PT1994171E

PT1994171E - Análises multiplexadas de amostras de teste

Info

Publication number: PT1994171E
Application number: PT77181477T
Authority: PT
Inventors: Larry Gold; Dominic Zichi; Daniel J Schneider; Sheri K Wilcox; James R Heil; Daniel T Nieuwlandt; Todd Gander; Bruce Eaton
Original assignee: Somalogic Inc
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-16
Publication date: 2015-07-06
Also published as: EP2613147A1; CA2634987C; EP1994171B1; CA2634987A1; PL1994171T3; JP2009523430A; AU2007205974A1; CN101374965B; CN101374965A; JP2017104122A; HK1127093A1; EP2952894A1; JP6768547B2; EP2952894B1; WO2007084886A2; EP2613147B1; US20070166740A1; JP5680827B2; HK1217540A1; DK1994171T3

Description

DESCRIÇÃO

ANÁLISES MULTIPLEXADAS DE AMOSTRAS DE TESTE

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente a métodos, dispositivos, reagentes e kits para a deteção de uma molécula alvo numa amostra e, mais especificamente, à deteção e/ou quantificação de uma ou mais moléculas alvo que podem estar contidas numa amostra de teste.

ANTECEDENTES A seguinte descrição proporciona um sumário de informação relevante para a presente invenção e não constitui uma concessão que qualquer da informação proporcionada ou publicações referenciadas no presente documento sejam técnica anterior em relação à invenção presentemente reivindicada.

Ensaios dirigidos à deteção e quantificação de moléculas fisiologicamente significantes em amostras biológicas e outras amostras são ferramentas importantes na investigação cientifica e no campo dos cuidados de saúde. Uma classe de tais ensaios envolve a utilização de uma micromatriz que inclui um ou mais aptâmeros imobilizados num suporte sólido. Os aptâmeros são cada um capaz de se ligar a uma molécula alvo de uma forma altamente especifica e com afinidade muito elevada. Veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 5.475.096 intitulado "Nucleic Acid Ligands"; veja-se também, por exemplo, documento de Patente U.S. N° 6.242.246, documento de Patente U.S. N° 6.458.543, e documento de Patente U.S. N° 6.503.715, cada um dos quais é intitulado "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Uma vez que a micromatriz é colocada em contacto com uma amostra, os aptâmeros ligam-se às suas moléculas alvo respetivas presentes na amostra e permitem assim a determinação da ausência, presença, quantidade, e/ou concentração das moléculas alvo na amostra.

Uma variação deste ensaio emprega aptâmeros que incluem grupos funcionais fotoreativos que permitem que os aptâmeros se liguem de forma covalente, ou "fotorreticulem", com as suas moléculas alvo. Veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 6.544.776 intitulado "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Estes aptâmeros fotoreativos são também referidos como fotoaptâmeros. Veja-se, por exemplo, documento de Patente U.S. N° 5.763.177, documento de Patente U.S. N° 6.001.577, e documento de Patente U.S. N° 6.291.184, cada um dos quais é intitulado "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX; " veja-se também, por exemplo, documento de Patente U.S. N° 6.458.539, intitulado "Photoselection of Nucleic Acid Ligands". Depois de a micromatriz ser colocada em contacto com a amostra e os fotoaptâmeros tenham tido uma oportunidade de se ligarem às suas moléculas alvo, os fotoaptâmeros são fotoativados, e o suporte sólido é lavado para remover quaisquer moléculas ligadas de forma não especifica. Condições de lavagem rigorosas podem ser utilizadas, uma vez que as moléculas alvo que estão ligadas aos fotoaptâmeros não são geralmente removidas, devido às ligações covalentes efetuadas pelo(s) grupo(s) funcional (ais) fotoativado(s) nos fotoaptâmeros. Desta forma, o ensaio permite uma determinação da ausência, presença, quantidade, e/ou concentração das moléculas alvo na amostra de teste.

Em ambos estes formatos de ensaio, os aptâmeros são imobilizados no suporte sólido antes de serem colocados em contacto com a amostra. Sob determinadas circunstâncias, no entanto, a imobilização dos aptâmeros antes do contacto com a amostra pode não proporcionar um ensaio ótimo. Por exemplo, a pré-imobilização dos aptâmeros pode resultar na mistura ineficaz dos aptâmeros com as moléculas alvo na superfície do suporte sólido, levando talvez a tempos de reação morosos e, desta forma, períodos de incubação prolongados para permitir a ligação eficiente dos aptâmeros às suas moléculas alvo. Além disso, quando os fotoaptâmeros são empregues no ensaio e dependendo do material utilizado como um suporte sólido, o suporte sólido pode tender a dispersar ou asbsorver a luz utilizada para efetuar a formação de ligações covalentes entre os fotoaptâmeros e as suas moléculas alvo. Além disso, dependendo do método empregue, a deteção de moléculas alvo ligadas aos seus aptâmeros pode estar sujeita a imprecisão, uma vez que a superfície do suporte sólido pode também estar exposta a, e ser afetada por quaisquer agentes de marcação que sejam utilizados. Finalmente, a imobilização dos aptâmeros no suporte sólido envolve geralmente uma etapa de preparação de âptameros (isto é, a imobilização) antes da exposição dos aptâmeros à amostra, e esta etapa de preparação pode afetar a atividade ou funcionalidade dos aptâmeros.

Consequentemente, existe uma necessidade para métodos, dispositivos, reagentes e kits que proporcionem ensaios de elevada sensibilidade para a deteção e/ou quantificação de moléculas alvo numa amostra de teste otimizando as condições que afetam (1) a atividade dos aptâmeros, (2) a eficiência do alcance de equilíbrios de ligação para complexos de aptâmero-molécula alvo, (3) a formação de ligação(ões) covalente(s) entre um aptâmero e a sua molécula alvo, e (4) a deteção de complexos de aptâmero-molécula alvo. 0 documento US20030219801 refere-se à utilização de uma molécula de aptâmero, concebida para se ligar seletivamente a um ligando, para capturar o ligando específico numa amostra, formando um complexo de aptâmero-ligando e subsequentemente à separação do complexo do restante da amostra e da amplificação de uma subsequência do aptâmero identificar o ácido nucleico que capturou o ligando através da utilização de uma matriz de ácido nucleico e para identificar o próprio ligando.

Kirby et al., 2004 (Anal. Chem 76: 4066-4075) descreve biosensores de aptâmeros imobilizados em esferas e introduzidos em chips microusinados na matriz de sensor de língua eletrónica, e utilizados para a deteção e quantificação de proteínas. Kirby explica que os chips poderiam detetar proteínas em ambos os formatos de ensaio de tipo sandwich e captura. O documento US2002/0037506 descreve um ensaio de tipo sandwich baseado em dois aptâmeros que reconhecem dois sítios independentes numa molécula alvo. Em particular, o documento US2002/0037506 proporciona um método para deteção da presença de um composto alvo numa substância que pode conter o composto alvo compreendendo expôr uma substância que pode conter o composto alvo a uma molécula de captura capaz de se ligar à dita molécula alvo, em que a dita molécula de captura é imobilizada num suporte sólido.

Baldrich et al., 2004 (Anal. Chem. 76: 7053-7063) descreve uma avaliação sistemática dos parâmetros com potencial efeito no desempenho do ensaio de aptâmero ligado a enzima (ELAA). O documento US2005/0142582 descreve um protocolo de seleção in vitro melhorado que se baseia em separações magnéticas para a produção de aptâmero de ADN que é relativamente fácil e dimensionável sem a necessidade de robótica dispendiosa. Os aptâmeros selecionados através dos métodos foram utilizados em ensaios ligados a enzimas, western blots e pufiricação de afinidade.

Sekiya et al (In vitro selection of RNA aptamers against cellular and abnormal isoform of mouse prion protein. Nucleic Acids Symposium Series, Vol.49, N.° 1, 1 de setembro de 2005, página 361-362) descreve um método para isolamento de aptâmeros proteicos anti-prião nos quais ARN competidor está presente durante o período no qual é permitido ao aptâmero e alvo ligarem-se.

SUMÁRIO A presente divulgação inclui métodos, dispositivos, reagentes e kits para a deteção e/ou quantificação de uma ou mais moléculas alvo que podem estar presentes numa amostra de teste. Numa forma de realização, uma amostra de teste é colocada em contacto com um aptâmero que inclui um marcador e tem uma afinidade especifica para uma molécula alvo. É permitido que se forme um complexo de afinidade de aptâmero que inclui um aptâmero ligado à sua molécula alvo. Se a amostra de teste contém a molécula alvo, um complexo de afinidade de aptâmero formar-se-á geralmente na amostra de teste. 0 complexo de afinidade de aptâmero é opcionalmente convertido num complexo covalente de aptâmero que inclui um aptâmero ligado de forma covalente à sua molécula alvo. 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo de afinidade de aptâmero opcional) pode depois ser detetado e/ou quantificado utilizando qualquer de uma variedade de métodos conhecidos para um perito na especialidade, incluindo mas não limitado à utilização de um suporte sólido, utilizando espectrometria de massa, e utilizando reação em cadeia da polimerase quantitativa (Q-PCR) .

Numa forma de realização, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é detetado e/ou quantificado através da utilização de um suporte sólido. Nesta forma de realização, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é ligado a um suporte sólido. A ligação é alcançada colocando em contacto o suporte sólido com o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) e permitindo que um marcador incluído no aptâmero se associe, seja direta ou indiretamente, com uma sonda que está ligada ao suporte sólido. 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) que se associou com a sonda no suporte sólido é depois detetado e opcionalmente quantificado. Em qualquer ponto antes da deteção e quantificação opcional, ou seja, em qualquer momento antes da ligação ou depois da ligação do complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) com o suporte sólido, o complexo é colocado em contacto com um agente de marcação para permitir a deteção da molécula alvo ligada.

Noutra forma de realização, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é detetado e/ou quantificado utilizando espectrometria de massa. Nesta forma de realização, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é ligado a um suporte sólido colocando em contacto o suporte sólido com o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) e permitindo que um marcador incluído no aptâmero se associe, seja direta ou indiretamente, com uma sonda que está ligada ao suporte sólido. Isto facilita a partição do complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) a partir do restante da amostra de teste, concentrando assim a molécula alvo antes da análise de espectrometria de massa e melhorando a deteção e quantificação dos analitos de misturas complexas utilizando esta análise. 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) que se associou com a sonda no suporte sólido é depois eluído e analisado utilizando espectrometria de massa, que produz um espectro de picos que podem ser utilizados para identificar, e portanto, detetar, a molécula alvo. Uma vez detetada a molécula alvo, opcionalmente, ela também pode ser quantificada através de técnicas padrão conhecidas do perito na especialidade. Numa forma de realização em que a molécula alvo é uma proteína, antes da utilização da espectrometria de massa para analisar o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional), o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) pode ser digerido com enzimas proteases, tais como, por exemplo, proteinase K ou tripsina, para produzir fragmentos da molécula alvo ligada que podem depois ser utilizados para identificar a molécula alvo, e deste modo permitir a deteção e quantificação opcional da molécula alvo.

Numa forma de realização adicional, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é detetado e/ou quantificado utilizando Q-PCR. Nesta forma de realização, aptâmero livre na amostra de teste é dividido a partir do complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) antes da deteção e/ou quantificação. 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é quantificado através da realização de PCR e determinando, seja direta ou indiretamente, a quantidade ou concentração de aptâmero que se ligou à sua molécula alvo na amostra de teste. A quantidade ou concentração da molécula alvo na amostra de teste é, normalmente, diretamente proporcional à quantidade ou concentração do aptâmero quantificado através da utilização de Q-PCR. Um método exemplar que pode ser empregue para quantificar um complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) desta forma é o ensaio TaqMan® (PE Biosystems, Foster City, Calif., veja-se também o documento de patente U.S. N° . 5.210.015).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As FIGS. IA e 1B ilustram métodos exemplares para a deteção e/ou quantificação de uma ou mais moléculas alvo que podem estar presentes numa amostra de teste. As FIGS. 2A, 2B, e 2C ilustram métodos exemplares para a deteção e/ou quantificação de uma ou mais moléculas alvo que podem estar presentes numa amostra de teste. A FIG. 3 ilustra um método exemplar para a deteção e/ou quantificação de uma ou mais moléculas alvo que podem estar presentes numa amostra de teste. A FIG. 4 mostra curvas de dose resposta para diluições seriadas de VEGF em tampão (FIG. 4A) e plasma (FIG. 4B) utilizando o ensaio ilustrado nas FIGS. 2A, 2B e 2C. A resposta de tampão sem proteína foi subtraída de cada ponto de dados em ambos os conjuntos. 0 ajuste linear de quadrados mínimos aos dados transformados por logaritmo é mostrado.

As FIGS. 5A-5J mostram curvas de dose resposta para diluições seriadas de 10 proteínas multiplexadas com 41 fotoaptâmeros em tampão utilizando o ensaio ilustrado nas FIGS. 2A, 2B e 2C. A resposta de tampão sem proteína para cada aptâmero foi subtraída de cada ponto de dados dentro desse conjunto. O ajuste linear de quadrados mínimos aos dados transformados por log é também traçado. Apenas os pontos de dados utilizados no ajuste linear são mostrados.

As FIGS. 6A e 6B mostram medições replicadas em RFU para a resposta de 57 fotoaptâmeros em amostras séricas para dois indivíduos obtidas a partir do ensaio delineado nas FIGS. 2A, 2B, e 2C. Ambas as medições replicadas exibem uma reprodutibilidade muito boa para 57 dos alvos medidos, produzindo correlações de Pearson maiores do que 0,99. A FIG. 7 mostra curvas de dose resposta para tPA em tampão (·) e plasma (A) utilizando um ensaio de captura de hibridização UPS com o desafio cinético opcional. Foi feita a média da resposta de tampão sem proteína e foi subtraída de ambas as curvas. Para a amostra de plasma sem proteína alvo adicionada, a resposta de plasma diluído sem desafio cinético é denotada por (□) e aquela com desafio cinético é denotada por (Δ) a tPA a 0,1 pM. A resposta medida é reduzida em quase um log devido ao desafio cinético no plasma, enquanto a resposta de aptâmero-alvo não se altera, conforme evidenciado por (o) (tampão) e (Δ) (plasma) a 10 nM de tPA adicionado. A FIG. 8 mostra curvas de dose resposta para tPA em plasma utilizando o ensaio com o desafio cinético opcional com competidor () e sem (·) . O valor de plasma sem proteína é traçado a 1 pM [tPA] e é reduzido em 70% devido à adição de um competidor, enquanto a resposta de aptâmero-alvo não se altera, conforme evidenciado pelas respostas a tPA a 30 nM, que são essencialmente as mesmas na presença ou ausência de competidor. A FIG. 9 mostra as curvas de dose resposta para três proteínas alvo (tPA (FIG. 9A), PAI-1 (FIG. 9B), e IL-6 (FIG. 9C) ) em tampão (·) e plasma (A). Os valores de RFU foram corrigidos através da subtração do valor de RFU do tampão sem proteína para cada aptâmero. O ajuste linear de quadrados mínimos aos dados transformados por log é também traçado para os dados do tampão. Os valores de RFU de plasma sem proteína corrigidos para estes aptâmeros (Δ a 1 pM) são 66, 26, e 49 RFU, respetivamente.

As FIGS. 10A-10D mostram curvas de dose resposta para quatro proteínas alvo reticuladas em tampão e adicionadas a plasma antes da remoção opcional do aptâmero livre utilizando precipitação de K+/SDS (·) em comparação com curvas geradas sem remoção do aptâmero livre () . O sinal é aumentado depois da remoção do aptâmero livre e o intervalo dinâmico das medições é geralmente aumentado. A FIG. 11 mostra o efeito de reticulação química induzida pela luz de uma proteína alvo (bFGF) com o seu fotoaptâmero quando detergente e uma alta concentração salina são utilizados durante a hibridização. Na ausência de luz, e portanto, ausência de ligação covalente do alvo ao seu fotoaptâmero, o sinal do ensaio é reduzido em mais de duas ordens de grandeza em tampão. A concentração endógena de bFGF é bastante baixa, refletida no pequeno sinal em relação ao controlo sem luz e resposta de base geral. A FIG. 12 mostra a cruva de dose resposta em tampão de uma proteína alvo (C4b), utilizando um fotoaptâmero desenvolvido com uma biblioteca modificada de 5-benzil-dT em vez de dT. A resposta linear ao longo de 3 logs de concentração de alvo demonstra a atividade do aptâmero de nucleótido modificado no ensaio. A FIG. 13 mostra a curva de dose resposta gerada com a marcação direta da proteína alvo (A) ou biotinilação seguida de estreptavidina marcada com fluorescência () sobre uma superfície Schott Nexterion (FIG. 13A) ou uma superfície de copolímero de metacrilato (FIG. 13B). Ambas as superfícies desempenham bem e as duas estratégias de marcação são comparáveis. A FIG. 14 ilustra a hibridização de complexos de aptâmero-alvo a partir de cada tampão (FIG. 14A) ou soro a 10% (FIG. 14B) e marcados com NHS-PECq-biotina numa Matriz Affymetrix GeneChipl® Test3. A coloração com Ficoeritrina-R é realizada numa estação fluídica Affymetrix GeneChip® Em tampão (FIG. 14A), o aptâmero VEGF hibridiza com a sonda 201 (1) com uma intensidade de 3500 RFU, e o aptâmero bFGF hibridiza com a sonda 1121 (2) com uma intensidade de 23000 RFU. No soro (FIG. 14B), as intensidades relativas são 5000 (1) e 18000 (2) para os aptâmeros VEGF e bFGF, respetivamente. A FIG. 15 ilustra o efeito do bloqueio de uma Matriz

Affymetrix GeneChip® Test3 antes da hibridização de complexos de aptâmero-alvo a partir de amostras de plasma. As sondas biotiniladas foram hibridizadas em tampão (FIG. 15A) e em amostras de plasma a superfícies bloqueadas con leite desnatado (FIG. 15B) , "bloco de iniciação" (FIG. 15C), e plasma não marcado (FIG. 15D) . Os valores de fundo para estas quatro superficies são 49, 300, 400 e 500 RFU enquanto os sinais de hibridização para as três sondas são 16.000, 33000 e 18000 em (FIG. 15A) e (FIG. 15B) , 17000, 35000, e 18000 em (FIG. 15C) e 20000, 36000 e 18000 em (FIG. 15D). A FIG. 16 ilustra a deteção quantitativa de proteínas alvo adicionadas ao plasma, reticuladas a fotoaptâmeros, e hibridizadas numa Matriz Affymetrix Gene-Chip® Test3. A resposta de hibridização para complexos de aptâmero das proteínas alvo IL1-R4 (Δ) e bFGF () formados no plasma têm o valor em RFU de resposta sem proteína subtraído. O intervalo de quantificação de dois-log é visto a partir das amostras de plasma depois do bloqueio da superfície da matriz para reduzir a absorção de moléculas na matriz da amostra. A FIG. 17 mostra os valores de dose resposta de proteínas alvo para diluições seriadas de três proteínas alvo multiplexadas com fotoaptâmeros em tampão. As proteínas alvo reticuladas com fotoaptâmero foram capturadas através da hibridização com microsferas Luminex SeroMap™ conjugadas com sonda de oligonucleótidos. Um sistema de instrumento Luminex 100 IS foi utilizado para quantificação do sinal. Os valores de IFM (intensidade de fluorescência média) foram corrigidos através da substração do valor de IFM do controlo sem proteína para cada aptâmero.

DESCRIÇÃO DETALHADA A prática da invenção divulgada no presente documento emprega, a menos que seja indicado de outro modo, métodos convencionais de química, microbiologia, biologia molecular, e técnica de ADN recombinante ao nível da experiência na técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Veja-se, por exemplo, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Edição Atual); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames e S. Higgins, eds., Edição Atual); Transcription and Translation (B. Hames e S. Higgins, eds., Edição Atual).

Conforme utilizado nesta memória descritiva, incluindo as reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referências plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário, e são utilizados indistintamente com "pelo menos um" e "um ou mais". Assim, referência a "um aptâmero" inclui misturas de aptâmeros, referência a "uma sonda" inclui misturas de sondas, e semelhantes.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "compreende", "compreendendo"", "inclui", "incluindo", "contém", "contendo", e qualquer variação dos mesmos, pretendem cobrir uma inclusão não exclusiva, tal que um processo, método, produto do processo, ou composição de matéria que compreende, inclui, ou contém um elemento ou lista de elementos não inclui somente esses elementos, mas que podem incluir outros elementos não listados expressamente ou inerentes a tal processo, método, produto do processo, ou composição de matéria. A presente divulgação inclui métodos, dispositivos, reagentes e kits para a deteção e/ou quantificação de uma ou mais moléculas alvo que podem estar presentes numa amostra de teste. Os métodos, dispositivos, reagentes e kits divulgados proporcionam ensaios de elevada sensibilidade para a deteção e/ou quantificação de moléculas alvo numa amostra de teste otimizando as condições que afetam (1) a atividade dos aptâmeros, (2) a eficiência do alcance de equilíbrios de ligação para complexos de aptâmero-molécula alvo, (3) a formação de ligação(ões) covalente(s) entre um aptâmero e a sua molécula alvo, e (4) a deteção de complexos de aptâmero-molécula alvo.

Com referência às FIGS. IA e 1B, a presença de uma molécula alvo numa amostra de teste é detetada e/ou quantificada primeiro colocando em contacto uma amostra de teste com um aptâmero que tem uma afinidade específica para uma molécula alvo. É permitido que se forme um complexo de afinidade de aptâmero que inclui um aptâmero ligado à sua molécula alvo. Se a amostra de teste contém a molécula alvo, um complexo de afinidade de aptâmero formar-se-á geralmente na amostra de teste. 0 complexo de afinidade de aptâmero é opcionalmente convertido, utilizando um método apropriado ao aptâmero a ser empregue, num complexo covalente de aptâmero que inclui um aptâmero ligado de forma covalente à sua molécula alvo. 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é detetado e/ou quantificado.

Numa forma de realização, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é detetado e/ou quantificado através da ligação do complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) a um suporte sólido. Com referência às FIGS. 2A, 2B, e 2C, num método exemplar para a deteção e/ou quantificação de uma molécula alvo que pode estar presente numa amostra de teste, uma amostra de teste é colocada em contacto com um aptâmero que inclui um marcador e tem uma afinidade específica para uma molécula alvo. É permitido que se forme um complexo de afinidade de aptâmero que inclui um aptâmero ligado à sua molécula alvo. Se a amostra de teste contém a molécula alvo, um complexo de afinidade de aptâmero formar-se-á geralmente na amostra de teste. 0 complexo de afinidade de aptâmero é opcionalmente convertido, utilizando um método apropriado ao aptâmero a ser empregue, num complexo covalente de aptâmero que inclui um aptâmero ligado de forma covalente à sua molécula alvo. 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é ligado a um suporte sólido. A ligação é alcançada colocando em contacto o suporte sólido com o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) e permitindo que o marcador incluído no aptâmero se associe, seja direta ou indiretamente, com uma sonda que está ligada ao suporte sólido. 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) que se associou com a sonda no suporte sólido é depois detetado e opcionalmente quantificado. Em qualquer ponto antes da deteção e quantificação opcional, ou seja, em qualquer momento antes da ligação ou depois da ligação do complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) com o suporte sólido, o complexo é colocado em contacto com um agente de marcação para permitir a deteção da molécula alvo ligada.

