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PT1866423E - Produção de metabolitos microbiais secundários altamente marcados com isotopos e metabolitos correspondentes - Google Patents

Produção de metabolitos microbiais secundários altamente marcados com isotopos e metabolitos correspondentes Download PDF

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PT1866423E
PT1866423E PT06704767T PT06704767T PT1866423E PT 1866423 E PT1866423 E PT 1866423E PT 06704767 T PT06704767 T PT 06704767T PT 06704767 T PT06704767 T PT 06704767T PT 1866423 E PT1866423 E PT 1866423E
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PT
Portugal
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process according
production
chromatography
liquid
Prior art date
Application number
PT06704767T
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Inventor
Martin Freudenschuss
Georg Haeubl
Rudolf Krska
Guenther Jaunecker
Eva Binder
Original Assignee
Erber Ag
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Publication date
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Description

DESCRIÇÃO
PRODUÇÃO DE METABOLITOS MICROBIAIS SECUNDÁRIOS ALTAMENTE MARCADOS COM ISOTOPOS E METABOLITOS CORRESPONDENTES A presente invenção refere-se a um processo para a produção de metabolitos secundários marcados com isótopos, a partir de fungos ou bactérias, num meio de cultura sintético liquido, e a metabolitos secundários marcados com isótopos seleccionados do grupo das micotoxinas, toxinas ou antibióticos.
Actualmente, as substâncias marcadas com isótopos ganham cada vez mais importância, sobretudo na tecnologia da cromatografia liquida acoplada a um detector de espectrometria de massas (LC/MS) que permite uma análise espectrográfica eficiente com elevada produtividade. A tecnologia pode ser usada para uma grande diversidade de potenciais analitos não havendo limitação da massa molecular mas problemas na comprovação das várias substâncias na medida em que tem de haver uma atribuição correspondente tanto dos espectros de desintegração como dos vários picos moleculares. Para obter uma aplicação e métodos LC/MS fiáveis, ganha cada vez mais importância a utilização das chamadas substâncias padrão internas. Os padrões internos são substâncias que apresentam uma elevada semelhança com o analito destino propriamente dito, isto é, sobretudo, se possivel, uma estrutura molecular idêntica mas com um peso molecular diferente. Como padrões internos ideais revelaram-se, por isso, moléculas marcadas com isótopos do analito destino, ou seja, moléculas nas quais um ou vários átomos na molécula são substituídos pelos seus isótopos. Actualmente, tais substâncias são produzidas mediante síntese orgânica, na medida em que, por exemplo, os hidrogénios e os carbonos são substituídos pelos respectivos isótopos mais pesados. 1
No entanto, neste contexto, as análises LC/MS mostraram ser desejável que as substâncias marcadas com isótopos, usadas como padrões internos possuam uma diferença na massa molecular de pelo menos 3 para ser conseguida uma clara separação do analito destino e que sejam usadas, se possível, substâncias constituídas por uma quantidade de isotopómeros tão reduzida quanto possível.
Um caminho para a produção de metabolitos vegetais ou microbiais marcados com isótopos é o caminho que passa pela biossíntese das respectivas plantas e/ou dos micróbios. Os meios de cultura são misturados com substâncias nutritivas radioactivamente marcadas, e uma determinada percentagem dos componentes do meio nutritivo é integrada nos circuitos anabólicos e metabólicos das culturas microbiais ou vegetais, de modo que os isótopos são incorporados nos metabolitos. Uma desvantagem deste processo consiste em que este processo apenas permite conseguir uma marcação incompleta e que normalmente é formada uma mistura dos mais variados isotopómeros, que a utilização de tais substâncias marcadas com isótopos ou de metabolitos vegetais ou microbiais marcados com isótopos parece ser pouco adequada para a utilização como padrões internos, uma vez que em caso de utilização de tais substâncias não seria utilizado um padrão mas uma larga palete de isotopómeros, pelo que, por sua vez, uma comprovação definida de substâncias destino nas espectrometrias LC/MS não parece possível ou apenas muito dificilmente.
No trecho de literatura Wu et al., Analytical Biochemistry 336 (2005) 164-171 já consta um processo para a análise quantitativa dos metabolomes microbiais com utilização de uma mistura de metabolitos completa e uniformemente marcados com 2 13C como padrões internos no processo de extracção de metabolitos e na seguinte análise por LC-ESI-MS/MS sendo que os metabolitos 13C completos são obtidos a partir de um cultivo de Saccharomyces cerevisiae.
