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PT1946761E - Composição veicular para o transporte de ácido nucleico - Google Patents

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PT1946761E
PT1946761E PT68118728T PT06811872T PT1946761E PT 1946761 E PT1946761 E PT 1946761E PT 68118728 T PT68118728 T PT 68118728T PT 06811872 T PT06811872 T PT 06811872T PT 1946761 E PT1946761 E PT 1946761E
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PT
Portugal
Prior art keywords
nucleic acid
carrier composition
cells
composition
oil
Prior art date
Application number
PT68118728T
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English (en)
Inventor
Hidekazu Toyobuku
Hideo Miyao
Masako Sato
Kazuo Sekiguchi
Original Assignee
Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Otsuka Pharma Co Ltd filed Critical Otsuka Pharma Co Ltd
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Description

DESCRIÇÃO
COMPOSIÇÃO VEICULAR PARA O TRANSPORTE DE ÁCIDO
NUCLEICO
[DOMÍNIO TÉCNICO] A presente invenção tem por objecto uma composição veicular de baixa toxicidade e altamente segura, para a administração de um ácido nucleico, sendo a composição veicular, quando utilizada para administrar um ácido nucleico, tal como um ARNpi, a uma célula derivada de um animal ou a um organismo capaz de administrar com eficácia o ácido nucleico às células, que ao mesmo tempo, protege o ácido nucleico de se degradar; e uma composição para administrar o ácido nucleico.
[TÉCNICA ANTERIOR]
Com os recentes avanços da biotecnologia verificou-se que vários ácidos nucleicos exibem funções bioactivas nas células. Por exemplo, os ARNpi (ARN de pequena interferência, em inglês siRNA) são conhecidos por causarem a degradação de ARNm de genes-alvo em células e assim inibirem a expressão dos genes-alvo (interferência de ARN) . A inibição da expressão de genes-alvo por interferência do ARN é útil para aliviar ou tratar sintomas de doenças causadas pela expressão anormal de genes específicos ou de aglomerados de genes e assim desenvolver os ARNpi como agentes terapêuticos. Contudo, para utilizar ácidos nucleicos, tais como os ARNpi, como agentes terapêuticos, é importante que esses ácidos nucleicos exibam as suas funções em células-alvo. Com esta 1 finalidade, é indispensável que a tecnologia administre com eficácia ácidos nucleicos a células-alvo.
As tecnologias conhecidas para administrar moléculas exógenas de ácidos nucleicos ou genes a células incluem tratamentos de doenças intratáveis em seres humanos, utilizando vários virus incluindo retrovirus, adenovirus, virus do herpes, etc. Contudo, esses tratamentos envolvem dificuldades por causa de problemas de infecções, imuno-reactividade, produtividade e similares. Por isso, estão a ser desenvolvidos veiculos não virais que não têm os problemas causados pelos virus e que podem administrar moléculas de ácidos nucleicos a células.
Por exemplo, o documento 1 das patentes relatou uma estrutura especifica comportando um lipido com uma estrutura especifica como um veiculo não virai de administração de ácidos nucleicos, que promove a administração de ácidos nucleicos, tais como ARNpi, a células. Contudo o lipido catiónico relatado no documento 1 das patentes tem um defeito que é o facto de exibir toxicidade quando administrado a células ou a organismos em cultura. 0 documento 2 das patentes descreve uma composição veicular que contém um composto anfifilico e poli-catiões como um veiculo com uma toxicidade relativamente baixa, que pode administrar ARNpi às células. Contudo, a composição relatada no documento 2 das patentes também tem um problema relacionado com a sua toxicidade para as células quando introduzida uma quantidade suficiente de ARNpi.
Em função destes antecedentes da técnica anterior, é desejável o desenvolvimento de uma composição veicular de baixa toxicidade para administrar um ácido nucleico, 2 composição essa que possa, com eficácia, administrar ácidos nucleicos, tais como ARNpi, a células.
[Documento 1 de patentes]
Publicação do pedido de patente japonesa não examinada N°. 2002-529439.
[Documento 2 de patentes]
Publicação do pedido de patente japonesa não examinada N° . 2005-508394 [DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO] [PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA PRESENTE INVENÇÃO]
Um dos objectos da presente invenção consiste em resolver os problemas da técnica antecedente referidos anteriormente. Especificamente, um dos objectos da presente invenção consiste em providenciar uma composição veicular para administrar ácido nucleico que tenha baixa toxicidade e alta sequrança, sendo que a composição veicular, quando utilizada para administrar um ácido nucleico tal como um ARNpi numa célula derivada de um animal ou num organismo é capaz de levar com eficácia os ácidos nucleicos para as células ao mesmo tempo que o protege de ser degradado; e também tem por objecto uma composição para administração de ácido nucleico contendo a composição veicular e um ácido nucleico. 3 [MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS]
Os requerentes realizaram investigações muito extensas para resolver os problemas anteriores e verificaram que uma composição contendo (A) um lípido catiónico com uma estrutura de esteróide (núcleo de esteróide) em combinação com (B) um lipido catiónico do tipo de sal de amónio quaternário, é útil como um veiculo para administrar um ácido nucleico, dado que tem baixa toxicidade e é capaz de administrar com eficácia os ácidos nucleicos ao mesmo tempo que protege os ácidos nucleicos de se degradarem. A presente invenção foi realizada por meio da extensa investigação que teve por base estas verificações. A presente invenção tem por objecto os seguintes itens:
Item 1. Uma composição veicular para administrar um ácido nucleico que compreende (A) um lipido catiónico com uma estrutura de esteróide (núcleo de esteróide) e (B) um lipido catiónico do tipo de sal de amónio quaternário.
Item 2. Uma composição veicular, de acordo com o item 1, compreendendo ainda (C) um material de base oleosa.
Item 3. Uma composição veicular, de acordo com o item 1, em que o componente (A) é 3β-[N-(Ν',Ν'-dimetilamino-etano)carbamoil]colesterol e/ou iodeto de 3β-[Ν',Ν',Ν' -trimetilaminoetano]colesterol.
