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ES2335623T3 - Medicamentos que comprenden un inhibidor de las alfa-manosidasas de clase i para el tratamiento de sarcoglicanopatias. - Google Patents

Medicamentos que comprenden un inhibidor de las alfa-manosidasas de clase i para el tratamiento de sarcoglicanopatias. Download PDF

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ES2335623T3
ES2335623T3 ES07803872T ES07803872T ES2335623T3 ES 2335623 T3 ES2335623 T3 ES 2335623T3 ES 07803872 T ES07803872 T ES 07803872T ES 07803872 T ES07803872 T ES 07803872T ES 2335623 T3 ES2335623 T3 ES 2335623T3
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sarcoglycans
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Isabelle Richard
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Genethon
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Abstract

Uso de un inhibidor de las & alpha ;-manosidasas de clase I para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las sarcoglicanopatías.

Description

Medicamentos que comprenden un inhibidor de las \alpha-manosidasas a clase I para el tratamiento de sarcoglicanopatías.
Campo técnico
La presente invención se refiere al tratamiento de las sarcoglicanopatías.
La invención preconiza el uso de inhibidores de la manosidasa I, como medicamentos para el tratamiento de ciertas formas de estas enfermedades.
Estado anterior de la técnica
Las sarcoglicanopatías son unas enfermedades musculares del grupo de las miopatías de cinturas ("Limb Girdle Muscular Dystrophy" o LGMD) y se transmiten en el modo autosómico recesivo. Se han identificado cuatro formas (LGMD 2C, LGMD 2D, LGMD 2E, LGMD 2F), debidas respectivamente a unos defectos en los genes de los \gamma-, \alpha-, \beta- y \delta-sarcoglicanos (11, 17).
La LGMD 2C está particularmente extendida en la cuenca mediterránea y en las poblaciones gitanas que residen en Europa. La LGMD 2D ha sido identificada en el mundo en pacientes en Europa, África, Japón y Brasil. La LGMD 2E se ha encontrado particularmente en la comunidad amish y en el Magreb. La LGMD 2F se ha descrito hasta ahora sólo en 7 familias de origen brasileño, turco e italiano. Las sarcoglicanopatías se traducen por una deficiencia progresiva de los músculos de las cinturas pelvianas y escapulares asociada frecuentemente a una hipertrofia de las pantorrillas. El intelecto está todavía conservado. Una afección cardiaca de tipo cardiomiopatía se encuentra a veces en las LGMD 2C, LGMD 2E y LGMD 2F.
A nivel histológico, los músculos presentan unas zonas de regeneración y de degeneración, unos infiltrados inflamatorios, fibrosis y una variabilidad del tamaño de las fibras. Las sarcoglicanopatías presentan una severidad variable, incluso en el seno de las descendencias. En las formas más graves, los pacientes pierden el andar antes de los 30 años y tienen una esperanza de vida reducida.
Dos de las sarcoglicanopatías presentan unas mutaciones recurrentes. Para la LGMD 2C, la mutación del521T se encuentra frecuentemente en las poblaciones magrebíes, y la mutación C283Y en las poblaciones gitanas (4, 13).
La mutación más frecuente presente en la LGMD 2D corresponde a una sustitución de la arginina en posición 77 por una cisteína (R77C). Esta mutación se encuentra en una tercera parte de los pacientes en Europa con la excepción de Finlandia en la que se encuentra en el 100% de los pacientes la mayoría de las veces en los dos alelos
(5, 9).
Los sarcoglicanos (SG) constituyen un grupo de glicoproteínas integradas en la membrana plásmica y que participan en el complejo asociado a la distrofina (12). Este complejo participa en la unión entre el citoesqueleto de actina y la matriz extracelular y, por consiguiente, en la estabilidad de la membrana de la fibra muscular (10). Los sarcoglicanos están compuestos por un pequeño dominio intracelular localizado en C-terminal (\alpha-sarcoglicano) o en N-terminal (\gamma-, \beta- y \delta-sarcoglicanos), un dominio transmembranario único y un amplio dominio extracelular que contiene unos sitios de N-glicosilación.
El complejo de los sarcoglicanos se forma durante el tránsito de estas proteínas en el retículo sarcoplásmico y el aparato de Golgi (6, 16). El \beta-sarcoglicano sirve de iniciador para la formación del complejo. Su asociación con el \delta-sarcoglicano posiciona el complejo en la membrana. Por último, la incorporación del \alpha-sarcoglicano y su interacción con el \gamma-sarcoglicano termina el ensamblaje. Unas mutaciones en cualquiera de los sarcoglicanos pueden impedir que el complejo se forme, provocando una deficiencia secundaria de los demás sarcoglicanos.
