PT1968948E - Novo sal de sulfato de hidrogénio - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"NOVO SAL DE SULFATO DE HIDROGÉNIO" ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Âmbito da Invenção A presente invenção refere-se a um novo sal e, mais particularmente, a um novo sal de (2-hidroxi-etoxi)amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H- benzoimidazol-5-carboxílico (a seguir referido como "Composto 1") , que é um inibidor MEK, útil no tratamento e/ou profilaxia de doenças proliferativas, como o cancro, num mamífero. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 e a processos para a preparação do referido sal. Também são fornecidas composições farmacêuticas contendo um sal de sulfato de hidrogénio do composto 1, e a utilização do sal no fabrico de medicamentos para o tratamento e/ou profilaxia de doenças proliferativas, como o cancro, no corpo humano ou animal, e métodos de tratamento de doenças proliferativas, como o cancro, num mamífero, por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um sal de sulfato de hidrogénio do composto 1.

Descrição do estado da técnica A sinalização celular através de receptores dos factores de crescimento e proteínas quinases é um regulador importante do crescimento, proliferação e diferenciação celulares. No crescimento normal das células, os factores de crescimento, através da activação do receptor (ou seja, PDGF ou EGF e outros), activam as vias de MAP quinase. Uma das mais 1 importantes e mais bem compreendida vias de MAP quinase envolvida no crescimento celular normal e descontrolado é a Ras/Raf quinase. GTP ativos ligados a Ras resultam na ativação e fosforilação indireta de Raf quinase. Assim, Raf fosforila MEK1 e 2 em dois residuos de serina (S218 e S222 para MEK1 e S222 e S226 para a MEK2) (Ahn et al. , Methods in Enzymology, 2001, 332:417-431). Então MEK ativado fosforila apenas os seus substratos conhecidos, a MAP quinase ERK1 e 2. A fosforilação de ERK pela MEK ocorre em Y204 e T202 para ERK1 e Y185 e T183 para a ERK2 (Ahn et al., Methods in Enzymology 2001, 332:417-431). A ERK fosforilada dimeriza e, em seguida, transloca-se para o núcleo, onde se acumula (Khokhlatchev et al., Cell 1998, 93:605-615). No núcleo, a ERK está envolvida em várias funções celulares importantes, incluindo mas não se limitando ao transporte nuclear, à transdução de sinal, à reparação do ADN, à montagem dos nucleossomas e à translocação e processamento e tradução de mRNA (Ann et al, Molecular Cell, 2000, 6: 1343-1354) . Em geral, o tratamento de células com factores de crescimento conduz à activação de ERK1 e 2 o que resulta na proliferação e, em alguns casos, na diferenciação (Lewis et al. Adv. Câncer Res., 1998, 74: 49-139).

Nas doenças proliferativas, mutações genéticas e/ou sobre-expressão dos receptores de factores de crescimento, proteínas de sinalização a jusante, ou proteínas quinases envolvidas na via de ERK da quinase levam à proliferação celular descontrolada e, eventualmente, à formação do tumor. Por exemplo, alguns cancros contêm mutações que resultam na activação contínua desta via devido à produção contínua de factores de crescimento. Outras mutações podem levar a defeitos na desativação do complexo ativado Ras-GTP, o que resulta, mais uma vez, na ativação da via da MAP 2 quinase. Foram encontrados mutantes, formas oncogénicas da Ras em 50% dos cancros do cólon e > 90% do pâncreas, bem como em muitos outros tipos de cancros (Kohl et al., Science, 1993, 260:1834-1837). Recentemente, foram identificadas mutações bRaf em mais de 60% dos melanomas (Davies, H. et al., Nature 2002, 417:949-954). Estas mutações bRaf resultadam numa cascata de MAP quinase constitutivamente ativa. Estudos de amostras de tumor primárias e linhas celulares monstraram também via da MAP quinase constitutiva ou a sobreactivação em cancros do pâncreas, cólon, pulmão, ovário e rim (Hoshino, R. et al. Oncogene 1999, 18:813-822). Deste modo, existe uma forte correlação entre os cancros e uma via de MAP quinase hiperactiva resultante de mutações genéticas.

Tal como a cascata de MAP quinase constitutiva ou sobreactivada desempenha um papel fundamental na proliferação e diferenciação celular, acredita-se que a inibição desta via para ser benéfica em doenças hiperproliferativas. MEK é um factor chave neste caminho, pois está a jusante de Ras e Raf. Além disso, é um alvo terapêutico atraente porque os únicos substratos conhecidos para fosforilação MEK são as MAP quinases, ERK1 e 2. Tem sido mostrado, em vários estudos, que a inibição MEK tem um potencial terapêutico beneficio. Por exemplo, os inibidores MEK de pequenas moléculas têm demonstrado inibir o crescimento de tumores humanos em xenoenxertos de ratinho, (Sebolt-Leopold et al, Nature Medicine, 1999, 5 (7) :810-816; Trachet et al, AACR April 6-10, 2002, Póster #5426; Tecle, H., IBC 2nd International Conference of Protein Kinases, September 9-10, 2002), bloquear a alodinia estática em animais (WO 01/05390) e inibir o crescimento de células de leucemia mielóide aguda (Milella et al., J. clin. Invest. 2001, 108 (6) :851-859) . 3

Foram divulgados os pequenos inibidores da molécula MEK. Pelo menos treze pedidos de patente apareceram nos últimos anos: US 5.525.625, WO 98/43960, WO 99/01421, WO 99/01426, WO 00/41505, WO 00/42002, WO 00/42003, WO 00/41994, WO 00/42022, WO 00/42029, WO 00/68201, WO 01/68619 e WO 02/06213.

Os inibidores MEK também estão descritos no documento WO 03/077914. A (2-hidroxi-etoxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico, ou "Composto 1", é exemplificada no documento WO 03/077914 e possui a seguinte fórmula estrutural:

H

Composto 1

Tem sido demonstrado que o composto 1 possui actividade inibidora de MEK e, por conseguinte, são úteis no tratamento de uma doença hiperproliferativa tal como o cancro. O documento WO 03/077914 descreve, em termos gerais, certos sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos ai revelados. É especificamente, afirmado no documento WO 03/077914 que os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos aqui revelados, que possuem uma porção suficientemente básica podem formar sais de adição de ácidos que contêm aniões farmaceuticamente aceitáveis, e 4 são listados uma variedade de tais aniões. Do mesmo modo, os sais adequados de compostos que possuem uma porção ácida são formados através do tratamento de um composto com um composto básico e, particularmente uma base inorgânica. A forma de um composto farmaceuticamente activo, que é usado em medicamentos, é apropriadamente um que proporciona propriedades de manuseamento razoáveis, que permitam que seja processado e formulado. No entanto, também é necessário assegurar que as propriedades biológicas da formulação final, tais como a taxa de dissolução dos comprimidos e a biodisponibilidade do ingrediente activo, sejam optimizadas, o que compromete, frequentemente, a selecção de uma forma particular que melhor satisfaz todos estes requisitos. No entanto, em alguns casos, os sais não se formam facilmente e/ou não são estáveis, o que é provavelmente devido aos baixos valores pKa. 0 valor de pKa expressa a força de ácidos e de bases, isto é, a tendência de um ácido para perder um protão, ou de uma base receber um protão (Bronsted JN, Rec. Trav. Chim. (1923) 47:718).

Isto é particularmente verdadeiro para o Composto 1.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um sal de sulfato de hidrogénio (1:1 medicamento: H2S04) do Composto 1 e as suas várias formas, todas incluídas dentro do âmbito da invenção. 0 sal pode ser de várias formas, todas incluídas dentro do âmbito da invenção. Estas formas incluem formas anidras assim como os solvatadas. Uma outra forma pode ser produzida por desolvatação dos solvatados. Numa forma de realização particular do sal este está na forma anidra.

Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de utilização de um sal de sulfato de hidrogénio do 5 composto 1 como um medicamento para tratar uma doença ou condição hiperproliferativa.

Um aspecto adicional da invenção é a utilização de um sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição hiperproliferativa.

Outras vantagens e novas características da presente invenção serão apresentadas na descrição que se segue, e irão tornar-se em parte evidentes para os especialistas na técnica após leitura da especificação seguinte ou podem ser aprendidas pela da prática da invenção. As vantagens da invenção podem ser realizadas e atingidas por meio dos instrumentos, combinações, composições, e métodos particularmente apontados nas reivindicações em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Os desenhos anexos, que são incorporados neste documento e constituem uma parte da especificação, ilustram formas de realização não limitativas da presente invenção, e, em conjunto com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.

