KR20070118675A - 고도로 동위원소 표지된 2차 미생물 대사 생성물의 생성방법 및 상응하는 대사 생성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 액체 합성 배지에서 진균 또는 세균의 동위원소 표지된 2차 대사 생성물을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 따르면, 합성은 진균 또는 세균을 비활성 담체상에 고정시키고, 본질적으로 모든 탄소 원자, 질소 원자 및/또는 황 원자가 안정한 동위원소에 의해 대체되는 액체 합성 배지를 첨가함으로써 수행된다.

Description

고도로 동위원소 표지된 2차 미생물 대사 생성물의 생성 방법 및 상응하는 대사 생성물 {PRODUCTION OF HIGHLY ISOTOPICALLY LABELLED, SECONDARY, MICROBIAL METABOLIC PRODUCTS, AND CORRESPONDING METABOLIC PRODUCTS}

본 발명은 액체 합성 배지에서 진균 또는 세균의 동위원소 표지된 2차 대사 생성물을 생성시키는 방법 뿐만 아니라 진균 또는 세균의 동위원소 표지된 2차 대사 생성물에 관한 것이다.

현재, 동위원소 표지된 물질은 점차 중요해지고 있는데, 높은 생성물 처리량으로 효율적인 분광 분석을 가능하게 하는 액체 크로마토그래피 질량 분광 검출 (LCMS) 기술에서 특히 그러하다. 이러한 기술은 분자량에 관해 임의의 제한을 두지 않고 매우 다양한 잠재적 분석물에 대해 사용될 수 있지만, 붕괴 스펙트럼 및 개개의 분자 피크 둘 모두가 그에 따라 부여되어져야 한다는 점에서 개개의 물질의 검출에서 문제가 발생할 여지가 있다. 신뢰성있는 LCMS 적용 및 방법을 보장하기 위해서는, 소위 내부 표준 물질을 사용하는 것이 점차 중요해져 가고 있다. 내부 표준은 표적 분석물과 특성이 매우 유사한 물질, 즉, 특히 가능하게는 분자 구조는 동일하지만 분자량이 상이한 물질이다. 표적 분석물의 동위원소 표지된 분자, 즉, 분자내의 하나 또는 수 개의 원자가 이들의 동위원소에 의해 대체된 분자가 이상적 인 내부 표준인 것으로 입증되었다. 현재, 이러한 물질은 유기 합성에 의해, 예를 들어 수소 또는 탄소를 상응하는 보다 무거운 동위원소로 치환함으로써 생성된다.

그러나, 이와 관련하여 내부 표준으로서 사용된 동위원소 표지된 물질이 표적 분석물과 별개로 분리될 수 있도록 적어도 3의 분자량 차이를 지니고, 가능한 경우 가능한 한 적은 동위원소 이성질체를 포함하는 물질을 사용하는 것이 바람직한 것으로 LMCS 분석에서 밝혀졌다.

동위원소 표지된 식물 또는 미생물 대사물을 생성시키는 방법은 각각의 식물 및/또는 미생물의 생합성 경로를 거친다. 이렇게 하는 경우, 배지에는 방사성표지된 영양분이 보충되고, 배지 성분은 동위원소가 대사 생성물에 혼입되도록 일정한 비율로 미생물 또는 식물 배양물의 동화 및 대사 주기에 통합된다. 상기 방법은 이러한 방법에 의해서는 불완전한 표지화만이 가능하고 일반적으로 다양한 동위원소 이성질체의 혼합물이 형성된다는 결점을 수반하여, 이러한 동위원소 표지된 물질 또는 동위원소 표지된 식물 또는 미생물 대사물이 내부 표준으로서 사용되기에 적절치 못하게 하는데, 그 이유는 이러한 물질을 사용하는 경우 하나의 표준이 아니라 광범위한 동위원소 이성질체가 적용되며, 이는 LCMS 분광법에서 표적 물질의 선택적 검출이 전혀 가능하지 않게 하거나 매우 어렵게만 가능해지게 하기 때문이다.