Conforme utilizado no presente documento, "ácido nucleico", "oligonucleótido" e "polinucleótido" são utilizados indistintamente para referirem-se a um polímero de nucleótidos de qualquer comprimento, e os tais nucleótidos podem incluir desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, e/ou análogos ou desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos quimicamente modificados. Os termos "polinucleótido", "oligonucleótido" e "ácido nucleico" incluem moléculas de cadeia simples ou dupla bem como moléculas de hélice tripla.

Se presentes, as modificações químicas de um nucleótido podem incluir, isoladamente ou em qualquer combinação, modificações de açúcar na posição 2', modificações de pirimidina na posição 5 (por exemplo, 5-(N-benzilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N- isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-[2-(lH-indol-3-il)etil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, cloreto de 5-(N-[1-(3-trimetilamónio) propil]carboxiamida)-2'- desoxiuridina, 5-(N-naftilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, e 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina), modificações de purina na posição 8, modificações em aminas exociclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo- ou 5-iodo-uracilo, modificações da cadeia principal, metilações, combinações não habituais de emparelhamento de bases tais como as isobases isocitidina e isoguanidina, e semelhantes. As modificações também podem incluir modificações 3' e 5', tais como capeamento. Outras modificações podem incluir substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural com um análogo, modificações de internucleótidos tais como, por exemplo, aquelas com ligações sem carga (por exemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e aquelas com ligações com carga (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquelas que contêm quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas que contêm alquiladores, a aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.) . Além disso, qualquer dos grupos hidroxilo que estão presentes habitualmente num açúcar podem ser substituídos por um grupo fosfonato ou um grupo fosfato; protegidos por grupos protetores de referência; ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleótidos adicionais ou a um suporte sólido. Os grupos OH das extremidades 3' e 5' podem ser fosforilados ou substituídos com aminas, frações de um grupo de capeamento orgânico de cerca de 1 a cerca de 20 átomos de carbono, ou frações de um grupo de capeamento orgânico de cerca de 1 a cerca de 20 polímeros de polietilenglicol (PEG) ou outros polímeros hidrofílicos ou hidrofóbicos, biológicos ou sintéticos. Se estiverem presentes, pode ser feita uma modificação da estrutura do nucleótido antes ou depois da montagem de um polímero. Uma sequência de nucleótidos pode estar interrompida por componentes não nucleótidos. Um polinucleótido pode ser modificado além disso depois da polimerização, tal como por conjugação com um componente marcador.

Os polinucleótidos podem conter também formas de açúcares análogas de ribose ou desoxirribose que conhecem-se em geral na técnica, incluindo 2'-O-metil-, 2'-0-alilo, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbociclicos, açúcares a. -anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleósidos abásicos, tais como metil ribósido. Conforme indicado acima, uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem formas de realização em que fosfato é substituído por P(O) S ("tioato"), P (S)S ("ditioato") , (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R', CO ou CH2 ("formacetal") , em que cada R ou R' é independentemente H ou alquilo substituído ou não substituído (1-20 C) contendo opcionalmente uma ligação de éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo ou araldilo. Nem todas as ligações num polinucleótido têm de ser idênticas. A substituição de formas análogas de açúcares, purinas e pirimidinas pode ser vantajosa na conceção de um produto final, como podem ser estruturas de cadeia principal alternativas como uma estrutura principal de poliamida, por exemplo.

Tal como utilizado no presente documento, "aptâmero" e "e ligando de ácido nucleico" são utilizados indistintamente para referir-se a um ácido nucleico que tem uma afinidade de ligação específica para uma molécula alvo. Reconhece-se que as interações de afinidade são uma questão de grau; no entanto, Neste contexto, a "afinidade de ligação específica" de um aptâmero para o seu alvo significa que o aptâmero se liga ao seu alvo, geralmente com um grau muito mais elevado de afinidade do que aquele com que se liga a outros componentes numa amostra de teste. Um "aptâmero" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula de ácido nucleico que tem uma sequência de nucleótidos específica. Um aptâmero pode incluir qualquer número adequado de nucleótidos. "Aptâmeros" refere-se a mais do que um tal conjunto de moléculas. Diferentes aptâmeros podem ter o mesmo número de nucleótidos ou diferente. Qualquer um dos métodos divulgado no presente documento pode incluir a utilização de um ou mais aptâmeros. Qualquer um dos métodos divulgado no presente documento pode também incluir a utilização de dois ou mais aptâmeros que se ligam especificamente à mesma molécula alvo. Como descrito mais abaixo, um aptâmero podem incluir um marcador. Se um aptâmero inclui um marcador, todas as cópias do aptâmero não precisam de ter o mesmo marcador. Além disso, se diferentes aptâmeros cada inclui um marcador, estes diferentes aptâmeros podem ter o mesmo marcador ou um marcador diferente.

Um aptâmero pode ser identificado usando qualquer método conhecido, incluindo o processo SELEX. Veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 5.475.096 intitulado "Nucleic Acid Ligands". Uma vez identificado, um aptâmero pode ser preparado ou sintetizado de acordo com qualquer método conhecido, incluindo os métodos de síntese química e os métodos de síntese enzimática.

Os termos "SELEX" e "processo SELEX" são utilizados indistintamente no presente documento para referir-se genericamente a uma combinação de (1) a seleção de ácidos nucleicos que interage com uma molécula-alvo de um modo desejável, por exemplo, que se liga com elevada afinidade a uma proteína, com (2) a amplificação daqueles ácidos nucleicos selecionados. Veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 5.475.096 intitulado "Nucleic Acid Ligands". O processo SELEX pode ser utilizado para gerar um aptâmero que se liga de forma covalente ao seu alvo, assim como um aptâmero que se liga de forma não covalente ao seu alvo. Veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 5.705.337, intitulado "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponencial Enrichment: Chemi-SELEX".

Conforme descrito no presente documento, um aptâmero pode ainda compreender um "marcador", que se refere a um componente que fornece um meio para ligar ou imobilizar um aptâmero (e qualquer molécula alvo que está ligada a ele) a um suporte sólido. Um "marcador" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de componente que é capaz de se associar com uma sonda. "Marcadores" refere-se a mais de um conjunto de tais componentes. O marcador pode ser ligado a ou incluído no aptâmero por qualquer método conhecido na técnica. Geralmente, o marcador permite que o aptâmero se associe, seja direta ou indiretamente, com uma sonda que está ligada ao suporte sólido. Um marcador pode permitir a localização de um complexo covalente de aptâmero a um endereço espacialmente definido sobre um suporte sólido. Marcadores diferentes podem, desta forma, permitir a localização de diferentes complexos covalentes de aptâmero a diferentes endereços espacialmente definidos num suporte sólido. Um marcador pode ser um polinucleót ido, um polipéptido, um ácido nucleico peptídico, um ácido nucleico bloqueado, um oligossacárido, um polissacárido, um anticorpo, um affybody, um mimético de anticorpo, um recetor celular, um ligando, um lípido, qualquer fragmento ou derivado destas estruturas, qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outra estrutura com a qual uma sonda (ou molécula ligante, tal como descrito abaixo) pode ser concebida ou configurada para se ligar ou, de outra forma, associar-se com especificidade. Geralmente, um marcador está configurado de tal modo que não interage de forma intramolecular quer consigo ou com o aptâmero ao qual está ligado ou do qual é uma parte. Se SELEX é utilizado para identificar um aptâmero, o marcador pode ser adicionado ao aptâmero quer pré ou pós-SELEX. Numa forma de realização, o marcador está incluído na extremidade 5' do aptâmero pós-SELEX. Noutra forma de realização, o marcador está incluído na extremidade 3' do aptâmero pós-SELEX.

Numa forma de realização, o marcador inclui um polinucleótido que está concebido para se associar diretamente com uma sonda que inclui uma sequência polinucleotídica complementar por hibridação direta com a sequência da sonda. Nesta forma de realização, o marcador é geralmente configurado e a reação de hibridação é efetuada sob condições tais que o marcador não hibridiza com uma sonda diferente da sonda para a qual o marcador inclui um complemento perfeito.

Em algumas formas de realização, o marcador compreende nucleótidos que fazem parte do próprio aptâmero. Por exemplo, se SELEX é usado para identificar um aptâmero, o aptâmero inclui, geralmente, uma extremidade fixa 5' separada de uma extremidade fixa 3' por uma sequência de nucleótidos que varia, dependendo do aptâmero, ou seja, uma região variável. Numa forma de realização, o marcador pode compreender qualquer número conveniente de nucleótidos incluídos numa extremidade fixa do aptâmero, tal como, por exemplo, uma extremidade fixa completa ou qualquer parte de uma extremidade fixa, incluindo os nucleótidos que são internos a uma extremidade fixa. Noutra forma de realização, o marcador pode compreender qualquer número adequado de nucleótidos incluídos dentro da região variável do aptâmero, tal como, por exemplo, a região variável completa ou qualquer porção da região variável. Numa forma de realização adicional, o marcador pode compreender qualquer número adequado de nucleótidos que se sobrepõem tanto à região variável como a uma das extremidades fixas, ou seja, o marcador pode compreender uma sequência de nucleótidos que inclui qualquer porção (incluindo todos) da região variável e qualquer porção (incluindo todos) de uma extremidade fixa.

Numa outra forma de realização, um marcador pode associar-se diretamente com uma sonda e ligar-se covalentemente com a sonda, ligando dessa forma, covalentemente o aptâmero à superfície do suporte sólido. Nesta forma de realização, o marcador e a sonda podem incluir grupos reativos adequados que, mediante associação do marcador com a sonda, são suficientemente próximos uns dos outros para passarem por uma reação química que produz uma ligação covalente. A reação pode ocorrer espontaneamente ou pode exigir a ativação, tal como, por exemplo, foto-ativação ou ativação química. Numa forma de realização exemplar, o marcador inclui uma fração de dieno e a sonda inclui um dienófilo, e a formação de ligações covalentes resulta de uma reação de conjugação de Diels-Alder espontânea do dienófilo e dieno. Qualquer química complementar apropriada pode ser utilizada, tal como, por exemplo, a reação de N-Mannich, formação de dissulfureto, reação de Curtius, condensação aldólica, formação de base de Schiff e adição de Michael.

Noutra forma de realização, o marcador associa-se indiretamente com uma sonda, tal como, por exemplo, através de uma molécula ligante, como descrito adicionalmente abaixo. Nesta forma de realização, o marcador pode incluir uma sequência de polinucleótido que é complementar a uma região particular ou um componente de uma molécula ligante. 0 marcador é geralmente configurado e a reação de hibridização é efetuada de modo tal que o marcador não hibridiza com uma sequência polinucleotídica que não seja a sequência polinucleotídica incluída na molécula ligante.

Se o marcador inclui um polinucleótido, um polinucleotido pode incluir qualquer número adequado de nucleótidos. Numa forma de realização, um marcador inclui, pelo menos, cerca de 10 nucleótidos. Noutra forma de realização, o marcador inclui desde cerca de 10 a cerca de 45 nucleótidos. Ainda noutra forma de realização, o marcador inclui pelo menos cerca de 30 nucleótidos. Marcadores diferentes que incluem um polinucleótido podem incluir o mesmo número de nucleótidos ou um número diferente de nucleótidos.

Tal como utilizado no presente documento, o termo "cerca" representa uma modificação ou variação insignificante dos valores numéricos de modo a que a função básica do item a que se refere o valor numérico é inalterada.

Conforme utilizado no presente documento, "associado", "associa-se", e qualquer variação dos mesmos refere-se a uma interação ou complexação entre um marcador e uma sonda, resultando num complexo suficientemente estável, de modo a permitir a separação de materiais "não associados" ou não ligados, tais como, por exemplo, os componentes não ligados de uma amostra de teste, a partir do complexo de marcador-sonda sob determinadas condições de complexação e de reação. Um marcador e uma sonda podem associar-se um com o outro diretamente por interação e ligação um ao outro com especificidade. Um marcador e uma sonda também se podem associar um com o outro indiretamente tal como quando a sua complexação é mediada por uma molécula ligante.

Conforme utilizado no presente documento, "sonda" refere-se a uma molécula que é configurada para se associar, seja direta ou indiretamente, com um marcador.

Uma "sonda" é um conjunto de cópias de um tipo de molécula ou um tipo de estrutura mult imolecular que é capaz de imobilizar um aptâmero a um suporte sólido, associando, seja direta ou indiretamente, com um marcador. "Sondas" refere-se a mais do que um tal conjunto de moléculas. Uma sonda pode ser um polinucleótido, um polipéptido, um ácido nucleico peptidico, um ácido nucleico bloqueado, um oligossacárido, um polissacárido, um anticorpo, um affybody, um mimético de anticorpo, um recetor celular, um ligando, um lipido, qualquer fragmento ou derivado destas estruturas, qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outra estrutura com a qual um marcador (ou molécula de ligação) pode ser concebido ou configurado para se ligar ou de outra forma associado com especificidade. Uma sonda pode ser ligada a um suporte sólido, quer covalentemente ou não covalentemente através de qualquer método conhecido na técnica.

Numa forma de realização, a sonda inclui um polinucleótido que tem uma sequência que é complementar com uma sequência de marcador de polinucleótido. Nesta forma de realização, a sequência da sonda está geralmente configurada e a reação de hibridização é levada a cabo sob condições tais que a sonda não hibridiza com uma sequência de nucleótidos que não seja o marcador para o qual a sonda inclui a sequência complementar (isto é, a sonda é geralmente configurada e a reação de hibridização é levada a cabo sob condições tais que a sonda não hibridiza com um marcador ou aptâmero diferente).

Numa outra forma de realização, a sonda associa-se indiretamente com um marcador, por exemplo, através de uma molécula ligante. Nesta forma de realização, a sonda pode incluir uma sequência polinucleotidica que é complementar com uma região ou componente particular de uma molécula ligante. A sonda é geralmente configurada e a reação de hibridização é levada a cabo de modo que a sonda não hibridiza com uma sequência polinucleotídica que não seja a sequência polinucleotídica incluída na molécula ligante.

Se uma sonda inclui um polinucleótido, o polinucleotido pode incluir qualquer número adequado de nucleótidos. Numa forma de realização, uma sonda inclui pelo menos cerca de 10 nucleótidos. Noutra forma de realização, uma sonda inclui desde cerca de 10 a cerca de 45 nucleótidos. Ainda noutra forma de realização, uma sonda inclui pelo menos cerca de 30 nucleótidos. Sondas diferentes que incluem um polinucleótido podem incluir o mesmo número de nucleótidos ou um número diferente de nucleótidos.

Conforme utilizado no presente documento, "molécula ligante" refere-se a uma ou mais moléculas que estão configuradas para mediar a associação de um marcador com uma sonda. Geralmente, a molécula ligante é bifuncional na medida em que inclui uma funcionalidade para a ligação a um marcador e uma funcionalidade para a ligação a uma sonda. Uma "molécula ligante" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula (s) ou estrutura (s) multimolecular(es) que são capazes de associar um marcador com uma sonda. "Moléculas ligante" refere-se a mais do que um tal conjunto de moléculas ou estruturas multimoleculares. Uma molécula ligante pode ter qualquer configuração adequada e pode incluir quaisquer componentes adequados, incluindo um polinucleótido, um polipéptido, um ácido nucleico peptídico, um ácido nucleico bloqueado, um oligossacárido, um polissacárido, um anticorpo, um affybody, um mimético de anticorpo, uma molécula de polietilenoglicol (PEG), um recetor celular, um ligando, um lipido, qualquer fragmento ou derivado destas estruturas, qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outra estrutura ou componente químico que pode ser concebido ou configurado para mediar uma associação entre um marcador e uma sonda com especificidade. Uma molécula ligante pode ser alifática ou aromática. A composição da molécula ligante não é critica para qualquer um dos métodos divulgados no presente documento. É muitas vezes preferido que a molécula ligante seja hidrofílica. Como regra geral, o comprimento de uma molécula ligante particular pode ser selecionado para proporcionar conveniência de síntese e facilidade na mediação da associação de um marcador com uma sonda. A molécula ligante não deve conter funcionalidades, ou ser de um comprimento, que irá interferir com as reações que são desejadas de acordo com os métodos divulgados.

Com referência às FIGS. 2A, 2B e 2C, quando uma molécula ligante é empregue em qualquer dos métodos divulgados no presente documento, a molécula ligante pode ser introduzida em qualquer momento adequado, durante a realização do ensaio e pode primeiro entrar em contato com um marcador ou uma sonda. Por exemplo, um marcador incluído num aptâmero pode ser colocado em contacto com a molécula ligante em qualquer momento antes de um complexo covalente de aptâmero entrar em contacto com a sonda num suporte sólido. Noutra forma de realização, uma sonda ligada a um suporte sólido pode ser colocada em contacto com uma molécula ligante em qualquer momento antes de a sonda ser exposta ao marcador num complexo covalente de aptâmero. Numa forma de realização adicional, dependendo da complexidade do ensaio particular realizado e das condições da reação, por exemplo, uma sonda pode ser colocada em contacto tanto com uma molécula ligante e um marcador num complexo covalente de aptâmero simultaneamente.

Uma molécula ligante compreende geralmente um componente de associação de marcador e um componente de associação de sonda. 0 componente de associação de marcador e componente de associação de sonda são independentemente selecionados com base no marcador em particular e sonda utilizada num ensaio particular. Numa forma de realização, o componente de associação de etiqueta é um polinucleótido que é complementar com uma sequência polinucleotidica incluída num marcador. Noutra forma de realização, o componente de associação de sonda é um polinucleótido que é complementar com uma sequência polinucleotidica incluída num marcador. Numa forma de realização adicional, o componente de associação de marcador é um polinucleótido e o componente de associação de sonda é também um polinucleótido.

Noutra forma de realização, a molécula ligante inclui um componente de associação de marcador separado de um componente de associação de sonda por um terceiro componente. Nesta forma de realização, o terceiro componente pode incluir uma ou mais moléculas ou subcomponentes, incluindo um polinucleótido, um polipéptido, um ácido nucleico peptídico, um ácido nucleico bloqueado, um oligossacárido, um polissacárido, um anticorpo, um affybody, um mimético de anticorpo, uma molécula de carbono alifático, uma molécula de polietilenoglicol (PEG), um recetor celular, um ligando, um lípido, qualquer fragmento ou derivado destas estruturas, qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outra estrutura química ou componente que pode ajudar na associação do marcador com a sonda, tal como, por exemplo, aumentando a flexibilidade entre o componente de associação de marcador e o componente de associação de sonda.

Um componente de polinucleótido de uma molécula ligante pode incluir qualquer número adequado de nucleótidos. Numa forma de realização, um componente de polinucleótido de uma molécula ligante inclui pelo menos cerca de 10 nucleótidos. Noutra forma de realização, um componente de polinucleótido de uma molécula ligante inclui desde cerca de 10 a cerca de 45 nucleótidos. Ainda noutra forma de realização, um componente de polinucleótido de uma molécula ligante inclui pelo menos cerca de 30 nucleótidos.

Moléculas ligantes utilizadas em qualquer um dos métodos divulgados no presente documento podem incluir componentes de polinucleótido tendo o mesmo número de nucleótidos ou um número diferente de nucleótidos.

Conforme utilizado no presente documento, "fotoaptâmero", "ligando de ácido nucleico fotorreativo," e "aptâmero fotorreactivo" são utilizados indistintamente para se referir a um aptâmero que contém um ou mais grupos funcionais fotorreativos que se podem ligar covalentemente ou "reticular" com uma molécula alvo. Por exemplo, um resíduo de ácido nucleico de ocorrência natural pode ser modificada para incluir um grupo químico funcional que confere fotorreatividade sobre o resíduo de ácido nucleico após exposição a uma fonte de radiação de um comprimento de onda apropriado. Um fotoaptâmero pode ser identificado e/ou preparado utilizando qualquer método conhecido. Em algumas formas de realização, um aptâmero fotorreativo é identificado utilizando o processo fotoSELEX. Veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 5.763.177, documento de Patente U.S. N.° 6.001.577, e documento de Patente U.S. N.° 6.291.184, cada um dos quais é intitulado "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselecion of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; veja-se também, por exemplo, ο documento de Patente U.S. N.° 6.458.539, intitulado "Photoselection of Nucleic Acid Ligands." Noutras formas de realização, um aptâmero é preparado e é posteriormente modificado para incorporar um ou mais grupos funcionais fotorreativos, gerando assim uma fotoaptâmero. Nestas formas de realização, um ou mais resíduos de ácido nucleico fotoreactivos podem ser incorporados num aptâmero, quer por substituição de um resíduo de ácido nucleico fotoreactivo no lugar de um ou mais outros nucleótidos, tal como um ou mais dos nucleótidos de timidina e/ou citidina no aptâmero, por exemplo, ou por modificação de um ou mais resíduos de ácido nucleico de modo a incluir um grupo funcional fotorreativo.

Exemplos de grupos funcionais fotorreativos que podem ser incorporados num fotoaptâmero incluem 5-bromouracilo, 5-iodo-uracilo, 5-bromoviniluracilo, 5-iodoviniluracilo, 5-azidouracilo, 4-tiouracilo, 5-tiouracilo, 4-tiocitosina, 5-bromocitosina, 5-iodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5-iodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8-azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-iodoadenina, 8-aziodoguanina, 8- bromoguanina, 8-iodoguanina, 8-azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-iodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8-bromoxantina, 8-iodoxantina, 5-[ (4-azidofenacil) tio] citosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]uracilo, 7-desaza-7-iodoadenina, 7-desaza-7-iodoguanina, 7-desaza-7- bromoadenina e 7-desaza-7-bromoguanina.

Em adição a estes grupos funcionais fotorreativos à base de nucleósidos exemplares, outros grupos funcionais fotorreativos que podem ser adicionados a uma extremidade terminal de um aptâmero utilizando uma molécula ligante adequada podem também ser utilizados. Tais grupos fotorreactivos funcionais incluem benzofenona, antraquinona, 4-azido-2-nitroanilina, psoraleno, derivados de qualquer um destes e semelhantes.

Um grupo funcional fotorreativo incorporado num fotoaptâmero pode ser ativado por qualquer método adequado. Numa forma de realização, um fotoaptâmero contendo um grupo funcional fotorreativo é reticulada com o seu alvo, expondo o complexo de afinidade de fotoaptâmero a uma fonte de radiação eletromagnética. Os tipos adequados de radiação eletromagnética incluem luz ultravioleta, luz visível, raios-X e raios gama. Fontes de radiação adequadas incluem fontes que utilizam luz monocromática ou luz policromática filtrada.

Numa forma de realização, um nucleótido fotorreativo, tal como 4-azido-2-nitro-anilina, por exemplo, pode ser incorporado num fotoaptâmero, e luz tendo um comprimento de onda que varia desde cerca de 325 nm até cerca de 470 nm, pode ser utilizada para irradiar um complexo de afinidade de fotoaptâmero que inclui este fotoaptâmero. A excitação nestes comprimentos de onda pode ser realizada, por exemplo, com díodos emissores de luz (LEDs) de baixo custo com recurso a um único díodo emissor de luz ou uma matriz de LEDs, uma vez que os requisitos de energia são modestos. Luz quase monocromática com um comprimento de onda que varia de 465 a 475 nm, um ângulo de visão de 100 graus e fornecendo 38 lumens de luz é fornecida por um ou mais LEDs de alta potência. No caso em que um grupo funcional fotorreativo desejado não possa ser excitado com um comprimento de onda produzido por um LED, a substituição apropriada de grupos de remoção de eletrões ou dadores de eletrões pode muitas vezes ser utilizada para desviar modestamente o comprimento de onda de excitação do grupo funcional fotorreativo para permitir a excitação do grupo fotorreativo funcional a um comprimento de onda produzido por um LED.