Item 4. Uma composição veicular, de acordo com o item 1, em que o componente (B) é pelo menos um elemento seleccionado no grupo que consiste em sal de brometo de dimetildioctadecilamónio, dioleoiltrimetilamónio e propano e cloridrato de N-[1-(2,3-bis(oleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamónio. 4
Item 5. Uma composição veicular, de acordo com o item 1, em que o componente (B) está contido numa proporção de 10 a 200 partes em peso por 100 partes em peso do componente (A).
Item 6. Uma composição veicular, de acordo com o item 1, sendo a composição veicular uma composição veicular para administrar ARNpi.
Item 7. Uma composição de administração de um ácido nucleico, que compreende uma composição veicular, de acordo com um qualquer dos itens 1 a 5 e um ácido nucleico. Item 8. Uma composição de administração de um ácido nucleico, de acordo com o item 7, em que o ácido nucleico é um ARNpi.
Item 9. Um processo de introdução de ácido nucleico, in vitro, compreendendo o contacto da composição de administração de ácido nucleico, de acordo com o item 7, com uma célula, para introduzir o ácido nucleico na célula.
Item 10. Utilização de (A), um lípido catiónico com uma estrutura de esteróide, em combinação com (B), um lipido catónico do tipo de sal de amónio quaternário, para a produção de uma composição veicular para a administração de um ácido nucleico.
[BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS] A figura 1 mostra os resultados do exame microscópico das imagens de fluorescência derivadas do ácido nucleico das células após o tratamento utilizando cada uma das amostras de ensaio; A figura 2 mostra gráficos que ilustram os resultados da medição das actividades da luciferase das células após o tratamento, utilizando cada uma das amostras de ensaio; 5 A figura 3 mostra os resultados da medição das actividades da neprilisina (NEP) nos pulmões de ratos; A figura 4 mostra os resultados da medição do número de células vivas após o tratamento, utilizando cada uma das amostras de ensaio; e A figura 5 mostra os resultados das lâminas coradas dos tecidos de pulmão de ratos, coradas com hematoxilina e eosina, em que os núcleos, os ribossomas, etc., estão corados de azul até azulão com hematoxilina e cora-se de vermelho o citoplasma, as fibras e os glóbulos vermelhos do sangue com eosina.
[EFEITOS DA INVENÇÃO] A composição veicular para administrar um ácido nucleico e a composição de administração do ácido nucleico da presente invenção provocam os seguintes e significativos efeitos. (1) Os ácidos nucleicos podem ser administrados com eficácia a células, de tal maneira que possam efectivamente exibir as suas funções nas células. (2) Pode-se evitar a degradação dos ácidos nucleicos em organismos e em meios de cultura. (3) 0 veiculo e a composição têm baixa toxicidade e elevada segurança. A composição veicular para a administração de um ácido nucleico e a composição de administração de ácido nucleico são por isso úteis para o tratamento de várias doenças, por meio da introdução de ácido nucleico e, em particular, para o tratamento de doenças intratáveis que são difíceis de tratar com compostos de peso molecular baixo. 6 A composição de administração do ácido nucleico da presente invenção é também vantajosa pelo facto de poder ser liofilizada e assim poder ser armazenada no estado liofilizado.
[MELHOR PRÁTICA PARA A REALIZAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO] A seguir descreve-se com detalhe a presente invenção. Composição veicular para administrar ácido nucleico A composição veicular para administrar um ácido nucleico da presente invenção compreende (A) um lípido catiónico com uma estrutura de esteróide (núcleo de esteróide) e (B) um lipido catiónico do tipo de sal de amónio quaternário. A composição veicular da presente invenção é utilizada como um veiculo para administrar (introduzir) ácidos nucleicos em células.
Os ácidos nucleicos que podem ser utilizados com a composição veicular da presente invenção não estão limitados nem no tipo nem na estrutura, desde que seja necessário a sua administração às células. Exemplos desses ácidos nucleicos incluem ARNpi, ARNm, ARNt, ARNr, ADNc, miARN (microARN), ribozimas, oligonucleótidos anti-paralelos, oligonucleótidos de atracção, ADN de plasmidos, ácidos nucleicos de péptidos, oligonucleótidos formando triplexes (OFT), genes, etc. Em particular, a composição veicular da presente invenção é útil para a administração de ARNpi a células. Os ácidos nucleicos a serem administrados pela composição veicular da presente invenção podem ser derivados de seres humanos, de animais, de plantas, de bactérias, de virus, etc., ou podem ser sintetizados quimicamente. Além disso, esses ácidos nucleicos 7 podem ser de hélice simples, de hélice dupla ou de hélice tripla e não estão limitados no que respeita ao peso molecular. Além disso, na presente invenção, também se podem utilizar ácidos nucleicos modificados com produtos quimicos, enzimas ou péptidos. Na presente invenção, esses ácidos nucleicos podem ser utilizados isoladamente ou em combinação. 0 lipido catiónico com uma estrutura de esteróide (daqui para a frente algumas vezes referido como "componente (A)") utilizado na composição veicular da presente invenção é um lipido que é catiónico e tem uma estrutura de esteróide (anel de per-hidrociclopentafenantreno; C17H28) · 0 lipido catiónico com uma estrutura de esteróide para ser utilizado na presente invenção não está limitado desde que seja aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Exemplos específicos desses lípidos incluem 3β-[N-(Ν',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]-colesterol (DC-Col), iodeto de 3β-[Ν',Ν',Ν'-trimetilaminoeta-ηο]colesterol (TC-Col), bis (guanidinio)-trencolesterol (BGTC), N-colesteriloxicarbonil-3,7-diazanonano-l,9-diamina, β-alanina-dietanolamina-colesterol, carbamato de N4-espermina e colesterilo (GL-67), carbamato de N [N4-3-aminopropil-espermidina]colesterilo (GL-78), N4-espermina-colesteril-carboxamida (GL-90), carbamato de N1, N8-bis(carboxamida argínica)-N4-espermidina e colesterilo (GL-95), carbamato de N-[N1, N4, N8-tris(3-aminopropil)espermidina]colesterilo (GL-96) e derivados de colesterol semelhantes (lípidos catiónicos com uma estrutura de colesterol); esqualamina, 3a,7a,12a-tris (3-aminopropoxi)-5β-οοΐ3η-24-(Ν,Ν-bis(3-aminopropil)amina), 3a,7a,12a-tris(3-aminopropoxi)-5β-σοΐ3η-24-(N-(N-(3-aminopropil) )-3-aminopropil)amina, 3a,7a,12a-tris(3-azidopropoxi)-5β-colan-24-(Ν,Ν-bis(2-cianoetil)amina)), 3a,7a,12a-tris(3-azi dopropoxi) -5β-οοΐ3η-24-(N-(benziloxicarbonil)-N-(3-hidroxi-propil)amina) e lípidos catiónicos semelhantes a que se ligam os esteróides; conjugados do grupo espermina e lípidos 8 catiónicos semelhantes aos quais se liga o ácido eólico; lipidos catiónicos aos quais se liga o glicósido esterol; lípidos catiónicos aos quais se liga o esteróide saponina; etc.
