PT1643983E - Métodos de inibir a permeabilidade vascular e apoptose - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS DE INIBIR A PERMEABILIDADE VASCULAR E APOPTOSE"

DECLARAÇÃO VISANDO A INVESTIGAÇÃO & DESENVOLVIMENTO FINANCIADO A NÍVEL FEDERAL O Governo dos EUA possui determinados direitos nesta invenção de acordo com as Bolsas HL67330 e HL70694 atribuídas pelo National Institute of Health.

ANTECEDENTES 0 processo de formar novos vasos sanguíneos é denominado angiogénese. Durante a angiogénese, células endoteliais vasculares sofrem proliferação, migração e morfogénese ordenada, para formar novas redes capilares. Sob condições normais ou não patológicas, a angiogénese ocorre sob condições bem definidas, tais como na cicatrização de feridas, em resposta a isquémia e durante o desenvolvimento embrionário e fetal. Contudo, a angiogénese persistente ou descontrolada pode levar a uma variedade de estados de doença ou patologias e, no caso de tumores sólidos, pode ser uma condição necessária para manter o estado de doença.

Muitas moléculas de sinalização extracelulares e intracelulares interagem com receptores celulares e regulam os efeitos no sistema vascular, incluindo os processos relacionados com a angiogénese. A esfingosina-l-fosfato (S1P) é um 1 esfingolípido bioactivo que medeia uma vasta variedade de respostas celulares através da interacção com os membros da família de genes de diferenciação de células endoteliais (EDG, também conhecidos como receptores de SlPn) dos receptores acoplados a proteína G localizados na membrana plasmática. Até à data, foram identificados cinco membros desta família como receptores S1P em diferentes tipos de células, SlPi/EDG-1, SIP2/EDG-5, SIP3/EDG-3, SlP4/EDG-6 e SIP5/EDG-8. Em particular, a interacção de S1P com os receptores SlPi e SIP3 demonstraram desempenhar um papel importante na sobrevivência e morfogénese de células endoteliais in vitro e o SlPi é necessário para a maturação vascular in vivo. Contudo, o S1P também exerce efeitos potentes noutros sistemas de órgãos, tais como o sistema imunitário e o sistema reprodutor, indicando que é um mediador lipídico multifuncional. 0 S1P e os seus receptores estão envolvidos na regulação da vasculatura. É por isso desejável manipular os receptores S1P, particularmente no tratamento de doenças do sistema vascular.

BREVE SUMÁRIO A invenção proporciona a utilização de um agonista do receptor da esfingosina-l-fosfato endotelial vascular, uma sua forma farmaceuticamente aceitável ou uma sua forma fosforilada, para a preparação de um medicamento para o tratamento de apoptose de células endoteliais vasculares indesejada relacionada com um distúrbio relacionado com apoptose, em que o agonista do receptor da esfingosina-l-fosfato endotelial vascular é definido na reivindicação 1 e em que a apoptose de 2 células endoteliais vasculares indesejada não está relacionada com a rejeição de transplante.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Em referência agora aos desenhos, em que elementos iguais são numerados de igual modo nas várias FIGURAS: A Figura 1 é um gráfico dos resultados de um teste de migração celular para HUVEC expostos a FTY720 e (R)-AAL com e sem incubação celular. A Figura 2 é um gráfico dos resultados de um ensaio de migração celular demonstrando que a capacidade de células endoteliais para activar FTY720 e (R)-AAL é bloqueada pelo inibidor da cinase de esfingosina (SK) dimetilesfingosina (DMS). A Figura 3 é uma cromatografia de camada fina (TLC)-autorradiografia de um ensaio de cinase in vitro com meio condicionado (CM) e extracto celular total (TCE) de HUVEC. A Figura 4 é uma TLC-autorradiografia de um ensaio de cinase in vitro realizado com extractos de células de controlo de vector 293T (2931), células 293T sobre-expressando SK1 (SK1-293T) e células 293T sobre-expressando SK2 (SK2-293T). As vezes de indução da actividade especifica de SK1-293T (barras brancas) e SK2-293T (barras pretas) vs 293T transfectado com vector é apresentado no painel de baixo. A Figura 5 é uma experiência de migração com HUVEC (barras brancas: controlo, barras pretas: tratamentos com toxina de 3