Numa forma de realização, um nucleótido fotorreativo é incorporado num fotoaptâmero, e luz tendo um comprimento de onda que varia desde cerca de 300 nm até cerca de 350 nm pode ser utilizada para irradiar um complexo de afinidade de fotoaptâmero que inclui este fotoaptâmero para converter o complexo de afinidade de fotoaptâmero num complexo covalente de fotoaptâmero.

Numa forma de realização, um nucleótido fotorreativo, tal como um 5-iodouracilo ou 5-iodocitosina, por exemplo, pode ser incorporado num fotoaptâmero, e luz tendo um comprimento de onda que varia desde cerca de 320 nm até cerca de 325 nm, pode ser utilizada para irradiar um complexo de afinidade de fotoaptâmero que inclui este fotoaptâmero. Esta combinação facilita a fotorreticulação seletiva do fotoaptâmero que contém cromóforo com a molécula alvo sem induzir outras, fotorreações não específicas. Por exemplo, no caso da proteína alvo, quaisquer resíduos de triptofano que podem ser incluídos na proteína alvo e quaisquer bases de timina e uracilo que podem ser incluídas no fotoaptâmero podem também ser fotorreativos. Uma vez que 5-iodouracilo ou 5-iodocitosina absorvem luz com um comprimento de onda de cerca de 325 nm, mas o triptofano e bases de ácido nucleico que ocorrem naturalmente não, a utilização de luz deste comprimento de onda permite uma fotorreação seletiva no(s) 5-iodouracilo(s) ou 5-iodocictosina(s) dentro do complexo de afinidade de fotoaptâmero. Luz monocromática com um comprimento de onda que varia desde cerca de 320 nm até cerca de 325 nm, pode ser fornecida, por exemplo, por laser de corante sintonizável de frequência duplicada emitindo luz a um comprimento de onda de cerca de 320 nm ou por um laser de hélio cádmio emitindo luz num comprimento de onda de cerca de 325 nm.

Numa forma de realização adicional, um complexo de afinidade de fotoaptâmero pode ser exposto a um laser excímero de cloreto de xénon (XeCl) configurado para emitir luz num comprimento de onda de cerca de 308 nm. Nesta forma de realização, o fotoaptâmero pode incluir um grupo funcional fotorreativo (por exemplo, um 5-bromouracilo ou uma 5-bromocitosina) , e o tratamento do complexo de afinidade de fotoaptâmero com a fonte de luz serve para fotoativar o grupo funcional fotorreativo de tal forma que o fotoaptâmero reticula com a sua molécula alvo e um complexo covalente de fotoaptâmero é formado.

Ainda noutra forma de realização, um fotoaptâmero pode ser reticulado com o seu alvo, expondo um complexo de afinidade de fotoaptâmero a uma lâmpada de mercúrio de alta pressão configurada para emitir luz num comprimento de onda de cerca de 313 nm. Em formas de realização adicionais, filtros de comprimento de onda podem ser utilizados para restringir a luz emitida para ser superior a cerca de 300 nm para minimizar a ativação de outros cromóforos que não aqueles incluídos num complexo de afinidade de fotoaptâmero.

Numa forma de realização adicional, um fotoaptâmero pode ser reticulado com o seu alvo, expondo um complexo de afinidade de fotoaptâmero a uma lâmpada de mercúrio de baixa pressão configurada para emitir luz num comprimento de onda de cerca de 254 nm, o qual é então absorvido por uma substância fluorescente e reemitido num comprimento de onda que varia desde cerca de 300 nm até cerca de 325 nm. Nesta forma de realização, a luz reemitida é filtrada para remover qualquer luz de cerca de 254 nm, que não é absorvida pela substância fluorescente, bem como qualquer luz de comprimentos de onda que vão desde cerca de 2 90 nm até cerca de 305 nm, que pode ser prejudicial para um proteína alvo.

Ainda noutra forma de realização, um grupo funcional fotorreativo de halogéneo, tal como um iodouracilo ou uma bromocitosina por exemplo, pode ser incorporado num fotoaptâmero, e um complexo de afinidade de fotoaptâmero que inclui este fotoaptâmero pode ser tratado com luz com um comprimento de onda que varia desde cerca de 350 nm até cerca de 400 nm. Por exemplo, luz monocromática a partir do terceiro harmónico de um conjunto de laser de Neodímio YAG a cerca de 355 nm ou luz monocromática a partir do primeiro harmónico de um laser de excímero de fluoreto de xénon (XEF) a cerca de 351 nm pode ser utilizada.

Conforme utilizado no presente documento, "molécula alvo" e "alvo" são utilizados indistintamente para se referir a qualquer molécula de interesse à qual um aptâmero se pode ligar com elevada afinidade e especificidade e que pode estar presente numa amostra de teste. Uma "molécula de interesse" inclui qualquer variação menor de uma molécula particular, tal como, no caso de uma proteína, por exemplo, pequenas variações na sequência de aminoácidos, na formação de ligações de dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação que não altera substancialmente a identidade da molécula. Uma "molécula alvo" ou "alvo" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula ou estrutura multimolecular que é capaz de se ligar a um aptâmero. "Moléculas alvo" ou "alvos" refere-se a mais do que um tal conjunto de moléculas. Moléculas alvo exemplares incluem proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lipidos, polissacarídeos, glicoproteínas, hormonas, recetores, antigénios, anticorpos, affybodies, miméticos de anticorpos, vírus, agentes patogénicos, substâncias tóxicas, substratos, metabolitos, análogos de estado de transição, cofatores, inibidores, fármacos, corantes, nutrientes, fatores de crescimento, células, tecidos e qualquer fragmento ou porção de qualquer um dos anteriores. Um aptâmero pode ser identificado para virtualmente qualquer molécula química ou biológica de qualquer tamanho, e assim virtualmente qualquer molécula biológica ou química de qualquer tamanho pode ser um alvo adequado. Um alvo pode também ser modificado para aumentar a probabilidade ou a força de uma interação entre o alvo e o aptâmero. Em formas de realização exemplares, a molécula alvo é uma proteína. Veja-se o documento de Patente U.S. N.° 6.376.190, intitulada "Modified SELEX Processes Without Purified Protein" para métodos em que o alvo de SELEX é um péptido. "Polipéptido", "péptido" e "proteína" são utilizados indistintamente no presente documento para referir-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por ácidos não-aminados. Os termos englobam também um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos dentro da definição, por exemplo, polipéptidos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. Os polipéptidos podem ser cadeias simples ou cadeias associadas.

Conforme utilizado no presente documento, "molécula não alvo" e "não alvo" são utilizados indistintamente para se referirem a uma molécula contida numa amostra de teste que pode formar um complexo não especifico com um aptâmero. Uma "molécula não alvo" ou "não alvo" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula ou estrutura multimolecular que é capaz de se ligar a um aptâmero. "Moléculas não alvo" ou "não alvos" refere-se a mais do que um tal conjunto de moléculas. Será apreciado que uma molécula que é um não alvo para um primeiro aptâmero pode ser um alvo para um segundo aptâmero. Igualmente, uma molécula que é um alvo para o primeiro aptâmero pode ser um não alvo para o segundo aptâmero.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "complexo de afinidade de aptâmero" refere-se a um complexo não covalente que é formado pela interação de um aptâmero com a sua molécula alvo. Um "complexo de afinidade de aptâmero" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de complexo formado por um aptâmero ligado à sua molécula alvo correspondente. "Complexos de afinidade de aptâmero" refere-se a mais do que um conjunto de tais complexos. Um complexo de afinidade de aptâmero pode geralmente ser revertido ou dissociado por uma mudança numa condição ambiental, por exemplo, um aumento da temperatura, um aumento da concentração salina ou uma adição de um desnaturante.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "complexo covalente de aptâmero" refere-se a um complexo de afinidade de aptâmero no qual o aptâmero foi induzido a formar, ou forma de outro modo, uma ligação covalente com a sua molécula alvo. Um "complexo covalente de aptâmero" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de complexo formado por um aptâmero covalentemente ligado à sua molécula alvo correspondente. "Complexos covalentes de aptâmero" refere-se a mais do que um tal conjunto de complexos. Uma união ou ligação covalente entre um aptâmero e a sua molécula alvo pode ser induzida por fotoativação de uma fração química no aptâmero, incluindo aquelas frações descritas acima em relação aos fotoaptâmeros. Uma união ou ligação covalente entre um aptâmero e a sua molécula alvo também pode ser induzida quimicamente. Grupos químicos que podem ser incluídos num aptâmero e utilizados para induzir uma ligação covalente com o alvo incluem, mas não estão limitados a aldeídos, maleimidas, derivados de acrililo, derivados de diazonio, tióis, etc. Em algumas formas de realização, grupos químicos de reticulação, tais como maleimida ou sais de diazonio, por exemplo, podem converter os complexos de afinidade de aptâmero em complexos covalentes de aptâmero simplesmente fornecendo o ambiente adequado e justaposição de grupos reativos necessárias para que ocorra uma reatividade química específica e suficientemente potenciada. Noutras formas de realização, agentes de reticulação químicos, tais como os grupos aldeído, podem necessitar da adição de um outro componente, por exemplo, cianoborohidreto de sódio, para converter os complexos de afinidade de aptâmero em complexos covalentes de aptâmero estáveis e irreversíveis. Ainda noutras formas de realização, nenhum desses agentes de reticulação químicos são incluídos num aptâmero; em vez disso, um terceiro reagente é utilizado para converter um complexo de afinidade de aptâmero num complexo covalente de aptâmero facilitando uma ligação covalente entre o aptâmero e o seu alvo. Por exemplo, um reagente homo ou heterobifuncional contendo ambos uma fração reativa de amina (por exemplo, um éster de N-hidroxisuccinimidilo, um aldeído, ou um imidato) e um grupo reativo de nucleósido (por exemplo, uma iodoacetamida ou um aldeído ativado) pode induzir a complexação covalente de um complexo de afinidade de aptâmero, tal como um complexo de afinidade formado por um aptâmero e uma proteína alvo. 0 termo "amostra de teste" refere-se no presente documento a qualquer material, solução ou mistura que contêm uma pluralidade de moléculas e que podem incluir, pelo menos, uma molécula alvo. 0 termo amostra de teste inclui amostras biológicas, conforme definido abaixo, e amostras que podem ser utilizadas para testagem ambiental ou toxicológica, tais como água contaminada ou potencialmente contaminada e efluentes industriais, por exemplo. Uma amostra de teste pode também ser um produto final, produto intermediário ou subproduto de um processo de preparação, por exemplo, um processo de fabrico. Uma amostra de teste pode incluir qualquer meio de ensaio, tampão, ou diluente adequado que tenha sido adicionado a um material, solução ou mistura obtida a partir de um organismo ou a partir de alguma outra fonte (por exemplo, do ambiente ou de uma fonte industrial). 0 termo "amostra biológica" refere-se a qualquer material, solução ou mistura obtida a partir de um organismo. Isto inclui sangue (incluindo sangue total, leucócitos, células mononucleares do sangue periférico, plasma e soro), expetoração, respiração, urina, sémen, saliva, fluido de meninges, líquido amniótico, fluido glandular, fluido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, fluido sinovial, aspirado de articulações, células, um extrato celular e fluido cerebrospinal. Isto também inclui frações experimentalmente separadas de todos os anteriores. 0 termo "amostra biológica" inclui também materiais, soluções ou misturas que contêm material sólido homogeneizado, tal como a partir de uma amostra de fezes, uma amostra de tecido ou uma biópsia de tecido, por exemplo. 0 termo "amostra biológica" inclui também materiais, soluções, misturas ou derivadas de uma cultura de tecido, cultura de células, cultura bacteriana ou cultura virai. "Suporte sólido" refere-se a qualquer substrato que tem uma superfície à qual podem ser ligadas moléculas, direta ou indiretamente, quer através de ligações covalentes ou não-covalentes. 0 suporte sólido pode incluir qualquer material de substrato que seja capaz de proporcionar suporte físico para as sondas que estão ligadas à superfície. 0 material é geralmente capaz de resistir a condições relacionadas com a fixação das sondas à superfície e a qualquer tratamento posterior, manuseamento, ou processamento encontrado durante a realização de um ensaio. Os materiais podem ser de ocorrência natural, sintéticos, ou uma modificação de um material de ocorrência natural. Materiais de suporte sólido apropriados podem incluir silício, grafite, superfícies espelhadas, laminados, cerâmica, plásticos (incluindo polímeros, tais como, por exemplo, poli (cloreto de vinilo), copolímeros de cicloolefinas, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno (PTFE ou Teflon®), nylon, poli(butirato de vinilo), germânio, arsenieto de gálio, ouro, prata, etc, usados por si só ou em conjunto com outros materiais. Materiais inertes adicionais podem ser considerados, tais como vidro, que inclui de sílica e adicionalmente inclui, por exemplo, vidro que está disponível como Bioglass. Outros materiais que podem ser utilizados incluem materiais porosos, tais como, por exemplo, esferas de vidro de poro controlado. Quaisquer outros materiais conhecidos na técnica que sejam capazes de ter um ou mais qrupos funcionais, tais como qualquer um de um qrupo funcional amino, carboxilo, tiol, ou hidroxilo, por exemplo, incorporados na sua superfície, são também contemplados. 0 material utilizado para um suporte sólido pode tomar qualquer uma de uma variedade de configurações que vão do simples ao complexo. 0 suporte sólido pode ter qualquer uma de uma série de formas, incluindo uma tira, placa, disco, haste, partícula, incluindo esfera, tubo, poço, e semelhantes. Normalmente, o material é relativamente plano, tal como, por exemplo, uma lâmina, embora possa ser esférico, tal como, por exemplo, uma esfera, ou cilíndrico (por exemplo, uma coluna). Em muitas formas de realização, o material tem a forma geralmente de um sólido retangular. Múltiplas disposições predeterminadas, tais como, por exemplo, matrizes de sondas, podem ser sintetizadas numa folha, que é depois cortada, isto é, cortada quebrando ao longo de linhas vincadas, em substratos de matriz únicos. Exemplos de suportes sólidos que podem ser utilizados incluem poços de microtitulação, lâminas de microscópio, membranas, esferas paramagnéticas, papel com carga, películas de Langmuir-Blodgett, chips em hóstias de silício, chips de fluxo contínuo e microesferas. A superfície do suporte sólido é geralmente a porção exterior do material de substrato que forma o suporte sólido. A superfície do suporte sólido no qual as sondas estão ligadas pode ser lisa ou substancialmente plana, ou ter irregularidades, tais como ranhuras, depressões, elevações ou outras texturas. A superfície pode ser modificada com uma ou mais camadas diferentes de compostos que servem para modificar as propriedades da superfície de uma forma desejável. Em várias formas de realização, tais camadas de modificação de superfície, quando presentes, podem geralmente variar em espessura de uma espessura monomolecular até cerca de 1 mm, ou de uma espessura monomolecular até cerca de 0,1 mm ou, de uma espessura monomolecular até cerca de 0,001 mm.

Camadas de modificação da superfície de interesse incluem camadas inorgânicas e orgânicas, tais como metais, óxidos de metal, polímeros, pequenas moléculas orgânicas e semelhantes. Camadas poliméricas de interesse incluem copolímeros de metacrilato, poliacrilamidas, polissacarídeos, fosfolípidos, poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureias, poliamidas, aminas de polietileno, sulfuretos de poliarileno, polissiloxanos, poliimidas, poliacetatos e semelhantes, em que os polímeros podem ser hetero ou homopolímeros, e podem ou não ter frações funcionais separadas a eles ligadas (por exemplo, frações conjugadas). Outras modificações de superfície de interesse incluem redes tridimensionais, tais como hidrogéis, por exemplo. Qualquer hidrogel adequado conhecido na técnica pode ser utilizado. Veja-se, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. N.° 2003/0218130, intitulada "Biochips with Surfaces Coated with Polysaccharide-Based Hydrogels", Publicação do Pedido de Patente U.S. N.° 20050147994, intitulada "Method for Immobilizing a Biologic in a Polyurethane-Hydrogel Composition, a Composition Prepared from the Method, and Biomedical Applications", Publicação do Pedido de Patente U.S. N.° 2005005908 intitulada "Photocrosslinked Hydrogel Blend Surface Coatings", e qualquer uma das referências citadas nestas publicações.

Numa forma de realização, a superfície de um suporte sólido inclui um hidrogel. O hidrogel pode compreender, por exemplo, uma matriz de polímero. O hidrogel pode ser quimicamente ligado à superfície do suporte sólido e pode incluir uma funcionalidade de ligação que é capaz de fixar, seja direta ou indiretamente, uma sonda ao hidrogel. Funcionalidades de ligação exemplares incluem um grupo hidrofóbico, um grupo hidrofílico, grupos reativos tais como aldeídos, epóxi, carbonatos e semelhantes, um grupo carboxilo, um tiol, um sulfonato, um sulfato, um amino, um amino substituído, um fosfato, um grupo quelante de metal, um tioéter, uma biotina, um boronato, etc.

Qualquer superfície adequada para a expressão génica ou análise de SNP pode também ser utilizada, incluindo substratos e superfícies oferecidas, por exemplo, por Affymetrix, General Electric (por exemplo, CodeLink), Agilent e Schott Nexterion, quer como substratos e superfícies ou como componentes de produtos que compreendem adicionalmente outros componentes.

Uma sonda pode ser ligada à superfície do suporte sólido de qualquer maneira adequada, desde que a sonda não se torne não ligada durante a incubação subsequente e as etapas de processamento, de acordo com os métodos divulgados, tais como a lavagem da superfície para remover complexos não específicos, por exemplo. A sonda pode ser ligada estando ligada de forma não covalente, por exemplo, aderida, absorvida, adsorvida, ou estando ligada de forma covalente à superfície do suporte sólido. No caso de uma ligação covalente da sonda ao suporte sólido, a superfície do suporte sólido irá conter um grupo funcional que se liga à sonda. A natureza do(s) grupo (s) funcional (ais) utilizados é dependente da natureza da sonda. Uma variedade de métodos têm sido relatados para a ligação covalente de moléculas a uma superfície. Tipicamente, estas reações são realizadas pela reação de um grupo funcional ativo numa molécula com um grupo funcional ativado na superfície. Como um exemplo, um composto contendo amina pode ser ligado a uma superfície contendo ácido carboxílico através da formação de um éster ativado do ácido carboxílico, tal como um derivado de N-hidroxisuccinimida. A amina reage prontamente com este éster ativado para formar uma ligação de amida estável. Esta reação é útil sob condições em que a reação com a amina desejada é significativamente mais rápida do que com outros nucleófilos no sistema.

Exemplos de métodos que foram previamente descritos na técnica incluem a ativação de superficies com brometo de cianogénio, ésteres de N-hidroxisuccinimida, carbonildiimidazol, carbodiimidas, azlactonas, cloretos cianúricos, cloretos de sulfonilo orgânico, divinil sulfona, ésteres de nitrofenilo, iodoacetilo, maleimida, epóxi, hidrazida, aminação redutora, sais de diazonio, e condensações de Mannich. Moléculas que reagem com a superfície ativada incluem aminas, álcoois, tióis, ácidos carboxílicos, carbonilos e compostos contendo hidrogénios ativos.

Numa forma de realização, as sondas são ligadas à superfície do suporte sólido numa disposição espacial ou padrão predeterminado, o que significa qualquer disposição sobre a superfície em que a identidade de uma sonda numa localização particular é conhecida. Numa forma de realização, a disposição predeterminada é uma matriz. Uma matriz inclui, geralmente, qualquer disposição de uma, duas ou três dimensões das regiões endereçáveis portadoras de uma sonda particular, associada com aquela região. Uma matriz é endereçável na medida em que tem múltiplas regiões de diferentes sondas, de tal forma que uma região ou recurso ou ponto da matriz numa localização ou endereço predeterminado particular na matriz deteta um complexo covalente de aptâmero particular, e portanto, uma molécula alvo particular, em virtude de se associar especificamente com o marcador no tal complexo covalente de aptâmero.

Uma montagem de matriz na superfície de um suporte sólido refere-se a uma ou mais matrizes dispostas ao longo de uma superfície de um suporte sólido individual e separadas por áreas inter-matriz. Normalmente, a superfície do suporte sólido oposta à superfície com as matrizes (superfície oposta) não carrega quaisquer matrizes. As matrizes podem ser concebidas para o ensaio contra qualquer tipo de amostra de teste. A superfície do suporte sólido pode carregar, pelo menos, um, dois, quatro, vinte, uma centena, ou pelo menos, quinhentas matrizes. Dependendo da utilização pretendida, qualquer ou todas as matrizes podem ser iguais ou diferentes umas das outras e, cada uma delas, pode conter vários pontos ou recursos de sondas dispostas sobre as mesmas. Uma matriz típica pode conter mais do que dez, mais do que cem, mais do que mil, ou dez mil recursos, ou mesmo mais do que cem mil recursos, numa área de menos do que cerca de 2 0 cm2 ou mesmo menos do que cerca de 10 cm2. Por exemplo, os recursos podem ter larguras (isto é, diâmetro, para um ponto redondo) no intervalo desde cerca de 10 ym até cerca de 1,0 cm. Em outras formas de realização, cada recurso pode ter uma largura no intervalo desde cerca de 1,0 ym até cerca de 1,0 mm, ou desde cerca de 5,0 ym até cerca de 500 ym ou desde cerca de 10 ym até cerca de 200 ym. Recursos não redondos podem ter intervalos de área equivalentes àquela de recursos circulares com os intervalos de largura (diâmetro) anteriores.

Qualquer uma de uma variedade de geometrias de matrizes sobre um suporte sólido pode ser usada. Conforme mencionado acima, um suporte sólido individual pode conter uma matriz única ou matrizes múltiplas. Os recursos da matriz podem ser dispostos em filas e colunas retilíneas. Isto é particularmente atrativo para matrizes únicas sobre um suporte sólido. Quando várias matrizes estão presentes, tais matrizes podem ser dispostas, por exemplo, numa sequência de linhas curvilíneas em toda a superfície do suporte sólido (por exemplo, uma sequência de círculos concêntricos ou semicírculos de pontos), e semelhantes. De forma semelhante, o padrão de recursos pode ser variado desde as filas retilíneas e colunas de pontos para incluir, por exemplo, uma sequência de linhas curvilíneas em toda a superfície do suporte sólido (por exemplo, uma sequência de círculos concêntricos ou semicírculos de pontos), e semelhantes. A configuração das matrizes e os seus recursos podem ser selecionados de acordo com o fabrico, manuseamento e considerações de utilização.