Nas Figuras: A Figura 1 mostra o XRPD do sal de sulfato de hidrogénio do composto 1; A Figura 2 mostra o espectro de infravermelhos do sal de sulfato de hidrogénio do Composto 1 obtido através da técnica de amostragem DRIFTS; e A Figura 3 mostra os resultados dos níveis de concentração do Composto 1 no plasma após a administração de doses de 6 equivalentes orais de 150 mg de dispersão livre de base de um Composto 1 (x) e do sal de sulfato de hidrogénio, a cães em jejum (A) .

DESCRIÇÃO DETALHADA

Será feita agora referência, em detalhe, a certas formas de realização da invenção, cujos exemplos são ilustrados nas estruturas e fórmulas anexas. Enquanto a invenção será descrita em conjunto com as formas de realização enumeradas, faz-se observar que essas formas de realização não se destinam a limitar a invenção. Pelo contrário, a invenção destina-se a cobrir todas as alternativas, modificações e equivalentes, que podem ser incluídas dentro do âmbito da presente invenção tal como definido pelas reivindicações. Um especialista na técnica irá reconhecer que muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos podem ser utilizados na prática da presente invenção. A presente invenção não está limitada aos métodos e materiais descritos. No caso em que uma ou mais literatura incorporada, patentes, e materiais semelhantes ou diferes contrariarem esta aplicação, incluindo, mas não limitado a, o uso de termos definidos prazo, as técnicas descritas, ou similares, são definidos por esta aplicação. A presente invenção proporciona um sal de sulfato de hidrogénio (1:1 medicamento: H2S04) do Composto 1 e as suas várias formas, todas incluídas dentro do âmbito da invenção. O sal pode ser de várias formas, todas incluídas dentro do âmbito da invenção. Estas formas incluem formas anidras assim como solvatadas. Uma outra forma pode ser produzida por desolvatação das formas solvatadas. Numa concretização particular, o sal é o sal de sulfato de hidrogénio anidro de composto 1. Além disso, a presente 7 invenção proporciona uma forma do sal de sulfato de hidrogénio do Composto 1, que apresenta propriedades físicas e farmacêuticas únicas que o tornam particularmente apropriado para uso em medicamentos.

Em certas formas de realização, os sais do Composto 1 são cristalinos. Os sais cristalinos são melhores do que a base livre em termos das suas propriedades de manuseamento do ponto de vista de fabrico, nomeadamente nas suas propriedades estáticas e de fluxo. A formação de sais pode proporcionar um meio de purificação, como as impurezas do processo podem ser separadas e os sais são geralmente mais fáceis de isolar do que a base livre.

Numa forma de realização da invenção, o sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 é um sal cristalino, que foi possui surpreendentemente propriedades farmacêuticas melhoradas, quando comparado com a base livre do composto 1 e com outras formas de sal do Composto 1. Em particular, verificou-se que a taxa de dissolução deste sal cristalino, bem como a sua biodisponibilidade é particularmente elevada quando comparada com a base livre e os outros sais, tal como ilustrado nos exemplos que se seguem. Tem sido mostrado que a biodisponibilidade aumentada do sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 em relação à base livre é independente da formulação utilizada para a administração. A biodisponibilidade da base livre e das formas de sulfato de hidrogénio tenham sido até aqui comparadas quando administradas nas mesmas formulações de dispersão, mas foram também observados diferenças semelhantes na biodisponibilidade para as formulações de comprimidos simples.

Quando é referido que a presente invenção se refere a um sal do Composto 1, que é um sal cristalino, o grau de cristalinidade é convenientemente maior do que cerca de 60%, mais convenientemente superior a cerca de 80%, de preferência superior a cerca 90% e mais preferencialmente superior a cerca de 95%. Mais preferivelmente, o grau de cristalinidade é maior do que cerca de 98%. O grau de biodisponibilidade aumentada oferecido pelo sal de sulfato de hidrogénio é, surpreendente e particularmente útil, uma vez que a base livre do composto 1 tem sido classificada como um composto de classe 4 BCS. Os compostos de classe 4 BCS possuem, normalmente, baixa biodisponibilidade devido à baixa taxa de dissolução e de permeabilidade, e a limitação da permeabilidade da absorção significa não seria normalmente esperado que esses sais exerçam um impacto substancial na absorção (Ver, por exemplo, Dressman et al. (2001) Pharm Tech. July: 68).

Os solventes adequados do sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 são formados a partir de uma vasta gama de solventes, em especial solventes orgânicos tais como tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo (ACN), etanol (EtOH) e metanol (MeOH). Os solventes orgânicos adequados incluem ésteres tais como ésteres alquilicos em Ci-6, por exemplo acetato de etilo, e as cetonas, tais como cetonas alquilicas em Ci-6, , por exemplo metil-etil-cetona (2-butanona). A preparação do sal pode ser efectuada por reacção de uma suspensão do Composto 1 num solvente orgânico e água, com ácido sulfúrico. Para a preparação de um sal 1:1 é utilizado cerca de 1 equivalente de ácido sulfúrico. Assim, num outro aspecto, a invenção proporciona um método para a 9 preparação de um sal de sulfato de hidrogénio do composto 1, o referido método compreende: (i) a reacção de uma suspensão do Composto 1 num líquido orgânico e água, com cerca de 1 equivalente de ácido sulfúrico; (ii) a recuperação do sal da solução resultante, e (iii) depois disso, se desejado ou necessário, a formação um seu solvatado. A proporção molar da quantidade de ácido sulfúrico para o Composto 1 está, adequadamente, na gama de 1,00:1 a 2:1, por exemplo numa gama de 1,05:1 a 1,15:1. O ácido sulfúrico é utilizado, adequadamente, na forma de ácido sulfúrico concentrado. Numa forma de realização particular, a proporção molar de ácido sulfúrico para o Composto 1 é 1,10:1,0.

Adequadamente, a quantidade de água adicionada no passo (i) é limitada à necessária para assegurar que o sal é formado. As quantidades exactas utilizadas dependerão da natureza particular do solvente, da concentração do ácido sulfúrico, etc, mas normalmente, a água estará presente numa quantidade inferior a 20% v/v do total do líquido presente, por exemplo 13-17% v/v

Numa concretização particular, o solvente orgânico utilizado no passo (i) é a 2-butanona (metil-etil-cetona) , a água é aproximadamente 15% do volume de líquido, e a quantidade total de líquido usado em relação ao Composto 1 é aproximadamente 8 mL por grama de Composto 1.

De modo adequado, a adição de ácido sulfúrico no passo (i) é realizada de uma maneira controlada, por exemplo a uma temperatura inferior a 10 °C, e o restante do passo (i) é 10 então levado a cabo a temperatura elevada, por exemplo 30-90 °C, ou como exemplo adicional numa gama entre 55-75 °C, e como exemplo adicional a cerca de 65 °C.

Os líquidos orgânicos adequados incluem solventes orgânicos, em que o Composto 1 e os seus sais são pouco solúveis. Tal como aqui utilizada, a expressão "fracamente solúvel" significa ter uma solubilidade inferior a 100 mL de solvente por grama de soluto, por exemplo, entre 30 e 100 ml de solvente por grama de soluto. Estes solventes incluem cetonas alquilicas, por exemplo cetonas alquilicas em Ci-6, tais como 2-butanona, álcoois, tais como álcoois em em Ci_6, por exemplo metanol ou etanol, e ésteres tais como ésteres alquilicos em Ci_6, por exemplo, o acetato de etilo. Numa concretização, o solvente orgânico é a metil-etil-cetona (2-butanona).

De forma vantajosa, a mistura reaccional é filtrada entre os passos (i) e (ii) para remover qualquer material estranho. O resíduo é, opcionalmente, lavado, por exemplo com uma mistura de água e do líquido orgânico, e o sal desejado cristalizado a partir do filtrado, o que pode, opcionalmente, ser combinado com a solução de lavagem.

Em certas formas de realização, o sal de sulfato de hidrogénio é recuperado no passo (ii) por arrefecimento da mistura reaccional, com a adição opcional de mais líquido orgânico, de modo que o sal de sulfato de hidrogénio seja precipitado. O líquido orgânico adicional pode ser o mesmo líquido orgânico, tal como utilizado no passo (i), ou pode ser um líquido orgânico diferente, desde que actue como um anti-solvente para o sal de sulfato de hidrogénio do composto 1. A solução de formação dos cristais de sal de 11 sulfato de hidrogénio do composto 1 pode ser útil para o processo de precipitação.

