PT2063877E - Medicamentos compreendendo um inibidor das alfa-manosidases de classe i para o tratamento das sarcoglicanopatias - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

MEDICAMENTOS COMPREENDENDO DM INIBIDOR DAS ALFA-MANOSIDASES DE CLASSE I PARA O TRATAMENTO DAS SARCOGLICANOPATIAS

DOMÍNIO TÉCNICO O presente invento refere-se ao tratamento de sarcoglicanopatias.

Preconiza a utilização de inibidores da manosidase I, como medicamentos para o tratamento de certas formas destas doenças.

ESTADO ANTERIOR DA TÉCNICA

As sarcoglicanopatias são doenças musculares do grupo das miopatias das cinturas (Limb Girdle Muscular Dystrophy ou LGMD - ("distrofia muscular das cinturas" ou DMC)) e transmitem-se no modo autosómico recessivo. Foram identificadas quatro formas (DMC2C, DMC2D, DMC2E, DMC2F), devidas respectivamente, a defeitos nos genes da γ-,α-,β- e δ-sarcoglicanos (11, 17).

As sarcoglicanopatias A DMC2C é particularmente difundida na bacia mediterrânica e nas populações ciganas residentes na Europa. A DMC2D foi identificada pelo mundo em pacientes na Europa, África, Japão e Brasil. A DMC2E foi encontrada particularmente na comunidade amish e no Magrebe. A DMC2F só foi até agora descrita em apenas 7 famílias de origem brasileira, turca e italiana. 7408 traduzem-se num déficit progressivo dos músculos da cintura pélvica e escapular, frequentemente associada à hipertrofia das barrigas das pernas. 0 intelecto é sempre conservado. Encontra-se por vezes um sintoma cardíaco do tipo cardiomiopatia nas DMC2C, DMC2E e DMC2F.

Ao nível histológico, os músculos apresentam zonas de regeneração e degeneração, infiltrações inflamatórias, fibrose e uma variabilidade do tamanho das fibras. As sarcoglicanopatias apresentam gravidade variável, mesmo entre irmãos. Nas formas mais graves, os pacientes perdem o andar antes dos 30 anos e têm uma esperança de vida reduzida.

Duas das sarcoglicanopatias apresentam mutações recorrentes. Para a DMC2C, a mutação del52lT é frequentemente encontrada nas populações magrebinas e a mutação C283Y nas populações ciganas (4, 13). A mutação mais frequente presente na DMC2D corresponde a uma substituição da arginina na posição 77 por uma cisteína (R77C). Esta mutação é encontrada num terço dos pacientes na Europa com excepção da Finlândia onde é encontrada em 100% dos pacientes na maioria das vezes nos alelos (5, 9) .

Os sarcoglicanos (SG) constituem um grupo de glicoproteínas integrado na membrana plásmica e que participam no complexo associado à distrofina (12) . Este complexo participa na ligação entre o citoesqueleto de actina e a matriz extracelular e consequentemente na 2 7408 estabilidade da membrana da fibra muscular (10) . Os sarcoglicanos são compostos por um pequeno domínio intracelular localizado em C-terminal (α-sarcoglicano) ou em N-terminal (γ-, β- e δ-sarcoglicanos), um domínio transmembranar único e um largo domínio extracelular que contém locais de N-glicosilação. O complexo dos sarcoglicanos forma-se durante o trânsito destas proteínas no retículo sarcoplásmico e no aparelho de Golgi (6, 16). O β-sarcoglicano serve de iniciador à formação do complexo. A sua associação com ο δ-sarcoglicano posiciona o complexo na membrana. Finalmente, a incorporação do α-sarcoglicano e a sua interacção com o γ-sarcoglicano completa a montagem. Mutações em qualquer dos sarcoglicanos podem impedir o complexo de se formar, acarretando uma deficiência secundária dos outros sarcoglicanos.

Se actualmente se sabe diagnosticar as sarcoglicanopatias, e mesmo identificar a componente mutada responsável pelo fenótipo (γ-, α-, β- ou δ-sarcoglicano), bem como a mutação em causa, os meios para se lidar com esta doença permanecem modestos.

Presentemente não é conhecido qualquer tratamento específico e a maior parte dos pacientes necessita de uma quinesiterapia para prevenir o agravamento das contracturas. No entanto, várias equipas relataram resultados positivos a nível experimental por abordagens de transferência de genes com a ajuda de vectores virais ou por terapia celular em modelos animais (1, 7, 14) . Assim, o 3 7408 documento WO 00/20582 preconiza uma terapia por substituição dos genes de sarcoglicanos defeituosos veiculados nomeadamente por AAV.

Foi igualmente proposto, na arte anterior, uma abordagem geral da inibição do proteassoma para o tratamento das patologias musculares, em particular distrofias musculares. Todavia, esta estratégia pouco especifica parece pouco eficaz e coloca problemas de tolerância.