Cada recurso, ou elemento, no interior da matriz é definido como sendo uma pequena região, de forma regular da superfície do suporte sólido. Os recursos estão dispostos de uma forma predeterminada. Cada recurso de uma matriz geralmente carrega uma sonda ou mistura de sondas predeterminada. Cada recurso dentro da matriz molecular pode conter uma sonda diferente, e a sonda dentro de um dada recurso pode ser diferente das sondas dentro dos restantes recursos da matriz. Alguns ou todos os recursos podem ser de composições diferentes. Cada matriz pode conter múltiplos pontos ou recursos, e cada matriz pode ser separada de outra matriz por espaços ou áreas. Também será apreciado que não é necessário haver qualquer espaço que separa as matrizes umas das outras. Áreas inter-matriz ou áreas inter-recurso estão normalmente presentes, mas não são essenciais. Tal como acontece com todas as áreas de fronteira, essas áreas inter-matriz ou inter-recurso não carregam quaisquer sondas. Será apreciado que as áreas inter-matriz e as áreas inter-recurso, quando presentes, podem ser de vários tamanhos e configurações.

Em algumas formas de realização, uma matriz pode ser formada ligando uma sonda a um primeiro suporte sólido, tal como uma esfera, por exemplo, e em seguida, dispondo o primeiro suporte sólido num formato de matriz sobre um segundo suporte sólido, tal como um placa de microtitulação, por exemplo. Em outras formas de realização, uma matriz pode ser formada ligando as sondas de esferas endereçáveis. "Esferas endereçáveis" incluem corantes, códigos de barras e transponders.

Em algumas formas de realização, dependendo da superfície selecionada do suporte sólido, a superfície pode ser "bloqueada" ou "passivada", a fim de reduzir ou inibir a ligação não específica de moléculas à superfície do suporte sólido. Reagentes de bloqueio ou passivação incluem leite seco, caseína, soro agrupado, plasma agrupado, BSA, PEG-PLL, PEG-silano, SuperBlock ou StarterBlock (Pierce Biotechnology, Rockford, III.), e qualquer combinação de qualquer um dos anteriores.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "agente de marcação" refere-se a um ou mais reagentes que podem ser utilizados para detetar uma molécula alvo que está ligada a um aptâmero num complexo covalente de aptâmero.

Numa forma de realização para a deteção de uma molécula alvo, um complexo covalente de aptâmero é colocado em contacto com um agente de marcação que compreende um parceiro de ligação que é específico para a molécula alvo ligada ao aptâmero. 0 parceiro de ligação específico pode ser qualquer fração adequada, incluindo um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um mimético de anticorpo sintético, um biomimético, um aptâmero, um ligando com impressão molecular, e semelhantes. 0 parceiro de ligação específico é conjugado ou ligado a um outro componente de agente de marcação, geralmente, uma fração ou marcador detetável. A ligação do parceiro de ligação específico ao marcador pode ser efetuada por qualquer um dos métodos acima referidos para a ligação de uma sonda à superfície do suporte sólido. Será apreciado que, no caso de se detetarem várias moléculas alvo, múltiplos complexos covalentes de aptâmero podem ser colocados em contacto com uma mistura de parceiros de ligação específicos, cada um específico para uma molécula alvo que se suspeita estar presente. Os marcadores empregues podem ser aqueles que são conhecidos na técnica para a deteção multiplexada de múltiplas moléculas alvo. A fração ou marcador detetável é capaz de ser detetado direta ou indiretamente. No geral, qualquer molécula repórter que é detetável pode ser um marcador. Os marcadores incluem, por exemplo, (i) moléculas repórter que podem ser detetadas diretamente em virtude da geração de um sinal, (ii) membros de pares de ligação específicos que podem ser detetados indiretamente por subsequente ligação a um cognato que contém uma molécula repórter, (ill) marcadores de massa detetáveis por espectrometria de massa, (iv) iniciadores de oligonucleótidos que podem proporcionar um molde para amplificação ou ligação, e (v) uma sequência de polinucleótido específica ou sequência de reconhecimento que pode atuar como um ligando, tal como, por exemplo, uma proteína repressora, em que nos dois últimos casos, o iniciador de oligonucleótido ou proteína repressora terão, ou serão capazes de ter, uma molécula repórter, e assim por diante. A molécula repórter pode ser um catalisador, tal como uma enzima, um polinucleótido que codifica um catalisador, promotor, corante, molécula fluorescente, pontos quânticos, molécula quimioluminescente, coenzima, substrato enzimático, grupo radioativo, uma pequena molécula orgânica, sequência de polinucleótido amplificável, uma partícula tal como látex ou partícula de carbono, sol metálico, cristalito, lipossoma, célula, etc., que pode ou não ser ainda marcada com um corante, catalisador ou outro grupo detetável, um marcador de massa que altera a massa da molécula com a qual se encontra conjugado para fins de espectrometria de massa, e semelhantes. 0 marcador pode ser selecionado a partir de matérias eletromagnéticos ou eletroquímicos. Numa forma de realização, o marcador detetável é um corante fluorescente. Outros marcadores e sistemas de marcação serão evidentes para um perito na especialidade com base na divulgação do presente documento.

Noutra forma de realização para a deteção de uma molécula alvo, a molécula alvo é uma proteína, e o complexo covalente de aptâmero é colocado em contacto com um agente de marcação que compreende uma coloração de proteína universal. Conforme utilizado no presente documento, "coloração de proteína universal" e "UPS" são utilizados indistintamente para se referirem a qualquer agente de marcação que marca a maioria, se não todas, as proteínas presentes numa amostra de teste com uma fração detetável, mas tende a não marcar ou marca apenas minimamente, ácidos nucleicos ou outros componentes do ensaio, tais como o suporte sólido. Qualquer grupo químico reativo encontrado nas proteínas, mas não encontrado em ácidos nucleicos ou na superfície do substrato, pode servir como um sítio de ligação covalente. Grupos químicos reativos exemplificativos incluem aminas primárias (por exemplo, em resíduos de lisina), tióis (por exemplo, em cisteína, que podem ser produzidos por redução das ligações de dissulfureto), álcoois (por exemplo, em serina, treonina, tirosina e frações de açúcar em glicoproteínas (incluindo os produtos de oxidação de cis-dióis em tais açúcares)), e carboxilatos (por exemplo, em ácido glutâmico e aspártico) . A fração detetável pode incluir qualquer uma das moléculas repórter listadas acima, bem como qualquer outro produto químico ou componente que pode ser utilizado de qualquer modo para gerar um sinal detetável. A fração detetável pode ser detetado através de um sinal fluorescente, um sinal quimioluminescente, ou qualquer outro sinal detetável que depende da identidade da fração. No caso em que a fração detetável seja uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina), o sinal pode ser gerado na presença do substrato enzimático e quaisquer fatores adicionais necessários para a atividade enzimática. No caso em que a porção detetável seja um substrato enzimático, o sinal pode ser gerado na presença da enzima e quaisquer fatores adicionais necessários para a atividade enzimática. Configurações de reagente adequadas para ligar a fração detetável a uma proteína alvo incluem a ligação covalente da fração detetável à proteína alvo, a associação não covalente da fração detetável com outro componente agente de marcação que está covalentemente ligado à proteína alvo, e ligação covalente da fração detetável a um componente agente de marcação que está associado de forma não covalente com a proteína alvo. Colorações de proteínas universais são descritas em detalhe no Pedido de Patente U.S. 2006-0057573 Al, depositado em 12 de agosto de 2004, intitulado "Methods and Reagents for Detecting Target Binding by Nucleic Acid Ligands".

Em algumas formas de realização, a UPS é um reagente químico único que compreende uma fração detetável e que reage de forma covalente com um grupo funcional que é característico de proteínas, mas não de aptâmeros, e, na dita reação, liga de forma covalente a fração detetável a uma proteína alvo. UPSs de acordo com esta forma de realização incluem corantes com grupos capazes de reagir de forma covalente com grupos funcionais que são únicos das proteínas. Tais grupos podem ser adicionados aos corantes por derivatização ou podem estar presentes no corante não modificado. Numa forma de realização, a UPS compreende um corante ativado por N-hidroxisuccinimida que reage com grupos amina, tais como um fluoróforo ativado por N-hidroxisuccinimida, incluindo fluoróforos NHS-Alexa (tais como, por exemplo, NHS-Alexa 647) . Uma outra UPS que pode ser utilizada é CBQCA (3-(4-carboxibenzoil)quinolina-2-carboxaldeido), que também reage com aminas na presença de cianeto ou tióis para formar isoindoles altamente fluorescentes. Outros grupos reativos de amina adequados para utilização em reagentes de UPS incluem isocianatos, isotiocianatos, azidas de acilo, cloretos de sulfonilo, aldeídos, ésteres de 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenol (STP), TFP-Alexa 647, e agentes de arilação como cloreto de NBD (7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol) , fluoreto de NBD e diclorotriaz inas.

Noutras formas de realização, a UPS compreende uma pluralidade de reagentes. Por exemplo a UPS pode compreende um primeiro reagente que reage de forma covalente com uma proteína alvo, e um ou mais reagentes adicionais que se ligam à fração detetável, seja direta ou indiretamente, e seja de forma covalente ou não covalente, à proteína alvo através de um grupo químico ou outra funcionalidade introduzida pelo primeiro reagente. Quando a UPS compreende múltiplos reagentes, será apreciado que em alguns casos os reagentes são adicionados sequencialmente, e noutros casos eles podem ser adicionados simultaneamente.

Noutra forma de realização, uma UPS adequada compreende (a) um derivado de biotina que reage com uma proteína alvo; e (b) um conjugado de fração detetável por estreptavidina, tal como, por exemplo, um derivado de estreptavidina fluorescente ou um conjugado de enzima-estreptavidina. 0 derivado de biotina reage com grupos amina, ligando assim de forma covalente a biotina à proteína alvo; o conjugado de fração detetável por estreptavidina liga-se aos grupos de biotina imobilizados, localizando assim a fração detetável a um ou mais sítios no suporte sólido aos quais a proteína alvo está ligada. Nesta forma de realização, reagentes adequados incluem PFP-biotina, NHS-PE04-biotina (braço de espaçamento de 29 Â) , Sulfo-NHS-LC-biotina (braço de espaçamento de 22,4 Â) e TFP-PE03-biotina (braço de espaçamento de 32,6 Á).

Noutra forma de realização, uma UPS adequada compreende: (a) biotina, ou derivado de biotina, conjugada com um grupo reativo que é capaz de ligar de forma covalente a biotina, ou derivado de biotina, a uma proteína alvo ligada; (b) avidina e/ou estreptavidina; e (c) um conjugado de fração detetável de biotina, tal como, por exemplo, um derivado de biotina fluorescente. 0 derivado de biotina em (a) acima pode ser um derivado de biotina reativo a amina, tal como, por exemplo, NHS-Biotina, em que a biotina é opcionalmente separada de NHS por átomos espaçadores (Calbiochem, Inc.). A reação do grupo NHS com aminas primárias na proteína alvo ligada leva à ligação covalente da biotina à proteína alvo que está ligada ao seu aptâmero correspondente. A proteína alvo complexada com o seu aptâmero correspondente pode depois ser tratada com a estreptavidina ou avidina. Uma vez que a estreptavidina ou avidina se podem ligar a quatro biotinas, a adição destas proteínas proporciona três sítios de ligação para cada biotina originalmente acoplada à proteína alvo ligada pela NHS-biotina. 0 derivado de fração detetável de biotina de (c) acima pode depois ser adicionado, após o qual se liga fortemente aos sítios de ligação de biotina não ocupados na estreptavidina ou avidina. Nesta forma de realização, reagentes adequados incluem PFP-biotina, NHS-PECq-biotina (braço de espaçamento de 29 Á), Sulfo-NHS-LC-biotina (braço de espaçamento de 22,4 Â) e TFP-PECq-biot ina (braço de espaçamento de 32,6 Â).

Considerações tais como a natureza do agente de marcação, a natureza de, e níveis de corte para, as moléculas alvo, a significância biológica dos níveis de alvo específicos, e assim por diante, determinam normalmente a concentração do agente de marcação, incluindo as concentrações individuais dos reagentes particulares que podem ser utilizados. A concentração final de cada dos reagentes irá normalmente ser determinada empiricamente para otimizar a sensibilidade do método. Numa forma de realização, a concentração do agente de marcação é normalmente suficiente para detetar pelo menos cerca de 1% das moléculas alvo. Noutra forma de realização, a concentração do agente de marcação é normalmente suficiente para detetar pelo menos 10% das moléculas alvo. Numa forma de realização adicional, a concentração do agente de marcação é normalmente suficiente para detetar pelo menos cerca de 90% das moléculas alvo. A ativação do agente de marcação depende da natureza dos reagentes utilizados. Por exemplo, para aqueles reagentes que são ativados pela luz, o reagente é irradiado com luz de um comprimento de onde apropriado. Outros métodos de ativação serão sugeridos para os peritos na especialidade em vista das divulgações no presente documento. Para alguns agentes de marcação, tais como agentes de marcação que envolvem um marcador radioativo, uma enzima, e assim por diante, não é necessário qualquer agente de ativação. Para sistemas enzimáticos, a adição de um substrato e/ou cofator pode ser necessária. A análise do suporte sólido para a presença e/ou quantidade do sinal gerado pelo agente de marcação inclui a deteção do sinal, que é geralmente apenas uma etapa, na qual o sinal é lido. O sinal é normalmente lido utilizando um instrumento, cuja natureza depende da natureza do sinal. O instrumento pode ser um espectrofotómetro, fluorómetro, um espectrómetro de absorção, luminómetro, quimioluminómetro, actinómetro, instrumento fotográfico e semelhantes. A presença e/ou quantidade de sinal detetada é relacionada com a presença e quantidade de qualquer molécula alvo presente numa amostra de teste acima de um nível de corte predeterminado. As temperaturas durante as medições geralmente podem variar desde cerca de 10 0 até cerca de 70 °C, ou desde cerca de 20 0 até cerca de 45 °C, ou desde cerca de 20 0 até cerca de 25 °C. Numa abordagem, as curvas padrão são formados utilizando concentrações conhecidas das moléculas alvo a serem testadas. Podem também ser utilizados calibradores e outros controlos.

Numa forma de realização, um suporte sólido, incluindo uma matriz, por exemplo, é transferido para um dispositivo de análise onde a superfície do suporte sólido é interrogado para a presença de quaisquer moléculas alvo ligadas. 0 dispositivo de análise pode ser um dispositivo de varrimento que envolve um sistema ótico. A matriz pode ser examinada ou lida, por exemplo, iluminando a matriz e lendo a localização e a intensidade de um sinal resultante (por exemplo, fluorescência) em cada recurso da matriz. 0 scanner pode ser semelhante a, por exemplo, o scanner TECAN LS 300 disponível a partir de Tecan Systems, San Jose, Califórnia. No entanto, as matrizes podem ser examinadas ou lidas usando métodos ou um aparelho que não os anteriores, com outros métodos de análise de uma matriz incluindo outras técnicas óticas (por exemplo, deteção de marcadores quimioluminescentes ou eletroluminescentes) e técnicas elétricas.

Os resultados gerados a partir de uma análise da matriz podem ser resultados brutos (tais como leituras de intensidade de fluorescência para cada recurso em um ou mais canais de cor) ou podem ser resultados processados, como resultados obtidos ao rejeitar uma leitura para uma recurso que está abaixo de um limiar predeterminado e/ou formando conclusões com base no padrão lido a partir da matriz (por exemplo, se uma molécula alvo particular pode ter estado presente ou não na amostra de teste). Os resultados da análise (processados ou não) podem ser reencaminhados (tal como por comunicação) a uma localização remota, se desejado, e aí recebidos para utilização posterior (tal como processamento adicional).

Noutra forma de realização, o método é levado a cabo sob o controlo de um computador, ou seja, com o auxílio de um computador. Por exemplo, pode ser utilizado um computador pessoal compatível IBM®. O computador é acionado por um software específico para os métodos descritos no presente documento. Hardware de computador capaz de assistir na realização dos métodos divulgados no presente documento pode envolver um sistema que tenha as seguintes especificações: processador Pentium® ou melhor com uma velocidade de relógio de pelo menos 100 MHz, pelo menos 32 megabytes de memória de acesso aleatório (RAM), e pelo menos 80 megabytes de memória virtual, funcionando sob qualquer sistema operativo Microsoft Windows® 95 ou Microsoft Windows NT® 4.0 (ou sucessor do mesmo), por exemplo. O software que pode ser utilizado para realizar os métodos pode ser, por exemplo, Microsoft Excel ou Microsoft Access®, devidamente expandido por meio de funções e modelos escritos pelo utilizador, e ligado quando necessário a programas independentes que podem ser desejados. Exemplos de software ou programas de computador utilizados na assistência na realização dos presentes métodos podem ser escritos em Visual BASIC®, FORTRAN, C, C++, Java, Python, ou qualquer outra linguagem de programação adequada disponível agora ou no futuro. Deve entender-se que a informação do computador acima e o software utilizado no presente documento são apenas exemplificativos e não se destinam a ser restritivos. Qualquer um dos métodos divulgados no presente documento pode ser adaptado a outros computadores, sistemas de computador e software. Outras linguagens que podem ser utilizadas incluem, por exemplo, PASCAL, PERL ou linguagem Assembly.

Noutra forma de realização, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é detetado e/ou quantificado utilizando espectrometria de massa. Com referência à FIG. 1B, num método exemplar para a deteção e/ou quantificação de uma molécula alvo que pode estar presente numa amostra de teste, uma amostra de teste é colocada em contacto com um aptâmero que inclui um marcador e tem uma afinidade específica para uma molécula alvo. É permitido que se forme um complexo de afinidade de aptâmero que inclui um aptâmero ligado à sua molécula alvo. Se a amostra de teste contém a molécula alvo, um complexo de afinidade de aptâmero formar-se-á geralmente na amostra de teste. 0 complexo de afinidade de aptâmero é opcionalmente convertido, utilizando um método apropriado ao aptâmero a ser empregue, num complexo covalente de aptâmero que inclui um aptâmero ligado de forma covalente à sua molécula alvo. 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é ligado a um suporte sólido. A ligação é alcançada colocando em contacto o suporte sólido com o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) e permitindo que o marcador incluído no aptâmero se associe, seja direta ou indiretamente, com uma sonda que está ligada ao suporte sólido. 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) que se associou com a sonda sobre o suporte sólido é então preparado para deteção (e quantificação opcional) utilizando espectrometria de massa. 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) pode ser preparado para a deteção e quantificação opcional por espectrometria de massa usando qualquer um de uma variedade de métodos. Por exemplo, numa forma de realização, quando a molécula alvo é uma proteína, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é preparado por digestão de protéase antes ou após da remoção do complexo a partir do suporte sólido. Noutra forma de realização, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é libertado do suporte sólido e, em seguida, preparado para análise por espectrometria de massa usando qualquer um de uma série de métodos conhecidos na técnica, incluindo ionização de dessorção a laser assistida por matriz (MALDI), ionização de dessorção a laser potenciada de superfície (SELDI), ionização por eletropulverização, ou ionização por impacto de eletrões.

Numa forma de realização, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) pode ser eluído diretamente para um espectrómetro de massa de ionização por eletropulverização. Noutras formas de realização, a amostra de teste eluída pode ser submetida a processamento adicional, tal como, por exemplo, digestão enzimática ou modificação química, antes da análise por espectrometria de massa. Os espectros de massa podem ser obtidos, por exemplo, por ionização por eletropulverização, ionização de dessorção a laser assistida por matriz, ou ionização por impacto de eletrões.

Tipicamente, a quantificação de uma molécula alvo por espectrometria de massa requer um padrão interno, ou seja, um composto de concentração conhecida que é introduzido na amostra de teste que deve ser analisada. Padrões internos ideais terão características de eluição e ionização semelhantes às da molécula alvo, mas irão gerar iões com diferentes razões massa-para-carga. Um padrão interno comum é uma versão marcada com isótopo estável da molécula alvo. Numa forma de realização, uma versão marcada com isótopo estável da molécula alvo é adicionada à amostra de teste, como um padrão interno. Os picos espectrais correspondem aos vários componentes na amostra de teste são depois comparados com a altura ou área do pico do padrão interno e possibilitando assim a quantificação da molécula alvo.

Noutra forma de realização, a quantificação de uma molécula alvo é conseguida através da comparação da altura do pico ou área dos picos espectrais que correspondem à molécula alvo com aqueles picos espectrais gerados a partir de um conjunto de amostras com concentrações conhecidas de uma molécula alvo. As alturas dos picos ou áreas dos picos espectrais, obtidas a partir das amostras que têm concentrações conhecidas da molécula alvo constituem uma curva padrão a partir da qual a concentração desconhecida da molécula alvo na amostra de teste pode ser calculada.

Noutra forma de realização, o complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é detetado e/ou quantificado utilizando Q-PCR. Conforme utilizado no presente documento, "Q-PCR" refere-se a uma reação de PCR realizada de tal modo e sob condições controladas tais que os resultados do ensaio são quantitativos, ou seja, o ensaio é capaz de quantificar a quantidade ou concentração de aptâmero presente na amostra de teste. Com referência à FIG. 1B, num método exemplar para a deteção e/ou quantificação de uma molécula alvo que pode estar presente numa amostra de teste, uma amostra de teste é colocada em contacto com um aptâmero que pode incluir um marcador e tem uma afinidade específica para uma molécula alvo. É permitido que se forme um complexo de afinidade de aptâmero que inclui um aptâmero ligado à sua molécula alvo. Se a amostra de teste contém a molécula alvo, um complexo de afinidade de aptâmero irá no geral formar-se na amostra de teste. 0 complexo de afinidade de aptâmero é opcionalmente convertido, utilizando um método apropriado para o aptâmero a ser empregue, num complexo covalente de aptâmero que inclui um aptâmero ligado de forma covalente à sua molécula alvo. Conforme adicionalmente descrito no presente documento, na sequência da formação de um complexo de afinidade de aptâmero e qualquer conversão opcional num complexo covalente de aptâmero, qualquer aptâmero livre que possa estar presente na amostra de teste é então particionado a partir do complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional). 0 complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é, então, quantificado utilizando técnicas conhecidas para a replicação quantitativa de polinucleótidos.

Numa forma de realização, a quantidade ou a concentração do complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) na amostra de teste é determinada utilizando PCR TaqMan®. Esta técnica baseia-se geralmente na atividade 5'-3' da exonuclease da enzima de replicação de oligonucleótidos para gerar um sinal a partir de uma sequência direcionada. Uma sonda TaqMan é selecionada com base na sequência do aptâmero a ser quantificado e, geralmente, inclui um flúor na extremidade 5', tal como 6-carboxifluoresceina, por exemplo, e um supressor na extremidade 3', tal como, por exemplo, uma 6-carboxitetrametilfluoresceina, para gerar um sinal à medida que a sequência de aptâmero é amplificada utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR). À medida que a polimerase copia a sequência de aptâmero, a atividade da exonuclease liberta o flúor a partir da sonda, que é hibridizado a jusante a partir dos iniciadores de PCR, gerando assim o sinal. 0 sinal aumenta à medida que o produto replicativo é produzido. A quantidade de produto de PCR depende tanto do número de ciclos replicativos realizados, como da concentração de partida do aptâmero.

Noutra forma de realização, a quantidade ou concentração de um complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é determinada utilizando um corante fluorescente intercalante durante o processo replicativo. 0 corante intercalante, tal como, por exemplo, SYBR® Green, gera um grande sinal fluorescente na presença de ADN de cadeia dupla, em comparação com o sinal fluorescente gerado na presença de ADN de cadeia simples. À medida que o produto de ADN de cadeia dupla é formado durante a PCR, o sinal produzido pelo corante aumenta. A magnitude do sinal produzido é dependente tanto do número de ciclos de PCR e da concentração de partida do aptâmero.