본 발명의 목적은 출발 생성물에 함유된 탄소 원자, 질소 원자 또는 황 원자의 전부 또는 거의 전부가 안정한 동위원소에 의해 대체되는 진균 또는 세균의 동위원소 표지된 2차 대사 생성물을 생성시키는 방법을 제공하여, 분광법, 특히 LCMS에서 용이하고 신뢰성있게 검출될 수 있는 동위원소 표지된 하나의 최종 생성물을 제공하는 데에 있다. 또한, 본 발명의 목적은 분광 분석법, 특히 LCMS에서 내부 표준으로서 안전하고 신뢰성있게 사용될 수 있는 대사 생성물을 생성시키는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 따른 방법은 진균 또는 세균을 비활성 담체상에 고정시키고 실질적으로 모든 탄소 원자, 질소 원자 및/또는 황 원자가 안정한 동위원소에 의해 대체된 액체 합성 배지를 첨가함으로써 합성을 수행하는 방식으로 진행된다. 진균 또는 세균을 비활성 담체상에 고정시키고 실질적으로 모든 탄소 원자, 질소 원자 및/또는 황 원자가 안정한 동위원소에 의해 대체된 액체 합성 배지를 첨가함으로써 합성을 수행함으로써, 종래 기술에서 자주 등장하는 가변적 동원원소 원자수를 지닌 다양한 동족체의 혼합물 보다는 선택적인 동위원소 표지된 생성물의 회수가 가능하도록 증식에 의해 배지로부터 수득되는 원자, 즉, 탄소, 질소 또는 황 원자의 95% 이상 또는 전부가 배지에 함유된 동위원소 표지된 영양분의 보다 안정한 동위원소에 의해 대체된, 진균 및 세균의 동위원소 표지된 대사 생성물을 생성시키는 것이 가능해진다. 따라서, 이러한 생성 방법에 의해 임의의 분석 또는 대사 연구에서 명백하고 분명하게 검출될 수 있고 선택적으로 사용될 수 있는 동위원소 표지된 2차 대산 생성물을 수득하는 것이 가능하다.

또 다른 일면에 따르면, 본 발명의 방법은 당 또는 당 알코올, 특히 D-[U-¹³C₆]-글루코오스, ¹³C-수크로오스, ¹³C-글리세롤 및/또는 ¹³C-아세테이트가 액체 합성 배지에서 탄소원으로서 사용되고, ¹⁵N-아미노산, -니트레이트, -암모늄 화합물 또는 -우레아가 질소원으로서 사용되고, ³³S- 또는 ³⁴S-설페이트, -설파이드 또는 -아미노산이 황원으로서 사용되는 방식으로 수행된다. 진균 또는 세균의 대사 생성물을 증식시키는 경우, 진균 또는 세균은 각각 액체 합성 배지에 함유된 완전히 표지된 탄소원, 질소원 및/또는 황원으로 인해 진균 또는 세균의 2차 대사 생성물이 각각의 동위원소로 표지되거나 완전하지 않은 경우 높은 정도로 관련 동위원소에 의해 대체됨을 보장하도록 각각 표지된 동위원소를 대사 생성물에 혼입시킬 수 밖에 없다.

진균 또는 세균의 동위원소 표지된 2차 대사 생성물의 수율을 개선시키기 위해, 또 다른 일면에 따른 본 발명의 방법은 액체 합성 배지가 Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺, Fe⁺⁺⁺, Zn⁺⁺, Cu⁺⁺, B⁺⁺⁺ 뿐만 아니라 CO₃ ^--, SO₄ ^--, PO₄ ^---, NO₃ ^- 이온을 지닌 유기 염 또는 산 및 염기로부터 선택된 혼합물을 추가로 함유하는 방식으로 수행된다. Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺, Fe⁺⁺⁺, Zn⁺⁺, Cu⁺⁺, B⁺⁺⁺ 뿐만 아니라 CO₃ ^--, SO₄ ^--, PO₄ ^---, NO₃ ^- 이온을 지닌 염 또는 산 및 염기가 액체 합성 배지에 함유되어 있다는 사실로 인해, 탄소, 수소, 질소 및 황 이외에 진균 또는 세균에 존재할 수 있는 임의의 외래 이온이 신속한 증식 뿐만 아니라 높은 수율을 보장하도록 충분한 양으로 안전하게 제공됨이 보장된다.

수율을 추가로 개선시키기 위해, 커다란 내부 표면적을 지닌 천연 또는 합성 담체, 특히 실리케이트, 층상(layered) 실리케이트, 제올라이트, 벤토나이트, 소성(burnt) 점토, 규조토, 합성물(synthetic) 등이 상기 비활성 담체로서 사용된다. 커다란 내부 표면적을 지닌 비활성 담체를 사용함으로써, 본 발명에 따른 방법의 수율을 커다란 내부 표면적을 지닌 비활성 담체없이 수행되는 통상적인 방법에 비해 50% 이상 개선시키는 것이 가능하다. 이러한 수율 증가는 본 발명의 방법을 보다 경제적이 되게 할 뿐만 아니라 분석 또는 대사 연구에서 내부 표준으로서 적절한 방식으로 사용될 수 있도록 동위원소 표지된 2차 대사 생성물의 요망되는 최종 생성물이 충분한 양으로 생성됨을 보장해준다.