Existe, por conseguinte, uma necessidade crucial de desenvolver novas terapias, designadamente medicamentosas, que permitam tratar especificamente e eficazmente as sarcoglicanopatias.

OBJECTO DO INVENTO 0 presente invento assenta na colocação em evidência, por parte dos inventores, que: - certas mutações nos sarcoglicanos associadas a uma sarcoglicanopatia dão lugar a glicoproteinas que apresentam uma má dobragem; - estas proteínas "mal dobradas" são responsabilizadas pela via de degradação proteolítica das glicoproteinas associadas ao retículo endoplasmático; quando são não degradadas (na presença de inibidores), os sarcoglicanos mutados podem ser 4 7408 correctamente translocados para a membrana plásmica e integrados no complexo dos sarcoglicanos, o que se traduz pela restauração do fenótipo normal.

Relembrando, as glicosidases do retículo endoplasmático (RE) têm um papel no controlo de qualidade da produção das glicoproteínas. Asseguram que só as correctamente dobradas são transportadas para o seu destino final. Em particular, a clivagem dos resíduos manose no RE pelas α-manosidases age como um sinal para dirigir as glicoproteínas mal dobradas para uma degradação pelo proteassoma.

As α-manosidases são classificadas em dois grupos. As de classe I (manosidase I) são inibidas pela 1-desoxinojirimicina e a cifunensina, enquanto as de classe II são especificamente inibidas pela swainsonina. O proteassoma, quanto a si, é um complexo proteico implicado na degradação das proteínas intracelulares no citosol e pode ser inibido por exemplo, pelo MG132 ou o bortezomib. A priori, qualquer inibidor desta via de degradação (ERAD em inglês para "Endoplasmic reticulum-associated degradation") pode ser utilizado. Todavia, o presente invento focalizou-se nos inibidores da manosidase I que se revelam de uma grande selectividade no seu modo de acção e de uma eficácia notável para o tratamento das sarcoglicanopatias. Clinicamente, isto traduz-se nomeadamente por efeitos secundários potencialmente menores. 5 7408

Desde logo, o invento refere-se à utilização de inibidores das α-manosidases de classe I para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento das sarcoglicanopatias. É claro, no contexto do invento, que se visa a utilização de pelo menos um inibidor da manosidase I. Obviamente não se exclui a utilização de um "cocktail" de inibidores, a saber vários inibidores de natureza diferente, que tenham actividades inibidoras complementares, nomeadamente em termos de actividade/selectividade. São sempre particularmente preferidas a cifunensina (CAS 109944-15-2) e a 1-Desoxinojirimicina (CAS 84444-90-6), moléculas conhecidas por serem inibidoras da manosidase i.

Todavia, o invento não poderia limitar-se a estas moléculas. Efectivamente, qualquer molécula candidata pode ser testada pela sua actividade inibidora da manosidase I, graças à concretização de um teste enzimático simples.

Assim, na medida em que se procuram soluções terapêuticas para as sarcoglicanopatias humanas, a enzima testada é vantajosamente uma alfa-manosidase de classe I de origem humana, nomeadamente a referenciada nas bases de dados sob o número: (Número de Acesso) : np_005898 (manosidase, alfa, classe IA, membro 1 [Homo sapiens]) . 6 7408

Um teste enzimático adaptado para testar esses inibidores está por exemplo descrito na publicação J Biol Chem. 2004 Oct 8; 279(41): 42638 - 47. Epub 2004 Jul 22. "The twisted abdómen phenotype of Drosophila POMT1 and P0MT2 mutants coincides with their heterophilic protein 0-mannosyltransferase activity", Ichimiya T, Manya H, Ohmae Y, Yoshida H, Takahashi K, Ueda R, Endo T, Nishihara S. O modo de administração, a dose administrada, assim como a frequência de administração são determinadas caso a caso, consoante os protocolos clássicos, conhecidos pelo especialista. Efectivamente, estes parâmetros podem nomeadamente depender da mutação a tratar e do inibidor escolhido. A cifunensina pode ser preferencialmente escolhida. Revela-se de uma muito grande especificidade e apresenta a vantagem de ser uma molécula solúvel na água, que pode prestar-se a uma administração por via oral.

Além disso, este tratamento revela-se particularmente apropriado para o tratamento de uma sarcoglicanopatia ligada à mutação R77C (Arg77Cys ao nível da proteína ou 229C>T ao nível do gene) na α-sarcoglicanopatia humana. Como já dito, esta mutação é responsável por numerosos casos clínicos, nomeadamente na Europa.

Todavia o Requerente demonstrou que a 1-Desoxinojirimicina podia também do mesmo modo ser utilizada em vez da cifunensina. 7 7408

Demonstrou, além disso, no âmbito do invento, que o efeito observado não estava ligado a uma mutação específica numa subunidade específica.

