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および基底溶解の存在下で決定した。図１２に示されるように、二重特異性抗体ＰＢ３４４８は、組み合わせペルツズマブ＋トラスツズマブと比較して、類似のＡＤＣＣ活性を示した。二重特異性抗体ＰＢ４１８８は、高い抗体濃度（１０μｇ／ｍｌ）で有効であった。

ＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体は、親抗体の組み合わせと比較して、より高いＡＤＣＣを示す
異なるＡＤＣＣ設定では、ＡＤＣＣＲｅｐｏｒｔｅｒＢｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。このバイオアッセイは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体、Ｖ１５８（高親和性）またはＦ１５８（低親和性）バリアント、およびホタル・ルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定に発現する操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を使用する。このアッセイは、古典的^５１Ｃｒ放出アッセイに対して、ＡＤＣＣＲｅｐｏｒｔｅｒＢｉｏａｓｓａｙを用いて得られたデータを比較することによって検証された。これらのＡＤＣＣアッセイを、３８４白色ウェル・プレートを使用した、ＰｒｏｍｅｇａＡＤＣＣＢｉｏａｓｓａｙキットを使用して実施した。この実験設定では、ＳＫＢＲ−３細胞を、バイオアッセイの２０〜２４時間前に、３０μｌのアッセイ培地（４％の低ＩｇＧ血清を含むＲＰＭＩ）中、１０００細胞／ウェルの密度でプレートした。次の日、培養培地を除去した。次に、抗体ＰＢ４１８８、ならびにその親抗ＨＥＲ２ＰＧ３９５８および抗ＨＥＲ３ＰＧ３１７８ならびにそれらの組み合わせの連続希釈を、２連で作製した。１０μｌ抗体希釈を、ウェルに添加した。抗体の出発濃度は１０μｇ／ｍｌであり、１０点の片対数倍連続希釈を作製して、完全な用量応答曲線を提供した。最後に、５μｌのＡＤＣＣＢｉｏａｓｓａｙエフェクター細胞（１５０００細胞／ウェル、Ｖ１５８）を添加した。これらの細胞を、３７℃で６時間インキュベートした。次に、１５μｌのＢＩＯ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を添加し、５分後、ルミネセンスを、プレート・リーダーで検出した。得られたデータを図１３に示す。ＰＢ４１８８二重特異性抗ＨＥＲ２×ＨＥＲ３抗体は、親ＨＥＲ２およびＨＥＲ３モノクローナルまたはそれらの組み合わせと比較して、より高いＡＤＣＣ強度を示した。

ＰＢ４１８８のＡＤＣＣ増強
ＡＤＣＣ活性は、異なる技術によって増強され得、そのうちの１つは、フコースの除去である。フコースの除去は、いくつかのｉｎｖｉｖｏモデルにおいて、増加した抗腫瘍活性を生じている［Ｊｕｎｔｔｉｌａ、２０１０］。ＰＢ４１８８の活性を最大化するために、非フコシル化テクノロジーを適用し（ＣｈｅｎｇＬｉｕおよびＡｎｄｒｅｉａＬｅｅ．ＡＤＣＣＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｆｏｒＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｎｔｉｂｏｄｙ．Ａｎｔｉｂｏｄｙｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏ／ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ２００９［１３〜１７］）、それによって、Ｆｃ領域中のＮ結合型炭水化物構造のフコシル化を防止する。野生型ＰＢ４１８８と比較した、非フコシル化されたＰＢ４１８８のＡＤＣＣ強度を、ＨＥＲ２低発現性細胞（ＭＣＦ−７）およびＨＥＲ２増幅された細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）を使用して、ＡＤＣＣ^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて決定した。両方の抗体を、連続希釈で適用し、陰性コントロール抗体およびトラスツズマブを、このアッセイ中に含めた。図１４は、高ＨＥＲ２発現性細胞および低ＨＥＲ２発現性細胞の両方における、野生型バージョンおよび／またはトラスツズマブと比較した、非フコシル化されたＰＢ４１８８のＡＤＣＣ強度における増加を示している。

非フコシル化されたＰＢ４１８８は、低親和性ＦｃγＲＩＩＩ受容体と共に優れたＡＤＣＣ活性を示す
非フコシル化されたＰＢ４１８８の活性を、Ｖ１５８（高親和性）ＦｃγＲＩＩＩａ受容体バリアントまたはＦ１５８（低親和性）ＦｃγＲＩＩＩａ受容体バリアントのいずれかを含むＡＤＣＣレポーター細胞に対して試験した。抗体、即ち、コントロール抗体、トラスツズマブおよび非フコシル化されたＰＢ４１８８の連続滴定を、接着性ＳＫ−ＢＲ−３細胞に、異なるＦｃγＲＩＩＩａバリアントを保有するＡＤＣＣレポーター細胞と組み合わせて添加した。ＡＤＣＣ活性を、ルシフェラーゼ活性を測定することによって測定した。非フコシル化されたＰＢ４１８８は、高親和性Ｖ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ受容体バリアントと組み合わせると、トラスツズマブと比較して、等しい活性を示した。対照的に、非フコシル化されたＰＢ４１８８は、低親和性Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ受容体バリアントと組み合わせると、トラスツズマブと比較して、優れたＡＤＣＣ活性を示した（図１５）。

ＪＩＭＴ−１異種移植研究
ＪＩＭＴ−１ヒト乳癌腫細胞を、移植の時まで、１０％胎仔ウシ血清、１００単位／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ中で成長させた。移植当日、ＪＩＭＴ−１乳房細胞を、対数期成長の間に回収し、冷ＰＢＳ中に再懸濁した。雌性ＣＢ．１７ＳＣＩＤマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）は、研究１日目に８週齢であり、１６．５〜２０．７ｇの体重範囲を有していた。各マウスに、５×１０^６の腫瘍細胞（０．２ｍＬ細胞懸濁物）を右側腹に皮下注射した。これらの腫瘍を、２次元でノギスによって測定して、サイズをその平均体積として１週間に２回モニタリングした。腫瘍がおよそ１００〜１５０ｍｍ^３のサイズに達したところで、動物を、効力研究へと進めたた。異常値動物−腫瘍体積−を除去し、マウスを、各々１０匹のマウスの群中にランダムに分配した。マウスに、４週間の期間にわたって、１週間に１回（抗体）または１日１回（ラパチニブ）注射した。処置群の詳細を表１１に示す。

腫瘍サイズを、ノギス測定によって毎週測定した。この効力研究により、両方の投薬スケジュールにおけるＰＢ４１８８が等しく有効であり、ラパチニブまたはペルツズマブおよびトラスツズマブの組合せよりも強力であったことが明らかになった。データを図１７および１８に示す。

ＰＢ４１８８は、ＨＲＧ媒介性の耐性を克服できる
ＮＲＧ１−β１の上方調節は、ＨＥＲ２標的化治療に対する重要な耐性機構である（Ｗｉｌｓｏｎ、２０１２）。ＰＢ４１８８を、漸増する濃度のＨＲＧ（ＮＲＧ１−β１ＥＧＦ）の存在下で、連続滴定でその親抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体ＰＧ３１７８と比較して試験した。この目的のために、Ｎ８７細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。増殖アッセイのために、Ｎ８７細胞のコンフルエント未満の細胞培養物を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地（０．０５％ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌのホロ・トランスフェリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）中で２回洗浄した。抗体を、１から０．０００１μｇ／ｍｌまでの範囲の片対数滴定で希釈した。細胞を、漸増する濃度のＨＲＧ（０．０４〜３９，５ｎＭ）の存在下で１００００細胞／ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って添加し、暗中で９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。蛍光を、５５０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で測定した。ＰＢ４１８８は、親抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体と比較して優れた活性を示した（図１９）。