본 발명에 따르면, 수율의 최대 개선은 운모 광물 군으로부터의 알루미늄 실리케이트, 예를 들어 규조토, 특히 키젤거(kieselguhr), 이소루트(isolute) HM-N 또는 제올라이트, 또는 층상 실리케이트, 특히 버미큘라이트(vermiculite)가 천연 형태 또는 처리된 형태로 상기 비활성 담체로서 사용되는 경우 특히 수득된다. 이들 물질의 경우, 표면 특성, 예를 들어 표면 장력, 다공성 등이 담체 표면상에서 특히 양호한 전환 속도 (turnover rate)를 달성하기에 특히 적합하다. 유사한 방식으로, 발포 물질, 폴리아미드, 실리콘, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에스테르 등으로부터 선택될 수 있는 비활성 합성 담체가 사용되면 이에 따른 커다란 수율 개선을 가능하게 하며, 이로써 커다란 내부 표면적을 지는 천연 담체를 사용하거나 합성 담체가 사용되면 생성시키고자 하는 대사 생성물에 따라 유사하게 향상된 수율을 생성시킨다.

방법 제어가 가능한 한 신속하게 동시에 고수율로 진행되는 경우, 본 발명은 3 내지 45℃, 특히 10 내지 35℃의 온도에서 생성이 이루어지는 정도까지 추가로 확장된다. 이와 관련하여, 생성 방법이 항상 일정한 온도에서 수행되지 않는 것이 유리한 것으로 부분적으로 입증되었지만, 지시된 한도내의 그러한 온도 변화는 또한 개선된 수율 또는 가속된 반응 속도 또는 상승된 전환 회수를 초래할 수 있다.

가능한 한 순수한 최종 생성물을 수득하기 위해, 본 발명에 따른 방법은 동위원소 표지된 2차 대사 생성물이 추출 및 농축에 의해, 예를 들어 고체/액체-액체/액체 추출, 원심분리, 여과 및 증발과 같은 단계들의 결합에 의해, 액체 합성 배지로부터 회수되는 방식으로 수행된다. 동위원소 표지된 2차 대사 생성물의 회수 후, 이들 생성물이 추가의 정제 절차를 받게 하는 것이 유리한 것으로 입증되었는데, 여기서 본 발명에 따르면 크로마토그래피 방법, 특히 컬럼 크로마토그래피, 제조용 박막 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피 및/또는 제조용 고압 액체 크로마토그래피가 정제 절차로서 바람직하게 사용된다. 이러한 재처리 방법 및 정제 절차는 탄소 원자, 질소 원자 및/또는 황 원자의 95% 이상이 각각의 안정한 동위원소로 대체된 진균 및 세균의 동위원소 표지된 2차 대사 생성물의 회수를 가능하게 하여, 예를 들어 액체 크로마토그래피 질량 분광 검출 (LCMS)에서 천연의 무거운 동위원소와 충분히 구별될 수 있도록 이들의 천연 분석물에 대해 적절한 질량 차이를 지닌 생성물을 회수할 수 있게 하고, 이에 따라 예를 들어 이러한 분석에서 안정하고 명백히 확인가능한 내부 표준을 제공하는 것을 가능하게 한다.

또한, 본 발명의 목적은 탄소 원자, 질소 원자 및/또는 황 원자의 실질적으로 전부, 특히 95% 이상이 안정한 동위원소로 대체된 진균 및 세균의 동위원소 표지된 2차 대사 생성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 진균 또는 세균의 이러한 동위원소 표지된 2차 대사 생성물은 분석학에서, 동물 사료공급 시험에서 대사 연구를 위해, 대사 연구를 위해, 대사 주기, 분해 경로 및/또는 분해 기간 뿐만 아니라 개재(intercalation)을 해명하기 위해 내부 표준으로서 사용될 수 있다. 언급된 모든 사용 목적과 관련하여, 개개의 방법 또는 처리 단계를 정확하게 재현할 수 있도록 하기 위해 시험 계획 또는 분해 계획에서 안정하고 명백히 검출가능한 표준 또는 명백히 검출가능하고 추적가능한 물질을 수득하는 것이 본질적으로 중요하다.

또 다른 일면에 따르면, 미코톡신, 특히 트리코테센(trichothecene), 예를 들어 니발레놀(nivalenol), 데옥시니발레놀, 3-아세틸-데옥시니발레놀, 15-아세틸-데옥시니발레놀, 푸사레논(fusarenon)-X, T-2 독소, HT-2 독소, DAS, 푸모니신(fumonisin), 예를 들어 푸모니신 B1, B2 또는 B3, 오크라톡신(ochratoxin), 예를 들어 오크라톡신 A, B, C 또는 D, 제아랄레논(zearalenone), 모닐리포르민(moniliformin) 또는 아플라톡신(aflatoxin), 예를 들어 아플라톡신 B1, B2, G1 또는 G2가 분석 방법 또는 대사 연구, 분해 경로 등에서 대사 생성물로서 사용된다. 미코톡신은 동물 질병의 병인학에서 점차 중요해지고 있고, 가능한 한 독특하고 순수한 화학 물질을 사용함으로써 각각의 수의학적 독성 검사를 후속 수행할 수 있게 하기 위해 이러한 물질의 충분량을 기술적으로 생성시킬 필요가 있다. 미코톡신이 인간 및 동물에 대한 심각한 건강 위험 요소이므로, 이의 분석은 특히 많은 국가가 이러한 물질의 허용에 대한 지침 및 한계값을 이미 마련한 이래로 전세계적으로 관심을 끄는 주제이다. 정확하게 검출될 수 있어서 각각의 독소의 정량 분석을 가능하게 하는 내부 표준의 사용에 의한 이러한 미토콕신의 검출 및 정량은 이러한 유해 물질의 검출에서 중요한 진보를 이룬다.

