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PT2041177E - Anticorpos com elevada afinidade para o receptor il-6 humano - Google Patents

Anticorpos com elevada afinidade para o receptor il-6 humano Download PDF

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PT2041177E
PT2041177E PT07777380T PT07777380T PT2041177E PT 2041177 E PT2041177 E PT 2041177E PT 07777380 T PT07777380 T PT 07777380T PT 07777380 T PT07777380 T PT 07777380T PT 2041177 E PT2041177 E PT 2041177E
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PT
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leu
Prior art date
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PT07777380T
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English (en)
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James P Fandl
Nicholas J Papadopoulos
Sean Stevens
Tammy T Huang
Joel H Martin
Jeanette L Fairhurst
Ashique Rafique
Eric Smith
Kevin J Pobursky
Gang Chen
Margaret Karow
Original Assignee
Regeneron Pharma
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Publication date
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Description

1
DESCRIÇÃO
"ANTICORPOS COM ELEVADA AFINIDADE PARA O RECEPTOR IL-6 HUMANO"
Descrição da Técnica Relacionada A interleuquina-6 (IL-6) é uma citoquina pleiotrópica produzida por células imunes e não imunes, que desempenha um papel crucial na regulação da reacção imunológica, nas reacções em fase aguda, e na hematopoiese. Ela liga-se a IL-6R (uma cadeia) solúvel e não solúvel ligado à membrana celular, formando um complexo binário, e este complexo é capaz de interactuar com gp30 ligado à membrana celular (cadeia β), induz a formação de um complexo de sinalização incluindo duas unidades de cada uma de entre IL-6, IL-6R, e gpl30.
Estão descritos anticorpos contra hIL-6R nas US 5.670.373, 5.795.965, 5.817.790, 6.410.691, e na EP 409.607 BI. Estão descritos métodos terapêuticos nas US 6.888.510 e 6.723.319.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Num primeiro aspecto, a invenção proporciona anticorpos humanos, preferivelmente anticorpos humanos 2 recombinantes, que se liguem especificamente ao receptor humano de interleuquina-6 (hIL-6R).
Estes anticorpos são caracterizados por se ligarem a hIL-6R com uma alta afinidade e uma cinética de dissociação lenta, e pela capacidade de neutralizar a actividade da IL-6. Os anticorpos podem ser de comprimento inteiro (por exemplo, um anticorpo igGl ou IgG4) ou podem incluir apenas uma porção que se ligue a um antigénio (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')2 ou scFv), e podem ser modificados para tornar mais eficaz a sua funcionalidade, por exemplo, para eliminar as funções efectivadoras residuais (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164: 1925-1933). Numa concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo ou um seu fragmento que se ligue a um antigénio, que se ligue ao receptor IL-6 (SEQ ID NO:l) com um valor de KD de cerca de 500 pM ou menos, tal como medido por ressonância de plasmão superficial. Numa concretização mais especifica, o anticorpo ou o fragmento que se ligue a um antigénio apresenta um valor de KD inferior a 300 pM, ou inferior a 200 pM, ou mesmo inferior a 100 pM. Em diversas concretizações, o anticorpo ou o fragmento que se ligue a um seu antigénio bloqueia a actividade de hIL-6 com um valor de IC50 de 250 pM ou menos, tal como medido num bioensaio com luciferase. Em concretizações mais especificas, o anticorpo ou o seu fragmento que se ligue a um antigénio exibe um valor de IC50 de 150 pM ou menos. 3
Em aspectos relacionados, o anticorpo ou o fragmento que se ligue a um antigénio da invenção liga-se a hIL-6R com uma afinidade pelo menos 2 vezes superior àquela com que se liga a IL-6R de macaco. Em concretizações mais preferidas, o anticorpo ou o fragmento que se ligue a um antigénio liga-se à proteína hIL-6R (SEQ ID N0:1) com uma afinidade que pode ir até cerca de 3 vezes à da sua ligação ao IL-6R de macaco (domínio extracelular de Macaca fascicularis que se mostra na SEQ ID NO:251).
Portanto, a invenção proporciona um anticorpo ou um seu fragmento que se ligue a um antigénio, que se liga especificamente a receptor humano de interleuquina-6 (hlL-6R) com um KD de 500 pM ou menos, tal como medido por ressonância de plasmão superficial, em que os DR da cadeia pesada e os CDR da cadeia leve incluam: (i) SEQ ID NO: 21, 23 e 25, respectivamente a título de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada, e SEQ ID NO: 29, 31 e 33, respectivamente a título de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve; ou (ii) SEQ ID NO: 149, 151 e 153, respectivamente a título de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada, e SEQ ID NO: 157, 159 e 161, respectivamente a título de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve. 4
Em concretizações específicas, o anticorpo ou o seu fragmento que se ligue a um antigénio incluem os pares 19/27 ou 147/155 de HCVR/LCVR.
Num segundo aspecto, a invenção proporciona moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam para um anticorpo ou um seu fragmento que se ligue a um antigénio, da invenção. Numa concretização, a molécula de ácido nucleico da invenção codifica para um anticorpo ou um seu fragmento que se liga a um antigénio, incluindo um HCVR tal como se descreveu acima. Em concretizações específicas, a molécula de ácido nucleico que codifica para o HCVR é a SEQ ID NO:18 ou 146. Num aspecto relacionado, a invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica para um LCVR tal como se descreveu acima. Em concretizações específicas, a molécula de ácido nucleico que codifica para o LCVR é a SEQ ID NO: 26 ou 154. A invenção inclui anticorpos anti-hIL-6R ou os seus fragmentos que se ligam a antigénios, possuindo um perfil de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, pode ser útil uma modificação para remover locais de glicosilação indesejáveis, ou um anticorpo a que falte uma espécie fucose numa cadeia de oligossacárido, por exemplo, para amentar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (veja-se Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). Noutras aplicações, pode fazer-se uma modificação de uma galactosilação para se modificar a citotoxicidade dependente do complemento (CDC). 5
Em aspectos adicionais, a invenção proporciona vectores de expressão recombinantes portadores das moléculas de ácido nucleico da invenção, e células hospedeiras nas quais tais vectores tenham sido introduzidos, bem como métodos de fabricar os anticorpos ou os fragmentos que se ligam a antigénios da invenção, obtidos cultivando as células hospedeiras da invenção. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica, preferivelmente a células hospedeira é uma célula de E. coli ou uma célula de mamífero, tal como uma célula CHO.
Num aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica incluindo um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se ligue a um antigénio, humano, que se ligue especificamente a hIL-6R, e um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico.
Em aspectos adicionais, a invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo que se ligue a um antigénio, tal como se definiu acima, para utilização na atenuação ou na inibição de uma doença ou de uma patologia mediada por IL-6, em que a doença ou a patologia mediada por IL-6 é a artrite, uma doença inflamatória dos intestinos, ou o lúpus eritematoso sistémico. A patologia é portanto seleccionada de entre a artrite, incluindo a artrite reumatóide crónica, uma doença inflamatória dos 6 intestinos, incluindo a doença de Crohn e a colite ulcerosa, ou é o lúpus eritematoso sistémico.
Em aspectos adicionais, a invenção proporciona a utilização de um anticorpo ou de um fragmento de um anticorpo tal como se definiu acima, no fabrico de um medicamento para utilização para atenuar ou inibir uma doença ou uma patologia mediada por IL-6 num ser humano, em que a doença ou a patologia mediada por IL-6 é a artrite, uma doença inflamatória dos intestinos ou o lúpus eritematoso sistémico.
Outros objectos e vantagens tornar-se-ão aparentes lendo a descrição pormenorizada que se segue.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA
Antes de se descreverem os métodos presentes, tem que se entender que esta invenção não se limita aos métodos específicos e às condições experimentais descritas, uma vez que estes métodos e condições podem variar. Deve também entender-se que a terminologia utilizada neste documento se destina a descrever apenas concretizações específicas, e não pretende ser limitativa, uma vez que o âmbito da invenção presente será apenas limitado pelas reivindicações apensas. A não ser aonde de definir algo em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste 7 documento têm o mesmo significado que é habitualmente compreendido por indivíduos com conhecimentos médios da técnica à qual esta invenção pertence. Embora se possam utilizar quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos que se descrevem neste documento na prática ou para testar a invenção presente, os métodos e os materiais preferidos são descritos em seguida. 0 termo "IL6R humano" (ou hlL-6R), tal como se utiliza neste documento, pretende referir-se a um receptor de citoquinas humano que se liga especificamente à interleuquina-6 (IL-6). 0 domínio extracelular de hIL-6R é representado pela SEQ ID N0:1. 0 termo "anticorpo", tal como se utiliza neste documento, pretende referir-se a moléculas de imunoglobulina incluindo quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) ligadas entre si por ligações dissulfureto. Cada cadeia pesada inclui uma região variável da cadeia pesada (que se abrevia neste documento como HCVR ou como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada inclui três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve inclui uma região variável da cadeia leve (abreviada neste documento como LCVR ou como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve inclui um domínio (CL1) . As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes complementares (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões quadro (FR) . Cada VH e VL é constituída por três CDR e quatro FR, dispostas do terminal amino para o terminal carboxilo pela seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 0 termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de um anticorpo" ou "fragmento de um anticorpo"), tal como se utiliza neste documento, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de se ligarem especificamente a um antigénio (por exemplo, hIL-6R). Foi demonstrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser levada a cabo por fragmentos de um anticorpo de comprimento inteiro. Incluem-se nos exemplos de ligação fragmentos de um anticorpo aos quais se refere o termo "porção de ligação a um antigénio" (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente constituído pelos domínios VL, VH, CL1 e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2 / fragmento bivalente incluindo dois fragmento Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região da charneira; (iii) um fragmento Fd constituído pelos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv constituído pelos domínios VL e VH de um único braço do anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546), que consiste num domínio VH; e (vi) uma região determinante complementar isolada (CDR). Além disto, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser juntos, utilizando métodos recombinantes, por um agente de 9 ligação sintético que permite que sejam transformadas numa única cadeia continua na qual as regiões VL e VH se emparelham para formarem moléculas monovalentes (denominada Fv de cadeia única (scFv); veja-se, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883). Também se pretende que estes anticorpos de cadeia singela estejam incluídos no termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia singela, tais como os diacorpos, também estão incluídas (veja-se por exemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sei. USA 90: 6444-6448).
Um anticorpo "neutralizante" ou "bloqueante", tal como se utiliza neste documento, pretende referir um anticorpo de cuja ligação a hIL-6R resulte a inibição da actividade biológica de hIL-6. Esta inibição da actividade biológica de hIL-6 pode ser avaliada determinando quantitativamente um ou mais indicadores da actividade biológica de hIL-6 conhecidos na técnica, tais como a activação celular induzida por hIL-6 e a ligação de hIL-6 a hIL-6R (vejam-se exemplos adiante).
Uma "COR", ou região determinante complementar, é uma região com hipervariabilidade intercalada entre regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões quadro" (FR). Em diferentes concretizações do anticorpo anti-hIL-6R ou do seu fragmento, da invenção, as FR podem ser idênticas às sequências da linha gérmen humana, ou elas podem ser 10 natural ou artificialmente modificadas. Pode definir-se um grupo de CDR como sendo uma sequência de aminoácidos de consenso. O termo "ressonância de plasmão superficial", tal como se utiliza neste documento, refere-se a um fenómeno óptico que permite a análise de interacções em tempo real por detecção de alterações nas concentrações em proteína adentro de uma matriz bio-sensora, por exemplo utilizando o sistema BIAcore™ (Pharmacia Biosensor AB). O termo "epítopo" é um determinante biogénico que interactua com um local específico de ligação de um antigénio na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como um parátopo. Um determinado antigénio pode apresentar mais do que um epítopo. Os epítopos podem ser quer conformacionais, quer lineares. um epítopo conformacional provém de aminoácidos provenientes de diferentes segmentos da cadeia polipeptídica linear, que se encontram espacialmente justapostos. Um epítopo linear é um que resulte de resíduos de aminoácido adjacentes numa cadeia polipeptídica. Em determinadas circunstâncias, um epítopo pode incluir espécies polisacarídicas, grupos fosforilo, ou grupos sufonilo no antigénio. O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se refere a um ácido nucleico ou a um seu fragmento, indica que, quando alinhados de forma óptima com as inserções ou supressões de 11 nucleótidos que forem apropriadas, com outro ácido nucleico (ou com a sua cadeia complementar) , existe uma identidade entre sequências de nucleótidos em pelo menos cerca de 95 %, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96 %, 97 %. 98 % ou 99 % das bases nucleotidicas, tal como determinada por qualquer sistema bem conhecido de algoritmo de identidade de sequência, tal como o FASTA, o BLAST ou o Gap, tal como se descreve adiante.
