PT1841863E

PT1841863E - Método para a purificação de factor vii

Info

Publication number: PT1841863E
Application number: PT06700982T
Authority: PT
Inventors: Rikkle Bolding Jensen; Frank Bech Nygaard
Original assignee: Bayer Healthcare Llc
Priority date: 2005-01-14
Filing date: 2006-01-13
Publication date: 2010-10-25
Also published as: DK1841863T3; CY1110867T1; EP1841863A1; WO2006074664A1; DE602006015907D1; ATE476501T1; US20090047723A1; ES2349112T3; PL1841863T3; EP1841863B1

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA A PURIFICAÇÃO DE FACTOR VII"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de purificação da proteína factor VII utilizando hidroxiapatite.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 factor VII (FVII), uma importante proteína na cascata de coagulação do sangue, é uma proteína plasmática dependente da vitamina K sintetizada no fígado e secretada para sangue sob a forma de uma glicoproteína de cadeia simples com um peso molecular de 53 kDa. 0 zimogénio de FVII é convertido numa forma activada (FVIIa) por meio de clivagem proteolítica num sítio único, R152-I153, resultando em duas cadeias ligadas por uma única ponte dissulfureto. FVIIa humano recombinante encontra-se comercialmente disponível junto da Novo Nordisk com a designação NovoSeven® e é utilizado no tratamento de episódios hemorrágicos, por exemplo no caso de hemofilia ou trauma. Têm também sido descritas variantes do FVII humano produzidas de modo recombinante. A purificação do factor VII recombinante (rFVII) ou factor VII activado recombinante (rFVIIa) é geralmente efectuada utilizando uma combinação cromatografia de permuta iónica e cromatografia de imunoafinidade baseada num reconhecimento dependente de Ca2+ da região Gla de FVII (resíduos de aminoácido 1 a 45 do FVII humano) . Embora a fase de purificação baseada em imunoafinidade seja 2 extremamente selectiva e proporcione proteína FVII de alto grau de pureza, apresenta desvantagens. Por exemplo, a potencial contaminação com anticorpo do produto farmacológico pode afectar a segurança do fármaco final e o custo de produção da matriz de afinidade do anticorpo monoclonal (mAb) é considerável em comparação com as matrizes de purificação mais convencionais que não contêm anticorpos.

Embora fosse vantajosa a substituição da fase de imunoafinidade por uma técnica de purificação diferente, esta iria implicar a remoção de contaminantes não relacionados com FVII, bem como a capacidade de separar quaisquer isoformas indesejadas de FVII que estivessem presentes nos sobrenadantes da cultura.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra um traçado do espectro UV de uma amostra VII eluída a partir de uma coluna de hidroxiapatite de acordo com a invenção, como descrito no exemplo 1. A figura 2 mostra uma análise SDS-PAGE da amostra da figura 1. A figura 3 mostra um traçado do espectro UV de uma amostra VII eluída a partir de uma coluna de hidroxiapatite de acordo com a invenção, como descrito no exemplo 2. A figura 4 mostra uma análise SDS-PAGE da amostra da figura 3.

DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

Explorámos as possibilidades de utilização de métodos de purificação da proteína FVII que não sejam baseados em 3 anticorpos e possível separação de isoformas de FVII capturadas dos sobrenadantes da cultura e, surpreendentemente, descobriu-se que se obtêm excelentes resultados utilizando hidroxiapatite. A presente invenção refere-se, assim, a um método adequado para a purificação de rFVII ou rFVIIa, compreendendo a passagem de rFVII ou rFVIIa por cromatografia líquida numa coluna de hidroxiapatite (HAP), em que rFVII ou rFVIIa é eluído como definido na reivindicação 1.

Definições

Na descrição e reivindicações seguintes aplicam-se as seguintes definições: 0 termo "FVII" ou "polipeptídeo FVII" refere-se a uma molécula FVII apresentada sob forma de cadeia simples. 0 termo "FVIIa" ou "polipeptídeo FVIIa" refere-se a uma molécula de FVIIa desde que na sua forma de cadeia dupla activada, em que a ligação peptídica entre R152 e 1153 da forma de cadeia simples tenha sido clivada.