Efectivamente, o mesmo efeito benéfico pôde ser observado nas subunidades β e δ, mais precisamente para as mutações Q11E e E262K, respectivamente, qualquer que seja o inibidor em presença.

Assim, o presente tratamento pode aplicar-se potencialmente a todas as mutações actualmente identificadas nas quatro sarcoglicanopatias humanas. Todavia, só as mutações pontuais são potenciais candidatas a este tratamento dado que no caso de codões stop ou de delecções, exclui-se a priori que a proteína truncada mesmo que não esteja degradada, possa estar activa.

As principais mutações pontuais catalogadas até aos dias de hoje, estão listadas no quadro abaixo. Este não se pretende todavia, como sendo exaustivo. 8 7408 a-sarcoglicano b-sarcogllcano Mutação no Mutação na Mutação no Mutação na Exon gene Proteína Exon gene Proteína 01 c31C>G p GlnllGlu 02 c.92T>C 0.Leu31Pro 03 c.2 65G>A p. Vai 8 9Met 02 c.100CT p.Arg34Cys 03 c.271C>T p.Arg91Cys 02 c.101G>A p.Arg34His 03 c.272G>C p.Arg91Pro 03 c.184T>C p.Tyr62His 03 c.274_275AT>TC p.IIe92Ser 03 c.2 0 3G>A p.Gly68Gln 03 c.275T>C p.Ile 92Thr 03 c.220C>T p.Arg74Trp 03 c.2 9 9T>A p.MetlOOLys 03 c.229C>T p.Arg77Cys 03 c.32 3T>G p.Leul08Arg 03 c.2 66_2 67inv p.Leu8 9Pro 03 c. 34101 p.Serll4Phe 03 c.2 69>G p.Tyr90Cys 03 c.355A>T p.Ilell9Phe 03 c.2 71G>C p.Gly91Arg 03 c.416G>A p.Glyl3 9Asp 03 c.278C>T p.Ala93Val 04 c.452C>G p.Thrl51Arg 03 c.2 90A>G p.Asp97Gly 04 c.499G>A p.Glyl67Ser 03 c.292C>T p.Arg98Cys 04 c.53 8T>C p.Phel80Leu 03 c.2 93G>A p.Arg98His 04 c.544A>G p.Thrl82Ala 03 c.308T>C p.IIel03Ihr 04 c.551A>G p.Tyrl84Cys 04 c.329G>T p.ArgllOLeu d-sarcogllcano 04 c.371T>C p.IIel24Thr 04 c.212G>C p.Arg71Thr 05 c.409G>A p.Glul37Lys 06 c.451T>G p.Serl51Ala 05 c.421C>A p.Argl41Ser 08 c.593G>C p.Argl98Pro 05 c. 47201 p.Leul58Phe 08 c.631A>T p.Asn211Tyr 05 c. 518T>C p.Leul73Proa 09 c.784C>A p.Glu262Lys 05 c.524T>C p.Vall75Alaa g-sarcoglicano 05 c.541C>T p.Argl81Cys 03 c.205G>C p. Gly69Arg 06 c.5 8 6G>A p.Vali96Ile 03 c.206G>C p.Gly69Asp 06 c.614C>A p.Pro205His 03 c.2 69T>C p. Leu90Ser 06 c.662G>A p.Arg221His 07 c.581T>C p. Leul94Ser 06 o.683C>A p.Pro228Gln 07 c.629A>G p.His210Arg 06 c.724G>T p.Val242Phe 08 c.787G>A p.Glu263Lys 06 c.725T>C p.Val242Ala 08 c.848G>A p.Cys283Tyr 06 c.739G>A p.Va<1247Meta 07 c.850C>T p.Arg284Cys

De acordo com um segundo aspecto, o invento refere-se igualmente a um processo de avaliação in vitro da eficácia de um inibidor da degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD) na sarcoglicanopatia que compreende as seguintes etapas: 9 7408 -cotransfecção em células de quatro genes que codificam os sarcoglicanos (γ-, α-, β- ou δ-), sendo um dos genes portador da mutação testada; incubação durante várias horas na presença do inibidor; - localização do complexo dos sarcoglicanos.

Trata-se, vantajosamente, de sarcoglicanos humanos que portam mutações pontuais.

No caso em que o complexo está localizado na membrana plásmica, conclui-se que o inibidor testado é eficaz face à mutação testada e portanto constitui uma abordagem terapêutica para esta forma de sarcoglicanopatia. A detecção do complexo na membrana plásmica significa: - por um lado a prevenção pelo inibidor da degradação da proteína mutada; e - por outro lado uma translocação correcta da proteína mutada e a sua integração no complexo ao nível da membrana plásmica.