Esses lipidos catiónicos simples com uma estrutura de esteróide podem ser utilizados isoladamente ou em combinação.
Exemplos preferidos de lipidos catiónicos com uma estrutura de esteróide incluem derivados de colesterol (lip idos catiónicos com uma estrutura de colesterol) e, mais preferencialmente, os seus exemplos incluem 3β-[N-(Ν',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol e iodeto de 3β-[N',N',N'-trimetilaminoetano]colesterol (TC-Col). 0 lipido catiónico do tipo de sal de amónio quaternário para ser utilizado na presente invenção (daqui para a frente algumas vezes referido como "componente (B)") não está limitado desde que seja aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Exemplos específicos destes lípidos incluem brometo de dimetildioctadecilamónio (DDAB), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-pro-pano (DOTAP), metilsulfato de 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio e propano, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-distearoil-3-trimetilamonio-propano, cloridrato de N-(1-(2,3-bis(oleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA), brometo de dimiristoiloxipropil-dimetil-hidroxietilamónio (DMRIE), brometo de dioleoiloxipropil-dimetil-hidroxietilamónio (DORIE), brometo de dimetilodidodecilamónio, cloridrato de N-(oí-trimetilamonioacetil) didodecil-D-glutamina, cloridrato de N- (oí-trimetilamonioacetil) -0, 0' -bis- (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorode-cil)-L-glutamina, cloridrato de 0,0'-didodecanoil-N-(a-trime-tilamonioacetil)dietanolamina, brometo de metilalil-didode-cil-amónio, cloridrato de N-{p-(ω-trimetilamoniobutiloxi)- 9 benzoil}-didodecil-L-glutamina, brometo de 9-(co-trimetil-amoniobutil)-3,6-bis(dodecanoil)carbazol, cloridrato de dimetildioctadecil-amónio, brometo de Ν-ω-trimetilamoniodeca-noil-di-hexadecil-D-glutamina, brometo de N-{p-(co-trimetil-amonio-hexiloxi)-benzoil}-ditetradecil-L-glutamina, sal de brometo de p-(ω-trimetilamoniodeciloxi)-p'-octiloxiazobenzeno (MC-1-0810), sal de brometo de p-{ω-(β-hidroxietil)dimetil-amonio-deciloxi}-p'-octiloxiazobenzeno (MC-3-0810), sal de brometo de 0,0',0"-tridodecanoil-N-(ω-trimetilamonio- decanoil)tris(hidroximetil)aminometano (TC-1-12), 1,2-di- lauril-glicero-3-etilfosfocolina, 1, 2-dimiristoil-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dipalmitoil-glicero-3-etilfos-focolina, l,2-distearoil-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dioleoil- glicero-3-etilfosfocolina, l-palmitoil-2-oreoil-glicero-3-etilfosfocolina, etc. Estes lípidos catiónicos do tipo de sal de amónio quaternário podem ser utilizados isoladamente ou em combinação.
Estre estes lípidos catiónicos do tipo de sal de amónio quaternário preferem-se brometo de dimetildioctadecilamónio (DDAB), dioleoiltrimetilamonio-propano (DOTAP), cloridrato de N- (1- (2,3-bis(oleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA), cloridrato de 0,0'-didodecanoil-N-(α-trimetilamonioacetil)-dietanolamina (DC-6-12, n=12; e DC-6-14, n=14), sal de brometo de p-{ω-(β-hidroxietil)dimetilamonio-deciloxi}-p'-octiloxiazobenzeno (MC-3-0810) e brometo de 0,0',0"-trido-decanoil-N-(ω-trimetil-amoniodecanoil)tris(hidroximetil)-aminometano (TC-1-12); e são particularmente preferidos brometo de dimetildioctadecilamónio (DDAB), dioleoiltrimetilamonio-propano (DOTAP) e cloridrato de N-(l-(2,3-bis-(oleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA).