Os termos "rFVII" e "rFVIIa" referem-se a moléculas de FVII e de FVIIa produzidas por técnicas recombinantes, respectivamente. Estas podem ter a sequência humana de tipo selvagem ou podem ter variantes da sequência humana.

Os termos "hFVII" e "hFVIIa" referem-se a FVII e FVIIa humano de tipo selvagem, respectivamente.

Excepto quando houver indicação em contrário ou quando for evidente a partir do contexto, pretende-se que os termos "FVII", "proteína FVII" e "factor VII", tal como presentemente utilizados, incluam tanto a forma inactivada como activada do FVII e incluam a sequência de tipo 4 selvagem recombinante do FVII humano bem como as respectivas variantes.

Descrição pormenorizada

As proteínas FVII que podem ser purificadas pelo método da invenção incluem qualquer proteína FVII ou FVIIa, em particular FVII ou FVIIa recombinante humano e respectivas variantes. A sequência de aminoácidos de FVII humano de tipo selvagem é bem conhecida e encontra-se divulgada, por exemplo em WO 01/58935. Variantes de interesse que podem ser purificadas pelo método da invenção incluem, por exemplo, as descritas nas WO 01/58935, WO 03/093465, WO 2004/029091 WO 2004/111242, WO 99/20767, WO 00/66753, WO 88/10295, WO 92/15656, WO 02/29025, WO 01/70763, WO 01/83725, WO 02/02764, WO 02/22776, WO 02/38162, WO 02/077218, WO 03/027147, WO 03/037932, WO 2004/000366, WO 2004/029090 e WO 2004/108763.

As variantes FVII e FVIIa podem incluir uma ou mais substituições, inserções ou eliminações em comparação com FVII humano de tipo selvagem, por exemplo resultando numa variante que difere em 1 a 15 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos do FVII humano de tipo selvagem, tipicamente em 1 a 10 ou 2 a 20 resíduos de aminoácidos, por exemplo 1 a 8 ou 2 a 8 resíduos de aminoácidos, tal como em 3 a 7 ou 4 a 6 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos, em que as diferenças na sequência de aminoácidos em relação ao tipo selvagem são, tipicamente, substituições. Estas substituções podem ser executadas, por exemplo, com o objectivo de introduzir um ou mais sítios de glicosilação in vivo ou sítios de PEGuilação na proteína e/ou aperfeiçoar ou modificar de outra forma a actividade 5 de coagulação da proteína de tipo selvagem; estas variantes encontram-se descritas nas WO 01/58935, WO 03/093465, WO 2004/029091 e WO 2004/111242. Em alternativa, as variantes FVII ou FVIIa podem apresentar uma actividade de coagulação reduzida para funcionar como anticoagulantes. A proteína FVII/FVIIa ou respectiva variante pode ser produzida por qualquer organismo adequado, por exemplo em mamíferos, leveduras ou células bacterianas, embora sejam preferidas as células eucariotas, mais preferencialmente as células de mamífero, tais como as células CHO, células HEK ou células BHK. A hidroxiapatite (HAP) é um material de cromatografia poroso inorgânico à base de fosfato de cálcio que é útil para a purificação de proteínas, incluindo enzimas e anticorpos monoclonais, bem como ácidos nucleicos. Uma vez que a HAP consiste em fosfato de cálcio, contém cargas tanto positivas como negetivas. A cromatografia líquida utilizando HAP é tipicamente executada com um pH da ordem de cerca de 5,5 a 9, por exemplo cerca de 6 a 9. A coluna HAP pode ser equilibrada com um tampão de força iónica baixa, por exemplo cerca de 5 a 10 mM, sendo um tampão adequado, por exemplo, um tampão fosfato, tal como fosfato de sódio ou, em alternativa, um tampão não-fosfato, tal como imidazol, TRIS, histidina, MES (2-(N-morfolino)ácido etanossulfónico) ou borato. O tampão pode incluir opcionalmente um sal, tal como NaCl. A coluna propriamente dita pode ter qualquer tamanho e volume adequado conforme a quantidade de proteína e sobrenadante a ser purificado. Os especialistas na técnica serão facilmente capazes de seleccionar uma coluna adequada com base nas necessidades reais de purificação. 6