De maneira vantajosa, o processo é concretizado em paralelo: 10 7408 em células cotransfectadas com os genes que codificam os quatro sarcoglicanos não mutados. Isto constitui um testemunho positivo; - realizando-se uma incubação na ausência do inibidor testado. Este testemunho permite concluir quanto ao efeito eventual do inibidor testado.

De maneira preferida, a detecção do complexo é realizada por imuno-histoquimica, com a ajuda de anticorpos dirigida contra pelo menos um dos sarcoglicanos.

Em alternativa, um dos sarcoglicanos pode ser marcado nomeadamente por fluorescência, e depois detectado por microscopia ou por triagem. Esta solução é vantajosa na medida em que a etapa de detecção é menos pesada que a detecção imunológica. Todavia, é importante verificar que a proteína fusão (sarcoglicano + marcação) não perturba a formação do complexo.

Em ambos os casos, a detecção (escolha de anticorpos ou escolha do sarcoglicano a fundir) pode ter como alvo a sarcoglicanopatia mutada mas não necessariamente.

Deve notar-se que este processo de triagem de inibidores pode ser concretizado in vivo, nomeadamente em ratos portadores, numa das sarcoglicanopatias, da mutação testada. 11 7408 O invento e as vantagens que dele decorrem ressaltarão melhor a partir dos exemplos de realização que se seguem, com o auxilio das figuras anexas. O invento é ilustrado mais adiante em relação ao a-sarcoglicano que porta a mutação R77C e à presença de inibidores MG132 (inibidor do proteassoma) e cifunensina (inibidor da manosidase I).

Figura 1: Marcação imuno-histoquímica dos α-, β-, γ- sarcoglicanos e da distrofina de uma biopsia muscular de um paciente que porta a mutação R77C do a-sarcoglicano.

Figura 2: Marcação imuno-histoquímica dos α-, β-, γ- sarcoglicanos e da distrofina no rato, ao nivel de músculos normais (WT), Sgcallc/llc e Sgca-/-.

Figura 3: Histologia dos músculos Sgca-/-, WT e llc/llc /

Sgca (Qua=quadricipes, Ga=gastrocnemius,

Pso=psoas, Del=deltóide).

Figura 4: Detecção de células em necrose por azul Evans nos músculos Sgca-/- e Sgcallc/llc.

Figura 5: Marcação imuno-histoquimica do a- sarcoglicano e do β-sarcoglicano de músculos Sgca-/-injectados por um AAV-humanoSGCA77C. À esquerda: α isolado; ao centro: β isolado; à direita: α + β. 12 7408

Figura 6: Histologia dos músculos Sgca-/- injectados por um AAV-Sgca77C (esquerda: zona não transferida, direita: zona transferida).

Figura 7: Marcação imuno-histoquimica do a-sarcoglicano de células quadritransfectadas não permeabilizadas. À esquerda, quadritransfecção por um α-sarcoglicano normal, à direita com o a-sarcoglicano mutado.

Figura 8: Marcação imuno-histoquimica do a-sarcoglicano (à esquerda) e da calreticulina (ao centro). As duas marcações sobrepostas são mostradas à direita.

Figura 9: Marcação imuno-histoquimica do a-sarcoglicano de células quadritransfectadas com um a-sarcoglicano mutado na presença de MG132.

Figura 10: Marcação imuno-histoquimica do a-sarcoglicano de células quadritransfectadas com um a-sarcoglicano mutado na presença de cifunensina.

Figura 11: Marcação imuno-histoquimica do a-sarcoglicano que mostra a ausência de agregados ao nivel de músculo Sgca-/- injectado com um a-sarcoglicano mutado e depois de tratamento dos ratos pela cifunensina durante uma semana.

Figura 12: A/ Marcação imuno-histoquimica do a-sarcoglicano de células quadritransfectadas com os 13 7408 três sarcoglicanos delta gama beta e um a-sarcoglicano normal (à esquerda), ou com um α-sarcoglicano que porta a mutação R77C na ausência (ao centro) ou na presença de 1-Desoxinojirimicina (dMJ) 100 μΜ (à direita). B/ Marcação imuno-histoquímica do δ-sarcoglicano de células quadritransfectadas com os três sarcoglicanos alfa gama beta e um δ-sarcoglicano que porta a mutação E262K na ausência ou na presença de 1-Desoxinojirimicina (dMJ) 5 ou 100 μΜ. C/ Marcação imuno-histoquímica do β-sarcoglicano de células quadritransfectadas com os três sarcoglicanos delta gama alfa e um β-sarcoglicano que porta a mutação QllE na ausência ou na presença de 1-Desoxinojirimicina (dMJ) 5, 50 ou 100 μΜ.

