[go: up one dir, main page]

PT1673450E - Polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina k, vkorc1, um alvo terapêutico de cumarina e seus derivados - Google Patents

Polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina k, vkorc1, um alvo terapêutico de cumarina e seus derivados Download PDF

Info

Publication number
PT1673450E
PT1673450E PT04790318T PT04790318T PT1673450E PT 1673450 E PT1673450 E PT 1673450E PT 04790318 T PT04790318 T PT 04790318T PT 04790318 T PT04790318 T PT 04790318T PT 1673450 E PT1673450 E PT 1673450E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
polypeptide
sequence
activity
vk0rc1
vkorc1
Prior art date
Application number
PT04790318T
Other languages
English (en)
Inventor
Johannes Oldenburg
Clemens R Mueller-Reible
Andreas Fregin
Tim-Matthias Strom
Simone Rost
Original Assignee
Baxter Int
Baxter Healthcare Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34520024&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT1673450(E) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Baxter Int, Baxter Healthcare Sa filed Critical Baxter Int
Publication of PT1673450E publication Critical patent/PT1673450E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/04—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a disulfide as acceptor (1.1.4)
    • C12Y101/04001—Vitamin-K-epoxide reductase (warfarin-sensitive) (1.1.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

1
DESCRIÇÃO "POLIPÉPTIDO DE RECICLAGEM DE EPÓXIDO DE VITAMINA K, VKORC1, UM ALVO TERAPÊUTICO DE CUMARINA E SEUS DERIVADOS"
Campo da Invenção A invenção refere-se a métodos para identificar derivados de cumarina, e reivindica também polipéptidos VK0RC1 e ácidos nucleicos de VK0RC1 contendo uma anormalidade de sequência associada a uma deficiência associada ao VK0RC1 como a resistência à varfarina, em que os polipéptidos VK0RC1 e ácidos nucleicos de VK0RC1 podem ser utilizados para diagnosticar estas deficiências. Além disso, a invenção refere-se a métodos para identificar derivados de cumarina utilizáveis no controlo de pragas de roedores.
Antecedentes da invenção A repressão de coagulação sanguínea inoportuna é a opção terapêutica de eleição para o tratamento agudo e para a prevenção prolongada de eventos trombóticos. Entre os anticoagulantes, as cumarinas são muito utilizadas para a prevenção de trombose tal como em doentes imobilizados após cirurgia, doentes possuindo uma insuficiência cardíaca crónica, doentes possuindo doença vascular aterosclerótica, doentes possuindo uma malignidade e doentes que estão grávidas. Além disso, as cumarinas são os anticoagulantes orais mais utilizados para o tratamento e profilaxia de trombose [Suttie, 1987]. As cumarinas são tipicamente derivados de 6-hidroxicumarina, como a 3-(acetonilbenzil)-4-hidroxicumarina (COUMADIN®) .
As cumarinas visam indirectamente a cascata de coagulação sanguínea através da inibição do ciclo de vitamina K. 2 A vitamina K é um cofactor essencial para a activação pós-tradução por carboxilação gama de um grupo de proteínas reguladoras, as proteínas Gla. Em várias vias metabólicas, algumas proteínas chave requerem carboxilação para funcionamento adequado. A cascata de coagulação sanguínea é o exemplo mais bem estudado. Aqui, os factores pró-coagulantes II, VII, IX e X, e os factores anticoagulantes proteína C, proteína S, proteína Z são dependentes de carboxilação gama. Esta modificação pós-tradução permite a ligação das proteínas modificadas - na presença de cálcio -a membranas bicamada de fosfolípido, a qual é um passo essencial na activação de coagulação sanguínea [Sperling et al., 1978][Esmon et al., 1975]. Outras proteínas que requerem carboxilação gama são as proteínas gla da matriz e a osteocalcina, ambas reguladoras do metabolismo ósseo [Price, 1988] e o "gene específico de paragem do crescimento", uma proteína de transdução de sinal do ciclo celular [Manfioletti et al., 1993] [Stitt et al., 1995].
Durante a carboxilação gama é introduzido um grupo carboxilo em resíduos glutamato das proteínas alvo pela enzima gama-glutamil-carboxilase (GGCX) em microssomas de fígado [Furie & Furie, 1988] [Suttie, 1987]. A reacção requer como um cofactor, quantidades estequiométricas de vitamina Kl reduzida hidroquinona (vitamina K1H2) a qual é oxidada a epóxido de vitamina K-2.3 [Cain et al., 1997], A regeneração do cofactor activo é mediada por um complexo multi-proteico designado epóxido de vitamina K-2.3-redutase (VKOR) [Wallin & Martin, 1985]. 0 mesmo complexo é visado pelos venenos tipo cumarina utilizados no controlo de pragas de roedores. Este "ciclo de vitamina K" foi caracterizado bioquimicamente em grande pormenor mas as componentes moleculares ainda não foram purificadas até à 3 homogeneidade [Guenthner et al. , 19981]. Além disso, a natureza molecular da actividade da cumarina e as moléculas que interagem com as cumarinas continuam ininteligíveis. É geralmente reconhecido na técnica que, apesar de serem muito eficazes, existe um número de restrições à utilização de cumarinas. Antes de mais nada; existem humanos que são não reactivos ao tratamento com cumarina. 0 termo resistência à varfarina (WR) é utilizado para indivíduos que mantêm actividades normais do factor de coagulação apesar da anticoagulação oral com cumarinas (N° Acesso OMIM 122700). Foi observada transmissão autossómica dominante em várias linhagens [0'Reilly et al., 1964][0'Reilly, 1970]. A deficiência combinada de todos os factores de coagulação dependentes de vitamina K (VKCFD) é um distúrbio hemorrágico muito raro em humanos de hereditariedade autossómica recessiva com 14 casos descritos até à data [McMillan & Roberts, 1966] [Fischer, 1966] [Johnson et al., 1980][Goldsmith et al., 1982][Vicente et al., 1984][Ekelund et al., 1986] [Pauli et al. , 1987] [Leonard, 1988] [Pechlaner et al., 1992][Boneh & Bar-Ziv, 1996][Brenner et al., 1998][Spronk et al. , 2000] [Oldenburg et al., 2000]. Os sintomas clínicos da doença incluem episódios de hemorragia intracerebral perinatal por vezes com resultado fatal. A tendência para sangramento é em geral totalmente revertida por administração oral de vitamina K. Outros sintomas em recém-nascidos podem assemelhar-se a embriopatia varfarínica com hipoplasia nasal e falângica distai e calcificação prematura de epífises [Pauli et al., 1987]. A doença pode resultar de uma reabsorção/transporte insuficiente de vitamina K para o fígado [Prentice, 1985] ou de mutações em um dos genes envolvidos na carboxilação gama. No subtipo 1 (VKCFD1, OMIM # 277450), mutações no 4 gene GGCX no cromossoma 2pl2 resultam em carboxilação insuficiente de factores de coagulação [Brenner et al., 1998] [Spronk et al., 2000]. Foi descrita uma ligação de dois parentes com deficiência familiar múltipla de factores de coagulação (FMFD, agora designada: VKCFD2, OMIM # 607473) num intervalo de 20 Mb da região pericêntrica do cromossoma 16pl2-q21 [Fregin et ai., 2002], Doentes com VKCFD2 exibiram níveis de epóxido de vitamina K no soro significativamente aumentados, sugerindo assim um defeito em uma das subunidades do complexo de VKOR. No seu conjunto, é evidenciado que existem doentes que exibem resistência à varfarina. Consequentemente, existe uma necessidade de identificar novos derivados de cumarina que sejam anticoagulantes eficazes para tratar estes doentes e métodos para identificar estes derivados de cumarina. A utilização de cumarinas está associada a um risco de sangramentos espontâneos, com uma taxa de mortalidade significativa. Além disso é difícil determinar a dose exacta de cumarina de manutenção. Na ausência da molécula alvo sobre a qual a cumarina exerça um efeito, o regime de tratamento tem de ser determinado doente a doente. Durante o período de tempo em que ainda não foi estabelecido o regime óptimo, o doente sofre de um maior risco de trombogénese ou de um maior risco de sangramento. Portanto, existe a necessidade de um método para determinar o regime de tratamento óptimo que seja mais rápido e mais seguro. Além do mais, a determinação de um regime de tratamento óptimo é complicada pelo facto de existir um atraso considerável entre a administração de cumarinas e o aparecimento da sua actividade anticoagulante. Dado a acção retardada da cumarina e dado o facto de a cumarina tender a acumular-se ao longo do tempo existe uma necessidade para 5 derivados de cumarina que afectem a coagulação sanguínea de modo mais rápido que as cumarinas conhecidas na técnica. Pela mesma razão, existe também a necessidade de cumarinas que sejam metabolizadas mais rapidamente para que a acumulação de cumarina seja evitada ou melhorada e, consequentemente, seja reduzido ou anulado o perigo de sobredosagem.
Está bem estabelecido que se o tratamento com cumarina é iniciado durante um estado trombótico, os níveis de proteína C e S diminuem, criando assim temporariamente um potencial trombogénico o qual é geralmente compensado pela administração sobreposta de heparina e cumarina durante um certo número de dias. Mais uma vez, existe uma necessidade de identificar o alvo molecular de acção da cumarina para se conseguir seleccionar novos derivados de cumarina que não possuam estas limitações ou que as possuam pelo menos num grau menor. A terapia de cumarina induz, por vezes, necrose cutânea nos doentes e se aplicada durante a gravidez pode provocar embriopatia criando uma necessidade de novos derivados de cumarina que não originem estes efeitos.
Existe um número de interacções entre fármacos e cumarinas. Alguns destes fármacos, como o Fenobarbital, induzem menores níveis de cumarinas no plasma devido a uma maior metabolização de cumarina que se julga que seja provocada pelas oxidases de função mista como as oxidases de função mista do citocromo P450. Uma tal interacção é de relevância clínica se tiver sido determinado o regime apropriado de, por exemplo, Fenobarbital e cumarina e mais tarde for descontinuada apenas a administração de Fenobarbital 6 levando a um aumento do nível de cumarina no plasma, o qual provocaria uma anticoagulação excessiva. Outros fármacos como a Amiodarona provocam uma metabolização retardada de cumarina levando mais uma vez a anticoagulação excessiva se co-administrada com cumarinas. Uma vez que as moléculas afectadas pelas cumarinas não são conhecidas na técnica, existe uma necessidade para desenvolver novas cumarinas e ferramentas para identificar as últimas para resolver estes problemas. A WO 00/03015 descreve sequências de ácido nucleico e aminoácidos de homólogos da proteína de transporte humana e a sua utilização (cf. para os exemplos página 1, linhas 5 até 7) . Além disso, a Base de Dados EMBL, biblioteca de ADNc de Mus musculus (XP002318821) descreve o ADNc de um Mus musculus da cabeça de um embrião com 13 dias (cf. por exemplo o título). Adicionalmente, Fregin, A. et ai, Blood, Vol. 100, No. 9, 1 de Novembro de 2002, descreve a identificação de um segundo gene de deficiência hereditária combinada de múltiplos factores de coagulação no cromossoma 16 (cf. por exemplo página 3231, coluna da esquerda, linhas 22 até 25) e Zimmermann, A. et al. , Biochemical Pharmacology, Vol. 23, p. 1033-1040, descreve a influência de varfarina na formação de protrombina e na regeneração de vitamina K a partir de epóxido de vitamina K-2.3 (cf. por exemplo o resumo).
Finalmente, as cumarinas, especialmente a varfarina, não são apenas usadas em humanos mas desde os anos de 1950, as cumarinas têm sido utilizadas como um ingrediente activo em composições rodenticidas. A base para a eficácia de varfarina como um rodenticida assenta no facto de ser um anticoagulante eficaz em doses pequenas, múltiplas. Uma ou 7 duas doses do composto são raramente fatais se tomadas à concentração recomendada; assim é muito reduzido o perigo de toxicidade aguda no homem, animais domésticos e vida selvagem. Geralmente, os roedores começam a morrer após quatro ou cinco doses diárias dos materiais, e a população é muito reduzida ou erradicada em aproximadamente três semanas. A morte é provocada por hemorragias, originadas pela acção da varfarina na redução do poder de coagulação do sangue. Estas hemorragias podem ser externas ou internas e podem ser iniciadas por lesões muito ligeiras ou degradação capilar. Uma das outras vantagens das cumarinas é que, devido ao facto de serem necessárias ingestões múltiplas para matar os roedores, eles não desenvolvem receio ao isco. Nos inícios de 1969, os roedores - em particular ratazanas e, em menor grau, os ratos - começaram a mostrar resistência aos iscos de varfarina. A suposição geral foi que uma tal resistência tinha uma base genética. No que se refere ao mecanismo, é o complexo VK0RC1 mencionado acima que é visado pelos derivados de varfarina em utilização no controlo de pragas de roedores. [Jackson et al., 1988]. A resistência aos derivados de cumarina surgiu espontaneamente em várias populações de roedores selvagens tornando a utilização destas drogas localmente ineficazes no controlo de pragas. Foram mapeados sítios autossómicos dominantes para resistência à varfarina no rato (War) no cromossona 7 [Wallace et al. , 1976] e na ratazana (Rw) no braço comprido do cromossoma 1 [Greavses & Ayres, 1967] [Kohn & Pelz, 1999] . Uma vez que o complexo de VKOR é o alvo da resistência aos fármacos de cumarina, pensa-se que seja mediada por alterações numa das suas componentes proteicas [Jackson, 1988]. 0 desenvolvimento de resistência em roedores criou uma necessidade para identificar o alvo da acção de cumarinas o que poderia facilitar o desenvolvimento de novos derivados de cumarina para utilização no controlo de pragas.
No seu conjunto é um objecto da presente invenção proporcionar uma molécula alvo para a cumarina e seus derivados em mamíferos. É um outro objecto da presente invenção proporcionar métodos para identificar novas cumarinas que resolvam pelo menos um dos problemas mencionados acima. É ainda um outro objecto da presente invenção identificar polipéptidos e ácidos nucleicos que os codificam, os quais provocam resistência à varfarina em mamíferos humanos e não humanos, preferencialmente roedores. Também é um objecto da presente invenção diagnosticar, prevenir e/ou tratar distúrbios e doenças seleccionadas de doenças de resistência à varfarina, deficiência de factores múltiplos familiar, um distúrbio ou doença associada a coagulação sanguínea aumentada como doentes que sofrem de um trombo e/ou doentes possuindo um maior risco de desenvolver um trombo, como um maior risco hereditário de trombogénese, preferencialmente um maior risco de trombogénese devido a uma cirurgia ou devido a gravidez, e calcificação vascular aumentada. Além disso, também é um objecto da presente invenção diagnosticar, prevenir e/ou tratar doenças ou distúrbios associados a coagulação sanguínea atenuada, como hemofilia, calcificação vascular diminuída associada a distúrbio e distúrbios e doenças com um maior risco de sangramento. Finalmente, é um objecto da presente invenção proporcionar um método para identificar cumarina e seus derivados que sejam eficazes no controlo de pragas de mamíferos não humanos e composições para matar roedores.
Sumário da Invenção 9
Na resolução dos objectos acima é proporcionado um método de identificação de um derivado de cumarina que exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VK0RC1 compreendendo uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com SEQ ID No. 1, 12, e 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 80% de homologia com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b), em que a sequência polipeptidica tem actividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a), (b) ou (c) possuindo actividade VKORC1, compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula hospedeira onde foi introduzido um ácido nucleico de VKORC1 ou um vector contendo o ácido nucleico de VKORC1; (II) expressar o polipéptido VKORC1 na célula hospedeira; (III) administrar um derivado de cumarina candidato; (IV) determinar a actividade de polipéptido VKORC1 (valor de actividade do candidato); (V) comparar o valor de actividade do candidato com um valor de actividade de controlo; e (VI) identificar o derivado de cumarina candidato como um derivado de cumarina que exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VKORC1, desde que o valor de actividade do candidato seja significativamente diferente do valor de actividade do controlo. 10
Além disso, de acordo com outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de determinação de uma sequência de um polipéptido VKORC1 que confere um efeito de cumarina exercido sobre a actividade VKORC1, compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa o polipéptido VKORC1 de acordo com a invenção, polipéptido VKORC1 esse que tem pelo menos uma anormalidade de sequência; (II) administrar cumarina ou um seu derivado à célula; (III) determinar a actividade do polipéptido VKORC1 (valor de actividade da anormalidade de sequência); e (IV) comparar o valor de actividade da anormalidade de sequência com o valor de actividade da sequência de controlo, em que um desvio significativo do valor de actividade da anormalidade de sequência relativamente ao valor de actividade da sequência de controlo é revelador que a anormalidade de sequência do polipéptido VK0RC1 confere o efeito de cumarina exercido sobre o polipéptido VKORC1.
Noutro aspecto da presente invenção é proporcionado um polipéptido VKORC1 de acordo com a invenção, em que o polipéptido VKORC1 contém pelo menos uma anormalidade de sequência, a qual exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VKORC1 e em que o polipéptido VKORC1 é o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1 ou 12 e a anormalidade de sequência é seleccionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R, e Y139C.
Além disso, de acordo com outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de diagnóstico de uma resistência à varfarina ou deficiência de factores de 11 coagulação múltiplos de tipo 2 (VKCFD2) num doente compreendendo os passos de: (I) amplificar uma amostra de ADN obtida do doente ou transcrever inversamente uma amostra de ARN obtida do doente num ADN e amplificar o ADN; e (II) analisar o ADN amplificado do passo (I) para determinar pelo menos uma anormalidade de sequência numa sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido VK0RC1 ou numa sequência de aminoácido de um polipéptido VK0RC1; em que a anormalidade de sequência determinada é reveladora do doente que sofre de uma deficiência associada ao VK0RC1; preferencialmente a anormalidade de sequência exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VK0RC1.
Além disso, de acordo com outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de identificação de um derivado de cumarina o qual é toxicologicamente eficaz em roedores resistentes à varfarina compreendendo os passos de: (I) proporcionar um roedor resistente à varfarina; (II) administrar um derivado de cumarina candidato ao roedor, (III) determinar a toxicidade do derivado de cumarina candidato sobre o roedor (valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato); (IV) comparar o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato com um valor de toxicidade de cumarina de controlo; (V) identificar o derivado de cumarina candidato como um derivado de cumarina eficaz como rodenticida desde que o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato seja 12 significativamente maior do que o valor de toxicidade da cumarina de controlo.
Breve descrição dos desenhos
Fiq. 1 representa uma comparação do intervalo candidato de 3cM no mapa genético contendo o locus do gene de VK0RC1 em humanos, ratazanas e ratos. É mostrado o ideograma do cromossoma 16 humano, a área de homozigosidade nas famílias 1 e 2 prolonga-se desde 16pll.2 até 16ql3 correspondendo a aproximadamente 25 Mb. Na parte direita da figura existem partes homólogas de cromossomas de rato e ratazana. São representados os genes sinténicos de 16pll.2 e 16ql2.1 com os correspondentes homólogos em Mus musculus (MMU) e Rattus norvegicus (RNO). Os sítios do fenótipo de resistência à varfarina no rato (War) e ratazana (Rw) estão mapeados em regiões homólogas a 16pll.2. MMU: Mus musculus; RNO: Rattus norvegicus; PRKCB1; Prkcb; IL4R: receptor de interleucina 4 á (humano); II4ra: receptor de interleucina 4 á (murídeo); II4r: receptor de interleucina 4 á (ratazana); SPS2:
Selenofosfato-sintetase (humana); Sps2: Selenofosfato- sintetase (murídea/ratazana); HUMMLC2B: Cadeia leve 2 da miosina (humana); Milpf: Cadeia leve 2 da miosina (muridea) ; Mil2: Cadeia leve 2 da miosina (ratazana); SPN: Sialoforina (humana); Spn: Sialoforina (murídea/ratazana).
Fig. 2 apresenta mutações VK0RC1 no factor de coagulação 2 dependente de vitamina K humano (VKCFD2) e doentes com resistência à varfarina (WR) . A parte superior da figura mostra a segregação da mutação R98W em duas famílias VKCFD2 e os electroferogramas de um mutante homozigótico (esquerda) em comparação com um controlo (direita). A parte inferior da figura mostra as mutações heterozigóticas de 13 quatro doentes WR. (85G>T, 134T>C, 172A>G, 383T>G) e uma ratazana Rw (416A>G).
Fig. 3 mostra um alinhamento de sequência de polipéptidos VK0RC1 e proteína 1 tipo VK0RC1 (VK0RC1L1). 0 alinhamento foi gerado com CLUSTALW e PRETTYBOX. Os polipéptidos VK0RC1 de humano (hVKORCl), rato (mVKORCl) e ratazana (rVKORCl) e os polipéptidos VK0RC1L1, isto é VK0RC1L1 de humano (hVKORCILl), rato (mVKORCILl) e Fugu rubripes (fVKORCILl), partilham aproximadamente 84% de identidade de sequência em ambos os grupos e aproximadamente 50% de identidade entre ambos os grupos de proteínas. xVKORCl representa a sequência do polipéptido VKORC1 de Xenopus laevis, fVKORCl a sequência do polipéptido VKORC1 de Fugu rubripes e aVKORCl a sequência do polipéptido VKORC1 de Anopheles gambiae. A análise de árvore permite o agrupamento das proteínas de Fugu rubripes, Xenopus laevis e Anopheles gambiae no grupo apropriado. Estão sublinhadas as localizações dos domínios transmembranares previstos. Os resíduos 29, 45, 58 e 128 mutados em doentes WR são conservados em todas as espécies. A arginina na posição 98 mutada nos doentes com VKCFD2 é conservada em humanos, ratazanas e ratos (sinal mais).