Numa forma de realização, antes do arrefecimento, o filtrado é submetido primeiro a um passo de destilação para remover a água e para assegurar que o sal é recuperado com um rendimento aceitável. Numa forma de realização particular, o solvente é a 2-butanona, e o filtrado é destilado à pressão atmosférica.

Durante o arrefecimento, o sal pode ser recuperado a partir da suspensão resultante, por exemplo, por filtração. 0 material recuperado pode então ser seco, por exemplo, a temperatura elevada, por exemplo entre 40-60 °C, e como outro exemplo, a cerca de 50 °C, até ser atingido peso constante. Se o produto é solvatado com o líquido orgânico, tal como metanol, pode ser des-solvatado, nesta altura, se desejado, por meio de aquecimento.

Foram investigados as propriedades físicas do sal de sulfato de hidrogénio e estão descritas mais à frente nos Exemplos. A invenção inclui também compostos marcados isotopicamente, os quais são idênticos aos citados na presente invenção, mas com um ou mais átomos substituídos por um átomo tendo uma massa atómica ou número de massa diferente da massa atómica ou número de massa normalmente encontrado na natureza. Os oxemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos da invenção incluem isótopos de hidrogénio, carbono, azoto, oxigénio, fósforo, enxofre, flúor e cloro, tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 31P, 32P, 35S, 18F e 36C1, respectivamente. O sal de sulfato de hidrogénio do Composto 1 e os polimorfos destes que contêm 12 os isótopos acima mencionados e/ou outros isótopos de outros átomos estão dentro do âmbito deste invenção. Certos compostos da presente invenção marcados isotopicamente, por exemplo aqueles nos quais são incorporados isótopos O "I Λ ^ y % , radioactivos tais como He C, sao uteis em medicamentos e/ou ensaios de distribuição de tecido de substrato. Os isótopos tritiados, isto é, com 3H e com carbono-14, isto é, isótopos 14C, são particular e amplamente utilizados dada a sua facilidade de preparação e detectabilidade. Além disso, a substituição com isótopos mais pesados tais como deutério, isto é, 2H, pode produzir certas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo tempo de meia vida aumentado in vivo ou necessidade de dosagem reduzida, pelo que pode ser utilizado, em algumas circunstâncias particulares. Os sais isotopicamente marcados, da presente invenção, podem ser preparados geralmente realizando os procedimentos revelados em WO 03/077914, substituindo durante a preparação um reagente facilmente disponível marcado isotopicamente por um reagente não isotopicamente marcado, ou se desejado, utilizando um ácido sulfúrico isotopicamente na preparação do sal. A composição pode estar numa forma adequada para administração oral (por exemplo como comprimidos, pastilhas, cápsulas duras ou moles, emulsões, pós dispersáveis ou grânulos, xaropes, elixires ou suspensões aquosas ou oleosas preparadas extemporaneamente), para administração por inalação (por exemplo como um pó finamente dividido ou um aerossol líquido), para administração por insuflação (por exemplo como um pó finamente dividido), para injecção parentérica (por exemplo como uma solução estéril, suspensão ou emulsão para injecção intravenosa, subcutânea, intramuscular, intravascular ou a dosagem de infusão), por administração 13 tópica (por exemplo como cremes, pomadas, géis, soluções ou suspensões oleosas ou suspensões aquosas preparadas extemporaneamente) ou para administração por via rectal (por exemplo como um supositório) . Numa forma de realização, o sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 é administrado por via oral. Em geral, as composições acima podem ser preparadas de um modo convencional utilizando os excipientes convencionais. A quantidade do composto activo administrado será dependente do sujeito a ser tratado, da gravidade da desordem ou condição, da taxa de administração, da disposição do composto e do critério do médico prescritor. No entanto, uma dosagem eficaz está na gama de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg por kg de peso corporal por dia, de preferência cerca de 1 a cerca de 35 mg / kg / dia, em doses únicas ou divididas. Para um humano de 70 kg, isto significaria cerca de 0,7-7000 mg / dia, de preferência cerca de 70 a cerca de 2500 mg / dia. Em alguns casos, podem ser mais adequados níveis de dosagem abaixo do limite inferior da gama anteriormente mencionada, enquanto em outros casos podem ser empregues doses ainda maiores sem causar qualquer efeito secundário prejudicial, desde que tais doses maiores sejam primeiro divididas em várias doses mais pequenas para administração ao longo do dia. Uma forma de dosagem unitária tal como um comprimido ou cápsula irá normalmente conter, por exemplo, 1-1000 mg de ingrediente activo, e preferencialmente 5-420 mg de ingrediente activo. De preferência é empregue uma dose diária na gama de 0,03-6 mg/kg.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção é proporcionado um sal de sulfato de hidrogénio de um composto, tal como aqui definido, para uso num método 14 terapêutico de tratamento ou de profilaxia do corpo humano ou animal. Uma outra caracteristica da presente invenção é o sal de sulfato de hidrogénio do composto 1, tal como aqui definido para utilização como um medicamento. Num outro aspecto, a presente invenção proporciona o sal sulfato de hidrogénio do composto 1, tal como aqui definido, para utilização como um medicamento para o tratamento de estados de doença mediados por MEK, em particular distúrbios proliferativos ou crescimento celular anormal, tal como cancro, mamífero de sangue quente tal como um humano. Por conseguinte, um aspecto adicional do invenção proporciona a utilização de sal de sulfato de hidrogénio de um composto 1, como aqui definido, no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento de estados patológicos mediados através de MEK, em particular distúrbios proliferativos ou crescimento celular anormal, tal como o cancro, num mamífero de sangue quente tal como um humano.

De acordo com uma caracteristica adicional da invenção é proporcionado um método para o tratamento de estados de doença mediados por MEK, em particular distúrbios proliferativos ou crescimento celular anormal, tal como cancro, num mamífero de sangue quente, tal como um humano, com necessidade de tal tratamento que compreende a administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz de um sal de sulfato de hidrogénio de um de sal de sulfato de hidrogénio do Composto 1, ou de uma composição farmacêutica tal como aqui definida.

Os exemplos particulares de doenças proliferativas que podem ser tratadas utilizando os seus sais ou as composições da invenção, incluem as desordens hiperproliferativas num mamífero. Os cancros particulares 15 são do cérebro, pulmão, células escamosas, bexiga, estômago, pâncreas, mama, cabeça, pescoço, renal, rim, ovário, próstata, colorrectal, esófago, testicular, ginecológico ou da tireoide.

No entanto, os compostos e composições da também invenção podem ser utilizados no tratamento de uma desordem hiperproliferativa não cancerosa tal como hiperplasia benigna da pele (por exemplo, psoriase), restenose, ou da próstata (por exemplo, hipertrofia benigna da próstata (BPH) ) .

Outros exemplos de doenças mediadas por MEK, que podem ser tratadas utilizando os compostos ou composições da invenção incluem a pancreatite ou doença do rim (incluindo a glomerulonefrite proliferativa e a doença renal induzida por diabetes) ou o tratamento da dor num mamífero.

Os compostos e composições também podem ser utilizados para a prevenção da implantação de blastócito num mamífero, ou para tratamento de uma doença relacionada com vasculogénese ou angiogénese num mamífero. Essas doenças podem incluir a angiogénese tumoral, doença inflamatória crónica tal como artrite reumatóide, aterosclerose, doença inflamatória do intestino, doenças da pele tais como psoriase, eczema, e esclerodermia, diabetes, retinopatia diabética, retinopatia da prématuridade, degeneração macular relacionada com a idade, hemangioma, glioma, melanoma, sarcoma de Kaposi e ovário, mama, pulmão, pâncreas, próstata, cólon e cancro epidermóide.

Os termos "crescimento celular anormal" e "desordem hiperproliferativa" são utilizados indiferentemente neste pedido de patente e referem-se ao crescimento celular que é 16 independente dos mecanismos reguladores normais (por exemplo, perda de inibição de contacto). Isto inclui, por exemplo, o crescimento anormal de: (1) células tumorais (tumores) que proliferam por expressão de uma tirosina-quinase mutada ou pela sobre-expressão de um receptor tirosina-quinase, (2) células benignas e malignas de outras doenças proliferativas em que ocorre a activação aberrante da tirosina quinase, (3) quaisquer tumores que proliferam por receptores tirosina-quinases, (4) quaisquer tumores que proliferam por activação aberrante da tirosina quinase, e (5) células benignas e malignas de outras doenças proliferativas em que ocorre a activação aberrante da serina/treonina quinase. 0 termo "tratamento", tal como aqui utilizado, salvo indicação em contrário, significa reverter, aliviar, inibir o progresso de, ou prevenir o distúrbio ou condição à qual tal termo se aplica, um ou mais sintomas de tal desordem ou condição. 0 termo "tratamento" tal como aqui utilizado, salvo indicação em contrário, refere-se ao acto de tratar, sendo "tratar" como definido imediatamente acima.