Aunque en la actualidad se sabe diagnosticar las sarcoglicanopatías, e incluso identificar la componente mutada responsable del fenotipo (\gamma-, \alpha-, \beta- o \delta-sarcoglicano), así como la mutación en cuestión, los medios para ocuparse de esta enfermedad siguen siendo modestos.
En la actualidad, no se conoce ningún tratamiento específico y la mayoría de los pacientes necesitan una quinesiterapia para prevenir la agravación de las contracturas. Sin embargo, varios equipos han aportado unos resultados positivos a nivel experimental mediante unos enfoques de transferencia de gen con la ayuda de vectores víricos o de terapia celular en unos modelos animales (1, 7, 14). Así, el documento WO 00/20582 preconiza una terapia mediante la sustitución de los genes de sarcoglicanos defectuosos, vehiculados en particular por unos AAV.
Se ha propuesto asimismo, en la técnica anterior, un enfoque general de inhibición del proteasoma para el tratamiento de las patologías musculares, en particular de las distrofias musculares. Sin embargo, esta estrategia poco específica parece poco eficaz y plantea unos problemas de tolerancia.
Existe por lo tanto una necesidad crucial de desarrollar nuevas terapias, en particular medicamentosas, que permitan tratar específica y eficazmente las sarcoglicanopatías.
Objeto de la invención
La presente invención se basa en la demostración por los inventores de que:
-
ciertas mutaciones en los sarcoglicanos, asociadas a una sarcoglicanopatías, dan lugar a unas glicoproteínas que presentan un mal replegado;
-
estas proteínas "plegadas erróneamente" son asumidas por la vía de la degradación proteolítica de las glicoproteínas asociada al retículo endoplásmico;
-
unos inhibidores de esta vía bloquean la degradación de los sarcoglicanos mutados;
-
cuando no están degradados (en presencia de inhibidores), los sarcoglicanos mutados pueden ser correctamente translocados a la membrana plásmica e integrados en el complejo de sarcoglicanos, lo que se traduce por la restauración de un fenotipo normal.
Para recordar, las glicosidasas del retículo endoplásmico (RE) desempeñan una función en el control de la calidad de la producción de las glicoproteínas. Aseguran que únicamente las replegadas correctamente son transportadas hacía su destino final. En particular, la escisión de los residuos manosa en el RE por las \alpha-manosidasas actúa como una señal para dirigir las glicoproteínas mal replegadas hacía una degradación por el proteasoma.
Las \alpha-manosidasas se clasifican en dos grupos. Las de clase I (manosidasa I) son inhibidas por la 1-desoximanojirimicina y la kifunensina, mientras que las de la clase II son específicamente inhibidas por la swainsonina. En cuanto al proteasoma, éste es un complejo proteico implicado en la degradación de las proteínas intracelulares en el citosol y se puede inhibir por ejemplo mediante MG132 o el bortezomib.
A priori, se puede usar cualquier inhibidor de esta vía de degradación (ERAD en inglés para "Endoplasmic reticulum-associated degradation"). Sin embargo, la presente invención se ha centrado en los inhibidores de la manosidasa I que resultan ser de una gran selectividad en su modo de acción y de una eficacia remarcable para el tratamiento de las sarcoglicanopatías. Clínicamente, esto se traduce en particular por unos efectos secundarios potencialmente menores.
Por consiguiente, la invención se refiere al uso de inhibidores de las \alpha-manosidasas de clase I para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las sarcoglicanopatías.
Aparece claramente, en el contexto de la invención, que se prevé el uso de por lo menos un inhibidor de la manosidasa I. Evidentemente, no se excluye usar un "cóctel" de inhibidores, a saber, varios inhibidores de naturaleza diferente, que tienen unas actividades inhibidoras complementarias, en particular en términos de actividad/selectividad.
Se prefieren muy particularmente la kifunensina (CAS 109944-15-2) y la 1-desoximanojirimicina (CAS 84444-90-6), moléculas conocidas por ser unos inhibidores de la manosidasa I.
Sin embargo, la invención no se limitará a estas moléculas. En efecto, cualquier molécula candidata se puede ensayar para su actividad inhibidora de la manosidasa I, gracias a la realización de un ensayo enzimático simple.
Así, en la medida en la que se buscan soluciones terapéuticas para las sarcoglicanopatías humanas, la enzima ensayada es ventajosamente una alfa-manosidasa de clase I de origen humano, en particular la referenciada en las bases de dato con el número (Accession Number): NP_005898 (mannosidase, alpha, class 1A, member 1 [Homo sapiens]).