Fig. 4 apresenta uma análise de transferência de Northern de VKORC1 em tecidos fetal e adulto humano. O diagrama superior representa uma transferência de Northern de tecido adulto, enquanto o diagrama inferior representa uma transferência de Northern de tecido fetal. Para mais detalhes ver Exemplo 4. As linhas com fragmentos de tamanhos 2,4, 4,4, 7,5 e 9,5 KB indicam marcadores de massa molecular e permitem estimar o tamanho de todas as bandas visíveis) 14
Fiq. 5 mostra a localização subcelular de VK0RC1. Para mais pormenores ver exemplo 6. Para este fim, células COS-7 transfectadas transitoriamente com construções VK0RC1 foram reveladas com anti-calnexina (vermelho; coluna da esquerda) e anti-GFP ou anti-myc, respectivamente (verde; coluna do meio) . Na coluna da direita são mostradas figuras fundidas das células com revelação dupla. Ambas as construções VK0RC1 (marcadas com GFP ou myc) são co-localizadas com a revelação de calnexina especifica para ER. A construção de controlo (pEGFP-Nl) mostra um padrão de revelação difuso ao longo do citoplasma.
Fig. 6 apresenta uma lista de sequências de ARNsi para VK0RC1 de homo sapiens e iniciadores que codificam estes ARNsis os quais podem ser utilizados para os expressar utilizando, por exemplo, o Sistema de Interferência de ARN da Cassete siLentGene™ U6.
Fig. 7 apresenta localizações de alvos de ARNsi na sequência de codificação da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl), as quais são mostradas a cinzento claro; as regiões que fazem parte de dois alvos possíveis de ARNsi são mostradas a cinzento mais escuro; e as regiões com duas ou mais sequências de ARNsi possíveis são mostradas a cinzento ainda mais escuro.
Fiq. 8 fornece uma lista de sequências iniciadoras de PCR e condições de PCR para amplificação de VK0RC1 de Homo sapiens e VKORClLlde Homo sapiens. 15
Fig. 9 fornece uma listagem das sequências e seus respectivos SEQ ID NOs.
Fig. 10 mostra actividades VKOR de células HEK293 transfectadas com ADNc de VKORC1. Os valores são dados como percentagem de epóxido de vitamina K convertida em vitamina K quinona (produto/substrato residual+produto). A actividade VKORC1 selvagem também é definida como sendo sensível à varfarina (4,3% de actividade residual a 80μΜ de varfarina em comparação com a não inibida). As mutações Y139C e V29L que conduzem a resistência à varfarina exibem 69 e 11 % de actividade residual a 80 μΜ de varfarina, respectivamente). Todos os ensaios foram realizados em duplicado. Não transfectadas e transfectadas de modo simulado apresentaram actividades de 1,49 e 0,96%, e foram inibidas em >90% por 10 μΜ de varfarina. Para mais detalhes ver Exemplo 7.
Fig. 11 mostra a sequência de aminoácidos do polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina K de Homo sapiens (HS_VK0RC1; SEQ ID NO: 1)
Fig. 12 mostra a sequência de codificação de ácido nucleico do polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina K de Homo sapiens (HS VKORC1; SEQ ID NO: 2).
Fig. 13 mostra o resultado de uma experiência de ARMS-PCR para determinar se uma ratazana testada é resistente varfarina. A ratazanas de tipo selvagem exibiram uma banda a 123 pb (sonda# 3351, 3133, 3137, 3142, 4724, 4684, 3138, 3162), as ratazanas homozigóticas à mutação (sonda# 4701) exibiram uma banda a 101 pb e, finalmente, ratazanas com a mutação heterozigótica (sonda# 3066, 3350, 3352, 3354, 16 3139, 3140, 4754, 3146, 3148, 3149 ) mostraram duas bandas, uma banda a 101 e outra a 123 pb. Para mais pormenores ver Exemplo 9.
Descrição detalhada da invenção A fim de satisfazer as necessidades de desenvolver novos derivados de cumarina e para identificar o alvo de cumarina e seus derivados, clonou-se o polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina K (VK0RC1). Era anteriormente desconhecido que este gene atravessava uma região genómica de 5126 pb e que compreendia três exões que codificavam uma proteína de 163 aminoácidos. A análise de topologia sugere uma proteína extremamente hidrófoba com pelo menos dois domínios transmembranares. Isto é compatível com a localização conhecida da actividade do complexo VKORC1 em membranas ER e com os dados de imunofluorescência em células COS-7 transfectadas com construções de VKORC1 (Fig. 5) . O gene de VKORC1 foi surpreendentemente identificado numa pré-selecção de mutantes de doentes resistentes à varfarina (para pormenores cf. exemplos 1 e 2) . Foi surpreendentemente identificado um gene, VKORC1, o qual está mutado em doentes com uma deficiência combinada de todos os factores de coagulação dependentes de vitamina K (VKCFD2) e com resistência à varfarina (WR) , respectivamente, mostrando que o polipéptido VKORC1 contém um sítio de ligação para a varfarina e é um alvo de cumarina e seus derivados. A evidência que as mutações são originadoras dos dois fenótipos é como se segue: (i) uma mutação R98W surge com a doença em duas famílias sem parentesco com VKCFD2; 17 (ii) esta arginina na posição 98 é conservada nos genes humano e nos homólogos de rato e ratazana, respectivamente, (iii) três irmãos resistentes à varfarina partilham uma substituição R58G; (iv) este aminoácido e os outros residuos encontrados mutados em mais dois doentes WR sem parentesco (V29L e L128R) são conservados em todas as espécies analisadas excepto em três genes bacterianos (ver Fig. 3); e (v) nenhuma das 5 mutações presumíveis foram encontradas em 192 amostras de ADN de controlo.
Além do mais, pesquisas de homologia em bases de dados de genoma e proteínas não revelaram quaisquer semelhanças de VK0RC1 com qualquer domínio de proteína ou péptido da função anotada. No entanto, estão presentes genes homólogos em vertebrados (ratazana, rato, Xenopus, Fugu), insectos (Anopheles) e bactérias (Fig. 3) . Surpreendentemente, os três mamíferos e o Fugu têm cada um deles um segundo gene tipo VK0RC1 de semelhança moderada com o gene cognato. Um certo número de posições de aminoácido dentro destes genes foi conservado ao longo da evolução. Isto está de acordo com o facto bem estabelecido de que a carboxilação gama - e assim a utilização de vitamina K como um cofactor deste processo - é uma modificação evolucionária antiga pós-tradução da proteína [Bandyopadhyay et ai., 2002].
Uma substituição de valina 29, arginina 58 leucina 128 -embora dispersada sobre todo o polipéptido VKORC1 - torna, obviamente, a inibição de actividade VKORC1 pela varfarina ineficaz. Pode especular-se que estes aminoácidos cooperam funcionalmente na estrutura terciária da proteína 1 de VKORC1. No seu conjunto, os dados de mutação em doentes com 18 dois fenótipos diferentes indicam o VK0RC1 como a proteína alvo, para a ligação tanto da vitamina K como da varfarina.
Dentro do significado da invenção, o termo "polipéptido VK0RC1" refere-se à sequência completa do polipéptido VK0RC1 compreendendo, consistindo preferencialmente de, uma sequência polipeptídica seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptídica seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com SEQ ID No. 1,12,17, 21, 25 e 27; (b) uma sequência polipeptídica de um alelo da sequência polipeptídica definida em (a); (c) uma sequência polipeptídica possuindo pelo menos 80% de homologia com a sequência polipeptídica definida em (a) ou (b), sequência polipeptídica essa que tem actividade VK0RC1; e (d) uma sequência polipeptídica de um fragmento da sequência polipeptídica definida em (a), (b) ou (c) possuindo actividade VK0RC1.
Preferencialmente, o polipéptido VKORC1 é um alvo para a cumarina e seus derivados em mamíferos. O termo "polipéptido VKORC1" também abrange polipéptidos isolados de VKORC1 e polipéptidos VKORC1 que são preparados por métodos recombinantes, por exemplo por isolamento e purificação a partir de uma amostra, uma célula hospedeira que expressa o polipéptido VKORC1, por triagem de uma biblioteca e por síntese de proteínas, sendo todos este métodos geralmente conhecidos do especialista na técnica. Preferencialmente, pode sintetizar-se todo o polipéptido VKORC1 ou partes deste, por exemplo, com a ajuda de síntese convencional como a técnica Merrifield. Mais 19 preferencialmente, o termo "polipéptido VK0RC1" também abrange polipéptidos que têm uma homologia de sequência de cerca de 80%, preferencialmente cerca de 90%, em particular, cerca de 95%, especialmente cerca de 98% com o polipéptido VK0RC1 de acordo com uma de SEQ ID No. 1, 12, 17, 21, 25 e 27, desde que tal polipéptido VKORC1 possua actividade VKORC1. Além disso, é preferido que o termo "polipéptido VKORC1" também abranja polipéptidos homólogos que tenham origem em organismos que não o humano, preferencialmente de mamíferos não humanos como roedores, por exemplo rato, ratazanas, ou macacos e porcos e outros vertebrados e invertebrados, como as sequências de aminoácidos de acordo com as SEQ ID, Nos. 12, 17, 21, 25, 27, desde que esse polipéptido VKORC1 possua actividade VKORC1. É ainda mais preferido que o termo "polipéptido VKORC1" também inclua polipéptidos VKORC1, os quais são codificados por alelos diferentes do gene, em indivíduos diferentes, em órgãos diferentes de um organismo ou em fases diferentes do desenvolvimento, desde que esse polipéptido VKORC1 possua actividade VKORC1. Pretende-se ainda que o termo "polipéptido VKORC1" também abranja preferencialmente mutações naturais ou sintéticas que não exerçam nenhum efeito ou que exerçam apenas efeitos insignificantes na actividade do polipéptido VKORC1. Outros polipéptidos preferencialmente abrangidos pelo termo "polipéptido VKORC1" incluem polipéptidos VKORC1 que possam resultar de excisão-união diferencial do transcrito de VKORC1, desde que esse polipéptido VKORC1 possua actividade VKORC1. O termo "fragmento da sequência polipeptídica" pretende abranger sequências parciais de polipéptidos VKORC1, fragmentos esses que compreendem, preferencialmente 20 consistem de pelo menos cerca de 60%, preferencialmente pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% da sequência completa do polipéptido VKORC1. Em particular, prefere-se que o fragmento consista de uma única sequência contígua do polipéptido VKORC1 mas também pode conter pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos cerca de cinco porções de sequência diferentes de um polipéptido VKORC1 de acordo com a invenção as quais podem, ou não, estar intercaladas por uma sequência heteróloga ou não conter de todo qualquer sequência polipeptídica extra. O termo "homologia de sequência" é entendido como o grau de identidade (% de identidade) de duas sequências que, no caso de polipéptidos, pode ser determinada por meio de, por exemplo, BlastP 2.0.1 e no caso de ácidos nucleicos por meio de, por exemplo BLASTN 2.014, em que o Filtro está fixado e o BLOSUM é 62 (Altschul et al., 1997). "Actividade VKORC1" dentro do significado da presente invenção pretende significar a actividade biológica do polipéptido VKORC1 de SEQ ID No.l. Mais preferencialmente, "actividade VKORC1" é definida como a actividade do polipéptido VKORC1 para converter enzimaticamente (ou suportar a conversão enzimática) de epóxido de vitamina K2.3 em vitamina K-quinona e/ou a conversão de vitamina K quinona em vitamina K hidroquinona. A actividade VKORC1 pode ser determinada utilizando um ensaio com base nas experiências descritas em pormenor no exemplo 7 e figura 10. Utilizando o ensaio, uma percentagem medida de epóxido de vitamina K convertida em vitamina K quinona (produto/substrato+produto) em células que expressam um 21 dado polipéptido VK0RC1, ou uma molécula de ácido nucleico que codifica esse polipéptido VK0RC1, a qual aumenta a actividade VKOR basal de células HEK293 de cerca de 1% (1,49 e 0,96% para células HEK293 não transfectadas e transfectadas de modo simulado, respectivamente) para cerca de 15% ou mais, preferencialmente para cerca de 18% ou mais, preferencialmente para cerca de 20% ou mais, muito preferencialmente para cerca de 25% ou mais é considerada uma actividade VK0RC1 dentro da acepção da invenção.
Os polipéptidos VKORC1 de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por um método descrito em mais pormenor abaixo. Entre outras coisas, os polipéptidos VK0RC1 são úteis para identificar derivados de cumarina que evitem os problemas descritos acima. Em particular, eles são úteis para identificar derivados de cumarina, que inibem eficazmente a actividade VKORC1 e que são testados em ensaios independentes quanto à (1) sua semivida metabólica para identificar derivados de cumarina que são metabolizados mais depressa que as cumarinas conhecidas na técnica, (2) sua capacidade para provocar necrose cutânea para identificar derivados de cumarina que não provoquem necrose cutânea ou que provoquem em menor grau do que as cumarinas conhecidas na técnica, (3) interacções derivado de cumarina-fármaco para identificar derivados de cumarina com menos efeitos secundários do que as cumarinas conhecidas na técnica. Além disso, os polipéptidos VKORC1 de acordo com a presente invenção são úteis para identificar uma sequência VKORC1 que interaja com a cumarina e seus derivados, e para tratar doentes possuindo uma actividade VKORC1 menor ou maior em relação aos níveis de controlo. 22 0 termo "ácido nucleico de VK0RC1" refere-se a ARN ou ADN, o qual pode ser uma molécula de cadeia simples ou preferencialmente de cadeia dupla. A sequência do ácido nucleico de VK0RC1 pode ainda compreender pelo menos um intrão e/ou uma sequência poliA. 0 termo "ácido nucleico de VK0RC1" também pode abranger uma sua fase precursora, por exemplo um pró-polipéptido ou pré-pró-polipéptido. Entender-se-á ainda que podem estar presentes sequências não traduzidas na extremidade 5' e/ou extremidade 3' do ácido nucleico, sem que se altere significativamente a actividade dos polipéptidos codificados. No entanto, é particularmente preferida a região de ADN que codifica o polipéptido VK0RC1. Nos eucariotas, esta região começa com o primeiro códão de inicio (ATG) o qual está localizado numa sequência Kozak (Kozak, 1987) e prolonga-se até ao próximo códão de paragem (TAG, TGA ou TAA) o qual está localizado na mesma grelha de leitura que a ATG. No caso de procariotas, esta região começa com a primeira AUG (ou GUG) após uma sequência Shine-Dalgamo e termina com o próximo códão de paragem (TAG, TGA ou TAA) o qual está localizado na mesma grelha de leitura que a ATG. Além do mais, o termo "ácido nucleico de VK0RC1" também pode abranger sequências que exibem pelo menos cerca de 70%, em particular pelo menos cerca de 80%, especialmente pelo menos cerca de 90%, de homologia de sequência com a sequência de acordo com as SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28, preferencialmente com a sequência de acordo com a SEQ ID No. 2, desde que o polipéptido VKORC1 codificado por esse ácido nucleico possua actividade VKORC1. Numa forma de realização preferida da invenção o ácido nucleico compreende um ácido nucleico possuindo uma sequência complementar e/ou antimensageira a um ácido nucleico de VKORC1 compreendendo, consistindo preferencialmente de um modo essencial de, uma 23 sequência de ácido nucleico seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipéptido VK0RC1 de acordo com a invenção: (b) uma sequência de ácido nucleico seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com as SEQ ID No. 2, 13, 18, 22, 26 e 28; (c) uma sequência de ácido nucleico que hibridiza em condições rigorosas na sequência de ácido nucleico definida em (a) ou (b), sequência de ácido nucleico essa que codifica um polipéptido possuindo actividade VK0RC1; (d) uma sequência de ácido nucleico a qual, excepto no caso de degeneração do código genético, hibridizaria, preferencialmente em condições rigorosas, no ácido nucleico definido em (a) , (b) ou (c) e sequência de ácido nucleico essa que codifica um polipéptido possuindo actividade VK0RC1; e (e) um fragmento da sequência de ácido nucleico definida em (a), (b), (c) ou (d), fragmento esse que codifica um polipéptido possuindo actividade VK0RC1.
Preferencialmente, o ácido nucleico de VK0RC1 codifica um alvo para a cumarina e seus derivados em mamíferos. 0 ácido nucleico de VK0RC1 também pode compreender uma variante mutante não funcional do ácido nucleico de VK0RC1 como definido acima, contendo essa variante um único polimorfismo de nucleótido (SNP) como as sequências de ácido nucleico de acordo com as SEQ ID No. 8 e 9, desde que o polipéptido VK0RC1 codificado por esse ácido nucleico possua actividade VK0RC1. 24 0 termo "condições de hibridização rigorosas" é para ser entendido, em particular, como significando aquelas condições às quais ocorre uma hibridização, por exemplo, a 60°C em tampão SSC 2,5x seguida de vários passos de lavagem a 37°C numa concentração menor de tampão e permanece estável. O termo "fragmento da sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido possuindo actividade VKORC1" é compreendido como abrangendo fragmentos de sequência de ácido nucleico compreendendo, consistindo preferencialmente de, pelo menos cerca de 60%, preferencialmente pelo menos cerca de 7 0%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% da sequência completa que codifica o polipéptido VKORC1 de acordo com a invenção, preferencialmente que codifica o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1, desde que o polipéptido codificado por esse fragmento possua actividade VKORC1. Em particular, prefere-se que o fragmento consista de uma única sequência contígua que codifique o polipéptido VKORC1 mas também pode conter pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos cerca de cinco porções de sequência diferentes, as quais podem, ou não, estar intercaladas por uma sequência heteróloga ou não conter de todo qualquer sequência de ácido nucleico extra, desde que todas as porções de sequência estejam arranjadas na mesma grelha de leitura. É essencial para a definição destes fragmentos que eles apresentem actividade VKORC1.
Os ácidos nucleicos de VKORC1 podem ser produzidos por métodos geralmente conhecidos do especialista. Os ácidos nucleicos podem ser preparados sinteticamente. Assim, os 25 ácidos nucleicos de VK0RC1 podem ser, por exemplo, quimicamente sintetizados, por exemplo de acordo com o método de fosfotriéster, com a ajuda as sequências de ADN como definidas acima e/ou com a ajuda das sequências polipeptidicas que são também definidas acima tal como a SEQ ID No. 1 e por referência ao código genético (ver, por exemplo, Uhlmann & Peyman, 1990). Preferencialmente, os ácidos nucleicos de VKORC1 são produzidos por métodos de tecnologia recombinante de genes geralmente conhecidos do especialista na técnica.
Entre outras coisas, os ácidos nucleicos de VKORC1 são úteis (1) para identificar derivados de cumarina que evitam os problemas descritos acima, (2) para produzir iniciadores de PCR, sondas de ADN e ARN, ARNsi ou ARNsh, e para o polipéptido VKORC1, (3) para tratar doentes que têm uma actividade VKORC1 menor ou maior do que os valores de controlo, e (4) para identificar derivados de cumarina que podem ser utilizados para controlar pragas de roedores, as quais são todas descritas em mais pormenor abaixo.
Como aqui utilizada, uma célula hospedeira pode ser qualquer célula hospedeira como definida abaixo. Os métodos para seleccionar e cultivar as células hospedeiras e para fazer com que as células hospedeiras expressem um polipéptido são geralmente conhecidos do especialista na técnica. O mesmo é verdade para métodos de isolamento do polipéptido expressado da célula hospedeira; para este fim pode utilizar-se um anticorpo de acordo com a invenção para precipitação por imunoafinidade. Como uma alternativa, o vector pode conter uma etiqueta (poli)peptidica que permite a precipitação por imunoafinidade por anticorpos 26 específicos contra a etiqueta de acordo com protocolos correntes conhecidos do especialista (ver também abaixo) .