Constatou-se que a HAP é particularmente adequada para a purificação de rFVII, bem como para a separação de isoformas de FVII indesejadas. A proteina FVII liga estreitamente à HAP a baixas concentrações de tampão, por exemplo uma concentração de fosfato entre cerca de 1 mM, tal como desde cerca de 5 mm, por exemplo cerca de 10 mM até cerca de 20 mM, a um pH desde cerca de 5,5 até cerca de 7,5, por exemplo cerca de 6,0-7,5 ou na ausência de fosfato a um pH desde cerca de 5,5 até cerca de 9,0 ou 9,5, tipicamente cerca de 6,0-3,6. A presença de uma baixa concentração de CaCl2, por exemplo uma concentração até cerca de 1 mM ou uma concentração mais elevada, por exemplo até cerca de 5, 10 ou 20 mM ou mesmo superior, tal como cerca de 50 mM não impede a ligação da proteina FVII à matriz HAP. A eluição de impurezas não-FVII e isoformas de FVII indesejadas, por exemplo isoformas com um nível insuficiente de gama-carboxilação na região Gla da FVII, pode ser conseguida recorrendo a condições de eluição suaves a um pH desde cerca de 5,5 até cerca de 7,5, por exemplo lavagem com uma concentração de fosfato entre cerca de 10 mM até cerca de 50 mM ou superior, tal como cerca de 100 ou 150 mM, a um pH de cerca de 6,0-7,0. Uma outra alternativa de eluição de impurezas não-FVII e isoformas indesejadas de FVII reside no uso de uma elevada concentração de NaCl, por exemplo, até 1 M ou mesmo superior, tal como cerca de 1,5 M na presença de fosfato. A eluição da proteína FVII pode ser conseguida mediante aumento da concentração de fosfato, sendo a proteína FVII eluída da coluna utilizando uma combinação apropriada de pH e fosfato, por exemplo um gradiente a começar em cerca de 7 10-20 mM de fosfato e aumentando até uma concentração máxima de fosfato de, por exemplo, cerca de 400-500 mM a um pH de cerca de 5,5 ou superior, tipicamente cerca de 6,0 ou superior, por exemplo até 9,0 ou 9,5, tal como até cerca de 8,6. A concentração de fosfato pode ser aumentada de modo linear ou faseado, como é conhecido em geral na técnica. Em alternativa, a eluição pode ser efectuada de modo faseado ou com um gradiente, utilizando uma concentração crescente de um eluente não-fosfato de um modo similar à eluição com um tampão fosfato. Neste caso, o eluente pode ser, por exemplo, cálcio sob a forma de cloreto de cálcio ou sulfato de cálcio, com um pH de por exemplo cerca de 5,5-9,5, por exemplo 6,0-9,0. A eluição com fosfato será frequentemente preferida. A regeneração da coluna de HAL pode ser efectuada com um tampão fosfato, por exemplo numa concentração de cerca de 0,5 M.

Em determinadas condições de eluição, a proteína FVII elui em picos discretos, possivelmente devido à separação de diferentes isoformas. Neste caso, são possíveis diferentes abordagens de separação das diferentes fracções. Uma abordagem consiste no aumento da concentração de fosfato ou de eluente, como anteriormente descrito, mantendo sempre um pH constante. Depois de atingir a concentração máxima de fosfato/eluente, o pH pode então ser aumentado faseadamente, tipicamente aumentando o pH a cada fase entre 1 e 3, por exemplo cerca de 1,5 a 2,5, tal como cerca de 2, acima do pH utilizado durante a eluição do gradiente. Por exemplo, a proteína FVII pode ser eluída a pH de cerca de 6-7 e uma concentração máxima de fosfato ou outro eluente de 400-500 mM, após o que o pH é aumentado desde cerca de 6-7 até cerca de 8-9, por exemplo desde cerca de 6 até cerca de S ou cerca de 7 até cerca de 9, mantendo o nível de fosfato/eluente elevado.