No trecho de literatura Evans et al., Analytical Biochemistry 306, 197-203 (2002) já consta um processo de análise da biossíntese NAD com utilização de precursores de piridina marcados com isótopos. Neste processo é usado um padrão interno derivado de fermento marcado totalmente no referente aos átomos 13C e 15N.
De Kurzatkowski et al., Appl Microbial Biotechnol (1984) 19:312-315 é conhecida a produção de penicilina G radioactivamente marcada por vesciculos de fungos imobilizados, com o objectivo de medir a actividade intrínseca na produção de penicilina G radioactiva a partir de valina 14C.
Além disso, consta em Carson et al., Can. J. Microbiol. 43: 97-101 (1997), a biodegradação de ácido N-fosfonometilimino-diacético através de microorganismos de lodos industrialmente activados sendo que a componente chave neste processo de degradação é o glifosato marcado com 14C para que o processo de degradação pudesse ser seguido.
Do documento Blackwell B A et al: "Carbon-13 NMR Study of the biosynthesis of Toxins by fusarium-graminearum", 1985, Journal of biological chemistry, Tomo 260, n.° 7, página(s) 4243-4247 consta um estudo de RMN 13C da biossíntese de toxinas por Fusarium graminearum. Aqui são analisados estudos RMN 13C no referente à biossíntese de micotoxinas formadas por 3
Fusarium graminearum, através da incorporação de precursores de acetato [ 1 — 13C] e acetato [2 — 13C] .
No documento Lindenmeier M et al., Journal of Chromatography, Elsevier Science Publiciates B.V., Amsterdam NL, Tomo 1023, n.° 1, 9 de Janeiro de 2004, páginas 47-56, consta uma quantificação da ocratoxina A em produtos alimentares através de um ensaio de diluição isotópica estável com utilização da cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia e espectrometria de massa em tandem. Neste estudo foi desenvolvido um ensaio de diluição isotópica para a quantificação da micotoxina ocratoxina A com utilização de OTA [2H5] como padrão interno. A presente invenção tem por objectivo disponibilizar um processo para a produção de metabolitos secundários marcados com isótopos, a partir de fungos ou bactérias, nos quais todos ou quase todos os átomos de carbono, átomos de nitrogénio e átomos de enxofre no produto inicial são substituídos por isótopos estáveis resultando daí um único produto final marcado com isótopos que pode ser comprovado, de forma fácil e segura, em processos espectrométricos, sobretudo LC/MS. Além disso, a invenção visa a produção de um metabolito que possa ser aplicado ou utilizado com segurança e fiabilidade como padrão interno ou em processos de análise espectrométricos.
Para atingir estes objectivos, o processo segundo a invenção é conduzido de modo a que a síntese seja realizada por imobilização dos fungos ou bactérias num suporte inerte, com adição de um meio de cultura sintético líquido no qual pelo menos 95 % dos átomos de carbono, átomos de nitrogénio e/ou átomos de enxofre foram substituídos por isótopos estáveis. 4
Devido ao facto de a síntese ser realizada pela imobilização dos fungos ou bactérias num suporte inerte e com adição de um meio de cultura sintético líquido no qual quase todos ou pelo menos 95 % dos átomos de carbono, átomos de nitrogénio e/ou átomos de enxofre foram substituídos por isótopos estáveis, é possível produzir um metabolito marcado com isótopos dos fungos e bactérias no qual todos os átomos ou pelo menos 95 % dos átomos que podem ser extraídos do meio de cultura por cultivo, ou seja, os átomos de carbono, nitrogénio ou enxofre, são substituídos pelos isótopos estáveis das substâncias nutritivas marcadas com isótopos existentes no meio de cultura, podendo assim ser obtido um produto definido marcado com isótopos e não, como várias vezes descrito na situação técnica actual, uma mistura de diversos homólogos com um número variado de átomos isotópicos. Através deste processo de produção pode ser obtido um metabolito secundário marcado com isótopos que pode ser usado para determinados fins e que pode ser comprovado, de forma clara e inequívoca, em todas as análises ou também em estudos metabólicos.