Pertussis) utilizando: S1P (100 nM), FTY720-P (FTY720-P) ou (R)-AFD (a forma fosforilada de (R)-AAL) nas concentrações indicadas. A Figura 6 mostra uma transferência de Western de fosfo-Akt, Akt total, fosfo-ERK-1/2 e niveis de ERK-1/2 total em HUVEC após estimulação de 5 minutos com S1P, FTY720-P (FTY720-P), FTY720 (FTY), (R)-AFD ou (R)-AAL nas concentrações indicadas. A Figura 7 mostra uma transferência de Western demonstrando que o tratamento com a toxina de Pertussis previne fosforilação de Akt e ERK-1/2 por S1P, FTY720-P (FTY720-P) e (R)-AFD. A Figura 8 mostra um estudo dos efeitos de FTY720-P na apoptose, através da medição da percentagem de fragmentação de ADN após incorporação de {metil-3H}-timidina em células HUVEC. A Figura 9 é um ensaio de fragmentação de ADN mostrando que o tratamento com toxina de Pertussis elimina o efeito protector de S1P, FTY720-P e (R)-AFD na apoptose. A Figura 10 é um ensaio de imunof luorescência no qual C: controlo de veiculo, S1P: 100 nM S1P, FTY: 10 nM FTY720, FTY720-P: 10 nM FTY720-P, AAL: 10 nM (R)-AAL, AFD: 10 nM (R)-AFD. Barra de escala = 50 pm. A Figura 11 é um gráfico do decorrer do tempo da permeabilidade paracelular induzida por VEGF: VEGF:20 ng/mL, FTY720-P: 100 nM FTY720-P. 4 A Figura 12 é um gráfico demonstrando que 100 nM S1P (S1P), 100 nM FTY720-P (FTY720-P) e 100 nM (R)-AFD ((R)-AFD) inibem a permeabilidade paracelular induzida por VEGF. A Figura 13 mostra imagens de fluorescência de um ensaio de permeabilidade microvascular de orelha de murganho. A Figura 14 mostra a quantificação de fluorescência extravascular na orelha.