Em alternativa, a eluição pode ser executada utilizando uma concentração e gradiente de pH combinados em que tanto a concentração de fosfato/eluente como o pH são simultaneamente aumentados. Esta operação pode ser efectuada a começar com uma concentração baixa de fosfato/eluente de, por exemplo, cerca de 10-20 mM ou depois da concentração de fosfato/eluente ser inicialmente aumentada até um nivel intermédio de, por exemplo cerca de 100 ou 150 mM. Por exemplo, depois de um aumento inicial da concentração de fosfato para um nível intermédio de 100-150 mM, pode ser utilizado um gradiente da concentração de fosfato a começar a este nível e aumentando até, por exemplo, cerca de 400-500 mM em conjunto com um gradiente de pH, tipicamente a começar com um pH inicial de cerca de 5,5-7,0 e aumentando até um pH final de cerca de 7,5-9,0, por exemplo a começar com um pH de cerca de 6 e aumentando até um pH de cerca de 8. Uma variante desta abordagem consiste na utilização de uma eluição faseada, na qual a concentração de eluente e/ou o pH são alterados, de forma a passar directamente do nível intermédio para as condições finais de eluição. Um exemplo desta eluição faseada consiste em passar de uma concentração de fosfato/eluente de por exemplo cerca de 100 ou 150 mM e um pH de, por exemplo cerca de 6 numa única fase até uma concentração de fosfato de, por exemplo, cerca de 400 ou 500 mM e um pH de, por exemplo, cerca de 8 ou 9. Se desejado, o gradiente combinado de fosfato/eluente e pH pode ainda ser combinado com um gradiente salino, por exemplo, a começar com uma 9 concentração de NaCl de 0,5-1,5 M, tal como cerca de 1,0 M e diminuindo tipicamente para 0 M.

Pode-se constatar que a proteina FVII eluída pelo método da invenção possui uma pureza superior a cerca de 80% e, nalguns casos, cerca de 90% ou mais, conforme determinado por LDL PAGE (electrof orese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de litio). A presente invenção passa agora a ser descrita masi detalhadamente com referência aos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Materiais e métodos A proteina FVII humana recombinante aplicada a uma coluna de HAP foi produzida em células CHO-K1. Os sobrenadantes da cultura foram sujeitos esterilização por filtração, ultrafiltração e diafiltração contra Tris 10 mM pH 8,6. A amostra foi posteriormente capturada numa coluna de Q-Sepharose™ FF, previamente equilibrada com Tris 10 mM, pH 8,6. Após lavagem com Tris 10 mM, NaCl 100 mM, pH 8,6, a proteina FVII ligada foi eluida em Tris 10 mM, CaCl2 35 mM, NaCl 25 mM, pH 8,6. Esta amostra foi dessalinizada para diminuir a condutividade em 20 mM TrisHCl, CaCl2 0,5 mM, pH 7,5 antes da aplicação na coluna de hidroxiapatite. A hidroxiapatite cerâmica de tipo 1 era da Biorad (cat # 157-0400). As colunas foram carregadas por volumes de 3-10 ml com diâmetros de coluna de 5 ou 10 mm (Amersham Biosciences) em 0,2 M Na-fosfato, pH 9-10 e posteriormente equilibradas com Tris 10 mM, pH 8,6. As colunas foram 10 executadas à temperatura ambiente e tipicamente até 30 CV/h.