De acordo com uma forma mais evoluída, o processo é conduzido de modo a que como fonte de carbono no meio de cultura sintético líquido sejam usados açúcares ou álcoois de açúcar, nomeadamente D-glucose [U-13C6], sacarose 13C, glicerina 13C e/ou acetato 13C, como fontes do nitrogénio aminoácidos 15N, nitratos 15N, compostos de amónio 15N ou azoto 15N, como fontes do enxofre sulfatos 33S ou 34S, sulfuretos 34S ou aminoácidos 34S. Na medida em que o meio de cultura sintético líquido contém fontes de carbono, nitrogénio e/ou enxofre totalmente marcadas, no cultivo de metabolitos a partir de fungos ou bactérias o fungo ou a bactéria tem de incorporar no metabolito forçosamente o respectivo isótopo marcado, de modo que possa ficar assegurado que os metabolitos secundários dos 5 fungos ou bactérias sejam marcados ou substituídos num elevado grau, se não na totalidade, pelos respectivos isótopos.
Para melhorar o rendimento de metabolitos secundários marcados com isótopos de fungos ou bactérias, o processo de acordo com uma forma de evolução é conduzido de modo a que o meio de cultura sintético líquido contenha adicionalmente uma mistura escolhida entre sais inorgânicos ou ácidos e bases com os ioes Na+, K f, Ca++ , Mg++, Fe+++, Zn++, Cu++, B+++ bem como 1 ro O o 00 O 1 1 O 1 1 1 > no3~. Na medida em que o meio de cultura sintético líquido contém sais ou ácidos e bases com os iões Na+, K+, Ca++, Mg++, Fe+++, Zn++, Cu++, B+++ bem como C03““, SCh--, P04_~”, N03“, fica assegurado que todos os outros iões que possivelmente se encontram nos fungos ou bactérias para além do carbono, hidrogénio, nitrogénio e enxofre, sejam disponibilizados em quantidades suficientes e com segurança, resultando daí que para além de um rápido cultivo também possa ser obtido um elevado rendimento.
Para melhorar ainda mais o rendimento é usado como suporte inerte um suporte natural ou sintético com grande superfície interna, nomeadamente silicato, silicato estratificado, zeólito, bentonite, terracota, terra de diatomáceas, plásticos ou outros similares. Devido à utilização de um suporte inerte com grande superfície interna é possível conseguir no processo de acordo com a presente invenção um aumento do rendimento de pelo menos 50 % em comparação com processos tradicionais realizados sem suporte inerte com grande superfície interna. Tais aumentos do rendimento não tornam o processo apenas mais económico mas também garantem que sejam produzidas quantidades suficientes dos produtos finais desejados dos metabolitos secundários marcados com 6 isótopos, a fim de poderem ser usados de forma útil como padrão interno em análises ou também em estudos metabólicos.
Os maiores aumentos do rendimento podem ser conseguidos de acordo com a invenção, usando como suporte inerte com grande superfície interna um silicato de alumínio, por exemplo, terra diatomácea, nomeadamente diatomite, isolute HM-N ou um zeólito, ou um silicato estratificado, nomeadamente um vermiculite do grupo dos minerais micáceos, na sua forma natural ou tratada. Nestas substâncias, é sobretudo o estado da superfície, tal como a tensão superficial, a porosidade e outros, que é importante para obter um rendimento especialmente bom na superfície do suporte. Analogamente, também podem ser obtidos os respectivos aumentos de rendimento utilizando suportes inertes de plástico seleccionados por entre espuma plástica, poliamida, silicone, polietileno, polipropileno, politetrafluoretileno, poliéster ou similares, sendo que a utilização de suportes naturais com grande superfície interna ou a utilização de suportes de plástico proporcionam igualmente rendimentos melhorados, em função dos metabolitos a produzir.
Para a realização mais rápida possível do processo e, ao mesmo tempo, a obtenção de um elevado rendimento, numa forma mais evoluída da invenção a produção é realizada a temperaturas entre os 3 e os 45 °C, nomeadamente entre os 10 e os 35 °C. Neste contexto, revelou-se favorável, em parte, que um processo de produção não seja realizado sempre com a mesma temperatura uma vez que mudanças de temperatura dentro dos limites indicados podem proporcionar o aumento do rendimento ou a aceleração das reacções ou do débito. 7
Para conseguir que o produto final seja o mais puro possível, o processo segundo a invenção é realizado de modo que os metabolitos secundários marcados com isótopos sejam obtidos do meio de cultura sintético líquido pela extracção e concentração, por exemplo, pela combinação das etapas, tais como extracção sólido/líquido-líquido/líquido, centrifugação, filtração, evaporação, concentração e vaporização. Após a obtenção dos metabolitos secundários marcados com isótopos revelou-se vantajoso submeter estes produtos a mais uma purificação para a qual, segundo a invenção, são utilizados como processos de purificação, de preferência, processos cromatográficos, nomeadamente, a cromatografia em coluna, a cromatografia preparativa em camada fina, a cromatografia iónica, a cromatografia de afinidade, a cromatografia de exclusão e/ou a cromatografia preparativa líquida de alta eficiência. Após um tal processo de tratamento e processo de purificação é possível obter metabolitos secundários marcados com isótopos de fungos e bactérias nos quais pelo menos 95 % dos átomos de carbono, átomos de nitrogénio e/ou átomos de enxofre tenham sido substituídos pelos respectivos isótopos estáveis. E deste modo podem ser obtidos produtos que apresentam a correspondente diferença mássica em relação ao analito natural, por exemplo, para que numa cromatografia líquida acoplada a um detector de espectrometria de massas (LC/MS) possam ser suficientemente diferenciados dos isótopos naturais pesados, podendo assim ser disponibilizado, por exemplo, um padrão interno estável e claramente identificável em tais análises.