従って、例えばＮＲＧ１−β１の上方調節などの逃避機構の場合、本発明に従う二重特異性抗体が好ましい。

ＨＥＲ２／ＨＥＲ３特異的ＩｇＧのエピトープ・マッピング
ショットガン変異誘発実験
アラニン・スキャニング変異誘発を使用して、それぞれＨＥＲ２およびＨＥＲ３について、ＰＧ３９５８およびＰＧ３１７８のエピトープをマッピングした。ショットガン変異誘発アッセイでは、クローンを作製するが、ここでＨＥＲ２／ＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の各アミノ酸残基を、アラニンに置換する。次に、細胞アレイを、リバーストランスフェクションによって調製した（米国特許出願公開第２０１１／００７７１６３号Ａ１）。従って、各クローンのＤＮＡを、リポフェクタミンと混合し、この混合物を、３８４ウェル・プレートの特化したウェル中に配置した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、各ウェルに添加し、タンパク質の発現を、２４時間後に測定した。引き続いて、抗体の反応性を、免疫蛍光染色によって測定し、結合マップおよび抗体結合のための重要残基の同定をもたらした。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３ＥＣＤ構築物の発現レベルを、市販のモノクローナル抗体（Ｒ＆ＤｍＡｂ１１２９（ＨＥＲ２）およびＲ＆ＤｍＡｂ６６２２３（ＨＥＲ３））を使用してＦＡＣＳ分析によって検証した。

ＨＥＲ２
ＨＥＲ２ＥＣＤ変異体への一価ＰＧ３９５８Ｆａｂの結合を、このアッセイにおいて０．２５μｇ／ｍｌの濃度で試験し、ストリンジェントな洗浄条件を使用した（ｐＨ９．０、３５０ｍＭＮａＣｌ）。これにより、コントロールｍＡｂの結合を保持しつつ、ＷＴＨＥＲ２と比較して、ＰＧ３９５８Ｆａｂの３５％未満の残留結合を示した、ＨＥＲ２における３つの「重要」残基（Ｔ１４４、Ｒ１６６、Ｒ１８１）が同定された。ＨＥＲ２構造中の重要残基近傍に位置する２つの残基（Ｐ１７２、Ｇ１７９）は、顕著ではあるが、より重度ではない結合の喪失を示し、これらを「二次重要」残基と称した（表１３および図２１Ａ）。これら全ての、表面に露出した残基は、ＨＥＲ２のドメインＩ中に位置し、これらは、一緒になって、ＨＥＲ２分子の表面上に非連続的パッチを形成する。

確認実験ＨＥＲ２エピトープ
野生型（ＷＴ）ＨＥＲ２ＥＣＤおよび表１３に列挙されるＨＥＲ２ＥＣＤバリアントをコードする構築物を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現させた。表面に露出しており、決定された重要残基に対し構造的に近傍にある３つのドメインＩ残基を、さらなる分析に選択した。チロシンへのＴ１６４、Ｓ１８０およびＤ１４３の点変異を、ＨＥＲ２ＥＣＤ構築物において作製し、得られた構築物もまた、ＣＨＯ−Ｋ１において発現させた。Ｌ１５９ＡＨＥＲ２ＥＣＤバリアントを、コントロール・サンプルとして、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現させた。

ＦＡＣＳ滴定実験においてＥＣＤバリアントへの結合について試験した二重特異性ＰＧ３９５８×ＴＴ抗体。ＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブを使用して、細胞表面におけるＨＥＲ２ＥＣＤ発現を検証した。平均ＭＦＩ値をプロットし、各曲線について、ＡＵＣを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して計算した。ＷＴＨＥＲ２結合を使用して、データを標準化した。このＦＡＣＳデータは、Ｔ１４４Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｒ１８１Ａ、Ｐ１７２Ａ、Ｇ１７９Ａに加えて、変異Ｔ１６４ＹおよびＳ１８０Ｙが、ＰＧ３９５８×ＴＴ抗体の結合において顕著な低減を生じたことを示した（図２２）。Ｄ１４３Ｙ変異は、コントロールｍＡｂの減少した結合によって実証されるように発現の重度の喪失を生じ、従って、ＰＧ３９５８エピトープにおけるその潜在的な役割は決定できなかった。

ＨＥＲ３
ＦＡＣＳにおける、ＨＥＲ３ＥＣＤ変異体への、０．２５μｇ／ｍｌのＰＧ３１７８ＩｇＧの結合分析により、コントロールｍＡｂの結合が保持されつつ、アラニンへの変異がＷＴＨＥＲ３と比較して結合の実質的な喪失を引き起こした、２つのいわゆる「重要」残基（Ｆ４０９、Ｒ４２６）が同定された（表１４および図２３）。両方の残基は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩ中に位置し、空間的に遠位である。さらに、Ｆ４０９は、ＨＥＲ３疎水性コア中に埋められ、ＰＧ３１７８エピトープの一部である可能性は低くなっている。

確認実験ＨＥＲ３エピトープ
ＣＨＯ−Ｋ１細胞に、ＨＥＲ３ＥＣＤ変異構築物（表１４中に列挙した）、ＷＴＨＥＲ３ＥＣＤおよび２つのコントロール構築物（Ｈ４０７ＡおよびＹ４２４Ａ）をトランスフェクトした。ＨＥＲ３ＥＣＤバリアントへのＰＧ３１７８結合を、ＦＡＣＳ滴定実験において試験した。ＨＥＲ３のドメインＩ（ＭＭ−１２１）およびドメインＩＩＩ（ＭＥＨＤ７９４５Ａ）に結合する２つのコントロール抗体を、細胞表面上のＨＥＲ３ＥＣＤ発現を検証するために含めた。平均ＭＦＩ値をプロットし、各曲線について、ＡＵＣを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して計算した。ＷＴＨＥＲ３結合を使用して、データを標準化した。Ｒ４２６Ａ変異は、ＰＧ３１７８結合に重要であることが示されたが、Ｆ４０９Ａへの結合は、細胞表面での発現の喪失に起因して確認できなかった（図２４）。

ｉｎｖｉｔｒｏの心筋細胞に対するＰＢ４１８８活性
ＨＥＲ２は、ヘレグリン受容体複合体ＨＥＲ２：ＨＥＲ４が関与するシグナル伝達ネットワークの一部として、成体心筋細胞の成長、修復および生存に関与する。心臓毒性は、ＨＥＲ２標的化における公知の危険因子であり、合併症の頻度は、トラスツズマブがアントラサイクリンと併せて使用される場合に増加し、それによって、心臓負荷を誘導する。ヒト幹細胞由来の心筋細胞に基づくモデル系を使用して、ＰＢ４１８８の潜在的毒性を試験し、アントラサイクリン・ドキソルビシンの存在下で、トラスツズマブならびにトラスツズマブおよびペルツズマブの組み合わせに対して、その潜在的毒性を評価した。ヒト幹細胞由来の心筋細胞（ＰｌｕｒｉｏｍｉｃｓＢＶ）を、白色平底アッセイ・プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ６５５０９８）中に、２０．０００ウェルの濃度で播種した。培養の５日目に、培地を、１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧを補充したグルコースおよびガラクトース・フリーの培養培地に置き換えた。７日目に、試験抗体を、ドキソルビシン（３μＭ）と組み合わせて添加した。細胞生存度を、ＰｒｏｍｅｇａＣｅｌｌ力価Ｇｌｏアッセイを使用して、９日目にアッセイした。単一特異性抗体は、６８ｎＭの単一濃度で試験したが、ＰＢ４１８８は、３μＭのドキソルビシンの存在下で３つの濃度で試験した。図２５は、心筋細胞の生存度が、試験した全てのＰＢ４１８８濃度によって影響を受けなかったことを示している。対照的に、トラスツズマブならびにトラスツズマブおよびペルツズマブの組み合わせの両方が、心筋細胞の細胞生存度を低減させた。