Tal como se aplica aos polipéptidos, o termo "semelhança substancial" ou "substancialmente semelhante" significa que duas sequências peptidicas, quando alinhadas de forma óptima, tal como através dos programas GAP ou BESTFIT utilizando os pesos dos hiatos definidos por defeito, partilham pelo menos 95 % de indentidade de sequências, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 % ou 99 % de identidade de sequências. Preferivelmente, os resíduos em posições em que não são idênticos, diferem por substituições conservadoras dos aminoácidos. Uma "substituição conservadora de aminoácido" é aquela em que um resíduo de aminoácido seja substituído por outro resíduo de aminoácido que tenha uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição conservadora de aminoácido não altera substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos caos em que duas ou mais sequências de aminoácidos difiram umas das outras por substituições conservadoras, pode ajustar-se para cima a percentagem a identidade de sequências ou o grau de 12 semelhança, para introduzir uma correcção devida ao grau de semelhança da substituição. As maneiras de se fazer este ajustamento são bem conhecidas dos especialistas da técnica. Veja-se, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Incluem-se nos exemplos dos grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais semelhantes nas suas propriedades químicas 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifáticas com grupo hidroxilo: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo a função amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina, e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e 7) cadeias laterais contendo enxofre são a cisteína, a cistina e a metionina. Os grupos de substituições conservadoras de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina. Em alternativa, uma substituição conservadora é qualquer substituição que a presente um valor positivo na matriz de semelhança logarítmica PAM250 descrita em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. Uma substituição "moderadamente conservadora" é qualquer substituição com um valor não negativo na matriz de semelhança logarítmica PAM250. A semelhança de sequências para cadeias de polipéptidos, que também é referida como semelhança de sequências entre cadeias de polipéptidos, que também é 13 referida como identidade de sequências, é tipicamente medida utilizando programas de análise de sequências, os programas de análise de proteínas emparelham sequências semelhantes utilizando medidas de semelhança atribuídas a diversas substituições, excisões e outras modificações, incluindo substituições conservadoras de aminoácidos. Por exemplo, o programa GCG contém programas tais como o Gap e o Bestfit que se podem utilizar com parâmetros definidos por defeito para se determinarem homologias entre sequências ou identidades de sequências, entre polipéptidos bastante parecidos, tais como os polipéptidos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma sua muteína. Veja-se, por exemplo, a Versão 6.1 do GCG. Também se podem comparar sequências de proteínas utilizando o FASTA com parâmetros definidos por defeito ou recomendados, um programa na Versão 6.1 do GCG. 0 FASTA (por exemplo, o FASTA2 e o FASTA3) proporciona alinhamentos e percentagens de identidade de sequências das regiões com melhor sobreposição entre as sequências a classificar e as integradas na base de dados de pesquisa (Pearson (2000), acima). outro algoritmo preferido quando se compara uma sequência da invenção com uma base de dados contendo um grande número de sequências provenientes de diferentes organismos, é o programa de computador BLAST, em particular o blastp ou o tblastn, utilizando os parâmetros definidos por defeito. Veja-se, por exemplo, Altschul et ai. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-02. 14
Preparação de Anticorpos Humanos
Incluem-se nos métodos para se gerarem anticorpos humanos, por exemplo, o Velocimmune™ (Regeneron Pharmaceuticals), a tecnologia XenoMouse™ (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21; Abgenix), a aproximação do "mini-local", e a exibição de fagos (e veja-se, por exemplo, a US 5.545.807, a US 6.787.637). A tecnologia Velocimmune™ (US 6.596.541) inclui um método de se gerar um anticorpo completamente humano com elevada especificidade, contra um determinado antigénio. Esta tecnologia envolve gerar-se um murganho transgénico cujo genoma inclua regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada humanas, operacionalmente ligadas a locais endógenos da região constante de murganho, de tal forma que o murganho produza um anticorpo que inclua uma região variável humana e uma região constante de murganho, em resposta a uma estimulação com um antigénio. Isolam-se os ADN codificando para as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo, e ligam-se operacionalmente ao ADN que codifica para as regiões constantes das cadeias pesada e leve humanas. Expressa-se então o ADN numa célula capaz de expressar o anticorpo humano completo. Numa concretização especifica, a célula é uma célula CHO.
Os anticorpos podem ser úteis do ponto de vista terapêutico ao bloquearem uma interacção ligando-receptor ou ao inibirem uma reacção de uma componente do receptor, em vez de matarem células através da fixação do 15 complemento, em vez de matarem células através da fixação do complemento (citotoxicidade dependente do complemento)(CDC) e por participação na citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada pelas células (ADCC). A região constante de um anticorpo é importante na capacidade de um anticorpo para fixar complemento e para mediar a citotoxidade mediada dependente de células. Deste modo, o isotipo de um anticorpo pode ser seleccionado com base em ser desejável que o anticorpo medeie a citotoxicidade.
As imunoglobulinas humanas podem existir em duas formas que estão associadas à heterogeneidade da charneira. Numa forma, uma molécula de imunoglobulina inclui uma construção estável com quatro cadeias e uma massa de cerca de 150-160 kDa na qual os dimeros são mantidos em conjunto por uma ligação dissulfureto entre as cadeias pesadas, numa segunda forma, os dimeros não se ligam por ligações dissulfureto entre cadeias e forma-se uma molécula com cerca de 75-8 0 kDa composta por uma cadeia leve e uma cadeia pesada ligadas covalentemente (meio-anticorpo). Estas formas foram extremamente difíceis de separar, mesmo depois de uma purificação por afinidade. A frequência com que aparece a segunda forma em diversos isotipos de IgG intactos é devida a, mas não se limita a, diferenças estruturais associadas com o isotipo do anticorpo na região da charneira. De facto, uma única substituição e aminoácido na região da charneira de IgG4 humana pode diminuir significativamente a frequência de aparecimento da segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30: 105) 16 até níveis tipicamente observados utilizando uma charneira de IgGl humano. A invenção presente inclui anticorpos contendo uma ou mais mutações na charneira, na região CH2 ou na CH3, que possam ser desejáveis, por exemplo, na produção, para aumentar o rendimento na forma de anticorpo que se pretenda.
Os anticorpos da invenção são preferivelmente preparados utilizando a tecnologia Velocimmune™. Provoca-se um murganho transgénico no qual as regiões variáveis das cadeias pesada e leve da imunoglobulina endógena foram substituídas pelas regiões humanas comparáveis, com o antigénio que interessa, e recuperam-se as células linfáticas (tais como as células B) dos murganhos que expressam anticorpos. Podem fundir-se as células linfáticas com uma linha de células de mieloma para se prepararem linhas de células imortais de hibridoma, e despistam-se essas linhas de células de hibridoma e seleccionam-se para se identificarem linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos contra o antigénio que interessa. Pode isolar-se o AND que codifica para as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, e ligar-se a regiões constantes isotípicas da cadeia pesada e da cadeia leve. Uma tal proteína de anticorpo pode ser produzida numa célula, tal como uma célula CHO. Em alternativa, pode isolar-se directamente o AND que codifica para os anticorpos quiméricos específicos para o antigénio ou para os domínios variáveis das cadeia leve e pesada, a partir dos linfócitos específicos contra o antigénio. 17
Numa concretização, o murganho transgénico inclui até 18 genes funcionais da cadeia pesada variável humana e 12 genes funcionais da cadeia leve variável kappa humana. Noutra concretização, o murganho transgénico inclui até 39 genes da cadeia pesada variável humana e 30 genes da cadeia leve variável kappa humana. Noutra concretização ainda, o murganho transgénico inclui até 80 genes funcionais da cadeia pesada variável humana e 40 genes funcionais da cadeia leve variável kappa humana.
Em geral, os anticorpos da invenção presente possuem afinidades muito grandes, apresentando tipicamente valores de KD de entre cerca de 1CT9 e cerca de 1CT12 M, quando medidos através da ligação a antigénio, quer imobilizado sobre uma fase sólida, quer em fase de solução.
Inicialmente, isolam-se anticorpos quiméricos com elevadas afinidades contendo uma região variável humana e uma região constante de murganho. Tal como se descreve adiante, os anticorpos são caracterizados e seleccionados de acordo com caracteristicas desejáveis, incluindo a sua afinidade na ligação a hIL-6R, a sua capacidade de bloquear hIL-6, e/ou a sua selectividade para a proteína humana. Substituem-se as regiões constantes de murganho por uma região constante humana pretendida para se gerar o anticorpo completamente humano da invenção, por exemplo IgG4 ou IgGl de tipo selvagem ou modificados (por exemplo, SEQ id NO:242, 243, 244). Enquanto a região constante pode 18 variar de acordo com a utilização especifica, a ligação a antigénio com elevada afinidade e as caracteristicas da especificidade para o alvo residem na região variável.
Mapeamento de Epítopos e Tecnologias Relacionadas
Para se proceder ao despiste de anticorpos que se ligam a um determinado epítopo, pode levar-se a cabo um ensaio de rotina de bloqueio cruzado, tal como o descrito em Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow e Lane, editores. Incluem-se em outros métodos o despiste de mutantes de alanina, de manchas de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63) , ou a análise de clivagem de péptidos tal como se descreve nos exemplos adiante. Além disto, podem empregar-se métodos tais como o da excisão de epítopos, de extracção de epítopos e a modificação química de antigénios (Tomer (2000), Protein Science: 9: 487-496). A Perfilagem Assistida por Modificação (MAP), também denominada Perfilagem de Anticorpos com base na Estrutura de Antigénios (ASAP) é um método pelo qual se atribuem categorias a grandes números de anticorpos monoclonais (mAb) dirigidos contra o mesmo antigénio consoante as semelhanças dos perfis de ligação de cada anticorpo a superfícies de antigénios modificadas química ou enzimaticamente (Publicação de Pedido de Patente US No. 2004/0.101.920). Cada categoria poderá reflectir um epítopo único, quer distintamente diferente de, quer sobrepondo-se 19 parcialmente a, um epitopo representado por outra categoria. Esta tecnologia permite filtrar rapidamente anticorpos geneticamente idênticos, permitindo que a caracterização possa ser focada em anticorpos geneticamente distintos. Quando aplicada ao despiste de hibridomas, a MAP pode facilitar a identificação de clones raros de hibridoma com as características pretendidas. Pode utilizar-se a MAP para classificar os anticorpos hIL-6R da invenção em grupos de anticorpos que se ligam a diferentes epitopos.
Os enzimas são agentes úteis para alterar a estrutura do antigénio imobilizado, usando-se, por exemplo, enzimas proteolíticos e agentes químicos. Pode imobilizar-se a proteína do antigénio quer em superfícies de bio-sensores em chips, quer em pérolas de poliestireno, estas últimas podem ser processadas com, por exemplo, um ensaio tal como um ensaio de detecção multiplex Luminex™ (Luminex Corp., TX) . Atenta a capacidade do Luminex™ para levar a cabo análise multiplex com até 100 tipos diferentes de pérolas, o Luminex™ proporciona um número quase ilimitado de superfícies de antigénios com diversas modificações, proporcionando uma resolução melhorada na determinação do perfil de epitopos de anticorpos, em comparação com um ensaio sobre um bio-sensor.
Administração Terapêutica e Formulações A administração de entidades terapêuticas consoante a invenção será feita em conjunto com veículos, 20 excipientes, e outros agentes apropriados, que se incorporam em formulações para proporcionarem uma melhor transferência, veiculação, tolerância, e outras caracteristicas semelhantes. No formulário que todos os químicos farmacêuticos conhecem pode encontrar-se uma multidão de formulações: Remington's Pharmaceutical Sciences (15a edição, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1975) , em especial no Capítulo 87, por Blaug, Seymour, nele incluído. Incluem-se nestas formulações, por exemplo, pós, pastas, unguentos, geleias, ceras, óleos, lipidos, vesículas (tais como Lipofectin™) contendo lipidos (catiónicos ou aniónicos), conjugados de ADN, pastas anidras para absorção, emulsões de água em óleo e de óleo em água, emulsões carbowax (polietilenoglicóis com diversas massas moleculares), geles semi-sólidos, e misturas semi-sólidas contendo carbowax. Qualquer das misturas anteriores pode ser apropriada em tratamentos e terapias consoante a invenção presente, desde que o ingrediente activo na formulação não tenha sido inactivado pela formulação, e que a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável pela via de administração seleccionada. Veja-se também Powell et al. PDA (1998) J. Pharm. Sei. Technol. 52: 238-311, e as citações aí incluídas para se obter informação adicional relacionada com excipientes e veículos bem conhecidos pelos químicos farmacêuticos.
EXEMPLOS 21
Os exemplos que se seguem estão incluídos para proporcionar aos indivíduos com conhecimentos médios da técnica uma revelação e uma descrição completa de como levar a cabo e utilizar os métodos e as composições da invenção, e não se pretende que limitem o âmbito de quanto os inventores consideram ser a sua invenção. Foram feitos esforços para assegurar rigor no que toca aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas deve considerar-se existirem sempre alguns erros e desvios experimentais. A não ser quando se indicar algo em contrário, as partes são partes em massa, a massa molecular é a massa molecular média, a temperatura é em graus Centígrados, e a pressão é a atmosférica ou próxima desta.
Exemplo 1. Geração de Anticorpos Humanos Contra o Receptor IL—6 Humano.
Podem imunizar-se roedores por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, Harlow e Lane (1988), acima; Malik e Lillehoj, Antibody techniques: Academic Press, 1994, CA). Numa concretização preferida, administra-se o antigénio hIL-6R directamente a murganhos que contenham locais de ADN que codificam tanto para a região variável da cadeia pesada de Ig humano, como para a região variável da cadeia leve Kappa (Velocimmune™, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; US 6.596.541), com um adjuvante para estimular a reacção imunológica. Incluem-se num tal adjuvante, adjuvante de Freund completo e incompleto, sistema adjuvante MPL+TDM (Sigma), ou RIBI 22 (dipéptidos com muramilo) (veja-se 0'Hagan, Vaccine
Adjuvant, pela Human Press, 2000, NJ) . Um tal adjuvante pode evitar a dispersão rápida de polipéptido por sequestrar o antigénio num depósito local, e pode conter factores que podem estimular a reacção imunológica do hospedeiro. numa concretização, administra-se hIL-6R indirectamente sob a forma de um plasmideo de ADN que contém o gene de hIL-6R e expressa o hIL-6R utilizando a maquinaria do hospedeiro para expressão celular de proteínas, para produzir o polipéptido antigénico ín vivo. Em ambos os métodos, o regime de imunização obriga a diversas administrações a intervalos de poucas semanas. Monitoriza-se a resposta imunológica com anticorpos por imunoensaio especifico para o antigénio, como habitualmente. Quando os animais atingem a sua reacção imunológica máxima, recolhem-se as células B que expressam os anticorpos e fundem-se com células de mieloma de murganho para conservar a sua viabilidade, formando-se células hibridoma. Para se seleccionarem os anticorpos monoclonais funcionalmente pretendidos, despistam-se os meios acondicionados das células hibridoma, ou células transfectadas, quanto à especificidade, afinidade de ligação ao antigénio, e potência no bloqueio da ligação de hIL-6 a hIL-6R (descrito adiante).