Para além disso, a invenção visa um metabolito secundário marcado com isótopos, seleccionado do grupo das micotoxinas ou antibióticos, onde quase todos ou pelo menos 95 % de todos 8 os átomos de carbono, átomos de nitrogénio e/ou átomos de enxofre tenham sido substituídos por isótopos estáveis.
Tais metabolitos secundários marcados com isótopos nos quais pelo menos 95 % dos átomos de carbono, átomos de nitrogénio e/ou átomos de enxofre tenham sido substituídos pelos respectivos isótopos estáveis, seleccionados do grupo das micotoxinas ou antibióticos podem ser utilizados, de acordo com uma forma mais evoluída da invenção, como padrões internos na analítica, para estudos do metabolismo em ensaios de alimentação de animais, para estudos metabólicos, para obter informações sobre circuitos metabólicos, vias de degradação e/ou períodos de degradação e depósitos. Em todas as formas de utilização mencionadas é de importância significativa ter obtido um padrão estável e claramente identificável ou uma substância claramente identificável e rastreável no esquema de ensaio ou no esquema de degradação, para que os diversos passos de processo e de execução possam ser claramente reproduzidos.
De acordo com uma determinada forma de evolução são usados nos processos analíticos ou nos estudos metabólicos, nas vias de degradação e similares como micotoxinas tricotecenos como nivalenol, deoxinivalenol, 3-acetil-deoxinivalenol, 15- acetilo, fusarenona X, toxina T-2, toxina HT-2, DAS, fumonisinas como fumonisina Bl, B2 ou B3, ocratoxinas como ocratoxina A, B, C ou D, zearalenonas, moniliformina ou aflatoxinas como aflatoxina Bl, B2, G1 ou G2. As micotoxinas ganham cada vez mais importância na etiologia de doenças animais sendo necessário produzir de forma técnica quantidades suficientes de tais substâncias para depois poderem ser levadas a cabo investigações toxicológicas veterinárias com substâncias que quimicamente sejam o mais 9 claro e puro possível. Uma vez que as micotoxinas representam um sério risco de saúde para animais e seres humanos, a sua analítica é um assunto de interesse global visto já muitos países terem desenvolvido valores de orientação e de limite para a tolerância de tais substâncias. A comprovação ou a quantificação de tais micotoxinas através da utilização de padrões internos que sejam claramente comprováveis permitindo assim uma análise quantitativa da respectiva toxina, representa um progresso significativo na comprovação de tais substâncias.
Da mesma maneira, ganha cada vez mais importância também a utilização de antibióticos como os antibióticos formados por actinomicetos como tetraciclinas, estreptomicinas ou aminoglicosídeos, os antibióticos formados por Bacillus sp. como bacitracina ou polimixina, os antibióticos formados por Penicillium como penicilina ou griseofulvina, ou as cefalosporinas formadas por Cephalosporium, nomeadamente no caso de doenças ou no caso de comprovação de tais substâncias em produtos alimentares e estimulantes naturais sendo necessário afirmar também em relação a estas substâncias que as substâncias que permitem uma comprovação quantitativa dos metabolitos, como os antibióticos, são de interesse vital para o público em geral.
De acordo com uma determinada forma de evolução, são usadas como metabolitos substâncias puras com um grau de marcação de 13C, 15N ou 33S ou 34S, resultando daí, por um lado, a possibilidade de diferenciação inequívoca das substâncias não marcadas ou metabolitos e, por outro, a garantia da diferenciação segura dos isótopos naturais, podendo ser disponibilizada, finalmente, uma substância rastreável em análises e processos de comprovação. 10
Seguidamente, a invenção é explicada mais pormenorizadamente com a ajuda de exemplos que mostram a produção de metabolitos altamente marcados com isótopos.