異なるＨＥＲ２レベルを有する細胞へのＰＢ４１８８の結合
トラスツズマブおよびＨＥＲ３抗体Ｕ１−５９と比較した、ＰＢ４１８８の結合を、異なるレベルのＨＥＲ２を発現する乳癌細胞株および胃癌細胞株に対するＦＡＣＳによって分析した。細胞を、それらが数百万のＨＥＲ２コピーを発現する場合、および／またはＨＥＲ２遺伝子増幅されている場合、ＨＥＲ２＋＋＋とみなした。以下の細胞株を使用した：ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２＋）；ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ２＋、ＭＫＮ−４５（ＨＥＲ２＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５（ＨＥＲ２＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＨＥＲ２＋＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＨＥＲ２＋＋）、ＺＲ−７５−１（ＨＥＲ２＋＋）、ＪＩＭＴ−１（ＨＥＲ２＋＋＋）、ＢＴ−４７４（ＨＥＲ２＋＋＋）、ＳＫＢＲ−３（ＨＥＲ２＋＋＋）、ＳＫ−ＯＶ−３（ＨＥＲ２＋＋＋）、Ｎ８７（ＨＥＲ２＋＋＋）。指数関数的に成長した培養物の細胞を、トリプシンによって回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．５ｍＭＥＤＴＡ）中１０^６細胞／ｍｌに希釈した。１〜２×１０^５細胞を、Ｕ底９６ウェル・プレート中の各ウェルに添加した。細胞を、４℃で３００ｇで２分間遠心分離した。上清を、上記のプレート（複数可）を反転させ、その後１回はじくことによって廃棄した。５０μｌの各ＩｇＧサンプルを、３．１６ｎｇ〜１０μｇ／ｍｌの連続希釈で添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞を、１回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。５０μｌの１：１００希釈したマウス抗ヒトＩｇＧガンマＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、暗中で氷上で３０〜６０分間インキュベートした。細胞を、１回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＨＴＳ設定のＦＡＣＳＣａｎｔｏフロー・サイトメーターで分析した。結合した抗体の量を、中央値蛍光によって評価した。データをプロットし、曲線下面積（ＡＵＣ、中央値蛍光強度の累積測定値）を、試験した細胞株当たりで、各抗体について決定した（図２６）。

この実験から、ＰＢ４１８８が、トラスツズマブと比較して、ＨＥＲ２＋＋＋細胞、ＨＥＲ＋＋細胞およびＨＥＲ＋細胞に対するより高い結合親和性を有すると結論付けられる。

トラスツズマブとの同時結合
ＰＢ４１８８およびトラスツズマブは、ＨＥＲ２への結合について競合しない
ＰＢ４１８８は、ＨＥＲ２タンパク質のドメインＩに結合するが、トラスツズマブの結合エピトープは、ドメインＩＶ中に局在する。両方の抗体がＨＥＲ２結合について競合しないことを実証するために、ＨＥＲ２増幅されたＳＫＢＲ−３乳房細胞を用いた結合アッセイを実施した。最初に、未標識の抗体を、飽和濃度でＳＫＢＲ−３に結合させた。次に、ＦＩＴＣ標識されたＰＢ４１８８を、滴定範囲内で添加し、蛍光をＦＡＣＳによって測定した。図２７は、ＰＢ４１８８^ＦＩＴＣが、トラスツズマブまたは陰性コントロールの存在下で細胞に効率的に結合したことを実証している。ＳＫＢＲ−３細胞とＰＢ４１８８とのプレインキュベーションは、ＰＢ４１８８^ＦＩＴＣが結合することを防止した。従って、トラスツズマブおよびＰＢ４１８８は、ＨＥＲ２への結合について競合しない。

ＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性分子によるＨＥＲ２のドメインＩの標的化は、ヘレグリン耐性を克服できる
ＨＥＲ２×ＨＥＲ３二量体上でのＰＢ４１８８の配向が、ＨＲＧストレス条件下での細胞増殖を阻害するのに好ましいかどうかを試験するために、３１７８のＨＥＲ３アーム、およびドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれかを標的化するＨＥＲ２アームから構成される二重特異性抗体を作製した。２つのＨＥＲ２×ＨＥＲ３二重特異性抗体を、ＨＥＲ２ドメインＩ〜ＩＶの各々のために作製した。ＨＥＲ２アームは以下を含んだ：ドメインＩを標的化するＭＦ３９５８およびＭＦ３００３；ドメインＩＩを標的化するＭＦ２８８９およびＭＦ２９１３；ドメインＩＩＩを標的化するＭＦ１８４７およびＭＦ３００１、ならびにドメインＩＶを標的化するＭＦ１８４９およびＭＦ１８９８。各ＨＥＲ２Ｆａｂアームを、３１７８のＨＥＲ３Ｆａｂアームと組み合わせ、高濃度のヘレグリンの存在下での細胞増殖を阻害するそれらの強度について試験した。抗体滴定を、ＨＥＲ２低発現性ＭＣＦ−７細胞ならびに、ＨＥＲ２過剰発現性のＮ８７およびＳＫ−ＢＲ−３細胞に対して実施した。Ｎ８７、ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７細胞のコンフルエント未満の細胞培養物を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地（０．０５％ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌのホロ・トランスフェリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）中で２回洗浄した。抗体を、片対数滴定で希釈した。細胞を、実験的に規定されたストレス濃度のＨＲＧ（ＳＫ−ＢＲ−３は１０ｎＭ、Ｎ８７およびＭＣＦ−７は１００ｎＭ）の存在下で、１００００細胞／ウェル（Ｎ８７、ＳＫＢ−ＢＲ−３）および５０００細胞／ウェルＭＣＦ−７の密度で添加した。これらの細胞を、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で３〜４日間培養した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して、増殖を評価した。吸光度を、５９０ｎｍの発光波長を用いて５５０ｎｍの励起波長で測定した。試験した全てのアッセイにおいて、ＨＥＲ２のドメインＩを標的化する二重特異性抗体のみが、高いヘレグリン濃度の存在下で増殖を阻害することができた（図２８）。