Assim, os pacientes que podem ser tratados com os compostos ou composições da presente invenção incluem, por exemplo, pacientes que tenham sido diagnosticados como tendo psoriase, restenose, aterosclerose, BPH, cancro do pulmão, cancro do pulmão de não pequenas células, cancro do osso, CMML, concro do pâncreas, cancro colorrectal, cancro de pele, cancro da cabeça e pescoço, melanoma (em particular, cutâneo ou melanoma intra-ocular), cancro uterino, cancro de ovário, cancro retal, cancro da região anal, cancro de estômago, cancro de cólon, cancro da mama, testicular, tumores ginecológicos (por exemplo, sarcomas uterinos, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, 17 carcinoma do colo uterino, carcinoma da vagina ou carcinoma da vulva), cancro do ovário, mieloma múltiplo, carcinoma hepatocelular, doença de linfoma de Hodgkin, cancro de esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino (por exemplo, cancro de tireoide, paratireóides ou glândulas supra-renais), sarcomas de tecidos moles, o cancro da uretra, cancro de pênis, cancro de próstata, leucemia crónica ou aguda, em particular tumores sólidos, leucemias mielóides agudas da infância, linfomas linfociticos, cancro da bexiga, cancro do rim ou do ureter (por exemplo, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal), ou neoplasmas do sistema nervoso central (por exemplo, linfoma CNS primários, tumores do eixo da coluna vertebral, gliomas do cérebro ou adenomas da hipófise). 0 sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 pode ser aplicado como uma terapia única ou pode envolver, para além do sal de sulfato de hidrogénio do composto 1, uma ou mais substâncias e/ou tratamentos. Tal tratamento conjunto pode ser conseguido por meio da administração simultânea, sequencial ou separada dos componentes individuais do tratamento. No campo da oncologia médica é prática normal usar uma combinação de diferentes formas de tratamento para tratar cada paciente com cancro. Em oncologia médica o(s) outro(s) componente(s) de tal tratamento conjunto, em adição ao composto 1 do sal de sulfato de hidrogénio pode ser a cirurgia, radioterapia ou quimioterapia. A quimioterapia pode abranger categorias de agente terapêutico, tais como: (i) agentes anti-angiogénicos, tais como aqueles que inibem os efeitos do factor de crescimento endotelial vascular, (por exemplo, o anticorpo do factor de crescimento endotelial vascular bevacizumab [Avastin™] , e os inibidores VEGF dos receptores da tirosina quinase do 18 anticorpo anti-factor de crescimento celular endotelial vascular tal como 4-(4-bromo-2-fluoroanilino)-6-metoxi-7-(1-metilpiperidin-4-ilmetoxi) quinazolina (ZD6474; Exemplo 2, na WO 01/32651), 4-(4-fluoro-2-metilindol-5-iloxi)-6-metoxi-7-(3-pirrolidin-l-ilpropoxi) quinazolina (AZD2171; Exemplo 240 no documento WO 00/47212), vatalanib (PTK787; WO 98/35985) e SU1248 (sunitinib; WO 01/60814), compostos tais como os divulgados nos Pedidos de Patente Internacional W097/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 e WO 98/13354 e aqueles que funcionam por mecanismos diferentes dos aqui definidos ( por exemplo, linomida, inibidores da função da integrina ανβ3, angiostatina, razoxina, talidomida, inibidores da MMP-2 (matriz-metaloprotienase 2) inibidores da MMP-9 (matriz-metaloprotienase 9) inibidores da protease, e inibdroes da COX-II (ciclo-oxigenase II),), e (ii) agentes vasculares (por exemplo fosfato de combretastatina e os compostos revelados em WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 e WO 02/08213 e os agentes de danificação vascular descritos no Pedido de Patente Internacional Publicação No. WO 99/02166, (por exemplo, N-acetilcolchinol-O-fosfato)); (iii) agentes citostáticos, tais como antiestrogénios (por exemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifene e iodoxifeno), receptor de estrógeno de baixa regulação (por exemplo fulvestranto), progestágenos (por exemplo, acetato de megestrol), inibidores da aromatase (anastrozol por exemplo, letrazole, vorazole e exemestano), antiprogestogénios, antiandrogenes (por exemplo flutamida, nilutamida, bicalutamida, e acetato de ciproterona), agonistas e antagonistas de LHRH (por exemplo acetato de 19 goserelina, leuprorelina e buserelina) , inibidores da 5a-redutase (por exemplo finasterida); (iv) agentes anti-invasão (por exemplo inibidores de metaloproteinase como marimastat e inibidores da função activadora receptora do plasminogénio urocinase ou dos anticorpos para Heparanese; (v) inibidores da função do factor de crescimento (tais factores de crescimento incluem por exemplo factor de crescimento derivado de plaquetas e factor de crescimento de hepatócitos), tais inibidores incluem anticorpos do factor de crescimento, anticorpos do receptor do factor de crescimento, (por exemplo, o anticorpo trastuzumab anti-Erbb2 [Herceptin™] , o anticorpo panitumumab anti-EGFR, o anticorpo cetuximab anti-erbBl [C225]) , e qualquer fator de crescimento ou anticorpos do receptor do fator de crescimento divulgadas por Stern et al.

Nas revisões críticas em oncologia / hematologia, 2005, vol. 54, 11-29 ppl), tais inibidores incluem inibidores de tirosina quinase, tais como inibidores da familia do factor de crescimento da epiderme (por exemplo, inibidores da tirosina quinase da família EGFR, tais como N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropoxi)-quinazolin-4-amina (gefitinib, AZD1 839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi) quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI-774) e 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi) quinazolin-4-amina (Cl 1033)), e os inibidores de tirosina quinase erbB2, tais como lapatinib, inibidores da família do factor de crescimento de hepatócitos, os inibidores da familia do factor de crescimento derivado das plaquetas, tais como imatinib, inibidores de serina / treonina quinases (por exemplo inibidores de Ras / Raf, tais como 20 inibidores de sinalização da farnesil transferase, por exemplo sorafenib (BAY 43-9006)), inibidores de sinalização celular através de quinases MEK e / ou AKT, os inibidores de c-kit, inibidores de abl-quinase, receptor de IGF (factor de crescimento semelhante à insulina), inibidores da quinase, inibidores da quinase da aurora (por exemplo AZD1 152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763 , MP235, MP529, VX-528, e AX39459) e inibidores de quinase dependentes de ciclina, tais como inibidores CDK2 e / ou CDK4; (vi) fármacos antiproliferativos / antineoplásicos e combinações destes, tal como os utilizados em oncologia médica, tais como antimetabolitos (por exemplo antifolatos tais como metotrexato, fluoropirimidinas, tais como 5-fluorouracil, tegafur, análogos de purina e adenosina, citosina e arabinosido, hidroxiureia, ou, por exemplo, um dos anti-metabolitos especificamente revelados no Pedido de Patente Europeia No. 239362 tal como ácido N-(5-[N-(3,4-di-hidro-2-metil-4-oxoquinazolin-6-ilmetilo)-N-metilamino-2-tenoil)-L-glutâmico;, antibióticos antitumorais (por exemplo, antraciclinas, tais como adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina e idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina e mitramicina); derivados de platina (por exemplo cisplatina e carboplatina), agentes alquilantes (por exemplo mostarda de azoto, melfalano, clorambucil, bussulfano, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas e tiotepa), agentes antimitóticos (por exemplo alcaloides da vinca tais como vincristina, vinblastina, vindesina e vinorelbina , e taxóides, tais como taxol e taxotere); inibidores da topoisomerase (por exemplo epipodofilotoxinas como etoposido e teniposido, amsacrina, topotecano, irinotecano e camptotecina), enzimas (por exemplo asparaginase), e inibidores da sintase de timidilato (por exemplo raltitrexed); 21 e outros tipos de agente quimioterapêutico incluindo: (vii) modificadores da resposta biológica (por exemplo interferão); (viii) anticorpos (por exemplo edrecolomab); (ix) terapias antisense, por exemplo, aquelas que são dirigidas para os alvos listados acima, tais como ISIS 2503, um anti-ras antisense; (x) abordagens de terapia genética, incluindo por exemplo abordagens para substituir genes aberrantes, tais como p53 aberrante ou BRCA1 ou BRCA2 aberrante, GDEPT (Terapia de profármaco/enzima dirigida por genes) abordagens tais como aquelas que utilizam citosina desaminase, timidina-quinase ou uma enzima nitro-redutase bacteriana e abordagens para aumentar a tolerância do paciente à quimioterapia ou radioterapia, tais como terapia de resistência genética a múltiplos fármacos, e (xi) abordagens de imunoterapia, incluindo, por exemplo, aborgagens ex vivo e in vivo para aumentar a imunogenicidade das células de tumor do paciente, tais como a transfecção com citocinas, tais como interleucina 2, interleucina 4 ou factor estimulante de colónias de granulócito-macrófago, abordagens para diminuir a anergia das células T, abordagens utilizando células imunes transfectadas, tais como células dendríticas transfectadas e citocina, abordagens utilizando linhas celulares tumorais transfectadas com citocina e abordagens utilizando anticorpos anti-idiotipicos. 22