Noutra forma de realização, a quantidade ou a concentração do complexo de afinidade de aptâmero (ou complexo covalente de aptâmero opcional) é determinada utilizando um "sinal molecular" (molecular beacon) durante o processo de replicação (veja-se, por exemplo, Tyagi et al., Nat. Biotech. 16:49 53, 1998; o documento de Patente U.S. N.° 5.925.517) . Um sinal molecular é uma sonda de ácido nucleico especifica que se dobra numa ansa em gancho e que contém um flúor numa extremidade e um supressor na outra extremidade da estrutura em gancho de tal modo que pouco ou nenhum sinal é gerado pelo flúor quando a estrutura em gancho se forma. A sequência da ansa é especifica para uma sequência de polinucleótido alvo e, após hibridização com a sequência de aptâmero a estrutura em gancho desenrola-se e gera assim um sinal fluorescente.

Um programa de computador pode ser utilizado para levar a cabo uma ou mais etapas de qualquer um dos métodos divulgados no presente documento. Outro aspeto da presente divulgação é um produto de programa de computador que compreende um meio de armazenamento legível por computador tendo um programa de computador armazenado no mesmo, que quando carregado num computador, executa ou auxilia no desempenho de qualquer um dos métodos divulgados no presente documento.

Um aspeto da divulgação é um produto de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, nomeadamente, um resultado de ensaio, que pode ser avaliado no local do teste ou pode ser enviado para um outro local para avaliação e comunicação para uma parte interessada numa localização remota, se desejado. Conforme utilizado no presente documento, "localização remota" refere-se a uma localização que é fisicamente diferente daquela na qual são obtidos os resultados. Consequentemente, os resultados podem ser enviados para uma sala diferente, um edifício diferente, uma parte diferente de uma cidade, uma cidade diferente e assim por diante. Os dados podem ser transmitidos através de meios convencionais, tais como, por exemplo, fax, correio, entrega noturna, correio eletrónico, ftp, correio de voz e semelhantes. "Comunicar" a informação refere-se à transmissão dos dados que representam essa informação como sinais elétricos ao longo de um canal de comunicação adequado (por exemplo, uma rede privada ou pública). "Reencaminhar" um item refere-se a qualquer meio de conseguir mover o item de uma localização para a seguinte, seja por transporte físico desse item ou de outra forma (onde seja possível) e inclui, pelo menos no caso de dados, transportar fisicamente um meio que carrega os dados ou comunicar os dados.

Com referência à FIG. 3, noutro método exemplificativo para a deteção e/ou quantificação de uma ou mais moléculas alvo que podem estar presentes numa amostra de teste, uma amostra de teste que pode compreender uma molécula alvo e, pelo menos, uma molécula não alvo pode ser opcionalmente colocada em contacto com uma molécula competidora (indicada como Opção A na FIG. 3). Podem formar-se um ou mais complexos não específicos. A amostra de teste é então colocada em contacto com um aptâmero que inclui um marcador e tem afinidade específica para uma molécula alvo. É permitido que se forme um complexo de afinidade de aptâmero que compreende um aptâmero ligado à sua molécula alvo. Se a amostra de teste contém a molécula alvo, um complexo de afinidade de aptâmero formar-se-á geralmente na amostra de teste. Dependendo da natureza da amostra de teste, um ou mais complexos não específicos entre o aptâmero e uma ou mais moléculas não alvo podem também formar-se. Se a amostra de teste foi colocada em contacto com uma molécula competidora, vários complexos não específicos que compreendem o competidor podem também ter-se formado e estar presentes na amostra de teste. A amostra de teste pode então ser opcionalmente exposta a condições que desafiam cineticamente componentes da amostra de teste (indicado como Opção B na FIG. 3). Como descrito adicionalmente abaixo, um desafio cinético pode compreender a diluição da amostra de teste, a introdução de uma molécula competidora à amostra de teste, ou a captura de complexos de afinidade de aptâmero sobre um suporte sólido seguida de lavagem, com ou sem moléculas competidoras presentes na solução de lavagem. Se um desafio cinético é introduzido, não é provável que se formem novamente complexos não específicos entre o aptâmero e quaisquer moléculas não alvo a seguir à dissociação. Uma vez que os complexos não específicos geralmente se dissociam mais rapidamente do que um complexo de afinidade de aptâmero, um desafio cinético reduz a probabilidade de que um aptâmero estará envolvido num complexo não específico com um não alvo. Um desafio cinético eficaz pode fornecer especificidade adicional ao ensaio, além daquela do evento de ligação de aptâmero inicial e da interação covalente subsequente.

Independentemente de se um desafio cinético é empregue, o complexo de afinidade de aptâmero que se formou é depois convertido, utilizando um método apropriado para o aptâmero a ser empregue, num complexo covalente de aptâmero que compreende um aptâmero covalentemente ligado à sua molécula alvo. Após a formação do complexo covalente de aptâmero, qualquer aptâmero livre ou não complexado que possa estar presente na amostra de teste pode ser opcionalmente particionado a partir da amostra de teste (indicado como Opção C na FIG. 3). Opcionalmente, todas as moléculas alvo e não alvo livres ou não complexadas que possam estar presentes na amostra de teste podem ser particionadas a partir da amostra de teste (indicado como Opção D na FIG. 3) . Opcionalmente, tanto o aptâmero livre como as moléculas alvo e não alvo livres podem ser removidos, por qualquer ordem, após a formação do complexo covalente de aptâmero.

Se é utilizada a diluição para introduzir um desafio cinético, a amostra de teste subsequente contendo o complexo covalente de aptâmero é, de preferência, concentrada. Se for o caso, esta concentração pode ser alcançada utilizando métodos descritos abaixo no que diz respeito à partição opcional de quaisquer aptâmeros livres a partir da amostra de teste e/ou a remoção opcional de outros componentes da amostra de teste que podem reagir com o agente de marcação. 0 complexo covalente de aptâmero na amostra de teste é então detetado e/ou quantificado utilizando qualquer um dos métodos descritos no presente documento ou qualquer outro método adequado conhecido de um perito na especialidade. Por exemplo, o complexo covalente de aptâmero pode ser ligado a uma superfície de um suporte sólido através de contacto do suporte sólido com a amostra de teste e permitindo que um marcador no aptâmero se associe, seja direta ou indiretamente, com uma sonda que é imobilizada na superfície do suporte sólido. 0 complexo covalente de aptâmero que se associou com a sonda sobre o suporte sólido é então detetado e opcionalmente quantificado. Em qualquer ponto antes da deteção e quantificação opcional, ou seja, em qualquer altura antes ou após a ligação do complexo de covalente de aptâmero ao suporte sólido, o complexo covalente de aptâmero é colocado em contacto com um agente de marcação para permitir a deteção da molécula alvo ligado. Como um perito na especialidade irá apreciar, o complexo covalente de aptâmero também pode ser detetado e/ou quantificado utilizando espectrometria de massa, Q-PCR ou qualquer outro método adequado conhecido na técnica.

Conforme utilizado no presente documento, "molécula competidora" e "competidor" são utilizados indistintamente para se referirem a qualquer molécula que possa formar um complexo não específico com uma molécula não alvo. Uma "molécula competidora" ou "competidor" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula. "Moléculas competidoras" ou "competidores" referem-se a mais do que um tal conjunto de moléculas. Moléculas competidoras incluem oligonucleótidos, polianiões (por exemplo, heparina, ADN de esperma de salmão de cadeia simples e polidextranos (por exemplo, sulfato de dextrano)), polímeros de fosfodiéster abásicos, dNTPs e pirofosfato. No caso de um desafio cinético que utiliza um competidor, o competidor, também pode ser qualquer molécula que possa formar um complexo não específico com um aptâmero. Tais moléculas competidoras incluem policatiões (por exemplo, espermina, espermidina, polilisina e poliarginina) e aminoácidos (por exemplo, arginina e lisina).

Conforme utilizado no presente documento, "complexo não específico" refere-se a uma associação não covalente entre duas ou mais moléculas que não um aptâmero e a sua molécula alvo. Uma vez que um complexo não específico não é selecionado com base numa interação de afinidade entre as suas moléculas constituintes, mas representa uma interação entre classes de moléculas, as moléculas associadas num complexo não especifico irão exibir, em média, afinidades muito mais baixas umas para as outras e terão uma taxa de dissociação correspondentemente mais elevada do que um aptâmero e a sua molécula alvo. Complexos não específicos incluem complexos formados entre um aptâmero e uma molécula não alvo, um competidor e uma molécula não alvo, um competidor e uma molécula alvo, e uma molécula alvo e uma molécula não alvo.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "desafiado cineticamente" e "desafio cinético" referem-se a um processo de enriquecimento para um complexo de afinidade de aptâmero a partir de um conjunto de complexos que inclui um complexo de afinidade de aptâmero e complexos não específicos, através da aplicação de pressão cinética e fazendo uso das diferentes caracteristicas de afinidade dos constituintes de tais classes de complexos, incluindo taxas de dissociação. Um desafio cinético resulta geralmente num aumento da especificidade, uma vez que os complexos de aptâmero-não alvo são tipicamente reduzidos em comparação com complexos de aptâmero-alvo. Conforme utilizado no presente documento, o termo "pressão cinética" refere-se a um meio para proporcionar uma oportunidade para a dissociação natural de complexos naturais e/ou inibição da religação das moléculas que se dissociam a partir de um complexo naturalmente. A pressão cinética pode ser aplicada através da adição de uma molécula competidora, ou por diluição da amostra, ou por lavagens extensas quando os complexos estão ligados a um suporte sólido, ou por quaisquer outros meios conhecidos para um perito na especialidade. Como um perito na especialidade apreciará, uma vez que um desafio cinético geralmente depende das diferentes taxas de dissociação de complexos de afinidade de aptâmero e complexos de aptâmero-não alvo, a duração do desafio cinético é escolhida de modo a reter uma alta proporção de complexos de afinidade de aptâmero, enquanto reduz substancialmente o número de complexos de aptâmero-não alvo. Para que um desafio cinético seja eficaz, a taxa de dissociação para o complexo de afinidade de aptâmero é, de preferência, significativamente mais baixa do que aquelas para os complexos de aptâmero-não alvo. Uma vez que um aptâmero pode ser selecionado para incluir propriedades particulares, os constituintes de um complexo de afinidade de aptâmero podem ser concebidos para ter uma taxa de dissociação comparativamente baixa.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "partição" refere-se a uma separação ou remoção de uma ou mais espécies moleculares a partir da amostra teste. A partição pode ser utilizada para aumentar a sensibilidade e/ou reduzir o fundo. A partição é mais eficaz a seguir à formação do complexo covalente de aptâmero, quando o complexo de afinidade de aptâmero se torna irreversível devido às ligações covalentes.

Por exemplo, a remoção de aptâmero livre da amostra de teste pode aumentar a sensibilidade do ensaio, uma vez que o aptâmero livre pode competir com um complexo covalente de aptâmero durante a ligação do complexo covalente de aptâmero a uma sonda na superfície do suporte sólido. Ao utilizar QPCR para a deteção e quantificação opcional, a remoção do aptâmero livre facilita a deteção e quantificação da molécula alvo. Numa forma de realização, a molécula alvo é uma proteína e o aptâmero livre é particionado a partir do complexo covalente de aptâmero (e do resto da amostra de teste) utilizando reagentes que precipitam as proteínas, e complexos que incluem proteínas, tais como o complexo covalente de aptâmero, e não ácidos nucleicos livres na amostra de teste. Tais reagentes podem incluir K+/SDS, acetona, (NH4)2S04, ProCipitate, e outros polímeros com carga que são conhecidos na técnica.

Numa forma de realização, um aptâmero, tal como, por exemplo, um fotoaptâmero marcado com uma afinidade especifica para uma molécula alvo, neste caso, uma proteína alvo, é introduzido na amostra de teste. Conforme adicionalmente descrito no presente documento, na sequência da formação de um complexo de afinidade de aptâmero e da conversão num complexo covalente de aptâmero, o complexo covalente aptâmero-proteína e proteína não complexada são precipitados a partir da amostra de teste utilizando um reagente adequado, tal como qualquer um dos reagentes listados acima ou qualquer outro reagente adequado. Os componentes precipitados da amostra de teste são sedimentados por centrifugação e o sobrenadante contendo o aptâmero livre é descartado. 0 sedimento, contendo proteína livre e o complexo covalente de aptâmero-proteína, é então suspenso numa solução adequada, tal como, por exemplo, o diluente de ligação do ensaio, e o complexo covalente de aptâmero pode então ser colocado em contacto com um agente de marcação, antes ou depois da ligação do complexo covalente de aptâmero ao suporte sólido. A molécula alvo, se presente na amostra de teste, é depois detetada e/ou quantificada através de deteção do agente de marcação sobre o complexo covalente de aptâmero.

Para reduzir o fundo do ensaio, as moléculas que são capazes de reagir com o agente de marcação, e que não estão covalentemente ligadas ao aptâmero podem ser removido a partir da amostra de teste. Numa forma de realização, isto é conseguido através da precipitação do aptâmero, tanto livres como complexado, a partir da amostra de teste, deixando outras moléculas que podem reagir com o agente de marcação no sobrenadante a ser descartado. Tal precipitação de ácidos nucleicos pode ser conseguida com reagentes que incluem brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB), brometo de dodeciltrimetilamónio (DTAB), e solventes orgânicos, tais como etanol, por exemplo. Noutra forma de realização, o aptâmero, tanto livre como complexado, é particionado a partir da amostra por hibridização do aptâmero com um suporte sólido. 0 suporte sólido pode, neste caso, incluir microesferas (por exemplo, esferas paramagnéticas), quaisquer outros suportes sólidos adequados descritos no presente documento, e semelhantes. Depois de se permitir que o aptâmero hibridize com a superfície de um suporte sólido adequado, a solução contendo as moléculas que podem reagir com o agente de marcação é facilmente removida, resultando numa concentração do complexo covalente de aptâmero. Como um perito na especialidade apreciará, a partição do aptâmero desta forma pode utilizar quer um marcador incluído no aptâmero como uma outra sequência de ácidos nucleicos no aptâmero para hibridizar o aptâmero com uma sequência de nucleótidos adequadamente complementar ligada ao suporte sólido.

Numa forma de realização, um aptâmero marcado, tal como um fotoaptâmero marcado com uma afinidade específica para uma proteína alvo, é introduzido na amostra de teste. Conforme adicionalmente descrito no presente documento, na sequência da formação de um complexo de afinidade de aptâmero e da conversão num complexo covalente de aptâmero, o complexo covalente de aptâmero-proteína e aptâmero livre são precipitados a partir da amostra de teste utilizando um reagente apropriado, tal como qualquer um dos reagentes listados acima ou qualquer outro reagente adequado. Os componentes precipitados da amostra de teste são sedimentados por centrifugação, e o sobrenadante contendo o alvo não complexado e o restante da amostra de teste é descartado. 0 sedimento, que contém o aptâmero livre e o complexo covalente de aptâmero, é então suspenso numa solução apropriada, tal como, por exemplo, o diluente de ligação do ensaio, e o complexo covalente de aptâmero e aptâmero livre pode então ser colocado em contacto com um agente de marcação seja antes ou depois da ligação do complexo covalente de aptâmero ao suporte sólido. A molécula alvo, se presente na amostra de teste, é então detetada e/ou quantificada através da deteção do agente de marcação no complexo covalente de aptâmero.

Noutra forma de realização, um aptâmero marcado, tal como um fotoaptâmero marcado com uma afinidade específica para uma proteína alvo, é introduzido na amostra de teste. Como adicionalmente descrito no presente documento, na sequência da formação de um complexo de afinidade de aptâmero e a conversão num complexo covalente de aptâmero, o complexo covalente de aptâmero-proteína e aptâmero livre são capturados sobre o suporte sólido utilizando, por exemplo, esferas contendo uma sonda que é complementar ao marcador de aptâmero. As esferas são sedimentadas por força magnética, no caso de esferas paramagnéticas, ou centrifugação para esferas não paramagnéticas e o sobrenadante contendo alvo não complexado e amostra de teste é descartado. 0 sedimento é então suspenso numa solução adequada, tal como, por exemplo, o diluente de ligação do ensaio, e o complexo covalente de aptâmero e aptâmero livre são eluídos utilizando quaisquer meios adequados para interromper a interação de hibridização, incluindo, por exemplo, calor, pH elevado, água destilada, alguma combinação dos mesmos, ou qualquer outro método conhecido. As esferas são novamente sedimentadas e o sobrenadante, contendo o aptâmero livre e o complexo covalente de aptâmero, pode ser colocado em contacto com um agente de marcação, antes ou depois da ligação do complexo covalente de aptâmero ao suporte sólido. A molécula alvo, se presente na amostra de teste, é então detetada e/ou quantificada por deteção do agente de marcação no complexo covalente de aptâmero.

Noutra forma de realização, o ensaio é realizado conforme delineado acima, até e incluindo a etapa em que as esferas são suspensas após o descarte do sobrenadante contendo alvo não complexado e amostra de teste. Depois, antes da eluição do aptâmero livre e complexo covalente de aptâmero a partir das esferas, o complexo covalente de aptâmero pode ser colocado em contacto com um agente de marcação, seguido por sedimentação repetida e lavagem para remover o agente de marcação não reativo antes de contactar o suporte sólido com o complexo covalente de aptâmero para a deteção e/ou quantificação da molécula alvo.

Em qualquer um dos métodos divulgados no presente documento, a amostra de teste pode ser preparada como duas ou mais diluições da amostra de teste, o que pode aumentar o intervalo dinâmico de concentrações em que uma molécula alvo pode estar presente numa amostra de teste e ser sujeita a deteção pelos métodos divulgados no presente documento. As amostras de teste de diluição individuais são testadas separadamente até, e incluindo a formação do complexo covalente de aptâmero, após o que as amostras de teste de diluição podem ser agrupadas para o que resta do ensaio e detetadas em simultâneo num único suporte sólido. Numa forma de realização, cada amostra de teste de diluição inclui um aptâmero único, permitindo assim uma única medição do alvo correspondente. Noutra forma de realização, um aptâmero pode ser adicionado a duas ou mais diluições, cada uma das diluições em contacto com um aptâmero claramente marcado para um alvo em particular, permitindo a deteção de um sinal de aptâmero especifico para cada uma das diferentes amostras de diluição num único suporte sólido. 0 encadeamento de amostras diluídas em conjunto desta maneira pode ampliar um intervalo dinâmico para uma única molécula alvo ao longo de muitas ordens de grandeza e adicionar precisão quando regiões sobrepostas de quantificação levam a determinações múltiplas da concentração de um único alvo.

Numa forma de realização, um conjunto de amostras de teste é preparado como diluições seriadas às quais um aptâmero marcado, tal como um fotoaptâmero marcado com uma afinidade específica para uma molécula alvo, é introduzido. 0 mesmo aptâmero com um marcador diferente pode ser adicionado a cada diluição de amostra de teste. Conforme adicionalmente descrito no presente documento, na sequência da formação de um complexo de afinidade de aptâmero e da conversão num complexo covalente de aptâmero, as amostras de teste individuais podem ser agrupados e colocadas em contacto com um agente de marcação, antes ou depois da ligação do complexo covalente de aptâmero ao suporte sólido. A molécula alvo, se presente na amostra de teste, é então detetada e/ou quantificada por deteção do agente de marcação sobre o complexo covalente de aptâmero. Os sinais resultantes detetados para cada aptâmero tendo um marcador diferente podem ser combinados para quantificar com precisão a quantidade ou a concentração da molécula alvo na amostra de teste original. Por exemplo, a primeira diluição pode resultar num sinal máximo para o alvo, produzindo apenas uma informação semi-quantitativa, enquanto a segunda diluição pode resultar num sinal que é menos do que saturante, permitindo uma quantificação precisa do alvo na amostra de teste original.

Noutra forma de realização, um conjunto de amostras de teste é preparado como diluições seriadas às quais um aptâmero marcado, tal como um fotoaptâmero marcado com uma afinidade especifica para uma molécula alvo, é introduzido. Aptâmeros diferentes tendo marcadores únicos podem ser adicionados a cada diluição da amostra. Conforme adicionalmente descrito no presente documento, na sequência da formação de complexos de afinidade de aptâmero e da conversão em complexos covalentes de aptâmero, as amostras de teste individuais podem ser agrupados e colocadas em contacto com um agente de marcação, antes ou depois da ligação dos complexos covalentes de aptâmero ao suporte sólido. Moléculas alvo presentes na amostra de teste são depois detetadas e/ou quantificadas por deteção do agente de marcação no complexo covalente de aptâmero. Os sinais resultantes podem ser quantificados em relação a intervalos alvo ao longo de muitas ordens de grandeza, dependendo das diferentes diluições seriadas da amostra original.

Em qualquer um dos métodos descritos no presente documento, uma amostra de teste pode ser comparada com uma amostra de referência. Uma "amostra de referência" refere-se, no presente documento, a qualquer material, solução, ou mistura que contém uma pluralidade de moléculas e que se sabe que inclui, pelo menos, uma molécula alvo. A quantidade ou concentração precisa de quaisquer moléculas alvo presentes na amostra de referência pode também ser conhecida. 0 termo amostra de referência inclui amostras biológicas, conforme definido no presente documento, e amostras que podem ser utilizadas para testes ambientais ou toxicológicos, tal como água contaminada ou potencialmente contaminada e efluentes industriais, por exemplo. Uma amostra de referência pode também ser um produto final, ou produto intermediário ou subproduto de um processo de preparação, por exemplo, um processo de fabrico. Uma amostra de referência pode incluir qualquer meio de ensaio, tampão, ou diluente adequado que tenha sido adicionado a um material, solução ou mistura obtida a partir de um organismo ou a partir de alguma outra fonte (por exemplo, do ambiente ou de uma fonte industrial).

Numa forma de realização, uma amostra de referência é tratado separadamente de uma amostra de teste de uma forma idêntica até, mas não incluindo, a exposição ao agente de marcação, o que, apenas nesta forma de realização, deverá ocorrer antes de ligar o complexo covalente de aptâmero ao suporte sólido. Dois agentes de marcação diferentes são utilizados para diferenciar níveis alvo na amostra de referência a partir dos níveis alvo na amostra de teste. Depois das amostras serem colocadas em contacto com o agente de marcação, podem ser misturadas de forma igualada e podem ser colocadas em contacto com o suporte sólido em simultâneo. Uma comparação direta de qualquer expressão diferencial (isto é, uma quantidade ou concentração diferencial do alvo nas amostras) entre a amostra de referência e a amostra de teste é então possível através da medição do sinal de cada agente de marcação separadamente. Os dois agentes de marcação podem incluir um par de Cy3 e Cy5, e um par de Alexa555 e Alexa647. Numa forma de realização, a amostra de referência pode ser uma amostra biológica agrupada representando um grupo de controlo. Noutra forma de realização, a amostra de referência pode ser uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, recolhida num primeiro momento, e a amostra de teste pode ser obtida a partir do mesmo indivíduo, mas recolhida num segundo momento, facilitando assim um estudo longitudinal de um indivíduo através da medição e avaliação de quaisquer mudanças na concentração ou quantidade de uma ou mais moléculas alvo em várias amostras biológicas proporcionadas pelo indivíduo ao longo do tempo.