Resultados FVII eluida de uma captura de permuta iónica, como descrito anteriormente, ligou em 20 mM Tris-HCl, CaCl2 0,5 mM, pH 7,5 à coluna de hidroxiapatite. A proteína ligada foi lavada em primeiro lugar em 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, depois utilizando 20 mM Na-fosfato, pH 6,0. A proteína ligada foi depois eluida com um gradiente de 20-500 mM de Na-fosfato a pH 6,0, seguido de uma fase de 500 mM de Na-fosfato pH 8,0. A figura 1 mostra um traçado de espectro UV da amostra eluida a partir da coluna de HAP, indicando as letras A a E conjuntos que foram analisados por SDS-PAGE, como revelado na figura 2, em que a pista 1 é um MW padrão, a pista 2 é a solução proteica carregada na coluna de HAP, a pista 3 é um conjunto A, a pista 4 é um conjunto B, a pista 5 é um conjunto C, a pista 6 é um conjunto D e a pista 7 é um conjunto E. A eluição extremamente selectiva de FVIIa no fim de um gradiente linear de fosfato de 20 a 500 mM a pH 6,0 e a 500 mM de fosfato pH 8,0 encontra-se nas pistas 6 e 7 respectivamente. A proteína FVII eluiu em dois conjuntos bem separados, um tardio no gradiente e um a acompanhar o pH 8,0. A proteína era >90% pura em ambos os conjuntos, como estimado por SDS-PAGE (figura 2).

Exemplo 2

Materiais e métodos A proteína FVII humana recombinante aplicada a uma coluna de HAP foi produzida em células CH0-K1. Os 11 sobrenadantes da cultura foram sujeitos esterilização por filtração, ultrafiltração e diafiltração contra 25 mM de imidazol, 25 mM de NaCl, pH 7,0. Adicionou-se posteriormente 5 mM de EDTA à amostra sujeita a diafiltração antes da captura em coluna Q-Sepharose™ FF, previamente equilibrada com 25 mM de imidazol, 25 mM de NaCl, pH 7,0. Depois da lavagem em 25 mM de imidazol, 25 mM de NaCl, 5 mM CaCl2,pH 7,0, a proteína FVII ligada foi eluída em 25 mM de imidazol, 75 mM de CaCl2, 5 mM NaCl, pH 7,0. Esta amostra foi diluída em 25 mM de imidazol, pH 6,5 para diminuir a condutividade antes da aplicação na coluna de hidroxiapatite. A hidroxiapatite cerâmica era tal como anteriormente descrito no exemplo 1. As colunas foram carregadas e executadas como anteriormente descrito, equilibrando com 25 mM de imidazol, pH 6,5 com um volume da coluna de 30 ml e um diâmetro da coluna de 16 mm. A presença de isómeros FVII é estimada pela proporção entre dois ELISAs, orientados para o domínio Gla ("Sigma ELISA") e domínio PD (residuo de aminoácido 153-406 FVII humana) ("PD ELISA"), respectivamente. O ELISA Sigma reconhece a proteína FVII com domínios Gla correctamente enrolados e extremamente gama-carboxilados e constitui, assim, uma estimativa quantitativa da população de FVII com domínios Gla funcionais. O PD ELISA reconhece todas as moléculas FVII numa amostra, independentemente da condição do domínio Gla. A proporção dos dois ELISAs constitui um indicador da pureza da população FVII com domínio Gla afuncional.