DESCRIÇÃO DETALHADA FTY720 é um potente imunomodulador que mostrou efeitos em modelos animais de transplante de órgão como mostrado nas Patentes U.S. N° 6486209; 6476004; 6471980; 6372800; 6274629; 6187821; 6004565; e 5948820 que são aqui incorporados por referência. O mecanismo de acção deste composto demonstrou, recentemente, incluir fosforilação em FTY720-P, que é um agonista para quatro dos cinco receptores S1P em linfócitos T. Foi demonstrado previamente que FTY720 é um potente modulador de tráfico de linfócitos, todavia, o efeito de FTY720 nos elementos vasculares era previamente desconhecido. É aqui demonstrado que as células endoteliais vasculares contêm sistemas enzimáticos para "activar" FTY720 e os seus análogos. As células endoteliais cultivadas, tal como as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), são aceites em sistemas de modelo in vitro para estudar a angiogénese. Após incubação com HUVEC em meio condicionado ou extractos celulares, FTY720 é fosforilado e é capaz de activar as células endoteliais para migrarem de um modo sensível à toxina de pertussis, 5 sugerindo que está a activar os receptores S1P acoplados a Gí. É aqui mostrado que a cinase 2 da esfingosina derivada de células endoteliais (SK2) está envolvida no metabolismo de FTY720 em FTY720-P. É também aqui mostrado que FTY720-P e o seu análogo (R)-AFD activam receptores S1P vasculares e estimulam as vias de sinalização, de um modo semelhante a S1P. Estes eventos resultam na inibição da apoptose de células endoteliais que ocorre em vários estados patológicos nos quais o sistema celular é submetido a stresse. Outro efeito fisiologicamente relevante de agonistas do receptor S1P é a indução de montagem da junção de aderência em células endoteliais. É também mostrado que a translocação de VE-caderina é induzida após estimulação de S1P, FTY720-P e (R)-AFD. As moléculas de junção célula-célula são um alvo importante de mediadores que regulam a permeabilidade vascular. S1P, FTY720-P e (R)-AFD podem bloquear a permeabilidade paracelular induzida por VEGF in vitro e a permeabilidade vascular induzida por VEGF in vivo. A indução da montagem da junção de aderência em células endoteliais por FTY720-P e (R)-AFD pode possuir duas aplicações importantes in vivo. Por um lado, pode ser uma parte do mecanismo de acção de FTY720. FTY720 pode prevenir a regressão de linfócitos no sino linfático através da regulação das junções célula-célula no endotélio que forra o sino. De facto, FTY720-P inibe a migração induzida por quimiocinas de linfócitos, através de uma mono camada de células endoteliais in vitro. Por outro lado, FTY720 pode ser capaz de inibir a permeabilidade vascular em situações vasculopáticas agudas, tal como o síndrome do distúrbio respiratório que ocorre como uma complicação de sepsia. Adicionalmente, as alterações a longo termo na permeabilidade vascular é um cunho da lesão celular endotelial e pode conduzir 6 a doenças crónicas comuns à doença cardiovascular isquémica e distúrbios vasculares periféricos associados a diabetes. FTY720-P é um modificador potente do sistema vascular e que pode ser utilizado como um protector da integridade das células endoteliais em situações em que está comprometida. A presente invenção refere-se, por isso, à utilização de álcoois 1,2-amino particulares no fabrico de um medicamento para a inibição de apoptose de células endoteliais vasculares. Estes agonistas de receptores S1P endoteliais vasculares ou uma sua forma farmaceuticamente aceitável, pode ser utilizada para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio ou estado de resposta a um agonista de um receptor S1P endotelial vascular. Receptores S1P endoteliais vasculares adequados incluem, por exemplo, SlPi, SIP2, SIP3, SIP4, S1P5, e combinações compreendendo um ou mais dos receptores precedentes. Numa forma de realização, os receptores S1P incluem SlPi, SIP3, e suas combinações. 0 agonista de um receptor S1P endotelial vascular pode ser um sal f armaceut icamente aceitável e/ou ser fosforilado por uma enzima esfingosina-cinase 2.

Os agonistas dos receptores S1P endoteliais vasculares são 1,2-aminoálcoois particulares (definidos abaixo na fórmula(I)), os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, as suas formas fosforiladas e combinações compreendendo um ou mais dos agonistas precedentes. "Formas farmaceuticamente aceitáveis" dos agonistas dos receptores S1P endoteliais vasculares aqui recitados incluem sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos, solvatos, formas de cristal, polimorfos, quelatos, complexos não covalentes, ésteres, clatratos, pró-fármacos, e misturas desses compostos. 7

Os sais farmaceuticamente aceitáveis são uma forma farmaceuticamente aceitável adequada. "Sais farmaceuticamente aceitáveis" incluem derivados dos agonistas de receptores S1P endoteliais vasculares, em que o composto parental é modificado produzindo os seus sais de ácido ou base não tóxicos e referem-se, ainda, a solvatos farmaceuticamente aceitáveis desses compostos e desses sais. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a sais de ácido mineral ou orgânico de resíduos básicos, tal como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos acídicos, tal como ácidos carboxílicos; e semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais e os sais de amónia quaternária do composto parental formado, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, sais de ácido não tóxico convencional incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos, tais como clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e semelhantes; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos, tais como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicílico, mesílico, esílico, besílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzóico, fumárico, toluenossulfónico, metanossulfónico, etanodissulfónico, oxálico, isetiónico, HOOC-(CH2) n-COOH, em que n é 0-4, e semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser sintetizados a partir de um composto parental, uma unidade básica ou acídica, através de métodos químicos convencionais. De um modo geral, esses sais podem ser preparados fazendo reagir formas de ácido livre destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base apropriada (tais como hidróxido, carbonato ou bicarbonato de Na, Ca, Mg, ou 8 K, ou semelhantes), ou reagindo formas de base livre destes compostos com uma quantidade estequiométrica do ácido apropriado. Essas reacções são tipicamente realizadas em água ou num solvente orgânico ou numa mistura dos dois. De um modo geral, são preferidos meios não aquosos, tais como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol ou acetonitrilo, quando praticável. Listas de sais adicionais adequados podem ser encontrados, e. g., em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., p. 1418 (1985).