Na composição veicular da presente invenção, a proporção entre a componente (A) e a componente (B) não está limitada 10 e, do ponto de vista da melhoria da administração de ácidos nucleicos e da melhoria da eficiência em células, a proporção do componente (B) pode ser, por exemplo, de 10 a 200 partes em peso, preferencialmente, 30 a 150 partes em peso e, mais preferencialmente, 75 a 125 partes em peso, por 100 partes em peso do componente (A). A proporção total dos componentes (A) e (B) em relação à quantidade total da composição de veiculo da presente invenção pode ser, por exemplo, 10 a 100 % em peso, preferencialmente, 20 a 80 % em peso e, mais preferencialmente, 40 a 70 % em peso. A composição veicular da presente invenção pode conter um material de base oleosa (daqui para a frente algumas vezes referido como "componente (C)"), para além dos componentes (A) e (B). Quando se adiciona um material de base oleosa, as suas propriedades tornam possível controlar a eficácia da introdução dos ácidos nucleicos por meio da administração de uma composição veicular de ácido nucleico. Por exemplo, quando se adiciona um material de base oleosa para ajustar o peso especifico da composição veicular, o grau de contacto da composição veicular com as células pode ser controlado melhorando assim a eficácia da introdução in vitro. Alternativamente, por exemplo, quando se adiciona um material de base oleosa sensível à temperatura, o núcleo da composição veicular pode desintegrar-se em condições de temperatura pré-determinadas para induzir flutuações na superfície das células, melhorando assim a eficácia da introdução do ácido nucleico. Além disso, alternativamente, por exemplo, quando se adiciona um material de base oleosa que tem uma capacidade disruptiva por estímulos externos, o núcleo da composição veicular pode desintegrar-se por um estímulo externo para induzir flutuações na superfície da célula, melhorando assim a eficácia da introdução de ácido nucleico. 11
Exemplos de materiais de base oleosa podem ser adicionados à composição veicular da presente invenção incluem perfluorocarbono, perfluoropentano, brometo de perfluoro-octilo, perfluoro-hexano, perfluorotributilamina, óleo de soja, óleo de soja refinado, óleo de soja hidrogenado, óleo de soja não-saponifiçado, esqualeno, óleo de rícino, óleo de cravo, trioleato de sorbitano, óleo de turmentina, óleo de açaflor, ácido gordo de óleo de açaflor, ácido oleico, óleo de palma, óleo de colza, óleo de álcool amilico, azeite, óleo de linhaça, óleo de sésamo, óleo de gergelim, óleo de clorofila, óleo de protão, óleo de bergamota, óleo de cedro, óleo de laranja, óleo de funcho, óleo de eucalipto, óleo de milho, óleo de alfazema, óleo de manjerona, óleo de limão, óleo de sementes de algodão, óleo de coco, óleo de gema de ovo, óleo de rosas, óleo de pinheiros, óleo de amendoim, óleo de camélia, óleo branco de canfora, óleo de camomila, óleo de canela, óleo de hortelã-pimenta, óleo de milho esterifiçado, óleo de gengibre, óleo de camomila romana, óleo de serpente, óleo de hortelã, óleo de semente de girassol, manteiga de cacau, óleo de gérmen de trigo, óleo de óxido de zinco, óleos endurecidos, óleos vegetais hidrogenados, parafina liquida leve, parafina liquida, triglicéridos de ácidos gordos de cadeia média, óleo de marta, óleo de laranja amarga, óleo de rícino e polioxietileno, óleo de rícino 10 e polioxietileno hidrogenado, óleo de rícino 100 e polioxietileno hidrogenado, óleo de rícino 20 e polioxietileno hidrogenado, óleo de rícino 40 e polioxietileno hidrogenado, óleo de rícino 5 e polioxietileno hidrogenado, óleo de rícino 50 e polioxietileno hidrogenado, óleo de rícino 60 e polioxietileno hidrogenado, óleo de rícino 35 e polioxilo, óleos de processo, etc. Entre estes materiais de base oleosa, o perfluoropentano é sensível à temperatura e é caracterizado por um ponto de ebulição e por ser gasificado a 29,5 °C. Além 12 disso, o perfluoro-hexano, o brometo de perfluoro-octilo e a perfluorotributilamina têm uma capacidade disruptiva por estimulo externo e são caracterizados por causarem cavitação da composição veicular e por a desintegrarem quando recebem um estimulo externo tal como uma radiação ultra-sónica.
Quando está contido um material de base oleosa, a proporção não está limitada desde que os efeitos da presente invenção não sejam prejudicados e essa proporção pode ser, por exemplo, de 0,1 a 50 partes em peso, preferencialmente, 1 a 30 partes em peso e, mais preferencialmente, 5 a 20 partes em peso, por 100 partes do peso total dos componentes (A) e (B) . O veiculo de transporte do ácido nucleico da presente invenção pode ainda conter um lipido fusogénico da membrana (lipido auxiliar), se necessário. Quando contém esse lipido de fusão da membrana, a composição veicular da presente invenção tem ainda mais eficácia na administração de ácidos nucleicos às células. Exemplos desses lipidos que fundem a membrana incluem dioleoilfosfatidiletanolamina, dioleoil-fosfatidilcolina, transfosfatidilfosfatidiletanolamina, 1,2-bis-(10,12-tricosadinoil)-fosfoetanolamina, 1,2-dielaidoil-fosfoetanolamina, 1,2-di-hexadecilfosfoetanolamina, 1,2-di-hexanoilfosfoetanolamina, 1,2-dilauroilfosfoetanol-amina, 1,2-dilinoleoilfosfoetanolamina, 1,2-dimiristoilfosfo-etanol-amina, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina, 1,2-dipalmitoleoil-fosfoetanolamina, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina, 1,2-di-fitanoilfosfoetanolamina, 1,2-distearoilfosfoetanolamina, 1-palmitoil-2-oleoilfosfoetanolamina, l-palmitoil-2-(10,12-tri-cosadinoil)fosfoetanolamina, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-caproilamina, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N-caproil-amina, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N,N-dimetilo, 1,2-dipalmitoilf osf oetanolamina-N, N-dimetilo, 1,2-dipalmitoilfosfoeta- 13 nolamina-N-dodecanoílo, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-dode- canoílo, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-dodecanilamina, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N-dodecanilamina, 1,2-dioleoil- fosfoetanolamina-N-glutarilo, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolami- na-N-glutarilo, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-lactose, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-[4(p-maleimidemetil)ciclo-hexano-carboxilato, dipalmitoilfosfoetanolamina-N-[4(p-maleimidemetil) ciclo-hexano-carboxilato, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N- [4(p-maleimidefenil)butilamida, 1,2-dioleoilfosfoetanol-amina-N-[4(p-maleimidefenil)butirato], 1,2-dioleoilfosfoeta-nolamina-N-metilo, dipalmitoilfosfoetanolamina-N-metilo, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato, 1,2-dipalmitoilfosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)proprio-nato, 1,2-dioleoilfosfoetanolamina-N-(succinilo), 1,2-dipalmitoilf osf oetanolamina-N- (succinilo) , etc. Entre estes lipidos pode-se utilizar, com vantagem, dioleoilfos- fatidiletanolamina no veiculo que transporta o ácido nucleico da presente invenção.