Un ensayo enzimático adaptado para ensayar dichos inhibidores se describe, por ejemplo en la publicación J. Biol Chem. 8 de octubre de 2004; 279(41):42638-47. Epub 22 de julio de 2004. "The twisted abdomen phenotype of Drosophila POMT1 and POMT2 mutants coincides with their heterophilic protein O-mannosyltransferase activity", Ichimiya T, Manya H, Ohmae Y, Yoshida H, Takahashi K, Ueda R, Endo T, Nishihara S.
El modo de administración, la dosis administrada, así como la frecuencia de administración se determinan caso por caso, según unos protocolos habituales, conocidos por el experto en la materia. En efecto, estos parámetros pueden depender en particular de la mutación a tratar y del inhibidor elegido.
Se puede elegir preferentemente la kifunensina. Resulta de una muy alta especificidad y presenta la ventaja de ser una molécula soluble en agua, que puede prestarse para una administración por vía oral.
Además, este tratamiento parece particularmente apropiado para el tratamiento de una sarcoglicanopatía relacionada con una mutación R77C (Arg77Cys a nivel de la proteína o 229C>T a nivel del gen) en el \alpha-sarcoglicano humano. Como ya se ha mencionado, esta mutación es responsable de numerosos casos clínicos, en particular en Europa.
Sin embargo, el solicitante ha mostrado que la 1-desoximanojirimicina podía ser usada asimismo en lugar de la kifunensina.
Además, se ha demostrado en el ámbito de la invención que el efecto observado no estaba relacionado con una mutación específica en una sub-unidad específica.
En efecto, el mismo efecto beneficioso se ha podido observar en las sub-unidades \beta y \delta, más precisamente para las mutaciones Q11E y E262K, respectivamente, sea cual sea el inhibidor presente.
Así, el presente tratamiento puede aplicarse potencialmente a todas las mutaciones identificadas en la actualidad en los cuatro sarcoglicanos humanos. Sin embargo, sólo las mutaciones puntuales son candidatos potenciales a este tratamiento puesto que en el caso de codones stop o de deleciones, está a priori excluido que la proteína truncada, incluso si no está degradada, pueda ser activa.
Las principales mutaciones puntuales catalogadas en la actualidad se listan en la tabla siguiente. Ésta no pretende sin embargo ser exhaustiva.
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\newpage
Según un segundo aspecto, la invención se refiere asimismo a un procedimiento de evaluación in vitro de la eficacia de un inhibidor de la degradación asociada al retículo endoplásmico (ERAD) sobre la sarcoglicanopatía, que comprende las siguientes etapas:
-
co-transfectar en unas células los cuatro genes que codifican los sarcoglicanos (\gamma-, \alpha-, \beta- o \delta-), siendo uno de los genes portador de la mutación ensayada;
-
incubar durante varias horas en presencia del inhibidor;
-
localizar el complejo de los sarcoglicanos.
Ventajosamente, se trata de los sarcoglicanos humanos, que contienen unas mutaciones puntuales.
En el caso en el que el complejo está localizado en la membrana plásmica, se concluye que el inhibidor ensayado es eficaz frente a la mutación ensayada, y por lo tanto constituye un enfoque terapéutico para esta forma de sarcoglicanopatía.
La detección del complejo en la membrana plásmica significa:
-
por un lado, la prevención de la degradación de la proteína mutada por el inhibidor; y
-
por otro lado, una translocación correcta de la proteína mutada y su integración en el complejo a nivel de la membrana plásmica.
De manera ventajosa, el procedimiento se realiza en paralelo:
-
sobre unas células co-transfectadas con los genes que codifican los cuatro sarcoglicanos no mutados. Esto constituye un control positivo;
-
realizando una incubación en ausencia del inhibidor ensayado. Este control permite concluir sobre el efecto eventual del inhibidor ensayado.
De manera preferida, la detección del complejo se realiza mediante inmunohistoquímica, con la ayuda de anticuerpos dirigidos contra por lo menos uno de los sarcoglicanos.
Alternativamente, uno de los sarcoglicanos puede ser marcado, en particular mediante fluorescencia, y después detectado mediante microscopía o mediante selección. Esta solución es ventajosa en la medida en la que la etapa de detección es menos pesada que la detección inmunológica. Sin embargo, es importante verificar que la proteína de fusión (sarcoglicano + marcado) no perturbe la formación del complejo.
En los dos casos, la detección (elección del anticuerpo o elección del sarcoglicano a fusionar) puede tener como diana el sarcoglicano mutado pero no obligatoriamente.
Se debe observar que este procedimiento de cribado de inhibidores se puede realizar in vivo, en particular sobre unos ratones portadores, en uno de los sarcoglicanos, de la mutación ensayada.