Também se pode adicionar pelo menos mais uma "etiqueta polipeptídica," por exemplo, para o propósito de purificar os polipéptidos VK0RC1 anteriormente descritos. Por exemplo, as etiquetas proteicas adequadas permitem que as proteínas de fusão que vão ser purificadas sejam absorvidas com lata afinidade para uma matriz. Isto é depois seguido, por exemplo, de lavagem rigorosa com tampões adequados sem eluir as proteínas de fusão em qualquer extensão significativa e, subsequentemente, eluição específica das proteínas de fusão. Exemplos de etiquetas proteicas que são conhecidas do especialista são uma etiqueta (His)6, uma etiqueta Myc, uma etiqueta FLAG, uma etiqueta de hemaglutinina, uma etiqueta de glutationa-transferase (GST), inteina possuindo uma etiqueta de ligação de quitina por afinidade e uma etiqueta proteica de ligação de maltose (MBP) . Estas etiquetas proteicas podem ser localizadas em posição N-terminal, C-terminal e/ou internamente em relação ao polipéptido VK0RC1. As proteínas de fusão são, por exemplo, úteis para a produção de VK0RC1 e isolamento subsequente. Além disso, as proteínas de fusão podem ser utilizadas para detectar a localização do produto de expressão na célula ou no organismo. A fim de permitir que os ácidos nucleicos de VK0RC1 sejam utilizados de acordo com a presente invenção, eles podem ser introduzidos numa célula eucariota ou procariota por meio de transfecção, transformação ou infecção, e desse modo permitir que o polipéptido seja expressado. 0 ácido nucleico de VK0RC1 pode estar presente como um plasmídeo, ou como uma parte de um vector virai ou não virai. Os 27 vectores virais particularmente adequados a este respeito são: baculovirus, virus de vaccinia, adenovirus, virus adeno-associados e virus herpes. Os vectores não virais particularmente adequados são por exemplo: virossomas, lipossomas, lipidos catiónicos e ADN conjugado com polilisina. Os vectores podem ser vectores de expressão procariotas ou eucariotas. Exemplos de vectores de expressão procariotas são os vectores pGEM ou derivados de pUC, os quais são utilizados para expressão em E. coli, e exemplos de vectores de expressão eucariotas são os vectores p426Met25 ou p426GALl (Mumberg et ai., 1994) os quais são utilizados para expressão em Saccharamyces cerevisiae, os vectores de Baculovirus, como divulgados em EP BI 0 127 839 ou EP BI 0 549 721, os quais são utilizados para expressão em células de insecto, e os vectores Rc/CMV e Rc/RSV, ou vectores de SV40, os quais são utilizados para expressão em células de mamíferos, encontrando-se todos estes vectores geralmente disponíveis. Em geral, os vectores de expressão também contêm promotores os quais são adequados para a respectiva célula, como o promotor trp promotor para expressão em E. coli (ver, por exemplo, EP-Bl-0 154 133), o promotor Met 25, GAL 1 ou ADH2 para expressão em leveduras (Russel et ai, 1983; Mumberg, ver acima), e o promotor poliedrina de baculovirus para expressão em células de insecto (ver, por exemplo, EP BI 0127 839) .
Os promotores que permitem a expressão constitutiva, regulável, específica em relação ao tecido, específica em relação ao tipo de célula, específica em relação ao ciclo celular ou específica em relação ao metabolismo em células eucariotas são adequados, por exemplo, para expressão em células de mamíferos. Os elementos reguláveis de acordo com 28 a presente invenção são promotores, sequências activadoras, intensificadoras, silenciadoras e/ou repressoras. Exemplos de elementos reguláveis preferidos que permitem a expressão constitutiva em eucariotas são promotores que são reconhecidos pela ARN-polimerase III ou promotores virais, intensificador de CMV, promotor de CMV, promotor de SV40 ou promotores de LTR, por exemplo derivados de MMTV (virus do tumor mamário de rato; Lee et al., 1981) e outras sequências promotoras e activadoras virais que são derivadas, por exemplo, de HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV ou HIV. Exemplos de elementos reguláveis que permitem a expressão indutivel em eucariotas são o operador de tetraciclinas em associação com um repressor apropriado (Gossen et al. , 1994) . A expressão de ácidos nucleicos de VK0RC1 ocorre preferencialmente sob o controlo de promotores específicos em relação ao tecido. Os vectores de expressão podem ser utilizados para preparar polipéptidos VK0RC1, sondas de ADN ou ARN, ou ARNsi ou ARNsh, os quais podem ser utilizados de acordo com a invenção. "Actividade VK0RC1 insuficiente" na acepção da invenção refere-se a um nivel de actividade e/ou expressão da proteína VK0RC1 que é inferior ao nível de actividade do controlo (como definida acima) e/ou à expressão determinada num indivíduo saudável; os respectivos níveis de actividade também podem ser determinados com base no ensaio como descrito no Exemplo 7.
Como aqui utilizada uma célula hospedeira pode ser qualquer célula adequada para expressão de polipéptidos VK0RC1 e/ou ácidos nucleicos de VK0RC1, preferencialmente uma célula HEK293-EBNA. As células podem ser células procariotas ou eucariotas, células heterólogas ou autólogas. Exemplos de 29 células procariotas são E. coli e exemplos de células eucariotas incluem células de hepatócitos primários, células de levedura, por exemplo Saccharomyces cerevisiae ou células de insecto. Mais preferencialmente, a célula hospedeira é uma linhagem de células, por exemplo uma célula COS como células COS-7 ou linhagens de células de hepatócitos como células HepG2. Além disso, a célula hospedeira é preferencialmente uma célula pluripotente embrionária não humana. Os métodos para seleccionar e cultivar células hospedeiras e para fazer com que as células hospedeiras expressem um polipéptido são geralmente conhecidos do especialista na técnica. Os processos para a transformação de células e/ou células pluripotentes são também bem conhecidos de um especialista na técnica e incluem, por exemplo, electroporação ou microinjecção. As células hospedeiras da presente invenção podem ser, por exemplo utilizadas em métodos de identificação de derivados de cumarina, na produção de polipéptidos VK0RC1 e ácidos nucleicos de VK0RC1, ARNsis e ARNshs de acordo com a invenção, e para pré-seleccionar novos fármacos tais como derivados de cumarina que afectem a actividade e/ou expressão de VK0RC1.
Os animais transgénicos, em geral, exibem uma expressão aumentada especifica em relação ao tecido dos polipéptidos VK0RC1 e/ou ácidos nucleicos de VK0RC1 e podem ser utilizados para a análise de distúrbios de coagulação e resistência à varfarina e para o desenvolvimento e avaliação de estratégias terapêuticas de tais distúrbios. Os animais transgénicos podem ser ainda utilizados na produção do polipéptido VK0RC1. 0 polipéptido produzido pelo animal pode estar, por exemplo, enriquecido num fluido corporal do animal. 30
Os métodos para a preparação de animais transgénicos, em particular de ratos transgénicos, são também conhecidos do especialista na técnica a partir de DE 196 25 049 e US 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 e US 5,750,825 e incluem animais transgénicos que podem ser produzidos, por exemplo, por meio de injecção directa de vectores de expressão de acordo com a presente invenção em embriões ou espermatócitos ou por injecção dos vectores de expressão no pronúcleo do óvulo fertilizado ou por meio de transfecção de vectores de expressão em células pluripotentes embrionárias ou por transferência nuclear em células receptoras apropriadas (Polites & Pinkert, 1994; Doetschman, em Pinkert, 1994, supra; Wood em Pinkert, 1994, supra; Monastersky em Pinkert, 1994, supra).
Dentro do significado do termo "deficiência associada a VK0RC1" pretende-se incluir um distúrbio ou doença que está associado a resistência à varfarina, isto é o doente apresenta uma susceptibilidade reduzida ou nula ao tratamento com cumarina ou seus derivados, preferencialmente a resistência à varfarina resulta de uma anormalidade de sequência do polipéptido VKORC1. Além do mais, o termo também abrange preferencialmente distúrbios ou doenças associadas a um nível de actividade e/ou expressão de VKORC1 que difere significativamente da condição em doentes saudáveis, preferencialmente a expressão do polipéptido VKORC1 e/ou a sua actividade está significativamente reduzida ou é numa, o que pode ser determinado, por exemplo, medindo o tempo de protrombina, por exemplo pelo protocolo internacional de ração normalizada (INR). Esta deficiência associada a VKORC1 pode ser provocada por uma anormalidade de sequência no 31 polipéptido VK0RC1 ou ácido nucleico de VK0RC1 como descrito em pormenor. Além disso, quando o nível de expressão e/ou actividade do polipéptido VK0RC1 ou ácido nucleico de VK0RC1 é reduzido ou até completamente anulado, também pode ser insuficiente a carboxilação gama de proteínas dependentes de vitamina K. Assim, neste contexto o termo "deficiência associada a VK0RC1" também abrange doenças e/ou distúrbios seleccionados de deficiência de factores múltiplos familiar, um distúrbio ou doença associada a coagulação sanguínea diminuída, como hemofilia e um distúrbio associado a calcificação vascular diminuída, doenças e/ou distúrbios associadas a carboxilação gama insuficiente de proteínas dependentes de vitamina K.
Também é concebível que o nível de expressão e/ou actividade do polipéptido VK0RC1 esteja aumentada em relação à condição em doentes saudáveis. Tais deficiências, as quais também estão abrangidas pelo termo "deficiência associada a VK0RC1" podem ser provocadas por uma anormalidade de sequência no polipéptido VK0RC1 e/ou no gene correspondente. Além do mais, quando o nível de expressão e/ou actividade do polipéptido VK0RC1 ou ácido nucleico de VK0RC1 está aumentado, a carboxilação gama de proteínas dependentes de vitamina K também pode estar facilitada. Assim, neste contexto o termo "deficiência associada a VK0RC1" pode ainda compreender deficiências seleccionadas de doenças ou distúrbios associados a coagulação sanguínea aumentada incluindo doentes que sofrem de um trombo e/ou doentes possuindo um maior risco de desenvolver um trombo, preferencialmente devido a uma anormalidade de sequência no polipéptido VK0RC1 ou no seu gene, doenças e/ou distúrbios associados a carboxilação gama aumentada e proteínas dependentes de vitamina K. 32
Também é possível que uma anormalidade de sequência no polipéptido VK0RC1 e/ou no gene correspondente possa aumentar a susceptibilidade ao tratamento com cumarina e seus derivados num doente possuindo tal anormalidade de sequência. Como consequência os doentes submetidos a tratamento com cumarina podem exibir valores de coagulação sanguínea muito baixos. Tais distúrbios associados a uma maior susceptibilidade ao tratamento com cumarina também estão abrangidos pelo termo "deficiência associada a VK0RC1". Os doentes portadores de um gene de VK0RC1 possuindo uma mutação de paragem sofrem de uma tal deficiência associada a uma maior sensibilidade à cumarina. 0 termo "amostra" pretende referir um biomaterial compreendendo tecido ou células fetais ou adultas, preferencialmente tecido ou células, preferencialmente isolados ou provenientes de coração, rim e pulmão, pâncreas, cérebro, placenta e músculo-esquelético e sangue, preferencialmente de fígado. A amostra pode ser isolada de um doente ou de outro indivíduo por meio de métodos incluindo métodos invasivos e não invasivos. Os métodos invasivos são geralmente conhecidos do especialista e compreendem, por exemplo, isolamento da amostra por meio de punção, remoção cirúrgica da amostra do corpo aberto ou por meio de instrumentos endoscópicos. Os métodos minimamente invasivos e não invasivos também são conhecidos do especialista na técnica e incluem, por exemplo, colheita de fluidos corporais como sangue, preferencialmente por venopunctura, ou urina ou fezes. 0 termo "amostra" também pode abranger uma biblioteca genómica ou uma biblioteca de expressão, preferencialmente construída com base numa amostra isolada de um doente, em cujo caso podem ser 33 utilizadas técnicas de isolamento de ADNc que são geralmente conhecidas do especialista.
De acordo com a presente invenção, o termo "anticorpo" ou "fragmento de anticorpo" é entendido como significando também anticorpos ou partes destes de ligação ao antigénio preparados por manipulação genética e opcionalmente modificados, tal como, por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos multifuncionais, anticorpos bi- ou oligoespecificos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos F(ab) ou F(ab)2 (ver, por exemplo, EP-Bl-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649. WO 93/06213, WO 98/24884).
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de identificação de um derivado de cumarina que exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VKORC1 como definido acima, preferencialmente um polipéptido VKORC1 compreendendo uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com as SEQ ID No. 1, 12 e 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 80% de homologia com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b), em que a sequência polipeptidica tem actividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a), (b) ou (c) possuindo actividade VKORC1, compreendendo os passos de: 34 (I) proporcionar uma célula hospedeira onde foi introduzido um ácido nucleico de VK0RC1 ou um vector contendo o ácido nucleico de VK0RC1; (II) expressar o polipéptido VK0RC1 na célula hospedeira; (III) administrar um derivado de cumarina candidato; (IV) determinar a actividade de polipéptido VK0RC1 (valor de actividade do candidato); (V) comparar o valor de actividade do candidato com um valor de actividade de controlo; e (VI) identificar o derivado de cumarina candidato como um derivado de cumarina que exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VK0RC1, desde que o valor de actividade do candidato seja significativamente diferente do valor de actividade do controlo. A actividade determinada do polipéptido VK0RC1 é a conversão dependente de ditiotreitol de epóxido de vitamina K 2.3 em vitamina K quinona e em que o valor de actividade significativamente diferente é um valor de actividade do candidato que é significativamente maior do que o valor de actividade do controlo, como descrito em mais pormenor acima e no Exemplo 7 e Figura 10. Se essencialmente a mesma concentração de derivado de cumarina candidato produz uma menor percentagem de conversão de epóxido de vitamina K em vitamina K quinona (produto/substrato+produto) que a varfarina a essa concentração, isto é indiciador de o derivado de cumarina candidato possuindo um efeito inibidor mais forte do que a varfarina, e vice-versa.
Preferencialmente no método de identificação de um derivado de cumarina de acordo com a presente invenção, o valor da actividade de controlo é determinado por um método compreendendo os passos de: 35 (A) proporcionar uma célula hospedeira de acordo com o passo (I); (B) expressar o polipéptido VK0RC1 na célula hospedeira; e (C) determinar a actividade do polipéptido VK0RC1 (valor da actividade de controlo).
Ainda mais preferencialmente no método de identificação de um derivado de cumarina de acordo com a presente invenção é introduzido pelo menos um composto adicional na célula hospedeira, composto esse que é seleccionado do grupo consistindo de vitamina K, citocromo B5, um ácido nucleico que codifica a gama-glutamil-carboxilase, a epóxido-hidrolase microssomal, a calumenina ou a glutationa-S-transferase. Os métodos para introduzir ácidos nucleicos em células hospedeiras foram descritos em pormenor acima. Preferencialmente, os ácidos nucleicos são expressados sob o controlo de um promotor constitutivamente activo ou um promotor que pode ser especificamente activado na célula hospedeira escolhida.
Os métodos de identificação de um derivado de cumarina são úteis para desenvolver novos derivados de cumarina que evitem pelo menos uma das limitações da cumarina e dos seus derivados, conhecidas na técnica. Se a análise da cinética de coagulação sanguínea estiver incluída como um ensaio separado na determinação da actividade do polipéptido VK0RC1, o método de acordo com a invenção pode ser útil na identificação de derivados de cumarina que medeiam a coagulação sanguínea de modo mais rápido do que a cumarina e seus derivados conhecidos na técnica e/ou que são metabolizados mais rapidamente pelo que pode ser evitada ou melhorada a acumulação de cumarina e seus derivados e, consequentemente, é substancialmente diminuído ou até mesmo 36 eliminado o perigo de sobredosagem. Além do mais, esse método de identificação pode ser combinado com outros ensaios para que possam ser identificados derivados de cumarina que têm um efeito mais forte (fraco) na actividade VK0RC1 e assim, por sua vez, na coagulação sanguínea e derivados de cumarina esses que demonstrem em ensaios independentes que (1) são metabolizados mais rapidamente pelo que pode ser evitada ou melhorada a acumulação de cumarina e, consequentemente, é substancialmente reduzido ou eliminado o perigo de sobredosagem, (2) não provocam ou provocam em menor grau necrose cutânea em doentes ou embriopatia se aplicados durante a gravidez e/ou (3) são metabolizados mais rapidamente ou são menos estáveis e/ou são menos afectados por outros fármacos como Fenobarbital ou amiodarona. Os ensaios que são adequados para examinar tais propriedades dos derivados de cumarina e os quais são combinados numa triagem com o método de identificação de um derivado de cumarina de acordo com a invenção são geralmente conhecidos do especialista na técnica. 0 termo "cumarina" é entendido como significando 3-(acetonilbenzil)-4-hidroxicumarina, isto é COUMADIN® ou varfarina sódica. 0 termo "derivado de cumarina" é entendido como abrangendo compostos orgânicos ou inorgânicos, péptidos, polipéptidos ou complexos destes, desde que eles exerçam um efeito na actividade e/ou expressão do polipéptido VK0RC1, preferencialmente um efeito que inibe a actividade do polipéptido VK0RC1, ainda mais preferencialmente um efeito específico para o polipéptido VK0RC1, isto é o derivado de cumarina não interage directamente com outras moléculas envolvidas na via de coagulação. Exemplos de tais compostos 37 são moléculas orgânicas que são provenientes de bibliotecas de compostos, preferencialmente aquelas que foram analisadas quanto à sua actividade farmacológica. Por causa da sua interacção, os derivados de cumarina podem influenciar a actividade do polipéptido VK0RC1 in vivo e/ou in vitro e entrar em interacções de maneira covalente ou não covalente com o mesmo. Se o derivado de cumarina é um composto quiral entender-se-á que o "derivado de cumarina" também abrange as respectivas formas enantioméricas R e L do composto como aquelas divulgadas em WO 00/43003. Em particular, o termo "derivado de cumarina" refere-se a compostos derivados de 4-hidroxicumarina, especialmente compostos derivados de COUMADIN. Mais preferencialmente, "derivado de cumarina" também inclui quaisquer coagulantes que inibam a regeneração de vitamina K activa. O termo "derivado de cumarina candidato" é entendido como abrangendo compostos orgânicos ou inorgânicos, péptidos, polipéptidos ou complexos. Exemplos de tais compostos são moléculas orgânicas que são derivadas de bibliotecas de compostos, preferencialmente aquelas que foram analisadas quanto à sua actividade farmacológica. Preferencialmente, o termo refere-se a compostos que são estruturalmente relacionados ou derivados de 4-hidroxicumarina, especialmente compostos relacionados ou derivados de COUMADIN. Se o derivado de cumarina candidato é um composto quiral entender-se-á que as respectivas formas enantioméricas R e L do composto, como aquelas divulgadas em WO 00/43003, também estão abrangidas pelo termo "derivado de cumarina candidato".
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de determinação de uma sequência de um polipéptido VKORC1 38 que confere um efeito de cumarina exercido sobre a actividade VK0RC1, compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa um polipéptido VK0RC1 compreendendo uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com as SEQ ID No. 1, 12 e 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 80% de homologia com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b), em que a sequência polipeptidica tem actividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a), (b) ou (c) possuindo actividade VKORC1, invenção, preferencialmente um polipéptido de acordo com as SEQ ID NO. 1, 12, 17, 21, polipéptido VKORC1 esse que tem pelo menos uma anormalidade de sequência, preferencialmente uma anormalidade de sequência seleccionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C; (II) administrar cumarina ou um seu derivado à célula; (III) determinar a actividade do polipéptido VKORC1 (valor de actividade da anormalidade de sequência); e (FV) comparar o valor de actividade da anormalidade de sequência com o valor de actividade da sequência de controlo, em que um desvio significativo do valor de actividade da anormalidade de sequência do valor de actividade da sequência de controlo é revelador que a anormalidade de sequência do polipéptido VKORC1 confere o efeito de cumarina exercido sobre o polipéptido VK0RC1. A actividade 39 do polipéptido VK0RC1 pode ser determinada como descrito em pormenor acima.
Mais preferencialmente, no método de determinação de uma sequência de um polipéptido VK0RC1, o valor de actividade da sequência de controlo é determinado por um método compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa um polipéptido VK0RC1, compreendendo uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com as SEQ ID No. 1, 12 e 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 80% de homologia com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b), em que a sequência polipeptidica tem actividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a), (b) ou (c) possuindo actividade VKORC1, (II) administrar cumarina ou um seu derivado à célula; (III) determinar a actividade do polipéptido VKORC1 (valor de actividade da sequência de controlo). A actividade VKORC1 determinada é a conversão dependente de ditiotreitol de epóxido de vitamina K 2.3 em vitamina K quinona e o valor significativamente diferente é um valor de actividade de anormalidade da sequência que é significativamente maior do que valor de actividade da sequência de controlo. Mais pormenores são proporcionados acima e no Exemplo 7 e Figura 10. 0 método pode ser útil na 40 identificação de polipéptidos VK0RC1 que são menos sensíveis às cumarinas. Ao introduzir polipéptidos VKORC1 com anormalidades de sequência diferentes este método permite a identificação de sítios do polipéptido que são críticos para a interacção de uma cumarina e VKORC1 testados. Esse conhecimento será, por exemplo, útil para conceber novas cumarinas. É particularmente preferido que no método de determinação de uma sequência de um polipéptido VKORC1 seja pelo menos introduzido um composto adicional na célula, composto esse que é seleccionado do grupo consistindo de vitamina K, citocromo B5, e um ácido nucleico que codifica a gama-glutamil-carboxilase, a epóxido-hidrolase microssomal, a calumenina ou a glutationa-S-transferase.
Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um polipéptido VK0RC1 em que o polipéptido VKORC1 contém pelo menos uma anormalidade de sequência, a qual exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VKORC1 e em que o polipéptido VK0RC1 é o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1 ou 12 e a anormalidade de sequência é seleccionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C.
Um tal polipéptido VKORC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência pode ser gerado por métodos geralmente conhecidos do especialista, incluindo técnicas recombinantes e, por exemplo, mutagénese específica de um locus, ou por isolamento do polipéptido VK0RC1 possuindo a pelo menos uma anormalidade de sequência a partir de uma amostra obtida de um doente, preferencialmente de um doente que sofre de deficiências associadas a VK0RC1. Os métodos 41 para isolar proteínas de uma amostra foram descritos em pormenor acima. 0 polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência, a qual exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VK0RC1 pode ser, por exemplo, utilizado para gerar anticorpos que se ligam especificamente a estes polipéptidos VK0RC1. Por sua vez, estes anticorpos podem ser utilizados para diagnosticar deficiências associadas a VK0RC1. 0 termo "anormalidade de sequência" pretende abranger adições, inserções, supressões, substituições de pelo menos um aminoácido que resultem numa alteração da sequência do polipéptido VK0RC1, preferencialmente da sequência do polipéptido VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 1. Também são abrangidas adições, inserções, supressões, substituições de pelo menos um nucleótido que conduzam a uma sequência de aminoácidos alterada codificada pela sequência de ácido nucleico de VK0RC1. Também são abrangidas alterações da sequência do ácido nucleico de VK0RC1 que conduzam a uma alteração na grelha de leitura da sequência de ácido nucleico.
As anormalidades de sequência são indicadas pelo código de uma letra de aminoácidos em que o aminoácido original está colocado à esquerda do número que indica o número do aminoácido na sequência polipeptídica de acordo com a SEQ ID No. 1. 0 número à direita do número do aminoácido indica o aminoácido que substitui o aminoácido original. Por exemplo, a anormalidade de sequência V29L indica que na posição 2 9 do polipéptido VK0RC1 de SEQ ID No. 1, o aminoácido valina (V) foi substituído por leucina (L) . No 42 caso da anormalidade de sequência ocorrer num polipéptido VK0RC1 que não o polipéptido VK0RC1 de SEQ ID No. 1, o número no código refere-se à posição na sequência de acordo com a numeração dos aminoácidos nesse outro polipéptido particular.
Noutro aspecto, a invenção proporciona um método de diagnóstico de uma resistência à varfarina ou deficiência de factores de coagulação múltiplos de tipo 2 (VKCFD2) num doente compreendendo os passos de: (I) amplificar uma amostra de ADN obtida do doente ou transcrever inversamente uma amostra de ARN obtida do doente num ADN e amplificar o ADN; e (II) analisar o ADN amplificado do passo (I) para determinar pelo menos uma anormalidade de sequência numa sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido VK0RC1 ou numa sequência de aminoácido de um polipéptido VK0RC1; em que a anormalidade de sequência determinada é reveladora de que o doente sofre de uma deficiência associada ao VK0RC1; preferencialmente resistência à Varfarina; preferencialmente a anormalidade de sequência exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VK0RC1, preferencialmente a anormalidade de sequência é seleccionada de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R, e Y139C.
Os métodos para obter amostras de um doente e para isolar o ARN total ou ARNm são geralmente conhecidos do especialista, alguns dos quais foram descritos acima. As técnicas para amplificação de ADN não estão particularmente restringidas e incluem técnicas de PCR, as quais também foram descritas acima. Do mesmo modo, as técnicas para transcrição inversa foram mencionadas acima e não estão 43 particularmente restringidas e incluem transcrição inversa utilizando protocolos convencionais e estojos comercialmente disponíveis que geralmente utilizam transcriptase inversa e iniciadores oligo dT. A análise também se pode basear em ADN genómico isolado de uma amostra obtida de um doente.
Após amplificação, o ADN é submetido a análise para determinar pelo menos uma anormalidade de sequência numa sequência de ácido nucleico que codifica o polipéptido VK0RC1. Os métodos para analisar o ADN amplificado não estão particularmente restringidos. Preferencialmente, o ADN amplificado é analisado por uma técnica seleccionada do grupo consistindo de análise com base em PCR, utilizando preferencialmente iniciadores de PCR específicos para a anormalidade de sequência, análise por digestão de restrição e análise por sequenciação de ADN. Numa forma de realização preferida, o ácido nucleico portador de uma anormalidade de sequência codifica uma sequência de VK0RC1 possuindo uma anormalidade de sequência seleccionada do grupo consistindo de V29L(85 G>T), V45A(134 T>C), R58G (172 A>G) , R98W (292 OT), e L128R (383 T>G) , Y139C (416 A>G) . Numa forma de realização preferida do método de diagnóstico, o ADN amplificado codifica pelo menos uma sequência parcial do polipéptido VK0RC1 de acordo com a SEQ ID No. 1. No exemplo 8 é proporcionada uma maneira de determinar uma anormalidade de sequência que está associada a uma deficiência associada ao VK0RC1.
As sequências de VK0RC1 de acordo com a invenção contendo as mutações 85 G>T, 134 T>C, 172 A>G, 292 OT e 383 T>G são proporcionadas nas SEQ ID Nos. 3 até 7 e podem ser utilizadas como sondas para diagnosticar uma deficiência 44 associada ao VK0RC1 utilizando análise de amostras de ácido nucleico de um doente com base na técnica de hibridização.
Como uma alternativa, a expressão de VK0RC1 pode ser detectada ao nível do polipéptido VK0RC1. Por conseguinte, noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de diagnóstico de uma resistência à varfarina ou deficiência de factores de coagulação múltiplos de tipo 2 (VKCFD2) num doente compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma amostra obtida do doente; e (II) detectar um polipéptido VK0RC1 possuindo uma anormalidade de sequência na amostra utilizando um anticorpo ou um fragmento deste, o qual reconhece e liga especificamente o polipéptido VK0RC1 da reivindicação 10 em que a anormalidade de sequência determinada é reveladora de que o doente sofre de uma deficiência associada ao VK0RC1. Preferencialmente a anormalidade de sequência é seleccionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C.
Os métodos de obtenção de amostras já foram descritos em pormenor. Os métodos para detecção do polipéptido VKORC1 possuindo uma anormalidade de sequência não estão particularmente restringidos, desde que o método permita a detecção específica da proteína portadora da(s) anormalidade(s) de sequência. Exemplos de tais métodos incluem preferencialmente detecção imuno-histoquímica, imunotransferência, preferencialmente transferência de Western e ELISA do polipéptido, de modo particularmente preferido com anticorpos específicos para o polipéptido VK0RC1 possuindo uma anormalidade de sequência como definido acima. A análise de anormalidades de sequência ao nível da sequência de aminoácidos não está particularmente 45 restringida e pode ser, por exemplo, realizada utilizando anticorpos contra VK0RC1 os quais reconhecem e ligam especificamente um polipéptido VK0RC1 possuindo uma ou mais anormalidades de sequência.
Preferencialmente, os métodos de diagnóstico são utilizados para diagnosticar doenças e/ou distúrbios seleccionados de resistência à varfarina, deficiência de factores múltiplos familiar, um distúrbio ou doença associada a coagulação sanguínea reduzida ou nula, como hemofilia e um distúrbio associado a uma calcificação vascular diminuída, doenças e/ou distúrbios associados a carboxilação gama insuficiente de proteínas dependentes de vitamina K.
Além disso, os métodos de diagnóstico também podem ser utilizados para diagnosticar distúrbios e doenças associados a coagulação sanguínea aumentada incluindo doentes e/ou doentes possuindo um maior risco de desenvolver um trombo devido a uma anormalidade de sequência no polipéptido VK0RC1 ou no seu gene, doenças e/ou distúrbios associada a uma maior carboxilação gama de proteínas dependentes de vitamina K.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de identificação de um derivado de cumarina o qual exerce um efeito inibidor sobre a actividade de um polipéptido VK0RC1 possuindo pelo menos uma anormalidade de sequência, compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa um polipéptido VK0RC1, em que o polipéptido VK0RC1 contém pelo menos uma anormalidade de sequência, a qual exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VK0RC1, e em que o polipéptido VK0RC1 é o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1 ou 12 e 46 a anormalidade de sequência é seleccionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C, preferencialmente um polipéptido codificado por uma sequência seleccionada do grupo consistindo de 3, 4, 5, 6, 7, 14 e 94; (II) administrar um derivado de cumarina candidato à célula; (III) determinar a actividade do polipéptido VK0RC1 (valor de actividade da anormalidade de sequência); e (IV) comparar o valor de actividade da anormalidade de sequência com o valor de actividade da sequência de controlo, (V) identificar o derivado de cumarina candidato como o derivado de cumarina que exerce um efeito inibidor sobre a actividade de um polipéptido VK0RC1, se a administração do derivado de cumarina candidato resulta numa anormalidade de sequência, cujo valor de actividade é significativamente menor do que valor de actividade da sequência de controlo.
Mais preferencialmente, o valor de actividade da sequência de controlo é determinado por um método compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa o polipéptido VK0RC1 da reivindicação 1, preferencialmente um polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1 ou 12; (II) administrar cumarina à célula; (III) determinar a actividade do polipéptido VK0RC1 (valor de actividade da sequência de controlo). A actividade do polipéptido VK0RC1 pode ser determinada como descrito em pormenor acima. E o método pode ser adaptado do método descrito no Exemplo 7. Um tal método de identificação de um derivado de cumarina é útil para 47 identificar derivados de cumarina que podem ser utilizados como anticoagulantes em doentes com resistência à varfarina.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método de identificação de um derivado de cumarina que é toxicologicamente eficaz em roedores resistentes à varfarina compreendendo os passos de: (I) proporcionar um roedor resistente à varfarina; (II) administrar um derivado de cumarina candidato ao roedor; (III) determinar a toxicidade do derivado de cumarina candidato sobre o roedor (valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato); (IV) comparar o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato com um valor de toxicidade de cumarina de controlo; e (V) identificar o derivado de cumarina candidato como um derivado de cumarina toxicologicamente eficaz, desde que o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato seja significativamente maior do que o valor de toxicidade da cumarina de controlo, em que o roedor resistente à varfarina é um roedor transgénico para um polipéptido VK0RC1 compreendendo uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com SEQ ID No. 1, 12 e 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 80% de homologia com a sequência polipeptidica definida em (a) ou 48 (b), em que a sequência polipeptídica tem actividade VK0RC1; e (d) uma sequência polipeptídica de um fragmento da sequência polipeptídica definida em (a), (b) ou (c) possuindo actividade VK0RC1, em que o polipéptido VK0RC1 contém pelo menos uma anormalidade de sequência, a qual origina resistência à varfarina, preferencialmente um polipéptido codificado pela sequência de acordo com a SEQ ID No. 14 ou uma ratazana resistente à varfarina comercialmente disponível ou uma ratazana selvagem possuindo resistência à varfarina. Mais preferencialmente, o polipéptido VK0RC1 é o polipéptido de acordo com SEQ ID No. 12 e a anormalidade de sequência é seleccionada do grupo consistindo de V29L (85 G>T) , V45A(134 T>C) , R58G (172 A>G) , R98W (292 C>T) e L128R (383 T>G) e Y139C (416 A>G). A amostra pode ser qualquer órgão, tecido, fluido corporal ou sonda desde que possua ADN genómico ou ARNm da ratazana a ser testada. Preferencialmente, a amostra é sangue, tecido da cauda ou orelha, urina ou fezes. Outros pormenores do método são proporcionados no Exemplo 9.
Roedores resistentes à varfarina foram descritos (Kohn & Pelz, 1999) e podem ser obtidos de fornecedores comerciais (por exemplo Centro de Investigação Biológico Federal para a Agricultura e Silvicultura, Instituto de Nematologia e Investigação de Vertebrados, Toppheideweg 88, 48161 Munster, Alemanha). Numa forma de realização preferida, o roedor resistente à varfarina é um roedor transgénico para o polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência, anormalidade de sequência essa que provoca resistência à varfarina. De um modo mais preferido, o 49 polipéptido VK0RC1 contendo pelo menos uma anormalidade de sequência é o polipéptido codificado pela sequência de ácido nucleico de acordo com as SEQ ID Nos. 3 até 7 e 15, e a anormalidade de sequência é seleccionada do grupo consistindo de V29L (85 G>T) , V45A(134 T>C) , R58G (172 A>G), R98W (292 C>T) , e L128R (383 T>G) , Y139C (416 A>G) . Os métodos para gerar roedores, em particular ratos transgénicos para os polipéptidos VK0RC1 especificados foram descritos acima.
De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se à utilização de iniciadores de PCR de acordo com as SEQ ID No. 8 8 até 91 para determinar se uma ratazana tem um genótipo de resistência à varfarina numa amostra obtida da ratazana. A administração de cumarina e seus derivados não está particularmente restringida. Tipicamente, composições toxicologicamente eficazes contendo cumarina (varfarina) são formuladas com composições de isco granular contendo de cerca de 50-300 ppm, preferencialmente cerca de 250 ppm, de cumarina e seus derivados. O isco é tipicamente formulado com 0,5% até 2,5% de concentrado de varfarina num aglutinante adequado tal como óleo de milho. Se for utilizado óleo de milho como um aglutinante, ele pode estar presente numa quantidade de cerca de 0,5% até cerca de 2% da composição total. O aglutinante e a varfarina são então misturados, por exemplo, com um produto à base de produtos cereais, farinha de milho, aveia enrolada, rações animais mistas e produtos semelhantes conhecidos na técnica. A administração, isto é a quantidade, formulação e frequência e duração de administração podem seguir protocolos correntes para avaliar a toxicidade varfarina em roedores, 50 mais preferencialmente seguem protocolos correntes para avaliar o valor de dose letal 50 (LD50) para um dado veneno a ser testado, os quais são todos geralmente conhecidos do especialista e descritos no exemplo 9.
Para que o derivado de cumarina seja toxicologicamente eficaz é desejável que sejam necessárias ingestões múltiplas para matar o roedor para que eles não desenvolvam receio ao isco. Por conseguinte, prefere-se repetir a administração das composições do derivado de cumarina candidato várias vezes. Duma maneira geral, os roedores começam a morrer após quatro ou cinco doses diárias das composições. Além disso, pode preferir-se suprimir a dor nas ratazanas para melhorar o sofrimento durante as experiências através da administração de agentes supressores da dor geralmente conhecidos do especialista. A inclusão de supressores de dor na composição de cumarina e derivado de cumarina pode ser ainda vantajosa para suprimir ainda mais a possibilidade dos roedores desenvolverem receio ao isco.
Após administração determina-se a toxicidade do derivado de cumarina candidato no roedor, o que produz o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato. Os métodos para determinar a toxicidade dos derivados de cumarina candidatos são geralmente conhecidos do especialista e incluem a análise de LD50, análise da coagulação sanguínea para determinar o tempo de protrombina, por exemplo pelo protocolo de ração normalizada internacional (INR). O valor determinado para toxicidade do derivado de cumarina candidato é então comparado com um valor de toxicidade da cumarina de controlo apropriado determinado com base em submeter um espécimen diferente do roedor resistente à 51 varfarina ao mesmo tratamento mas trocando a administração dos derivados de cumarina pela administração de composições correntes de cumarina para roedores às quais os roedores são resistentes, geralmente utilizadas para controlo de pragas. No controlo são utilizadas as mesmas condições experimentais descritas acima para a administração do derivado de cumarina candidato. Se o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato for igual ou, de um modo preferido, significativamente maior em termos estatísticos do que o valor de toxicidade da cumarina de controlo, o derivado de cumarina candidato representa um derivado de cumarina toxicologicamente eficaz. A invenção será agora adicionalmente ilustrada a seguir com o auxílio das figuras e exemplos, que representam formas de realização e caracteristicas preferidas da invenção.
Exemplos
Exemplo 1: Caracterização da região genómica candidata 0 locus da deficiência combinada de factores de coagulação dependentes de vitamina K de tipo 2 (VKCFD2) foi mapeado na região pericentromérica do cromossoma 16 entre os marcadores D16S3131 e D16S419 [Fregin et al., 2002], Esta região compreende aproximadamente 20 Mb. Os genes responsáveis pela resistência à varfarina em ratazanas (Rw) e ratos (War) foram mapeados no cromossoma 1 [Kohn et al., 1999] e cromossoma 7 [Wallace, 1976][Greavses & Ayres, 1967] em estreita ligação com o gene da cadeia leve 2 de miosina (Mil2) . O ortólogo humano de Mil2, HUMMLC2B, está localizado no cromossoma 16pll na região candidata de VKCFD2 e faz parte de um grupo de ligação conservado de genes. Com base nesta sintenia e em considerações 52 bioquímicas é admitida a hipótese de que a VKCFD2 e a resistência à varfarina possam ser devidas a mutações alélicas no mesmo gene. Se assim for, isto tornaria mais estreito o intervalo crítico nos humanos a uma região de aproximadamente 4,5 Mb entre o gene do receptor de interleucina 4 (IL4R) e o gene da cadeia alfa M de integrina (ITGAM) no braço curto do cromossoma 16 (Fig. 1) .
De acordo com a montagem do genoma, esta região contém 141 genes Ensembl com aproximadamente 1000 exões. Destes genes, 117 foram assinalados como conhecidos. Muitos destes genes podiam ser excluídos de mais análise porque a sua função estava bem definida e, obviamente, não relacionada com os passos metabólicos do ciclo de vitamina K. Por outro lado, são incluídos os genes a montante e a jusante desta região que foram vistos como candidatos funcionais na pré-selecção de mutação.
Exemplo 2: Pré-selecção de mutação
Utilizando ADN genómico de dois indivíduos VKCFD2 e três indivíduos WR, iniciou-se uma pré-selecção sistemática de mutações por sequenciação comparativa dos genes candidatos remanescentes. Os dados clínicos das famílias VKCFD2 foram anteriormente descritos [Oldenburg et al., 2000]. Os doentes resistentes à varfarina foram comprovados devido à sua resposta anormal à administração oral de varfarina durante tratamento ou prevenção de trombose. Os doentes C e E são casos esporádicos. O doente D tem dois irmãos que também sofrem de resistência à varfarina. Os doentes C e D requerem aproximadamente 150 - 250 mg de varfarina por semana para se alcançar uma gama terapêutica de anticoagulação oral enquanto o doente E não mostrou 53 qualquer resposta. Todos os doentes deram consentimento informado antes de participar.
Surpreendentemente, foram encontradas mutações antimensageiras num gene de função desconhecida em todos os indivíduos VKCFD2 e WR investigados (Fig. 2) . Este gene (IMAGE3455200) atravessa uma região genómica de 5126 pb e compreende três exões que codificam uma proteína de 163 aminoácidos. Foi chamada proteína 1 de reciclagem de epóxido de vitamina K (VK0RC1). Constatou-se que ambos os doentes VKCFD2 sem parentesco e os seus irmãos afectados eram portadores do mesmo ponto de mutação homozigótico no terceiro exão (292C>T) ao mesmo tempo que se constatou que os pais eram heterozigóticos. A mutação é provocada pela substituição de arginina por triptofano no resíduo de aminoácido 98 (R98W). As famílias são de origem Alemã e Libanesa. Os haplotipos na região de homozigosidade em torno do gene mutado foram diferentes em ambas as famílias indicando eventos de mutação independentes. Nos doentes WR foram observadas três mutações heterozigóticas diferentes que levaram a uma substituição de valina por leucina (doente C: V29L), uma substituição de arginina por glicina (doente D: R58G) e uma troca de leucina para arginina (doente E: L128R). A mutação R58G é partilhada pelos dois irmãos afectados do doente de índice D. As mutações antimensageiras não estavam presentes em 384 cromossomas de controlo. A sequenciação dos cromossomas de controlo revelou dois polimorfismos de um único nucleótido não sinónimos (C43C; L120L).
As sequências e anotações do genoma foram obtidas de NCBI, UCSC e Ensembl. Os iniciadores para a pré-selecção de mutações foram concebidos utilizando o software Primer3 54 integrado num escrito, ExonPrimer, para permitir a concepção automática do iniciador. Para a pré-selecção de mutações, os exões com iniciadores intrónicos foram amplificados e os fragmentos amplificados foram analisados por sequenciação directa com o estojo de sequenciação BigDye Terminator Cycle (ABI)). As sequências iniciadoras estavam disponíveis a pedido. As previsões da topologia foram realizadas utilizando TMPRED e TMHM.
Exemplo 3: Homologia e estrutura da proteína
Estava presente um ortólogo do gene de VK0RC1 no rato (NM_178600) e os ortólogos na ratazana e no Fugu rubripes foram estabelecidos por pesquisa de homologia e RT-PCR (Fig. 3) . As proteínas correspondentes partilham 79% a 84% de identidade com a proteína humana. As pesquisas de bases de dados não mostraram qualquer homologia com um gene conhecido nem com qualquer domínio de proteína caracterizado. Os programas de previsão de topologia anteciparam três domínios transmembranares (TM) . 0 primeiro TM é localizado entre os resíduos 10 até 29 por todos os programas testados. As previsões são discordantes quanto ao segundo e terceiro TM, os quais são localizados entre os aminoácidos 100 e 150. O servidor PSORT II previu um sinal de retenção de membrana ER (KKXX ou KXKXX) na posição 159-163 de VKORC1 em humanos com uma probabilidade de 67 % [Jackson et al., 1990]. A sequência consenso também estava presente nas outras proteínas VK0RC1. Isto está em concordância com a localização provável do complexo VKORC1 no sistema membranar ER [Cain et al., 1997].