Por exemplo, pode ser utilizado um sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 em conjunto com uma quantidade eficaz de uma ou mais substâncias seleccionadas a partir de agentes anti-angiogénese, inibidores da transdução de sinal e agentes antiproliferativos.

Numa forma de realização particular, os agentes anti-angiogénese, tais como inibidores de MMP-2 (matriz-metaloprotienase 2), inibidores da MMP-9 (matriz- metaloprotienase 9) inibidores da protease, e inibidores de COX-II (ciclooxigenase II), podem ser usados em conjunto com um sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 da presente invenção e as composições farmacêuticas aqui descritas. Os exemplos de inibidores de COX-II úteis i TM i

incluem CELEBREX (alecoxib), valdecoxib e rofecoxib. Exemplos de inibidores de matriz metaloprotienase úteis estão descritos em WO 96/33172, WO 96/27583, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, Patente dos EUA 5 863 949, e Patente dos EUA 5 861 510, as quais são aqui incorporadas na sua totalidade por referência. Os inibidores apropriados de MMP-9 e MMP-2 são aqueles que têm pouca ou nenhuma actividade inibidora de MMP-1. Em particular, são utilizados aqueles que inibem selectivamente MMP-2 e / ou MMP-9 relativamente às outras metaloproteinases de matriz (isto é, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 e MMP-13).Os exemplos particulares de inibidores de MMP úteis na presente invenção são AG-3340, RO 32-3555 e RS 13-0830.

Portanto, um outro aspecto da presente invenção, o sal de sulfato de hidrogénio de um composto 1 em combinação com qualquer um dos agentes anti-tumorais listados na alinea (i)-(xi) aqui acima. Um outro aspecto do presente invenção 23 proporciona o sal sulfato de hidrogénio do composto 1 em combinação com um ou mais dos agentes anti-tumorais listados na alinea (i)-(xi) aqui acima. Um outro aspecto do presente invenção proporciona o sal sulfato de hidrogénio do composto 1 em combinação com qualquer uma das classes de agentes anti-tumorais listados na alinea (i)-(xi) aqui acima.

Aqui, onde o termo "combinação" é usado é para ser entendido que esta se refere a administração simultânea, separada ou sequencial. Num aspecto da invenção "combinação" refere-se a administração simultânea. Num outro aspecto da invenção "combinação" refere-se a separar a administração. Num outro aspecto da invenção "combinação" refere-se a administração sequencial. Quando a administração é sequencial ou separada, o atraso na administração do segundo componente não deve ser tal que se perca o efeito benéfico da combinação.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção é proporcionado um kit que compreende o sal de sulfato de hidrogénio de um composto 1 em combinação com um agente anti-tumoral seleccionado a partir dos listado em (i)-(xi) acima.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um kit que compreende: a) o sal de sulfato de hidrogénio do Composto 1 numa primeira forma de dosagem unitária; b) um agente anti-tumoral seleccionado a partir dos listados em (i)-(xi) acima, numa segunda forma de unidade de dosagem, e c) meios de recipiente para conter as primeira e segunda formas de dosagem referidas.

Verificou-se actividade no composto 1 no seguinte ensaio. N-terminal de 6 His-tag, MEK1 constitutivamente activa (2-393) foi expressa em E. coli e a proteína foi purificada pelos métodos convencionais (Ahn et al., Science 1994, 265:966-970). A actividade de MEK1 foi avaliada pela medição da incorporação de y-33P-fosfato a partir de γ-33Ρ-ATP no N-terminal His marcado ERK2, que é expressa em E. coli e é purificada pelos métodos convencionais, na presença de MEK1. O ensaio é realizado em placas de polipropileno de 96 poços. A mistura de incubação (100 μΜ compreende Hepes 25 mM, pH 7,4, MgCl2 10 mM, β-glicerolfosfato 5 mM, 100 μΜ de ortovanadato de sódio, DTT 5 mM, MEK1 5 nM e 1 μΜ ERK2. Os inibidores são suspensos em DMSO e todas as reacções, incluindo os controlos são realizadas a uma concentração final de 1% de DMSO. As reacções são iniciadas pela adição de 10 μΜ ATP (com 0,5 μΟί y-33P-ATP/poço) e incubadas à temperatura ambiente durante 45 minutos. É adicionado igual volume de 25% de TCA para parar a reacção e precipitar as proteínas. As proteínas precipitadas são presas em filtros de fibra de vidro B, e o excesso de ATP marcado é lavado usando um Tomtec MACH III Harvestor. As placas são secas ao ar antes da adição de 30 μL/poço de Packard Microscint 20 e as placas são contadas utilizando um Packard TopCount. Neste ensaio, o Composto 1 exibiu um IC5o inferior a 50 micromolar.

EXEMPLOS A fim de ilustrar a invenção, estão incluídos os seguintes exemplos. No entanto, deve ser entendido que estes exemplos não limitam a invenção e destinam-se apenas a sugerir um método de praticar a invenção. Os rendimentos são dados 25 para os exemplos tal como realizados e provavelmente poderiam ser melhorados através de um maior desenvolvimento. 0 Espectro de RMN ΧΗ (400 MHz) foi referenciada a TMS (0,00 ppm) , Espectro de RMN 13C (100 MHz) foi referenciado para o solvente de RMN (39,5 ppm) e a espectro de RMN 19F foi referenciado para triclorofluorometano (0,00 ppm). Os espectros de FTIR foram obtidos num Nicolet Magna 860 FTIR ESP em várias formas, incluindo a partir de uma dispersão p/p deste material em pó de KBr 2%, utilizando a técnica de amostragem DRIFTS, entre 4000-400 cm'1 médio da região espectral de infravermelho.

Exemplo 1

Preparação do sal de sulfato de hidrogénio do composto 1

A uma suspensão agitada da (2-hidroxi-etoxi) amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (100 g, 0,206 mol) (obtido tal como descrito no Exemplo 10 de WO 03/077914, que é aqui incorporada por referência e como descrito abaixo) em 2-butanona (680 mL) e água (115 ml) a 0-5 °C, foi adicionado ácido sulfúrico (12,3 ml, 0,226 mol), seguido de água (5 mL) mantendo uma temperatura de 10 °C ou inferior. A mistura agitada foi aquecida até aos 65 °C e mantida durante 30 minutos antes de ser filtrada para remover quaisquer impurezas. O filtro foi lavado com uma mistura de 26 2-butanona (85 mL) e água (15 ml). Os filtrados foram combinados e aquecidos a 72 °C antes da adição de 2-butanona (500 mL) mantendo uma temperatura entre 60-72 °C. A mistura resultante foi destilada à pressão atmosférica (temperatura de destilação de aproximadamente 73-74 °C) até ser recolhido 500 mL de destilado.