La invención y las ventajas que se desprenden de ella se pondrán más claramente de manifiesto a partir de los ejemplos de realización siguientes, con el apoyo de las figuras adjuntas.
La invención se ilustra más adelante con relación al \alpha-sarcoglicano que contiene la mutación R77C y en presencia de los inhibidores MG132 (inhibidor del proteasoma) y kifunensina (inhibidor de la manosidasa I).
Figura 1: Marcado inmunohistoquímico de los \alpha-, \beta-, \gamma-sarcoglicanos y de la distrofina de una biopsia muscular de un paciente que contiene la mutación R77C del \alpha-sarcoglicano.
Figura 2: Marcado inmunohistoquímico de los \alpha-, \beta-, \gamma-sarcoglicanos y de la distrofina en el ratón, a nivel de músculos normales (WT), Sgca^{77C/77C} y Sgca-/-.
Figura 3: Histología de los músculos Sgca-/-, WT y Sgca^{77C/77C} (Qua = cuádriceps, Ga = gastrocnemio, Pso = psoas, Del = deltoides).
Figura 4: Detección de células en necrosis mediante azul de Evans en los músculos Sgca-/- y Sgca^{77C/77C}.
Figura 5: Marcado inmunohistoquímico del \alpha-sarcoglicano y del \beta-sarcoglicano de músculos Sgca-/- inyectados mediante un AAV-humano SGCA77C. A la izquierda: \alpha solo; en el centro: \beta solo; a la derecha: \alpha + \beta.
Figura 6: Histología de los músculos Sgca-/- inyectados mediante un AAV-Sgca77 (izquierda: zona no transducida, derecha: zona transducida).
Figura 7: Marcado inmunohistoquímico del \alpha-sarcoglicano de células transfectadas por cuadruplicado no permeabilizadas. A la izquierda, transfección cuádruple por un \alpha-sarcoglicano normal, a la derecha con el \alpha-sarcoglicano mutado.
Figura 8: Marcado inmunohistoquímico del \alpha-sarcoglicano (a la izquierda) y de la calreticulina (en el centro). Los dos marcados superpuestos se muestran a la derecha.
Figura 9: Marcado inmunohistoquímico del \alpha-sarcoglicano de células transfectadas por cuadruplicado con un \alpha-sarcoglicano mutado en presencia de MG132.
Figura 10: Marcado inmunohistoquímico del \alpha-sarcoglicano de células transfectadas por cuadruplicado con un \alpha-sarcoglicano mutado en presencia de kifunensina.
Figura 11: Marcado inmunohistoquímico del \alpha-sarcoglicano que muestra la ausencia de agregados a nivel del músculo Sgca-/- inyectado con un \alpha-sarcoglicano mutado y después del tratamiento de los ratones mediante la kifunensina durante una semana.
Figura 12: A/ Marcado inmunohistoquímico del \alpha-sarcoglicano de células transfectadas por cuadruplicado con los tres sarcoglicanos delta, gamma, beta y un \alpha-sarcoglicano normal (a la izquierda), o con un \alpha-sarcoglicano que contiene la mutación R77C en ausencia (en el centro) o en presencia de 1-desoximanojirimicina (dMJ) 100 \muM (a la derecha).
B/ Marcado inmunohistoquímico del \delta-sarcoglicano de células transfectadas por cuadruplicado con los tres sarcoglicanos alfa, gamma, beta y un \delta-sarcoglicano que contiene la mutación E262K en ausencia o en presencia de 1-desoximanojirimicina (dMJ) 5 ó 100 \muM.
C/ Marcado inmunohistoquímico del \beta-sarcoglicano de células transfectadas por cuadruplicado con los tres sarcoglicanos delta, gamma, alfa y un \beta-sarcoglicano que contiene la mutación Q11E en ausencia o en presencia de 1-desoximanojirimicina (dMJ) 5, 50 ó 100 \muM.
Figura 13: A/ Marcado inmunohistoquímico del \delta-sarcoglicano de células transfectadas por cuadruplicado con los tres sarcoglicanos alfa, gamma, beta y un \delta-sarcoglicano que contiene la mutación E262K en ausencia o en presencia de kifunensina 5 \muM.
B/ Marcado inmunohistoquímico del \beta-sarcoglicano de células transfectadas por cuadruplicado con los tres sarcoglicanos delta, gamma, alfa y un \beta-sarcoglicano que contiene la mutación Q11E en ausencia o en presencia de kifunensina 5 \muM.