Exemplo 2. Anticorpos Anti-hIL6R gerados por isolamento directo de células do baço 23
Pode isolar-se directamente ADN codificando para os domínios VH e VL a partir de uma única célula B positiva para o antigénio. Em suma, sacrificou-se o murganho transgénico imunizado com hIL-6Ra e recolheram-se os esplenócitos. Removeram-se as células vermelhas do sangue por lise seguida de uma peletização dos esplenócitos recolhidos. Voltaram a suspender-se os esplenócitos gue se incubaram primeiro com uma mistura de IgG, FITC-anti-mFc, e biotin-IL6Ra humanos, durante 1 hora. Lavaram-se as células contrastadas por duas vezes com PBS, e depois contrastaram-se com uma mistura de IgG, APC-anti-mlgM, e SA-PE humanos e de rato, durante uma hora. Lavaram-se as células contrastadas uma vez com PBS e analisaram-se por citometria de fluxo num MoFlo (Cytomation). Separaram-se cada uma das células B positivas para IgG, negativas para IgM, e positivas para o antigénio, e plaguearam-se em poços separados de uma placa de 96 poços. Levou-se a cabo uma RT-PCR dos genes de anticorpos destas células B seguindo um método descrito por Wang et al. (2000) (J. Immunol. Methods 244: 217-225). Em suma, sintetizaram-se por RT-PCR cADN de cada uma das células B. Cada produto de RT obtido foi então dividido e transferido para dois poços correspondentes em duas placas de 96 poços. Um conjunto de produtos de RT resultantes foi em primeiro lugar amplificado por PCR utilizando um iniciador 5' degenerado específico para a seguência líder da região variável da cadeia pesada do IgG humano, e com um iniciador 3' degenerado específico para a região constante da cadeia pesada de murganho, para se formar um amplicão. Amplificou-se então o amplicão mais uma 24 vez por PCR utilizando um iniciador 5' degenerado especifico para o quadro 1 da região variável da cadeia pesada de IgG humano e um iniciador 3' aninhado, especifico para a região constante da cadeia pesada de murganho. 0 outro conjunto resultante de produtos de RT foi em primeiro lugar amplificada por PCR utilizando um iniciador 5' degenerado especifico para a sequência líder da região variável da cadeia leve kappa humana e com um iniciador 3' específico para a região constante da cadeia leva kappa de murganho, para formar um amplicão. Amplificou-se então de novo este amplicão por PCR utilizando um iniciador 5' degenerado específico para o quadro 1 da sequência da região variável da cadeia leve kappa humana e um iniciador 3' aninhado específico para a região constante da cadeia leve kappa de murganho. Clonaram-se os produtos de PCR da cadeia leve e da cadeia pesada em vectores de anticorpo linearizados Sap I contendo, respectivamente, a região constante da cadeia pesada de IgGl e a região constante da cadeia leve kappa. 0 plasmídeo de cadeia pesada tem um local Iox2272 e um local Iox511 flanqueando as regiões de expressão da cadeia pesada. Além disto, imediatamente a jusante do local Iox2272 no plasmídeo da cadeia pesada existe um gene de resistência à higromicina ao qual falta um promotor e um ATG de iniciação. 0 gene de resistência à higromicina está também transcricionalmente ligado a jusante a um gene eGFP através de uma sequência IRES. 0 plasmídeo da cadeia leve tem um local IoxP e um local Iox2272 flanqueando a região de expressão da cadeia leve. Além disto, o plasmídeo da cadeia leve tem um promotor SV40 25 imediatamente antes de um ATG no local Iox2272, de tal modo que à integração numa célula hospedeira apropriada o promotor SV40 próximo do local Iox2272 e o ATG de iniciação do plasmideo da cadeia leve ficam adjacentes ao gene de resistência à higromicina do plasmideo da cadeia pesada no quadro de leitura adequado para permitir a transcrição e a tradução dos genes de resistência à hidromicina e eGFP. Combinaram-se e transfectaram-se os plasmideos recombinantes purificados com uma sequência da região variável da cadeia pesada e os plasmideos com uma sequência da região variável da cadeia leve da mesma célula B, em conjunto com um plasmideo expressando a recombinase Cre, numa linha de células hospedeiras CHO. A linha de células hospedeiras CHO modificadas contém, de 5' para 3', um local IoxP, em eCFP, um local Iox2272, DsRed, e um local Iox511 no local transcricionalmente activo. Em consequência, a célula hospedeira CHO pode ser isolada por citometria de fluxo como uma célula positiva a azul, positiva a vermelho, e negativa a verde. Quando se transfectam plasmideos recombinantes expressando genes da cadeia leve e da cadeia pesada, em conjunto com um plasmideo expressando a recombinase Cre, uma recombinação especifica para um local mediada pela recombinase Cre origina a integração dos plasmideos do anticorpo no local cromossómico que contém os locais Iox e a substituição dos genes eCFP e DsRed. Podem isolar-se então os recombinantes por citometria de fluxo como células negativas a azul, negativas a encarnado e positivas a verde. Deste modo, separaram-se por citometria de fluxo as células CHO transfectadas com plasmideos 26 recombinantes contendo uma sequência da região variável da cadeia pesada e os plasmídeos contendo uma sequência da região variável da cadeia leve provenientes de uma mesma célula B, e isolaram-se os recombinantes adequados demonstrando fenótipo adequado negativo a azul, negativo a vermelho e positivo a verde, e estabeleceram-se as linhas de células CHO recombinantes e estáveis expressando o anticorpo, a partir de clones isolados.
Exemplo 3. Determinação da Afinidade da Ligação a
Antigénio
Determinaram-se os valores de KD da ligação do antigénio aos anticorpos seleccionados descritos acima, por cinética de superfície, num ensaio em tempo real num bio-sensor por um ensaio de ressonância de plasmão superficial (BIAcore™). Mais especificamente, mediu-se a afinidade dos anticorpos para o IL-6R humano utilizando um BIAcore® 2000 ou um BIAcore® 3000. Capturou-se o anticorpo sobre uma superfície de IgG anti-murganho e expôs-se a diversas concentrações de proteína hIL-6R recombinante quer sob a sua forma monomérica, quer sob a dimérica. Levou-se a cabo uma análise cinética recorrendo a um programa BIAevaluation™ para se obterem as constantes de velocidade de associação e de dissociação.
Também se mediram as afinidades de ligação dos anticorpos ao hlL-6R quer para meios condicionados a hibridoma, quer para proteínas purificadas, por imunoensaio 27 de competição baseado em placas. As proteínas de anticorpos foram purificadas utilizando cromatografia de afinidade para a Proteína G do meio de acondicionamento das células hibridoma que era isento de IgG de bovino (Invitrogen). Para o ELISA em competição, em suma, fizeram-se misturas de quantidades constantes de anticorpo a diferentes níveis com diluições em série de proteína de antigénio, hIL-6R-hFc, na gama de entre 0 e 10 pg/mL, e incubou-se durante duas horas à temperatura ambiente para se atingir um pseudo-equilíbrio de ligação entre o anticorpo e o antigénio. Transferiram-se então estas soluções para placas de 96 poços previamente revestidas com hIL-6R-hFc, para permitir que o anticorpo livre presente nas misturas se ligasse a hIL-6R-hFc do revestimento da placa. Revestiram-se tipicamente as placas com 1 a 2 pg/mL de proteína hIL-6R-hFc dissolvida em PBS de um dia para o outro a 4°C, seguindo-se um bloqueio não específico com BSA. Depois de se arrastar por lavagem o excesso de anticorpo em solução, detectaram-se os anticorpos ligados à placa usando um reagente policlonal para anticorpos conjugado com HRP, de cabra contra IgG ou IgA de murganho, e desenvolveu-se utilizando substratos, quer colorimétricos, quer para luminescência. Analisou-se a forma da dependência dos sinais face às concentrações de antigénio em solução com uma curva com 4 parâmetros utilizando um programa Prism" (Graph Pad) e registou-se sob a forma de IC50. Também se levaram a cabo imunoensaios de competição utilizando um instrumento de fase de solução em estado estacionário Kinexa™ (Sapidyne Inc.). 28
Mostram-se os resultados na Tabela 1 (controlo: anticorpo monoclonal humanizado contra IL-6R humano (Patente U.S. No. 5.817.790, SEQ ID NO: 69 e 71). Anticorpo (sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR) : VQSA9-6 (3, 11); VQ8F11-21 (19, 27); W7G4-1 (35, 43); W7G4-10 (51, 59) W6C10-1 (67, 75); W6C10-3 (83, 91); W6C10-4 (99, 107); W6F12-11 (115, 123); W9A6-11 (131, 139); W6A9-5 (147, 155), W3D8-4 (163, 171); W1G4-7 (179, 187); 248982-13-1- E5 (195, 203); 248982-13-2-A9 (211, 219). KD de monómero e dimero determinados por BIAcore™; KD em solução com Kinexa™; IC50 por ensaios ELISA (n.d. = não determinado).
Tabela 1. Afinidade de Ligação a Antigénio
Anticorpo Rd do KD do KD do ELISA IC50 (Monómero iDimero Monómero em (do Dimero ((nM) (nM solução (nM) s(nM) VQ8A9-6 \ 0,222 1 0,101 0,120 | 0,004 VQ8F11-21 l 0,0 67 ! 0,023 1 0,009 | 0,008 W3D8-4 \ 2,410 I 0,172 I 1,910 | 0,013 W6A9-5 0, 097 | 0,146 1 0,032 1 0,005 W1G4-7 \ 0,225 1 0,07 0 1 0,197 0,041 W6C10-1 | 0,2 67 1 0,032 I 2,050 | 0,010 W6F12-11 l n.d. n.d. | n.d. | 0,033 ÍW7G4.10 | n.d. J n.d. 1 1,980 (W9A6-11 ij n.d. n.d. 1 n.d. 1 0,347 (W6C10-3 ij n.d. n.d. 1 n.d. | 0,009 (248982-13- 0,987 1 0,785 1 n.d. | 0,360 1-E5 248982-13- \ 2,870 n.d. 1 n.d. 1 0,054 29
Anticorpo KD do: KD do:;KD doiELISA IC5o
Monómero iDímero Monómero emfdo Dímero (nM) :: (nM solução (nM)i(nM) I2-A9 1 Controlo !, 790 n.d. 1,960 n.d.
Exemplo 4. Neutralização da Actividade de hIL-6
Despistaram-se os bloqueios de actividades do hIL-6 por parte dos anticorpos anti-hIL-6R da invenção, por imunoensaios de bloqueio de hIL-6, por bioensaios in vitro de crescimento células dependente de hIL-6, e por ressonância de plasmão superficial (BIAcore™). 0 imunoensaio foi utilizado para despistas a capacidade do anticorpo em teste para bloquear a ligação do hIL-6 ao hlL-6R, e o bioensaio in vitro foi utilizado para determinar a potência dos anticorpos para neutralizar a transdução de sinais celulares mediada por hIL-6R.
Para o imunoensaio, revestiu-se com proteína de hIL-6 recombinante em tampão PBS uma placa de 96 poços, de um dia para o outro a 4°C. Utilizou-se esta placa para capturar hIL-6R-hFc livre de soluções de amostras de anticorpos, e quantificou-se o hIL-6R-hFc capturado de acordo com a curva padrão. As soluções de amostra eram constituídas por uma quantidade constante de proteína recombinante hIL-6R-hFc (100 pM) e quantidades variáveis de anticorpo, quer em meio bruto de condicionamento de hibridoma, quer como proteína de anticorpo purificada, na 30 gama de entre 0 e cerca de 50 nM, numa série de diluições. Incubaram-se as misturas de anticorpo com antigénio à temperatura ambiente durante 2 horas para se permitir que se atingisse o equilíbrio no estabelecimento das ligações entre anticorpo e antigénio. Transferiram-se então as soluções de amostra equilibradas para as placas revestidas com hIL-6 para se medir a quantidade de hIL-6R-hFc livre. Passada 1 hora de ligação, lavou-se a placa e detectou-se o hIL-6R-hFc ligado utilizando anticorpos policlonais de cabra anti-hFc conjugados com HRP (Jackson Immuno Research), e desenvolveram-se utilizando substrato TMB (BD Pharmigen) . Determinaram-se os valores de IC5o sob a forma de quantidades de anticorpo necessárias para diminuir em 50 % o IL-6R-hFc detectável ao ligando hIL ligado à placa. Mostram-se os resultados na primeira coluna da Tabela 2.
Além disto, determinou-se a capacidade do anticorpo em teste para bloquear a ligação de hIL-6 ao receptor hIL-6R utilizando ressonância de plasmão superficial. Capturaram-se moléculas de antigénio hIL-6R-hFc com anticorpos policlonais IgG de cabra anti-humanos imobilizados sobre uma superfície CM-5 através de acoplamento com aminas a uma densidade de 250 RU. Injectou-se uma solução de hIL-6 (0,25 mL, 50 nM) sobre a superfície do receptor e registou-se o hIL-6 ligado (primeira injecção de IL-6). Removeu-se então o hIL-6 ligado com um pulso de MgCl2 3 M, seguindo-se um tampão de condicionamento. Injectou-se anticorpo Anti-hIL6R em meio condicionado par hibridoma sobre a superfície com o receptor capturado e em 31 seguida aplicou-se uma segunda injecção de hIL-6. A percentagem de redução da ligação de hL-6 que resulta do complexo previamente formado entre anticorpo e receptor foi utilizada como classificação para definir os bloqueadores de hIL-6, em relação aos não bloqueadores (segunda coluna da Tabela 2).