유사하게는, 또한 독소 및 무엇보다도 본 발명의 또 다른 일면에 상응하게는 내독소 및 외독소, 특히 대장균 종, 살모넬라 종, 클로스트리듐 종, 바실러스 종 또는 스태필로코커스 종의 세균 독소의 정량적 검출 또는 추적은 공중 보건을 위해 및 식품과 기호(semi-luxury) 식품에서 유해 물질의 검출을 위해 극히 중요하다. 또한, 대사 생성물, 예를 들어 항생제, 특히 테트라사이클린, 스트렙토마이신 또는 아미노글리코시드와 같은 방선균(actinomycetes)으로부터 형성된 항생제, 박시트라신 또는 폴리믹신과 같은 바실러스 종으로부터 형성된 항생제, 페니실린 또는 그리세오풀빈과 같은 페니실리움(penicillium)으로부터 형성된 항생제, 또는 세팔로스포리움(cephalosporium)으로부터 형성된 세팔로스포린을 사용하는 것은, 특히 질병의 경우 또는 식품과 기호 식품에서 이러한 물질을 검출하기 위해 점차 중요해지고 있으며, 여기서 항생제와 같은 대사 생성물의 정량적 검출을 가능하게 하는 물질이 일반 대중에게 중요한 관심을 끈다는 것이 또한 이들 물질을 지지해준다.

또 다른 일면에 따르면, 표지화할 정도의 ¹³C, ¹⁵N, 또는 ³³S 또는 ³⁴S를 지닌 순수한 물질은 대사 생성물로서 사용되는데, 이로써 한편으로는 표지되지 않은 물질 또는 대사 생성물과의 명백한 구분을 가능하게 하고, 다른 한편으로는 천연 동위원소와의 구분을 안전하게 보장하여, 결국에는 분석 및 검출 방법에서 정밀하게 추적가능한 물질을 제공한다.

하기에서 본 발명은 고도로 동위원소 표지된 대사 생성물을 생성시키는 것을 예시하는 실시예에 의해 보다 상세히 설명된다.

실시예 1

고도로 동위원소 표지된 [U- ¹³ C ₁₅ ]-데옥시니발레놀 (DON)의 생성

완전히 표지된 ¹³C-DON을 생성시키기 위해, 푸사리움(fusarium) 진균, 즉, 푸사리움 그라미니어룸 (Fusarium graminearum)을 비활성 담체 물질, 즉, 버미큘라이트상에 접종시키고, 0.5g K₂HPO₄, 2.0g NaNO₃, 0.7g MgSO₄·7H₂O, 2.0g KCl, 15g D-[U-¹³C₆]글루코오스, 1.5g NH₄H₂PO₄, 15mg Fe(II)SO₄*7H₂O 또는 20mg ZnSO₄*7H₂O로 구성되고 유일한 탄소원으로서 D-[U-¹³C₆]글루코오스를 함유하는 합성 배지에서 인큐베이션시킨다. 약 28℃에서 5주간 유지시킨 후, 독소 함유 물질을 에틸 아세테이트로 추출한 후, 추출, 크로마토그래피 및 결정화에 의해 표준 품질 (98%가 넘는 순도)로 정제한다.

생성 포뮬레이션(formulation) 당 약 40ml의 배양 배지를 준비한다. 그 후, 풀링(pooling)된 독소 함유 물질을 추가로 처리한다. 1000ml의 포뮬레이션 또는 배치(batch)로부터, 5 내지 50mg [7.5 내지 17.5mg]의 완전히 표지된 [U-¹³C₁₅]-DON을 수득한다.