Numa forma de realização, um aptâmero marcado, tal como um fotoaptâmero marcado com uma afinidade especifica para uma molécula alvo, é introduzido tanto numa amostra de referência e uma amostra de teste. Conforme adicionalmente descrito no presente documento, na sequência da formação de um complexo de afinidade de aptâmero e da conversão num complexo covalente de aptâmero, as duas amostras podem ser colocadas em contacto com dois agentes de marcação distintos, contendo duas moléculas de deteção diferentes. As duas amostras marcadas separadamente contendo o complexo covalente de aptâmero podem, depois, ser ligadas ao suporte sólido. A molécula alvo, se presente em uma ou em ambas as amostras, é então detetada e/ou quantificada através da deteção dos dois agentes de marcação no complexo covalente de aptâmero, tipicamente, através da realização de vários varrimentos a diferentes comprimentos de onda de excitação e de emissão quando o marcador de deteção é um molécula fluorescente, por exemplo. Tal quantificação pode conduzir a uma avaliação mais precisa de quantidades ou concentrações de alvo diferenciais na amostra de referência e na amostra de teste e pode facilitar as comparações entre as diferentes amostras de teste quando a amostra de referência utilizada é a mesma.

Em qualquer um dos métodos divulgados no presente documento, vários agentes de marcação podem ser utilizados para analisar uma amostra de teste única. Numa forma de realização, dois ou mais agentes de marcação, cada um com uma química distinta para a marcação de diferentes frações da molécula alvo e um grupo de deteção opcionalmente diferente, podem ser utilizados com uma amostra de teste única. As diferentes químicas irão marcar grupos funcionais diferentes na molécula alvo a partir dos quais informação adicional pode ser derivada. Por exemplo, no caso de uma proteína alvo, um marcador pode ser ligado ao alvo utilizando química que reage com aminas primárias (por exemplo, lisinas), enquanto um segundo marcador está ligado ao alvo por meio de química que reage com, por exemplo, grupos de hidratos de carbono que estão tipicamente associados com as proteínas glicosiladas. A quantificação relativa destas duas frações na mesma molécula alvo, reconhecida por um aptâmero comum, pode proporcionar informação útil sobre a extensão da glicosilação para esse alvo dentro da amostra de teste.

Numa forma de realização, um aptâmero marcado, tal como um fotoaptâmero marcado com uma afinidade especifica para uma molécula alvo, é introduzido numa amostra de teste. Conforme adicionalmente descrito no presente documento, na sequência da formação de um complexo de afinidade de aptâmero e da conversão num complexo covalente de aptâmero, a amostra de teste pode ser colocada em contacto com dois agentes de marcação distintos, contendo duas moléculas de deteção diferentes, seja antes ou após o contacto do complexo de aptâmero com o suporte sólido. Numa forma de realização, os marcadores de deteção e as químicas são únicas, permitindo a marcação sequencial da mesma amostra de teste contendo um complexo covalente de aptâmero. Noutra forma de realização, as químicas podem ser levadas a cabo simultaneamente numa reação. 0 complexo covalente de aptâmero multiplamente marcado pode então ser detetada e/ou quantificado através da deteção dos dois agentes de marcação no complexo covalente de aptâmero, tipicamente, através da realização de vários varrimentos em diferentes comprimentos de onda de excitação e de emissão quando os marcadores de deteção são moléculas fluorescentes, por exemplo.

Noutra forma de realização, dois ou mais agentes de marcação empregam o mesmo marcador de deteção. 0 ensaio prossegue conforme descrito acima, até e incluindo a conversão num complexo covalente de aptâmero, após a qual a amostra de teste é dividida em tantas alíquotas como quantos agentes de marcação diferentes existirem, e cada alíquota da amostra de teste é colocada em contacto separadamente com um agente de marcação seja antes ou depois da ligação do complexo covalente de aptâmero covalente ao suporte sólido. As alíquotas marcadas separadamente da amostra de teste contendo o complexo covalente de aptâmero podem ser detetadas e/ou quantificadas separadamente.

Qualquer um dos métodos descritos no presente documento podem ser utilizados para realizar uma análise multiplexada de uma amostra de teste. Qualquer tal análise multiplexada pode incluir a utilização de pelo menos dois, pelo menos dezenas, pelo menos centenas, ou pelo menos milhares de aptâmeros para testar simultaneamente um número igual de moléculas alvo numa amostra de teste, tal como uma amostra biológica, por exemplo. Nestas formas de realização, uma pluralidade de aptâmeros marcados, tais como fotoaptâmeros marcados, que têm cada um uma afinidade específica para uma molécula alvo é introduzida na amostra de teste. Conforme adicionalmente descrito no presente documento, na sequência da formação de complexos de afinidade de aptâmero e da conversão em complexos covalentes de aptâmero, os complexos covalentes de aptâmero são ligados a um suporte sólido através de uma pluralidade de sondas correspondentes que estão imobilizadas no suporte sólido. Os complexos covalentes de aptâmero podem ser colocados em contacto com um agente de marcação, seja antes ou depois da ligação dos complexos covalentes de aptâmero ao suporte sólido. Moléculas alvo presentes na amostra de teste são então detetadas e/ou quantificadas através de deteção do agente de marcação no complexo covalente de aptâmero.

Outro aspeto da presente divulgação refere-se a kits úteis para realizar convenientemente qualquer um dos métodos divulgados no presente documento para analisar amostras de teste. Para aumentar a versatilidade da divulgação exposta os reagentes podem ser fornecidos numa combinação embalada, no mesmo ou em recipientes separados, de modo que a razão dos reagentes proporciona a otimização substancial do método e do ensaio. Os reagentes podem, cada um estar em recipientes separados ou vários reagentes podem ser combinados num ou mais recipientes, dependendo da reatividade cruzada e da estabilidade dos reagentes.

Um kit compreende, numa combinação embalada, pelo menos, um aptâmero marcado, um suporte sólido incluindo pelo menos uma sonda e um agente de marcação adequado. 0 kit pode também incluir soluções de lavagem tais como meio aquoso tamponado para a diluição da amostra, bem como a lavagem da matriz, reagentes de preparação de amostras, e assim por diante. As quantidades relativas dos vários reagentes nos kits podem ser amplamente variadas para proporcionar concentrações dos reagentes que otimizam substancialmente as reações que necessitam de ocorrer durante o ensaio e para otimizar ainda mais substancialmente a sensibilidade do ensaio. Sob circunstâncias apropriadas, um ou mais dos reagentes do kit podem ser fornecidos como um pó seco, geralmente liofilizado, incluindo excipientes, que após dissolução proporcionarão uma solução reagente tendo as concentrações adequadas para a realização de um método ou ensaio de acordo com a presente invenção. 0 kit pode ainda incluir uma descrição escrita de um método de acordo com a presente invenção conforme descrito no presente documento.

Numa forma de realização exemplar, um kit para a deteção e/ou quantificação de uma ou mais moléculas alvo que possam estar presentes numa amostra de teste inclui pelo menos um aptâmero possuindo afinidade especifica para uma molécula alvo e que compreende um marcador; um agente de marcação; e um suporte sólido, em que o suporte sólido compreende pelo menos uma sonda disposta sobre o mesmo, e em que a sonda é capaz de se associar com o marcador no aptâmero.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são proporcionados para propósitos ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o âmbito da invenção conforme definido nas reivindicações anexas.

Exemplo 1. Ensaio de Fotoaptâmeros Medindo VEGF Diluído em Série em Tampão e Plasma Utilizando Captura de Hibridização através de Sondas Imobilizadas numa Superfície para Deteção e Quantificação

Este exemplo ilustra as etapas do ensaio conforme ilustrado nas FIGS. 2A, 2B e 2C para um único fotoaptâmero e a sua proteína alvo. 0 ensaio é realizado utilizando duas amostras de teste diferentes, tampão e plasma. A. Preparação de Oligonucleótidos. Um marcador de oligonucleótido de ADN incluído na extremidade 3' do fotoaptâmero foi aqui utilizado. Neste caso, o marcador era a região fixa 3' utilizada durante o protocolo SELEX. 0 fotoaptâmero VEGF 509-80 foi sintetizado utilizando protocolos padrão para síntese de ADN com fosforamidite em fase sólida utilizando um sintetizador convencional. O 5-BrdU contendo fotoaptâmero foi clivado e desprotegido em condições mais moderadas do que aquelas que são padrão na síntese de ADN, usando t-butilamina:metanol:água numa razão de 1:1:2 a 70 °C durante 5 horas, filtrou-se e evaporou-se até à secura. O aptâmero foi purificado utilizando precipitação com etanol seguida por HPLC de fase reversa. As sondas de ADN complementares ao marcador no fotoaptâmero e incluindo um grupo reativo de amina foram sintetizadas conforme descrito acima e clivadas e desprotegidas utilizando protocolos padrão para ADN. As sondas foram purificadas utilizando apenas precipitação com etanol. B. Imobilizção de Sondas de Captura sobre uma Superfície Reativa de Amina. O complemento inverso do marcador de captura foi sintetizado conforme descrito acima com uma amina 5' e acoplada a uma superfície de lâmina amino-reativa compreendida por um substrato de copolímero de olefina cíclica (COC) revestido com um copolímero de metacrilato, conforme adicionalmente descrito no Pedido Internacional Número PCT/CTS2006/008877 (WO 2006/101798), depositado em 14 de março de 2006, intitulado "Polymer Compound for Biomedical Use and Biochip Substrate Using Such a Polymer Compound" e referida no presente documento como a "superfície de copolímero de metacrilato". Micromatrizes de sondas de captura foram impressos sobre a superfície. De forma breve, aminas contendo sondas de captura foram feitas reagir com grupos éster ativos incorporados na superfície. As sondas de captura foram diluídas até 20 μΜ num tampão consistindo em fosfato de sódio a 300 mM, borato de sódio a 25 mM (pH 9,5 a 21 °C), Tween® 20 a 0,01% e 4-dimetilaminopiridina (DMAP) a 1 mM. Sondas de captura foram depositadas em pontos de 250 pL em triplicado na superfície da lâmina numa matriz utilizando um dispositivo de micromatrizes GeneMachines OmniGrid Accent. As lâminas com matrizes foram incubadas a 65% de humidade durante 1 hora à temperatura ambiente seguidas por 65 °C durante 1 hora e, finalmente, durante a noite à temperatura ambiente. Os restantes grupos amino-reativos foram hidrolisados em NaOH a 20 mM durante 5 minutos, seguidos de 10 lavagens com H20 e depois secos sob uma corrente de N2. Antes da utilização, as lâminas foram armazenadas no escuro à temperatura ambiente numa câmara de dessecação. VEGF aptâmero 509-80 foi incubado a uma concentração de 1 nM com VEGF de proteína alvo diluído em série, desde 5 nM até 1,6 pM, em 100 μΐ de diluente de ensaio (lxSB17 (HEPES a 40 mM, NaCl a 102 mM, KC1 a 5 mM, MgCl2 a 5 mM, EDTA a 1 mM), Tween® 20 a 0,1%, BSA a 0,05%, ADN de esperma de arenque a 100 pg/ml) ou em plasma a 10% (plasma a 10% em lxSBl8 (HEPES a 40 mM, NaCl a 102 mM, KC1 a 5 mM, MgCl2 a 5 mM) , ADN de esperma de arenque a 200 mg/ml, Tween® 2 0 a 0,1%) . As amostras foram misturadas suavemente e incubadas a 37 °C durante 30 minutos. As amostras foram irradiadas com 1 joule de luz de 308 nm emitida por um laser excímero (Tui Laser ExciStar S200, comprimento de pulso de 10 ns, 200 Hz, 0,8 mJ por impulso). A coloração foi iniciada pela adição a cada amostra de 1 μΐ de succinimidil-Alexa647 a 10 mg/ml em DMSO. As soluções foram misturadas e feitas reagir durante a noite a 4 °C. A reação de coloração foi extinta por adição de 5 μΐ de BSA a 10% e incubando durante 2 horas. Finalmente, 18 μΐ de NaCl a 5 M e 4,5 μΐ de Triton a 10% foram adicionados a 90 μΐ das amostras de plasma a 10%, e 18 μΐ de NaCl a 5 M e 0,9 μΐ de Triton a 10% foram adicionados a 90 μΐ das amostras de tampão. Uma placa de vedação Grace Proplate foi fixa a uma lâmina contendo as sondas imobilizadas, criando de 16 poços. Cada poço foi incubado durante 15 minutos a 42 °C com 80 μΐ de uma solução composta de 600 μΐ de NaCl a 5 M, 30 μΐ de Triton a 10% e 3 ml de diluente de ensaio. Esta solução foi então removida e substituída com 80 μΐ de amostra. Os poços foram selados com Película Microseal Έ' e a lâmina foi misturada a 600 rpm, 37 °C num Eppendorf Thermomixer R durante 3 horas. As soluções de hibridização foram removidas e os poços lavados três vezes com uma solução composta de SB17, Triton a 0,5%, ADN de esperma de arenque a 100 pg/ml e NaCl a 1 Μ. A placa de vedação foi então removida e a lâmina inteira foi colocada num frasco coletor em 30 ml de uma solução composta de SB17, Triton a 0,5% e NaCl a 1 M durante 30 minutos, seguido por uma lavagem de 2 minutos em lxSB17, Tween® 20 a 0,05%, seguido por uma lavagem em 30 segundos em 0,5xSB17. A lâmina foi seca sob uma corrente de N2 e digitalizada com um scanner fluorescente TECAN LS300 (excitação 633 nm/emissão 670 nm) . A imagem TIF resultante foi analisada com Software ArrayVision de Imaging Research, Inc. para isolar recursos e calcular as suas intensidades médias, utilizando técnicas convencionais de processamento de imagens de micromatrizes.

Os resultados são estabelecidos na FIG. 4 em que os resultados de tampão (FIG. 4A) e plasma (FIG. 4B) foram quantificados conforme descrito acima para a sonda de captura de aptâmero VEGF. A resposta linear para diluição em série em ambos os meios, obtida com subtração do controlo de tampão sem proteína de cada resposta, abrange o intervalo desde 2 pM até 5 nM em concentração de VEGF. Exemplo 2. Ensaio de Fotoaptâmero Utilizando Captura de Hibridização através de Sondas Imobilizadas numa Superfície para Deteção e Quantificação de Múltiplas Proteínas Alvo em Tampão

Este exemplo ilustra as etapas do ensaio conforme ilustrado nas FIGS. 2A, 2B e 2C num formato multiplexado utilizando 10 fotoaptâmeros e as suas proteínas alvo num tampão. A. Preparação de Fotoaptâmero Marcado. Marcadores únicos de oligonucleótido foram atribuídos a cada fotoaptâmero a partir dos complementos inversos de um conjunto de sondas de expressão génica obtidas a partir da Matriz Affymetrix Gene-Chip® Test3. Os fotoaptâmeros marcados foram preparados conforme descrito no Exemplo 1 exceto que o grupo amina foi adicionado à extremidade 5' dos fotoaptâmeros. Antes da utilização, as soluções de aptâmero foram aquecidas até 95 °C durante 3 minutos seguidas de arrefecimento controlado até 37 °C a uma taxa de 0,1 °C por segundo. B. Imobilização de Sondas de Captura sobre uma

Superfície Reativa de Amina. Os complementos reversos dos marcadores de captura foram imobilizados conforme descrito no Exemplo 1, exceto que uma amina 3' foi aqui utilizada para as sondas e Tween® 20 a 0,0025% foi utilizado enquanto DMAP foi eliminado a partir do tampão de impressão. As lâminas impressas foram incubadas a 65 °C durante 2 horas, seguidas de armazenamento durante a noite num dessecador. As lâminas foram em seguida tratadas com uma solução de metoxietil amina (pH 9,5 a 37 °C) para remover sondas não ligadas e consumir o excesso de grupos éster ativos na superfície. 0 ensaio segue o esquema delineado nas FIGS. 2A, 2B e 2C. 0 protocolo básico descrito no Exemplo 1 foi utilizado. No entanto, 41 fotoaptâmeros foram multiplexados e 10 proteínas alvo para um subconjunto destes aptâmeros foram diluídas em série nas amostras. Os pares de proteína:fotoaptâmero quantificados neste exemplo incluem bFGF:6-7, ERBB4:1797-1738, IL-1 R4:1472-3, MCP-3:851-90, PAI-1:1921-52, TIMP-1:90536, tPA:987-51, uPA:1162-70, VEGF:509-80, VEGF sR2:1546-23. 41 fotoaptâmeros, cada um a uma concentração de 2 nM, foram incubados com 6 diluições em série de 10 proteínas alvo e um controlo sem proteína em 100 μΐ de tampão de ensaio (SB 17, Tween® 20 a 0,1%) durante 30 minutos a 37 °C. As amostras foram irradiadas e coradas conforme descrito no Exemplo 1, exceto que 2,1 μΐ de succinimidil-Alexa647 foram utilizados e a reação foi incubada durante 2 horas à temperatura ambiente no escuro. A reação de coloração foi extinta pela adição de 25 μΐ de NaCl a 5 M, 5 μΐ de Triton X-100, 13,5 μΐ de glicina a 100 mM e 1,5 μΐ de ADN de esperma de arenque a 10 mg/ml e incubada durante 40 minutos à temperatura ambiente no escuro, seguida por 2 minutos a 70 °C. Antes da hibridização, as lâminas com placas de vedação com matrizes com sondas de hibridização foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1. A solução de pré-hibridização foi removida e adicionaram-se as amostras de hibridização aos poços e incubou-se a 45 °C durante 2 horas numa câmara húmida. As soluções de hibridização foram removidas e os poços lavados 3 vezes com uma solução de lavagem a 45 °C composta por lxSB17, Triton X-100 a 0,33% e cloridrato de guanidinio a 1 M. As placas de vedação foram em seguida removidas e cada lâmina inteira foi colocada num frasco coletor com o tampão de lavagem durante 20 minutos a 45 °C, seguido por uma lavagem de 2 minutos em lxSB17, Tween® 20 a 0,1%, e uma lavagem final em 0,25xSB17. A lâmina foi seca, digitalizada e quantificada conforme descrito no Exemplo 1. Os resultados são estabelecidos na FIG. 5, que ilustra o sinal gerado a partir do ensaio multiplexado para concentrações de proteína que variam desde 10 pM a 1 nM em tampão para dez proteínas alvo.

Exemplo 3. Ensaio de Fotoaptâmero Utilizando Captura de Hibridização através de Sonda Imobilizadas numa Superfície para Deteção e Quantificação de Múltiplas Proteínas Alvo em Soro

Este exemplo demonstra a utilidade do ensaio, conforme ilustrado nas FIGS. 2A, 2B e 2C num formato multiplexado formato utilizando 57 fotoaptâmeros para medições em amostras de soro. A. Preparação de Fotoaptâmero Marcado._Os fotoaptâmeros marcados foram preparados conforme descrito no Exemplo 2. B. Imobilização de Sondas de Captura numa Superfície Reativa de Amina. Os complementos reversos dos marcadores de captura foram imobilizados conforme descrito no Exemplo 2 .

Os 57 fotoaptâmeros foram divididos em dois conjuntos para multiplexação, um de 27 aptâmeros para alvos pouco abundantes e um de 30 aptâmeros para alvos altamente abundantes em soro ou plasma humano. 14 amostras de soro foram preparadas em duas diluições e misturadas com os dois conjuntos de aptâmeros para dar uma concentração final de 1 nM para cada aptâmero e soro a 10%, 0,9xSBl, Tween® 20 a 0,1%, IghsADN a 50 mg/ml, (BrdU) 30 a 10 mg/ml para o conjunto de 27 aptâmeros e soro a 1%, 0,99xSBl, Tween 20 a 0,1%, IghsADN a 5 mg/ml, (BrdU) 30 a 1 mg/ml para o conjunto de 30 aptâmeros. SB1 é compreendido por HEPES a 40 mM, NaCl a 102 mM, KC1 a 5 mM, MgCl2 a 1 mM e CaCl2 a 1 mM. As amostras foram equilibradas, reticuladas e coradas conforme descrito no Exemplo 2. A reação de coloração foi extinta pela adição de 10 μΐ de BSA baixo em ácidos gordos (FA) a 10%, 25 μΐ de NaCl a 5 nM, 5 μΐ de Triton X100 a 10% e 7 μΐ de glicina a 100 mM e incubou-se durante 40 minutos à temperatura ambiente. Após a extinção, 1,5 μΐ de SDS a 10% foram adicionados e as amostras foram aquecidas até 42 °C durante dois minutos. Lâminas com placas de vedação foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1 e incubadas com lxSBl, Tween® 20 a 0,1%, BSA baixo em FA a 0,66%, NaCl a 830 mM, Triton X-100 a 0,33%, SDS a 0,1%, ADN de esperma de arenque grande 50 mg/ml e (BrdU) 30 a 10 mg/ml durante 15 minutos. O tampão de pré-hibridização foi removido, as amostras coradas adicionadas e incubadas numa câmara húmida a 60 °C durante 2 horas. Após a hibridização, as lâminas foram lavadas, secas, digitalizadas e quantificadas conforme descrito no Exemplo 2. A FIG. 6 mostra os sinais quantificados a partir das imagens digitalizadas para medições replicadas dos 57 fotoaptâmeros para amostras de soro de dois indivíduos. As medições são demonstradas como sendo altamente reprodutíveis, com correlações de Pearson melhores do que 0,99 para medições de aptâmeros entre as amostras replicadas.

Exemplo 4. Desafio Cinético com Diluição em Ensaios de Fotoaptâmeros Utilizando Captura de Hibridização através de Sondas Imobilizadas numa Superfície

Este exemplo ilustra a utilização de duas etapas opcionais no ensaio ilustrado na FIG. 3, um desafio cinético seguido pela remoção da proteína livre. O desafio cinético, alcançado através de diluição, ilustra a perda de complexos não específicos de aptâmero-proteína com retenção dos complexos de afinidade de aptâmero-alvo no plasma. Este exemplo também ilustra a utilização da captura com esferas para concentrar a amostra após diluição e para permitir a remoção da proteína livre antes da coloração. A. Preparação de Fotoaptâmero 987-51 Marcado. 0 fotoaptâmero marcado foi preparado conforme descrito no Exemplo 2. B. Imobilização de Sondas de Captura numa Superfície Reativa de Amina. Os complementos reversos dos marcadores de captura foram imobilizados conforme descrito no Exemplo 2 . 0 fotoaptâmero 987-51 a concentração de 20 nM foi misturado com dois controlos sem proteína e 10 concentrações diluídas em série de proteína alvo tPA tanto em tampão de ensaio (SB17, Tween® 20 a 0,1%) como plasma (plasma a 10% em SB18, Tween® 20 a 0,1%) . Para avaliar a resposta na ausência de um desafio cinético, duas amostras de controlo adicionais foram preparadas em tampão e plasma, uma sem proteína e uma com a concentração de proteína mais elevada. Estas 28 amostras em volumes de 10 μΐ, 14 cada para tampão e plasma, foram incubadas durante 30 minutos a 37 °C. As primeiras 12 amostras tanto em tampão como plasma foram diluídas 50 vezes através da adição de SB17, Tween® 20 a 0,1% e incubadas durante 5 minutos, seguido por irradiação de todas as vinte e oito amostras com 1 J de luz UV (fonte de luz filtrada de lâmpada de Hg OAI). Depois da irradiação, as duas amostras restantes, cada em tampão e plasma foram diluídas 50 vezes conforme descrito acima.