Figura 13: A/ Marcação imuno-histoquimica do δ-sarcoglicano de células quadritransfectadas com os três sarcoglicanos alfa gama beta e um δ-sarcoglicano que porta a mutação E262K na ausência ou na presença de cifunensina 5 μΜ. B/ Marcação imuno-histoquimica do β-sarcoglicano de células quadritransfectadas com os três sarcoglicanos delta gama alfa e um β-sarcoglicano que porta a mutação QllE na ausência ou na presença da cifunensina 5 μΜ. 14 7408

I) MATERIAL E MÉTODOS 1 - Geração do rato Sgcallc/llc

Um fragmento BamHl-Sfil que porta os exons 2 e 3 do gene Sgca é amplificado por PCR no ADN de um bacteriófago que contém o gene Sgca e depois inserido no vector plasmidico pSP72 (Promega). A mutação H77C é introduzida no exon 3 por mutagénese dirigida com a ajuda dos oligonucleótidos seguintes: 5'- GCCCAGGTGGCTGTGCTACACACAGCGCA-3' (SEQ ID 1) e 5'-TGCGCTGTGTGTAGCACAGCCACCTGGGC-3' (SEQ ID 2) . A presença da mutação pontual é confirmada por sequenciação. Um fragmento 5' BglII-BamHI de cerca de 4 kb e um fragmento 3' Sfil-Spel de 2981 pb são clonados nas duas extremidades do fragmento mutado do vector pSP72. Uma cassete loxP-neor-loxP do vector pGEM- neor é inserida ao nível de um local EcoRV presente no intron 3 e uma cassete timidina quinase (TK) é inserida a jusante do fragmento 3' para realizar o vector de recombinação final. O vector de recombinação (25 pg) é linearizado por digestão Sall e introduzido nas células ES 129Sv por electroporação. O ADN das colónias resistentes ao G418 é isolado e analisado por PCR ou Southern Blot para verificar os acontecimentos de recombinação. São injectados dois clones recombinados independentes (IB4 e VIIICII) em blastócitos C57B1/6 e são produzidos ratos híbridos. Os machos híbridos são cruzados com fêmeas C57B1/6 para produzirem ratos heterozigotas. A cassete neor é eliminada por cruzamento com a raiz eliminadora (15). Os ratos 15 7408 resultantes extirpados da cassete neor são cruzados entre si para produzirem ratos homozigotas mutantes. A genotipagem é realizada por PCR em ADN de cauda extraído pelo conjunto Qiagen DNeasy Tissue Kit, com utilização dos oligonucleótidos a montante a-sarcoQ5': 5'-TATAACCCTGGCTTCCTCTA-3' (SEQ ID 3) e teste Neol 5'-CGAATTCGCC AATGACAAGACGCT-3' (SEQ ID 4) e o oligonucleótido a jusante a- sarcoQ3' 5'-TAGTGGCTCATGCCTTTAAT-3' (SEQ ID 5), que produz um fragmento de 639 pb para o alelo mutante que porta a cassete neor e um fragmento de 484 pb para o alelo selvagem, nas condições de PCR seguintes: 94°C durante 3 minutos, depois 30 ciclos de 94°C durante 30s, 61°C durante 40s e 72°C durante 1 minuto, depois 3 minutos a 72°C. Após excisão da cassete neor, o genotipo é realizado com o oligonucleótido a-sarcoQ5' (SEQ ID 3) e o oligonucleótido a-sarcoQ3' (SEQ ID 5) que produz um fragmento de 575 pb para o alelo mutante.

Para verificar a presença da mutação H77C no gene Sgca do modelo, uma PCR com os oligonucleótidos Klgenoseq2.s: 5'-TGTGTTTGGGACTTATGGGG-3' (SEQ ID 6) e KIgenoseq2.as: 51- CAATCAGCAGCAGCAGCCTC-3' (SEQ ID 7) é realizada em ADN de cauda, que produz um fragmento de 659 pb que é analisado por sequenciação. 2 - Histologia e imuno-histoquímica

Os cortes (8 pm de espessura) preparados a partir de músculos congelados são coloridos por hematoxilina e eosina (H&E). Os cortes que correspondem aos ratos injectados por 16 7408 azul Evans são revelados por excitação fluorescente a 633 nm.