Exemplo 1
Produção de deoxinivalenol (DON) [U-13Ci5] altamente marcado com isótopos
Para a produção de DON 13C totalmente marcado é inoculado um fungo Fusarium, a saber Fusarium graminearum, num material suporte inerte, a saber vermiculite, e incubado num meio de cultura sintético composto por 0,05 g de K2HPO4, 2,0 g de NaN03, 0,7 g de MgS04.7H20, 2,0 g de KC1, 15 g de D-glucose [U-13C6], 1,5 g de NH4H2P04, 15 mg de Fe (II) S04*7H20 ou 20 mg de ZnS04*7H20 que contém D-glucose [U-13C6] como única fonte de carbono. Após 5 semanas a aproximadamente 28 °C o material contendo toxinas é extraído com acetato de etilo e seguidamente purificado por extracção, cromatografia e cristalização, até apresentar a qualidade padrão (pureza > 98 %) ·
Por cada solução base de produção são preparados cerca de 40 ml de solução base de incubação. A seguir, o pool de material contendo toxinas continua a ser processado. A partir de uma solução base de 1000 ml são obtidos entre 5 e 50 mg [7,5 a 17,5 mg] de DON [U-13Cis] totalmente marcado. O produto purificado foi caracterizado através dos seguintes processos analíticos: RMN ^ e RMN 13C. LC-MS/MS Q Trap para a determinação da percentagem de isótopo 11 13C, determinação de pureza e concentração contra materiais de referência com UV/VIS e HPLC-DAD, ajuste da concentração
Controlo de qualidade com UV/VIS, HPLC-DAD, LC-MS/MS Q Trap. Um deoxinivalenol 13Ci5 [DON 13C15 ] altamente marcado com isótopos pode ser usado, por exemplo, como padrão interno. Um tal padrão interno tem uma massa molecular precisamente 15g/Mol mais pesada e, assim, o seu sinal aparece no espectro de massa (Fig. 1) precisamente 15 u.m.a. mais alto do que o sinal do analito. Uma vez que todas as outras caracteristicas químicas e físicas do DON marcado com 13C são idênticas às do analito, um tal padrão interno tem exactamente a mesma fragmentação como o analito, também a ionização da substância é a mesma e, por conseguinte, também o rendimento da ionização. Isto significa que a altura do sinal dos fragmentos ou das substâncias se torna absolutamente comparável entre o padrão interno e o analito, e uma vez que a concentração do padrão interno numa análise é conhecida, é possível tirar conclusões directas no referente à concentração de um analito, resultando daí que um deoxinivalenol totalmente marcado com um grau tão elevado representa um padrão interno praticamente ideal. A Fig. 1 mostra DON Ci2 e DON Ci3 num espectro de massa comum. Para além dos picos moleculares de DON 13Ci5 e do de DON 12C a 295,2 ou 310,2, respectivamente, a Fig. 1 mostra também a distribuição dos compostos nos quais nem todos os átomos C foram totalmente marcados e por isso não são constituídos por uma única variedade de isótopos (isoptómeros). No caso do deoxinivalenol natural trata-se do DON 13Ci o que corresponde à distribuição natural entre C12 e C13. 12
Exemplo 2
Produção de fumonisina 13C altamente marcado com isótopos
Para a produção de uma fumonisina totalmente marcada com 13C, 1000 ml de um meio liquido, composto por 0,5 g de KH2PO4, 0,5 g de KN03, 0,7 g de MgS04.7H20, 2,0 g de KC1, 17,5 g de D-glucose [U-13C6] , 1,5 g de NH4H2P04, 15 mg de Fe (II) S04*7H20 e 20 mg de ZnS04*7H20, com a D-glucose [U-13C6] como única fonte de carbono, são aplicados em cubos de espuma plástica de 1 x lxl cm, inoculados com Fusarium moniliforme e incubados na incubadora a 28 °C e uma humidade relativa do ar de 70 %.
Passado 3 semanas, o material contendo toxinas é extraído com uma mistura de solventes de acetonitrilo:H20 na proporção de 1:1 e, a seguir, purificado por extracção e determinadas etapas de cromatografia, tais como a cromatografia de permuta iónica, a cromatografia em coluna (flash) com gel de sílica, a cromatografia de camada fina e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) preparativa, até apresentar a qualidade padrão (pureza > 98 %)
Por cada 1000 ml de solução base são obtidos cerca de 80 a 240 mg de fumonisinas 13C (HPLC-FLD).