Foi adicionada uma segunda alíquota de 2-butanona (500 mL), mantendo a temperatura da mistura acima de 70 °C. A mistura resultante foi destilada de novo até ter sido recolhido 250 ml de destilado. A mistura foi arrefecida até 0-5 °C ao longo de aproximadamente 1 hora. A pasta resultante foi filtrada, lavada com 2-butanona (240 mL) e seca a pressão reduzida a 50 °C, até ser conseguido um peso constante, para dar o sulfato de hidrogénio da (2-hidroxi-etoxi)amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (103,5 g, 0,186 mol, 90% de rendimento) como um sólido cristalino esbranquiçado. XH NMR (400 MHz, D6 DMSO) δ 3,58 (2H, t, CH2OH) , 3,89 (2H, t, CH2ON) , 3,99 (3H, s, CH3), 6,47 (1H, dd, ArH) , 7,29 (1H, dd, ArH), 7,63 (1H, d, ArH), 7,91 (1H, s, ArH), 7,96 (3H, br, ROH, NH, SOH), 8,10 (1H, br, ArNH), 8,94 (1H, s, NCHN), 11,79 (1H, s, ONH). 13C NMR (100 MHz, D6 DMSO) δ 32,1 (CH3), 58,5 (CH2OH) , 77,3 (CH2ON), 108,2 (CH), 109,6 (CBr), 115,8 (CH), 120,6 (CC1), 122,0 (C), 125,0 (CC=0), 129,4 (C), 130,5 (CH), 131,1 (CH), 132,3 (C), 140,6 (C), 145,8 (CF), 146,5 (CH), 164,2 (C=0).

Os resultados da análise de infravermelho são mostrados na Figura 2.

As avaliações espectrais estão resumidas na Tabela 1. 27 Número ondas 3255 3200 - 2700 - 1673 1653 1640 - 1570 1506 1213

Tabela 1 de Avaliaçao (cm-1)

Inclui a vibração de alongamento do grupo O-H do álcool primário e as vibrações de alongamento do N-H d a amina aromática secundária e dos grupos amida secundários. 2700 Inclui vibrações de estiramento =C-H do anel aromático e de um grupo benzimidazole e as vibrações de alongamento do C-H alifático. 2300 Inclui vibrações de alongamento múltiplo do grupo NH+ do benzimidazol 1:1 sal de sulfato. Vibrações de alongamento do grupo C=0 da amida secundária, onde O grupo carbonilo está sujeito a efeitos ambientais diferentes, tais como ligação de hidrogénio. 1370 Inclui vibrações de estiramento C=C do anel aromático, o C = C e vibrações de estiramento C = N do grupo benzimidazole, a vibração de deformação do grupo O-H do álcool primário e as vibrações de deformação dos -CH alifáticos. A banda de combinação CNH do grupo amida secundária.

Inclui a vibração de flexão CNH do grupo de amina aromática secundária.

Vibração de alongamento C-F do arilo Vibração de alongamento assimétrico do SC>3_ 28 1189 1:1 sal de sulfato. 1100 - 1000 Inclui a vibração de alongamento de C-0 do grupo álcool primário e a vibração de alongamento C-Br do arilo. 1011 Vibração de alongamento simétrico do SC>3~ benzimidazolo 1:1 sal de sulfato. 920-600 Inclui as vibrações C-H e C = C do anel vibrações de flexão do anel aromático 1,2,4-trisubtitutidod e do grupo benzimidazolo. 888 Inclui a vibração de alongamento do S-O(H) do benzimidazolo 1:1 grupo de sal de sulfato.

Exemplo IA

Preparação do sal de sulfato de hidrogénio do composto 1

Adicionou-se ácido sulfúrico (1,52 mL, 27,86 mmol) a uma suspensão agitada da (2-hidroxietoxi) amida do ácido 6-(4-bromo-2-clorofenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (10 g, 0,0214 mol) (obtido tal como descrito no Exemplo 10 de WO 03/077914, que é aqui incorporada por referência e como descrito a seguir) em tetrahidrofurano (THF) (62 ml) e água (8 ml) enquanto se manteve a temperatura a 10 ° C ou inferior. A mistura agitada foi aquecida até 65 °C e mantida durante 30 minutos antes de ser filtrada para remover quaisquer impurezas. Adicionou-se, então, THF (150 mL) à mistura, mantendo a temperatura acima de 60 °C. A mistura foi então arrefecida até 0-5 °C durante cerca de 2 horas. A pasta resultante foi filtrada, lavada com THF (30 ml) e seca sob pressão reduzida a 50 °C, até ser conseguido um peso constante, para dar o sulfato de hidrogénio da (2-hidroxietoxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (9,81g, 0,17 mol, rendimento de 82%) como um 29 sólido cristalino esbranquiçado. 0 material era idêntico ao produzido no Exemplo 1 acima.

Exemplo 1B

Preparação da (2-hidroxi-etoxi) amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxilico

Passo A: ácido 2,3,4-trifluoro-5-nitro-benzóico: Colocou-se, num balão de fundo redondo de 3 litros com três tubuladuras, 125 ml de H2S04. Adicionou-se ácido nítrico fumegante (8,4 ml, 199 mmol) e agitou-se suavemente a mistura. Adicionou-se ácido 2,3,4-trifluorobenzóico (25 g, 142 mmol) em porções de 5 g durante 90 minutos. A solução amarela acastanhada escura foi agitada durante 60 minutos, altura em que a reacção foi completa. A mistura reaccional foi vertida sobre 1 litro de mistura de gelo:água e extraída com éter dietílico (3 x 600 ml) . Os extractos combinados foram secos (MgS04) e concentrados sob pressão reduzida para dar um sólido amarelo. O sólido foi suspenso em hexano e agitado durante 30 min, depois foi filtrado para dar 29 g (92%) do produto desejado, limpo, como um sólido amarelo: MS APCI (-) detectado m/z 220 (M-l).

Passo B: ácido 4-Amino-2,3-difluoro-5-nitro-benzóico: adicionou-se uma solução de hidróxido de amónio (30% em água) (35 ml, 271 mmol) a uma solução de ácido 2,3,4-trifluoro-5-nitro-benzóico (15 g, 67,8 mmol) em 30 ml de água a 0 0 C sob agitação. Após a conclusão da adição de hidróxido de amónio, a mistura reaccional foi aquecida até à temperatura ambiente sob agitação. Após 2,5 horas, a mistura reaccional foi arrefecida a 0 °C e adicionou-se cuidadosamente HC1 concentrado até o pH da mistura 30 reaccional ser 0. A mistura reaccional foi diluída com água (30 ml) e extraída com éter dietílico (3 X 50 ml) . Os extractos orgânicos combinados foram secos (MgS04) e concentrados sob pressão reduzida para dar 14 g (95%) do produto desejado puro: MS APCI (-) detectado τη/z 217 (M-l).

Passo C; éster metílico do ácido 4-amino-2,3-difluoro 5-nitrobenzóico: a uma solução 2 M de diazometano tetrametilsilano (TMS) em hexano (6,88 mL, 13,75 mmol) foi adicionada a uma suspensão de ácido 4-amino-2,3-difluoro-5-nitrobenzóico (2,00 g, 9,17 mmol) em 25 ml de 4:1 de tetrahidrofurano (THF):MeOH, a 0 °C, sob atmosfera de azoto. Após a adição, a mistura reaccional foi aquecida até à temperatura ambiente. Após 0,5 horas, foi destruído TMS diazometano em excesso pela adição cuidadosa de ácido acético. A reacção foi então concentrada sob pressão reduzida e secou-se sob vácuo 1,95 g (92%) do produto desejado puro: MS APCI (-) detectado m/z 231 (M-l).

Passo D: éster metílico do ácido 4-amino-3-fluoro-5-nitro-2-fenilamino-benzóico: éster metílico do ácido 4-Amino-2,3-difluoro-5-nitrobenzóico (23,48 g, 101,1 mmol) foi suspenso em xilenos (125 ml) e adicionada anilina (92 ml, 1,011 mmol) . A mistura reaccional foi agitada a 125 °C, durante 16 horas, sob N2. A mistura reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente e os sólidos precipitaram da solução. Os sólidos foram recolhidos por filtração e lavados com xileno e depois com éter dietílico. Recuperou-se 22,22 g (72,78 mmol) de um sólido amarelo, produto desejado puro. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, dissolvido novamente em cloreto de metileno e passado através de uma coluna de gel de sílica eluido com cloreto de metileno. As fracções desejadas foram concentradas sob pressão reduzida para dar um sólido castanho que foi triturado com éter 31 dietílico para originar 5,47 g (17,91 mmol) de um sólido amarelo, o qual era o produto desejado puro. 0 rendimento do produto combinado foi 27,69 g (90%). MS APCI (-) detectado m/z 304 (M-l).