Cada amostra foi ajustada a NaCl a 1 M e incubada a 45 °C durante 90 minutos com 25 pg de esferas paramagnéticas Dynal acopladas a um oligonucleótido complementar com a extremidade 3' do aptâmero 987-51. As amostras foram centrifugadas a 1000 g durante 2 minutos e o sobrenadante removido. As esferas foram lavadas 3 vezes com 100 μΐ de SB17, Tween® 20 a 0,1%. As esferas foram suspensas em bicarbonato de sódio a 100 mM, EDTA a 1 mM, Tween® 20 a 0,02%, corante Alexa647-NHS a 0,2 mg/ml, e agitadas à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de coloração foi removida e substituída com 100 μΐ de SB17, Tween-20 a 0,1%, glicina a 10 mM para extinguir a reação de coloração. As esferas foram, em seguida, lavadas 3 vezes com volumes de 100 μΐ de tampão de lavagem de guanidina (SB17, Tween-20 a 0,1%, Triton-X100 a 0,33%, cloridrato de guanidina a 1 M), suspensas em 70 μΐ de Triton X-100 a 0,33%, sulfato de dextrano a 1 mg/ml e aquecidas a 95 °C durante 5 minutos para eluir os aptâmeros das esferas magnéticas. Lâminas com placas de vedação foram preparadas e pré-hibridizadas conforme descrito no Exemplo 2. 65 ml de cada sobrenadante contendo aptâmeros eluídos foram transferidos para um poço contendo 25 μΐ de NaCl a 3,6 M, HEPES a 144 mM, Triton-X100 a 0,33%. As amostras foram incubadas numa câmara húmida a 45 °C durante a noite e depois lavadas, secas, digitalizadas e quantificadas conforme descrito no Exemplo 2 . A FIG. 7 mostra uma representação gráfica dos resultados em tampão (·) e plasma (A) após diluição de 50 vezes. O sinal obtido a partir das amostras de controlo de proteína sem diluição (o tampão, Δ plasma) encontram-se de acordo com os valores diluídos, indicando uma pequena perda de sinal de alvo durante o alvo cinético. As RFU de plasma sem proteína e sem diluição são 838 RFU (□ a 0,1 pM e 131 RFU (Δ) , resultando numa queda de 84% no sinal, presumivelmente devido à remoção dos complexos não específicos de aptâmero durante o desafio cinético.

Exemplo 5. Desafio Cinético com Competidores em Ensaios de Fotoaptâmeros Utilizando Captura de Hibridização através de Sondas Imobilizadas numa Superfície

Este exemplo ilustra a etapa opcional de introdução de um desafio cinético no ensaio ilustrado na FIG. 3. O desafio cinético, alcançado neste exemplo através da adição de uma molécula competidora, ilustra a perda de complexos não específicos de aptâmero-proteína enquanto mantém os complexos de afinidade de aptâmero-alvo no plasma. A. Preparação de Fotoaptâmero 987-51 Marcado. 0 fotoaptâmero marcado foi preparado conforme descrito no Exemplo 2. B. Imobilização de Sondas de Captura numa Superfície Reativa de Amina. Os complementos reversos dos marcadores de captura foram imobilizados conforme descrito no Exemplo 2 . 0 fotoaptâmero 987-51 a concentração de 20 nM foi misturado com um controlo sem proteína e 6 concentrações diluídas em série de proteína alvo tPA em plasma a 10% diluído em SB18, Tween® 20 a 0,1%. Dois conjuntos de amostras foram preparados para facilitar as comparações entre as amostras e sem adição de competidor. Cada solução foi incubada a 37 °C durante 30 minutos. Após o equilíbrio de 30 minutos, metade de cada amostra de um conjunto foi adicionada ao mesmo volume de competidor dNi5 a 550 μΜ em SB17, Tween® 20 a 0,1% a 37 °C e incubada durante 9 minutos seguida por irradiação conforme descrito no Exemplo 4. Depois da irradiação, SB17, Tween-20 a 0,1% foi adicionado ao conjunto de amostras sem competidor para igualar o volume da adição do competidor. As amostras foram coradas conforme descrito no Exemplo 4 exceto que o tempo de incubação foi de 2 horas. A reação de coloração foi extinta com a adição de 45 μΐ de NaCl a 0,83 M, Triton-X100 a 0,33%, ADN de esperma de arenque grande a 0,1 mg/ml e glicina a 9 mM. As amostras foram misturadas e incubadas no escuro à temperatura ambiente durante 40 minutos, seguidas de aquecimento até 70 °C durante 2 minutos. Lâminas com placas de vedação foram preparadas conforme descrito no Exemplo 2 e incubadas numa solução de SB18, Tween® 20 a 0,1%, Triton-X100 a 0,33% e ADN de esperma de arenque grande a 100 pg/ml. As amostras foram adicionadas a poços das lâminas e incubadas numa câmara húmida a 45 °C durante a noite e depois lavadas, secas, digitalizadas e quantificadas conforme descrito no Exemplo 2 .

Os resultados são mostrados na FIG. 8, onde as curvas de dose resposta para tPA no plasma com e sem a adição do competidor são apresentadas. 0 valor de plasma sem proteína adicionada é reduzido em 70% devido à adição do competidor, enquanto a resposta à concentração de alvo mais elevada é inalterada na presença de competidor.

Exemplo 6. Desafio Cinético com Captura com Esferas e Lavagem de Complexos de Afinidade de Aptâmero em Ensaio de Fotoaptâmero Utilizando Captura de Hibridização através de Sondas Imobilizadas numa Superfície

Este exemplo ilustra a etapa opcional de introdução de um desafio cinético no ensaio ilustrado na FIG. 3. O desafio cinético neste exemplo é alcançado através da captura de complexos de afinidade de aptâmero em esferas e lavagem dos complexos imobilizados de modo que as proteínas alvo dissociadas são removidas antes da reticulação. A. Preparação de Fotoaptâmeros 987-51, 1152-46, e 1920-1 Marcados. Os fotoaptâmeros marcados foram preparados conforme descrito no Exemplo 2. B. Imobilização de Sondas de Captura numa Superfície Reativa de Amina. Os complementos reversos dos marcadores de captura foram imobilizados conforme descrito no Exemplo 2 .

Fotoaptâmeros 987-51, 1152-46, e 1920-1 a uma concentração de 4 nM foram misturados com sondas biotiniladas complementares à sequência de marcador única de cada fotoaptâmero a uma concentração de 8 nM e incubados durante 15 segundos a 95 °C, depois arrefecidos lentamente a 0,1 °C por segundo até 37 °C. Os complexos de fotoaptâmero:sonda biotinidada a uma concentração de fotoaptâmero a 0,2 nM:sonda a 0,4 nM foram misturados com um controlo sem proteína e 6 concentrações diluídas em série de proteínas alvo tPA, PAI-1, e IL-6 em tampão de ensaio (SB17, Tween® 20 a 0,1%) ou plasma (plasma a 10% em SB18, Tween® 20 a 0,1%) . Estas 14 amostras em volumes de 100 μΐ, 7 cada para tampão e plasma, foram incubadas durante 30 minutos a 37 °C, após o que 50 pg de esferas de estreptavidina Dynal MyOne foram adicionadas a cada amostra e incubadas durante 2 minutos a 37 °C com mistura para capturar os complexos não covalentes de fotoaptâmero:sonda biotinidada:proteína. As esferas foram lavadas 3 vezes durante 30 segundos com 100 μΐ de SB17, Tween® 20 a 0,1%, ADN de esperma de arenque a 0,1 mg/ml, suspensas novamente em 100 μΐ do mesmo, e irradiadas com 4 J de luz UV (fonte de luz filtrada de lâmpada de Hg OAI) com mistura.

As esferas foram lavadas uma vez com bicarbonato de sódio a 100 mM, EDTA a 1 mM, Tween® 20 a 0,02%, suspensas novamente em bicarbonato de sódio a 100 mM, EDTA a 1 mM, Tween® 20 a 0,02%, corante Alexa647-NHS a 0,2 mg/ml, e agitadas à temperatura ambiente durante 1 hora. As esferas foram, em seguida, lavadas 3 vezes com 100 μΐ de SB17, Tween-20 a 0,1%, Triton-X100 a 0,33%, cloridrato de guanidina a 1 M, glicina a 25 mM, uma vez com 100 μΐ de SB17, Tween-20 a 0,1%, Triton-X100 a 0,33%, e suspensas em 95 μΐ de HEPES a 40 mM, pH 7,5, Triton X-100 a 0,33% e aquecidas a 70 °C durante 5 minutos para eluir os aptâmeros das esferas magnéticas. Lâminas com placas de vedação foram preparadas e pré-hibridizadas conforme descrito no Exemplo 2. 90 μΐ de cada sobrenadante contendo aptâmeros eluidos foram combinados com 30 μΐ de HEPES a 40 mM, pH 7,5, NaCl a 3 M, Triton-X100 a 0,33%, incubados durante 2 minutos a 70°C, e 110 μΐ de cada foram transferidos para os poços da lâmina. As lâminas foram incubadas numa câmara húmida a 45 °C durante a noite. As amostras foram removidas e lavadas três vezes com 150 μΐ de SB17, Tween-20 a 0,1%, Triton-X100 a 0,33%, cloridrato de guanidina a 1 M a 45 °C. As lâminas com placas de vedação foram desmontadas, colocadas num frasco coletor contendo 30 ml de SB17, Tween-20 a 0,1%, Triton-X100 a 0,33%, cloridrato de guanidina a 1 M, e misturadas por rotação durante 20 minutos a 45 °C. As lâminas foram depois transferidas para um frasco coletor contendo 30 ml de SB17, TWEEN-20 a 0,1% e misturadas por rotação durante 2 minutos a 20 °C, transferidas para um frasco coletor contendo 30 ml de 0,2XSB17, TWEEN-20 a 0,2% durante 15 segundos sem mistura, e secas, digitalizadas, e quantificadas conforme descrito no Exemplo 2. A FIG. 9 mostra a representação gráfica dos resultados para tPA aptâmero 987-51 (FIG. 9A) , PAI-1 aptâmero 1152-46 (FIG. 9B), e IL-6 aptâmero 1920-1 (FIG. 9C) em tampão (·) e plasma (A) . Os valores de RFU foram corrigidos através da substração do valor de RFU do tampão sem proteína para cada aptâmero. Os valores de RFU de plasma sem proteína corrigidos para estes aptâmeros (Δ a 1 pM) são 66, 26, e 49 RFU, respetivamente.

Exemplo 7. Remoção de Fotoaptâmeros Livres no Ensaio de Fotoaptâmeros Utilizando Captura de Hibridização através de Sondas Imobilizadas numa Superfície

Este exemplo ilustra a etapa opcional de remoção de aptâmero livre antes da captura de hibridização na superfície, conforme ilustrado na FIG. 3. O aptâmero livre é removido através da precipitação de proteína e complexos covalentes de aptâmero-proteína por K+/SDS enquanto aptâmero livre permanece na solução. O sobrenadante contendo aptâmero livre é descartado e o sedimento é suspenso para completar a etapa. A. Preparação de Fotoaptâmeros Marcados. O fotoaptâmero marcado foi preparado conforme descrito no Exemplo 2. B. Imobilização de Sondas de Captura numa Superfície Reativa de Amina. Os complementos reversos dos marcadores de captura foram imobilizados conforme descrito no Exemplo 2 .

As reações de ligação foram preparadas em SB18 conforme descrito no Exemplo 1 para conter uma concentração final de 2 nM de fotoaptâmero e proteínas alvo diluídas em série desde 2 nM - 0,64 pM em adição a um controlo sem proteína. As reações foram incubadas a 37 °C durante 30 minutos e irradiadas conforme descrito no Exemplo 1. As amostras foram transferidas para tubos eppendorf de 1,5 ml e 10 μΐ de plasma agrupado foram adicionados. 300 μΐ da seguinte solução SDS foram adicionados a cada amostra: SDS a 1,33%, ARNt a 1,33 pg/ml e HEPES a 10 mM (pH 7,5) (volume final de 400 μΐ) . As amostras foram vigorosamente submetidas a vórtex durante 10 segundos, depois incubadas a 37°C durante 10 minutos. 6 μΐ de KC1 a 2,5 M foram adicionados a cada reação e as amostras foram vigorosamente submetidas a vórtex durante 10 segundos e depois mantidas em gelo durante 10 minutos. Os precipitados foram sedimentados através de centrifugação a 8.000 g durante 5 minutos a 4 °C numa microcentrifugadora. Os sobrenadantes foram descartados. Os sedimentos foram lavados através da adição de KC1 a 200 mM, HEPES a 10 mM (pH 7,5), seguido por mistura suave por vórtex durante 5 segundos. O precipitado foi mais uma vez sedimentado através de centrifugação a 8.000 g durante 5 minutos a 4 °C. Os sobrenadantes lavados foram descartados. Cada sedimento foi suspenso em 200 μΐ de EDTA a 1 mM quente (> 37 °C) , HEPES a 10 mM (pH 7,5).

Esferas paramagnéticas, descritas no Exemplo 4, foram adicionadas a cada amostra e a suspensão de esferas foi misturada vigorosamente a 50 °C durante 30 minutos.

Utilizando um íman de placa de micropoços, as esferas foram lavadas 3 vezes com 100 ml de SB17, tampão de Tween® 20 a 0,1%. As esferas foram suspensas em tampão de carbonato (pH 8,5) contendo 0,2 mg/ml de NHS-Alexa647 amino-reativo e incubadas a 25 °C durante 60 minutos com mistura constante. A reação foi extinta, as esferas foram lavadas, os aptâmeros eluídos e hibridizados conforme descrito no Exemplo 4. As lâminas foram digitalizadas e quantificadas conforme descrito no Exemplo 1. A FIG. 10 mostra os resultados para amostras tratadas com e sem remoção de aptâmero livre. Os sinais são mais elevados quando os aptâmeros complexados são removidos a partir da amostra antes de introduzir a amostra às sondas. Exemplo 8. Geração de Sinal de Ensaio UPS sob Condições que Afetam o Sinal de Complexo de Afinidade de Aptâmero mas não de Complexo Covalente de Aptâmero

Este exemplo demonstra o efeito da ligação não covalente de uma molécula alvo ao seu fotoaptâmero quando detergente e uma concentração salina elevada são utilizados durante a hibridização do complexo de fotoaptâmero com a sua sonda no suporte sólido. Os resultados de um ensaio realizado tanto com e sem reticulação covalente, mediado aqui por fotoativação, são comparados para uma amostra de plasma e uma amostra contendo bFGF em tampão. A. Preparação de Fotoaptâmero 6-7 Marcado. 0 marcador de oligonucleótido aqui utilizado foi a região fixa 3' utilizada durante o protocolo SELEX. O fotoaptâmero bFGF 6-7 foi sintetizado conforme descrito no Exemplo 1. B. Imobilização de Sondas de Captura numa Superfície Reativa de Amina. Os complementos reversos dos marcadores de captura foram imobilizados conforme descrito no Exemplo 1. 6-7 a 1 nM foi preparado em soluções de ligação de tampão e plasma conforme descrito no Exemplo 1. Proteína bFGF a 10 nM foi adicionada à amostra de tampão apenas. As amostras foram misturadas suavemente e incubadas a 37 °C durante 30 minutos. Um conjunto de amostras foi irradiado conforme descrito no Exemplo 1 e um conjunto duplicado de amostras não foi irradiado. As amostras foram depois coradas conforme descrito no Exemplo 1 exceto que o tempo de reação foi de 3 horas à temperatura ambiente seguido pela adição de 10 μΐ de BSA, 25 μΐ de NaCl a 5 M, e 5 μΐ de Triton X-100 a 10% e uma incubação de 2 horas. A lâmina foi preparada como no Exemplo 1 e 80 μΐ de uma solução de pré-hibridização (500 μΐ de NaCl a 5 M e 100 μΐ de Triton a 10% para 2 ml de tampão de amostra) foi adicionada a cada poço durante 15 minutos a 42 °C. A solução de pré-hibridização foi removida e substituída com 80 μΐ de amostra. Os poços foram selados com Película Microseal 'F' e as lâminas foram depois misturadas a 600 rpm, 40 °C num Eppendorf Thermomixer R durante 2 horas, seguido por 20 minutos a 35 °C. Os poços foram lavados duas vezes com lxSB17, Triton a 0,5%, NaCl a 1 M e depois incubados na segunda lavagem durante 15 minutos. Após a hibridização, a lâmina foi tratada conforme descrito no Exemplo 1 exceto que os tempos das 3 lavagens foram de 15 minutos, 2 minutos, e 30 segundos. A lâmina foi seca, digitalizada, e quantificada conforme descrito no Exemplo 1.

Os resultados para bFGF fotoaptâmero 6-7 são apresentados na FIG. 11. Os sinais obtidos para bGFG a 10 nM em tampão e em plasma a 10% verificam-se ser dependentes da luz. O sinal nas amostras sem luz, onde a ligação covalente de alvo a fotoaptâmero não pode ocorrer, são comparáveis com o sinal observado fora de um recurso, designado aqui como "fundo geral". A concentração endógena de bFGF em plasma a 10% é bastante baixa conforme refletido no pequeno sinal no plasma em comparação com a resposta sem luz e de fundo geral.

Exemplo 9. Deteção de C4b Reticulado com um Fotoaptâmero de ADN Compreendido por nucleótidos 5-benzil-dT e 5-bromo-dC em Tampão

Este exemplo ilustra a atividade de fotoaptâmeros contendo nucleótidos modificados no formato de ensaio mostrado nas FIGS. 2A, 2B, e 2C. O fotoaptâmero de ADN (1987-74) para a proteína C4b está composto de nucleótidos 5-benzil-dT e 5-bromo-dC em vez de dT e dC padrão. A. Preparação de Fotoaptâmero 1987-74 Marcado.

Insertos de vetor contendo as sequências de aptâmero foram amplificados a partir de células de E. coli através de iniciadores de PCR específicos para as regiões fixas do aptâmero. 0 iniciador 3' era biotinilado, permitindo a captura do produto de PCR em esferas de estreptavidina MyOne. Depois da lavagem, a cadeia não-biotinilada do dúplex capturado foi removida com uma lavagem com NaOH a 20 mM e os aptâmeros foram criados por extensão de iniciador com um oligonucleótido com um marcador de captura único acoplado à sequência do iniciador 5'. A extensão de iniciador foi realizada com o ADN de molde ainda acoplado à esfera de estreptavidina numa mistura contendo dATP, 5-Br-dCTP, dGTP e 5-benzil-dUTP utilizando ADN-polimerase KOD para incorporar os nucleótidos modificados. Aptâmero foi recolhido a partir das esferas com uma lavagem com NaOH a 20 mM seguida por neutralização com HC1. B. Imobilização de Sondas de Captura sobre uma Superfície Reativa de Amina. Os complementos reversos dos marcadores de captura foram imobilizados conforme descrito no Exemplo 1. 1987-1974 a uma concentração final de 2 nM foi incubado com uma série de diluições de proteína C4b em SB 17, Tween® 20 a 0,1% nas seguintes concentrações: 25 nM, 5 nM, 1 nM, 0,2 nM, 0,04 nM e um controlo sem proteína. As amostras foram equilibradas e irradiadas como no Exemplo 1, após o que 2 μΐ de ADN de esperma de arenque (10 mg/mL) foram adicionados. Proteína C4b foi marcada por fluorescência através da adição de 7,5 μΐ de NHS-Alexa-647 (1,33 mg/ml em DMSO) a cada amostra e incubada durante 2 horas à temperatura ambiente. 25 μΐ de NaCl a 5 M, 5 μΐ de Triton-100 a 10% e 1 μΐ de glicina a 100 mM foram adicionados para extinguir marcador que não reagiu, romper interações não covalentes e facilitar a hibridação subsequente. Lâminas com placas de vedação foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1 e incubadas com uma solução contendo SB17, Tween® 20 a 0,1%, NaCl a 0,8 M, ADN de esperma de arenque a 20 mg/ml e Triton X-100 a 0,33% durante 15 minutos a 42 °C. Depois de se remover a solução, 80 μΐ de amostra marcada foram adicionados à lâmina, uma por sub-matriz, e incubadas durante 30 minutos a 42 °C numa plataforma rotatória. As amostras foram removidas e os substratos foram lavados duas vezes com a solução de pré-hibridização, uma vez com solução de pré-hibridização, sem ADN de esperma de arenque ou Tween® 20, uma vez com lxSB17, Tween® 20 a 0,1% e uma vez com 0,25xSB17. As lâminas foram depois secas, digitalizadas e quantificadas conforme descrito no Exemplo 1. A FIG. 12 mostra a curva de dose resposta resultante de 1987-1974 obtida como uma função da concentração de alvo, que ilustra a atividade de aptâmeros de nucleótidos modificados no ensaio.

Exemplo 10. Ensaio de Captura de Hibridização UPS em Duas Superfície Diferentes Utilizando Dois Métodos de Coloração Independentes

Este exemplo demonstra a funcionalidade do ensaio em duas superfícies de composição diferente, a superfície de copolímero de metacrilato dos exemplos anteriores e uma superfície reativa de amina Schott Nexterion sobre um substrato de vidro. Além disso, a reação de coloração da proteína alvo é realizada tal como nos exemplos anteriores através de ligação direta de Alexa-647 à proteína alvo ou marcando primeiro a proteína alvo com biotina seguida de marcação com estreptavidina-Alexa-647. O ensaio permite a deteção quantitativa de proteína VEGF em tampão utilizando qualquer superfície ou método de coloração. A. Preparação de Fotoaptâmero 509-80 Marcado. Os fotoaptâmeros marcados foram preparados conforme descrito no Exemplo 1. B. A imobilização de Sondas de Captura sobre Superfície Reativa de Amina. A sonda de captura com uma amina 5' foi sintetizada como descrito no Exemplo 1 e imobilizada em ambas as superficies. A imobilização na lâmina Schott Nexterion foi conseguida dissolvendo a sonda em 40 ou 20 μΜ num tampão composto por fosfato de sódio a 300 mM (pH 8,5), Tween® 20 a 0,005% e sarcosilo a 0,001%. As sondas de captura foram depositadas conforme descrito no Exemplo 1. Após a deposição das sondas, as lâminas foram incubadas durante a noite numa caixa seca e, em seguida, incubadas com bicarbonato de sódio a 100 mM (pH 8,5) e Tween® 20 a 0,1% durante 8 horas à temperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas com água 10 vezes e secas sob uma corrente de N2. A sonda de captura foi imobilizada na superfície do copolímero de metacrilato pelo protocolo descrito no Exemplo 1. VEGF aptâmero 509-80 foi incubado a uma concentração de 1 nM num volume de 100 μΐ com 6 concentrações de VEGF diluídas em série, a partir de 50 nM a 16 pM, e um controlo sem proteína em diluente de ensaio (SB 17, Tween® 20 a 0,1%, BSA a 0,05%, ADN de esperma de arenque a 100 pg/ml). As amostras foram misturadas suavemente e incubadas a 37 °C durante 15 minutos, seguidas por irradiação, conforme descrito no Exemplo 1. As amostras foram divididas e coradas diretamente com NHS-Alexa-647 ou por reação com NHS-PECh-biotina e subsequentemente coradas com estreptavidina Alexa-647. Para a coloração com NHS-Alexa-647, utilizou-se o procedimento do Exemplo 1, exceto que a reação foi à temperatura ambiente durante 4 horas. Para a reação com NHS-PECh-biot ina, 1 μΐ NHS-PE04-biot ina a 20 mM dissolvido em DMSO foi adicionado a 100 μΐ de amostra. A solução foi misturada e incubada à temperatura ambiente durante 4 horas. Ambas as reações de coloração foram extintas através da adição de 23 μΐ de NaCl a 5 M, 11,4 μΐ de BSA a 10% e 1,1 μΐ de Triton X-100 a 10% e deixadas a incubar durante 2 horas.