I) Material y métodos 1 - Generación del ratón Sgca^{77C/77C}
Un fragmento BamHI-SfiI de 1075 pb que contiene los exones 2 y 3 del gen Sgca se amplifica mediante PCR sobre el ADN de un fago que contiene el gen Sgca y después se inserta en el vector plasmídico pSP72 (Promega). La mutación H77C se introduce en el exón 3 mediante mutagénesis dirigida con la ayuda de los siguientes oligonucleótidos: 5'-GCCCAGGTGGCTGTGCTACACACAGCGCA-3' (SEC ID nº 1) y 5'-TGCGCTGTGTGTAGCACAGCCACCTG
GGC-3' (SEC ID nº 2). La presencia de la mutación puntual se confirma mediante secuenciación. Un fragmento 5' BglII-BamHI de aproximadamente 4 kb y un fragmento 3' SfiI-SpeI de 2981 pb se clonan en los dos extremos del fragmento mutado del vector pSP72. Un casete loxP-neo^{r}-loxP del vector pGEM-neo^{r} se inserta a nivel de un sitio EcoRV presente en el intrón 3, y se inserta un casete timidina quinasa (TK) corriente abajo del fragmento 3' para realizar el vector de recombinación final.
El vector de recombinación (25 \mug) se lineariza mediante digestión SalI y se introduce en unas células ES 129Sv mediante electroporación. El ADN de las colonias resistentes al G415 se aísla y se analiza mediante PCR o transferencia Southern para verificar los eventos de recombinación. Dos clones recombinantes independientes (IB4 y VIIICII) se inyectan en unos blastocistos C57B1/6, y se producen unos ratones quimeros. Los machos quiméricos se cruzan con unas hembras C57B1/6 para producir unos ratones heterocigotos. El casete neo^{r} se elimina mediante cruce con la cepa deleter (15). Los ratones resultantes escindidos del casete neo^{r} se cruzan entre sí para producir unos ratones homocigotos mutantes.
El genotipaje se realiza mediante PCR sobre ADN de cola extraído mediante el kit Qiagen DNeasy Tissue Kit, usando los oligonucleótidos corriente arriba a-sarcoQ5': 5'-TATAACCCTGGCTTCCTCTA-3' (SEC ID nº 3) y testNeol 5'-CGAATTCGCCAATGACAAGACGCT-3' (SEC ID nº 4) y el oligonucleótido corriente abajo a-sarcoQ3': 5'-TAGTGGCTCATGCCTTTAAT-3' (SEC ID nº 5), produciendo un fragmento de 639 pb para el alelo mutante que contiene el casete neo^{r} y un fragmento de 484 pb para el alelo salvaje, en las condiciones de PCR siguientes: 94ºC durante 3 minutos, después 30 ciclos de 94ºC durante 30s, 61ºC durante 40s y 72ºC durante 1 minuto, y después 3 minutos a 72ºC. Después de la escisión del casete neo^{r}, el genotipo se realiza con el oligonucleótido a-sarcoQ5' (SEC ID nº 3) y el oligonucleótido a-sarcoQ3' (SEC ID nº 5) produciendo un fragmento de 575 pb para el alelo mutante.
Para verificar la presencia de la mutación H77C en el gen Sgca del modelo, se realiza una PCR con los oligonucleótidos Klgenoseq2.s: 5'-TGTGTTTGGGACTTATGGGG-3' (SEC ID nº 6) y Klgenoseq2.as: 5'-CAATCAGCAGCAGCAGCCTC-3' (SEC ID nº 7) sobre el ADN de cola, produciendo un fragmento de 659 pb que se analiza mediante secuenciación.
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2 - Histología e inmunohistoquímica
Los cortes (8 \mum de grosor) preparados a partir de músculos congelados se tiñen mediante hematoxilina y eosina (H&E). Los cortes que corresponden a los ratones inyectados mediante azul de Evans se revelan mediante excitación fluorescente a 633 nm.
Los cortes secados, y después hidratados en PBS, o las células fijadas se tratan durante 20 min. con 1% de tritón diluido en PBS, y después se incuban durante 30 min. a temperatura ambiente (TA) en PBS que contiene 15% de suero de ternera fetal. Unos anticuerpos policlonales contra los sarcoglicanos (\alpha-sarcoglicano: dilución 1/1000, dirigido contra los aminoácidos 366-379 del \alpha-sarcoglicano humano; \beta-sarcoglicano: dilución 1/20, NCL-b-SARC (Novocastra); \gamma-sarcoglicano: dilución 1/20 NCL-g-SARC (Novocastra); distrofina: dilución 1/20, NCL-DYS2 (Novocastra); y calreticulina; dilución 1/70, ab4109 (Abecam)) se depositan sobre los cortes que se incuban después durante 1 a 2 horas a TA y después se lavan 3 veces en PBS. Los anticuerpos primarios se revelan después de la incubación durante 1 hora a TA con un anticuerpo secundario conjugado con los fluorocromos Alexa488 (A-11032, Molecular Probes) o Alexa594 (A-11037, Molecular Probes), diluidos al 1:1000 en PBS. Los cortes se lavan tres veces en PBS, se montan con fluoromount-G (SouthernBiotech 0100-01) y después se examinan con un microscopio confocal (Leica). Los análisis de inmunohistoquímica sobre las biopsias humanas se realizan tal como se describe en Hackman et al. (9).