ｉｎｖｉｔｒｏでのＰＢ４１８８との薬物組み合わせ。
ＰＢ４１８８を小分子薬物と組み合わせる可能性を調査するために、ＰＢ４１８８を、ＰＩ３ＫまたはＭＡＰＫ経路の異なるレベルにおいて妨害する薬物と組み合わせた。さらに、化学療法薬物およびサイクリン阻害剤との組み合わせを試験した。組み合わせを、マトリゲルにおいてＨＲＧの存在下で（ＳＫ−ＢＲ−３およびＢＴ−４７４）、またはＨＲＧストレス濃度の存在下で（増殖アッセイに記載したように、Ｎ８７およびＳＫ−ＢＲ−３）成長しているＨＥＲ２過剰発現性細胞に対して試験した。薬物組み合わせの阻害効果を、画像化によって、またはＡｌａｍａｒＢｌｕｅを本明細書で上に記載したように使用して増殖を測定することによって、試験した。最初に、ＥＣ２０ＰＢ４１８８および試験する薬物を決定した。次に、交差力価測定を、ＰＢ４１８８および薬物を用いて実施した。相乗作用が、チロシン・キナーゼ阻害剤（アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ）、ＰＩ３Ｋａ阻害剤ＢＹＬ７１９、Ａｋｔ阻害剤ＭＫ−２２０６、ｍＴＯＲ阻害剤エベロリムス、Ｓｒｃ阻害剤サラカチニブ、微小管破壊薬物パクリタキセルおよびＨＤＡＣ阻害剤ボリノスタット（図４０中で「ボロニスタット（ｖｏｒｏｎｉｓｔａｔ）」とスペルミスされている）を用いて試験した全ての細胞株において観察された。図２９は、形態学的変化および細胞成長の低減を結果的に生じる、マトリゲルにおいて増殖したＳＫＢＲ−３細胞に対する、ＰＢ４１８８とラパチニブとの相乗的組み合わせの一例を示す。各組み合わせで得られた成長阻害の程度を計算した。強度のシフトは、その効果に到達するために必要とされる単剤と比較した場合に、所望のレベルを達成するために組み合わせにおいて必要とされる薬物の量がどれだけ少ないかを示すアイソボログラム（Ｇｒｅｃｏら、１９９５）を使用して示され得る。ＣＨＡＬＩＣＥ（商標）Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアが組み合わせ実験の阻害値を使用して、アイソボログラムを生成した。ＨＥＲ２増幅された細胞に対する異なる薬物組み合わせのアイソボログラムを、図４０に示す。アイソボログラム分析により、ＰＢ４１８８が、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ＢＹＬ７１９、ＭＫ−２２０６、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルとの相乗的な薬物組み合わせを示したことが示された。

これらのデータは、ＰＩ３Ｋ経路に対して作用する薬物が、ＰＢ４１８８との組み合わせで特に有効であったことを実証している。さらに、チロシン・キナーゼ阻害剤との組み合わせが有効である。さらに、成長および遊走／浸潤薬物サラカチニブとの組み合わせが、転移の状況において好都合であり得る。

ＰＢ４１８８のｉｎｖｉｔｒｏでのリン酸化の阻害
指数関数的に成長した培養物の細胞を回収し、飢餓培地（Ｎ８７細胞：ＲＰＭＩ−１６４０、０．０５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌホロ・トランスフェリン；ＳＫＢＲ−３細胞：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、２ｍＭＬ−グルタミン、０．０５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌホロ・トランスフェリン）中で６ウェル・プレート中に播種し（Ｎ８７について３．７５×１０^６細胞およびＳＫＢＲ−３について１．５×１０^６細胞）、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートした。次の日、抗体を、５ｎＭの最終濃度になるように添加し、細胞を、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。次いで、ＨＲＧを、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように添加した。９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で１、３、６または２４時間の後、プレートを氷上に配置し、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した。引き続いて、０．３ｍｌの氷冷溶解緩衝液を添加し（ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＲＴＫ＃９８０３またはＩＣ＃７０１８）、細胞を、氷上で最低３０分間溶解させた。次に、タンパク質濃度を、ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ＃２３２３５）を使用して測定した。タンパク質濃度を、溶解緩衝液を用いて２ｍｇ／ｍｌに調整した。次に、溶解物を、ＰａｔｈＳｃａｎＲＴＫＳｉｇｎａｌｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｙＡｒｒａｙｓ（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃７９４９）またはＰａｔｈＳｃａｎＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＳｉｇｎａｌｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｙＡｒｒａｙｓに適用した。全てのインキュベーションを、オービタル・シェーカー上の密封ウェルを用いて室温で実施した。溶解物（７５μｌ）を、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを補充した７５μｌのアレイ希釈剤緩衝液で０．８ｍｇ／ｍｌの濃度まで２回希釈し、氷上で維持した。アレイ・ウェルを、１００μｌのアレイブロック緩衝液で１５分間ブロッキングした。ブロック緩衝液を除去し、溶解物をウェルに適用し、２時間インキュベートした。溶解物を吸引し、ウェルを、１００μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄した。次に、１ウェル当たり１００μｌの検出抗体のカクテルを適用し、１時間インキュベートした。抗体のカクテルを吸引し、ウェルを、１００μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄した。７５μｌのＤｙｌｉｇｈｔ８０（商標）ストレプトアビジンを、各ウェルに添加した。Ｄｙｌｉｇｈｔ８０（商標）ストレプトアビジンを吸引し、ウェルを、１００μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄した。マルチ−ガスケット（ｍｕｌｔｉ−ｇａｓｋｅｔ）を除去し、スライドを、脱イオン水中１０ｍｌで１０秒間洗浄した。スライドを乾燥させ、Ｏｄｙｓｅｅ（登録商標）Ｃｌｘでの画像化のために処理した。スポット蛍光強度を、ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して計算した。

Ｎ８７およびＳＫＢＲ−３では、ＰＢ４１８８は、トラスツズマブ＋ペルツズマブの組み合わせとは対照的に、インキュベーションの最初の６時間の間、ＡＫＴのリン酸化を完全に遮断する。さらに、強い阻害が、トラスツズマブ＋ペルツズマブの組み合わせとは対照的に、ＥＲＫおよびＳ６のリン酸化において観察される。ＰＢ４１８８は、ＨＥＲ２のリン酸化を阻害しない（図３０）。

ウエスタン・ブロット分析
ＲＴＫおよび細胞内Ｐａｔｈｓｃａｎアレイにおいて観察されたリン酸化阻害を検証するために、ウエスタン・ブロットを、ＨＲＧストレス濃度の存在下で、ＰＢ４１８８、ペルツズマブおよびトラスツズマブの組合せ、ならびにコントロール抗体で処置した細胞に対して実施した。指数関数的に成長した培養物の細胞を回収し、飢餓培地（Ｎ８７細胞：ＲＰＭＩ−１６４０、０．０５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌホロ・トランスフェリン；ＳＫＢＲ−３細胞：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、２ｍＭＬ−グルタミン、０．０５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌホロ・トランスフェリン）中で、１０ｃｍディッシュ中に播種した（Ｎ８７について２０×１０^６細胞およびＳＫＢＲ−３について７×１０^６細胞）。次の日、抗体を、５ｎＭの最終濃度になるように添加し、細胞を１時間インキュベートした。次いで、ＨＲＧを、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように添加した。１、３、６または２４時間後、ディッシュを氷上に配置し、細胞を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、エッペンドルフチューブに移し、２５０μｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭベータ−グリセロホスフェート、１ｍＭＮａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌロイペプチン）で溶解した。溶解を、氷上で３０分間進行させた。細胞溶解物を遠心分離し、上清を、新しいエッペンドルフチューブ中に収集した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。３０μｇの溶解物を、４〜１２％のＢｉｓ−ＴｒｉｓＮｕＰａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、ゲル上のタンパク質を、ニトロセルロースのメンブレンに移した。メンブレンを、５％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔで１時間ブロッキングし、製造者の指示（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って、示された抗体で染色した。次いで、メンブレンを、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートし、ＥＣＬ基質と共にインキュベートし、Ｘ線フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用するオートラジオグラフィーに供した。全ての検出抗体は、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからであった：ホスホ（Ｐｈｏｓｐｈｏ）−Ａｋｔ（ｓｅｒ４７３）＃４０６０、総（Ｔｏｔａｌ）Ａｋｔ＃４６９１、ホスホＰｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ２（Ｔｙｒ１２２１／１２２２）＃２２４３、総ＨＥＲ２＃２２４２、ホスホ−ＨＥＲ３（Ｔｙｒ１２８９）＃４７９１、総ＨＥＲ３＃４７５４、ホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）＃４３７７、総ＥＲＫ１／２＃４６９５、ホスホ−Ｓ６ＲＰ（Ｓｅｒ２３５／２３６）＃２２１１、総Ｓ６ＲＰ＃２２１７、ヤギ抗ウサギＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ＃７０７４。