Os cortes secos e depois hidratados em PBS, ou as células fixadas são tratados 20 minutos com 1% Triton diluido em PBS, e depois incubados 30 minutos à temperatura ambiente (TA) em PBS que contém 15% de soro fetal de vitela. Anticorpos policlonais contra os sarcoglicanos (a-sarcoglicano: diluição 1/1000, dirigida contra os ácidos aminados 366-379 do α-sarcoglicano humano; β-sarcoglicano: diluição 1/20, NCL-b-SARC (Novocastra); γ-sarcoglicano: diluição 1/20, NCL-g-SARC (Novocastra); distrofina: diluição 1/20, NCL-DYS2 (Novocastra); e calreticulina: diluição 1/70, ab4109 (Abcam)) são depositadas nos cortes que são de seguida incubados 1 a 2 horas a TA e depois lavados 3 vezes em PBS. Os anticorpos primários são revelados após incubação durante a hora a TA com um anticorpo secundário conjugado aos fluorocromos Alexa488 (A-11032, Molecular Probes) ou Alexa594 (A-11037, Molecular Probes), diluidos a 1:1000 em PBS. Os cortes são lavados três vezes em PBS, são montados com Fluoromount-G (SouthernBiotech 0100-01) e depois examinados com um microscópio confocal (Leica). As análises de imuno-histoquimica nas biopsias humanas são realizadas como descrito em Hackman et al. (9). 3 - Construções dos plasmidos e vectores AAV.

Os plasmidos pAAV_C5-12_a-SG, pcDNA3_a-SG, pcDNA3_p-SG, pcDNA3_Y-SG e pcDNA3_5-SG são obtidos por PCR em ADNc de músculo-esquelético e clones com a ajuda do TOPO TA 17 7408

Cloning kit (Invitrogen). Os sarcoglicanos são em seguida subclonados no plasmido pcDNA3 (Invitrogen) ou pAAV_C5-12_MCS (3) . Os plasmidos pcDNA3_a-SG-R77C e pAAV_C5-12_a-SG-R77C são obtidos a partir de pcDNA3-a-SG ou pAAV_C5-12_a-SG por mutagénese dirigida com utilização do kit Quickchange site-directed mutagenese kit (Stratagene) com a ajuda do oligonucleótido 5'-GCCCCGGTGGCTCTGCTACACCCAGCGC-3' (SEQ ID 8) . As construções são verificadas por digestão enzimática e seguenciação.

As preparações virais AAV 2/1 livres de adenovirus são obtidas com incorporação dos genomas com recombinação AAV2-iTRs em capsideos AAVl com utilização de um protocolo de tritransfecção (2). Os genomas virais são quantificados por dot-blot contra diluições seriadas de plasmido normalizado. 4 - Culturas celulares

As células NIH3T3 ou 911 são cultivadas em meio modificado Dulbecco's D'Eagle, suplementado com glutamina, com gentamicina e 10% de soro fetal de vitela. As células são transfectadas com utilização de 6 μΐ de FuGENE (ROCHE) para 1 pg de plasmido. Para caixas de 6 poços, são utilizados 0,5 pg de cada plasmido (α-SG ou a-SG-R77C e β-SG, y-SG, δ-SG). Para os tratamentos, as células são incubadas 43 horas após transfecção com o inibidor da manosidase (5 pM de cifunensina, VWR) ou um inibidor do proteassoma (5 pM de MG132 dissolvidos em DMSO, Sigma) durante 5 horas. As células são lavadas em PBS e fixadas 15 minutos à TA com formaldeido 3,7% em PBS e depois secadas três vezes em PBS antes da marcação imuno-histoquimica. 18 7408 5 - Experiências in vivo

Os ratos Sgca11/llc são submetidos a um exercício de corrida durante 30 minutos num tapete rolante (Columbus treadmill instrument Exer 6M) durante 3 dias consecutivos. 0 tapete rolante é inclinado segundo uma inclinação de 15 graus em descida e a velocidade fixada em 10 metros por minuto. Ao fim dos 3 dias, os ratos são injectados em intraperitoneal por azul Evans (0,5 mg/g). No dia seguinte, os ratos são sacrificados e os músculos deltoides, psoas, gastrocnemius, glúteo, extensor digitorum longus e quadrícepes são amostrados e rapidamente congelados em isopentano arrefecido com azoto líquido.

As preparações virais rAAV2/l são injectadas (1010 genoma virai (gv) em 30 μΐ no total) no músculo tibialis anterior esquerdo de ratos Sgca-/-. Aos dias 20, 22, 25 e 27 após injecção, são injectadas 10 μΜ de cifunensina ou 20 μΜ de MG132 no músculo (seja 2 e 4 vezes as concentrações utilizadas in vitro para ter em conta a difusão no músculo). Um dia antes do sacrifício (dia 27), os ratos são injectados em intraperitoneal por azul Evans. Os tibialis direito e esquerdo são tirados para amostra e rapidamente congelados em isopentano arrefecido com azoto líquido. 19 7408

II) RESULTADOS 1 - A forma mutada R77C do α-sarcoglicano está ausente da membrana no homem. A presença da mutação R77C no α-sarcoglicano acarreta a destabilização do complexo dos sarcoglicanos no homem, como mostrado por uma marcação imuno-histoquímica com a ajuda de anticorpos dirigida contra as diferentes proteínas do complexo (Figura 1). 2 - A presença de uma cisteína na posição 77 no rato não perturba o endereçamento para a membrana do cx-sarcoglicano e não acarreta manifestação patológica.