\vskip1.000000\baselineskip
3 - Construcciones de los plásmidos y de los vectores AAV
Los plásmidos pAAV_C5-12_\alpha-SG, pcDNA3_\alpha-SG, pcDNA3-\beta-SG, pcDNA3_\gamma-SG y pcDNA3_\delta-SG se obtienen mediante PCR sobre ADNc de músculo esquelético y clones con la ayuda del kit TOPO TA cloning kit (Invitrogen). Los sarcoglicanos se sub-clonan a continuación en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen) o pAAV_C5-12_MCS (3). Los plásmidos pcDNA3_\alpha-SG-R77C y pAAV_C5-12_\alpha-SG-R77C se obtienen a partir de pcDNA3-\alpha-SG o pAAV_C5-12_\alpha-SG mediante mutagénesis dirigida usando el kit Quickchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene) con la ayuda del oligonucleótido 5'-GCCCCGGTGGCTCTGCTACACCCAGCGC-3' (SEC ID nº 8).
Las construcciones se verifican mediante digestión enzimática y secuenciación.
Las preparaciones virales AAV 2/1 adenovirus-free se obtienen incorporando los genomas recombinantes AAV2-ITR en unas cápsides AAV1 usando un protocolo de transfección triple (2). Los genomas víricos se cuantifican mediante transferencia dot contra unas diluciones seriadas de plásmido estándar.
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4 - Cultivos celulares
Las células NIH3T3 o 911 se cultivan en medio modificado Dulbecco de Eagle, suplementado con glutamina, gentamicina y 10% de suero de ternera fetal. Las células se transfectan usando 6 \mul de Fugene (ROCHE) para 1 \mug de plásmido. Para unas cajas de 6 pocillos, se usan 0,5 \mug de cada plásmido (\alpha-SG o \alpha-SG-R77C y \beta-SG, \gamma-SG, \delta-SG). Para los tratamientos, las células se incuban durante 43 horas después de la transfección con el inhibidor de la manosidasa (5 \muM de kifunensina, VWR) o un inhibidor del proteasoma (5 \muM de MG132 disuelto en DMSO, Sigma) durante 5 horas. Las células se lavan en PBS y se fijan durante 15 min. a TA con formaldehído al 3,7% en PBS y después se aclaran tres veces en PBS antes del marcado inmunohistoquímico.
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5 - Experimentos in vivo
Los ratones Sgca^{77C/77C} se someten a un ejercicio de carrera durante 30 minutos sobre una cinta de correr (Columbus treadmill instrument Exer 6M) durante 3 días consecutivos. La cinta de correr se inclina según una pendiente de 15 grados en bajada y la velocidad se fija a 10 metros por minuto. Al final de los 3 días, los ratones se inyectan por vía intraperitoneal con azul de Evans (0,5 mg/g). Al día siguiente, los ratones son sacrificados y los músculos deltoides, psoas, gastrocnemio, glúteo, extensor digitorum longus y cuádriceps se extraen y se congelan rápidamente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido.
Las preparaciones virales rAAV2/1 se inyectan (10^{10} viral genoma (vg) en 30 \mul en total) en el músculo tibial anterior izquierdo de ratón Sgca-/-. Los días 20, 22, 25 y 27 después de la inyección, se inyectan 10 \muM de kifunensina o 20 \muM de MG132 en el músculo (es decir, 2 y 4 veces las concentraciones usadas in vitro para tener en cuenta la difusión en el músculo). Un día antes del sacrificio (día 27), los ratones se inyectan por vía intraperitoneal con azul de Evans. Los tibiales derecho e izquierdo se extraen y se congelan rápidamente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido.
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II) Resultados
1 - La forma mutada R77C del \alpha-sarcoglicano está ausente de la membrana en el ser humano
La presencia de la mutación R77C sobre el \alpha-sarcoglicano provoca la desestabilización del complejo de los sarcoglicanos en el ser humano, tal como se muestra mediante un marcado inmunohistoquímico con la ayuda de anticuerpos dirigidos contra las diferentes proteínas del complejo (Figura 1).