Os 1,2-aminoálcoois possuem uma fórmula FL, ÇH2OR3 N— Ç—CH2(0)nR3

Rs H2C-R1 φ em que Ri é uma cadeia de carbono substituída ou não substituída, linear ou ramificada possuindo 12 a 22 átomos de carbono que pode ser opcionalmente interrompido por um fenileno substituído ou não substituído ou fenoxilo; cada de R2, R3, R4 e R5, independentemente, é hidrogénio ou alquilo Ci-6; e n é 0 ou 1. Numa forma de realização, os compostos de fórmula I são aqueles em que Ri é um alquilo de cadeia linear ou ramificada possuindo 13 a 20 átomos de carbono, opcionalmente substituída por nitro, halogéneo, amino, hidroxilo ou ácido carboxílico e, de um modo mais preferido, aqueles em que Ri é (fenil) alquil- em que o fenilo é substituído por um alquilo C6-14 linear ou ramificado ou cadeia alcoxilo C6-14 opcionalmente substituído por halogéneo e a unidade alquilo é um alquilo Ci_6 opcionalmente substituído por hidroxilo. Numa forma de realização, Ri é (fenil) alquilo Ci_6 substituído no fenilo por uma cadeia alquilo C6_i4 ou alcoxilo 9 C6-i4 linear ou ramificada. A cadeia alquilo C6~i4 pode estar na posição orto, meta ou para. Numa forma de realização, cada de R2 a R5 é hidrogénio.

Como aqui utilizado, opcionalmente interrompido significa que uma cadeia alquilo pode ser interposta em qualquer ponto na cadeia alquilo. Ver, por exemplo, a formula 2. Um traço que não está entre duas letras ou símbolos é utilizado para indicar um ponto de ligação a um substituinte. Por exemplo, (fenil)alquil- é ligado através do átomo de carbono do grupo alquilo.

Como aqui utilizado, "alquilo" pretende incluir grupos hidrocarboneto alifáticos saturados de cadeia ramificada ou linear, possuindo o número especificado de átomos de carbono. Assim, o termo alquilo C1-C6, como aqui utilizado inclui grupos alquilo possuindo desde 1 até 6 átomos de carbono. Quando o alquilo Co-Cn é aqui utilizado em conjunto com outro grupo, por exemplo, (fenil)alquilo C0-C4, o grupo indicado, neste caso fenilo, está directamente ligado por uma única ligação covalente (Co) ou ligado por uma cadeia alquilo possuindo o número de átomos de carbono especificado, neste caso de 1 a cerca de 4 átomos de carbono. Exemplos de alquilo incluem, mas não estão limitados a metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo e sec-pentilo. Grupos alquilo preferidos são grupos alquilo inferior, os grupos alquilo possuindo de 1 a cerca de 8 átomos de carbono, e. g., grupos alquilo Ci-C8 e Ci-C6.

Os derivados de 1,2-aminoálcool podem possuir um ou mais centros quirais. Como resultado, pode preparar-se selectivamente um isómero óptico, incluindo diastereómeros e enantiómeros, em relação a outro, por exemplo, por materiais de partida quirais, 10 catalisadores ou solventes, ou podem preparar ambos os estereoisómeros ou ambos os isómeros ópticos, incluindo os diastereómeros e os enantiómeros em simultâneo (uma mistura racémica). Uma vez que os compostos podem existir como misturas racémicas, misturas de isómeros ópticos, incluindo diastereómeros e enantiómeros, ou estereoisómeros podem ser separados utilizando métodos conhecidos, tais como através da utilização de, por exemplo, sais quirais e cromatografia quiral.

Adicionalmente, é reconhecido que um isómero óptico, incluindo a diastereómero e enantiómero, ou um estereoisómero, pode possuir propriedades favoráveis em relação ao outro. Quando é aqui discutida uma mistura racémica, é claramente contemplado que incluirá ambos os isómeros ópticos, incluindo diastereómeros e enantiómeros, ou um estereoisómero substancialmente livre do outro.