Quando está contido esse lípido que se funde na membrana, a sua proporção não está limitada desde que os efeitos da presente invenção não sejam prejudicados e pode ser, por exemplo, de 1 a 500 partes em peso, preferencialmente, 10 a 250 partes em peso e, mais preferencialmente, 25 a 100 partes em peso, por 100 partes do peso total dos componentes (A) e (B). A composição veicular da presente invenção pode conter vários aditivos, tais como agentes isotónicos, excipientes, diluentes, espessantes, estabilizantes, tampões, conservantes, etc., conforme necessário. As quantidades desses aditivos que se adicionam podem ser seleccionadas, de forma apropriada, de acordo com a forma de utilização da composição veicular. 14 A composição veicular da presente invenção pode ser produzida misturando os componentes (A) e (B) e, eventualmente, outros componentes.
Composição de administração de ácido nucleico A composição para administração de ácido nucleico da presente invenção compreende a composição veicular descrita anteriormente e um ácido nucleico. Nesta composição, o ácido nucleico forma um complexo com os componentes da composição veicular por via de ligações iónicas e/ou hidrofóbicas, de tal maneira que a composição de administração de ácido nucleico melhora a administração de ácido nucleico às células. A composição para administração de ácido nucleico da presente invenção produz-se por mistura da composição veicular com um ácido nucleico ou por mistura de um ácido nucleico com os componentes da composição veicular em qualquer ordem.
Na composição para administração de ácido nucleico da presente invenção, a proporção entre o ácido nucleico e a composição veicular varia consoante os tipos de ácido nucleico e o veículo de administração do ácido nucleico, o tipo de células-alvo para a administração do ácido nucleico, etc., e a proporção do ácido nucleico pode ser, por exemplo, de 0,1 a 300 partes em peso, preferencialmente, 1 a 100 partes em peso e, mais preferencialmente, 2,5 a 50 partes em peso, por 100 partes do peso total dos componentes (A) e (B) .
Além disso, a quantidade total dos componentes (A) e (B) na composição de administração de ácido nucleico pode ser, por exemplo, 10 a 90 % em peso, preferencialmente, 30 a 80 % 15 em peso e, mais preferencialmente, 50 a 70 % em peso, do peso total da composição. A composição de administração de ácido nucleico da presente invenção pode conter vários aditivos, tais como agentes isotónicos, excipientes, diluentes, espessantes, estabilizantes, tampões, conservantes, etc., de acordo com a forma de utilização. As quantidades desses aditivos podem ser seleccionadas apropriadamente de acordo com a forma de utilização da composição de administração de ácido nucleico.
Na presente invenção, exemplos de células a que se pode administrar ácidos nucleicos incluem células de cultura, células isoladas de organismos (incluindo linhas de células estabelecidas), etc. A forma de utilização da composição de administração de ácido nucleico, in vitro, da presente invenção, não está limitada desde que a composição possa ser posta em contacto com células-alvo para a introdução do ácido nucleico. Administra-se um ácido nucleico a células de cultura ou a células isoladas de um organismo e, por exemplo, pode-se adicionar previamente a composição de administração de ácido nucleico a um meio para a cultura das células. Um ácido nucleico pode também ser administrado às células da cultura ou a células isoladas de um organismo na presença de soro sanguíneo. A presente invenção também tem por objecto um ácido nucleico que pode ser administrado às células in vivo, e exemplos de formas de utilização da composição aqui descrita incluem injecção directa no tecido; injecção sob a pele ou numa veia, músculo, cavidade abdominal, olhos, órgãos digestivos, dentes, etc.; administração por inalação na cavidade nasal, cavidade oral, pulmões, etc.; administração oral; administração transdérmica; e administração transmucosa 16 através da mucosa oral, mucosa vaginal, mucosa ocular, mucosa rectal ou mucosa uterina; e similares.
MELHOR FORMA DE REALIZAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção vai ser descrita em detalhe a seguir com referência aos exemplos, etc., que não pretendem limitar o âmbito da presente invenção. EXEMPLO 1
Preparou-se uma composição veicular para administrar ácido nucleico com a seguinte fórmula.
Brometo de dimetildioctadecilamónio 0,9 pg 3β-[N-(Ν',Ν'-dimetilaminoetano)carbamoil]-colesterol 0,9 pg
Dioleoilfosfatidiletanolamina 0,9 pg
Glicerol 40,5 pg
Água purificada 2 pL
Meio OPTI-MEM (produzido pela Invitrogen Corporation)Quantidade _apropriada
Quantidade total 50 pL EXEMPLO 2
Preparou-se primeiro uma solução que contém um ácido nucleico com a seguinte composição. ARNpi 2 pmole
Meio OPTI-MEM (produzido pela Invitrongen Corporation) Quantidade apropriada
Quantidade total 50 pL
Em seguida, misturou-se 50 pL da composição veicular do exemplo 1 com 50 pL da solução contendo o ácido nucleico e fez-se uma incubação da mistura, durante 20 minutos, à 17 temperatura ambiente, de forma a preparar uma composição para administração de ácido nucleico. EXEMPLO 3
Preparou-se uma composição veicular para administrar um ácido nucleico com a seguinte fórmula.
Brometo de dimetildioctadecilamónio 0,5 mg 3β-[N-(Ν',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]-colesterol 0,5 mg
Dioleoilfosfatidiletanolamina 0,5 mg
Sacarose 88,9 mg Água purificada . . . , , . _Quantidade apropriada
Quantidade total 1,0 mL EXEMPLO 4
Preparou-se uma composição veicular para administrar um ácido nucleico com a seguinte fórmula.