Passo E: Éster metílico do ácido 7-Fluoro-6-fenilamina-3H-benzoimidazol-5-carboxilico: éster metilico do ácido 4-amino-3-fluoro-5-nitro-2-fenilamino-benzóico (16,70g, 54,71 mmol), ácido fórmico (250 ml, 6,63 mol) e 20% Pd(OH)2 / C (9,00 g, 16,91 mmol) em etanol (250 mL) a 40 °C durante duas horas sob N2 e em seguida a 95 °C durante 16 horas. A mistura reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente e filtrou-se através de Celite lavando com acetato de etilo. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar um sólido amarelo. O sólido foi triturado com éter dietílico para dar 13,47 g (86%) do produto desejado como um sólido dourado. MS APCI (+) detectado m/z 286 (M+l); MS APCI (-) detectado m/z 284 (M-l).

Passo F: éster metílico de ácido 6-(4-bromo-fenilamino)-7-fluoro-3H-benzoimidazol-5-carboxílico: éster metílico do ácido 7-fluoro-6-phenilamino-3H-benzoimidazoIe-5- carboxílico (4,99 g, 17,51 mmol) foi dissolvido em N, N- dimetilformamida (275 ml) . Foi adicionado N- bromossuccinimida (3,15 g, O r-1—1 mmol ) como sólido e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente sob N2. Após 30 minutos, a mistura reaccional foi temperada por meio da adição de solução de bissulfito de sódio aquoso saturado. A mistura reaccional foi, então, vertida numa ampola de decantação, diluída com água e acetato de etilo e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo. Os extractos orgânicos combinados foram lavados três vezes com água, uma vez com salmoura e em seguida secos e (Na2S04) e concentrados sob pressão 32 reduzida para produzir 6,38 g (100%) do produto desejado puro como um sólido castanho-amarelado. MS ESI ( + ) detectado m/z 364, 366 (M + Br padrão).

Passo G: éster metálico do ácido 6-4-Bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3H-benzoimidazol-5-carboxilico: foi dissolvido éster metálico do ácido 6-(4-Bromo-fenilamino)-7-fluoro-3H-benzoimidazol-5-carboxilico (6,38 g, 17,51 mmol), em N,N- dimetilformamida (275 mL). Foi adicionada N-clorossuccinimida (2,36 g, 17,70 mmol) como sólido e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente, sob N2, até a reacção estar completa (5-6 dias). A mistura reaccional foi temperada por meio da adição de uma solução saturada de bissulfito de sódio aquoso para originar uma suspensão. Os sólidos resultantes foram recolhidos por filtração, lavados com água e éter dietilico e secos sob pressão reduzida para produzir 6,07 g (87%) do produto desejado puro como um sólido bege. MS ESI (+) detectado m/z 398, 400 (M + Br padrão).

Passo H: éster metílico do ácido 6-(4-Bromo-2- clorofenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxilico e éster metílico do ácido 6-(4-Bromo-2-clorofenilamino)-7- fluoro-1 -metol- 1H- benzoimidazol-5-carboxilico: Uma solução de éster metílico do ácido 6 — (4 — Bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro -3H-benzoimidazol-5- carboxilico (150 mg, 0,38 mmol), iodometano (28 μ]0, 0,45 mmol) e carbonato de potássio (78 mg, 0,56 mmol) em dimetilformamida (1,5 mL) foi agitada a 75 °C, durante uma hora. A mistura reaccional foi diluída com acetato de etilo, lavada com carbonato de potássio aquoso saturado (2x) , salmoura e seca (Na2S04) . A cromatograf ia em coluna flash (20:1 cloreto de metileno / acetato de etilo) proporcionou 56 mg (36%) do éster metílico do ácido 6— (4— 33 bromo-2-clorofenyilamino)-7-fluoro-3-meti1-3H-benzoimidazol-5-carboxilico sob a forma de um sólido branco. 19F NMR (376 MHz, CD3OD) - 133,5 (s) MS APCI (+)detectado m/z 412, 414 (M + Br padrão).

Também é isolado 54 mg (35%) de éster metílico do ácido 6-4(-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-l-metil-lH-benzoimidazol-5- carboxilico sob a forma de um sólido branco. 19F NMR (376 MHz, CD3OD) - 139,9 (s) MS APCI (+)detectado m/z Todos,412, 414 (M + Br padrão). Passo I: éster metílico do ácido 6-(4-Bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxilico: foi dissolvido éster metílico do ácido 6—(4— Bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-meti1-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (56 mg, 0,14 mmol) em 2:1 THF / água (3 mL) e foi adicionado NaOH (0,55ml solução aquosa 1,0 M, 0,55 mmol) . Após agitação durante duas horas, a reacção foi reduzida a um quarto de volume inicial por meio de evaporação rotativa e o resto diluído para 50 ml com água. A solução aquosa foi acidificada a pH 2 pela adição de 1,0 M de HC1 aquoso e extraiu-se com 1:1 de tetrahidrofurano / acetato de etilo (3x) , secou-se (Na2SC>4) e concentrou-se sob pressão reduzida para proporcionar 43 mg (79%) do ácido carboxilico puro como um sólido esbranquiçado. MS ESI (+)detectado m/z 397, 398 (M + Br padrão).

Passo J: (2-viniloxi-etoxi)amida do ácido 6-(4-Bromo-2 cloro-fenilamino-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxilico: ácido 6-(4-bromo 2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (2,00 g, 5,0 mmol), O-(2-vinloxi-etil)-hidroxilamina (0,776 g, 7,5 mmol), HOBt 34 (0,88 g, 6,5 iranol), trietilamina (1,61 mL, 2,3 mmol) e EDCI (1,3 g, 6,5 mmol) foram dissolvidos em dimetilformamida (52 mL), e agitou-se à temperatura ambiente durante 48 horas. A mistura reaccional foi diluída com acetato de etilo, lavada com água (3x) , carbonato de potássio saturado (2x), cloreto de amónio saturado (2x), salmoura, seca (Na2S04) e concentrada sob pressão reduzida para originar um sólido esbranquiçado. A trituração do sólido com éter dietílico deu 2,18 g (90%) do produto desejado como um sólido esbranquiçado. MS ESI (=) detectado m/z 483, 485 (M + Br padrão).

Passo K: (2-hidroxi-etoxi)-amida do ácido 6-(4-Bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxilico: ácido clorídrico (14 ml de solução aquosa 1,0 M, 14 mmol) foi adicionado a uma suspensão da (2-viniloxietoxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-cloro- fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboilico (2,18 g, 4,50 mmol) em etanol (50 mL) e a mistura da reacção foi deixada sob agitação durante 24 horas. . A mistura reaccional foi concentrada até à secura por evaporação rotativa e os sólidos foram particionados em 3:1 de acetato de etilo/tetra-hidrofurano e carbonato de potássio saturado. A fase aquosa foi extraída com 3:1 de acetato de etilo/tetra-hidrofurano (3x), as fases orgânicas combinadas foram secas (Na2S04) e concentrou-se para proporcionar 2,11 g (100%) de (2-hidroxietoxi)-amida do ácido 6-(4-bromo-2-clorofenilamino)-7-flúor-3-meti1-3H-benzoimidazol-5-carboxílico como um sólido esbranquiçado. MS ESI (+)detectado m/z 457, 459 (M +, Br padrão). ΤΗ NMR (40 0 MHz, MeOH-d4) δ 8,26 (s, 1H), 00 r- (s, 1H) 7,57 (d, 1H), 7,24 (dd, 1H), 6, 40 (dd, 1H) , 3,86 (s, 3H) 3, 79 (m, 2H) , 3, 49 (m, 2H) . 19F NMR (376 MHz, MeOH-d4) -133,68 (s) . 35

Exemplo 2

Investigação das propriedades físicas do sal de sulfato de hidrogénio 0 produto do Exemplo 1 foi sujeito aos seguintes testes, para determinar as suas propriedades físicas.

Difração de raios-X de pó (PXRD)

Todas as amostras foram colocadas em um difratómetro Bruker D5000.