Compostos adequados de Fórmula 1 incluem 2-amino-2-[2-(4-octafenil)etil]propan-1,3-diol, também conhecido como FTY720 (Fórmula II) e um derivado de FTY720 no qual um substituinte hidroximetileno é substituído por um grupo metilo também conhecido como AAL ou 2-amino-2-metil-4-[4-heptoxifenil]butan-1-ol (Fórmula III).

OH

(Π) 11

In vivo, FTY-720 e AAL pode ser fosforilado por cinases endógenas, tal como, por exemplo, a cinase SK2, para produzir compostos das fórmulas (IV) (FTY720-P ou 2-amino-3-fosfato-2-[2-4-octafenil)etil]propan-l-ol) e (V) ((R)-AFD ou ácido 2-amino-2-metil-4-[4-heptoxifenil]1-difosfórico), respectivamente. o

0 agonista do receptor da esfingosina-l-fosfato endotelial vascular pode ser 2-amino-2-[2-(4-octafenil)etil]propan-1,3-diol; 2-amino-2-metil-4-[4-heptoxifenil]butan-l-ol; 2-amino-3- 12 ácido fosfato-2-[2-4-octafenil)etil]propan-l-ol; ácido metil-4-[4-heptoxi-fenil)1-difosfórico; ou uma compreendendo um ou mais dos agonistas precedentes. 2-amino-2- combinação A invenção também inclui utilizações desses 1,2-aminoálcoois no fabrico de um medicamento para o tratamento de apoptose de células endoteliais vasculares indesejada, tal como um distúrbio relacionado com a apoptose. Um agonista de um receptor S1P vascular endotelial pode ser administrado numa quantidade eficaz. A apoptose não desejada não está relacionada com a rejeição do transplante. A apoptose é uma série cuidadosamente controlada de eventos celulares que por último conduz à morte da célula. As características morfológicas da apoptose incluem encolhimento celular e perda de contacto célula-célula, condensação de cromatina nuclear seguido por fragmentação, o surgimento de pregueamento da membrana, formação de bolas na membrana e corpos apoptóticos. No final do processo, as células vizinhas e os macrófagos fagocitam os fragmentos da célula apoptótica. 0 evento bioquímico melhor definido da apoptose envolve a destruição ordeira de ADN nuclear. Os sinais para a apoptose promovem a activação de endonucleases dependentes de cálcio e magnésio específicas que clivam o ADN de cadeia dupla nas regiões ligantes entre os nucleossomas. Este processo resulta na produção de fragmentos de ADN que são múltiplos de fragmentos de cerca de 180 a cerca de 200 pares de bases. A desregulação da apoptose pode desempenhar um papel importante nos estados de doença e as doenças podem ser provocadas pela ocorrência de apoptose excessiva ou muito pouca. Um exemplo de uma doença associada com apoptose muito pequena pode ser determinados cancros. Exemplos de doenças relacionadas com a apoptose, relacionadas com apoptose excessiva ou 13 inapropriada incluem doença isquémica (excluindo lesão de reperfusão), trombose periférica, doença neurodegenerativa, lesão no nervo periférico, anemia aplástica, lesão hepática e infecção com HIV. Além disso, a apoptose endotelial é um cunho da terapia de radiação que é utilizada para tratar tumores. Os agonistas de receptor S1P podem ser úteis para tratar doentes que se submetem a terapia de radiação para proteger função vascular. A apoptose é uma causa principal subjacente da morte celular na falência cardiaca. Exemplos das doenças isquémicas incluem doença cardiaca, tal como cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia induzida por fármacos (e. g., adriamicina) ou por alcolismo crónico, cardiomiopatia familiar, miocardite virai ou cardiomiopatia, enfarte cardíaco, angina cardíaca, falência congestiva do coração e arritmia, e doenças cerebrovasculares, tais como derrame cerebral, hemorragia subaracnoidal, enfarte cerebral e trombose cerebral. A apoptose está também relacionada com várias doenças neurodegenerativas. Exemplos dessas doenças neurodegenerativas incluem doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrópica e resinite pigmentosa. A utilização de um agonista do receptor S1P endotelial vascular pode permitir a reparação da lesão vascular que induz a lesão neuronal.