Tabela 2. Neutralização da Ligação a hlL-6
Anticorpo; IC50 (nM) para a Inibição da ; Ligação hIL6R/hIL6 j Inibição da Ligação i hIL6R/hIL6 (%) : ( ; IC50 (nM) para I a Inibição da j Proliferação ide células XG-1 :IC50 (nM) para;; a Actividade ii de Luciferase;; HepG2/Stat3 | VQaA9-6 i VQ8F11-21i 0,39 0,12 68 98 0,40 0,62 0,097 0,135 Ϊ W3D8-4 i 0,61 93 >100 n.d. W6A9-5! 0,35 100 1,10 0,188 1 W1G4-7 i 1,10 34 1,80 0,57 8 ii ::::::::::: :·::.........:: vSvivi^^ W6C10-1 i 4,60 61 V Ολ to o n.d. vavavavav: avavavavavívívavavavavavava ! W6F12-11 i 2,20 n. d. n. d. n.d. W7G4-10 ! _ ,:: . . . .. n.d. W9A6-11 j 0,50 n. d. n. d. n.d. W6C10-3 i O O <y\ n. d. n.d. ! Controlo j 2,20 91 1,50 0,854 ii
Determinou-se a capacidade dos anticorpos hIL-6R para bloquearem a actividade de hIL-6 in vitro na linha de células de mieloma dependente de hIL-6, XG-1. Mantiveram-se células XG-1 num meio contendo hIL-6 e lavaram-se por duas 32 vezes com meio isento de hIL-6, cultivando-se em seguida durante 24 horas em meio isento de hIL-6 para que fosse consumido o hIL-6 residual. Submeteram-se então as células 'esfomeadas' a uma centrifugação, e voltou a suspender-se a pastilha no meio, a 4 x 105 células por mL, plaqueando-se 20.000 células por poço numa placa de cultura de tecidos com 96 poços. Diluiram-se em série as proteínas de anticorpo purificadas, em meio, e adicionaram-se as soluções às células plaqueadas a concentrações de entre 0 e 50 nM. Subsequentemente, adicionou-se hIL-6 recombinante aos poços a uma concentração final de 8 pM. Deixaram-se crescer as células durante 72 horas a 37 °C numa incubadora humidificada sob 5 % de CO2. No final do período de crescimento, determinaram-se as células vivas utilizando um estojo CCK-8 (Dojindo, Japão). Determinaram-se os valores de IC50 tal como se descreveu acima, que se reportam na terceira coluna da Tabela 2.
Também se determinou ín vitro a capacidade dos anticorpos hIL-6R para bloquearem a actividade de hIL-6 na linha de células de hepatoma humano que reage a hIL-6, HepG2. Transfectaram-se células HepG2 com um plasmídeo repórter contendo um elemento de resposta STAT3 (Transdutor de Sinal e activante da Transcrição 3) ligado a um gene de luciferase. Tripsinizaram-se as células transfectadas, precipitaram-se por centrifugação e voltaram a suspender-se no meio a cerca de 2,5 x 105 células por mL, plaqueando-se a 20.000 células por poço em placas de 96 poços para cultura de tecidos. Diluiram-se em série em meio as 33 proteínas de anticorpo purificadas, e adicionaram-se as soluções às células plaqueadas a concentrações variando entre 0 e 100 nM. Subsequentemente, adicionou-se aos poços hIL-6 recombinante, a uma concentração final de 50 pM. Mediu-se a reacção depois de se incubarem as células durante 6 horas a 37°C numa incubadora humidificada sob 5 % de CO2. Mediu-se a actividade da luciferase usando o sistema de determinação de luciferase Steady-Glo™ (Promega) . Determinaram-se os valores de IC50 tal como se descreveu acima, e reportaram-se na quarta da coluna da Tabela 2.
Exemplo 5. Diversidade da Ligação a Epítopos
Levou-se a cabo um imunoensaio competitivo de ligação ao anticorpo recorrendo, na qualidade de controlo, a anticorpo humanizado de IL-6R humano. Em suma, revestiu-se uma placa imuno-sorvente com 96 poços com 20 ng por poço de proteína recombinante hIL-6R, de um dia para o outro, a 4°C. Depois de se bloquear a ligação não específica com BSA, saturaram-se os locais de ligação de hIL-6R em metade da placa com ligação de anticorpo de controlo por adição de 500 ng do controlo por poço, e à outra metade da placa adicionou-se apenas tampão de ligação. Passadas três horas à temperatura ambiente, adicionaram-se anticorpos a um a concentração de 50 ng/mL, com e sem o anticorpo de controlo previamente existente no poço. Passada mais uma hora de ligação, lavou-se o anticorpo livre e detectou-se a quantidade de anticorpo ligada à placa com anticorpo 34 policlonal IgG ou IgA de cabra anti-murganho conjugado com HRP, e desenvolveu-se a placa utilizando substratos cromáticos de HRP e registando a absorvância a 450 nm. Deduziram-se as percentagens de ligação dos anticorpos anti-hIL6R devidas à presença do anticorpo de controlo que se listam na Tabela 3 adiante. Levou-se a cabo uma experiência semelhante utilizando tecnologia de ressonância de plasmão superficial (Tabela 3). Ambos os métodos geraram resultados consistentes. Os anticorpos VQ8F11, W3D8, W6A9, W6C10-1 ligaram-se a epitopos sobrepondo-se ao anticorpo de controlo; enquanto os anticorpos VQ8A9, W1G4, WW6F12, W7G4, W9A6, e W6C10-3 pareciam ligar-se a epitopos distintos uma vez que a sua ligação a antigénio não era bloqueada pelo anticorpo de controlo. Uma competição parcial pode resultar do impedimento estereoquimico por parte do primeiro anticorpo a ligar-se, mesmo que os epitopos não se sobreponham.
Tabela 3. Competição com o Anticorpo de Controlo na Ligação a Antigénio (Anticorpo j BIAcore™ (% de Imunoensaio (% redução) redução) (YQSA9—6 2 6 1 3 |vQ8Fll—21! 96 j 79 |W3D8—4 97 ! 84 |W6A9—5 96 I 84 fwiG4—7 12 j 3 fwecio—1 | 90 1 80 |W6F12—ll| n.d. ! 3 35 35 ÍAnticorpo W7G4-10 W9A6-11 W6C10-3 BIAcore™ (% de redução) n. d. n. d. n. d.
Imunoensaio (% de redução) 26 18 1
Exemplo 6. Propriedade de Ligação Através de Espécies
Testaram-se quatro anticorpos quanto à sua reactividade cruzada com a proteína recombinante IL-6R de macaco, utilizando a tecnologia BIAcore™. Em suma, utilizou-se uma chip bio-sensora à superfície da qual se imobilizara anticorpo policlonal Fc de cabra anti-murganho, para apresentar os anticorpos monoclonais anti-hIL-6R a uma densidade de cerca de 75 RU. Injectou-se sobre a superfície dos anticorpos proteína recombinante IL-6R, humana ou de macaco (Macaca fascicularis, domínio extracelular; SEQ ID NO:251), a uma gama de concentrações de entre 1,25-40 nM. A ligação do receptor ao anticorpo e a dissociação do complexo ligado foram monitorizadas em tempo real. Obtiveram-se tanto a constante de velocidade de associação (ka) como a constante de velocidade de dissociação (kd), e calculou-se KD (Tabela 4).
Tabela 4. Comparação da Afinidade de Ligação a IL-6R Humano e de Macaco jAnticorpo Antigénio ka (M-1S-1) kd (S1) KD (nM) jj IControlo ::IL6R Humano |l,74E+05 [l,67E-04 |0, 963 | 36 (Anticorpo Antigénio Ika (M_1S_1) kd (S_1) KD (nM) (IL6R de Macaco |l, 44E+05 [l, 68E-04 |l, 170 1 : VQ8 Kl 1-21 (IL6R Humano |8,51E+05 (4,38E-05 |θ, 051 |lL6R de Macaco |3, 39E+05 14,8 6E-05|θ, 143 ÍW1G4-7 ÍIL6R Humano |2,57E+05 (6, 18E-05 !o, 240 1 |lL6R de Macaco (não se liga (W6A9-5 jlL6R Humano (5, 18E+05 :;8,41E-05 |θ, 162 |lL6R de Macaco |5, 00E+05 (7,70E-05|0, 154 (VQ8A9-6 jlL6R Humano |7,32E+05 (2,76E-04 |o, 377 j IL6R de Macaco ! 7,31 El05 [4, 16E-04 lo, 569 1
Entre os quatro anticorpos testados, VQ8F11, W6A9, e VQ8A9 reagiram fortemente com o receptor de macaco, com valores de KD que diferiam entre cerca de 1,5 e cerca de 3 vezes a ligação ao receptor humano, respectivamente. 0 W1G4, que não era bloqueado pelo anticorpo de controlo (Tabela 3), não exibia qualquer ligação ao receptor de macaco apesar de se ligar fortemente ao receptor humano, com um KD de 241 pM.
Exemplo 7. Efeito da Região Constante na Afinidade de
Ligação
Determinou-se a afinidade de ligação a hIL-6R monomérico, de quatro anticorpos com IgG de murganho, IgGl humano ou IgG4 humano (de tipo selvagem ou modificado), utilizando BIAcore™ tal como se descreveu acima, excepto 37 que se utilizou um anticorpo policlonal Fc de cabra anti-humano para capturar os anticorpos hlgG. Injectou-se o hlL-6R monomérico a concentrações de 12,5, 6,25, 3,12, e 1,56 nM. Também se determinou a capacidade dos anticorpos para neutralizarem a transdução de sinal dependente de hIL-6, HepG2/STAT3, num ensaio com luciferase (IC50) . Os valores de IC5o para diferentes isotipos de IgG eram semelhantes, sugerindo que não havia efeito do isotipo sobre a afinidade do anticorpo para o antigénio.
Tabela 5. Comparação dos Isotipos de IgG
Anticorpo IgG ka : kd (S_1) KD IC50 (M-1S-1) (nM) (nM) VQ8F11-21 fhlgGl :j:6, 22E+05 |4,54E-05 0, 073 l0, 150 |hIgG4 |7,17E+05 |5, 22E-05 Í°, 073 10, 22 8 |mIqG2a :;7, 86E+05 |5, 27E-05 :0,067 |θ, 135 |modhIgG4 |8,81E+05 U,70E-05 |0, 053 0, 24 9 VQ8A9-6 (hlgGl |l,09E+06 Í2, 60E-04 |0, 238 jo, 130 i|hIgG4 |l,17E+06 Í2,35E-04 |o, 201 |o, 185 ImlgGl 19,95E+05 12,21E-04 lo, 222 l0,097 W6A9-5 IhlgGl |7,12E+05 Í8, 87E-05 |0, 125 (0, 2 04 |hIgG4 15,67E+05 \Ί, 64E-05 lo, 135 II0,343 |mIgG2a |7,72E+05 Í7,52E-05 lo, 097 |||0, 188 VQ1G4-21 IhlgGl |3,34El05 |7, 92E-05 |0, 237 |θ, 7 67 |hIgG4 12,73E+05 \9, 18E-05 |0, 336 |θ,528 |m!gG2a !3,41 EI 05 |7, 66E-05 IO, 225 ||0, 578 38
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> High Affinity Antibodies to Human IL-6 Receptor
<130> 6010A-WO <140> A atribuir <141> 2007-06-01 <150> 60/810.664 <151> 2006-06-02 <150> 60/843.232 <151> 2006-09-08 <160> 251 <170> FastSEQ para Windows, Versão 4.0 <210> 1 <211> 358 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <4 0 0> 1 39
Met Vai 1 Ala Val Gly Cys 5 Ala Leu Leu Ala 10 Ala Leu Leu Ala Ala 15 Pro Gly Ala Ala Leu 20 Ala Pro Arg Arg Cys 25 Pro Ala Gin Glu Val 30 Ala Arg Gly Vai Leu 35 Thr Ser Leu Pro Gly 40 Asp Ser Val Thr Leu 45 Thr Cys Pro Gly val so GlU Pro Glu ASp Asn 55 Ala Thr val His Trp 60 val Lau Arg Lys Pro Ala 65 Ala Gly Ser HiS 70 Pro Ser Arg Trp Ala 75 Gly Met Gly Arg Arg 80 Leu Leu Leu Arg Ser 85 Val Gin Leu His Asp 90 Ser Gly Asn Tyr Ser 95 cys Tyr Arg Ala Gly Arg 100 Pro Ala Gly Thr 105 Val His Leu Leu Val 110 Asp Val Pro Pro Glu 115 Glu Pro Gin Leu Ser 120 Cys Phe Arg Lys ser 12 5 Pro Leu Ser Asn Val 130 val Cys Glu. Trp Gly 135 Pro Arg Ser Thr Pro 140 Ser Leu Thr Thr Lys Ala 145 val Leu Leu Val 150 Arg Lys Phe □ln Asn 155 Ser Pro Ala Glu Asp 160 Phe Gin Glu Pro Cys 165 Gin Tyr Ser Gin Glu 170' Ser Gin Lys Phe Ser 175 cys Gin Leu Ala val 180 Pro Glu Gly Asp Ser 185 Ser Phe Tyr ile Val 190 Ser Met cys val Ala 195 ser Ser Val Gly Ser 200 Lys Phe ser Lys Thr 205 Gin Thr Phe Gin Gly Cys 210 Gly Ile Leu Gin 215 Pro Asp Pro Pro Ala 220 Asn Ile Thr Val Thr Ala 225 Val Ala Arg Asn 230 Pro Arg Trp Leu Ser 235 Val Thr Trp Gin Asp 240 Pro His Ser Trp Asn 245 Ser Ser Phe Tyr Arg 250 Leu Arg Phe Glu Leu 255 Arg Tyr Arg Ala Glu 260 Arg Ser Lys Thr Phe 265 Thr Thr Trp Met Val 270 Lys Asp Leu Gin His 275 Hls Cys Val Ile HiS 280 Asp Ala Trp Ser Gly Leu 285 Arg His Val Val 290 Gin Leu Arg Ala Gin 295 Glu Glu Phe Gly Gin Gly Glu 300 Trp Ser Glu Trp 305 Ser Pro Glu Ala 310 Met Gly Thr Pro Trp 315 Thr Glu Ser Arg Ser 320 Pro Pro Ala Glu Asn 325 Glu Val Ser Thr Pro 330 Met Gin Ala Leu Thr 335 Thr Asn Lys ser Leu Aap Pro 355 Aap 340 Val Asp Gin Asn Asp Ile Leu Phe 345 Arg Asp Ser Ala Asn 350 Ala Thr
<210> 2 <211> 379 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 2 40 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaaac ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt catctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt atcagttgga atagtggtag cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtge aaaagatgga 300 ggcagcagct ggttaccgtt cgtctactac tacggtafcgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcgtcag 379 <210> 3
<211> 126 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 3
Glu 1 Vai Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Asn 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Arg Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 25 Ile Phe Asp 30 Asp Tyr Ala Met Hls 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ser Gly 50 Ile Ser Trp Asn Ser 55 Gly Ser Ile Gly Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Leu Tyr Tyr 95 cys Ala Lys Asp Gly 100 Gly Ser Ser Trp Leu Pro 105 Phe Val Tyr Tyr 110 Tyr Gly Met ASp val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser ser 115 120 125
<210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 4 24 ggattcatct ttgatgatta tgcc 41
<210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 5
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<210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> 42 <223> Sintética <400> 7 ile ser Trp Asn ser Gly Ser Ile 1 5 <210> 8 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 8 gcaaaagatg gaggcagcag ctggttaccg ttcgtctact actacggtat ggacgtc 57 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 9
Ala Lys Asp gly Gly Ser Ser Txp Leu Pro Phe Vai Tyr Tyr Tyr Gly 15 10 15
Met Asp Vai <210> 10 43
<211> 325 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética < 4 Ο Ο > 10 gaaatagtga tgaogcagto tccagccacc ctgtctgtgt ctcccgggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcaaotttg cctggcacca gcagaaacct 120 ggccaggcbc ccaggcccct catctatggc gcatccacca gggccacCgg Caccccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagao ttcactctca ccatcagcag cccgcagtct 240 gaagattttg cagcctatta ccgccagcag tatagcagcc ggcccccgta cactcctggc 300 caggggacca agctggagac caaac 325
<210> 11 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <40 Glu 0> lia 11 vai Mac Thr Gin ser Pro Ala Thr Leu ser Vai ser Pro Gly 1 Glu Arg Ala Thr 5 Leu Ser Cys Arg Ala 10 Ser Gin Ser Ile Ser 15 Ser Asn Phe Ala Trp 20 Tyr Gin Gin Lye Pro 25 Gly Gin Ala Pro Arg 30 Leu Leu Ile Tyr Gly 35 Ala Ser Thr Arg Ala 40 Thr Gly lie Pro Ala 45 Arg Phe Ser Gly Ser 50 Gly Ser Gly Thr 55 Aap Phe Thr Leu Thr Ile 60 Ser ser Leu Gin Ser 65 Glu Aap Phe Ala Vai 70 Tyr Tyr Cys Gin Gin 75 Tyr Ser Ser Trp Pro 80 Pro Tyr Thr Phe Gly 100 85 Gin Gly Thr Lye Leu 105 90 Glu Ile Lys 95 <210> 12 <211> 18 44
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 12 cagagtatta gcagcaac 18
<210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 13
Gin Ser Ile Ser Ser Asn 1 5
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<210> 16 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 16 cagcagtata gtagctggcc tccgtacact 30 <210> 17 <211> 10
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Oln Qln Tyr Ser Ser Trp Pro Pro Tyr Thr 15 10
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<210> 19 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 19 47
Glu 1 Vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai 10 Qln Pro Gly Arg 15 ser Leu Arg Leu 20 Ser Cya Ala Ala Ser 25 Arg Phe Thr Phe Asp 30 Asp Tyr Ala Met His 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40 Pra Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Vai ser Gly 50 ile Ser Trp Asn Ser 55 Gly Arg Ile Gly Tyr 60 Ala Asp ser vai Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Aan Ala Glu 75 Asn Ser Leu Phe 80 Leu Gin Met Asn Gly 85 Leu Arg Ala Glu Asp $0 Thr Ala Leu Tyr Tyr 95 Cys Ala Thr Lys Vai Gly Ser 115 Arg 100 Ser Asp Ser Phe Asp lie 105 Trp Gly Gin Gly Thr 110 MeC Vai
<210> 20 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 20 agatttacct ttgatgatta tgcc 24