Pesquisas Tblastn com VKORC1 detectaram um homólogo humano (BC027734) e um gene de rato (AK009497) que apresentam 50% de identidade de proteína um com o outro. Ambos os ARNm 55 foram erradamente previstos como codificando proteínas que não mostram qualquer homologia com VK0RC1. A proteína humana prevista começa na terceira metionina. A sequência de ARNm de rato está incompleta com uma proteína prevista numa grelha de leitura diferente. 0 ADNc completo foi estabelecido no rato bem como em Fugu rubripes e parcialmente na ratazana. Estas proteínas foram designadas proteína 1 tipo VK0RC1 (VK0RC1L1). As proteínas VK0RC1L1 humana, de rato e ratazana partilham, aproximadamente 84% de identidade umas com as outras e aproximadamente 50% de identidade com as proteínas VKORC1 correspondentes. Foi ainda detectada uma proteína homóloga em Xenopus laevis (AAH43742) e - com menor homologia (1 e-14) - em Anopheles gambiae (EAA06271). Três análises sugeriram que ambas as proteínas eram ortólogos do gene de VKORC1.
Exemplo 4: Análise da expressão O VKORC1 parece ser expressado de modo disseminado. A entrada Unigene correspondente contém mais do que 100 ESTs em vários tecidos. A expressão de VKORC1 em tecidos humanos de feto e adulto foi examinada por análise de transferência de Northern. Para este fim, as transferências de Northern de múltiplos tecidos humanos (Transferência Fetal 1, Stratagene; Pista 12 humana, BD Clontech) continham 2 pg de poli(A)+-RNA. O ADNc completo de VKORC1 foi marcado radioactivamente utilizando o sistema de marcação de ADN de iniciadores aleatórios (Invitrogen life technologies) e hibridizado utilizando uma Solução de Hibridização de Alto Desempenho miracleHyb (Stratagene). Foi utilizada uma sonda de β-actina fornecida com a transferência de Northern de múltiplos tecidos para controlo da hibridização. 56
Os níveis de expressão mais elevados de VK0RC1 podem ser observados no fígado fetal e adulto (Fig. 4) . Também foram observados níveis de expressão altos no coração, rim e pulmão fetal, bem como no coração e pâncreas adulto. 0 cérebro fetal, placenta e músculo-esquelético adultos mostraram níveis de expressão intermédios. Foram detectados níveis de expressão menores no cérebro, pulmão e rim adulto.
Exemplo 5: Clonagem de VK0RC1 e construção de vectores de expressão A amplificação da sequência de codificação completa de VK0RC1 foi efectuada a partir de ADNc de fígado e rim humano (ADNc de Marathon-Ready, BD Biosciences Clontech) com os seguintes iniciadores incluindo sítios de clivagem para HindIII e EcoRI:
VK0RC1-HindiII-F: ATTAAGCTTCACCATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCT (SEQ ID No. 53) VKORCl-EcoRI-R: ATTGAATTCCGTGCCTCTTAGCCTTGCCCTG (SEQ ID No. 54) . 0 produto foi clonado no vector pBluescript II (Stratagene) que foi clivado com as enzimas de restrição correspondentes e verificado por sequenciação directa. Para as experiências de imunocitoquímica, a inserção foi reclonada nos vectores de expressão de mamífero pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech) e pADNc3.1/myc-His (Invitrogen).
Para os estudos de expressão, o ADNc de VK0RC1 foi clonado no vector pADNc3 (Invitrogen) após amplificação com os iniciadores VK0RCl-pADNc3-F: GGGCGGAAGCTTGAGATAATGGGCA (SEQ ID No. 92) e VK0RCl-pADNc3-R: GCTTGAATTCAGGGCTCAGTGC (SEQ ID No. 93). A mutagénese foi realizada utilizando o estojo de mutagénese QuikChange (Stratagene). Os ADNc de tipo 57 selvagem e mutados foram reclonados para expressão em pCEP4 (Invitrogen) utilizando os sítios fíindIII e Xhol. Todas as construções foram verificadas por sequenciação.
Exemplo 6: Cultura de células, transfecção transitória e imunocitoquímica e localização subcelular A partir das experiências de fraccionamento bioquímico, sabe-se que a actividade VK0RC1 purifica com a fracção de membrana microssomal [Cain et al., 1997], Além disso, a gama-glutamil-carboxilase foi localizada na membrana do retículo endoplasmático por imunocitoquímica [Presnell, 2002 #31]. Para estudar a localização subcelular de VKORC1, foram geradas construções de proteína de fusão marcada com epítopo GFP e myc de VK0RC1 humana para experiências de transfecção transitória de células COS-7. Foram utilizados anticorpos primários contra as etiquetas de epítopo e anticorpos secundários marcados com fluorocromos para visualizar as proteínas de fusão. Um anticorpo contra a proteína específica para ER, calnexina, serviu como um controlo. Para este fim células COS-7 (DSMZ, Braunschweig) foram mantidas em meio de Eagle modificado por in Dulbecco com 10% de soro fetal de vitelo. As células foram aplicadas em lamelas de vidro em placas de seis poços e após 18-24 h em cultura foram transfectadas com as construções do vector de expressão utilizando Effectene (QIAGEN) de acordo com as especificações do fabricante. Após 48-60 h de cultura adicional, as células foram lavadas com PBS e fixadas em 70% de acetona / 30% de metanol a -20 °C durante 15 min. Após fixação, as células foram permeabilizadas em PBS, 0,1% de Nonidet P-40 (SIGMA N-6507) e em seguida bloqueadas com PBS, 2% de BSA e 0,1% de NP-40 a 37°C. Anticorpos primários, Living Colors A.v. (JI-8) (BD Biosciences Clontech), anticorpo anti-myc (Invitrogen) e anti-calnexina 58 (SIGMA) foram diluídos (1:100) na solução de bloqueio e incubados durante 45 min a 37 °C. As lamelas foram lavadas em PBS, 0,1% de NP-40 durante 30 min. Foram utilizados os mesmos procedimentos de incubação e lavagem para os anticorpos secundários, isto é anti-IgG de rato-FITC (SIGMA) e fragmento-Cy3 de F(ab')2 de anti-IgG de coelho (SIGMA). As lamelas foram submetidas a revelação de contraste com DAPI (1:500) durante 1 min, lavadas com água desionizada, montadas em lâminas utilizando Vectashield (Vector) e visualizadas utilizando um microscópio de fluorescência Leica. A imunofluorescência verde das proteínas de fusão VKORC1 decoraram as estruturas tipo malha de ER no citoplasma e co-localizaram-se perfeitamente com a etiqueta do marcador de ER calnexina (vermelho) (Fig. 5).
Exemplo 7: Um ensaio para determinar a actividade enzimática de VKORC1 Células HEK293-EBNA (Invitrogen) foram multiplicadas em MEM com 10% de FCS. Em cada experiência foram aplicadas 6xl05 células em placas Petri de 94 mm. Após 30 h a 37°C e 5% de CO2 foi efectuada a transfecção (20 pg de construção de ADN por placa) utilizando o método de fosfato cálcio. Após 40 h a 35 °C, as células transf ectadas a 3% de C02 (multiplicadas quase até à confluência) foram lavadas em PBS, colhidas e submetidas a lise em 450 pL de imidazole 0,25 mM, (pH = 7,6), 0,5% de CHAPS. A eficiência de transfecção foi verificada por sequenciação dos produtos de RT-PCR de uma alíquota de células. A actividade enzimática de VKOR foi medida com 30 pL dos extractos de células completas as quais foram 59 ressuspendidas em 500 pL de tampão A (imidazole 0,25 mM, (pH = 7,6), 0,5% de CHAPS) . Em seguida foram adicionados 20pL de DTT 125mM com um minuto de incubação. Em seguida foram adicionados 5pL de CaCl2 400 mM e Varfarina em 10 pL de DMSO (concentração final 0-80pM). A reacção foi iniciada pela adição de 2 pL de epóxido de vitamina K2.3 (concentração final 5pM) e incubada a 30 °C durante uma hora. A reacção foi parada pela extracção do substrato (epóxido de vitamina K2.3) e dos produtos da reacção (Vitamina K-quinona e hidroquinona) utilizando 1 mL de 2-Propanol/Hexano (3:2, v/v); o sobrenadante orgânico foi recolhido, seco e resolvido em 50 pL de metanol e analisado com um HPLC a 254 nm. A vitamina K quinona foi separada do epóxido por HPLC numa coluna C-18 de fase inversa. Durante o procedimento de extracção a vitamina K hidroquinona foi quantitativamente oxidada à forma de quinona. O resultado do HPLC foi analisado automaticamente calculado a área sob a linha de extinção de cada pico. A percentagem de conversão do substrato foi estimada fixando a área do pico do substrato residual (epóxido) e do pico do produto (quinona) como 100 por cento. As medições foram efectuadas em duplicado e a actividade é dada como percentagem de substrato convertido em quinona. O epóxido de vitamina K 2.3 foi preparado por oxidação de vitamina K quinona (Sigma-Aldrich) com H2O2. A varfarina (Sigma-Aldrich) foi adicionada em DMSO (< 1% v/v).
A dose-resposta à inibição da varfarina foi medida a uma concentração final de 5 até 80 pM (Walin & Martin 1985) . As células não transfectadas e transfectadas de modo simulado mostraram uma actividade basal baixa que era sensível à varfarina. A sobreexpressão de VKORC1 selvagem resultou numa estimulação impressionante da actividade VKOR. A 60 produção de vitamina K quinona foi 14 a 21 vezes maior relativamente às células não tratadas e transfectadas de modo simulado. A actividade foi inibida pela varfarina de um modo dependente da dose (Figura 10). Nós também determinamos a actividade VKOR após transfecção com construções de VKORC1 mutadas (Figura 10) . A expressão recombinante da mutação R98W observada nas duas famílias VKCFD2 apenas aumentou ligeiramente a actividade VKOR em células HEK293. Episódios de sangramento espontâneo e níveis elevados de epóxido de vitamina K no soro destes doentes sugerem que a eficiência de reciclagem de vitamina K também é drasticamente diminuída in vivo (Oldenburg et al. 2000) . As cinco mutações WR mostraram uma actividade VKOR reduzida que variava de 5% na variante L128R até 96% na mutação V29L. As mutações V45A, R58G e Y139C apresentaram cerca de 23%, 21 % e 48% de actividade, respectivamente (Quadro 1). Foi observada uma menor actividade VKOR associada a uma maior necessidade de vitamina K e morte por sangramento espontâneo em ratazanas Rw heterozigóticas e homozigóticas (Martin et al. 1979, Thijssen & Pelz 2001, Fasco et al. 1983b). Analogamente, no nosso sistema de expressão que imita as condições homozigóticas de mutações WR conduziu a uma eficiência funcional mais baixa do complexo de VKOR. Enquanto ao nível fenotípico todas as variantes WR exibiram pelo menos resistência parcial para o efeito de anticoagulação da varfarina, ambas as proteínas selvagem e mutante foram sensíveis à varfarina in vitro. A concentrações superiores a 20 μΜ, as mutações V29L e Y139C mantiveram actividades VKOR maiores do que o tipo selvagem enquanto nas mutações V45A, R58G, L128R, a actividade VKOR caiu abaixo do limite de detecção (Figura 10). 61
Exemplo 8: Um método de diagnóstico de uma anormalidade da sequência de VK0RC1 ADN genómico do espécimen (doente humano ou mamífero) é isolado de acordo com procedimentos correntes geralmente conhecidos do especialista. 0 ADN genómico do Exão (1-3) de VK0RC1 desejado é amplificado por PCR utilizando iniciadores específicos os quais também podem ser concebidos pelo especialista. 0 produto de PCR é então purificado utilizando por exemplo SAP/Exo (fosfatase alcalina e exonuclease de camarão) sob condições correntes. 0 ADN purificado é então submetido a procedimentos de sequenciação correntes como: adição de 0,3 pL de iniciador o qual é 10 pmol/pL (iniciador directo ou inverso) a 1 pL do produto de PCR purificado; seguido da adição de 8 pL de DTCS-Mix (Beckman-Coulter) e 10,7 pL de água; seguido de sequenciação cíclica a
Primeiro atraso 96°C 60 s Desnaturação 95 °C 30 s Emparelhamento Especifico para o iniciador (55-60 °C) 30 s Alongamento σ> o o O 4 min
Após a sequenciação cíclica seguiu-se a purificação por precipitação: • adicionar 2 pL de EDTA lOOmM, 2 pL de NaOAc 5M (pH 4,8), 1 pL de Glicogénio, vortex • adicionar 60 pL de etanol a 95 %, vortex • centrifugar a 13000 g (10 min) • remover o sobrenadante • lavar os sedimentos com 180 pL de Etanol a 70 % • secar os sedimentos • resolver os sedimentos em 35 pL de Solução de Carga de Amostra (SLS) 62
Em seguida as sondas são pipetadas numa placa microtitulo e cobertas com uma gota de óleo de parafina. Depois segue-se a separação no sequenciador a 4,2 V durante 60-120 min. Os dados em bruto são analisados e as sequências são alinhadas com as sequências de controlo utilizando o software CEQ 2000 XL (Versão 4.3.9, Beckman Coulter). As diferenças entre as sequências de controlo (preferencialmente a sequência do ácido nucleico genómico de VKORC1 ou a sua sequência de codificação de acordo com SEQ ID NO. 2) e o ADN sequenciado são reveladores da sequência das sondas para representar um ácido nucleico de VKORC1 contendo uma anormalidade de sequência.
Exemplo 9: Ensaio à base de PCR para determinar resistência à varfarina em ratazanas
Para determinar se uma ratazana (Rattus norvegicus) é resistente à varfarina, isto é se a sequência de codificação de VKORC1 de acordo com a SEQ ID No. 13 é portadora de uma mutação Y139C (416A>G) utilizou-se o seguinte ensaio com base em ARMS-PCR utilizando fezes de ratazana como uma fonte de ADN genómico de ratazana. É um princípio do ensaio incluir na reacção de PCR (1) um iniciador de PCR (rVKORCl-F interior) que hibridiza especificamente com a sequência de ADN que contém o alelo mutado resistente à varfarina 416G e (2) outro iniciador de PCR (rVKORCl-R interior) que hibridiza especificamente com a sequência de ADN de tipo selvagem que contém o alelo de tipo selvagem 416A. Além do mais, estes dois iniciadores estão orientados em direcções opostas pelo que eles emparelham com um dos dois iniciadores de PCR adicionais incluídos na reacção. Os últimos iniciadores estão localizados a distâncias diferentes e em direcções opostas 63 em relação ao sítio 416 e em consequência, dependendo de se o sítio 416 está mutado ou não, o iniciador rVKORCl-R interior ou o iniciador rVKORCl-F interior emparelhará e a reacção de PCR resultará em ADN amplificado de um tamanho diferente o que é revelador do genótipo da ratazana cujo ADN foi analisado. Nas ratazanas de tipo selvagem, a reacção de PCR resultará numa banda de 123 pb, enquanto em ratazanas homozigóticas para a mutação 416G, a reacção de PCR produzirá uma banda a 101 pb. Finalmente, em ratazanas com um genótipo heterozigótico, a reacção de PCR dará origem a duas bandas, uma banda a 101 e outra a 123 pb. 0 ADN genómico foi isolado das fezes utilizando procedimentos correntes de isolamento de ADN geralmente conhecidos do especialista. As seguintes componentes foram combinadas numa reacção de PCR: 1 pL de ADN (ratazana) , 1 pL de Betaína 5M (Sigma), 2 pmol de Iniciador-F-exterior (1 pL de uma diluição a 1:50), 2 pmol de Iniciador-R-exterior (1 pL de uma diluição a 1:50), 10 pmol de Iniciador-F-interior (1 pL de uma diluição a 1:10), 10 pmol de Iniciador-R-interior (1 pL de uma diluição a 1:10), 0,25 pL de Taq/Pfu-Polimerase (1,25U de Taq (Invitrogen) e 0,25U de Pfu (Stratagene) ) , adicionar 25 pL de tampão de PCR- (1 mL de tampão de PCR contém: 100 pL de tampão de PCR lOx (Invitrogen), 160 pL de solução de nucleótidos (dNTPs 1,25 mM) , 30 pL de MgCl2, 610 pL de água destilada) . As condições de PCR foram: 95°C durante 3 min, seguida de 32 ciclos de: 95°C durante 20 s, 62°C durante 20 s e 70°C durante 10 s. Finalmente, a reacção é incubada a 70 °C durante 3 min. Os produtos de PCR foram separados por electroforese de gel num Gel de 3,5 % de TAE-Agarose com brometo de etídio (10 pL de uma solução a 1% para cada 64 100 mL). A electroforese de gel foi deixada correr durante 30 min a 130 V.
Utilizou-se os seguintes iniciadores: rVKORCl-F exterior: ATC CTG AGT TCC CTG GTG TCT GTC GCT G (SEQ ID No. 88) rVKORCl -R exterior: TCA GGG CTT TTT GAC CTT GTG TTC TGG C (SEQ ID No. 89) iniciador de PCR específico para o alelo mutante 416G "rVKORCl-F interior": TGA TTT CTG CAT TGT TTG CAT CAC CAC ATG (SEQ ID No. 90) iniciador de PCR específico para o alelo de tipo selvagem 416A "rVKORCl-R interior": CAA CAT CAG GCC CGC ATT GAT GGA AT (SEQ ID No. 91)
No ensaio foram utilizadas ratazanas (Rattus norvegicus) com e sem resistência à varfarina. Os resultados de PCR são mostrados na Figura 13. As ratazanas de tipo selvagem exibiram uma banda a 123 pb, as ratazanas homozigóticas para a mutação exibiram uma banda a 101 pb e finalmente, as ratazanas com a mutação heterozigótica mostraram duas bandas, uma banda a 101 e outra a 123 pb.
Consequentemente, estes dados demonstram, que este ensaio pode ser utilizado para determinar se uma dada ratazana é resistente à varfarina ou não. Tais ensaios são extremamente versáteis para controlar pragas numa dada região, uma vez que o conhecimento da frequência de ratazanas resistentes à varfarina é crítica para decidir qual o pesticida que pode ser utilizado eficazmente. Se numa dada região existe uma prevalência elevada de ratazanas resistente à varfarina, a varfarina e seus análogos são um meio inadequado para matar as ratazanas. 65
Se, contudo, a frequência determinada de resistentes à varfarina é baixa, a varfarina eficazmente utilizada para combater os roedores. 65 ratazanas pode ser 66
Lista de Referências Numéricas
Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402
Bandyopadhyay, P. K., Garrett, J. E., Shetty, R. P., Keate, T., Walker, C. S., e Olivera, B. M. (2002) . gamma -Glutamyl carboxylation: An extracellular posttranslational modification that antedates the divergence of molluscs, arthropods, and chordates, Proc Natl Acad Sei USA 99, 1264-1269.
Boneh, A., e Bar-Ziv, J. (1996). Hereditary deficiency of vitamin K-dependent coagulation factors with skeletal abnormalities, Am J Med Genet 65, 241-243.
Brenner, B., Sanchez-Vega, B., Wu, S. M., Lanir, N., Stafford, D. W., e Solera, J. (1998). A missense mutation in gamma-glutamyl carboxylase gene causes combined deficiency of all vitamin K-dependent blood coagulation factors, Blood 92, 4554-4559.
Cain, D., Hutson, S. M., e Wallin, R. (1997). Assembly of the warfarin-sensitive vitamin K 2,3-epoxide reductase enzyme complex in the endoplasmic reticulum membrane, J Biol Chem 272, 29068-29075.
Chen, CA e Okayama, H. (1988). Calcium phosphate-mediated transfer: a highly efficient transfection system for stably transforming cells with plasmid DNA. Biotechniques 6, 632- 638 .
Dockal, M., Cárter, D. C., e Ruker, F. (1999) . The three recombinant domains of human serum albumin. Structural 67 characterization and ligand binding properties, J Biol Chem 274, 29303-29310.
Dockal, M. , Chang, M., Cárter, D. C., e Ruker, F. (2000). Five recombinant fragments of human serum albumin-tools for the characterization of the warfarin binding site, Protein Sei 9, 1455-1465.
Doetschman, Gene Transfer in Embryonic Stem Cells, page 115 to 146 in Pinkert, 1994
Ekelund, H., Lindeberg, L., e Wranne, L. (1986). Combined deficiency of coagulation factors II, VII, IX, and X: a case of probable congenital origin, Pediatr Hematol Oncol 3, 187-193.
Esmon, C. T., Suttie, J. W., e Jackson, C. M. (1975) . The functional significance of vitamin K action. Difference in phospholipid binding between normal and abnormal prothrombin, J Biol Chem 250, 4095-4099.