Os espectros de difracção de raios X foram determinados por montagem de uma amostra do sal cristalino em silício de cristal único (SSC) Siemens e espalhando a amostra numa camada fina com a ajuda de uma lâmina de microscópio. A amostra foi centrifugada a 30 rotações por minuto (para melhorar a estatística de contagem) e irradiada com raios X gerados por um tubo de foco longo-fino de cobre operado a 40kV 40mA e com um comprimento de onda de 1,5406 angstroms. A fonte de raios X colimada foi passada através de uma fenda de divergência variável automática fixada em V20 e a radiação reflectida dirigida através de uma fenda antidispersão de 2 mm e uma fenda de detector de 0,2 mm. A amostra foi exposta durante a incrementos de 1 segundo por 0,02 grau 2-teta (modo de varredura contínua) na faixa de 2 graus a 40 graus 2-teta no modo de teta-teta. O tempo de execução foi de 31 minutos e 41 segundos. O instrumento foi equipado com um contador de cintilação, como detector. O controlo e captura de dados foi realizada por meio de um difractometro Dell Optiplex 686 NT 4.0 Workstation operating with Diffract+ software.

Os dados foram recolhidos de 2-teta-2 - 40° com incrementos de 2-teta 0,02° com 4s por incremento e estão classificados 36 na Tabela 2, com as intensidades relativas derivadas de difratogramas medidos com fendas fixas.

Tabela 2 % de Intensidade Relativa Definição 25-100 VS - Muito Forte 10-25 S - Forte 3-10 M - Média 1-3 W - Fraca

Os resultados da análise são mostrados na Figura 1, onde a linha superior a cinza representa XRPD do sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 e a linha preta inferior representa a forma livre. Os picos mais intensos, começando com o mais intenso, são apresentados na Tabela 3. 0 pico a 24,59° é particularmente forte.

Tabela 3

Escala teta-2 Intensidade Relativa 24,59 VS 20,97 VS 23,99 s 27,65 s 12,24 s 23,49 s 24,30 s 17, 02 s 25, 91 s 22,50 M

As pessoas especialistas na técnica de difracção de raios X em pó vão perceber gue a intensidade relativa dos picos pode ser afectada por, por exemplo, grãos superiores a 30 37 microns em tamanho e proporções não unitárias, o que pode afectar a análise de amostras. 0 perito também irá perceber que a posição da reflexão pode ser afectada pela altura precisa a que a amostra fica no difractometro e pela calibração zero do difractometro. A planaridade da superfície da amostra pode também ter um efeito pequeno. Assim, os dados do padrão de difração apresentados não devem ser tomados como valores absolutos (ver Jenkins, R. & Snyder, RL, "Introduction to X-Ray Powder Diffractometry", John Wiley & Sons, 1996, para mais informações).

Exemplo 3

Investigação in vivo: Estudo dos sais em relação à base livre na formulação dispersa

Foi realizado um estudo em cães para medir os níveis de Composto 1 no plasma de cães em jejum, após a administração de 150 mg de doses orais equivalentes de base livre em 7,5 mL de várias formulações em dispersão de agentes de dispersão farmaceuticamente aceitáveis com um composto 1 contido na forma livre ou de sal de sulfato de hidrogénio. Foram administradas doses únicas, em cada um dos três dias de dosagem, 150 mg por via oral a cães beagle em jejum que pesam 12-17 kg e com cerca de 2 a 6 anos de idade. Cada dia de dosagem foi com 1 semana de intervalo.

Todas as formulações foram preparadas extemporaneamente, imediatamente antes de serem administradas por adição de 7,5 mL da solução dispersante adequada através de uma seringa descartável de 10 ml, em frascos que contêm 150 mg de equivalentes de base livre sob a forma de medicamento 38 apropriado, o nivelamento e vortex para realizar a mistura foi de 30 segundos para formar uma dispersão. A dispersão foi removida do frasco usando a seringa descartável e doseada ao animal através de um tubo de sonda posicionado no interior do estômago. Os frascos foram lavados duas vezes pela adição de, por cada uma das duas lavagens, uma alíquota de 15 mL de água (volume total de enxaguamento = 30 mL) através de uma seringa descartável de 20 mL, nivelamento e mistura durante 5 segundos, retirando a solução de lavagem a partir do frasco utilizando a seringa descartável e a dosagem ao animal através do tubo de lavagem.

Os cães foram alimentados com cerca de 400 g de Special Diet Services Laboratory Diet A todos os cada dia e permitiu-se que a água ad libitum. O sangue total (2 mL) em tubos de heparina de litio foi retirado da veia jugular imediatamente antes da dosagem e as 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 18, 24, 36 e 48 horas. O sangue foi centrifugado a 3000 rpm durante 15 minutos e o plasma foi removido para tubos de sangue simples e o plasma armazenado a -20 °C até à análise. O plasma (50 mel) foi analisado para a concentração de Composto 1. Dois cães foram excluídos da análise porque tinham vomitado pouco depois de dosagem. Os perfis de concentração média no plasma para o Composto 1, observados após a administração oral, são mostrados na Figura 3, onde a linha representada por A ilustra uma formulação que inclui o sal de sulfato de hidrogénio do composto 1, e a linha representada por X mostra os resultados de um composto 1 de base livre na mesma formulação. 39

Parece que as alterações na formulação tiveram um efeito relativamente pequeno sobre a exposição (resultados não mostrados). No entanto, quando o Composto 1 foi administrado como sal de sulfato de hidrogénio, foi produzido um aumento substancial de aproximadamente 4 a 8 vezes na exposição. A descrição anterior é considerada apenas como ilustrativa dos princípios da invenção. Além disso, uma vez que numerosas modificações e alterações serão prontamente evidentes para os peritos na técnica, não é desejado limitar a invenção à construção exacta e ao processo como acima descrito. Por conseguinte, podem ser invocadas todas as modificações e equivalentes adequados caindo dentro do âmbito da invenção como definido pelas reivindicações que se seguem.

As palavras "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo" e "inclui", quando utilizadas nesta especificação e nas reivindicações que se seguem destinam-se a especificar a presença de aspectos estabelecidos, números inteiros, de componentes, ou passos, mas não excluem a presença ou a adição de uma ou mais outras características, números inteiros, componentes, passos, ou grupos dos mesmos.

Lisboa, 18 de Julho de 2013 40

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Sal de sulfato de hidrogénio do composto 1.
2. 2. Sal de sulfato de hidrogénio de um composto de acordo com a reivindicação 1 na forma anidra.
3. 3. Sal de sulfato de hidrogénio de um composto 1 de acordo com a reivindicação 1, sob a forma solvatada.
4. 4. Sal de sulfato de hidrogénio de um composto 1 de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é cristalino.
5. 5. Sal de sulfato de hidrogénio de um composto 1 de acordo com a reivindicação 4, em que o referido sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 tem um padrão de difracção de raios X, com pelo menos um pico especifico a cerca de 24,59°.
6. 6. Sal de sulfato de hidrogénio de um composto 1 de acordo com a reivindicação 5, em que o referido sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 tem um padrão de difracção de pó de raios X com picos específicos a cerca de 2-teta igual a 24,59°, 20,97°, 23,99°, 27,65°, 12,24°, 23,49°, 24,30°, 17,02°, 25,91° e 22,50°. 1
7. 7. Sal de sulfato de hidrogénio de um composto 1 de acordo com a reivindicação 1, que tem um padrão de difracção de raios X em pó substancialmente igual ao padrão de difracção de raios-X mostrado na Figura 1.
8. 8. Sal de sulfato de hidrogénio de um composto 1 de acordo com a reivindicação 1 ou da reivindicação 2, sob a forma amorfa.
9. 9. Método para a preparação de um sal de sulfato de hidrogénio de um Composto 1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, compreendendo o referido método (i) a reacção de uma suspensão de Composto 1 num liquido orgânico, com pelo menos uma quantidade estequiométrica de ácido sulfúrico e de água; (ii) recuperar o sal a partir da solução resultante, e (iii) depois disso, se desejado ou necessário, formar um solvatado.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a quantidade de água adicionada no passo (i) está limitada à quantidade necessária para assegurar que o sal é formado.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação 10, em que o passo (i) é realizado a uma temperatura de 40-80 °C.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, em que o liquido orgânico é uma cetona alquilica em Ci_6·
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, em que o sal de sulfato de hidrogénio é recuperado no passo (ii) por arrefecimento da mistura reaccional, 2 opcionalmente com a adição de mais liquido orgânico, de modo que o sal de sulfato de hidrogénio seja precipitado.
14. 14. Sal de sulfato de hidrogénio de um Composto 1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para uso como um medicamento para o tratamento de estados de doença mediados por MEK.
15. 15. Utilização de sal de sulfato de hidrogénio do composto 1 de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento de estados de doença mediados por MEK.
16. 16. 0 sal de sulfato de hidrogénio de um composto 1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para uso no tratamento de estados patológicos mediados através de MEK. Lisboa, 18 de Julho de 2013 3