Exemplo 3
Produção de 3-acet il-deoxinivalenol [U-13Ci7] altamente marcado com isótopos
Para a produção de 3-acetil-deoxinivalenol [U—13Ci7] altamente marcado com isótopos, 1000 ml de um meio sintético líquido, composto por 0,5 g de KH2PO4, 0,5 g de KNO3, 0,7 g de MgS04*7H20, 2,0 g de KC1, 17,5 g de D-glucose [U-13C6], 1,5 g 13 de NH4H2PO4, 15 mg de Fe (II) S04*7H20 e 20 mg de ZnS04*7H20 que contém a glucose [U-13C6] totalmente marcada com isótopos como única fonte de carbono, são aplicados numa terra diatomácea, a saber isolute HM-N, inoculados com Fusarium graminearum e incubados durante 9 dias na incubadora a 28°C. Passado 9 dias, o material contendo toxinas é colhido, extraído com acetonitrilo/H20-azeotropo e seguidamente purificado por extracção, cromatografia, cristalização, cromatografia líquida de alta pressão (MPLC) com Buchi e recristalização, até apresentar a qualidade padrão (pureza > 98 %) . A partir de uma solução base podem ser obtidos 15 - 50 mg de um produto final altamente puro. O controlo da pureza realizou-se por análise LC-UV com uma coluna capilar C18.
Um 3-acetil-deoxinivalenol marcado com isótopos obtido desta forma tem, em comparação com o 3-acetil-deoxinivalenol não marcado, uma massa molecular 17 g/Mol mais pesada. O 3-acetil-deoxinivalenol não marcado tem uma massa molecular de M/z = 338 enquanto o produto totalmente marcado com isótopos tem uma massa molecular de 355. A Fig. 2 mostra o espectro de massa do 3-acetil-deoxinivalenol 13C onde é visível que a marcação do produto foi bem sucedida a 75 %, sendo visível também a distribuição dos isótopos do produto. A distribuição do produto e dos isotopómeros não totalmente marcados depende, neste caso, da pureza isotópica do produto de partida glucose 13C6 mas em caso de utilização de uma glucose 13C6 totalmente pura pode ser deslocada claramente na direcção de um produto totalmente marcado. Na Fig. 2 é nitidamente visível que os isotopómeros que possuem menos de 13 átomos 13C já são praticamente inexistentes de modo que também o 3-acetil-deoxinivalenol 13C pode ser usado muito bem como padrão interno. 14
Exemplo 4
Produção de 15-acetil-deoxinivalenol [U-13Ci7] altamente marcado com isótopos
Para a produção de 15-acetil-deoxinivalenol [U-13Ci7] altamente marcado com isótopos, um meio de cultura composto por 0,5 g de K2HP04, 2,0 g de NaNC>3, 0,7 g de MgS04*7H20, 2,0 g de KC1, 15 g de D-glucose [U-13C6], 1,5 g de NH4H2P04, 15 mg de Fe (11) S04*7H20 e 20 mg de ZnS04*7H20 é aplicado num suporte de filissilicato de grão grosseiro, inoculado com Fusarium graminearum e incubado na incubadora a 28°C. Passado 9 dias, o material contendo toxinas é colhido, extraído com acetato de etilo e seguidamente purificado por extracção, cromatografia e cristalização, até apresentar a qualidade padrão (pureza > 98 %) . Alternativamente à cristalização pode ser usado também um outro passo de purificação através da HPLC preparativa. A partir de uma solução base de fermentação podem ser obtidos cerca de 30 a 60 mg de produto de destino altamente puro.
Exemplo 5
Produção de nivelanol [U-13Cis] ou fusarenona X [U-13Ci7] altamente marcado com isótopos
Para a produção de nivelanol [U-13C45] ou fusarenona X [U-13Ci7] altamente marcado com isótopos, um meio liquido composto por 0,5 g de K2HP04, 2,0 g de NaN03, 0,7 g de MgS04*7H20, 2,0 g de KC1, 15 g de D-glucose [U-13Ci6], 1,5 g de NH4H2P04, 15 mg de
Fe (II) S04*7H20 ou 20 mg de ZnS04*7H20, com a glucose [U-13C6] como única fonte de carbono e filossilicato inerte são 15 inoculados com Fusarium nivale e incubados durante 5 semanas a 28°C. A seguir, o material contendo toxinas é extraído com metanol e cloreto de metileno e seguidamente purificado por de extracção, cromatografia e cristalização, até apresentar a qualidade padrão (pureza > 98 %). Alternativamente à cristalização pode ser usado também uma outra etapa de purificação através da HPLC preparativa.