정제된 생성물을 하기 분석 방법에 의해 특징화하였다:

¹H NMR 및 ¹³C-NMR

¹³C 동위원소 부분을 측정하기 위한 LC-MS/MS Q 트랩(Trap)

UV/VIS 및 HPLC-DAD를 이용하는 기준 물질에 대한 순도 및 농도의 측정

농도의 조정

UV/VIS, HPLC-DAD, LC-MS/MS A 트랩을 이용하는 품질 제어

이러한 고도로 동위원소 표지된 ¹³C₁₅-데옥시니발레놀 (¹³C₁₅-DON)을 예를 들어 내부 표준으로서 사용할 수 있다. 이러한 내부 표준은 질량 스펙트럼에서 이의 신호 보다 정확하게는 15g/mol 만큼 무거운 분자 질량을 지니며 (도 1), 이로써 분석물의 신호 보다 정확하게는 15amu 높게 나타난다. ¹³C-표지된 DON의 그 밖의 모든 화학적 및 물리적 특성이 분석물의 그러한 특성과 동일하기 때문에, 이러한 내부 표준은 분석물과 정확하게 동일한 단편화를 나타내며, 또한 물질의 이온화가 동 일하여, 이로써 이온화 수율도 동일하다. 이는 단편의 신호 높이 또는 물질 이온이 내부 표준과 분석물 사이에서 절대적으로 비교가능함을 의미하고, 내부 표준의 농도가 분석에서 알려져 있으므로 분석물의 농도에 대해 직접적인 결론이 내려질 수 있으며, 이러한 이유로 인해 이러한 고도로 표지된 데옥시니발레놀은 거의 이상적인 내부 표준을 구성한다.

도 1은 집단적(collective) 질량 스펙트럼에서의 C₁₂-DON 및 C₁₃-DON을 도시한다. 각각 295.2 및 310.2에서의 ¹³C₁₅-DON 및 ¹²C-DON의 분자 피크 이외에, 도 1은 모든 C-원자가 표지된 것은 아니어서 하나의 동위원소 종 (동위원소 이성질체)로 구성되지 않은 화합물의 분포를 또한 나타낸다. 천연 데옥시니발레놀의 경우, 이는 C₁₂ 및 C₁₃ 사이의 천연 분포에 상응하는 ¹³C₁-DON이다.

실시예 2

고도로 동위원소 표지된 ¹³C-푸모니신의 생성

¹³C으로 완전히 표지된 푸모니신을 생성시키기 위해, 0.5g의 KH₂PO₄, 0.5g의 KNO₃, 0.7g의 MgSO₄·7H₂O, 2.0g의 KCl, 17.5g의 D-[U-¹³C₆]글루코오스, 1.5g의 NH₄H₂PO₄, 15mg의 Fe(II)SO₄*7H₂O 및 20mg의 ZnSO₄*7H₂O로 구성되고 유일한 탄소원으로서 D-[U-¹³C₆]글루코오스를 함유하는 액체 배지 1000ml를 1 x 1 x 1cm 포움(foam) 입방체상에 적용시키고, 여기에 푸사리움 모닐리포르메 (Fusarium moniliforme)를 접종시키고, 28℃ 및 70% 상대 습도에서 인큐베이터내에서 인큐베이션시킨다. 3주 후, 독소 함유 물질을 1:1의 아세토니트릴:H₂O를 함유하는 용매 혼합물로 추출한 후, 추출 및 크로마토그래피 단계, 예를 들어 이온교환 크로마토그래피, 실리카겔을 사용한 플래시 컬럼 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피 및 제조용 HPLC에 의해 표준 품질 (98%가 넘는 순도)로 정제한다.

이러한 방식으로, 1000ml의 포뮬레이션 당 80 내지 240mg의 ¹³C-푸모니신이 수득된다 (HPLC-FLD).

실시예 3

고도로 동위원소 표지된 [U- ¹³C ₁₇ ]-3-아세틸 데옥시니발레놀의 생성

고도로 동위원소 표지된 [U-¹³C₁₇]-3-아세틸 데옥시니발레놀을 생성시키기 위해, 0.5g의 KH₂PO₄, 0.5g의 KNO₃, 0.7g의 MgSO₄*7H₂O, 2.0g의 KCl, 17.5g의 D-[U-¹³C₆]글루코오스, 1.5g의 NH₄H₂PO₄, 15mg의 Fe(II)SO₄*7H₂O 및 20mg의 ZnSO₄*7H₂O로 구성되고 유일한 탄소원으로서 완전히 동위원소 표지된 [U-¹³C₆]-글루코오스를 함유하는 합성 액체 배지 1000ml을 규조토, 즉, 이솔루트(isolute) HM-N상에 적용시키고, 여기에 푸사리움 그라미니어룸을 접종시키고, 28℃에서 인큐베이터내에서 9일간 인 큐베이션시킨다. 9일 후, 독소 함유 물질을 수거하고, 아세토니트릴/H₂O 공비혼합물로 추출한 후, 추출, 크로마토그래피, 결정화, 뷔히(Buechi)-MPLC 및 재결정화에 의해 표준 품질 (98%가 넘는 순도)로 정제한다. 하나의 배치로부터, 약 15 내지 50mg의 매우 순수한 최종 생성물이 수득될 수 있다. 순도 검사는 C18-모세관 컬럼을 사용하는 LC-UV 분석에 의해 수행한다.