Para estudar este fenómeno de destabilização, realizámos, por recombinação homóloga, um modelo animal (Sgcallc/llc) que porta uma cisteína na posição 77. É necessário notar que a espécie murina porta nesta posição um resíduo histidina em vez de um resíduo arginina. A análise dos músculos dos ratos assim obtida por imuno-histoquímica com a ajuda de anticorpos dirigidos contra as diferentes proteínas do complexo DGC mostrou que a presença da mutação não impede o endereçamento do a-sarcoglicano para a membrana nem a formação do complexo dos sarcoglicanos (Figura 2). Foram utilizados cortes de ratos normais e deficientes em α-sarcoglicano (Sgca-/-, 8) como controlo. A histologia dos músculos deltoide, psoas, gastrocnemius e quadrícepes obtidos do rato Sgcallc/llc com 20 7408 idade de 3 e 6 meses foi examinada por coloração com hematoxilina/eosina e comparada à do rato Sgca-/-. Enquanto estes últimos apresentaram sinais distróficos severos, não pôde ser detectada nenhuma anomalia ao nivel dos músculos Sgcallc/llc (Figura 3) . A ausência de anomalias musculares foi confirmada por uma analise funcional. Foram submetidos ratos Sgca a um exercício que favorece as contracções excêntricas e depois foram injectados em intraperitoneal por um colorante que marca especificamente as células em necrose, o azul Evans. Não se pôde evidenciar nenhuma penetração com azul Evans nos músculos dos ratos Sgcallc/llc (Figura 4) . Para determinar se as diferenças observadas ao nivel das consequências da presença da presença de um resíduo cisteína na posição 77 entre o homem e o rato estavam ligadas à natureza da proteína humana, realizámos experiências de transferência de gene no músculo dos ratos deficientes em α-sarcoglicano com a ajuda de um vector virai derivado do vírus associado ao adenovírus (AAV) que porta o gene humano do α-sarcoglicano mutado na posição 77. A análise dos músculos injectados permitiu mostrar que a forma mutada se localiza na membrana embora uma parte seja retida no retículo, que o complexo sarcoglicano se forma e que corrige a patologia (Figuras 5 e 6). De notar na figura 5 a acumulação perinuclear do α-sarcoglicano em certas células. 3 - A presença da mutação acarreta uma retenção do α-sarcoglicano e uma degradação pelo proteassoma. 21 7408

Estabelecemos um modelo celular que reproduz os fenómenos observados no homem por quádrupla transfecção de plasmidos codificadores para os diferentes sarcoglicanos. Neste modelo, o complexo é correctamente formado na membrana quando o α-sarcoglicano normal é cotransfectado com os três outros sarcoglicanos, enquanto não é detectado na membrana quando o α-sarcoglicano porta a mutação R77C. Isto pôde ser demonstrado por uma marcação imuno-histoquímica com a ajuda de um anticorpo dirigido contra a parte extracelular do α-sarcoglicano em células não permeabilizadas (Figura 7) .

Uma co-marcação do α-sarcoglicano com um marcador do reticulo endoplasmático (calreticulin) em células permeabilizadas mostra que a proteína mutada é retida nas vias de secreção (Figura 8).

Postulámos que o α-sarcoglicano mutado seria reconhecido como anormal pelo sistema de controlo/qualidade das proteínas ao nível do retículo e secundariamente degradado pelo proteassoma. Isto pôde ser confirmado pela utilização do inibidor do proteassoma MG132 que permite restaurar o endereçamento para a membrana (Figura 9).

4-0 endereçamento para a membrana é restaurado por inibição da manosidase I

Os sistemas de controlo/qualidade do retículo permitem a degradação de proteínas mal dobradas. A enzima manosidase I tem um papel importante neste processo por intermédio de uma modificação de cadeias de oligosacarídeos das proteínas 22 7408 glicolizadas como os sarcoglicanos. Em função deste dado e dos nossos resultados, postulámos que a utilização de um inibidor desta enzima permitiria restaurar o endereçamento para a membrana da forma mutada do α-sarcoglicano. Esta hipótese foi demonstrada em células quadritransfectadas com uma forma mutada do α-sarcoglicano no modelo celular tratado pela cifunensina (Figura 10).

As diferenças entre espécies, humana e murina observadas precedentemente não nos permitem dispor de um modelo in vivo equivalente ao homem. Entretanto, uma redução da retenção parcial da forma mutada no retículo após transferência do gene permitir-nos-ia sugerir que a inibição da manosidase I teria um efeito benéfico no endereçamento do α-sarcoglicano. Para determinar se a utilização do inibidor poderia ser eficaz in vivo, injectámos este produto em intramuscular três vezes durante uma semana nos músculos de ratos Sgca-/- que foram previamente injectados (15 dias antes) pelo vector AAV-SGCA77C. As observações dos músculos injectados e tratados mostram uma ausência quase total dos agregados em particular a ausência da acumulação perinuclear e valida portanto a hipótese de trabalho (Figura 11).