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2 - La presencia de una cisteína en posición 77 en el ratón no perturba el direccionamiento a la membrana del \alpha-sarcoglicano y no provoca ninguna manifestación patológica
Con el fin de estudiar este fenómeno de desestabilización, se ha realizado, mediante recombinación homóloga, un modelo animal (Sgca^{77C/77C}) que contiene una cisteína en posición 77. Se debe observar que la especie murina contiene en esta posición un residuo histidina en lugar de un residuo arginina. El análisis de los músculos de los ratones así obtenido mediante inmunohistoquímica con la ayuda de anticuerpos dirigidos contra las diferentes proteínas del complejo DGC ha mostrado que la presencia de la mutación no impide el direccionamiento del \alpha-sarcoglicano a la membrana ni la formación del complejo de los sarcoglicanos (Figura 2). Unos cortes de ratones normales y deficientes en \alpha-sarcoglicano (Sgca-/-, 8) han sido usados como control.
La histología de los músculos deltoides, psoas, gastrocnemio y cuádriceps procedentes del ratón Sgca^{77C/77C} de 3 a 6 meses de edad ha sido examinada mediante coloración con hematoxilina/eosina y comparada con la del ratón Sgca-/-. Mientras que estos últimos presentan unas señales distróficas severas, no se ha podido detectar ninguna anomalía a nivel de los músculos Sgca^{77C/77C} (Figura 3).
La ausencia de anomalías musculares se ha confirmado mediante un análisis funcional. Unos ratones Sgca^{77C/77C} han sido sometidos a un ejercicio que favorece las contracciones excéntricas y después han sido inyectados por vía intraperitoneal con un colorante que marca específicamente las células en necrosis, el azul de Evans. No se ha podido demostrar ninguna penetración del azul de Evans en los músculos de los ratones Sgca^{77C/77C} (Figura 4).
Con el fin de determinar si las diferencias observadas a nivel de las consecuencias de la presencia de un residuo de cisteína en posición 77 entre el ser humano y el ratón estaban relacionadas con la naturaleza de la proteína humana, se han realizado unos experimentos de transferencia de gen en el músculo de ratón deficiente en \alpha-sarcoglicano con la ayuda de un vector viral derivado del virus asociado al adenovirus (AAV) que contiene el gen humano del \alpha-sarcoglicano mutado en posición 77. El análisis de los músculos inyectados ha permitido demostrar que la forma mutada se localiza en la membrana aunque una parte sea retenida en el retículo, que se forma el complejo sarcoglicano y que corrige la patología (Figuras 5 y 6). Se debe observar en la figura 5 la acumulación perinuclear del \alpha-sarcoglicano en ciertas células.
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3 - La presencia de la mutación provoca una retención del \alpha-sarcoglicano y una degradación por el proteasoma
Se ha establecido un modelo celular que reproduce los fenómenos observados en el ser humano por transfección cuádruple de plásmidos que codifican para los diferentes sarcoglicanos. En este modelo, el complejo está correctamente formado en la membrana cuando el \alpha-sarcoglicano normal está cotransfectado con los otros tres sarcoglicanos, mientras que no se ha detectado en la membrana cuando el \alpha-sarcoglicano contiene la mutación R77C. Esto se ha podido demostrar mediante un marcado inmunohistoquímico con la ayuda de un anticuerpo dirigido contra la parte extracelular del \alpha-sarcoglicano sobre unas células no permeabilizadas (Figura 7).
Un co-marcado del \alpha-sarcoglicano con un marcador del retículo endoplásmico (calreticulum) sobre unas células permeabilizadas muestra que la proteína mutada está retenida en las vías de secreción (Figura 8).
Se ha postulado que el \alpha-sarcoglicano mutado sería reconocido como anormal por el sistema de control-calidad de las proteínas a nivel del retículo, y degradado secundariamente por el proteasoma. Esto se ha podido confirmar por el uso del inhibidor del proteasoma MG132 que permite restaurar el direccionamiento a la membrana (Figura 9).
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4 - El direccionamiento a la membrana está restaurado por la inhibición de la manosidasa I
El sistema de control-calidad del retículo permite la degradación de proteínas mal replegadas. La enzima manosidasa I desempeña una función importante en este proceso por medio de una modificación de cadenas de oligosacáridos de las proteínas glicosiladas, tales como los sarcoglicanos. En función de este dato y de los resultados, se ha podido postular que el uso de un inhibidor de esta enzima permitiría restaurar el direccionamiento a la membrana de la forma mutada de \alpha-sarcoglicano. Esta hipótesis ha sido demostrada sobre unas células transfectadas por cuadruplicado con una forma mutada de \alpha-sarcoglicano en el modelo celular tratado por kifunensina (Figura 10).