이러한 방식으로 생성된 동위원소 표지된 3-아세틸 데옥시니발레놀은 비표지된 3-아세틸 데옥시니발레놀 또는 철저하게 표지되지 않거나 불완전하게 표지된 3-아세틸 데옥시니발레놀의 분자 질량 보다 17g/mol 만큼 무거운 분자 질량을 지닌다. 불완전하게 표지된 3-아세틸 데옥시니발레놀은 M/z = 338의 분자 질량을 지니며, 완전히 동위원소 표지된 생성물은 355의 분자 질량을 지닌다. 도 2는 순수한 ¹³C-3-아세틸-데옥시니발레놀의 질량 스펙트럼을 도시하며, 이로부터 생성물이 75%까지 표지되었고 생성물의 동위원소 분포가 명백함을 알 수 있다. 이러한 경우의 불완전하게 표지된 동원원소 이성질체 및 생성물의 분포는 출발 생성물인 ¹³C₆-글루코오스의 동위원소 순도에 좌우되고, 완전히 순수한 ¹³C₆-글루코오스를 사용하는 경우 완전히 표지된 생성물쪽으로 명확히 이동할 수 있다. 그러나, 도 2로부터, 13개 미만의 ¹³C-원자를 지닌 동위원소 이성질체가 실질적으로 존재하지 않아서 ¹³C-3-아세틸-데옥시니발레놀이 또한 내부 표준으로서 완벽하게 사용될 수 있다는 것이 매우 명백하다.

실시예 4

고도로 동위원소 표지된 [U- ¹³C₁₇ ]-15-아세틸 데옥시니발레놀의 생성

고도로 동위원소 표지된 [U-¹³C₁₇]-15-아세틸 데옥시니발레놀을 생성시키기 위해, 0.5g의 K₂HPO₄, 2.0g의 NaNO₃, 0.7g의 MgSO₄*7H₂O, 2.0g의 KCl, 15g의 D-[U-¹³C₆]글루코오스, 1.5g의 NH₄H₂PO₄, 15mg의 Fe(II)SO₄*7H₂O 및 20mg의 ZnSO₄*7H₂O로 구성된 배양 배지에 조립 필로실리케이트(phyllosilicate) 담체상의 푸사리움 그라미니어룸을 접종시키고, 인큐베이터내에서 28℃에서 인큐베이션시킨다. 9일 후, 독소 함유 물질을 수거하고, 에틸 아세테이트로 추출한 후, 추출, 크로마토그래피 및 결정화에 의해 표준 품질 (98%가 넘는 순도)로 정제한다. 결정화 대신에, 제조용 HPLC를 사용하는 또 다른 정제 단계가 또한 적용될 수 있다.

약 30 내지 60mg의 매우 순수한 표적 생성물이 하나의 발효 배치로부터 수득될 수 있다.

실시예 5

고도로 동위원소 표지된 [U- ¹³C₁₅ ]-니발레놀 또는 [U- ¹³C₁₇ ]-푸사레논-X의 생성

고도로 동위원소 표지된 [U-¹³C₁₅]-니발레놀 또는 [U-¹³C₁₇]-푸사레논-X를 생성 시키기 위해, 0.5g의 K₂HPO₄, 2.0g NaNO₃, 0.7g의 MgSO₄*7H₂O, 2.0g의 KCl, 15g의 D-[U¹³C₆]글루코오스, 1.5g의 NH₄H₂PO₄, 15mg의 Fe(II)SO₄*7H₂O 또는 20mg의 ZnSO₄*7H₂O로 구성되고 유일한 탄소원으로서의 [U-¹³C₆]-글루코오스 및 비활성 필로실리케이트를 함유하는 액체 배지에 푸사리움 니발을 접종시키고, 28℃에서 5주 동안 인큐베이션시킨다. 그 후, 독소 함유 물질을 메탄올과 메틸렌 클로라이드로 추출한 후, 추출, 크로마토그래피 및 결정화에 의해 표준 품질 (98%가 넘는 순도)로 정제한다. 결정화 대신, 제조용 HPLC를 사용하는 또 다른 정제 단계가 또한 적용될 수 있다.

실시예 6

고도로 동위원소 표지된 [U- ¹³C ₂₀ ]-오크라톡신 A의 생성

표적 물질을 수득하기 위해, 비활성 필로실리케이트 담체상의 진균 페트로마이세스 알베르텐시스 (Petromyces albertensis)를 0.5g의 K₂HPO₄, 2.0g의 NaNO₃, 0.7g의 MgSO₄*7H₂O, 2.0g의 KCl, 15g의 D-[U-¹³C₆]글루코오스, 1.5g의 NH₄H₂PO₄, 15mg의 Fe(II)SO₄*7H₂O 또는 20mg의 ZnSO₄*7H₂O로 구성되고 유일한 탄소원으로서 완전하게 ¹³C-표지된 글루코오스를 함유하는 합성 액체 배지를 사용하여 발효시킨다. 그 후, 플라스크를 28℃ 및 70% 공기 수분에서 6주간 인큐베이터내에서 인큐베이션시킨다. 표적 물질을 이전 실시예에서와 같이 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하 고, 재결정화시킨다.