Resultados também totalmente convincentes foram obtidos com a cifunensina em duas outras mutações pontuais que afectam duas outras subunidades do complexo dos sarcoglicanos: mutação E262K portada pela subunidade δ (Fig. 13A) e mutação Q11E portada pela subunidade β (Fig. 13B) . 23 7408 5 - Restauração pela 1-Desoxinojirimicina (dMJ)

Foram realizadas experiências similares às conduzidas na presença de cifunensina na mutação R77C do a-sarcoglicano na presença de 1-Desoxinojirimicina (dMJ), um outro inibidor conhecido das manosidases de classe I. Os resultados aparecem na figura 12A e revelam a eficácia desta substância para restabelecer o endereçamento para a membrana da forma mutada do α-sarcoglicano (mutação R77C).

Além disso, experiências similares permitiram validar a hipótese de trabalho noutras mutações gue afectam outras subunidades do complexo dos sarcoglicanos: mutação E262K portada pela subunidade δ (Fig. 12B) e mutação Q11E portada pela subunidade β (Fig. 12C).

Em conclusão, foi mostrado que a espécie murina se diferencia da espécie humana no que diz respeito a encarregar-se da forma do α-sarcoglicano que porta uma cisteina na posição 77 e que esta forma mutada, quando é correctamente localizada, é funcional e corrige a patologia ligada à deficiência em sarcoglicano. Mostrámos num modelo celular que a inibição da manosidase I impede a degradação da forma mutada e o seu endereçamento correcto para a membrana. A utilização in vivo deste produto parece igualmente exercer o mesmo efeito.

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Zatz. 1996. The sarcoglycan complex in the six autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 5: 1963-9.

Lisboa, 14 de Janeiro de 2010 28 7408

LISTAGEM DE SEQUENCIA <no> genethon:

Centre National de la Recherche scientifique (CNRS)

<120> MEDICAMENTS POIJR LE TRAITEMENT DES SARCOGLYCANOPATHIES

<13Q> G143-B-23358 PCT <150> FR 06/53020 <151> 2006-07-18 <160> 8 <170> Patentin version 3.1 <210> 1 <211* 29 <212> DNA . <213> Artificial Sequente <220> <223> h77c (1) <400> 1 gcccaggtgg ctgtgctaca cacagcgca 29

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Claims (10)

1. 7398 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um inibidor das α-manosidases de classe I para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento das sarcoglicanopatias.
2. 2. Utilização de um inibidor de acordo com a reivindicação 1, caracterizada em que o inibidor é uma molécula que possui uma actividade inibidora das α-manosidases de classe 1.
3. 3. Utilização de um inibidor de acordo com a reivindicação 2, caracterizada em que o composto é a cifunensina ou 1-Desoxinojirimicina, vantajosamente a cifunensina.
4. 4. Utilização de um inibidor de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada em que a sarcoglicanopatia está ligada à mutação R77C no a- sarcoglicano humano.
5. 5. Utilização de um inibidor de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada em que a sarcoglicanopatia está ligada à mutação E262K no δ- sarcoglicano humano.
6. 6. Utilização de um inibidor de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada em que a sarcoglicanopatia está ligada à mutação QllE no β- sarcoglicano humano. 1 7398
7. 7. Processo de avaliação in vitro da eficácia de um inibidor das α-manosidases de classe I nas sarcoglicanopatias que compreende as seguintes etapas: cotransfecção nas células dos quatro genes que codificam os sarcoglicanos (γ-, α-, β- ou δ-), sendo um dos genes portador de uma mutação; - incubação durante várias horas na presença de um inibidor tal como definido numa das reivindicações 1 a 3; - localização do complexo dos sarcoglicanos.
8. 8. Processo de avaliação in vitro da eficácia de um inibidor de acordo com a reivindicação 7 caracterizado em que o processo é concretizado em paralelo em células cotransfectadas pelos genes não mutados que codificam os quatro sarcoglicanos.
9. 9. Processo de avaliação in vitro da eficácia de um inibidor de acordo com a reivindicação 7 ou 8 caracterizado em que o processo é concretizado em paralelo em células incubadas na ausência do inibidor.
10. 10. Processo de avaliação in vitro da eficácia de um inibidor de acordo com uma das reivindicações 7 a 9 caracterizado em que a localização do complexo é realizada por marcação imuno-histoquimica. Lisboa, 14 de Janeiro de 2010 2