Brometo de dimetildioctadecilamónio 0,5 mg 3β-[N-(Ν',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]-colesterol 0,5 mg
Dioleoilfosfatidiletanolamina 0,5 mg Água purificada . . . , , . _Quantidade apropriada
Quantidade total 1,0 mL EXEMPLO DE ENSAIO 1
Para avaliar a capacidade da composição de administração de ácido nucleico do exemplo 2 para administrar ARNpi às células, realizaram-se os ensaios que se seguem utilizando células A549 (estirpe de células derivadas de cancro de pulmão humano; Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.) como células-modelo. Neste ensaio, utilizou-se GL3-ARNpi marcadas por fluorescência (ARNpi que atinge luciferase de pirilampo; Dharmacon Corporation, Boulder, CO, EUA; Paralelo: 5'- 18 CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT; Anti-paralelo: 5'-UCGAAGUACUCAGCGU- AAGdTdT).
Em primeiro lugar semearam-se células A549, cuja concentração tinha sido ajustada para 1,2 x 105 células/mL com meio DMEM (médio Dulbecco essencial minimo) , numa placa de 24 poços, a 6,0 x 104 células por poço. Em seguida, adicionou-se a cada poço 500 yL de uma de cada das amostras de ensaio ilustradas no quadro 1 e incubou-se, a 37 °C, em CO2 a 5 %, durante 24 horas. Observaram-se imagens de fluorescência derivadas do ácido nucleico nas células com um microscópio de fluorescência (microscópio de fluorescência Olympus IX 71; Olympus, Tóquio, Japão), de modo a avaliar a capacidade de cada amostra de ensaio para administrar ARNpi às células.
[Quadro 1]
Amostra de ensaio Fórmula N° . Indicação na figura 1 1 Composição veicular + ARNpi A composição de administração de ácido nucleico do exemplo 2 2 LFA2000 + ARNpi Meio OPTI-MEM contendo LFA2000 (lipofectamina 2000; Produzida pela Invitrogen Corporation) (1,0 mg/mL) e ARNpi (20 pmole/mL) 3 NeoFectina + ARNpi Meio OPTI-MEM contendo neofectina (Produzida pela NeoPharm) (1,0 mg/mL) e ARNpi (20 pmole/mL) 4 ARNpi Meio OPTI-MEM contendo ARNpi (20 pmole/mL)
Os resultados estão ilustrados na figura 1. Quando se adiciona apenas ARNpi, não se observa fluorescência nas células. Pelo contrário, quando a composição de administração de ácido nucleico do exemplo 2 ou um veiculo conhecido de administração às células (isto é, LFA2000 ou neofectina) foi adicionado em conjunto com o ARNpi, observou-se fluorescência nas células. Particularmente, quando a composição de administração de ácido nucleico do exemplo 2 foi utilizada, observou-se uma forte fluorescência nas células. Estes resultados confirmaram que a composição de administração de 19 ácido nucleico da presente invenção exibe uma excelente capacidade de administração de ácido nucleico. EXEMPLO DE ENSAIO 2
Para avaliar a supressão de um gene-alvo ao nivel da proteína introduziu-se, temporariamente, um plasmido de codificação para o gene de luciferase nas células e, em seguida, adicionou-se a composição de administração de ácido nucleico do exemplo 2 às células, de modo a avaliar a quantidade de expressão de luciferase. Utilizou-se no ensaio GL3-ARNpi (ARNpi que atinge luciferase de pirilampo; Dharmacon Corporation, Boulder, CO, EUA; Paralelo: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT; Anti-paralelo: 5'-UCGAAGUACUCAGCG-UAAGdTdT).
Mais especificamente, adicionou-se 10 yg de pGL3 Luciferase ou Renilla Luciferase (Promega, Madison, WI, EUA) , a 5 x 106 células A549 (estirpe celular derivada de cancro de pulmão humano; produzida pela Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.) e fez-se a electroporação das células utilizando um nucleofector (Amaxa Inc., Gaithersburg, MD, EUA). As células em que tinha sido introduzida pGL3 Luciferase e Renilla Luciferase foram então ajustadas para 1,2 x 10s/mL com meio DMEM (meio de Dulbecco essencial mínimo), que estava isento de soro ou continha 10 % em volume de soro bovino fetal e, em seguida, semearam-se numa placa de 24 poços a 6,0 x 104 células por poço. Em seguida, adicionou-se, a cada poço, 500 yL de cada uma das amostras de ensaio ilustradas no quadro 2, e incubou-se, a 37 °C, em CO2 a 5 %, durante 24 horas. Fez-se a lise das células nos poços por um processo convencional para preparar lisados de células e avaliaram-se os lisados das células quanto à actividade de luciferase utilizando um sistema duplo de ensaio-repórter de luciferase (Promega, 20
Madison, WI, EUA). Avaliaram-se as actividades de luciferase calculando a proporção entre as actividades de luciferase de pirilampo e as de Renilla Luciferase (actividade relativa: %) .