これらの結果は、ＰＢ４１８８が、ＡＫＴリン酸化阻害に対して顕著な影響を有するＭＡＰＫおよびＰＩ３キナーゼ経路の両方の阻害を生じる、ＨＥＲ３リン酸化の延長された阻害を示すことを示している（図３１）。

ＰＢ４１８８のｉｎｖｉｖｏ薬物動力学
Ｌｕｍｉｎｅｘによるリンタンパク質分析
２用量のＰＢ４１８８および４用量のＰＢ４１８８で処置したＪＩＭＴ−１移植マウスの腫瘍（１００ｍｍ^３）を、投薬の２４時間後に取り出した。腫瘍を、瞬間凍結し、粉末に加工した。腫瘍溶解物を、凍結粉末サンプルへの冷ＢｉｏＲａｄ溶解緩衝液（０．４％ＢｉｏＲａｄＦａｃｔｏｒ１、０．２％ＢｉｏＲａｄＦａｃｔｏｒ２および２ｍＭＰＭＳＦを補充した）の使用により、５０ｍｇ腫瘍／ｍＬの濃度に調製し、ロッカー上で４℃で６０分間インキュベートして、完全な溶解を確実にした。これらのサンプルを、１６０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離し、アリコート化した。総タンパク質を、製造業者の指示に従ってＢｉｏｒａｄＤＣＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ試薬を使用して決定した。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ：ＪＩＭＴ−１腫瘍溶解物サンプルを処理し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからの市販のＬｕｍｉｎｅｘキット（カタログ番号４８−６１８ＭＡＧ（ロット番号２５３２０５０）、４６−６４５ＭＡＧ（ロット番号４６６４５Ｍ−１Ｋ）を使用して、総ＡＫＴ、ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）およびＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）について分析した。各サンプルを、２連で試験した。希釈物を、全ての総分析物およびリン酸化分析物の決定のために、１ウェル当たりおよそ２５μｇタンパク質の標的をロードするよう、サンプル希釈剤中に調製した。製造業者の仕様書に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅキットを使用した。

ＰＢ４１８８で処置した腫瘍は、未処置の腫瘍と比較して、Ａｋｔ発現における増加を示した。ＡＫＴのリン酸化は、２回の週１回の用量の後および４回の週１回の用量の後の両方に、ＰＢ４１８８によって完全に阻害された（図３２）。

ＶｅｒａＴａｇアッセイによるリン酸化タンパク質分析
１または２用量のＰＢ４１８８で処置したＪＩＭＴ−１移植マウスの腫瘍（１００ｍｍ^３または４００ｍｍ^３）を取り出し、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。１００ｍｍ^３腫瘍を保有するマウスは、単一ＰＢ４１８８用量（２５ｍｇ／ｋｇ）の２４時間後に屠殺したが、４００ｍｍ^３腫瘍を保有するマウスは、２５ｍｇ／ｋｇの２回の週１回の用量を投与され、投薬の４時間後に屠殺した。次に、サンプルをパラフィン包埋した。厚さ７ｕｍの切片を、ミクロトーム（ＬＥＩＣＡ）を用いてスライスし、通し番号で標識した、正に荷電したガラス・スライド（ＶＷＲ）上に配置した。スライドを、３０分間風乾し、次いで、６０℃に設定した加熱オーブン中で焼いた。次のサンプルを、異なるＶｅｒａＴａｇ分析のために処理した。米国特許出願第１２／３４０，４３６号に従う総ＨＥＲ２分析（ＨＴ２）、米国特許第８，３４９，５７４号と米国特許出願公開第２０１３／００７１８５９号に従う総ＨＥＲ３分析（Ｈ３Ｔ）、ならびに最後に、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３３２０８に従うＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体（Ｈ２３Ｄ）、ＨＥＲ３ｐＹ１２８９（Ｈ３ｐＹ１２８９）およびＨＥＲ３−ＰＩ３キナーゼ（Ｈ３ＰＩ３Ｋ）。両方の投薬レジメンにおいて、未処置のコントロールと比較して、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３二量体における顕著なＰＢ４１８８媒介性の低減が、明らかになった。ＰＢ４１８８処置した腫瘍とコントロールとの間で、総ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはリン酸化ＨＥＲ３における差異は観察されなかった。ＰＢ４１８８投薬の４時間後に分析した腫瘍は、未処置のコントロールと比較して、ＨＥＲ３−ｐ８５（ＰＩ３Ｋ）における顕著な低減を示した。

ＰＢ４１８８は、ＨＲＧ刺激された癌細胞において細胞周期の進行を低減する
ＰＢ４１８８が細胞周期の進行に影響を与える能力を、種々のタンパク質レベルのＨＥＲ２を発現する癌細胞株において調査した。ＨＥＲ２＋（ＭＣＦ−７）、ＨＥＲ２＋＋＋（ＪＩＭＴ−１、ＳＫ−ＢＲ−３およびＮ８７細胞）細胞を、アッセイ培地（ＭＣＦ−７細胞については、ＲＰＭＩ−１６４０、０．０５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌホロ・トランスフェリン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ＭＥＭＮＥＡＡ。ＪＩＭＴ−１については、ＤＭＥＭ、０．０５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌホロ・トランスフェリン。ＳＫ−ＢＲ−３細胞については、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、２ｍＭＬ−グルタミン、０．０５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌホロ・トランスフェリン。Ｎ８７細胞については、ＲＰＭＩ−１６４０、０．０５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌホロ・トランスフェリン）中に播種した。２４ウェル・プレートの１ウェル当たり、３００．０００のＭＣＦ−７、または４００．０００のＮ８７または１５０．０００のＳＫ−ＢＲ−３または１５０．０００のＪＩＭＴ−１または細胞を、１ｍｌのアッセイ培地中に播種し、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートした。次の日、ＰＢ４１８８またはペルツズマブ＋トラスツズマブまたはＰＧ３１７８またはＰＧ１３３７を、１ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＨＲＧの存在下で、細胞に添加した。９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２における２４時間のインキュベーション（ＪＩＭＴ−１、Ｎ８７またはＳＫ−ＢＲ−３細胞について）または４８時間のインキュベーション（ＭＣＦ−７細胞について）の後、細胞に、回収する前に２時間にわたってＥｄＵ（１０μＭ最終濃度）を補充し、製造業者の指示に従ってＣｌｉｃｋ−ｉＴＥｄＵＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８キット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｃ１０４２５）を使用して、ＥｄＵ取込みについて染色した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏでのフロー・サイトメトリーによって細胞を分析する少なくとも３０分前に、細胞を、２００ｎＭのＦｘＣｙｃｌｅ遠赤色色素（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｆ１０３４８）および１００μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２０９１−０３９）と共にインキュベートした。事象を、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ４８８チャネル（ＥｄＵ検出について）およびＡＰＣチャネル（ＦｘＣｙｃｌｅ色素による総ＤＮＡ染色について）において獲得した。データを、ＦＳＣ幅対ＦＳＣ高さ散布図上で単一細胞をゲーティングし、ＡＰＣ対ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８散布図上でＧ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２Ｍ期の細胞周期をサブゲーティングすることによって、それぞれＥｄＵ^陰性ＡＰＣ^低、ＥｄＵ^陽性およびＥｄＵ^陰性ＡＰＣ^高集団として、分析した。