실시예 7

고도로 동위원소 표지된 [U- ¹³C ₁₈ ]-제아랄레논의 생성

고도로 동위원소 표지된 [U-¹³C₁₈]-제아랄레논을 생성시키기 위해, 0.5g의 KH₂PO₄, 0.5g의 KNO₃, 0.7g의 MgSO₄*7H₂O, 2.0g의 KCl, 17.5g의 D-[U-¹³C₆]글루코오스, 1.5g의 NH₄H₂PO₄, 15mg의 Fe(II)SO₄*7H₂O 및 20mg의 ZnSO₄*7H₂O로 구성되고 유일한 탄소원으로서 D-[U-¹³C₆]글루코오스를 함유하는 액체 배지 1000ml를 과립 형태의 다공성 소성 점토, 즉, 세라미스(Seramis) 또는 레카(Lecca) 상에 적용시키고, 여기에 푸사리움 세미텍트룸 (Fusarium semitectrum)을 접종시키고, 28℃ 및 70% 상대 습도에서 인큐베이터내에서 인큐베이션시킨다. 3주 후, 독소 함유 물질을 순수한 석유 에테르 및 4:1 내지 2:1의 석유 에테르/에틸 아세테이트 혼합물로 추출한 후, 추출 및 크로마토그래피 단계, 예를 들어 이온교화 크로마토그래피, 실리카겔을 사용한 플래시 컬럼 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피 및 제조용 HPLC에 의해 표준 품질 (98%가 넘는 순도)로 정제한다.

실시예 8

고도로 동위원소 표지된 ¹⁵N ₅ -록퀘포르틴(rocquefortine) C의 생성

질소 동위원소 ¹⁵N로 완전히 표지된 록퀘포르틴 C를 생성시키기 위해, 0.8g의 KH₂PO₄, 0.7g의 MgSO₄*7H₂O, 1.0g의 KCl, 17.5g의 D-글루코오스, 1.0g의 ¹⁵NH₄ ¹⁵NO₃, 1.5g의 NaH₂PO₄, 15mg의 Fe(II)SO₄*7H₂O, 20mg의 ZnSO₄*7H₂O로 구성되고 유일한 질소원으로서 ¹⁵NH₄ ¹⁵NO₃를 함유하는 액체 배지 1000ml를 조립 키젤거상에 적용시키고, 여기에 페니실리움 코뮨 (Penicillium commune)을 접종시키고, 12℃ 및 70% 공기 수분에서 인큐베이터내에서 인큐베이션시킨다. 48시간 후, 독소 함유 물질을 9:1의 클로로포름:메탄올로 구성된 유기 용매로 추출한 후, 액체-액체 추출, 실리카겔을 사용한 플래시 컬럼 크로마토그래피 및 제조용 HPLC에 의해 표준 품질 (98%가 넘는 순도)로 정제한다. 1000ml의 포뮬레이션 당, 300mg의 ¹⁵N₅-록퀘포르틴 C가 수득된다 (HPLC-FLD).

실시예 9

고도로 동위원소 표지된 ¹⁵N ₂ - ³³S-페니실린의 생성

질소 동위원소 ¹⁵N 및 황 동위원소 ³³S로 완전히 표지된 페니실린을 생성시키기 위해, 1.0g의 K₂HPO₄, 0.2g의 MgCl₂, 20.0g의 D-글루코오스, 1.0g의 ¹⁵NH₄ ¹⁵NO₃, 0.5g의 Na₂ ³³SO₄, 1.5g의 Na₂HPO₄, 5mg의 Fe(II)Cl₂, 5mg의 ZnCl₂로 구성되고 유일한 질소원으로서 ¹⁵NH₄ ¹⁵NO₃ 및 유일한 황원으로서 Na₂ ³³SO₄를 함유하는 액체 배지 1000ml를 작은 포움 입방체상에 적용시키고, 여기에 페니실리움 노타툼 (Penicillium notatum)을 접종시키고, 28℃ 및 70% 공기 수분에서 인큐베이터내에서 인큐베이션시킨다. 30일 후, 독소 함유 물질을 에틸 아세테이트로 추출한 후, 액체-액체 추출, 실리카겔을 사용한 플래시 컬럼 크로마토그래피 및 제조용 HPLC에 의해 표준 품질 (98%가 넘는 순도)로 정제한다. 1000ml의 포뮬레이션 당, 500mg의 ¹⁵N₂-³³S-페니실린이 수득된다 (HPLC-FLD).