Fasco, M. J., Príncipe, L. M., Walsh, W. A., e Friedman, P. A. (1983). Warfarin inhibition of vitamin K 2,3-epoxide reductase in rat liver microsomes, Biochemistry 22, 5655-5660.
Fasco, M. J., Preusch, P. C., Hildebrandt, E. & Suttie, J. W. (1983b). Formation of hydroxyvitamin K by vitamin K epoxide reductase of warfarin-resistant rats. J Biol Chem 258, 4372-4380 68
Fischer, M., e E., Z. (1966). Kongenitaler Mangel der Faktoren II, VIII und X, Zeitschrift fur Kinderheilkunde 95, 309-323.
Fregin, A., Rost, S., Wolz, W., Krebsova, A., Muller, C. R., e Oldenburg, J. (2002). Homozygosity mapping of a second gene locus for hereditary combined deficiency of vitamin K-dependent clotting factors to the centromeric region of chromosome 16, Blood 100, 3229-3232.
Furie, B., e Furie, B. C. (1988) . The molecular basis of blood coagulation, Cell 53, 505-518.
Goldsmith, G. H., Jr., Pence, R. E., Ratnoff, O. D.,
Adelstein, D. J., e Furie, B. (1982) . Studies on a family with combined functional deficiencies of vitamin K-dependent coagulation factors, J Clin Invest 69, 1253-1260.
Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20
Greavses, J. H., e Ayres, P. (1967). Heritable resistance to warfarin in rats, Nature 215, 877-878.
Guenthner, T. M., Cai, D., e Wallin, R. (1998). Co- purification of microsomal epoxide hydrolase with the warfarin- sensitive vitamin Kl oxide reductase of the vitamin K cycle, Biochem Pharmacol 55, 169-175.
Harlow & Lane, 1998, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, USA, Chapter 5, pp. 53-135 69
Jackson, M. R., Nilsson, T., e Peterson, P. A. (1990). Identification of a consensus motif for retention of transmembrane proteins in the endoplasmic reticulum, Embo J 9, 3153-3162.
Jackson, W. B., Ashton, A. D., e Delventhal, K. (1988) . OverView of anticoagulant rodenticide usage and resistance. In Current advances in vitamin K research, J. W. Suttie, ed. (New York, Elsivier), pp. 381-397.
Johnson, C. A., Chung, K. S., McGrath, K. M., Bean, P. E., e Roberts, H. R. (1980) . Characterization of a variant prothrombin in a patient congenitally deficient in factors II, VII, IX and X, Br J Haematol 44, 461-469.
Kohn, Μ. H., e Pelz, H. J. (1999) . Genomic assignment of the warfarin resistance locus, Rw, in the rat, Mamm Genome 10, 696-698.
Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15: 8125-48 Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232
Leonard, C. O. (1988). Vitamin K responsive bleeding disorder: a genocopy of the warfarin embryopathy,
Proceedings of the Greenwood Genetic Center 7, 165-166.
Manfioletti, G., Brancolini, C., Avanzi, G., e Schneider, C. (1993). The protein encoded by a growth arrest-specific gene (gas6) is a new member of the vitamin K-dependent proteins related to protein S, a negative coregulator in the blood coagulation cascade, Mol Cell Biol 13, 4976-4985. 70
Martin, A. D., Steed, L. C., Redfern, R., Gill, J. E. & Huson, L. W. Warfarin-resistance genotype determination in the Norway rat, Rattus norvegicus. Laboratory Animais, 209-214 (1979).
McManus et al. 2002, Nature Reviews 3: 737-747, Gene
Silencing in Mammals by small interfering RNAs
McMillan, C. W., e Roberts, H. R. (1966). Congenital combined deficiency of coagulation factors II, VII, IX and X. Report of a case, N Engl J Med 274, 1313-1315.
Mutero, A., Pralavorio, M. , Bride, J. M., e Fournier, D. (1994). Resistance-associated point mutations in insecticide-insensitive acetylcholinesterase, Proc Natl Acad Sei USA 91, 5922-5926.
Monastersky, Gene Transfer Technology; Alternative Techniques and Applications, page 177 to 220 in Pinkert, 1994, supra
Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767 5768 Nellen and Lichtenstein, 1993, Trends Biochem. Sei. 18: 419-23; Stein, 1992, Leukemia 6: 967-74
Oldenburg, J. , von Brederlow, B., Fregin, A., Rost, S., Wolz, W., Eberl, W., Eber, S., Lenz, E., Schwaab, R., Brackmann, Η. H., et al. (2000) . Congenital deficiency of vitamin K dependent coagulation factors in two families presents as a genetic defect of the vitamin K-epoxide-reductase-complex, Thromb Haemost 84, 937-941. 71 0'Reilly, R. A. (1970). The second reported kindred with hereditary resistance to oral anticoagulant drugs, N Engl J Med 282, 1448-1451. 0'Reilly, R. A., Aggeler, P. M. , Silvija Hoag, M., Leong, L. S., e Kropatkin, M. L. (1964). Hereditary transmission of exceptional resistance to coumarin anticoagulant drugs: the first reported kindred, N Engl J Med 271, 809-815.
Pauli, R. M., Lian, J. B., Mosher, D. F., e Suttie, J. W. (1987). Association of congenital deficiency of multiple vitamin K-dependent coagulation factors and the phenotype of the warfarin embryopathy: clues to the mechanism of teratogenicity of coumarin derivatives, Am J Hum Genet 41, 566-583.
Pechlaner, C., Vogel, W., Erhart, R., Pumpel, E., e Kunz, F. (1992) . A new case of combined deficiency of vitamin K dependent coagulation factors, Thromb Haemost 68, 617.
Petersen, C. E., Ha, C. E., Curry, S., e Bhagavan, N. V. (2002). Probing the structure of the warfarin-binding site on human serum albumin using site-directed mutagenesis, Proteins 47, 116-125.
Prentice, C. R. (1985). Acquired coagulation disorders, Clin Haematol 14, 413-442.
Presnell, S. R. , e Stafford, D. W. (2002) . The vitamin K-dependent carboxylase, Thromb Haemost 87, 937-946.
Polites e Pinkert, DNA Microinjection and Transgenic Animal Production, page 15 to 68 in Pinkert, 1994, Transgenic 72
animal technology: a laboratory handbook, Academic Press, London, UK
Price, P. A. (1988) . Role of vitamin-K-dependent proteins in bone metabolism, Annu Rev Nutr 8, 565-583.
Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682
Sperling, R. , Furie, B. C., Blumenstein, M. , Keyt, B., e Furie, B. (1978) . Metal binding properties of gamma-carboxyglutamic acid. Implications for the vitamin K-dependent blood coagulation proteins, J Biol Chem 253, 3898-3906.
Spronk, Η. M., Farah, R. A., Buchanan, G. R., Vermeer, C., e Soute, B. A. (2000). Novel mutation in the gamma-glutamyl carboxylase gene resulting in congenital combined deficiency of all vitamin K-dependent blood coagulation factors, Blood 96, 3650-3652.
Stitt, T. N., Conn, G., Gore, M., Lai, C., Bruno, J., Radziejewski, C., Mattsson, K., Fisher, J., Gies, D. R.,
Jones, P. F., e et al. (1995). The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases, Cell 80, 661- 670.
Suttie, J. W. (1987). The biochemical basis of warfarin therapy, Adv Exp Med Biol 214,3-16.
Thijssen, Η. H. & Pelz, H. J. in Advances in vertebrate pest management (eds. Pelz, H. J., Cowan, D. P. & Feare, C. J.) 181-192 (Filander-Verlag, Furth, 2001). 73
Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584, No. 4
Vicente, V., Maia, R-, Alberca, I., Tamagnini, G. P., e Lopez Borrasca, A. (1984) . Congenital deficiency of vitamin K-dependent coagulation factors and protein C, Thromb Haemost 51, 343-346.
Wallace, Μ. E., e MacSwiney, F. J. (1976). A major gene controlling warfarin-resistance in the house mouse, J Hyg (Lond) 76, 173-181.
Wallin, R. , e Martin, L. F. (1985). Vitamin K-dependent carboxylation and vitamin K metabolism in liver. Effects of warfarin, J Clin Invest 76, 1879-1884.
Winter and Milstein, 1991, Nature 349:293-299
Wood, Retrovirus-Mediated Gene Transfer, page 147 to 176 in Pinkert, 1994, supra
Zheng e Kemeny, 1995, Clin. Exp. Immunol. 100: 380-2; 74
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Baxter International, Inc.
Oldenburg, Johannes Muller-Reible, Clemens Fregin, Andreas Rost, Simone Strom, Tim <120> Polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina K VK0RC1, um alvo terapêutico de cumarina e seus derivados <130> B2174 <160> 94 <170> Patentln versão 3.1
<210> 1 <211> 163 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1
Met Gly Ser Thr Trp Gly Ser Pro Gly Trp Vai Arg Leu Ala Leu Cys 15 10 15
Leu Thr Gly Leu Vai Leu Ser Leu Tyr Ala Leu His Vai Lys Ala Ala 20 25 30
Arg Ala Arg Asp Arg Asp Tyr Arg Ala Leu Cys Asp Vai Gly Thr Ala 35 40 45
Ile Ser Cys Ser Arg Vai Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly 50 55 60 75
Leu Vai Glu His Vai Leu Gly Gin Asp Ser Ile Leu Asn Gin Ser Asn 65 70 75 80
Ser ile Phe Gly Cys Ile Phe Tyr Thr Leu Gin Leu Leu Leu Gly Cys 85 90 95
Leu Arg Thr Arg Trp Ala Ser Vai Leu Met Leu Leu Ser Ser Leu Vai 100 105 110
Ser Leu Ala Gly Ser Vai Tyr Leu Ala Trp Ile Leu Phe Phe Vai Leu 115 120 125
Tyr Asp Phe Cys Ile Vai Cys Ile Thr Thr Tyr Ala Ile Asn Vai Ser 130 135 140
Leu Met Trp Leu Ser Phe Arg Lys Vai Gin Glu Pro Gin Gly Lys Ala 145 150 155 160
Lys Arg His <210> 2 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 atgggcagca cetgggggag ccctggctgg gtgoggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc oaggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctco ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacutaLguL-420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492 76 <210> 3 <211> 492
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 atgggcagca cotgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgetctcgc tctacgcgct gcaogtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gtggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttottcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492
<210> 4 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctcgc tctacgcgct gcacttgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 77 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtotc tcgctggtto tgtctacctg 360 gcotggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492
<210> 5 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgcgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 4B0 aagaggcact ga 492 <210> 6 <211> 492
<212> ADN <213> Homo sapiens 78 <400> 6 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc cgggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492 <210> 7 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 79 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gcgctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492
<210> 8 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 60 gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgtg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct 420 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492
<210> 9 <211> 492 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 60 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgcct gacgggctta 80 gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 180 a9999tttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatoctcaa tcaatccaac 240 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacttg 360 —gcetggatcc tgttcttcgt gctctatgat ttctgcattg tttgtatcac cacctatgct-42-0 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492
<210> 10 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Met Ala Ala Pro Vai Leu Leu Arg Vai Ser Vai Pro Arg Trp Glu Arg 1 Vai Ala Arg Tyr 5 Ala Vai Cys Ala Ala 10 Gly Ile Leu Leu Ser 15 Ile Tyr Ala Tyr Hls 20 Vai Glu Arg Glu Lys 25 Glu Arg Asp Pro Glu 30 His Arg Ala Leu Cys 35 Asp Leu Gly Pro 40 Trp Vai Lys Cys Ser Ala 45 Ala Leu Ala Ser Arg 50 Trp Gly Arg Gly Phe 55 Gly Leu Leu Gly 60 Ser He Phe Gly Lys Asp 65 70 75 80 81 Gly Vai Leu Asn Gin Pro Asn Ser Vai Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Ile 85 90 95 Leu Gin Leu Leu Leu Gly Met Thr Ala Ser Ala Vai Ala Ala Leu Ile 100 105 110 Leu Met Thr Ser Ser He Met Ser Vai Vai Gly Ser Leu Tyr Leu Ala 115 120 125 Tyr Ile Leu Tyr Phe Vai Leu Lys Glu Phe Cys Ile Ile Cys Ile Vai 130 135 140 Thr Tyr Vai Leu Asn Phe Leu Leu Leu Ile Ile Asn Tyr Lys Arg Leu 145 150 155 160 Vai Tyr Leu Asn Glu Ala Trp Lys Arg Gin Leu Gin Pro Lys Gin Asp 165 170 175 <210> 11 <211> 531 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 atggcggctc ccgtcctgct gcagtgtgcg ctgccggaat gagcgggacc ccgagcaccg gcccttgcct ccagatgggg ggtgtattaa accagccaaa cttggcatga cagcaagcgc gtcgtggggt ccctgtacct atctgcatcg tcacgtacgt gtttacttga acgaggcctg aagagtgtcg gtgccgcggt cctgctctcc atctacgcct ggccctctgc gacctggggc tcgaggattt ggtcttttgg cagtgtcttt ggacttatat tgtggcggct ttgatcctça ggcctacatt ctgtactttg gctgaacttc cttcttctca gaagcggcag ctgcaaccca gggagcgggt ggcccggtat accacgtgga gcgggagaag cctgggtgaa gtgctccgcc gttccatttt tggaaaggat tttatatact acagttatta tgacgtcctc catcatgtcg tgctgaagga gttctgcatc ttatcaacta caaacgacta agcaggactg a 60 120 180 240 300 360 420 480 <210> 12 531 82
<211> 161 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 12
Met Gly Thr Thr Trp Arg Ser Pro Gly Arg Leu Arg Leu Ala Leu Cys 15 10 15
Leu Ala Gly Leu Ala Leu ser Leu Tyr Ala Leu His Vai Lys Ala Ala 20 25 30
Arg Ala Arg Asn Glu Asp Tyr Arg Ala Leu Cys Asp Vai Gly Thr Ala 35 40 45
Ile Ser Cys Ser Arg Vai Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly 50 55 60
Leu Vai Glu His Vai Leu Gly Ala Asp Ser Ile Leu Asn Gin Ser Asn 65 70 75 80
Ser Ile Phe Gly Cys Met Phe Tyr Thr Ile Gin Leu Leu Leu Gly Cys 85 90 95
Leu Arg Gly Arg Trp Ala Ser Ile Leu Leu Ile Leu Ser Ser Leu Vai 100 105 110
Ser Vai Ala Gly Ser Leu Tyr Leu Ala Trp Ile Leu Phe Phe Vai Leu 115 120 125 83
Tyr Asp Phe Cys Ile Vai Cys Ile Thr Thr Tyr Ala Ile Asn Ala Gly 130 135 140
Leu Met Leu Leu Ser Phe Gin Lys Vai Pro Glu His Lys Vai Lys Lys 145 150 155 160 |Proj
<210> 13 <211> 486 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <400> 13 atgggcacca cctggaggag ccctggacgt ttgcggcttg cactatgcct cgctggccta 60 gccctctcac tgtacgcact gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgcaatga ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac ggccatcage tgtteccgcg tcttctcctc teggtggggc 180 cggggctttg ggctggtgga gcacgtgtta ggagctgaca gcatcctcaa ccaatccaac 240 agcatatttg gttgcatgtt ctacaccata cagctgttgt taggttgctt gaggggacgt 300 tgggcctcta tcctactgat cctgagttcc ctggtgtctg tcgctggttc tctgtacctg 360 gcetggatcc tgttctttgt cctgtatgat ttctgcattg tttgcatcac cacctatgcc 420 atcaatgcgg gcctgatgtt gcttagcttc cagaaggtgc cagaacacaa ggtcaaaaag 480 ccctga 4B6
<210> 14 <211> 486 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <400> 14 84 atgggcacca cctggaggag coctggacgt ttgcggcttg cactatgcct cgctggccta 60 gccctctcac tgtacgcact gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgcaatga ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac ggccatcagc tgttcccgcg tcttctcctc tcggtggggc 180 cggggctttg ggctggtgga gcacgtgtta ggagctgaca gcatcctcaa ccaatccaac 240 agcatatttg gttgcatgtt ctacaccata cagctgttgt taggttgctt gaggggacgt 300 tgggcctcta tcctactgat cctgagttcc ctggtgtctg tcgctggttc tctgtacctg 360 gcctggatcc tgttctttgt cctgtatgat ttctgcattg tttgcatcac cacctgtgcc 420 atcaatgcgg gcctgatgtt gcttagcttc cagaaggtgc cagaacacaa ggtcaaaaag 480 occtga 486
<210> 15 <211> 176 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 15
Met Ala Ala Pro Vai Leu Leu Arg Vai Ser Vai Pro Arg Trp Glu Arg 15 10 15
Vai Ala Arg Tyr Ala Vai Cys Ala Ala Gly Ile Leu Leu Ser Ile Tyr 20 25 30
Ala Tyr His Vai Glu Arg Glu Lys Glu Arg Asp Pro Glu His Arg Ala 35 40 45
Leu Cys Asp Leu Gly Pro Trp Vai Lys Cys Ser Ala Ala Leu Ala Ser 50 85
Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu Leu Gly Ser Ile Phe Gly Lys Asp 65 70 75 80 Gly Vai Leu Asn Gin Pro Asn Ser Vai Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Ile 85 90 95 Leu_ Gin Leu Leu Leu Glv Met Thr Ala Ser Al a Vai Ala Ala Leu Vai 100 105 110 Leu Met Thr Ser Ser Ile Vai Ser Vai Vai Gly Ser Leu Tyr Leu Ala 115 120 125 Tyr Ile Leu Tyr Phe Vai Leu Lys Glu Phe Cys Ile Ile Cys Vai Thr 130 135 140 Thr Tyr Vai Leu Asn Phe Leu Leu Leu Ile Ile Asn Tyr Lys Arg Leu 145 150 155 160 Vai Tyr Leu Asn Glu Ala Trp Lys Arg Gin Leu Gin Pro Lys Glu Asp 165 170 175
<210> 16 <211> 531 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <4 0 0> 16 86 atggcggcgc ccgtcctgct gagagtgtcg gtgccgcggt gggaacgggt ggcccggtat 60 gcagtgtgcg ccgccgggat cctgctctcc atctacgcot accaogtgga gcgggagaag 120 gagagggacc cggagcaccg ggccctctgc gacctggggc cctgggtgaa gtgctccgcc 180 gccctggcct ccagatgggg tcgaggattt ggtcttttgg gttccatttt tggaaaagat 240 ggtgtattaa accagccaaa cagtgtcttt ggacttatat tttatataet acagttatta 300 cttggcatga cagccagcgc agttgcagct ctggtcctca tgacctcctc catcgtgtcc 360 gtggtggggt ctttgtacct ggcctacatt ctgtactttg tgctgaagga gttttgcatc 420 atctgcgtca ocacatatgt gctgaacttc ottctcctca tcatcaacta caaacgactg 480 gtttacttga atgaggcctg gaagcgaoaa ctgcagocta aggaagactg a 531
<210> 17 <211> 161 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17
Met Gly Thr Thr Trp Arg Ser Pro Gly Leu Vai Arg Leu Ala Leu Cys 15 10 15
Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ser Leu Tyr Ala Leu His Vai Lys Ala Ala 20 25 3Õ
Arg Ala Arg Asp Glu Asn Tyr Arg Ala Leu Cys Asp Vai Gly Thr Ala 87
Ile Ser Cys Ser Arg Vai Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly 50 55 60
Leu Vai Glu His Met Leu Gly Ala Asp Ser Vai Leu Asn Gin Ser Asn 65 70 75 80
Ser Ile Phe Gly Cys Leu Phe Tyr Thr Leu Gin Leu Leu Leu Gly Cys 85 90 95
Leu Arg Gly Arg Trp Ala Ser Ile Leu Leu Vai Leu Ser Ser Leu Vai 100 105 110.