As duas lâminas diferentes foram cobertas com placas de vedação conforme descrito no Exemplo 1 e pré-hibridizadas com lxSB17, Triton-X100 a 0,1%, BSA a 0,5% e ADNhs a 100 pg/ml durante 15 minutos a 42 °C. A solução foi depois removida e substituído com 80 μΐ de amostra. Os poços foram selados com Película Microseal Έ' e as lâminas misturadas a 600 rpm, 42 °C num Eppendorf Thermomixer R durante 3 horas, seguido por 1 hora a 34 °C. Para as amostras marcadas diretamente com NHS-Alexa-647, os poços foram lavados 3 vezes com lxSB17, Triton a 0,5% e NaCl a 1 Μ. A placa de vedação foi removida a lâmina inteira foi colocada num frasco coletor em 30 ml de SB 17, Triton a 0,5%, NaCl a 1 M durante 30 minutos, seguido por uma lavagem de 2 minutos em lxSB17, Tween® 20 a 0,1%, seguido por uma lavagem de 20 segundos em 0,25xSB17. Para as amostras que tinham sido feitas reagir com NHS-PECq-biotina, os poços foram lavados 3 vezes com lxSB17, Tween® 20 a 0,1%, NaCl a 0,5 M, ADN de esperma de arenque a 100 yg/ml, BSA (tampão de coloração de estreptavidina) a 0,5%. Uma solução de 4 pg/ml de estreptavidina Alexa-647 foi preparada em tampão de coloração de estreptavidina e 80 μΐ desta solução foram adicionados a cada poço durante 15 minutos a 37 °C. Os poços foram depois lavados três vezes com lxSB17, Tween® 20 a 0,1%. A placa de vedação foi removida e a lâmina inteira foi colocada num frasco coletor de 30 ml em lxSB17, Tween® 20 a 0,1% durante 30 minutos, seguido de uma lavagem de 20 segundos em 0.25xSB17. As lâminas foram secas, digitalizadas e quantificadas conforme descrito no Exemplo 1. A FIG. 13 apresenta os resultados para a superfície

Schott Nexterion (Fig. 13A) e de copolímero de metacrilato (Fig. 13B) para a dose resposta em função da concentração proteica. Ambas as superfícies fornecem resultados quantitativos semelhantes, demonstrando a independência da superfície do ensaio. As duas estratégias de coloração são também vistas como sendo comparativamente eficazes.

Exemplo 11. Deteção de Proteínas Alvo VEGF e bFGF em Tampão e Soro através de Captura de Hibridização das Proteínas Fotorreticuladas numa Matriz Affymetrix GeneChip® Test3 numa Superfície de Quartzo Revestida

Este exemplo demonstra a utilidade de uma outra superfície, uma Matriz Affymetrix GeneChip® Test3 (superfície de vidro de quartzo), para a etapa de captura de hibridização do ensaio. Os ensaios foram executados em ambos soro e tampão. A. Síntese de Fotoaptâmeros 509-80 e 6-7 Marcados. Os complementos reversos das duas sondas designadas 201 e 1121 na Matriz Affymetrix GeneChip® Test3 foram atribuídas aos aptâmeros 509-80 e 6-7 e preparados conforme descrito no Exemplo 1. B. Imobilização de Sondas de Captura sobre Superfície Reativa de Amina. Uma Matriz GeneChip® Test3 foi comprada de Affymetrix com sondas que foram sintetizadas in situ.

Um volume de 100 μΐ de VEGF aptâmero 509-80 e bFGF aptâmero 6-7, cada um a uma concentração de 2 nM, foi preparado com proteína VEGF e bFGF a 20 nM em diluente de ensaio (lxSB17, Tween® 20 a 0,1%, BSA a 0,02%, ADN de esperma de arenque a 100 pg/ml). As amostras foram misturadas suavemente e incubadas a 37 °C durante 60 minutos e depois irradiadas e coradas com NHS-PECq-biotina conforme descrito no Exemplo 9, exceto que o tempo de reação foi de 1 hora. A reação foi extinta pela adição de 10 μΐ de BSA a 10%, 1 μΐ de ADN de esperma de arenque a 10 mg/ml, 5 μΐ de Triton X-100 a 10% e 25 μΐ de NaCl a 5 M. 10 μΐ de soro foi adicionado a uma amostra para aproximar uma amostra de soro a 10%.

Matrizes GeneChip® Test3 de Affymetrix foram incubadas com 100 μΐ de uma solução constituída por 100 μΐ de diluente de ensaio, 10 μΐ de BSA a 10%, 1 μΐ de ADN de esperma de arenque a 10 mg/ml, 25 μΐ de NaCl a 5 M, 5 μΐ de Triton X-100 a 10% e 7 μΐ de DMSO durante uma hora a 45 °C, após o que 100 μΐ de amostra foram adicionados à câmara da Matriz Test3 e incubados durante 60 minutos a 45 °C, depois lavados com um tampão composto por lxSBl, Triton X-100 a 0,5% e NaCl a 1 M. As matrizes foram depois colocadas na estação fluidica Affymetrix GeneChip®, que realizou os procedimentos de lavagem e coloração padrão de Affymetrix. As matrizes foram depois lidas e quantificadas no scanner Affymetrix. Os resultados são estabelecidos na FIG. 14. Em tampão (FIG. 14A) o aptâmero VEGF hibridiza com a sonda 201 (denotada 1 na figura) com uma intensidade de 3500 RFU e o aptâmero bFGF hibridiza com a sonda 1121 (denotada 2 na figura) com uma intensidade de 23000 RGU. No soro (FIG. 14B) as intensidades relativas são 5000 (1) e 18000 (2) para os aptâmeros VEGF e bFGF.

Exemplo 12. Passivação de Superfície de uma Matriz Affymetrix GeneChip® Test3 numa Superfície de Quartzo Revestida através de Pré-Bloqueio com Leite Desnatado, Superblock ou Plasma Não Corado

Este exemplo ilustra a passivação de superfície à adsorção de soro e plasma numa Matriz Affymetrix Gene-Chip Test3 através de bloqueio com leite desnatado, Superblock, ou plasma não corado. A. Preparação de Oligonucleótidos biotinilados.

Oligonulceótidos biotinilados que hibridizam com três sondas diferentes imobilizadas na Matriz GeneChip® Test3, denotadas 201, 1121, e 108, foram sintetizadas conforme descrito no Exemplo 1. B. Biotinilação de Plasma. 160 μΐ de NHS-PE04-biotin a 21 mM foram adicionados a 100 ml de plasma a 10% em lxSB18, Tween® 20 a 0,1% e a solução foi deixada a reagir durante 2 horas e depois extinta com a adição de 1 ml de glicina a 100 mM (pH 7,5). O plasma biotinilado foi armazenado a -20 °C. 0 tampão de controlo é compreendido por 0,75xSB 17, BSA a 0,1%, ADN de esperma de arenque a 100 pg/ml, Tween® 20 a 0,1% e NaCl a 0,8 M. Plasma biotinilado a 10% foi preparado com o tampão de controlo e plasma biotinilado. O plasma foi pré-tratado através da adição de 50 μΐ de Triton X—10 0 a 10%, 10 μΐ de SDS a 10% e 10 μΐ de ADN de esperma de arenque a 10 mg/ml a 1 ml de plasma biotinilado a 10%, aquecimento até 95 °C durante 10 minutos e depois adição de 200 μΐ de NaCl a 5 Μ. 1 μΐ de mistura de sonda biotinilada lOOOx foi adicionado a 1 ml de ambos tampão de controlo e plasma a 10%.

Quatro Matrizes Affymetrix Test3 foram incubadas com lxSBl7, BSA a 1%, Triton-XlOO a 0,4%, SDS a 0,1%, NaCl a 1 M e ADN de esperma de arenque a 100 pg/ml. A Matriz B foi bloqueada com uma solução de leite desnatado a 2% (Nestle Carnation, INSTANT NONFAT DRY MILK) suspensa em PBS, SDS a 0,1% e 0,4%. A Matriz C foi bloqueada com uma solução de StarterBlock (PIERCE), SDS a 0,1% e 0,4%. A Matriz D foi bloqueada com uma solução de plasma agrupado a 10%, SDS a 0,1% e Triton X-100 a 0,4%. Cada solução de bloqueio foi aquecida até 95 °C durante 10 minutos e deixada a arrefecer até à temperatura ambiente antes da adição à matriz. Cada matriz Test3 foi bloqueada com 100 μΐ da respetiva solução de bloqueio durante 1,5 horas a 45 °C. 100 μΐ de amostra foram depois adicionados a cada matriz. A matriz A recebeu o tampão de controlo com sondas e as Matrizes B, C, e D receberam o plasma a 10% com sondas. As matrizes foram incubadas a 45 °C durante 45 minutos.

As matrizes foram depois lavadas com lxSB17, Triton-XlOO a 0,4%, SDS a 0,1%, NaCl a 1 M, BSA a 1% fluindo 1 ml de solução de lavagem através da câmara, permitindo que a matriz incube durante 5 minutos, depois fluindo outro 1 ml através da câmara e, finalmente, substituindo os 100 μΐ finais de lavagem com 100 μΐ de lavagem nova. Este procedimento foi realizado 3 vezes. As matrizes foram incubadas durante aproximadamente 1 hora antes de serem colocadas na estação fluídica Affymetrix GeneChip® e lidas no scanner Affymetrix.

Os resultados são estabelecidos nas FIGS. 15A-D. 0 fundo geral nas quatro matrizes foi 40, 300, 400 e 500 RFU, enquanto as três sondas biotiniladas medem -17.000, -34000 e 18000 nas matrizes.

Exemplo 13. Deteção de Proteínas Alvo através de Captura de Hibridização de Proteínas Reticuladas numa Matriz GeneChip® Test3 Pré-Bloqueada com Leite Desnatado

Este exemplo ilustra a captura de hibridização de proteínas alvo IL-1 R4 e bFGF numa Matriz Affymetrix GeneChip® Test3 em superfícies de vidro revestidas bloqueadas com leite desnatado. A. Síntese de Fotoaptâmeros 1472-3 e 6-7 Marcados. Os complementos reversos de duas sondas denotadas 1364 e 1121 na Matriz Affymetrix GeneChip® Test3 foram atribuídos aos aptâmeros 1472-3 e 6-7 e sintetizados conforme descrito no Exemplo 1.

Quatro soluções, cada uma contendo uma concentração de 2 nM de cada aptâmero 1472-3 e 6-7, foram preparadas em plasma a 10% para dar as seguintes concentrações finais para os pares de proteínas (IL-1 R4, bFGF): (0,0), (1 nM, 30 pM) , (100 pM, 1 nM) , e (10 pM, 100 pM) . O diluente de plasma continha 0,9xSB18, ADN de esperma de arenque a 100 mg/ml, (BrdU) 30 a 5 mg/ml, Tween® 20 a 0,1% e plasma a 10%. As amostras foram incubadas a 37 °C durante 30 minutos e irradiadas conforme descrito no Exemplo 1. 1 μΐ de NHS-PE04-biotina a 5 mg/ml em DMSO foi adicionado a cada amostra e incubado durante 2 horas à temperatura ambiente, depois do que 2 μΐ de glicina a 100 mM (pH 7,5), 1 μΐ de SDS a 10% e 5 μΐ de Triton X-100 a 10% foram adicionados. As amostras foram depois aquecidas até 95 °C durante 10 minutos, deixadas a arrefecer até à temperatura ambiente e extintas com a adição de 10 μΐ de BSA a 10% e 25 μΐ de NaCl a 5 Μ. 1 μΐ de sonda-108 100x foi depois adicionado como uma sequência de controlo.

Quatro Matrizes Test3 foram bloqueadas durante 3 horas a 45 °C com a solução de leite em pó desnatado descrita no Exemplo 11 para a Matriz B. As matrizes foram depois lavadas com PBS, SDS a 0,1% e Triton X-100 a 0,4% e depois incubadas com lxSB17, BSA a 1%, Triton X-100 a 0,5%, SDS a 0,1%, NaCl a 1 M e ADN de esperma de arenque a 0,1 mg/ml durante 20 minutos a 45 °C. 100 μΐ de cada amostra foram depois adicionados a uma matriz separada. As matrizes foram incubadas a 45 °C durante 45 minutos. O ensaio foi depois completado conforme descrito no Exemplo 12. Os resultados são apresentados na FIG. 16, onde doses respostas lineares são observadas para ambos alvos no plasma.

Exemplo 14. Deteção de Proteínas Complexo C5,6, Neurotropina-3 e Troponina I através de Captura de Hibridização das proteínas Fotorreticuladas em Microesferas Luminex SeroMap™

Este exemplo demonstra a utilização de microesferas Luminex SeroMap™ como um suporte sólido para detetar e opcionalmente quantificar uma molécula alvo que pode estar presente numa amostra de teste. Estes ensaios foram realizados com proteínas alvo adicionadas em tampão. O instrumento de deteção foi um sistema de instrumento Luminex 100 IS.

Sondas terminadas em amina atribuídas aos fotoaptâmeros 2184-64 (aptâmero complexo C5b,6), 2273-34 (aptâmero neuroptropina-3), e 2338-12 (aptâmero Troponina I) foram conjugadas com microesferas SeroMap™ funcionalizadas com -COOH utilizando química de EDC (cloridrato de l-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida).

Fotoaptâmeros 2184-64, 2273-34, e 23338-12, numa concentração final de 2 nM cada, foram pré-hibridizados com oligonucleótidos complementares com as extremidades 3' dos aptâmeros e depois combinados com uma mistura das proteínas complexo C5b,6, neurotropina-3, e troponina I num intervalo de concentrações (169 fM a 3,33 nM) em tampão SB17, Tween® 20 a 0,05%. Amostras de ensaio de controlo sem proteína duplicadas foram também preparadas. Estas amostras de ensaio, em volumes de 100 μΐ, foram incubadas a 37 °C durante 15 minutos e depois fotorreticuladas. Esferas de Estreptavidina Dynal MyOne (400 pg) foram adicionadas a cada amostra de ensaio e incubadas durante 10 minutos a 25 °C com mistura para capturar os híbridos de fotoaptâmero:oligo biotinilado e proteína-fotoaptâmero:oligo biotinilado. As esferas foram lavadas 2 vezes durante 30 segundos cada com 100 μΐ de bicarbonato de sódio a 100 mM, EDTA a 1 mM, Tween® 20 a 0,02%, e D-biotina a 10 mM (pH 8,5) . O propósito do componente de D-biotina deste tampão era o de saturar sítios de ligação de estreptavidina livres. As esferas lavadas foram suspensas em 100 ml de bicarbonato de sódio a 10 mM (pH 8,5), 1 mM de EDTA, Tween® 20 a 0,02%, e sulf o-NHS-LC-biot ina a 150 μΜ (Pierce Biotechnology) para o propósito de marcação da proteína alvo conjugada com fotoaptâmero com biotina. Esta reação de biotinilação foi incubada a 25 °C durante 1 hora com mistura constante. As esferas foram depois lavadas 3 vezes com 100 μΐ de SB 17, cloridrato de guanidina a 3,14 M, Tween® 20 a 0,05% seguido por lavagem 2 vezes com 100 μΐ de SB 17, Triton-X100 a 0,33%. As esferas lavadas foram suspensas em 100 μΐ de D-biotina a 10 μΜ, Tween® 20 a 0,05%, HEPES a 10 mM, pH 7,5 depois aquecidas a 70 °C durante 5 minutos para libertar os fotoaptâmeros dos seus oligonucleótidos biotinilados complementares ligados às esferas. Para cada amostra de ensaio, 75 μΐ do volume de eluato de esferas foi combinado com 25 μΐ do seguinte tampão com alto teor de sal: NaCl a 4 M, Tween® 20 a 0,4%, Tris-Cl a 160 mM, pH 8,0. SDS (11,25 μΐ de 20%) foi adicionado e cada amostra de ensaio foi transferida para uma mistura de 30 μΐ das microesferas SeroMap™ conjugadas com sondas apropriadas (1500 esferas codificadas por cor por sonda, Tween® 20 a 0,1%, NaCl a 1 M, BSA a 1,25%, Tris-C1 a 40 mM, pH 8,0) . Para promover a hibridização dos fotoaptâmeros às sondas conjugadas com microesferas, as amostras de ensaio foram incubadas a 65 °C durante 2 horas com mistura constante. Enquanto a 65 °C, as amostras de teste foram transferidas para uma placa de filtração a vácuo de microtitulação de 96 poços e as microesferas foram lavadas 4 vezes com NaCl a 200 mM, Tween® 20 a 0,1%, Tris-C1 a 40 mM (pH 8,0) a 65 °C. As microesferas foram depois suspensas em 80 μΐ de NaCl a 200 mM, Tween® 20 a 0,1%, Tris-Cl a 40 mM, (pH 8,0) e transferidas para uma placa de microtitulação de 96 poços. 20 μΐ de estreptavidina-R-ficoeritrina (Molecular Probes # S866) a 10 pg/ml foram adicionados para permitir a deteção das proteínas alvo biotiniladas reticuladas com fotoaptâmero. A seguir a uma incubação de 15 minutos a 37 °C, as amostras de ensaio foram sujeitas a um protocolo de quantificação de sinal (R-ficoeritrina) de instrumento Luminex padrão. A FIG. 17 representa graficamente os resultados para o fotoaptâmero complexo C5b, 6 2184-64 (FIG. 17A) , fotoaptâmero neurotropina-3 2273-34 (FIG. 17B), e fotoaptâmero troponina I 2338-12 (FIG. 17C). Os valores de IFM (intensidade de fluorescência média) foram corrigidos através da subtração do valor de IFM do controlo sem proteína para cada aptâmero. O acima exposto descreve a invenção com referência a várias formas de realização e exemplos. Nenhuma forma de realização ou exemplo particular, ou elemento de uma forma de realização ou exemplo particular deve ser interpretado como um elemento ou característica crítica, necessária, ou essencial de qualquer das reivindicações. Além disso, nenhum elemento descrito no presente documento é necessário para a prática da invenção, a menos que expressamente descrito como "essencial" ou "critico".

Será apreciado que várias modificações e substituições podem ser feitas às formas de realização divulgadas sem se afastarem do âmbito da invenção conforme estabelecido nas reivindicações abaixo. A memória descritiva, incluindo as figuras e exemplos, deve ser considerada de uma forma ilustrativa, em vez de restritiva, e todas as tais modificações e substituições destinam-se a ser incluídas dentro do âmbito da invenção. Consequentemente, o âmbito da invenção deve ser determinado pelas reivindicações anexas e os seus equivalentes legais, em vez de pelos exemplos dados acima.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 5475096 A [0003] [0028] [0029] • US 6242246 B [0003] • US 6458543 B [0003] • US 6503715 B [0003] • US 6544776 B [0004] • US 5763177 A [0004] [0048] • US 6001577 A [0004] [0048] • US 6291184 B [0004] [0048] • US 6458539 B [0004] [0048] • US 20030219801 A [0007] • US 20020037506 A [0009] • US 20050142582 A [0011] • US 5210015 A [0016] • US 5705337 A [0029] • US 6376190 B [0059] • US 20030218130 A [0069] • US 20050147994 A [0069] • US 2005005908 A [0069] • US 20060057573 AI [0084] • US 5925517 A [0103] • US 2006008877 W [0138] • WO 2006101798 A [0138]

Documentos de não patente citados na descrição • KIRBY et al. Anal. Chem, 2004, vol. 76, 4066-4075 [0008] • BALDRICH et al. Anal. Chem., 2004, vol. 76, 7053-7063 [0010] • SEKIYA et al. In vitro selection of RNA aptamers against cellular and abnormal isoform of mouse prion protein. Nucleic Acids Symposium Series, 01 September 2005, vol. 49 (1), 361-362 [0012] • SAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [0018] • DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I-II [0018] • Oligonucleotide Synthesis [0018] • Nucleic Acid Hybridization [0018] • Transcription and Translation [0018] • TYAGI et al. Nat. Biotech., 1998, vol. 16, 49-53 [0103]

Lisboa, 28 de Maio de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a deteção de uma molécula alvo que pode estar presente numa amostra de teste, o método que compreende: (a) contactar uma amostra de teste com um aptâmero que tem uma afinidade específica para a molécula alvo, em que o complexo de afinidade de aptâmero é formado pela interação de um aptâmero com a sua molécula alvo, se a dita molécula alvo está presente na dita amostra de teste, em que o complexo de afinidade de aptâmero é um complexo não covalente formado pela interação de um aptâmero com a sua molécula alvo; (b) após a formação do complexo de afinidade de aptâmero na etapa (a) , introduzir uma molécula competidora na amostra de teste e/ou capturar o complexo de afinidade de aptâmero num suporte sólido seguido por lavagem com uma solução com uma molécula competidora presente na solução, a molécula competidora sendo selecionada a partir de um oligonucleótido, um polianião, um polidextrano ou dNTPs; e (c) detetar e/ou quantificar o aptâmero do complexo de afinidade de aptâmero ou o complexo covalente de aptâmero particionado a partir do restante da amostra de teste.
2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito competidor é um polianião.
3. 0 método de acordo com a reivindicação 2, em que o polianião é sulfato de dextrano.
4. 0 método de acordo com a reivindicação 2, em que o dito polianião é heparina ou polidextrano.
5. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o dito aptâmero é um ácido nucleico de cadeia simples ou um ácido nucleico de cadeia dupla.
6. 0 método de acordo com a reivindicação 5, em que o dito aptâmero é ADN ou ARN.
7. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que a dita molécula alvo é selecionada a partir do grupo que consiste numa proteína, um hidrato de carbono, um polissacarídeo, uma glicoproteína, uma hormona, um recetor, um antigénio, um anticorpo, um vírus, um substrato, um metabolito, um cofator, um inibidor, um fármaco, um corante, um nutriente, um fator de crescimento e um tecido.
8. 0 método de acordo com a reivindicação 7, em que a dita molécula alvo é uma proteína.
9. 0 método de acordo com a reivindicação 8, em que a dita proteína é uma glicoproteína.
10. O método de acordo com a reivindicação 8, em que a dita proteína é um recetor ou um anticorpo.
11. O método de acordo com a reivindicação 7, em que a dita molécula alvo é um hidrato de carbono.
12. O método de acordo com a reivindicação 11, em que o dito hidrato de carbono é um polissacarídeo.
13. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a dita amostra de teste é uma amostra biológica selecionada a partir do grupo que consiste em sangue total, leucócitos, células mononucleares do sangue periférico, plasma, soro, expetoração, respiração, urina, sémen, saliva, fluido de meninges, fluido amniótico, fluido glandular, fluido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, fluido sinovial, aspirado articular, células, um extrato celular, fezes, tecido, uma biópsia de tecido e fluido cerebrospinal.
14. 0 método de acordo com a reivindicação 13, em que a dita amostra de teste é uma amostra biológica de células.
15. 0 método de acordo com a reivindicação 14, em que as ditas células são leucócitos ou células mononucleares do sangue periférico. Lisboa, 28 de Maio de 2015