As dosagens diárias para administração dos agonistas do receptor S1P endotelial vascular irão variar dependendo de, por exemplo, o agonista empregue, o hospedeiro, o modo de administração e a gravidade do estado a ser tratado. Uma dosagem diária adequada é de cerca de 0,01 a cerca de 10 miligramas por 14 quilograma (mg/kg) por dia ou cerca de 0,1 a cerca de 2,5 mg/kg por dia, como uma dose única ou em doses divididas. As formas de dosagem unitária adequadas para administração oral compreendem cerca de 1 a cerca de 100 mg ou cerca de 5 a cerca de 50 mg de ingrediente activo, e. g., FTY720, juntamente com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Como uma alternativa, o agonista pode ser administrado na forma livre ou na forma de sal farmaceuticamente aceitável pode também ser administrado duas ou três vezes por semana, e. g., a uma dosagem como indicado acima.

Composições farmacêuticas compreendendo os agonistas do receptor S1P endotelial vascular podem compreender os agentes farmacológicos adicionais utilizados no tratamento de distúrbios que se referem à permeabilidade vascular e apoptose de células endoteliais vasculares. Os agentes farmacológicos adicionais adequados incluem, por exemplo, agentes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos, hormonas, fármacos anti-inflamatórios esteróides (e. g., prednisona, corticosteróides, e semelhantes), fármacos anti-inflamatórios não esteróides (e. g., NSAID, aspirina, acetaminofeno, e semelhantes); e combinações compreendendo um ou mais dos agentes farmacológicos adicionais precedentes.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas utilizando um ou mais veículos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. Assim, os compostos e os seus sais e solvatos fisiologicamente aceitáveis podem ser formulados para administração por inalação ou insuflação (quer através da boca ou do nariz) ou administração oral, bocal, parentérica ou rectal. 15

Para administração oral, as composições farmacêuticas podem tomar a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparadas por meios conhecidos na técnica com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ligação (e. g., amido de milho pré-gelatinizado, polivinil-pirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose) ; agentes de enchimento (e. g., lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); lubrificantes (e. g., estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (e. g., amido de batata ou glicolato de amido de sódio); agentes humidificantes (e. g., sulfato de lauril de sódio) ; e combinações compreendendo um ou mais dos excipientes precedentes. Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na técnica. As preparações líquidas para administração oral podem tomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou podem ser apresentados como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Essas preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de suspensão (e. g., xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas alimentares); agentes de emulsificação (e. g., lecitina ou acácia); veículos não aquosos (e. g., óleo de amêndoas, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fraccionados); conservantes (e. g., metil ou propil-p- hidroxibenzoatos ou ácido sórbico); e combinações compreendendo um ou mais dos aditivos precedentes. As preparações podem também conter sais de tampão, agentes aromatizantes, corantes e adoçantes, como apropriado.

As preparações para administração oral podem ser formuladas adequadamente para produzir a libertação controlada do composto activo. Para a administração bucal, as composições podem tomar a 16 forma de comprimidos ou pastilhas formuladas através de técnicas conhecidas na técnica. Para administração por inalação, os compostos são convenientemente distribuídos na forma de uma apresentação de sistema de aspersão de aerossol a partir de pacotes pressurizados ou um nebulizador, com a utilização de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para distribuir uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para utilização num inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada, tal como lactose ou amido. Os compostos podem ser formulados para administração parentérica através de injecção, por exemplo, por injecção de bolus ou infusão contínua. As formulações para injecção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multi-dose, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente activo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril sem pirogénio, antes da utilização. Os compostos podem também ser formulados em composições rectais, tais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases de supositório convencionais, tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos. Além disso às formulações descritas previamente, os compostos também podem ser formulados como uma preparação do depósito. Essas formulações de actividade prolongada podem ser administradas através de implantação (por 17 exemplo subcutaneamente ou intramuscularmente) ou através de injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de permuta iónica ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