Exemplo 6
Produção de ocratoxina A [U-13C2q] altamente marcada com isótopos
Para a obtenção da substância de destino, o fungo Petromyces albertensis é fermentado num suporte de filossilicato inerte com um meio sintético líquido composto por 0,5 g de K2HP04, 2,0 g de NaN03, 0,7 g de MgS04*7H20, 2,0 g de KC1, 15 g de D-glucose [U-13C6], 1,5 g de NH4H2P04, 15 mg de Fe (II) S04*7H20 ou
2 0 mg de ZnS04*7H20 que como única fonte de carbono contém glucose totalmente marcada com 13C. A seguir, os frascos são incubados durante 6 semanas numa incubadora a 28°C e uma humidade do ar de 70 % e depois extraídos com toluol. A substância de destino é purificada, tal como nos exemplos anteriores, por cromatografia de colunas e recristalizada.
Exemplo 7
Produção de zearalenona [U-13Ci8] altamente marcada com isótopos
Para a produção de zearalenona [U-13Ci8] altamente marcada com isótopos, 1000 ml de um meio líquido composto por 0,5 g de KH2P04, 0,5 g de KN03, 0,7 g de MgS04*7H20, 2,0 g de KC1, 17,5 16 g de D-glucose [U13C6] , 1,5 g de NH4H2PO4, 15 mg de
Fe (11) SO4* 7H20 e 20 mg de ZnS04*7H20, com a D-glucose [U13C6] como única fonte de carbono, são aplicados em terracota porosa em forma de granulado, a saber Seramis ou Lecca, inoculados com Fusarium semitectum e incubados numa incubadora a 28 °C e uma humidade relativa do ar de 70 %.
Passado 3 semanas, o material contendo toxinas é extraido com éter de petróleo puro e uma mistura de éter de petróleo/ acetato de etilo na proporção de 4:1 e 2:1 e seguidamente purificado por extracção, etapas de cromatografia, tal como a cromatografia de permuta iónica, cromatografia em coluna (flash) com gel de silica, cromatografia em camada fina e HPLC preparativa, até apresentar a qualidade padrão (pureza > 98 %) .
Exemplo 8
Produção de roquefortina C 15N5 altamente marcada com isótopos
Para a produção de uma roquefortina C totalmente marcada com o isótopo de nitrogénio 15N, 1000 ml de um meio liquido composto por 0, 8 g de KH2P04, 0,7 g de MgS04*7H20, 1,0 g de KC1, 17, 5 g de D-glucose, 1,0 g de 15NH4, 15N03, 1,5 g de NaH2P04, 15 mg de Fe (II) S04*7H20, 20 mg de ZnS04* 7H20, com 15NH4, 15N03 como única fonte de nitrogénio, são aplicados em diatomite grosseiro, inoculados com Penicillium commune e incubados numa incubadora a 12 °C e 70 % de humidade do ar. Passado 48 dias, o material contendo toxinas é extraido com uma mistura de solventes orgânica composta por clorofórmio:metanol na proporção de 9:1 e seguidamente purificado por extracção líquido-líquido, cromatografia em coluna (flash) com gel de sílica e HPLC preparativa, até apresentar a qualidade padrão (pureza > 98 %) . Por cada 1000 17 ml de solução base são obtidos 300 mg de roquefortina C 15N5 (HPLC-FLD).
Exemplo 9
Produção de penicilina 15N2-33S altamente marcada com isótopos
Para a produção de uma penicilina marcada totalmente com o isótopo de nitrogénio 15N e o isótopo de enxofre 33S, 1000 ml de um meio liquido composto por 1,0 g de K2HPO4, 0,2 g de MgCl2, 20 g de D-glucose, 1,0 g de 15NH415N03, 0,5 g de NA233S04, 1,5 g de Na2HP04, 5 mg de Fe(II)Cl2, 5 mg de ZnCl2, com 15NH415N03 como única fonte de nitrogénio e Na233S04 como única fonte de enxofre, são aplicados em pequenos cubos de espuma plástica, inoculados com Penicillium notatum e incubados na incubadora a 28°C e 70 % de humidade do ar. Passado 30 dias, o material contendo toxinas é extraído com acetato de etilo e seguidamente purificado por extracção líquido-líquido, cromatografia em coluna (flash) com gel de sílica e HPLC preparativa, até apresentar a qualidade padrão > 98 %) . Por cada 1000 ml de solução base são obtidos 500 mg de penicilina 15N2-33S (HPLC-FLD) . 22-03-2012 18

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a produção de metabolitos secundários marcados com isótopos, a partir de fungos ou bactérias, para a produção de um padrão interno na analítica, para estudos do metabolismo em ensaios de alimentação de animais, para estudos metabólicos, para obter informações sobre circuitos metabólicos, vias de degradação e/ou períodos de degradação e depósitos num meio de cultura sintético líquido, caracterizado por a síntese ser realizada por imobilização dos fungos ou bactérias num suporte inerte e com adição de um meio de cultura sintético líquido no qual pelo menos 95 % dos átomos de carbono, átomos de nitrogénio e/ou átomos de enxofre foram substituídos por isótopos estáveis.