[Quadro 2]
Amostra de ensaio Fórmula N°. Indicação na figura 2 1 Composição veicular + ARNpi A composição de administração de ácido nucleico do exemplo 2 2 LFA2000 + ARNpi Meio OPTI-MEM contendo LFA2000 (lipofectamina 2000; Produzida pela Invitrogen Corporation) (1,0 mg/mL) e ARNpi (20 pmole/mL) 3 NeoFectina + ARNpi Meio OPTI-MEM contendo neofectina (Produzida pela NeoPharm) (1,0 mg/mL) e ARNpi (20 pmole/mL) 4 ARNpi Meio OPTI-MEM contendo ARNpi (20 pmole/mL) 5 LFA2000 Meio OPTI-MEM contendo LFA2000 (lipofectamina 2000; Produzida pela Invitrogen Corporation) (1,0 mg/mL) 6 NeoFectina Meio OPTI-MEM contendo neofectina (Produzida pela NeoPharm) (1,0 mg/mL) 7 Composição veicular Meio OPTI-MEM contendo a composição veicular do exemplo 1 (50 % em volume) 8 Controlo Meio OPTI-MEM
Os resultados estão ilustrados na figura 2. Os resultados confirmaram que a utilização da composição de administração de ácido nucleico do exemplo 2 permite uma administração altamente eficaz de ARNpi às células e a expressão da função de ARNpi nas células, independentemente da presença ou da ausência de soro no meio. EXEMPLO DE ENSAIO 3
Neste ensaio, avaliou-se a composição veicular do exemplo 3 quanto à sua capacidade para administrar ARNpi a células de tecido de pulmão e quanto à funcionalidade do ARNpi nas células, utilizando neprilisina de rato (ARNpi que atinge a neprilisina de rato (NM_012608); ARN-TEC NV
Corporation, Bélgica; Paralelo: 5'-GCUCCAAAGCCGAAGAAGAdTdT, Anti-paralelo: 5'-UCUUCUUCGGCUUUGGAGCdTdT). 21
Preparou-se a composição de administração de ácido nucleico misturando a composição veicular do exemplo 3 com ARNpi numa proporção em peso de 1:1. Em seguida, administrou-se 0,4 mL de uma solução de ensaio, que tinha sido preparada por diluição da composição de administração de ácido nucleico com um veiculo apropriado (solução de sacarose a 8,89 % p/v), por via dos pulmões, a ratos machos SD, pesando 250-320 g ao mesmo tempo que se anestesiavam com um agente anestésico de inalação, o isoflurano (produzido pela Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), utilizando um dispositivo de inalação IA-1B (PENNCENTURY, Philadelphia, PA, EUA) . Preparou-se a solução de ensaio diluindo a composição de administração de ácido nucleico, conforme apropriado, de tal modo que a dose de ARNpi foi de 0,04 a 1,2 mg/kg (por rato). Vinte e quatro horas após a administração pulmonar, anestesiou-se cada rato com éter e fixou-se na posição de costas. Fez-se uma incisão na linha média abdominal e o rato foi morto por hemorragia por via da veia cava inferior abdominal. Em seguida retiraram-se os pulmões do rato e lavaram-se com uma solução salina fisiológica arrefecida com gelo. Utilizando os pulmões removidos, mediu-se a quantidade de expressão de ARNm de um gene-alvo modelo, NEP (endopeptidase neutra) e a quantidade de expressão de ARNm de um gene organizado, GAPDH (gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase). Além disso, mediu-se a actividade da neprilisina de rato (NEP) nos pulmões removidos. Os processos de medição e os resultados estão descritos com detalhe a seguir. Como controlo, realizou-se do mesmo modo, um ensaio por meio da administração apenas de veiculo (solução de sacarose a 8,89 % p/v) aos ratos, nas mesmas condições. Para comparação, utilizou-se também um ensaio utilizando ARNpi (Takara, Japão; Paralelo: 5'-GAACGGCAUCAAGGUGAACTT, Anti-paralelo: 5'-GUUCACCUUGAUGCCGUUCTT) atingindo EGFP (proteina fluorescente verde melhorada) em vez de neprilisina de rato. 22 <Processo e resultados da quantificação de ARNm de NEP e ARNm de GAPDH>
Isolou-se o ARN total de uma porção dos pulmões removidos e purificou-se utilizando um mini-estojo RNeasy (QIAGEN, Alemanha) . Realizou-se a conversão de ARNm em ADNc utilizando um sistema de síntese da primeira hélice SuperScript III para RCP-TI (Invitrogen, Califórnia, EUA) . A quantidade de ARNm para o gene-alvo modelo NEP (endopeptidase neutra) foi quantificada por RCP em tempo real, utilizando o ADNc preparado. Do mesmo modo, quantificou-se a quantidade de ARNm para o gene de organização de GAPDH (gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase). Avaliou-se a supressão da expressão de ARNm de neprilisina calculando a proporção de ARNm de NEP e ARNm de GAPDH. 0 resultado confirmou que a expressão de ARNm de neprilisina nos pulmões foi suprimida significativamente por neprilisina-ARNpi numa dose de 0,08 mg/kg. Como esta dose é mais baixa do que a dose relatada anteriormente como providenciando os efeitos de ARNi in vivo, ficou demonstrado que a administração eficaz de ARNpi, a células de tecidos de pulmão, pode ser conseguida utilizando a composição veicular do exemplo 3. <Processo e resultados para a medição da actividade de neprilisina (NEP) de rato>
Homogeneizou-se uma porção dos pulmões removidos e mediu-se a actividade de neprilisina de rato no homogeneizado. A actividade da neprilisina de rato (NEP) foi determinada pela medição da quantidade de substrato de NEP, DAGNPG (N-Dansil-D-Ala-Gli-p-nitro-Fen-Gli: SIGMA), hidrolisou-se num determinado período na presença ou na 23 ausência de um inibidor específico de NEP, fosforamido (SIGMA) e avaliou-se a diferença nas quantidades de hidrolisado na presença ou na ausência de inibidor. 0 homogeneizado de pulmão de rato foi utilizado numa quantidade de 50 pL; utilizou-se o substrato de DAGPNG numa concentração de 1 mM; e adicionou-se o inibidor, fosforamido, quando presente, a uma concentração de 10 mM, de modo que se realizaram as reacções num volume total de 100 pL. As reacções realizaram-se a 37 °C, durante 10 minutos e pararam-se por incubação, a 90 °C, durante 10 minutos. Determinou-se a actividade de NEP medindo as quantidades do hidrolisado DAG (Dansil-D-Ala-Gli) resultante. A quantidade de hidrolisado produzido foi determinada medindo a fluorescência do hidrolisado: mediu-se excitação realizada a 360 nm e emissão de fluorescência 535 nm.