Claims (14)

1. 진균 또는 세균을 비활성 담체상에 고정시키고, 탄소 원자, 질소 원자 및/또는 황 원자의 실질적으로 전부가 안정한 동위원소로 대체된 액체 합성 배양 배지를 첨가함으로써 합성을 수행함을 특징으로 하는, 액체 합성 배양 배지에서 진균 또는 세균의 동위원소 표지된 2차 대사 생성물을 생성시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 당 또는 당 알코올, 특히 D-[U-¹³C₆]-글루코오스, ¹³C-수크로오스, ¹³C-글리세롤 및/또는 ¹³C-아세테이트가 액체 합성 배양 배지에서 탄소원으로서 사용되고, ¹⁵N-아미노산, -니트레이트, -암모늄 화합물 또는 -우레아가 질소원으로서 사용되고, ³³S- 또는 ³⁴S-설페이트, -설파이드 또는 -아미노산이 황원으로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 액체 합성 배양 배지가 Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺, Fe⁺⁺⁺, Zn⁺⁺, Cu⁺⁺, B⁺⁺⁺ 뿐만 아니라 CO3^--, SO₄ ^--, PO₄ ^---, NO₃ ^- 이온을 지닌 무기 염 또는 산 및 염기로부터 선택되는 혼합물을 추가로 함유함을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 커다란 내부 표면적을 지닌 천연 또는 합성 담체, 특히 실리케이트, 층상 실리케이트, 제올라이트, 벤토나이트, 소성 점토, 규조토, 합성물 등이 상기 비활성 담체로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 운모 광물 군으로부터의 알루미늄 실리케이트, 예를 들어 제올라이트 또는 층상 실리케이트, 특히 버미큘라이트가 천연 형태 또는 처리된 형태로 상기 비활성 담체로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
6. 제 4항에 있어서, 발포 물질, 폴리아미드, 실리콘, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에스테르 등이 상기 비활성 합성 담체로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 3 내지 45℃, 특히 10 내지 35℃의 온도에서 생성이 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 동위원소 표지된 2차 대사 생성물이 추출 및 농축에 의해, 예를 들어 고체/액체-액체/액체 추출, 원심분리, 여과 및 증발과 같은 단계들의 조합에 의해 액체 합성 배양 배지로부터 회수됨을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 크로마토그래피 방법, 특히 컬럼 크로마토그래피, 제조용 박막 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피 및/또는 제조용 고압 액체 크로마토그래피가 정제 방법으로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
10. 동물 사료공급 시험에서 대사 연구를 수행하고, 대사 연구를 수행하고, 대사 주기, 분해 경로 및/또는 분해 기간 뿐만 아니라 개재(intercalation)를 해명하는데 있어서 그리고 분석학에서 내부 표준을 생성하기 위한, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 진균 및 세균의 동위원소 표지된 2차 대사 생성물.
11. 제 10항에 있어서, 미코톡신, 특히 트리코테센(trichothecene), 예를 들어 니발레놀(nivalenol), 데옥시니발레놀, 3-아세틸-데옥시니발레놀, 15-아세틸-데옥시니발레놀, 푸사레논(fusarenon)-X, T-2 독소, HT-2 독소, DAS, 푸모니신(fumonisin), 예를 들어 푸모니신 B1, B2 또는 B3, 오크라톡신(ochratoxin), 예를 들어 오크라톡신 A, B, C 또는 D, 제아랄레논(zearalenone), 모닐리포르민(moniliformin) 또는 아플라톡신(aflatoxin), 예를 들어 아플라톡신 B1, B2, G1 또는 G2가 대사 생성물로서 사용됨을 특징으로 하는 대사 생성물.
12. 제 10항에 있어서, 독소, 예를 들어 내독소 및 외독소, 특히 대장균 종, 살모넬라 종, 클로스트리듐 종, 바실러스 종 또는 스타필로코커스 종의 세균 독소가 상기 대사 생성물로서 사용됨을 특징으로 하는 대사 생성물.
13. 제 10항에 있어서, 항생제, 특히 테트라사이클린, 스트렙토마이신 또는 아미노글리코시드와 같은 방선균(actinomycetes)으로부터 형성된 항생제, 박시트라신 또는 폴리믹신과 같은 바실러스 종으로부터 형성된 항생제, 페니실린 또는 그리세오풀빈과 같은 페니실리움(penicillium)으로부터 형성된 항생제, 또는 세팔로스포리움(cephalosporium)으로부터 형성된 세팔로스포린이 상기 대사 생성물로서 사용됨을 특징으로 하는 대사 생성물.
14. 95% 이상의 ¹³C, ¹⁵N, 또는 ³³S 또는 ³⁴S에 의한 표지화 정도를 지닌, 순수한 물질로서의 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 대사 생성물.

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