Las diferencias entre las especies humana y murina observadas anteriormente no permiten disponer de un modelo in vivo equivalente al ser humano. Sin embargo, una reducción de la retención parcial de la forma mutada en el retículo después de la transferencia de gen permitiría sugerir que la inhibición de la manosidasa I tendría un efecto beneficioso sobre el direccionamiento del \alpha-sarcoglicano. Con el fin de determinar si el uso del inhibidor podría ser eficaz in vivo, se ha inyectado este producto por vía intramuscular tres veces durante una semana en los músculos de ratones Sgca-/- que han sido previamente inyectados (15 días antes) por el vector AAV-SGCA77C. Las observaciones de los músculos inyectados y tratados muestran una ausencia casi total de los agregados, en particular la ausencia de acumulación perinuclear y por lo tanto valida la hipótesis de trabajo (Figura 11).
Se han observado unos resultados tan convincentes con la kifunensina sobre otras dos mutaciones puntuales que afectan a otras dos sub-unidades del complejo de los sarcoglicanos: mutación E262K contenida en la sub-unidad \delta (Fig. 13A) y mutación Q11E contenida en la sub-unidad \beta (Fig. 13B).
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5 - Restauración por la 1-desoximanojirimicina (dMJ)
Se han realizado unos experimentos similares a los llevados a cabo en presencia de kifunensina sobre la mutación R77C del \alpha-sarcoglicano en presencia de 1-desoximanojirimicina (dMJ), otro inhibidor conocido de las manosidasas de clase I. Los resultados aparecen en la figura 12A y muestran la eficacia de esta sustancia para restablecer el direccionamiento a la membrana de la forma mutada del \alpha-sarcoglicano (mutación R77C).
Además, unos experimentos similares han permitido validar la hipótesis de trabajo sobre otras mutaciones que afectan a otras sub-unidades del complejo de los sarcoglicanos: mutación E262K contenida en la sub-unidad \delta (Fig. 12B) y mutación Q11E contenida en la sub-unidad \beta (Fig. 12C).
En conclusión, se ha demostrado que la especie murina se diferencia de la especie humana en cuanto a la adopción de la forma de \alpha-sarcoglicano que contiene una cisteína en posición 77 y que esta forma mutada, cuando está localizada correctamente, es funcional y corrige la patología relacionada con la deficiencia en sarcoglicano. Se ha demostrado en un modelo celular que la inhibición de la manosidasa I impide la degradación de la forma mutada y su direccionamiento correcto a la membrana. El uso in vivo de este producto parece ejercer asimismo el mismo efecto.
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<120> MEDICAMENTOS PARA EL TRATAMIENTO DE LAS SARCOGLICANOPATÍAS
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<130> G143-B-23358 PCT
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<150> FR 06/53020
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<151> 18/07/2006
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<160> 8
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<170> PatentIn version 3.1
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Claims (10)

1. Uso de un inhibidor de las \alpha-manosidasas de clase I para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las sarcoglicanopatías.
2. Uso de un inhibidor según la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor es una molécula que posee una actividad inhibidora de las \alpha-manosidasas de clase I.
3. Uso de un inhibidor según la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto es la kifunensina o 1-desoximanojirimicina, ventajosamente la kifunensina.
4. Uso de un inhibidor según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la sarcoglicanopatía está relacionada con la mutación R77C en el \alpha-sarcoglicano humano.
5. Uso de un inhibidor según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la sarcoglicanopatía está relacionada con la mutación E262K en el \delta-sarcoglicano humano.
6. Uso de un inhibidor según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la sarcoglicanopatía está relacionada con la mutación Q11E en el \beta-sarcoglicano humano.
7. Procedimiento de evaluación in vitro de la eficacia de un inhibidor de las \alpha-manosidasas de clase I sobre las sarcoglicanopatías, que comprende las siguientes etapas:
-
co-transfectar en unas células los cuatro genes que codifican los sarcoglicanos (\gamma-, \alpha-, \beta- o \delta-), siendo uno de los genes portador de la mutación;
-
incubar durante varias horas en presencia de un inhibidor tal como se define en una de las reivindicaciones 1 a 3;
-
localizar el complejo de los sarcoglicanos.
8. Procedimiento de evaluación in vitro de la eficacia de un inhibidor según la reivindicación 7, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo en paralelo sobre unas células cotransfectadas por los genes no mutados que codifican los cuatro sarcoglicanos.
9. Procedimiento de evaluación in vitro de la eficacia de un inhibidor según la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo en paralelo sobre unas células incubadas en ausencia del inhibidor.
10. Procedimiento de evaluación in vitro de la eficacia de un inhibidor según una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la localización del complejo se realiza mediante marcado inmunohistoquímico.
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