Ser Vai Ala Gly Ser Vai Tyr Leu Ala Trp Ile Leu Phe Phe Vai Leu 115 120 125
Tyr Asp Phe Cys Ile Vai Cys Ile Thr Thr Tyr Ala Ile Asn Vai Gly~ 130 135 140
Leu Met Leu Leu Ser Phe Gin Lys Vai Pro Glu His Lys Thr Lys Lys 145 150 155 160
His
<210> 18 <211> 486 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 18 atgggcacca cctggaggag ccctggactc gtgcggcttg cactgtgcet cgctggctta 60 gocctctcac tgtacgcact gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgcgatga aaattaccgc 120 88 gcgctctgog atgtgggcac ggccatcagc tgttcccgcg tcttctcctc tcggtggggc 180 cggggctttg ggctggtgga gcacatgcta ggagcggaca gcgtcctcaa ccaatccaac 240 agcatatttg gttgcctgtt ctacacctta cagctgttgt taggttgctt gaggggacgt 300 tgggcctcta tcctaotggt gctgagttcc ctggtgtccg tcgctggttc cgtgtacctg 360 gcctggatcc tgttctttgt gttatatgat ttctgcattg tgtgcattac cacetatgcc-4ZQ— atcaatgtgg gtctgatgtt gcttagcttc cagaaggtac cagaacacaa gaccaaaaag 480 cactga 486
<210> 19 <211> 176 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19
Met Ala Ala Pro Vai Leu Leu Arg Vai Ser Vai Pro Arg Trp Glu Arg 15 10 15
Vai Ala Arg Tyr Ala Vai Cys Ala Ala Gly Ile Leu Leu Ser lie Tyr 20 25 30
Ala Tyr His Vai Glu Arg Glu Lys Glu Arg Asp Pro Glu His Arg Ala 35 40 45
Leu Cys Asp Leu Gly Pro Trp Vai Lys Cys Ser Ala Ala Leu Ala Ser 60 89
Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu Leu Gly Ser Ile Phe Gly Lys Asp 65 70 75 80
Gly Vai Leu Asn Gin Pro Asn Ser Vai Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Ile 85 90 95
Leu Gin Leu Leu Leu Gly Met Thr Ala Ser Ala Vai Ala Ala Leu Vai 100 105 110
Leu Met Thr Ser Ser Ile Vai Ser Vai Vai Gly Ser Leu Tyr Leu Ala 115 120 125
Tyr Ile Leu Tyr Phe Vai Leu Lys Glu Phe Cys Ile Ile Cys Vai Thr 130 135 140
Thr Tyr Vai Leu Asn Phe Leu Leu Leu Ile Ile Asn Tyr Lys Arg Leu 145 150 155 160
Vai Tyr Leu Asn Glu Ala Trp Lys Arg Gin Leu Gin Pro Lys Glu Asp 165 <210> 20 <211> 531 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 20 atggcggcgc ccgtcctgct gagagtgtcg gtgccgcgtt gggaacgggt ggcccggtat 60 gcagtgtgcg ccgccgggat cctgctctcc atctacgcct accacgtgga gcgggagaag 120 gagagggacc cggagcaccg ggccctctgc gacctggggc cctgggtgaa gtgctccgcc 180 240 gccctggcct ccagatgggg tcgaggattt ggtcttttgg gttocatttt tggaaaagat 90 ggtgtattaa accagccaaa cagtgtcttt ggacttatat tttatatact acagttatta 300 cttggcatga cagccagcgc agttgcagct ctggtcctca tgacctcctc cattgtgtct 360 gtggtgggct ctttgtacct ggcctacatt ctgtactttg tgctgaaaga gttttgcatc 420 atctgcgtca ccacatatgt gctgaacttc ctcctcctea tcatcaatta caaacgacta 480 gtttatttga atgaggcctg gaagcgacag ctgcagccta aggaagactg a 531
<210> 21 <211> 163 <212> PRT <213> Fugu rubripes <400> 21
Met Ala Ile Pro Thr Trp Glu Arg Lys Vai Arg Ile Phe Leu Cys Vai 15 10 15
Phe Gly Leu Leu Leu Ser Vai Tyr Ala Leu His Vai Glu Leu Ser Arg 20 25 30
Glu Arg Asn Pro Asp Tyr Arg Ala Met Cys Asp Leu Gly Glu Ser Vai 35 40 45
Ser Cys Ser Lys Vai Phe Ser Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu 50 55 60
Vai Gin Tyr 65
Phe Vai Asp Lys Asp Ser Pro Leu Asn Gin Pro Asn Ser 70 75 80 91 91 Vai Leu Gly Ile Ile Phe Tyr Thr Leu Gin Met Cys Leu Gly Leu Ser 85 90 95 Leu Ser Arg Lys Ala Ala Leu Phe Leu Vai Phe Ser Ser Trp Vai Ser 100 105 110 Vai Ala Gly Ser Leu Tyr Leu Ala Ser Ile Leu Ala Phe Vai Leu Gly 115 120 125 Asp Phe Cys Met Vai Cys Vai Ser Thr Tyr Leu Vai Asn Phe Vai Leu Leu 130 Phe Thr Asn Leu Lys 135 Arg Arg Arg Ala Ile 140 Glu Gly Leu Lys Glu 145 Lys Ser Gly 150 155 160
<210> 22 <211> 492 <212> ADN <213> Fugu rubripes <400> 22_ eo 120 180 240 300 360 420 480 492 atggcgatcc ccacatggga gagaaaagtg cgcatatttc tctgtgtttt tggattactt ttgtctgttt acgcgctcca cgtcgagcta tcccgagaga gaaacccgga ttacagggcg atgtgcgacc tgggggagtc tgtgagctgc tctaaggttt tcagctccag atggggacgg ggttttggcc tagtccagta ctttgttgac aaagatagcc ctctgaacca gcccaacagt gtgcttggca tcatttttta cactctgcag atgtgtcttg gactgtctct gtccagaaaa gctgcgctgt ttttagtctt ctcctcctgg gtgtctgtgg ccggctccct ctatctggca tcgattctag cgtttgttct gggagacttc tgtatggtct gtgtgtcaac atatcttgtt aacttcgtac tgctcttcac taacctgaaa cgacggagag caattgaagg actgaaggag aagtctggat ag_ 92 <210> 23 <211> 175 <212> PRT <213> Fugu rubripes <400> 23
Met Ala Ala Pro Vai Leu Arg Vai Ser Thr Pro Arg Trp Glu Arg Ile 15 10 15
Ala Arg Vai Leu Vai Cys Leu Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu Tyr Ala 20 25 30
Phe His Vai Glu Arg Glu His Ala Arg Asp Pro Ser Tyr Lys Ala Leu 35 40 45
Cys Asp Vai Ser Ser Ser Ile Ser Cys Ser Lys Vai Phe Gly Ser Arg 50 55 60
Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu Leu Gly Ser Ile Phe Gly Asn Asp Ser 65 70 75 80
Ala Leu Asn Gin Pro Asn Ser Vai Tyr Gly Ile Vai Phe Tyr Ala Phe 85 90 95
Gin Leu Leu Leu Gly Met Thr Vai Ser Ala Met Ala Ala Leu Ile Leu 100 105 110
Met Thr Thr Ser Ile Met Ser Vai Vai Gly Ser Leu Tyr Leu Gly Tyr 115 120 125 93
Ile Leu Tyr Phe Vai Leu Lys Asp Leu Cys Vai Ile Cys Vai Thr Thr 130 135 140
Tyr Ala Leu Asn Phe Ile Leu Phe Vai Leu Asn Tyr Lys Arg Leu Vai 145 150 155 160
Tyr Leu Asn Glu Ala Trp Lys Gin Lys Leu Gin Ala Lys Gin Asp 1S5 170 175
<210> 24 <211> 528 <212> ADN <213> Fugu rubripes <400> 24
atggcggcgc ccgtcctgag agtatccacc cctcggtggg aaagaatagc ccgggtcctc 60 gtgtgcctcc tgggcatact gctgtctctg tacgccttcc acgtggagag ggaacatgct 120 cgggatcczca gttataaggc tttgtgcgac gtcagtagct ccatcagctg ttctaaagtg 180 ttcggctcca ggtggggccg aggatttgga ctcttgggct ccatttttgg gaatgacagc 240 gcactgaacc aacccaacag cgtctacggg atcgtctttt acgccttcca gcttttacta 300 ggaatgacgg tcagtgcgat ggcggccctg atcctcatga ccacgtccat catgtcggtg 360 gtgggctcgc tctacctggg ctacatcctc tactttgtcc tcaaggacct gtgcgtcatc 420 tgcgtcacca cgtacgcgct gaacttcatc ctttttgtcc tcaactacaa gcgactggtt 480 tacttgaacg aggcctggaa gcagaagctc caggccaagc aggactaa 52 B
<210> 25 <211> 169 <212> PRT <213> Xenopus laveis 94 <400> 25
Met Ser Vai Pro Gly Trp Glu Arg Pro Vai Arg Leu Leu Leu Cys Ser 15 10 15
Vai Gly Ile Ala Leu Ser Leu Tyr Ala Phe His Vai Glu Thr Ser Arg 20 25 30
Glu Arg Asp Pro Asp Tyr Thr Ala Leu Cys Asp Ile Asn Pro Ser Ile 35 40 45
Ser Cys Ser Lys Vai Phe Thr Ser Arg Trp Gly Arg Gly Phe Gly Leu 50 55 60
Vai Glu Gin Phe Leu Gly Gin Gin Ser Leu Leu Asn Gin Pro Asn Ser 65 70 75 80
Vai Phe Gly Vai Leu Phe Tyr Gly Leu Gin Leu Leu Leu Gly Phe Ser 85 90 95
Gly Ser Leu Ala Ala Ala Ser Thr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Met Ser 100 105 110
Ile Gly Gly Ser Met Tyr Leu Ala Tyr Ile Leu Vai Tyr Vai Leu Arg 115 120 125 95
Asp Phe Cys Vai Ile Cys Vai Ser Thr Tyr Vai Leu Asn Leu Leu Leu 130 135 140
Leu Leu Leu Asn Leu Lys Arg Leu Ser Ser Leu Arg Ala Pro Pro Lys Ϊ45 Í5Õ 155 160^
Lys His Lys Asn Lys Arg Lys Lys Asn 165
<210> 26 <211> 510 <212> ADN <213> Xenopus laveis <400> 26 atgtctgtgc cgggctggga gaggccagtg aggctgttgc tgtgctctgt gggtattgcc 60 ctgtcactat atgccttcca tgtagagacc tcccgggaaa gagaccccga ctataccgct 120 ctgtgtgaca tcaacccctc catcagctgc tccaaggtct tcacttccag atgggggcga 180 ggatttgggc tcgtggagca attcctgggg cagcagagtt tgctgaatca gcccaacagc 240 gtgtttggag tcctgttcta cggcctgcag ctcctgctgg gtttcagcgg atccctggct 300 gccgcctcca cgctactggg aacgtctctg atgtccatcg ggggctccat gtacttggcc 360 tatatcctgg tctatgtact gcgcgacttc tgcgttatct gcgtctccac ctacgtcctg 420 aacctcctcc tcctcctgct caacctcaag cgcctgtcct ccotccgagc gccccccaaa 480 aagcacaaga acaaacgcaa gaagaactaa 510
<210> 27 <211> 176 <212> PRT 96 <213> Anopheles gambiae <400> 27
Met Ser Ile Leu Ala Gly Asn Cys Lys Cys Thr Tyr Thr Leu Ala Leu 15 10 15
Vai Gly Leu Ser Vai Cys Gly Phe Leu Leu Ser Leu Tyr Thr Ser Tyr 20 25 30
Vai Glu Leu Arg Ala Glu His Asp His Thr Tyr Gin Ala Met Cys Asp 35 40 45
Ile Ser Glu Arg Ile Ser Cys Thr Lys Vai Phe Thr Ser Arg Tyr Gly 50 55 60
Arg Gly Phe Gly Ile Vai Gly Pro Leu Leu Gly Asp Asp Ser Leu Leu 65 70 75 80
Asn Vai Pro Asn, Gly Phe Tyr Gly Ile Phe Tyr Tyr Phe Leu Vai Ala 85 90 95
Gly Leu Ser Phe Ser Asn Asn Leu Ala Vai Ser Arg Leu Thr Ser Tyr 100 105 110
Leu Ile Leu Leu Ser Asn Gly Leu Ser Leu Tyr Leu Ala Tyr Leu Leu 115 120 125
Tyr Phe Vai Leu Gin Asp Met Cys Vai Vai Cys Vai Thr Thr Tyr Ala 130 135 140 97
Vai Asn Leu Vai Ser Leu Ile Leu Ala Leu Gin Lys Ile Gin Ala Leu 145 150 155 160
Ile Arg Glu Glu Gin Vai Met Arg Ala Leu Lys Vai Gly Lys Ala Lys 165 170 175
<210> 28 <211> 528 <212> ADN <213> Anopheles gambiae <400> 28 atgagcatcc tggcgggcaa ctgcaaatgc acgtacacgc tcgcgctcgt cggcctgagc 60 gtgtgcggct ttctgctgtc gctgtaoacg tcctacgtgg agctgcgggc cgagcacgac 120 catacctacc aggccatgtg cgacattagc gagcgcatca gctgcaccaa agtgtttacc 180 tccaggtacg ggcgtggttt tggcattgtc gggccgttgc tcggcgacga ctcgctgctg 240 aacgtgccga acgggttcta cggcatcttc tactacttcc tagtggccgg cctcagcttc 300 agcaacaatc tggccgtctc gcggctgacc agctacctca tactgctgtc caacgggctg 360 tcgctctacc tcgcctacct gctctacttc gtgctgcagg acatgtgcgt cgtgtgcgtc 420 accacgtacg cggtcaatct ggtcagcctg atactggcgc tgcagaaaat tcaggctctg 480 atccgggagg agcaggtaat gcgcgcgctc aaggttggca aggcaaag 528
<210> 29 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> 98 <223> Sequência de ARNsi 1 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 29 gguugcaucu ucuacacacu u 21
<210> 30 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de ARNsi 2 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 30 uuccaacgua gaagaugugu g 21
<210> 31 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 1 para a sequência ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 31 caaaaactgt aaaaaggttg catcttctac acacggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57 <210> 32 <211> 57 99
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador a jusante 2 para a sequência ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 32 caaaaactgt aaaaagtgtg tagaagatgc aaccggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 33 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 3 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 33 gucucucgcu gguucugucu u 21
<210> 34 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 4 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 34 100 uucagagagc gaccaagaca g 21 <210> 35 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 3 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 35 caaaaactgt aaaaagtctc tcgctggttc tgtcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57 <210> 36 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 4 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 36 caaaaactgt aaaaagacag aaccagcgag agacggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57 <210> 37 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> 101 <223> Sequência de ARNsi 5 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 37 ggccuggauc cuguucuucu u 21
<210> 38 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 6 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 38 uuccggaccu aggacaagaa g 21
<210> 39 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 5 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 39 57 caaaaactgt aaaaaggcct ggatcctgtt cttcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 102
<210> 40 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador subunidade 1 do de homo sapiens a jusante 6 para a sequência de ARNsi da complexo de epóxido de vitamina K-redutase (Hs VKORC1) <400> 40 caaaaactgt aaaaagaaga acaggatcca ggccggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 41 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 7 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 41 gauccuguuc uucgugcucu u 21
<210> 42 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> 103 <223> Sequência de ARNsi 8 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 42 uucuaggaca agaagcacga g 21 <210> 43 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante subunidade 1 do complexo de de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 43 para a sequência de ARNsi da epóxido de vitamina K-redutase caaaaactgt aaaaagatcc tgttcttcgt gctcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 44 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador a jusante 8 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 44 57 caaaaactgt aaaaagagca cgaagaacag gatcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 104 <210> 45 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 9 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 45 gcauuguuug uaucaccacu u 21 <210> 46 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 10 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 46 uucguaacaa acauaguggu g 21 <210> 47 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 105 <223> Iniciador a jusante 9 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 47 caaaaactgt aaaaagcatt gtttgtatca ccacggtgtt tcgtcctttc oacaaga 57
<210> 48 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 10 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 48 caaaaactgt aaaaagtggt gatacaaaca atgcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 49 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de ARNsi 11 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 49 21 gcucaguuuc cggaaggucu u 106 <210> 50 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de ARNsi 12 da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 50 uucgagucaa aggccuucca g 21 <210> 51 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador a jusante 11 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs VKORC1) <400> 51 caaaaactgt aaaaagctca gtttccggaa ggtcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57 <210> 52 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 107 <223> Iniciador a jusante 12 para a sequência de ARNsi da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (Hs_VKORCl) <400> 52 caaaaactgt aaaaagacct tccggaaact gagcggtgtt tcgtcctttc cacaaga 57
<210> 53 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para amplificação da sequência de codificação completa da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (VKORCI-HindIII-F) <400> 53 attaagcttc accatgggca gcacctgggg gagccct 37
<210> 54 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para amplificação da sequência de codificação completa da subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase de homo sapiens (VKORCl-EcoRI-R) <400> 54 31 attgaattcc gtgcctctta gccttgccct g 108
<210> 55 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-Exl-F <400> 55 caatcgccga gtcagagg 18 <210> 56 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-Exl-R <400> 56 taatcatctg gcatcctggc 20 <210> 57 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs_VKORCl-Ex2-F <400> 57 19 caaggcactg ggttgacag 109
<210> 58 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VK0RC1-Ex2-R <400> 58 gagtggggct gagctgac 18 <210> 59 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VK0RC1-Ex3-F <400> 59 gacatcatgg agtgttcggg 20 <210> 60 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>
<223> Iniciador de PCR para Hs_VKORCl-Ex3-R <400> 60 110 cttaggcaag gctçacatgc 20 <210> 61 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-ADNc-F <400> 61 ggcacgaggg ttttctcc 18 <210> 62 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCl-ADNc-R <400> 62 ctcacatgcc aaagcaaag 19 <210> 63 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>
<223> Iniciador de PCR para Rn VKORCl-ADNc-F 111 < 4 Ο Ο> 63 ggcgggttct tccctctt 18
<210> 64 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn VKORCl-ADNc-R <400> 64 catgtgctaa ggcaaagcaa 20
<210> 65 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn VKORCl-ADNc-F-nes <400> 65 ttgtgtctgc gctgtactgt c 21
<210> 66 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn VKORCl-ADNc-R-nes 112 <4 Ο Ο> 66 gtcagcctgg catgaggt
<210> 67 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr VKORCl-ADNc-F <400> 67 tcttttccat ttgattggtc ct <210> 68 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr VKORCl-ADNc-R <400> 68 tcagtttagt cgcacctcct g <210> 69 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr_VKORCl-ADNc-F-nes 113 <4Ο0> 69 gtggccatct gagcagaaac
<210> 70 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr VKORCl-ADNc-R-nes <400> 70 tgctggattt cagtgggaac 20 <210> 71 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCILl-ADNc-F <400> 71 tgggtcgggc cccgacgg 18
<210> 72 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCILl-ADNc-R <400> 72 tttaaatcca tcggctaaaa ac
<210> 73 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCILl-ADNc-F-nes <400> 73 ggcggctgag gtggag <210> 74 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Hs VKORCILl-ADNc-R-nes <400> 74 agcaatggtt gctcacttta c
<210> 75 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial 115 <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr VKORC1L1-ADNC-F <400> 75 cgagctccct gcgtatgtat
<210> 76 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr VKORCILl-ADNc-R <400> 76 gacgttgttg tttgtttatt tgattt <210> 77 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr VKORCILl-ADNc-F-nes <400> 77 cgtatgtatg cgtgtctcca g 21
<210> 78 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial 116 <22 0> <223> Iniciador de PCR para Fr VKORCILl-ADNc-Rnes <400> 78 ttttcaccgc cgttctga 18
<210> 79 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Iniciador de PCR para
Rn_VKORC1L1-ADNc - F <400> 79 ggcggcgtct gagtggag 18 <210> 80 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn_VKORClLl-ADNc-R <400> 80 acaggtttaa atccatcggc 20 <210> 81 <211> 17 117
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR para Rn VKORCILl-ADNc-F-nes <400> 81 ctgagtggag gcggagg
<210> 82 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Rn VKORCILl-ADNc-R-nes <400> 82 tttcatgttc atgatcacat tttg <210> 83 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR para Rn VKORCILl-ADNc-R-short <400> 83 ctggctgtca tgccaagtaa 2o <210> 84 118 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Mm VKORClLl-ADNc-F <400> 84 ggaagatggc ggcgcccg 18 <210> 85 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Mm VKORCILl-ADNc-R <400> 85 tctgctgtca acactgcacc 20 <210> 86 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Mm VKORCILl-ADNc-F-nes <400> 86 ggtatgcagt gtgcgcc 17 <210> 87 119
<211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR para Mm VKORClLl-ADNc-R-nes <400> 87 geatttccca agatgttctg 20 <210> 88 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR F exterior de rVKORCI <400> 88 atcctgagtt ccctggtgtc tgtcgctg 28 <210> 89 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR R exterior para rVKORCI <400> 89 28 tcagggcttt ttgaccttgt gttctggc 120 <210> 90 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial
<22 0> <223> Iniciador de PCR F interior para rVKORCl-F <400> 90 tgatttctgc attgtttgca tcaccacatg 30 <210> 91 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR R interior para rVKORCl <400> 91 caacatcagg cccgcattga tggaat 26 <210> 92 <211> 25 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR F de VKORCl-pADNc3 <400> 92 399cggaagc ttgagataat gggca 25 121
<210> 93 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR R de VK0RCl-pADNc3 <400> 93 22 gcttgaattc agggctcagt gc
<210> 94 <211> 492 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>
<223> VK0RC1 de homo sapiens com mutação de resistência à varfarina de ratazana 416A>G <400> 94 atgggcagca cctgggggag ccctggctgg gtgcggctcg ctctttgoct gacgggctta 60 gtgctctcgc tctacgcgct gcacgtgaag gcggcgcgcg cccgggaccg ggattaccgc 120 gcgctctgcg acgtgggcac cgccatcagc tgttcgcgcg tcttctcctc caggtggggc 180 aggggtttcg ggctggtgga gcatgtgctg ggacaggaca gcatcctcaa tcaatccaac 240 122 agcatattcg gttgcatctt ctacacacta cagctattgt taggttgcct gcggacacgc 300 tgggcctctg tcctgatgct gctgagctcc ctggtgtctc tcgctggttc tgtctacctg 360 gcctggatcc tgttcttcgt gctctatgfat ttctgcattg tttgtatcac cacctgtgct 42 0 atcaacgtga gcctgatgtg gctcagtttc cggaaggtcc aagaacccca gggcaaggct 480 aagaggcact ga 492
Lisboa, 5 de Maio de 2010

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES Método de identificação de um derivado de cumarina que exerce um efeito sobre a actividade de um polipéptido VK0RC1 (Subunidade 1 do complexo de epóxido de vitamina K-redutase) compreendendo uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com as SEQ ID No. 1, 12 e 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 80% de identidade com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b) , em que a sequência polipeptidica tem actividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a) , (b) ou (c) possuindo actividade VKORC1, compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula hospedeira onde foi introduzido um ácido nucleico de VKORC1 ou um vector contendo o ácido nucleico de VKORC1; (II) expressar o polipéptido VKORC1 na célula hospedeira; (III) administrar um derivado de cumarina candidato; (IV) determinar a actividade de polipéptido VKORC1 (valor de actividade do candidato); (V) comparar o valor de actividade do candidato com um valor de actividade de controlo; e (VI) identificar o derivado de cumarina candidato como um derivado de cumarina que exerce um efeito sobre a 2 actividade do polipéptido VK0RC1, desde que o valor de actividade do candidato seja significativamente diferente do valor de actividade do controlo.