<210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 21
Arg Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 48
<210> 22 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 22 attagttgga atagtggtag aata 24
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Ile Ser Trp Asη ser Gly Arg He 1 5
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Ala Lye Gly Axg Asp Ser Ptie Asp lie 1 5 XXX <210> 26 <211> 322
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 26 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgcctgcac ccgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgge gcatccagtt tggaaagtgg ggccccatoa 180 aggttcagcg gcagcggatc tgggacagac ttcaccctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg oaagttatta ttgtcaacag gctaaoagtt tcccgtacao ttttggccag 300 gggaccaage tggagatcaa ac 322 <210> 27 50
<211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> Αβρ Ιΐβ 27 Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly 1 Asp Are Vai Thr 5 Ile Thr Cya Arg Ala 10 Ser Gin Gly ile Ser 15 Ser Trp Leu Ala Trp 20 Tyr Gin Gin Lye Pro 25 Gly Lys Ala Pro Lys 30 Leu Leu Ile Tyr Gly 35 Ala Ser Ser Leu Glu 40 Ser Gly Vai Pro Ser 45 Arg Phe ser Gly 50 Ser Gly ser Gly Thr Αβρ 55 Phe Thr Leu Thr Ile 60 ser ser Leu Gin Pro 65 Glu Asp phe Ala 70 Ser Tyr Tyr Cys Gin Gin 75 Ala Αβη Ser Phe Pro BO Tyr Thr Phe Gly Gin 100 85 Gly Thr Lya Leu Glu 105 90 Ile Lys 95
<210> 28 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 28 cagggtatta gcagctgg 18 <210> 29 <211> 6
<212> PRT 51 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 29 Gin Gly Xle Ser Ser Trp 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 30 ggtgcatcc 9 <210> 31 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 31
Gly Ala Ser 1 52
<210> 32 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 32 caacaggcta acagtttccc gtacact 27 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 33
Gin Gin Ala Aan Ser Phs Pro Tyr- Thr 1 5 <210> 34 <211> 370 <212> ADN <213> Sequência Artificial 53 <22 0> <223> Sintética <400> 34 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag tcctgcaagg cttctggtta cacttttacc cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg gcacagaagt tccaggggag agtcaccatg atggagctga ggagcctgag atctgacgac cagctcgtcc tctactacta ctacggtatg gtctcctcag ctgaagaagc ctggggccCc agcgaaggtc 60 cattatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 atcagcgctt acaatgatga cacaaactac ISO accacagaca catccacgag cacagcctac 240 acggccgttt attactgtgc gagagaagcg 300 gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360 37 0
<210> 35 <211> 123 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 35
Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Leu Lya Lys pro Gly Ala 1 5 10 15 ser Vai Lye val 20 ser Cys Lys Ala ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 His Tyr Gly lie Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Met Gly Trp 50 Xle Ser Ala Tyr Asn 55 Asp Asp Thr Asn Tyr Ala 60 Gin Lys Phe Gin Gly 65 Arg Val Thr Mac 70 Thr Thr ASP Thr ser Thr Ser 75 Thr Ala Tyr 80 Met Glu Leu Arg Ser 85 Leu Arg ser ASP Asp Thr Ala Val 90 Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Glu Ala 100 Gin Leu Val Leu Tyr 105 Tyr Tyr Tyr Gly Met 110 Asp Val Trp Gly Qln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 36 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial 54 <22 0> <223> Sintética <400> 36 24 ggttacactt ttacccatta tggt 24 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 37
Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyrr Gly 1 5 <210> 38 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 38 24 atcagcgctt acaatgatga caca 24 <210> 39 <211> 8 55 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 39 ile Ser Ala Tyr Asn Asp Asp Thr 1 5 <210> 40 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 40 gcgagagaag cgcagctcgt cctctactac tactacggta tggacgtc 48 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 56 <400> 41
Ala Arg Glu Ala Gin Leu Vai Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai 15 10 15
<210> 42 <211> 322 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 42 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctcccctgca gggccagtca gagtgttagc ggccaggctc ccaggctcct catctatgaC aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac gaagattttg cagtttaeta ctgccagcag gggaccaagc tggagatcag ac ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 agcctcttag cctggaacca acagaaacct 120 gcaCccaaca gggccactgg catcccagcc 180 ttcacCctca ccatcagcag cctagagcct 240 cgtaacaatt ggccgtacat tcttggccag 300 322
<210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 43
Glu Ila Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Asn Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Asn Asn Trp Pro Tyr as 90 95 Ile Pile Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 100 105 57
<210> 44 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 44 cagagtgtta gcagcttc 18 <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 45
Oln Ser Vai Ser Ser Phe 1 s <210> 46 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 58 <4Ο0> 46 gatgcatcc 9 <210> 47 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 47
Aap Ala Ser 1 <210> 48 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 48 cagcagcgta acaattggcc gtacatt 27 <210> 49 <211> 9
<212> PRT <213> Sequência Artificial 59 <22 0> <223> Sintética <400> 49 01η Gin Arg Asη Asn Trp Fro Tyr Ila X 5
<210> 50 <211> 370 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética tggagctgag gtgaagaagc cacceetacc agtcatggta gatgggatgg atcagegett agtcaccatg accacagaca atctgacgac acggccgtct ctacggtatg gacgtctggg <400> 50 caggttcagc tggtgcagtc tcccgcaagg cttctggtta cctggacaag ggcttgagtg gcacagaagt fcccaggggag atggagctga ggagcctgag cagctcgtcc tctactacta gtctccccag ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcagctgggt gcgacaggcc 120 acaatgatga cacaaactat 180 catccacgag cacagcctac 240 actactgcgc gagagaagcg 300 gccaagggac cacggtrcacc 360 370
<210> 51 <211> 123 <212> PR <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 51 60 60 Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Val Lya Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly lie Ser Trp Vai Axg Gin Ala pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Asp Asp Thr Asn. Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser ASP ASP Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Gin Leu Val Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Val Ser ser 115 120
<210> 52 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 52
ggttacacct ttaccagtta tggt 24 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 53
Gly Tyr Thr Phe Thr ser Tyr Gly 5 1 61
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Ile Ser Ala Tyr Asn Aep Asp Thr 1 5 <210> 56 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 62 <223> Sintética <400> 56 gcgagagaag cgcagctcgt cctctactac tactacggta tggacgtc 48 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <4 0 0> 57
Ala Arg Glu Ala Gin Leu Vai Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai 1 5 10 15 <210> 58 <211> 322
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 58 gaaattgtgt tgacacagte tccagccaec ctgtetttgt ctceagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcttcttag cctggaacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcaccctca ccatcagcag cctagagcct 240 63
gaagattttg cagCttatta ctgccagcag cgtagcaatt ggccgtacat ttttggccag 300 gggaccaagc cggagaccaa ac 322 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 59
GlU Φ H H Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Asn Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 ao GlU Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg ser Asn Txp Pro Tyr 85 90 95 Xle Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 60 211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 60 cagagtgtta gcagcttc 18 <210> 61 64
<211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 61
Gin Ser Vai Ser Ser Stia 1 ' 5
<210> 62 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 62 gatgcatcc 9
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Asp Ala Ser 1 <210> 64 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 64 cagcagcgta gcaattggcc gtacatt 27 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 65
Gin Gin Arg Ser Aan Trp Pro Tyr Xle 1 5
<210> 66 <211> 349 <212> ADN <213> Sequência Artificial 66 <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 6 6 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ecctgtgcag cctctggaec cacccetgac ccagggaagg gcctggagtg ggtctoaggc gcggaceccg tgaaaggccg actcaccate ctgcaaatga aoagtctgag agttgaggac gacgcccttg atatctgggg ccaagggaca ttggtaoagc ctggcaggtc cctgagaotc 60 gattatgccc tgcactgggt ccggcaagct 120 gttagttgga atggtggtag aataggctat 180 tccagagaea acgccaagaa etccctcttt 240 acggccttgt attattgtgc aaaaggccgg 300 ttggtcaccg tcCcttcag 349
<210> 67 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 67
Glu Vai Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu'Val Gin Pro 0 £ 1 1 Ser Leu Arg Leu 5 Ser Cys Ala Ala Ser 10 Gly Phe Thr Phe Asp IS Asp Tyr Ala Leu His 20 Trp Val Arg Gin Ala 25 Pro Gly Lys Gly Leu 30 Glu Trp val Ser 35 Gly val sar Trp Asn 40 Gly Gly Arg Ile Gly Tyr 45 Ala Asp ser val Lys 50 Gly Arg Phe Thr Zle 55 Ser Arg Asp Asn 60 Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 Leu Gin Met Asn Ser 70 Leu Arg Val Glu Asp 75 Thr Ala Leu Tyr Tyr 80 Cys Ala Lys Gly Arg 85 ASP Ala Phe Asp Ile 90 Trp Gly Gin Gly Thr 95 Leu Val Thr Val Ser 115 100 Ser 105 110
<210> 68 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial 67 <22 0> <223> Sintética <400> 68 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 69
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 70 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 70 gttagttgga atggtggtag aata 24 <210> 71 68
<211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 71
Vai 9er Trp Asη Gly Gly Arg Ile 1 5
<210> 72 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 72 gcaaaaggcc gggatgcttt tgatatc 27
<210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 69 <4Ο0> 73
Ala Lys Gly Arg Asp Ala Phe Asp Ile <210> 74 <211> 325 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 74 1 5 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt etccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agttacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cattttatta ctgtcagcag cgtaacaacc ggcctccatt cactttcggc 300 cctgggácca aagtggatgt cagac 325 <210> 75 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 75 70 70 Glu Xle Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala X 5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser cys Arg Ala 20 25 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly 50 55 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 Glu Asp Phe Ala Phe Tyr Tyr Cys Gin 85 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val 100 105 <210> 76 <211> 18 ίο 90 75
Ser Leu Ser Pro Gly 15
Ser Vai Ser Ser Tyr 30
Pro Ar9 Leu Leu Ile 45
Ala Arg Phe Ser Gly 60
Ser Ser Leu Glu Pro 80
Asn Asn Arg pro Pro 95
Arg
<212> ADN <213> Sequência Artificj_ai <220> <223> Sintética <400> 76 cagagtgtta gcagttac xq
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Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 1 5 71
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Asp Ala Ser 1 <210> 80 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 72 <4Ο0> 80 cagcagcgta acaaccggcc tccattcact 30
<210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 81
Gin Gin Arg Asn Asn Arg Pro Pro Phe Thr 15 10
<210> 82 <211> 370 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 82 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgtaagg cttctggfctt caaettccct cattatggta tcacctggge gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg accagcactt acaaeggtga cacaatctat gcacagaagg tocagggcag agtcaccatg accacagaca cagccacgag cacggcctat atggaaetga ggagcotgag atctgacgac aeggccgtgt attactgtgc gagatcggaa cagcaggtgg actaccactt ccacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gcetcctcag <210> 83 73
<211> 123 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <4Ο0> 83
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Phe Phe Hls Tyr 20 25 30 Gly lie Thr Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu GlU Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Agn Cly Asp Thr Ile Tyr Ala Gin Lys val 50 55 60 Gin Gly Arg vai Thr Met Thr Thr Asp Thr Ala Thr Ser Thr Ala Tyr «5 70 75 80 Met Glu Leu Arg ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 9S Ala Arg Ser Glu Gin Gin Vai Asp Tyr Tyr Phe Tyr Gly Met Asp val 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
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<212> PRT - 74 - <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 85
Gly Phe Asn Phe Phe His Tyr Gly 1 5 <210> 86 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 86 atcagcactt acaatggtga caca 24 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 87
Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr 1 5 75
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Ala Arg Ser Glu Gin Gin Vai Asp Tyr Tyr Phe Tyr Gly Met Asp Vai 15 10 15 <210> 90 <211> 325 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 76 <223> Sintética <400> 90 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttage agetacttag cctggtacca acagaaacct ggccaggctc ccaggcccct catctatgat gcatccaaca gggccacCgg catcccagcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagao ttcactctca ccatcagcag cctagagcct gaagattttg cattttatta ctgtcagcag cgtaacaacc ggcctccatt cactttcggc cctgggacca aagtggatgt cagac
<210> 91 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 91
OlU Ile vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cya Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Αβρ Pbe Ala Pbe Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Asn Asn Arg Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Pbe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp Vai Arg 100 105
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Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 1 5
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Asp Ala Ser 1 <210> 96 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 96 cagcagcgta acaaccggcc tccattcact 30
<210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 79 <4Ο0> 97
Gin Gin Arg Asn Asn Arg Pro Pro Phe Thr 1 5 10 <210> 98 <211> 370 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 98 caggttcagc tggtgcagtc Cggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agCgaaggtc 60 tcctgtaagg cttctggttt caacttcttt cattatggba tcaectgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcactt acaacggtga cacaatctat 180 gcacagaagg tccagggcag agtcaccatg accacagaca cagccacgag cacggcctat 240 atggaactga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagatcggaa 300 cagcaggtgg actactactt ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360 gttccctcag 370 <210> 99 <211> 123 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 99 80
Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai i>ys Vai Ser Cys iiye Ala Ser Gly Phe Asn Phe Phe His Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 4S Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr ile Tyr Ala Gin Lys Val 50 55 60 Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ala Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met elu Lau Arg Ser Leu hrg ser ASP ASP Thr Ala Val Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Gin Gin val Asp Tyr Tyr Phe Tyr oiy Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 100 <211> 24
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 100 ggtttcaact tctttcatta tggt 24 <210> 101 <211> 8
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <4 0 0> 101
Gly phe Asn Ph« Phe Kis Tyr Gly 1 5 81
<210> 102 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 102 atcagcactt acaatggtga caca 24 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 103
Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr 1 5 <210> 104 <211> 48 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> Sintética 82 <400> 104 gcgagatcgg aacagcaggt ggactactac ttctacggta tggacgtc 48
<210> 105 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 105
Ala Arg Ser Glu Qln Gin Vai Aap Tyr Tyr Phe Tyr Gly Met Asp Vai 15 10 15
<210> 106 <211> 325 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética tccagccacc ccgtctccgt gagcgtcagc agccacttag catctaCgat gcatccaaca tgggacagac etcactctca ctgtcagcag cgtaacaacc cagac <400> 106 gaaattjtgt cgacacagtc ctcccctgca gggccagtca ggccaggctc ccaggctcct aggttcagtg gcagtgggtc gaagattttg caCCttatta cctgggacca aagtggatgfc ctccagggga aagagccacc 60 cctggtacca acagaaacct 120 gggccactgg catcccagcc 180 ccaticagcag cctagagcct 240 ggcctccatt cactttcggc 300 325 83
<210> 107 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética
<400> 107 Glu ile vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Giy 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cya Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Qln Gin Lya Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu xie 35 40 45 Tyr Asp Ala Sex Asn Axg Ala Thr Gly ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr xie ser ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Phe Tyr Tyr Cya Gin Gin Arg Asn Asn Arg Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lya Vai Asp Vai Arg 100 10S
<210> 108 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 108 cagagtgtta gcagttac 18 <210> 109 <211> 6 84
<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 109
Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 1 5 .
<210> 110 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 110 gatgcatcc 9
<210> 111 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <4 0 0> 111 85
Asp Ala Ser 1 <210> 112 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 112 cagcagcgta acaaccggcc tccattcact 30 <210> 113 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <4 0 0> 113
Gin Gin Arg Asn Asn Arg Pro Pro Phe Thr 15 10
<210> 114 <211> 361 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 86 <223> Sintética < 4 Ο Ο > 114 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaaagagc ctggggcotc agtgaagace 60 tcctgcaagg cetctggata caccttcacc tcttatgata tcatctgggt gcgacaggce 120 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccaa acagtggtga cagaggctat 180 acacagaacc tccagggcag agtcaccttg accagggaca cctccataag tacagtctac 240 atggaactga gcagcctgag atctgaggac acggccgtat attattgtgc gcgagactac 300 agtaaccact actacggttt ggacgCcCgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 g 361
<210> 115 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 115
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Xla Ile Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met: 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Arg Gly Tyr Thr Gin Asn Leu 50 55 60 Gin Gly Arg vai Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Ser Asn Hls Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Vai Thr val Ser Ser 115 120
<210> 116 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial 87 <22 0> <223> Sintética <400> 116 ggatacacct tcacctctta tgat 24 <210> 117 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 117
Gly Tyr Thr Phe Thx Ser Tyr Asp 1 5 <210> 118 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 118 atgaacccaa acagtggtga caga 24 <210> 119 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 119
Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Arg 1 5 <210> 120 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 120 gcgcgagact acagtaacca ctactacggt ttggacgtc 39 <210> 121 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 89 <4 Ο 0> 121
Ala Arg Asp Tyr Ser Asn His Tyr Tyr Gly Leu Asp Vai 15 10 <210> 122 <211> 322 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 122 gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtocgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcactCgct gggccagtca ggacatcagc aattatttag cctggtacca gcaaaaacoa 120 gggaaagccc ccaagccccC gacccctgtt gcatccactt tgcagagtgg ggtcccatca 180 aggcccagcg gcagtggacc cgggacagaa tccactctca caatcagtag cctgcagcct 240 gaagacttcg caacccatta ctgtcaacag cttaatagtt acccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcag ac 322 <210> 123 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 123 90
Asp He Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 Asp Arg val Thr 5 rie Thr Cys Trp Ala 10 Ser Gin Asp Ile Ser 15 Asn Tyr Leu Ala Trp 20 Tyr Gin Gin Lys Pro 25 Gly Lys Ala pro Lys 30 Leu Leu Ile Phe Val 35 Ala Ser Thr Leu Gin 40 Ser Gly Val Pro Ser 45 Arg Phe Ser Gly Ser 50 Gly Ser Oly Thr Glu SS Phe Thr Leu Thr Ile 60 Ser Ser Leu Gin Pro 6S Qlu Asp Phe Ala Thr 70 Tyr Tyr cys Gin Gin 75 Phe Asn Ser Tyr Pro 80 Leu Thr Phe Oly Gly 100 85 Gly Thr Lys Val Glu 105 90 Ile Arg 95 <210> 124 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 124 caggacatta gcaattat 18 <210> 125 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 125
Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 126 91
<211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 126 gttgcatcc 9
<210> 127 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 127
Val Ala Ser 1
<210> 128 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 92 <400> 128 caacagttta atagttaccc gctcactttc 30
<210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 129
Gin Gin Phe Asn Sar Tyr Pra Leu Thr 1 5
<210> 130 <211> 370 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 130 caggtccagc eggtgcagec tggagctgag tcctgcaagg cttctggtca cacccttacc cceggacaag ggcctgagtg gatgggatgg gcacagaagt tccaggggag agtcaccatg atggagctga ggagcctgag atctgacgac cagctcgtcc cctaccacta ctacggtatg gtcccctcag gtgaagaagc ctggggccto agtgaaggtc 60 agccatggta tcagetgggt gcgacaggcc 120 ateagcgctt acaacgatga eacaaactac 180 accacagaca catccacgag cacagcctac 240 acggccgttt attactgtgc gagagaagcg 300 gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360 370 <210> 131 <211> 123 93
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 131
Qln Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ρΐιβ Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly zle ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn ASp Asp Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Gin Leu Val Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser ser .115 120
<210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 132 ggttacacct ttaccagtta tggt 24
<210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial 94 <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 133
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 134 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 134 atcagcgctt acaatgatga caca 24 <210> 135 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 135
Ile Ser Ala Tyr Asn Asp Asp Thr 1 5 95
<210> 136 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 136 gcgagagaag cgcagctcgt cctctactac tactacggta tggacgtc 48
<210> 137 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 137
Ala Arg Glu Ala Gin Leu Vai Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai 15 10 15 <210> 138 <211> 322 <212> ADN <213> Sequência Artificial 96 <22 0> <223> Sintética <400> 138 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc ggccaggctc ccaggctcct catctatgat aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac gaagattttg cagtttatta ctgccagcag gggaccaagc tggagatcaa ac ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 agottctcag cctggaacca acagaaaccc 120 gcatccaaca gggccactgg catcecagcc 180 ttcactctca ccatcsgcag cctagagcct 240 cgtagcaatt ggccgtacat ttttggccag 300 322
<210> 139 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 139
Glu Ile vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser l>eu Ser Pro Gly 15 io 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Phe 20 25 30
Leu Ala Trp Asn Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Aen Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly SO ss 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Tyr 85 g0 95
Ile Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 140 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial 97 <22 0> <223> Sintética <400> 140 cagagtgtta gcagcttc 18 <210> 141 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 141
Gin Sor Vai Ser Ser Phe 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 142 gatgcatcc 9 <210> 143 98 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 143
Asp Ala Ser 1 <210> 144 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 144 cagcagcgta gcaattggcc gtacatt 27
<210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 99 <4 Ο 0> 145
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Tyr Ile 1 5 <210> 146 <211> 349 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 146 gaagcgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgccc tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt gttagttgga atggtggtag aataggctat 180 gcggactctg tgaaaggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctcttt 240 ctgcaaatga acagtctgag agttgaggac acggccttgt attattgtgc aaaaggccgg 300 gatgcttttg atatctgggg ccaagggaca ctggtcaccg cctcttcag 349 <210> 147 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 147 100
Glu Vai Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 1 S 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Vai Ser Trp Asn Gly Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gin Mec Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Arg Asp Ala Phe Asp He Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr vai Ser Ser
11S
<210> 148 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 148 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
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Gly Phe Thr Phe Aap Αβρ Tyr Ala 1 5 101
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Val Ser Trp Asn GXy Gly Arg He 1 5 <210> 152 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial 102 <22 0> <223> Sintética <400> 152 gcaaaaggcc gggatgcttt tgatatc 27
<210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 153
Ala Lys Gly Arg Asp Ala Phe Asp Xle 1 5
<210> 154 <211> 322 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400>_ 154 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc atcacCtgtc gggcgagtca gggtattagc gggaaagcce ctaaactcct gatctatgct aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg caacttacea ttgtcaacac gggaccaagc tggagatcaa ac gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gcatccagte tgcaaagtgg ggtcccatca 180 Ctcactctca ccatcagcag cctgcagccc 240 gctcacagtt tcccgtacac CtCtggccag 300 322 103
<210> 155 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 155
Asp Xle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Aap Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Xle Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Xle 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Xle Ser ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Xle Lys 100 105
<210> 156 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 156 cagggtatta gcagctgg 18 <210> 157 <211> 6 104 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 157
Gin Gly Ile Ser Ser Trp 1 5 <210> 158 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 158 gctgcatcc 9
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Ala Ala Ser 1
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Gin His Ala Tyr ser Phe Pro Tyr Thr 1 5
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<210> 163 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 163
Glu 1 Vai Gin Leu vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu val Gin Pro Gly 15 Arg ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 23 Gly Phe Thr Phe Asp 30 Asp Tyr Ala Leu His 35 Trp Vai Arg Gin Ala Pro 40 Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ser Gly 50 Ile Ser Trp Asn Ser 55 Gly Arg Ile Gly Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Xle 70 Ser Arg Asp Asn Ala Lys 75 Asn Ser Leu Phe 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Leu Tyr Tyr 95 Cys Ala Thr Lys Vai Gly Ser Arg 100 Ser Asp Ala Phe Asp Ile 105 Trp Gly Gin Gly Thr 110 Leu Val 115
<210> 164 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial 107 <22 0> <223> Sintética <400> 164 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24 <210> 165 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 165
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 S <210> 166 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 166 attagttgga acagtggtag aata 24 108 <210> 167 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 167
Ile Ser Trp Asn ser Gly Arg xia 1 5 <210> 168 <211> 27
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 168 gcaaaaggcc gggatgcttt tgatatc 27 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 109 <400> 169
Ala Lys Sly Arg Asp Ala Phe Asp Ila 1 5 <210> 170 <211> 322 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 170 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc GO atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagcggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa ac 322 <210> 171 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 171 110
Asp Ile Gin Hat Thr Gin ser 0 * Λ Ser ser H 4 > ser Ala Ser val Gly 1 5 10 15 Asp Arg val Thr Ile Thr cye Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ly9 Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin Ile Lys 100 íos
<210> 172 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 172 cagggtatta gcagctgg 18 <210> 173
<211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 173
Gin Gly Ile ser Ser Trp 1 5 <210> 174 111