データは、ＳおよびＧ２／Ｍ期にある細胞の百分率を、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の百分率によって除算することによって計算した増殖指数として表す。図３４は、ＰＢ４１８８が、標準的（１ｎｇ／ｍｌ）または高い（１００ｎｇ／ｍｌ）濃度のＨＲＧによって誘導された増殖を阻害することにおいて、ＰＧ３１７８またはペルツズマブ＋トラスツズマブよりも一貫してより強力であることを示している。高濃度のＨＲＧにおいても、ＰＢ４１８８は、細胞周期の進行を阻害する。

ＰＢ４１８８は、受容体内部移行を誘導する
抗体の内部移行パターンを、ｐＨ感受性色素を使用して測定した。これは、ＷＯ２０１３１３４６８６Ａ１において当技術分野で記載されており、ここで、かかる色素は、抗体とカップリングされた場合、より低いｐＨに曝露されたときに増加した蛍光シグナルを示す。これは、色素カップリングした抗体が、標的細胞の表面から、穏やかに酸性のエンドソーム（ｐＨ６〜６．５）や酸性のリソソーム（５．５より低いｐＨ）中に内部移行する場合に生じる。ＰＢ４１８８が癌細胞において内部移行するかどうかを調査するために、抗体を、製造者の指示に従って、スクシンイミジル・エステル反応性基を有するｐＨセンサー色素（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＣＳ１７８３Ａ０１）にカップリングさせた。コンパレーターとして、抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＰＧ３９５８）、抗ＨＥＲ３（ＰＧ３１７８、＃Ａｂ６）および陰性コントロール（抗破傷風毒素、ＰＧ１３３７）の色素標識された抗体を含めた。指数関数的に成長した培養物のＨＥＲ２過剰発現性ＳＫＢＲ−３およびＮ８７癌細胞を回収し、１ｎｇ／ｍｌのＨＲＧを含む１００μｌのアッセイ培地（Ｎ８７細胞については、ＲＰＭＩ−１６４０、０．０５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌホロ・トランスフェリン。ＳＫＢＲ−３細胞については、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、２ｍＭＬ−グルタミン、０．０５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌホロ・トランスフェリン）中で９６ウェル・プレート上に播種し（１ウェル当たり１５×１０^３細胞）、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートした。次の日、２０μｌのｐＨ感受性色素標識した抗体を添加して、１００ｎＭの最終濃度に到達させ、細胞を、９５％の相対湿度中で、３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートした。次の日、非接着性細胞を収集し、接着性細胞をトリプシン処理することによって、細胞を回収した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ０．５％ＢＳＡ０．１％アジ化ナトリウム）で細胞を洗浄した後、細胞を、ＡＰＣ標識した抗ヒトＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１３６−０９８、１：１００希釈）で染色した。細胞を、ＰＥおよびＡＰＣチャネルの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を測定するＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのフロー・サイトメトリーによって分析して、それぞれ、抗体の内部移行および残留表面結合を決定した。図３５に示されるデータは、ＰＢ４１８８がトラスツズマブと同じ程度まで内部移行するが、組み合わせトラスツズマブ＋ペルツズマブは、増強された内部移行をもたらすことを示している。トラスツズマブ＋ペルツズマブの組み合わせは、トラスツズマブ単独と比較して、ＡＤＣＣを低減する（図３６）。従って、ＰＢ４１８８内部移行のレベルは、ＡＤＣＣ強度に影響を与えないと理解される。

抗ＨＥＲ３抗体３１７８バリアントの作製および特徴付け
抗ＨＥＲ３抗体ＭＦ３１７８のバリアントを、抗体特性を改善することを目的として設計した。変異を、ＶＨ遺伝子フレームワーク領域１（ＦＲ１）、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＦＲ２、ＣＤＲ２および／またはＦＲ３中に導入したが、ＣＤＲ３およびＦＲ４は改変しなかった。この設計は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）モチーフを除去するため（例えば、脱アミド・モチーフＮＳをＮＱに変化させることによる）、表面疎水性を低減するため（例えば、ＩをＴに変化させることによる）または等電点を増加させるため（ｐＩ；例えば、ＱをＫに変化させることによる）に導入された変異を含むが、それらに限定されない。２０全てのバリアント（図３７を参照のこと）を、破傷風トキソイド（ＴＴ）アームと組み合わせた二重特異性抗体として発現させ、ＭＣＦ−７機能的アッセイにおいて試験したところ、２０全てのバリアントが、この形式でＭＦ３１７８抗体と類似の強度を有していた。２０全てのバリアントを、ＭＣＦ−７への結合について滴定でＦＡＣＳにおいてもこの形式で試験したところ、全てのバリアントが、非常に類似の結合プロファイルを有し、これは、全てのバリアントの親和性が類似していることを示唆している。それぞれ、１０、３および７つのアミノ酸変異を含む３つのリード・バリアントＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１およびＭＦ６０６５を、さらなる実験のために選択した（図１６Ｅおよび図３７の配列を参照のこと）。対応する単一特異性ＩｇＧ１ＰＧ６０５８、ＰＧ６０６１およびＰＧ６０６５を大規模で産生し、精製した。図３８に示されるように、ＨＲＧ依存的Ｎ８７細胞株増殖アッセイにおける３つのバリアントの阻害活性は、ＰＧ３１７８のものと類似である。３つのバリアントのＣＩＥＸ−ＨＰＬＣプロファイルは、図３９に示されるように、電荷不均一性ならびにピーク幅および対称性に関して、ＰＧ３１７８のものと類似であった。主要ピークの保持時間（ｔＲ）は、抗体のｐＩと大まかに相関した。即ち、ｐＩが高いほど、より長い保持時間を生じた。二重特異性抗体または抗体の混合物の設計において、最適なｔＲを有する抗体バリアントを選択することは有用であるが、それは、ＣＩＥＸを使用した所望の抗体成分の精製が促進され得るからである。

ＦＡＣＳによって決定された、免疫化したマウスの異なるコホートの血清力価。Ｄ＝抗体力価決定の日。表１：ＨＥＲ２に対する応答。表２：ＨＥＲ３に対する応答。使用した細胞株が示される（ＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４）。異なるマウスを各列に示す。

参考文献
Arteaga CL, Sliwkowski MX, Osborne CK, Perez EA, Puglisi F, Gianni L. 2011. Treatment of HER2-positive breast cancer: current status and future perspectives. Nat Rev Clin Oncol. 2011 Nov 29;9(1):16-32.

Balko JM, Miller TW, Morrison MM, Hutchinson K, Young C, Rinehart C, Sanchez V, Jee D, Polyak K, Prat A, Perou CM, Arteaga CL, Cook RS. 2012. The receptor tyrosine kinase ErbB3 maintains the balance between luminal and basal breast epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. Jan 3;109(1):221-6.

Baselga J, Cortes J, Kim SB, Im SA, Hegg R, Im YH, Roman L, Pedrini JL, Pienkowski T, Knott A, Clark E, Benyunes MC, Ross G, Swain SM. 2012. Pertuzumab plus trastuzumab plus docetaxel for metastatic breast cancer. N Engl J Med. Jan 12;366(2):109-19.

de Kruif et al. Mol. Biol. (1995), 248, 97-105

Ewer MS, Ewer SM. Cardiotoxicity of anticancer treatments: What the cardiologist needs to know. Nat Rev Cardiol 2010;7:564-75

Guarneri Jain KK, Casper ES, Geller NL, et al. A prospective randomized comparison of epirubicin and doxorubicin in patients with advanced breast cancer; J Clin Oncol 1985;3:818-26

Junttila TT, Akita RW, Parsons K, Fields C, Lewis Phillips GD, Friedman LS, Sampath D, Sliwkowski MX. 2009. Ligand-independent HER2/HER3/PI3K complex is disrupted by trastuzumab and is effectively inhibited by the PI3K inhibitor GDC-0941. Cancer Cell. May 5;15(5):429-40.

Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489

Merchant et al. Nature Biotechnology, Vol. 16 July 1998 pp 677-681

Nissim A, Hoogenboom HR, Tomlinson IM, Flynn G, Midgley C, Lane D, Winter G. 1994. Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents. EMBO J. 1994 Feb 1;13(3):692-8.

Ocana A, Vera-Badillo F, Seruga B, Templeton A, Pandiella A, Amir E. 2013. HER3 overexpression and survival in solid tumors: a meta-analysis. J Natl Cancer Inst. Feb 20;105(4):266-73.

Sergina NV, Rausch M, Wang D, Blair J, Hann B, Shokat KM, Moasser MM. 2007. Escape from HER-family tyrosine kinase inhibitor therapy by the kinase-inactive HER3. Nature. Jan 25;445(7126):437-41.

Schaefer et al. Cancer Cell 20, 472-486, October 2011

Schoeberl B, Faber AC, Li D, Liang MC, Crosby K, Onsum M, Burenkova O, Pace E, Walton Z, Nie L, Fulgham A, Song Y, Nielsen UB, Engelman JA, Wong KK. 2010. An ErbB3 antibody, MM-121, is active in cancers with ligand-dependent activation. Cancer Res. Mar 15;70(6):2485-94.

Shames et al. PLOS ONE, February 2013, Vol.8, Issue 2, pp 1-10

Tanner M, Kapanen AI, Junttila T, Raheem O, Grenman S, Elo J, Elenius K, Isola J. 2004. Characterization of a novel cell line established from a patient with Herceptin-resistant breast cancer. Mol Cancer Ther. 2004 Dec;3(12):1585-92.
Yarden Y, Pines G.2012. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nat Rev CancerJul 12;12(8):553-63.

Thery J.-C. et al., Resistance to human epidermal growth factor receptor type 2-targeted therapies, Eur J Cancer (2014), Vol. 50, Issue 5, pages 892-901

Wadhwa D, Fallah-Rad N, Grenier D, et al. Trastuzumab mediated cardiotoxicity in the setting of the adjuvant chemotherapy for breast cancer: A retrospective study. Breast Cancer Res Treat 2009;117:357-64.

Wehrman TS, Raab WJ, Casipit CL, Doyonnas R, Pomerantz JH, Blau HM. 2006. A system for quantifying dynamic protein interactions defines a role for Herceptin in modulating ErbB2 interactions. Proc Natl Acad Sci U S A. Dec 12;103(50):19063-8.

Wilson TR, Fridlyand J, Yan Y, Penuel E, Burton L, Chan E, Peng J, Lin E, Wang Y, Sosman J, Ribas A, Li J, Moffat J, Sutherlin DP, Koeppen H, Merchant M, Neve R, Settleman J. 2012. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. Jul 26;487(7408):505-9.

Yonesaka et al., Sci.transl.Med., Vol.3, Issue 99 (2011); pp1-11

Zhang H, Berezov A, Wang Q, Zhang G, Drebin J, Murali R, Greene MI. 2007. ErbB receptors: from oncogenes to targeted cancer therapies. J Clin Invest. Aug;117(8):2051-8.

Greco, Bravo, Parsons (1995) The search for synergy: a critical review from a response surface perspective. Pharmacol. Rev 47 (2): 331-85