Resultados FVII eluída de uma captura de permuta iónica, como descrito anteriormente, ligou em 25 mM imidazol, aprox. 6 12 mM de NaCl, aprox. 18 mM de CaCl2, pH 6,5 à coluna de hidroxiapatite. A proteína ligada foi lavada em primeiro ligar em 25 mM imidazol, pH 6,5, depois utilizando 100 mM Na-fosfato, pH 6,3 seguido de 150 mM Na-fosfato, 1 M de NaCl para eluir os contaminantes e isoformas de FVII indesejadas. A proteína FVII contendo as isoformas altamente gama-carboxiladas desejada foi depois eluida utilizando Na-fosfato, 1 M NaCl, com um gradiente da concentração de Na desde 150 mM até 500 mM, em conjunto com um gradiente de pH desde 6,3 a 8,0. A figura 3 mostra um traçado de espectro UV da amostra eluida a partir da coluna de HAP, indicando as letras A a F conjuntos que foram analisados por SDS-PAGE, em que a pista 1 é um MW padrão, a pista 2 é o material de partida que consiste no eluído da captura, a pista 3 é a solução proteica carregada na coluna de HAP, a pista 4 é um conjunto A (fracções flow-through/wash) , a pista 5 é um conjunto B (fracção wash 100 mM Na-fosfato), a pista 6 é um conjunto C (fracção wash de 150 mM Na-fosfato, 1 M NaCl), a pista 7 é um conjunto D e a pista 8 é um conjunto E (em que as pistas D e E compreendem um fosfato linear combinado/pH/gradiente salino desde 150 mM até 500 mM Na-fosfato, desde pH 6,3 a pH 8,0 e desde 1 M até 0 M NaCl, sendo o conjunto D a pré-eluição limiar principal e o conjunto E o conjunto do produto) e a pista 9 é o conjunto F (500 mM Na-fosfato, pH 8,0, pós-eluição limiar final). A eluição extremamente selectiva de FVII utilizando um gradiente linear de concentração Na-fosfato, pH e concentração salina pode ser observada na pista 8 da figura 4 . 13 A proteína FVII eluíu em dois conjuntos diferentes de condições: Um, em concentrações moderadas de Na-fosfato até 150 mM, com uma concentração de NaCl até 1 M e um pH entre 6,0 e 6,5 e um em que FVII é eluído no gradiente combinado fosfato/pH/sal terminando em 500 mM de Na-fosfato e pH 8,0. A proteína era >80% pura no conjunto final do produto (figura 4, pista 8), como estimado por SDS-PAGE. As proporções ELISA Sigma:PD dos conjuntos de FVII eluídos foram 0 (figura 4, pista 5) e 1 (figura 4, pista 8), respectivamente, sugerindo uma remoção muito eficaz da proteína FVII com domínios Gla que não são reconhecíveis em ELISA Sigma (isto é, com domínios Gla insuficientemente gama-carboxilados) nas passagens iniciais. Este facto foi também confirmado por uma análise HPLC de quantificação da permuta aniónica Gla. 14

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Esta lista não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição:

wo 0158935 A wo 03093465 A wo 20040290 91 A wo 20041112 42 A wo 9920767 A wo 0066753 A wo 8810295 A wo 9215656 A wo 0229025 A wo 0170763 A wo 0183725 A wo 0202764 A wo 0222776 A wo 0238162 A wo 02077218 A wo 03027147 A wo 03037932 A wo 20040003 66 A wo 20040290 90 A wo 20041087 63 A

Lisboa, 18/10/2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de purificação do factor VII (rFVII) recombinante ou do factor VII activado recombinante (rFVIIa), compreendendo a passagem de rFVII ou rFVIIa em cromatografia liquida numa coluna de hidroxiapatite (HAP) , em que o rFVII ou rFVIIa é eluido da coluna de HAP utilizando um gradiente linear ou faseado (stepwise) de tampão fosfato ou eluente não-fosfato com uma concentração crescente de fosfato/eluente, e em que: o método inclui ainda uma fase de eluição em que o pH é aumentado faseadamente num valor da ordem de 1 a 3 posteriormente à eluição por gradiente da concentração ou o gradiente de fosfato ou eluente é combinado com um gradiente de pH com pH crescente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o rFVII ou rFVIIa é rFVII ou rFVIIa humano.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o rFVII ou rFVIIa é uma variante de rFVII ou rFVIIa humano, em que a variante possui uma sequência de aminoácidos que difere da sequência da FVII humana de tipo selvagem em 1 a 15 resíduos de aminoácidos.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que rFVII ou rFVIIa é aplicado à coluna de HAP num tampão fosfato com um pH entre 5,5-7,5. 2

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que rFVII ou rFVIIa é aplicado à coluna de HAP num tampão não-fosfato com um pH entre 5,5-9,0.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo uma fase inicial de eluição, utilizando um pH entre 5,5 e 7,5.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a fase inicial de eluição é efectuada com fosfato a uma concentração até cerca de 150 mM.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a eluição é efectuada utilizando um tampão fosfato com um pH entre 5,5 e 9,0.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o pH é aumentado de 6 a 7 até 8 a 9.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a eluição é efectuada utilizando-se um gradiente de tampão fosfato e um gradiente de pH.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o pH é aumentado do pH inicial de 5,5 a 7 até ao pH final de 7,5 a 9,0. Lisboa, 18/10/2010