<211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 174 gctgcatcc 9
<210> 175 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 175
Ala Ala sor 1
<210> 176 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética 112 <400> 176 caacaggcta acagtttccc gtacact <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 177
Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr X 5 <210> 178 <211> 361 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 178 a 361 caggcgcagc cggtgcagcc tggggctgag gcgaaagagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 ecccgcaagg cttctggata cacctccacc tcttatgata tcatctgggt gcgacaggcc 120 actggacaag ggcCtgagtg gatgggatgg atgaacccaa acagtggtaa eacaggetat 130 acacagaaec tccagggcag agccaccttg accaggaaca cctccataac tacagtctae 240 acggaactga gcagcctgag ctctgaggac acggccgtce attactgtgc gcgagactac 300 agtagccact actacggttt ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 179 <211> 120 113
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <4 0 0> 179
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 A9p He Ile Trp vai Arg Gin Ala Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Oly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Thr Gin Asn Leu 50 55 60 Gin Gly Arg vai Thr Leu Thr Arg Asn Thr ser lie Thr Thr Val Tyr 65 70 75 80 MeC Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Ser Ser His Tyr Tyr Gly Leu Asp vai Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 180 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 180 ggatacacct tcacctctta tgat 24 <210> 181 <211> 8
<212> PRT 114 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 181
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Aap 1 5 <210> 182 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 182 atgaacccaa acagtggtaa caca 24 <210> 183 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 183
Met Asn Pro Asn Ser Gly Aan Thr 1 5 115 <210> 184 <211 > 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 184 gcgcgagact acagtagcca ctactacggt ttggai <210> 185 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 185 Ala Arg Asp Tyx ser Ser His Tyr Tyr Gly Leu Asp Vai 1 5 10 <210> 186 <211> 322 <212> ADN <213> Sequência Artificial 116 <22 0> <223> Sintética <400> 186 gac&tccagt tgacccagtc cccatccttc atcacttgct gggccagtca ggacattagc gggaaagccc ctaagctcct gatctttgtt aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa gaggattttg caacttatta ctgtcaaeag gggaccaagg tggaaatcaa ac ctgtctacat ctataggaga cagagtcacc 60 aattatttag cctggtaCca gcaaaaacca 120 gcatccactt tgcagagtgg ggtcccatca 180 tCcactctca caatcagCag ccCgcagcct 240 ttcaatagte acccgcccac tetcggcgga 300 322
<210> 187 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 187
Asp iie Gin Leu Thr Gin ser pro ser phe Leu Ser Thr ser xle Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Xle Thr Cys Trp Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Oln Gin Lye Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu ile 35 40 45 Phe Vai Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Xle Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu ila Lys 100 105
<210> 188 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial 117 <22 0> <223> Sintética <400> 188 caggacatta gcaattat 18 <210> 189 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 189
Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 190 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 190 gttgcatcc 9 <210> 191 118 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 191
Val Ala ser 1 <210> 192 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 192 caacagttta atagttaccc gctcactttc 30
<210> 193 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 119 <4 Ο 0> 193
Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe <210> 194 <211> 378 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 194 1 5 10 caggtccagc tggtgcagtc tgggggagac ttggtacagc ccggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaaact 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagctgga acagCggggc cataggctat 180 gcggactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ccecccgtac 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccccgt accactgtac aaaagaagaa 300 gcgggagcca cggcggatta ttcctacctc tacggtacgg acgcctgggg ccaagggacc 360 acggCcaccg cctcctca 378 <210> 195 <211> 126 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 195 120
Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Asp Leu val Gin Pro Gly Arg 1 Ser Leu Arg Leu 5 Ser Cys Ala Ala Ser 10 Gly phe Thr Phe Asp 15 Asp Tyr Ala Met His 20 Trp Val Arg Gin Thr 25 Pro Gly Lys Gly Leu 30 Glu Trp Val Sex Gly 35 Ile Ser Trp Asn Ser 40 Gly Ala Ile Gly Tyr 45 Ala Asp Ser Val Lys 50 Gly Argr Phe Thr Ile 55 Ser Arg Asp Asn Ala 60 Lys Asn Ser Leu Tyr 65 Leu Gin Met Asn Ser 70 Leu Arg Ala Glu 75 Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 80 Cys Thr Lys Glu Glu 85 Val Gly Ala Thr Val 90 Asp Tyr Phe Tyr Phe 95 Tyr Gly Met Asp Val 115 100 Trp Gly Gin Gly Thr 120 105 Thr Val Thr Val Ser 125 lio Ser
<210> 196 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 196 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
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Gly Phe Tlxr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 121
<210> 198 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 198 attagttgga atagtggggc cata 24 <210> 199 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 199
Ils ser Trp Asn Ser Gly Ala Ile 1 5 <210> 200 <211> 57
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 122 <400> 200 acaaaagaag aagtgggagc tacggtggat tatttctact tctacggtat ggacgtc 57
<210> 201 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 201
Thr Lys Glu Glu Vai Gly Ala Tbr Vai Asp Tyr Pha Tyr Phe Tyr Gly 1 5 10 15
Met Asp Vai <210> 202 <211> 318
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 202 gaaattgtga tgacecagtc tccagccacc ctgtccctgt cCccagggga aagagccacc 60 ctccccegct gggccagtca gagcgttagc aactacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccagactcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagce 180 aggctcagcg gcagcgggtc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttaCta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctacgtt cggecaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 123
<210> 203 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> Glu Ιΐβ 203 vai Met Thr Gin ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Giy 1 Glu Arg Ala Thr 5 Leu Ser Cya Trp 10 Ala ser Gin Ser Vai Ser 15 Asn Tyr Leu Ala Trp 20 Tyr Gin Gin Lys Pro 25 Gly Gin. Ala Pro Arg 30 Leu Leu Ile Tyr Asp 35 Ala Ser Asn Arg Ala 40 Thr Gly Ile Pro Ala 45 Arg Phe Ser Gly SO Ser «ly Ser Gly Thr Asp 55 Phe Thr Leu Thr Ile 60 Ser Ser Leu Glu pro 65 Glu Asp Phe Ala Vai 70 Tyr Tyr Cya Gin Gin 75 Arg Ser Asn Trp Pro 80 Thr Fhe Gly Gin Gly 100 85 Thr Lys vai Glu 90 Ile Lys 105 95
<210> 204 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 204 cagagtgtta gcaactac 18 <210> 205 <211> 6
<212> PRT 124 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 205
Gin Ser Vai Ser Asn Tyx 1 5 <210> 206 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 206 gatgcatcc 9
<210> 207 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 207
Aap Ala Ser 1 125
<210> 208 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 208 cagcagcgta gcaactggcc tacg 24
<210> 209 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 209
Gin Gin Arg Ser· Asn Trp Pro Thr 1 5 <210> 210 <211> 348 <212> ADN <213> Sequência Artificial 126 <22 0> <223> Sintética <400> 210 caagtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt gcggactctg tgaagggccg attcaccatc ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac gacgcttttg atacctgggg ccaggggaca ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 attagttgga atagtggtag ggtaggctat 180 tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 acggccttgt attactgtac aaaaggccgg 300 atggccaccg tctcttca 34a
<210> 211 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 211
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Sar Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Gly lie Ser Trp Asn Ser Gly Arg Vai Gly Tyr Ala Asp Ser vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Xle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Lys Gly Arg Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai 100 105 110
Thr Vai ser ser 115 <210> 212 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial 127 <22 0> <223> Sintética <400> 212 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24 <210> 213 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 213
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 214 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 214 attagttgga atagtggtag ggta 24 <210> 215 128 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 215
Ile Ser Trp Aan Ser Gly Arg Vai 1 5 <210> 216 <211> 27
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 216 acaaaaggcc gggatgcttt tgatatc 27 <210> 217 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 129 <4Ο0> 217
Thr Lya Gly Arg Asp Ala Phe Asp Ile 1 in <210> 218 <211> 321 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 218 gatactgtga tgacccagtc tccaccttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagccccc gatctatgct gcatccagtC Cgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 219 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 219 130
Asp Xle Vai 1
Asp Arg Vai
Leu Ala Trp 35
Tyr Ala Ala SO
Ser Gly Ser 65
Glu Asp Phe Thr Phe Gly 100
20 Thr Gin Ser PrO Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly 5 10 IS ile Thr cys Arg Ala Ser Gin Gly Xle Ser Ser Trp 25 30 Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Xle 40 45 Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly S5 60 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Xle Ser Ser Leu Gln Pro 70 75 80 Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Gly Thr Lys leu Glu Xle Lys 10S
<210> 220 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 220 cagggtatta gcagctgg
<210> 221 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 221
Gin Gly lie Ser Ser Trp 1 5 131
<210> 222 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 222 gctgcatcc 9
<210> 223 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <4Ο0> 223
Ala Ala Ser 1
<210> 224 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética 132 <400> 224 caacaggcta acagtttccc gtacact 27
<210> 225 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 225
Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr 1 5
<210> 226 <211> 378 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética tggaggagga ccggtgcagc tacctttgat gaccatgcta ggtgtctgga atctcttgga atctaoaatc tctagagata agccgaagat acagctctgt tgcgtattat tatggaatgg <400> 226 gaagtgcagc eggtggaaEc tcttgegctg ctcc cggatt cctggaaagg gactggaatg gctgactctg tgaagggaag ctgcagatga attotctgag ggatcttctt ggctgccttt acagtgacag tgtcttct ctggaagace cccgagaccg 60 tgcatcgggt gagacaggct 120 attctggatc tatcggatat 180 atgctaagaa tCctctgtat 240 attattgtgc taaggatgga 300 atgtgtgggg acagggaaca 360 378 <210> 227 133
<211> 126 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 227 aiu 1 Vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Arg Ser Leu Arg Leu 20 ser Cys Ala Ala ser 25 Gly Phe Ile Phe Asp 30 Asp Tyr Ala Met: His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pr o Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ser Gly 50 ile Ser Trp Asn Ser 55 Gly Ser Ile Gly Tyr 60 Ala ASP Ser val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Leu Tyr Tyr 95 Cys Ala Lys ASP Gly 100 Gly Ser Ser Trp Leu 105 Pro Phe Val Tyr Tyr 110 Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly □ln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 228 <211> 324 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 228 gaaatcgtga tgacacagtc tcctgctaca ctgtcttgta gagcttctca gtctatctct ggacaggcte ctagactgct gatctatgga agatttcccg gatctggatc cggaacagaa gaagatttcg ctgtgtatta ttgtcagcag cagggaacaa agctggaaat caag ctgtctgtgt ctcctggaga aagagctaca 60 tctaatctgg cttjgtatca gcagaagcct 120 gcttctacaa gagctacagg aatccctgct 180 tttacaetga caatctcttc tctgcagtct 240 tattcttett ggcctcctta tacattcgga 300 324 <210> 229 134
<211> 108 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 229
Glu Ile Vai Het Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser vai Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Zle ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 ao Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr ser Ser Trp Pro Pro as 90 95 ? I £ Gly Gin Gly Thr l<ys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 230 <211> 348 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 230 gaggtccagc tggtcgagtc aggaggaggc ctcgtccaac cagggcgcag ccttcgactc 60 tcctgtgccg ccageaggcc tacccecgat gactacgcca tgoaotgggt ccggcaggcc 120 cctggtaagg gcttggagtg ggtgtccggt atctcetgga actccggacg tatcggtcac 180 gccgacageg tgaagggaag gttcactacc tctcgcgaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctccg ggccgaagae accgccttgt attactgtgo caagggcagg 300 gatagtttcg atatctgggg tcaaggcacc atggtgaccg cgtcttca 348 <210> 231 <211> 116 135
<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 231 Olu Val Gin Leu vai Glu Ser Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20 Ala Mac His Trp val Arg Gin Ala 35 40 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly 50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70 Leu Gin Mac Asn Gly Leu Arg Ala 85 Ala Lys Gly Arg Asp Ser Fite Asp 100 Thr val ser ser 115
Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 10 15 Ser Arg Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 2S 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45 Arg ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 60 Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Phe 75 80 Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr cys 90 95 Ile Trp Gly Gin Gly Thr Met val 105 110
<210> 232 <211> 321 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética cceaagcagc gttagcgctt gggaaettct ccatggctgg gatatatggt gcctcctctc cggtacagat cttaccctga etgtcagcag gccaacagtt g <400> 232 gacatacaga tgacccaaag attacaCgca gagcctctca ggaaaagctc ccaagctgct cgcttctccg ggagtggctc gaagactttg ctacatacta ggaactaaac tggaaattaa ccgtaggcga cagggtgaca 60 catggtatca gcagaagccc 120 tccaaagcgg agtcccatca 180 caatctctag cccccagcct 240 ttccctacac cttcggtcag 300 321 <210> 233 <211> 107 136