Claims

ＥｒｂＢ−２のドメインIに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む全長の二重特異性抗体であって、
ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞上の、ＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減でき、
−重鎖ＣＤＲ１配列ＧＹＹＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥと、重鎖ＣＤＲ２配列ＮＥＫＦＫＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＰＨＹＧＹＤＤＷＹＦＧＶと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−２特異的結合ドメイン、および、重鎖ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨと、重鎖ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−３特異的結合ドメイン；または
−重鎖ＣＤＲ１配列ＡＹＹＩＮと、重鎖ＣＤＲ２配列ＲＩＹＰＧＳＧＹＴＳＹＡＱＫＦＱＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＰＰＶＹＹＤＳＡＷＦＡＹと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−２特異的結合ドメイン、および、重鎖ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨと、重鎖ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−３特異的結合ドメイン；または
−重鎖ＣＤＲ１配列ＹＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＫＧＬＥと、重鎖ＣＤＲ２配列ＮＧＫＦＫＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＧＱＬＧＬＥＡＷＦＡＹと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−２特異的結合ドメイン、および、重鎖ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨと、重鎖ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−３特異的結合ドメイン
を含む、二重特異性抗体。
請求項１に記載の二重特異性抗体において、
前記第２の抗原結合部位が、ＥｒｂＢ−３へのＥｒｂＢ−３リガンドの結合を妨害する、二重特異性抗体。
ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む全長の二重特異性抗体であって、
前記第１の抗原結合部位が、ＥｒｂＢ−２のドメインＩに結合し、前記第２の抗原結合部位が、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合し、
−重鎖ＣＤＲ１配列ＧＹＹＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥと、重鎖ＣＤＲ２配列ＮＥＫＦＫＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＰＨＹＧＹＤＤＷＹＦＧＶと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−２特異的結合ドメイン、および、重鎖ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨと、重鎖ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−３特異的結合ドメイン；または
−重鎖ＣＤＲ１配列ＡＹＹＩＮと、重鎖ＣＤＲ２配列ＲＩＹＰＧＳＧＹＴＳＹＡＱＫＦＱＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＰＰＶＹＹＤＳＡＷＦＡＹと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−２特異的結合ドメイン、および、重鎖ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨと、重鎖ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−３特異的結合ドメイン；または
−重鎖ＣＤＲ１配列ＹＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＫＧＬＥと、重鎖ＣＤＲ２配列ＮＧＫＦＫＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＧＱＬＧＬＥＡＷＦＡＹと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−２特異的結合ドメイン、および、重鎖ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨと、重鎖ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧと、重鎖ＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹと、軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮと、軽鎖ＣＤＲ２配列ＡＡＳＳＬＱＳと、軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＳＹＳＴＰＰＴとを含むＥｒｂＢ−３特異的結合ドメイン
を含む、二重特異性抗体。
請求項１から３までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、二重特異性抗体。
請求項１から４までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ＡＤＣＣを増強するために非フコシル化されている、二重特異性抗体。
請求項１から５までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ヒトまたはヒト化抗体である、二重特異性抗体。
請求項１から６までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
両方のアームが共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。
請求項７に記載の二重特異性抗体において、
前記共通の軽鎖が、生殖系列軽鎖である、二重特異性抗体。
請求項７または８に記載の二重特異性抗体において、
前記共通の軽鎖が、ＩＧＫＶｌ−３９遺伝子セグメントを含む再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖である、二重特異性抗体。
請求項７から９までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記共通の軽鎖が、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩＧＫＶｌ−３９＊０１／ＩＧＪＫｌ＊０１である、二重特異性抗体。
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
標識をさらに含む、二重特異性抗体。
請求項１から１１までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ｉｎｖｉｖｏ画像化のための標識をさらに含む、二重特異性抗体。
請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、または前記腫瘍を有するリスクがある対象の処置用の薬剤の調製のための、
請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
請求項１から１２までのいずれか一項に記載の抗体において、
ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、または有するリスクがある対象の処置における使用のための抗体。
請求項１５に記載の、使用のための抗体において、
前記二重特異性抗体は、心筋細胞の生存に顕著に影響を与えない、使用のための抗体。
請求項１５または１６に記載の、使用のための抗体において、
前記二重特異性抗体は、健康な心機能と比較して９０％未満の心機能を有する対象への使用のための抗体。
ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、または前記腫瘍を有するリスクがある対象の処置用の薬剤の調製のための、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用であって、
前記処置は、
− ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体、ならびに
− ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される１または複数の化合物、を対象に投与することを含む使用。
ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３もしくはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、または前記腫瘍を有するリスクがある対象の処置用の薬剤の調製のための、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用であって、
前記処置は、
− ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体、ならびに
− チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される１または複数の化合物、を対象に投与することを含む使用。
ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍の処置における使用のための、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、
前記処置が、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象に、前記二重特異性抗体、ならびに、ＰＩ３キナーゼ経路の成分の阻害剤、ＭＡＰＫ経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を投与することを含む、二重特異性抗体。
ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍の処置における使用のための、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、
前記処置が、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象に、前記二重特異性抗体、ならびに、チロシン・キナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋａ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を投与することを含む、二重特異性抗体。
請求項１９に記載の使用において、
前記チロシン・キナーゼ阻害剤は、アファチニブ、ラパチニブおよび／またはネラチニブを含む、使用。
請求項１９または２２に記載の使用において、
前記ＰＩ３Ｋａ阻害剤がＢＹＬ７１９である、使用。
請求項１９、２２および２３のいずれか一項に記載の使用において、
前記Ａｋｔ阻害剤はＭＫ−２２０６である、使用。
請求項１９、および２２から２４までのいずれか一項に記載の使用において、
前記ｍＴＯＲ阻害剤がエベロリムスである、使用。
請求項１９、および２２から２５までのいずれか一項に記載の使用において、
前記Ｓｒｃ阻害剤はサラカチニブである、使用。
請求項１８に記載の使用において、
前記微小管破壊薬物はパクリタキセルである、使用。
請求項１８または２７に記載の使用において、
前記ＨＤＡＣ阻害剤がボリノスタットである、使用。
請求項２１に記載の使用のための抗体において、
前記チロシン・キナーゼ阻害剤は、アファチニブ、ラパチニブおよび／またはネラチニブを含む、使用のための抗体。
請求項２１または２９に記載の使用のための抗体において、
前記ＰＩ３Ｋａ阻害剤は、ＢＹＬ７１９である、使用のための抗体。
請求項２１、２９および３０のいずれか一項に記載の使用のための抗体において、
前記Ａｋｔ阻害剤はＭＫ−２２０６である、使用のための抗体。
請求項２１、および２９から３１までのいずれか一項に記載の使用のための抗体において、
前記ｍＴＯＲ阻害剤がエベロリムスである、使用のための抗体。
請求項２１、および２９から３２までのいずれか一項に記載の使用のための抗体において、
前記Ｓｒｃ阻害剤はサラカチニブである、使用のための抗体。
請求項２０に記載の使用のための抗体において、
前記微小管破壊薬物はパクリタキセルである、使用のための抗体。
請求項２０または３４に記載の使用のための抗体において、
前記ＨＤＡＣ阻害剤がボリノスタットである、使用のための抗体。
ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象において転移の形成に対抗するための薬剤の調製のための、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％であるヘレグリン発現レベルを有する、
使用。
請求項３６に記載の使用であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも７０％であるヘレグリン発現レベルを有する、
使用。
請求項３６に記載の使用であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも８０％であるヘレグリン発現レベルを有する、
使用。
請求項３６に記載の使用であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも８５％であるヘレグリン発現レベルを有する、
使用。
請求項３６に記載の使用であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも９０％であるヘレグリン発現レベルを有する、
使用。
請求項３６に記載の使用であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも９５％であるヘレグリン発現レベルを有する、
使用。
ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞の転移の形成の処置または予防における使用のための、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％であるヘレグリン発現レベルを有する、
抗体。
請求項４２に記載の使用のための抗体であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも７０％であるヘレグリン発現レベルを有する、
抗体。
請求項４２に記載の使用のための抗体であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも８０％であるヘレグリン発現レベルを有する、
抗体。
請求項４２に記載の使用のための抗体であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも８５％であるヘレグリン発現レベルを有する、
抗体。
請求項４２に記載の使用のための抗体であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも９０％であるヘレグリン発現レベルを有する、
抗体。
請求項４２に記載の使用のための抗体であって、
前記ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも９５％であるヘレグリン発現レベルを有する、
抗体。
請求項１４、１８、１９、２２から２８まで、および３６から４１までのいずれか一項に記載の使用において、
前記対象が、細胞１つ当たり１，０００，０００未満の細胞表面にあるＥｒｂＢ−２受容体を有するＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、使用。
請求項１４、１８、１９、２２から２８まで、３６から４１まで、および４８のいずれか一項に記載の使用において、
前記腫瘍が、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫の細胞である、使用。
請求項１４、１８、１９、２２から２８まで、３６から４１まで、４８および４９のいずれか一項に記載の使用において、
前記対象が、健康な心機能と比較して９０％未満の心機能を有する、使用。
請求項５０に記載の使用において、
前記心機能が、左室駆出分画（ＬＶＥＦ）を含む、使用。
請求項５０または５１に記載の使用において、
前記対象は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、左室機能不全（ＬＶＤ）および／もしくは１０％以上減少した左室駆出分画（ＬＶＥＦ）に罹患している、ならびに／または前記対象は、心筋梗塞を有している、使用。
請求項１５から１７まで、２０、２１、２９から３５まで、および４２から４７までのいずれか一項に記載の使用のための抗体において、
前記対象が、細胞１つ当たり１，０００，０００未満の細胞表面にあるＥｒｂＢ−２受容体を有するＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、使用。
請求項１５から１７まで、２０、２１、２９から３５まで、４２から４７まで、および５３のいずれか一項に記載の使用のための抗体において、
前記抗体は、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の抗体である、使用のための抗体。
請求項１５から１７まで、２０、２１、２９から３５まで、４２から４７まで、５３および５４のいずれか一項に記載の使用のための抗体において、
前記腫瘍が、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫の細胞である、使用のための抗体。
請求項１５から１７まで、２０、２１、２９から３５まで、４２から４７まで、および５３から５５までのいずれか一項に記載の使用のための抗体において、
前記対象が、健康な心機能と比較して９０％未満の心機能を有する、使用のための抗体。
請求項１７または５６に記載の使用のための抗体において、
前記心機能が、左室駆出分画（ＬＶＥＦ）を含む、使用のための抗体。
請求項１７、５６および５７のいずれか一項に記載の使用のための抗体において、
前記対象は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、左室機能不全（ＬＶＤ）および／もしくは１０％以上減少した左室駆出分画（ＬＶＥＦ）に罹患している、ならびに／または前記対象は、心筋梗塞を有している、使用のための抗体。
Ａｋｔ、ＥＲＫおよび／またはＳ６リボソーム・タンパク質のリン酸化に対抗する、イン・ビトロでの、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の抗体の使用。
Ａｋｔ、ＥＲＫおよび／またはＳ６リボソーム・タンパク質のリン酸化を阻害する、イン・ビトロでの、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の抗体の使用。
Ａｋｔ、ＥＲＫおよび／またはＳ６リボソーム・タンパク質のリン酸化に対抗するための薬剤の調製のための、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
Ａｋｔ、ＥＲＫおよび／またはＳ６リボソーム・タンパク質のリン酸化を阻害するための薬剤の調製のための、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。