Os resultados, no caso de uma dose de ARNpi de 0,4 mg/kg estão ilustrados na figura 3. Os resultados mostram que a actividade de NEP nos pulmões foi significativamente suprimida por NF-ARNpi, numa dose de 0,4 mg/kg. De acordo com isto, os resultados mencionados antes também confirmaram que a administração eficaz de ARNpi a células de tecidos de pulmão pode ser conseguida utilizando a composição veicular do exemplo 3. EXEMPLO DE ENSAIO 4
Avaliou-se a composição veicular do exemplo 1 quanto à citotoxicidade utilizando um sistema de ensaio de proliferação de células Premix WST-1 (Takara, Siga, Japão). Mais especificamente, semearam-se células A549 (estirpe de células derivadas de cancro de pulmão humano; produzidas pela Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.), cuja concentração tinha sido ajustada para 1 x 105 células/mL com meio DMEM (meio de 24
Dulbecco essencial minimo), numa placa de 96 poços, a 104 células por poço. Em seguida, adicionou-se a cada poço, uma de cada das amostras de ensaio, isto é, a composição veicular do exemplo 1, LFA2000 (lipofectamina 2000; produzida pela Invitrogen) e neofectina (produzida pela NeoPharm Corporation), a uma concentração de 2 a 20 yg/mL. Depois, adicionou-se, a cada poço, 10 yL de uma solução de Premix WST-1 e fez-se a incubação das células, a 37 °C, durante 1 hora. Em seguida, mediu-se a absorvência de cada poço a 450 nm utilizando um leitor de microplacas (Tecan, Maennedorf, Suiça). Como controlo, adicionou-se um meio aos poços em vez das amostras de ensaio e fez-se a medição, da mesma forma. A absorvência, a 450 nm, representa a absorvência do corante formazano que é formado a partir de WST-1, por meio de uma redutase. Como existe uma relação linear entre esta absorvência e as células vivas, preparou-se uma curva de calibração entre o número de células vivas semeadas e a absorvência. O número de células de cada amostra de ensaio foi determinado com base na curva de calibração.
Os resultados estão ilustrados na figura 4. Os resultados confirmaram que o número de células decresceu fortemente com a adição da composição veicular do exemplo 1 e, por isso, a composição veicular tem uma baixa toxicidade e uma elevada segurança. EXEMPLO DE ENSAIO 5
Administrou-se a ratos machos SD (SLC, Tóquio, Japão), pesando 250-320 g, por via dos pulmões, uma solução de ensaio preparada diluindo 500 yg da composição veicular do exemplo 4 com água purificada até 0,4 mL utilizando um dispositivo 1A-IC produzido pela Penncentury Corporation. Depois da administração, cada rato voltou à gaiola e manteve-se em 25 condições normais. Vinte e quatro horas após a administração pulmonar administrou-se, intraperitonialmente, aos ratos, 50 mg/kg (1 mL/kg) de pentobarbital (nembutal, produzido pela Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.) e os ratos, após anestesia, foram fixados na posição de costas. Fez-se uma incisão abdominal média, os ratos foram mortos por via de hemorragia da veia cava abdominal inferior. Em seguida removeram-se os pulmões do rato e lavaram-se com uma solução salina fisiológica arrefecida com gelo. Prepararam-se lâminas de tecido do pulmão removido e examinaram-se as lâminas ao microscópio por meio de coloração com hematoxilina e eosina, de modo a avaliar a toxicidade da composição veicular para o tecido pulmonar. Para comparação, realizaram-se testes nas condições anteriores utilizando LFA2000 (lipofectamina 2000; produzida pela Invitrogen) ou neofectina (produzida pela NeoPharm Corporation) em vez da composição veicular do exemplo 4. Como os ratos foram mortos por administração de 500 yg de LFA2000, o ensaio foi realizado com a dose de LFA2000 alterada para 250 yg.
Os resultados estão ilustrados na figura 5. Ocorreu inflamação nos ratos aos quais se administrou localmente nos pulmões LFA2000 e neofectina e observaram-se edemas locais. Pelo contrário, confirmou-se que esses sintomas inflamatórios estavam reduzidos nos ratos aos quais se tinha administrado a composição veicular do exemplo 4. Os resultados confirmaram que a composição veicular do exemplo 4 tem baixa toxicidade mesmo após a administração pulmonar local e que é altamente segura.
Lisboa, 21 de Maio de 2013. 26

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição veicular para administrar um ácido nucleico, caracterizada pelo facto de compreender (A) um lipido catiónico com uma estrutura de esteróide e (B) um lipido catiónico do tipo de sal de amónio quaternário.
  2. 2. Composição veicular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de compreender ainda (C) , um material de base oleosa.
  3. 3. Composição veicular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o componente (A) ser 3β-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol e/ou iodeto de 3β-[Ν',Ν',Ν'-trimetilaminoetano]colesterol.
  4. 4. Composição veicular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o componente (B) ser pelo menos um elemento seleccionado no grupo que consiste em sal de brometo de dimetildioctadecilamónio, dioleoil-trimetilamónio-propano e cloridrato de N-[1-(2,3-bis-(oleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamónio.
  5. 5. Composição veicular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o componente (B) estar contido numa proporção de 10 a 200 partes em peso, para 100 partes em peso do componente (A).
  6. 6. Composição veicular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser uma composição veicular para a administração de um ARNpi.
  7. 7. Composição para administração de ácido nucleico, caracterizada pelo facto de compreender uma composição 1 veicular de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5 e um ácido nucleico.
  8. 8. Composição para administração de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de o ácido nucleico ser um ARNpi.
  9. 9. Processo de introdução, in vitro, de ácido nucleico, caracterizado pelo facto de compreender o contacto de uma composição para administração de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 7, com uma célula, para introduzir o ácido nucleico na célula.
  10. 10. Utilização de (A) um lípido catiónico com uma estrutura de esteróide, em combinação com (B) um lípido catiónico do tipo de sal de amónio quaternário caracterizada pelo facto de se destinar à produção de uma composição veicular para administrar um ácido nucleico. Lisboa, 21 de Maio de 2013. 2
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