  2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por como fonte de carbono no meio de cultura sintético líquido serem usados açúcares ou álcoois de açúcar, nomeadamente D-glucose [U-13C6], sacarose 13C, glicerina 13C e/ou acetato 13C, como fontes do nitrogénio aminoácidos 15N, nitratos 15N, compostos de amónio 15N ou azoto 15N, como fontes do enxofre sulfatos 33S ou 34S, sulfuretos 34S ou aminoácidos 34S .
  3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o meio de cultura sintético líquido conter adicionalmente uma mistura escolhida entre sais inorgânicos ou ácidos e bases com os iões Na+, K+, Ca++, Mg++, Fe+++, Zn++, Cu++, B+++ bem como C03__, SO<T“, PO4 , NCó”.
  4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por ser usado como suporte inerte um suporte natural ou sintético com grande superfície interna, 1 zeólito, nomeadamente silicato, silicato estratificado, bentonite, terracota, terra de diatomáceas, plásticos ou outros similares.
  5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser usado como suporte inerte um silicato de alumínio, por exemplo, um zeólito, ou um silicato estratificado, nomeadamente um vermiculite do grupo dos minerais micáceos, na sua forma natural ou tratada.
  6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser utilizado como suporte inerte de plástico espuma plástica, poliamida, silicone, polietileno, polipropileno, politetrafluoretileno, poliéster ou similares.
  7. 7. Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por a produção ser realizada a temperaturas entre os 3 e os 45 °C, nomeadamente entre os 10 e os 35 °C.
  8. 8. Processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado por os metabolitos secundários marcados com isótopos serem obtidos do meio de cultura sintético líquido pela extracção e concentração, por exemplo, pela combinação das etapas, tais como extracção sólido/líquido-líquido/líquido, centrifugação, filtração, evaporação, concentração e vaporização.
  9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por serem utilizados como processos de purificação processos cromatográficos, nomeadamente, a cromatografia em coluna, a cromatografia preparativa em camada fina, a cromatografia iónica, a cromatografia de afinidade, a cromatografia de 2 exclusão e/ou a cromatografia preparativa liquida de alta eficiência.
  10. 10. Metabolito secundário marcado com isótopos no qual pelo menos 95 % dos átomos de carbono, átomos de nitrogénio e/ou átomos de enxofre foram substituídos pelos respectivos isótopos estáveis, seleccionados do grupo das micotoxinas, tricotecenos como nivalenol, deoxinivalenol, 3-acetil-deoxinivalenol, 15-acetilo-deoxinivalenol, fusarenona X, toxina T-2, toxina HT-2, DAS, fumonisinas como fumonisina Bl, B2 ou B3, ocratoxinas como ocratoxina A, B, C ou D, zearalenonas, moniliformina ou aflatoxinas como aflatoxina Bl, B2, G1 ou G2, ou antibióticos como os antibióticos formados por actinomicetos como tetraciclinas, estreptomicinas ou aminoglicosideos, os antibióticos formados por Bacillus sp. como bacitracina ou polimixina, os antibióticos formados por Penicillium como penicilina ou griseofulvina, ou as cefalosporinas formadas por Cephalosporium, que é produzido segundo um processo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 9, para a produção de um padrão interno na analítica, para estudos do metabolismo em ensaios de alimentação de animais, para estudos metabólicos, para obter informações sobre circuitos metabólicos, vias de degradação e/ou períodos de degradação e depósitos.
  11. 11. Metabolito de acordo com a reivindicação 10, como substância pura com um grau de marcação com 13C, 15N, 33S ou 34S de pelo menos 95 %. 22-03-2012 3
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