  2. 2. Método da reivindicação 1, em que o valor da actividade de controlo é determinado por um método compreendendo os passos de: (A) proporcionar uma célula hospedeira de acordo com o passo (I) ; (B) expressar o polipéptido VK0RC1 na célula hospedeira; e (C) determinar a actividade de polipéptido VK0RC1 (valor da actividade de controlo).
  3. 3. Método da reivindicação 1, em que a actividade determinada do polipéptido VK0RC1 é a conversão dependente de ditiotreitol de epóxido de vitamina K 2.3 em vitamina K quinona e em que o valor de actividade significativamente diferente é um valor de actividade do candidato que é significativamente maior do que o valor da actividade de controlo.
  4. 4. Método da reivindicação 1, em que é introduzido pelo menos um composto adicional na célula hospedeira, composto esse que é seleccionado do grupo consistindo de vitamina K, citocromo B5 e um ácido nucleico que codifica a gama-glutamil-carboxilase, a epóxido-hidrolase microssomal, a calumenina ou a glutationa-S-transferase.
  5. 5. Método de determinação de uma sequência de um polipéptido VK0RC1 que confere um efeito de cumarina 3 exercido sobre a actividade VK0RC1, compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa um polipéptido VK0RC1 compreendendo uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com as SEQ ID No. 1, 12 e 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a) ; (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 80% de identidade com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b) , em que a sequência polipeptidica tem actividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a) , (b) ou (c) possuindo actividade VKORC1, polipéptido VKORC1 esse que tem pelo menos uma anormalidade de sequência; (II) administrar cumarina ou um seu derivado à célula; (III) determinar a actividade do polipéptido VKORC1 (valor de actividade da anormalidade de sequência); e (IV) comparar o valor de actividade da anormalidade de sequência com o valor de actividade da sequência de controlo, em que um desvio significativo do valor de actividade da anormalidade de sequência do valor de actividade da sequência de controlo é revelador de que a anormalidade de sequência do polipéptido VKORC1 confere o efeito de cumarina exercido sobre o polipéptido VKORC1. 4
  6. 6. Método da reivindicação 5, em que o valor de actividade da sequência de controlo é determinado por um método compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa um polipéptido VK0RC1 compreendendo uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com as SEQ ID No. 1, 12 e 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 80% de identidade com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b) , em que a sequência polipeptidica tem actividade VKORC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a) , (b) ou (c) possuindo actividade VK0RC1; (II) administrar cumarina ou um seu derivado à célula; (III) determinar a actividade do polipéptido VKORC1 (valor de actividade da sequência de controlo).
  7. 7. Método de determinação da reivindicação 5, em que a actividade determinada é a conversão dependente de ditiotreitol de epóxido de vitamina K 2.3 em vitamina K quinona e em que o valor significativamente diferente é um valor de actividade de anormalidade da sequência que é significativamente maior do que o valor de actividade da sequência de controlo.
  8. 8. Método da reivindicação 5, em que é introduzido pelo menos um composto adicional nas células, composto esse 5 que é seleccionado do grupo consistindo de vitamina K, citocromo B5 e um ácido nucleico que codifica a gama-glutamil-carboxilase, a epóxido-hidrolase microssomal, a calumenina ou a glutationa-S-transferase.
  9. 9. Polipéptido VK0RC1, em que o polipéptido VK0RC1 contém pelo menos uma anormalidade de sequência, a qual exerce um efeito sobre a actividade do polipéptido VK0RC1, e em que o polipéptido VK0RC1 é o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 1 ou 12 e a anormalidade de sequência é seleccionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C.
  10. 10. Método de diagnóstico da resistência à varfarina ou a deficiência de factores de coagulação múltiplos de tipo 2 (VKCFD2) num doente compreendendo os passos de: (I) amplificar uma amostra de ADN obtida do doente ou transcrever inversamente uma amostra de ARN obtida do doente num ADN e amplificar o ADN; e (II) analisar o ADN amplificado do passo (I) para determinar pelo menos uma anormalidade de sequência numa sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido VKORC1 ou numa sequência de aminoácido de um polipéptido VKORC1; em que a anormalidade de sequência determinada é reveladora de que o doente sofre de uma deficiência associada ao VKORC1; preferencialmente de resistência à varfarina.
  11. 11. Método da reivindicação 10, em que o ADN amplificado codifica pelo menos uma sequência parcial do polipéptido VKORC1 de acordo com a SEQ ID No. 1 e em 6 que a anormalidade de sequência é seleccionada do grupo consistindo de V29L, V45A, R58G, R98W, L128R e Y139C.
  12. 12. Método da reivindicação 10, em que o ADN amplificado é analisado por uma técnica seleccionada do grupo consistindo de análise com base em PCR, análise por digestão de restrição e análise por sequenciação de ADN.
  13. 13. Método de diagnóstico da resistência à varfarina ou deficiência de factores de coagulação múltiplos de tipo 2 (VKCFD2) num doente compreendendo os passos de: (I) proporcionar a amostra obtida do doente; e (II) detectar um polipéptido VK0RC1 possuindo uma anormalidade de sequência na amostra utilizando anticorpo ou um fragmento deste, o qual reconhece e liga especificamente o polipéptido VKORC1 da reivindicação 9, em que a anormalidade de sequência determinada é reveladora de que o doente sofre de uma deficiência associada ao VKORC1.
  14. 14. Método da reivindicação 13, em que a amostra é analisada por uma técnica seleccionada do grupo consistindo de detecção imuno-histoquimica, imunotransferência, preferencialmente transferência de Western, e ELISA.
  15. 15. Método de identificação de um derivado de cumarina o qual exerce um efeito inibidor sobre a actividade de 7 um polipéptido VK0RC1 possuindo pelo menos uma anormalidade de sequência, compreendendo os passos de: (I) proporcionar uma célula que expressa o polipéptido VK0RC1 de acordo com a reivindicação 9, preferencialmente um polipéptido codificado por uma sequência seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID No. 3, 4, 5, 6, 7, 14 e 94; (II) administrar um derivado de cumarina candidato à célula; (III) determinar a actividade do polipéptido VK0RC1 (valor de actividade da anormalidade de sequência); e (IV) comparar o valor de actividade da anormalidade de sequência com o valor de actividade da sequência de controlo, (V) identificar o derivado de cumarina candidato como o derivado de cumarina que exerce um efeito inibidor sobre a actividade de um polipéptido VK0RC1, se a administração do derivado de cumarina candidato resultar num valor de actividade de anormalidade da sequência que é significativamente inferior ao valor de actividade da sequência de controlo.
  16. 16. Método de identificação de um derivado de cumarina que é toxicologicamente eficaz em roedores resistentes à varfarina compreendendo os passos de: (I) proporcionar um roedor resistente à varfarina; (II) administrar um derivado de cumarina candidato ao roedor; (III) determinar a toxicidade do derivado de cumarina candidato sobre o roedor (valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato); (IV) comparar o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato com um valor de toxicidade de cumarina de controlo; (V) identificar o derivado de cumarina candidato como um derivado de cumarina toxicologicamente eficaz, desde que o valor de toxicidade do derivado de cumarina candidato seja significativamente maior do que o valor de toxicidade da cumarina de controlo, em que o roedor resistente à varfarina é um roedor transgénico para um polipéptido VK0RC1 compreendendo uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de: (a) uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo de uma sequência de acordo com as SEQ ID No. 1, 12 e 17; (b) uma sequência polipeptidica de um alelo da sequência polipeptidica definida em (a); (c) uma sequência polipeptidica possuindo pelo menos 80% de identidade com a sequência polipeptidica definida em (a) ou (b) , em que a sequência polipeptidica tem actividade VK0RC1; e (d) uma sequência polipeptidica de um fragmento da sequência polipeptidica definida em (a) , (b) ou (c) possuindo actividade VK0RC1, em que o polipéptido VKORC1 contém pelo menos uma anormalidade de sequência, a qual origina resistência à varfarina, preferencialmente um polipéptido codificado pela sequência de acordo com a SEQ ID No. 14. Método da reivindicação 16, em que o polipéptido VKORC1 é o polipéptido de acordo com a SEQ ID No. 12 e a anormalidade de sequência é seleccionada do grupo 9 consistindo de V29L (85 G>T), V45A(134 T>C), R58G (172 A>G) , R98W (292 C>T), e L128R (383 T>G) e Y139C (416 A>G).).
  17. 18. Utilização dos iniciadores de PCR de acordo com as SEQ ID No. 88 até 91 para determinar se uma ratazana tem um genótipo de resistência à varfarina numa amostra obtida da ratazana. Lisboa, de 5 Maio de 2010
PT04790318T 2003-10-14 2004-10-12 Polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina k, vkorc1, um alvo terapêutico de cumarina e seus derivados PT1673450E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51104103P 2003-10-14 2003-10-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1673450E true PT1673450E (pt) 2010-05-11

Family

ID=34520024

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT04790318T PT1673450E (pt) 2003-10-14 2004-10-12 Polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina k, vkorc1, um alvo terapêutico de cumarina e seus derivados
PT10002316T PT2189523E (pt) 2003-10-14 2004-10-12 Polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina k, vkorc1, um alvo terapêutico de cumarina e seus derivados

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT10002316T PT2189523E (pt) 2003-10-14 2004-10-12 Polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina k, vkorc1, um alvo terapêutico de cumarina e seus derivados

Country Status (12)

Country Link
US (5) US7939250B2 (pt)
EP (3) EP2272951B1 (pt)
JP (2) JP4777251B2 (pt)
AT (2) ATE540107T1 (pt)
AU (2) AU2004283246B2 (pt)
CA (1) CA2542017A1 (pt)
DE (1) DE602004026897D1 (pt)
DK (3) DK2272951T3 (pt)
ES (3) ES2344413T3 (pt)
PL (2) PL2189523T3 (pt)
PT (2) PT1673450E (pt)
WO (1) WO2005040367A1 (pt)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1842920T4 (da) 2003-09-23 2017-08-21 Univ North Carolina Chapel Hill Celler der co-udtrykker K-vitaminreduktase og K-vitaminafhængigt protein, samt anvendelse deraf til at forbedre produktiviteten af det K-vitaminafhængige protein
GB0324044D0 (en) 2003-10-14 2003-11-19 Astrazeneca Ab Protein
PT1673450E (pt) * 2003-10-14 2010-05-11 Baxter Int Polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina k, vkorc1, um alvo terapêutico de cumarina e seus derivados
EP1781779A2 (en) * 2004-08-02 2007-05-09 Novozymes A/S Creation of diversity in polypeptides
US7445896B2 (en) 2004-10-18 2008-11-04 University Of Washington Methods and compositions for detecting VKORC1 single nucleotide polymorphisms
EP1809767B1 (en) * 2004-10-18 2011-09-07 University of Washington Methods and compositions for predicting response to warfarin
DK1853700T3 (da) * 2005-02-28 2013-01-07 Baxter Int Rekombinant co-ekspression af vitamin-k-epoxid-reduktase-underenhed 1 til forbedring af vitamin-k-afhængig proteinekspression
CA2601574C (en) 2005-03-15 2014-12-02 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for producing active vitamin k-dependent proteins
KR20130140221A (ko) 2005-04-13 2013-12-23 아스트라제네카 아베 감마 카르복실화를 필요로 하는 단백질 생산용 벡터를 포함하는 숙주 세포
US20090226909A1 (en) * 2006-03-28 2009-09-10 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Methods and kits for Determining Predisposition to Warfarin Resistance
US8206967B2 (en) 2007-07-06 2012-06-26 Medimmune Limited Method for production of recombinant human thrombin
KR20110016440A (ko) 2008-04-24 2011-02-17 셀틱 파르마 피이지 엘티디. 연장된 반감기를 가진 제 ⅰⅹ 인자 접합체
US20110243958A1 (en) * 2008-10-15 2011-10-06 President And Fellows Of Harvard College Antimicrobial agents that target bacterial vkor
WO2011003153A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Csl Limited Method of increasing the expression yield of vitamin k-dependent proteins
WO2012088222A2 (en) 2010-12-21 2012-06-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for producing active vitamin k-dependent proteins
TWI600766B (zh) 2012-08-09 2017-10-01 財團法人工業技術研究院 用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及／或多形性的套組
US20160354489A1 (en) * 2013-09-26 2016-12-08 Universitat Autònome de Barcelona Gene therapy compositions for use in the prevention and/or treatment of non-alcoholic fatty liver disease
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN105177153B (zh) * 2015-09-30 2018-04-24 南通市疾病预防控制中心 一种黄胸鼠pcr鉴定引物及鉴定方法
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
CN109880889B (zh) * 2019-04-08 2022-12-06 厦门市妇幼保健院(厦门市优生优育服务中心、厦门大学附属妇女儿童医院、厦门市林巧稚妇女儿童医院) 华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物及其方法

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2189523A (en) * 1938-11-05 1940-02-06 Alexander A Poch Sprinkler head shut-off device
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0127839B1 (en) 1983-05-27 1992-07-15 THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
GB8822584D0 (en) 1988-09-27 1988-11-02 Abco Technology Ltd Steam boiler system
ATE102631T1 (de) 1988-11-11 1994-03-15 Medical Res Council Klonierung von immunglobulin sequenzen aus den variabelen domaenen.
WO1991001372A1 (en) 1989-07-17 1991-02-07 New England Medical Center Hospitals, Inc. VITAMIN K-DEPENDENT η-CARBOXYLASE
CA2087970A1 (en) 1990-07-23 1992-01-24 Kathleen L. Berkner Gamma-carboxylase and methods of use
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
US5268275A (en) 1991-05-08 1993-12-07 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vitamin K-dependent carboxylase
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
US5698765A (en) 1991-12-02 1997-12-16 The Ontario Cancer Institute Mouse having a disrupted CD4 gene
WO1993018144A1 (en) 1992-03-05 1993-09-16 The Trustees Of Columbia University Of The City Of New York Recombination activating gene deficient animal
US5625122A (en) 1992-04-24 1997-04-29 The Ontario Cancer Institute Mouse having a disrupted lck gene
JP3741447B2 (ja) 1992-10-23 2006-02-01 中外製薬株式会社 エンドセリン−１遺伝子の機能が欠損したマウス
DE19625049A1 (de) 1996-06-22 1998-01-02 Inst Pflanzengenetik & Kultur Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, das ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthält
AUPO864097A0 (en) 1997-08-19 1997-09-11 Peplin Pty Ltd Anti-cancer compounds
US5896337A (en) 1998-02-23 1999-04-20 Micron Technology, Inc. Circuits and methods for multi-level data through a single input/ouput pin
AU4978499A (en) * 1998-07-10 2000-02-01 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human transport protein homologs
AU3064800A (en) 1999-01-21 2000-08-07 Darwin Discovery Limited The therapeutic use of r-warfarin as anticoagulant
IL154879A0 (en) 2000-10-02 2003-10-31 Novo Nordisk As Factor vii glycoforms
EP1381622A2 (en) * 2001-03-21 2004-01-21 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
ES2606290T3 (es) 2001-07-12 2017-03-23 University Of Massachusetts Producción in vivo de ARN de interferencia pequeños que median el silenciamiento génico
JP4549027B2 (ja) * 2002-02-04 2010-09-22 アース製薬株式会社 ネズミ用毒餌剤及びその安定化方法
DK1842920T4 (da) * 2003-09-23 2017-08-21 Univ North Carolina Chapel Hill Celler der co-udtrykker K-vitaminreduktase og K-vitaminafhængigt protein, samt anvendelse deraf til at forbedre produktiviteten af det K-vitaminafhængige protein
PT1673450E (pt) 2003-10-14 2010-05-11 Baxter Int Polipéptido de reciclagem de epóxido de vitamina k, vkorc1, um alvo terapêutico de cumarina e seus derivados
DK1853700T3 (da) 2005-02-28 2013-01-07 Baxter Int Rekombinant co-ekspression af vitamin-k-epoxid-reduktase-underenhed 1 til forbedring af vitamin-k-afhængig proteinekspression
CA2601574C (en) 2005-03-15 2014-12-02 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for producing active vitamin k-dependent proteins
AU2006320168B2 (en) 2005-12-02 2012-02-23 Wake Forest University Health Sciences Compositions and methods for increasing production of recombinant gamma-carboxylated proteins
DK1969127T4 (en) 2005-12-21 2017-10-16 Cnj Holdings Inc Process for the preparation of biologically active vitamin K-dependent proteins by recombinant methods
CN101678124A (zh) 2007-03-14 2010-03-24 恩多塞特公司 结合配体连接的微管溶素递药缀合物

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007512002A (ja) 2007-05-17
PL2189523T3 (pl) 2012-05-31
AU2004283246B2 (en) 2009-07-23
PT2189523E (pt) 2012-01-24
DK2272951T3 (da) 2014-10-13
EP1673450A1 (en) 2006-06-28
ES2379764T3 (es) 2012-05-03
ATE540107T1 (de) 2012-01-15
DE602004026897D1 (de) 2010-06-10
AU2009212805A1 (en) 2009-09-17
US7939250B2 (en) 2011-05-10
EP2189523A1 (en) 2010-05-26
JP4777251B2 (ja) 2011-09-21
PL1673450T3 (pl) 2010-10-29
HK1141834A1 (en) 2010-11-19
ES2515216T3 (es) 2014-10-29
EP2272951A1 (en) 2011-01-12
ATE466074T1 (de) 2010-05-15
EP1673450B1 (en) 2010-04-28
AU2004283246A1 (en) 2005-05-06
US20090094708A1 (en) 2009-04-09
US20170240867A1 (en) 2017-08-24
EP2189523B1 (en) 2012-01-04
WO2005040367A1 (en) 2005-05-06
DK1673450T3 (da) 2010-08-23
US20130318640A1 (en) 2013-11-28
US20050271644A1 (en) 2005-12-08
DK2189523T3 (da) 2012-03-12
ES2344413T3 (es) 2010-08-26
CA2542017A1 (en) 2005-05-06
JP2011013231A (ja) 2011-01-20
EP2272951B1 (en) 2014-07-23
US20110154520A1 (en) 2011-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2344413T3 (es) Polipeptido vkorc1 de reciclaje de la vitamina k-epoxido, una diana terapeutica de la cumarina y sus derivados.
JP2007512002A5 (pt)
US7390894B2 (en) Glutathione S-transferase sequence variants
AU685627B2 (en) Germline mutations in the MTS gene and method for detecting predisposition to cancer at the MTS gene
WO1995025429A1 (en) Mts gene, mutations therein, and methods for diagnosing cancer using mts gene sequence
CA2494899A1 (en) Polypeptides and nucleic acids encoding these and their use for the prevention, diagnosis or treatment of liver disorders and epithelial cancer
Corrigall et al. Homozygous variegate porphyria in South Africa: genotypic analysis in two cases
AU2003201728B2 (en) Gene for peripheral arterial occlusive disease
WO2003076658A2 (en) A susceptibility gene for late-onset idiopathic parkinson's disease
AU2003201728A1 (en) Gene for peripheral arterial occlusive disease
AU2012254970A1 (en) Vitamin K Epoxide Recycling Polypeptide VKORC1, a Therapeutic Target of Coumarin and Their Derivatives
HK1141834B (en) Vitamin k epoxide recycling polypeptide vkorc1, a therapeutic target of coumarin and their derivatives
WO2008042762A2 (en) Single nucleotide polymorphisms associated with cardiovascular disease
Sharon A Missense Mutation in DHDDS, Encoding Dehydrodolichyl Diphosphate Synthase, Is Associated with Autosomal-Recessive Retinitis Pigmentosa in Ashkenazi Jews