<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 233 ASP Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Vai Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg vai Thr Ile Thr cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu ile 35 40 45 Tyr Gly Ala ser Ser Leu GlU ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Clu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Thx Phe Gly Gin Gly Thr Lye Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 234 <211> 360 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 234 caggtgcagc tggcgcagcc tggagetgaa gtgaagaagc ctggagctte egtgaaggtg 60 tcttgtaagg cttctggaca cacatttaca ccccacgaca tcatctgggt gagacaggcc 120 acaggacagg gactggaatg gatgggatgg acgaatccta atcctggaaa tacaggatat 180 gctcagaagt Ctcagggaag agtgacaatg acaagaaaca catctatctc tacagtgtat 240 atggaactgt cttctcCgag acccgaagac acagctgcgt atcatcgtgc tagagattat 300 tcttctcatt attatggacc ggatgtgtgg ggacagggaa caacagtgac agtgtcttct 360 <210> 235 <211> 120
<212> PRT 137 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 235
Gin Val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ile Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr ser ile Ser Thr val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr ser Ser Hls Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 236 <211> 321 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 236 gatatccagc tgacacagtc tccttctttt atcacatgta gagcttctca ggatatctct ggaaaggctc ctaagctgct gatctatgtg agattttctg gatctggatc tggaacagaa gaagattttg ctacatatta ttgtcagcag ggaacaaagg tggaaatcaa g ctgtctgctt ctgtgggaga Cagagtgaca 60 aattatctgg cttggtatca gcagaagcct 120 gcttctacac tgcagcctgg agtgccttct 180 tttacactga caatctcttc tctgcagcct 240 tttaattctt atcctctgac atttggagga 300 321 <210> 237 <211> 107
<212> PRT 138 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 237
Pm Ser Phe Leu Ser Ala Ser val Gly 10 15 Arg Ala Ser Gin Asp ile Ser Asn Tyr 25 30 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Xle 40 45 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60 Thr Leu Thr Ile ser Ser Leu Gin pro 75 80 Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 90 95 Val Glu Ile Lys 105
Asp Xle Gin Leu Thr Gin Ser 1 5
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 20
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys 35
Tyr Vai Ala Ser Thr Leu Gin 50 55
Ser Gly ser Gly Thr Glu Phe 65 70
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 85
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 <210> 238 <211> 349 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 238 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gactatgccc tgcactgggC ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggc gccagttgga atggtggtag aacaggctat 180 gcggactctg tgaaaggccg attcaccabc tccagagaca acgccaagaa ccccctcttt 240 ctgeaaaega acagtctgag agttgaggac acggccttgt attattgtgc aaaaggccgg 300 gatgcttttg atatctgggg ccaagggaca ttggtcaccg tctcttcag 343
<210> 239 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial 139 <22 0> <223> Sintética <400> 239
Glu 1 Vai Gin Leu vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Gin Pro Gly 15 Arg Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Asp 30 Asp Tyr Ala Leu His 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ser Gly Vai 50 Ser Trp Asn Gly 55 Gly Arg Ile Gly Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys 65 Gly Arg phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn ser Leu Phe 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Val Glu Asp Thr 90 Ala Leu Tyr Tyr 95 Cys Ala Thr Lys Gly Vai Ser 115 Arg 100 Ser Asp Ala Phe Asp Ile 105 Trp Gly Gin Gly Thr 110 Mee val
<210> 240 <211> 348 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 240 gaagtgcagc tggtggaatc tggaggagga tcttgtgctg cttctggatt tacatttgat cctggaaagg gactggaaeg ggtgtctgga gctgatcctg cgaagggaag acecacaaec ccgcagatga attctctgag agctgaagat gatgcttttg atatctgggg acagggaaca ctggtgcagc ctggaagatc tccgagactg 60 gactacgcta Cgcaccgggt gagacaggcc 120 gtgtcctgga atggaggaag aatcggatat 180 cctagagata atgctaagaa ttcCctgeat 240 acagctctgt attattgcgc taagggaaga 300 atggtgacag tgtcttct 348
<210> 241 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial 140 <22 0> <223> Sintética <400> 241 Glu 1 Vai Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 val Gin Pro Gly 15 Arg ser Leu Arg Leu 20 Ser Cye Ala Ala ser Gly 25 Phe Thr phe Asp 30 Asp Tyr Ala Met Hia 35 Trp val Arg Gin Ala 40 pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp val ser Gly 50 val Ser Trp Asn Gly Gly 55 Arg Xle Gly Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr xle 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80 Leu Gin Net Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Leu Tyr Tyr 95 Cys Ala Thr Lys Vai Gly Ser 115 Arg 100 Ser Asp Ala Phe Asp He Trp 105 Gly Gin Gly Thr 110 Met val
<210> 242 <211> 330 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 242 141
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys. Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val Hla Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser val Val Thr val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 Tyr Zle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys 85 90 95 Lys val Glu Pro Lys Ser cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro 11S 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro GlU Val Thr Cys 130 135 140 Val Val val Asp val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu pro Ala Pro Xle Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 23S 240 Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300 Val Fhe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr- Thr 305 310 315 320 Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 243 <211> 327 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 243 142
Ala 1 Ser Thr Lys Gly 5 Pro ser val Phe Pro 10 Leu Ala Pro Cys Ser 15 Arg Ser Thr Ser Glu 20 Ser Thr Ala Ala Leu 25 Gly cys Leu val Lys 30 Asp Tyr Phe Pro Glu 35 Pro Val Thr Val Ser 40 Trp Asn Ser Gly Ala 45 Leu Thr Ser Gly Vai 50 His Thr Phe Pro Ala SS Val Leu Gin Ser Ser 60 Gly Leu Tyr Ser Leu 65 Ser Ser val Val Thr 70 val Pro Ser Ser Ser 75 Leu Gly Thr Lys Thr 80 Tyr Thr Cys Asn Val 85 Asp His Lys Pro Ser 90 Asn Thr Lys val Asp 95 Ly3 Arg Val Glu Ser 100 Lys Tyr Gly Pro Pro 105 Cys Pro Ser Cys Pro 110 Ala Pro Qlu Phe Leu 115 Gly Gly Pro Ser Val 120 Phe Leu Phe Pro Pro 125 Lys Pro Lys Asp Thr 130 Leu Met ile ser Arg 135 Thr Pro Glu val Thr 140 Cys val val val Asp 145 val Ser Gin Glu Asp ISO Pro GlU Val Gin Phe 155 Asn Trp Tyr Val Asp 160 Gly Val Glu Val His 165 Asn Ala Lys Thr Lys 170 Pro Arg Glu Glu Gin 175 Phe Asn ser Thr Tyr 180 Arg Val Val Ser Val 185 Leu Thr Val Leu His 190 Gin Asp Trp Leu Asn 195 Gly Lys Glu Tyr Lys 200 Cys Lys Val Ser Asm 205 Lys Gly Leu Pro Ser 210 Ser Ile Glu Lys Thr 215 Ile Ser Lys Ala Lys 220 Gly Gin Pro Arg Glu 225 Pro Gin Val Tyr Thr 230 Leu Pro Pro Ser Gin 235 Glu Glu Met Thr Lys 240 Asn Gin Val Ser Leu 245 Thr cys Leu Val Lys 250 Gly Phe Tyr Pro Ser 255 ASp Ile Ala Val Glu 260 Trp Glu Ser Asn Gly Gin 265 Pro Glu Asn Asn 270 Tyr Lys Thr Thr Pro 275 Pro val Leu Asp ser 280 Asp Gly Ser Phe Phe 285 Leu Tyr Ser Arg Leu 290 Thr Val Asp Lys ser 295 Arg Trp Gin Glu Gly 300 Asn Val Phe Ser Cys 305 Leu Ser Ser Val Leu Mec Ser His Leu 325 Glu 310 Gly Ala Lys Leu His Asn HiS 315 Tyr Thr Gin Lys ser 320
<210> 244 <211> 327 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 244 143
Ala Ser Thr Lys Gly pro ser val Phe Pro Leu Ala pro Cys ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys ASP Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Vai Hia Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Vai Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr .65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val ASP His Lys pro ser Asn Thr Lys Val ASP Lys 85 90 95 Arg Vai Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 GlU Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Xle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Vai Ser Gin Glu Aap Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 ISO 155 160 Gly Vai Glu Vai Kis Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser xie Glu Lys Thr xle Ser Lys Ala Lys Gly Gin pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser ASP Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 28S Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 29S 300 Cys Ser Vai Met HÍS Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320 Lau Ser Lau Ser Lau Gly Lyg 325
<210> 245 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <220
<221> VARIANTE <222> (1)...(6) <223> Xaa = Qualquer Aminoácido 144 <4Ο0> 245
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 246 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <22 0> <221> VARIANTE <222> (1)...(3) <223> Xaa = Qualquer Aminoácido <400> 246
Xaa Xaa Xaa 1
<210> 247 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética 145 <22 0> <221> VARIANTE <222> (D . . . (10) <223> Xaa = Qualquer Aminoácido <4 0 0> 247
Xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 248 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <22 0> <221> VARIANTE <222> co \—1 <223> Xaa = Qualquer Aminoácido <400> 248
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa 1 5 <210> 249 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 146 <223> Sintética <22 0> <221> VARIANTE <222> (D . . . (8) <223> Xaa = Qualquer Aminoácido <400> 249
Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 250 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <22 0> <221> VARIANTE <222> (D . . . (19) <223> Xaa = Qualquer Aminoácido <400> 250
Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa 15 10 15 xaa xaa Xaa <210> 251 <211> 311 147
<212> PRT <213> Macaca Fascicularis <400> 251
Ala 1 Pro Gly Gly Cye 3 Pro Ala Gin Ser Leu Pro Gly 20 Asp Ser Vai Thr
GlU Asp Asn 35 Ala Thr Val Hls Trp 40 Ser HiS 50 Leu Ser Arg Trp Ala S5 Gly Ser 65 Vai Gin Leu Hís Asp 70 Ser Gly Arg Pro Ala Gly Thr 85 val His Leu Pro Gin Leu Ser 100 Cys Phe Axg Lys Glu Trp Gly 115 Pro Arg Ser Thr Pro 120 Leu Vai 130 Arg Lys Phe eln Asn 135 Ser cys 145 Gin Tyr Ser Gin Glu 150 Ser Gin Pro Glu Gly Asp Ser 165 Ser Phe Tyr Ser Vai Gly Ser ISO Lys Leu Ser Lys Ile Leu Gin 195 Pro Asp Pro Pro Ala 200 Arg Asn 210 Pro Arg Trp Leu Ser 215 Val Asn 225 Ser Ser Phe Tyr Arg 230 Leu Arg Arg Ser Lys Thr Phe 245 Thr Thr Trp Cys Vai He HiS 260 Asp Ala Trp Ser Arg Ala Gin 275 Glu Glu Phe Gly Gin 280 Glu Ala 290 Met Gly Thr Pro Trp 295 Thr Asn 305 Glu Val Ser Thr Pro 310 Thr
Glu Val 10 Ala Arg Gly Val Leu 15 Thr Leu 25 Thr Cys Pro Gly Gly 30 Glu Pro Val Leu Arg Lys Pro 45 Ala Val Gly Val Gly Arg Arg 60 Leu Leu Leu Arg Asn Tyr Ser 75 Cys Tyr Arg Ala Gly 80 Leu Val 90 Asp val Pro Pro Glu 95 Glu Ser 105 Pro Leu Ser Asn Val 110 Ala Cys Ser Pro Thr Thr Lys 125 Ala Val Leu Pro Ala Glu Asp 140 Phe Gin Glu Pro Lys Phe ser 155 Cys Gin Leu Ala Val 160 Ile Val 170 Ser Met Cys Val Ala 175 Ser Thr 185 Gin Thr Phe Gin Gly 190 Cys Gly Asn Ile Thr val Thr 205 Ala Val. Ala Thr Trp Gin Asp 220 Pro His Ser Trp Phe Glu Leu 235 Arg Tyr Arg Ala Glu 240 Met Val 250 Lys Asp Leu Gin His 255 - His Gly Leu 265 Arg His val Val 270 Gin Leu Gly Glu Trp Ser Glu 285 Trp Ser Pro Glu Ser Arg Ser 300 Pro Pro Ala Glu
Lisboa, 22 de Fevereiro de 2012

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo ou um seu fragmento que se ligue a antigénio, que se ligue especificamente ao receptor de interleuquina humano (hIL-6R) com um valor de KD de 500 pM ou menos, tal como determinado por ressonância de plasmão superficial, em que as CDR da cadeia pesada e as CDR da cadeia leve incluam: (i) SEQ ID NO: 21, 23 e 25 a titulo, respectivamente, de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada, e SEQ ID NO: 29, 31 e 33 a titulo, respectivamente, de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve; ou (ii) SEQ ID NO: 149, 151 e 153 a titulo, respectivamente, de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada, e SEQ ID NO: 157, 159 e 161 a titulo, respectivamente, de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve.
2. Um anticorpo ou um seu fragmento que se ligue a antigénio, consoante a reivindicação 1, incluindo pares de HCVR/LCVR com as SEQ ID NO: 19/27 ou 147/155.
3. Um anticorpo ou um seu fragmento que se ligue a antigénio, consoante a reivindicação 1 ou a 2, que se ligue especif icamente a hIL-6R com um KD de 300 pM ou 2 menos, tal como determinado por ressonância de plasmão superficial.
4. Um anticorpo ou um seu fragmento que se ligue a antigénio, consoante a reivindicação 1, 2 ou 3, que se ligue a hIL-6R com uma afinidade pelo menos 2 vezes maior em relação à sua ligação a IL-6R de macaco.
5. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifique para um anticorpo ou um seu fragmento que se ligue a um antigénio consoante qualquer uma das reivindicações precedentes.
6. Um vector incluindo a sequência de nucleótidos consoante a reivindicação 5.
7. Um sistema hospedeiro/vector para a produção de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que se ligue a um antigénio, que se ligue especificamente ao receptor de IL-6 humano, incluindo um vector consoante a reivindicação 6, numa célula hospedeira adequada.
8. Um sistema hospedeiro/vector consoante a reivindicação 7, em que a célula hospedeira seja uma célula procariótica ou eucariótica seleccionada de entre uma célula de E. coli ou uma célula CHO.
9. Um método para produzir um anticorpo anti-IL-6R ou um seu fragmento que se ligue a antigénio, que 3 inclua cultivarem-se células de um sistema hospedeiro/vector consoante a reivindicação 7 ou a 8 em condições que permitam a produção do anticorpo ou do seu fragmento, e recuperar-se o anticorpo ou o seu fragmento que deste modo se produziu.
10. Utilização de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo que se ligue a antigénio consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 4, no fabrico de um medicamento para utilização na atenuação ou na prevenção de uma doença ou de uma patologia mediada por IL-6 num ser humano, em que a doença ou patologia mediada por IL-6 seja a artrite, uma doença inflamatória dos intestinos ou lúpus eritematoso sistémico.
11. Um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que se ligue a antigénio consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para utilização na atenuação ou na prevenção de uma doença ou de uma patologia mediada por IL-6 num ser humano, em que a doença ou a patologia mediada por IL-6 seja a artrite, uma doença inflamatória dos intestinos ou lúpus eritematoso sistémico.
12. Uma composição farmacêutica incluindo um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que se ligue a antigénio consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veiculo ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico. 4
13. Utilização consoante a reivindicação 10 ou um anticorpo ou fragmento consoante a reivindicação 11, em que a referida artrite seja artrite reumatóide crónica ou a referida doença inflamatória dos intestinos seja a doença de Crohn ou a colite ulcerosa. Lisboa, 22 de Fevereiro de 2012.
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