Dado que a cinase SK2 fosforila FTY720 in vitro e in vivo, a medição do nível de cinase SK2 num indivíduo pode ser utilizada para prever a eficiência de um agonista de receptor S1P endotelial vascular no tratamento da doença. Por exemplo, este teste pode ser utilizado para prever se um dado indivíduo é um candidato para terapia com FTY720. Alternativamente, se um indivíduo possui um nível baixo de cinase SK2, os compostos preferidos para administração podem ser uma forma fosforilada de um agonista de receptor S1P endotelial vascular ou outro agonista de receptor S1P com uma estrutura química diferente. A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS MÉTODOS GERAIS

Reagentes. Albumina de soro sem ácido gordo (ffa-BSA), 4-desoxipiridoxina e β-glicerofosfato, isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (PM médio =2000 quilodaltons (kDa) e 165 kDa) foram adquiridos a Sigma Chemical Co. Esfingosina, N,N-dimetilesfingosina (DMS) e S1P foram adquiridos a Biomol

Research Laboratories, Inc. (Plymouth Meeting, PA). {γ-32Ρ}ΑΤΡ 18 (actividade específica 6000 Ci/mmol) e {metil-3H}-timidina (actividade específica 86 Ci/mmol) foram da Amersham. FTY720, fosfo FTY720, (S)-AAL, (R)-AAL e fosfo-(R)-AAL foram fornecidos pelo Dr. V. Brinkmann, Novartis. Os anticorpos fosfo-Akt, Akt, fosfo-ERKl/2 e ERK-1/2 vieram de Cell Signaling Tech., e o anticorpo VE-caderina foi de Santa Cruz Biotech. A clonagem de ADNc de SK1 e SK2 de murino. Foi utilizado ARN de fígado de murganho (Ambion) para amplificar um ADNc de cinase de espingosina de murino (SKI e SK2) por transcrição reversa-PCR com os iniciadores em sentido directo SEQ ID N°:l (AGC CCC ATG TGG TGG TGT TGT) e SEQ ID N°:2 (ATT ATG GCC CCA CCA CCA CTA CT), respectivamente e os iniciadores reversos SEQ ID N°:3 (GGC ACA GAG TTA TGG TTC TTC) e SEQ ID N°:4 (AGG TCA GGC TTG TGG CTT TTG AC), respectivamente. O produto de PCR resultante foi clonado no vector pcDNA3.1 Topo vector (Invitrogen) e a sequência de ADN foi confirmada. Os ADNc de SKI e SK2 foram então clonados no vector de expressão em eucariotas pcDNA3.1 (Invitrogen).

Cultura de Células e transfecção. Foram cultivadas HUVEC (Clonetics, p4-ll) em meio M199 suplementado com 10% de soro de bovino fetal (FBS) e factor de crescimento celular endotelial estabilizado com heparina. As células 293T em placas de 60 mm foram transfectadas com 4 microgramas (yg) de vector isolado ou com vectores contendo construções de SK pelo método de fosfato de cálcio. As células foram recolhidas 24 horas após a transfecção, por raspagem a 4 °C com 400 microlitros (yL) de 25 milimolar (mM) de HEPES pH 7,5, 5 mM MgCl2, lx mistura de inibidor de protease (Calbiochem) e rebentadas por sonicação curta. Os homogenatos celulares foram centrifugados durante 10 minutos, a 4 °C a 20 000 x g. 19

Análise estatística. Todas as experiências foram realizadas duas a cinco vezes e é apresentada uma experiência representativa. Nas experiências de migração e apoptose, os resultados representam valores médios de triplicados. Os valores de P foram calculados pelo teste t de Student, utilizando Microsoft Excel software. EXEMPLO 1: Fosforilaçao de FTY720 por cinases de esfingosina em células endoteliais vasculares

Uma vez que S1P é um potente indutor de quimiotaxia da célula, foi testado o efeito de FTY720 e seus análogos na migração da célula endotelial. A migração HUVEC foi ensaiada utilizando uma microcâmara de quimiotaxia de 96 poços (Neuro Probe, Inc.) (Paik, J.H. et al. J Biol Chem 276:11830-11837 (2001)). Resumidamente, filtros de policarbonato com um tamanho de poro de 8 micrómetros (pm) foram revestidos com 5 microgramas por mililitro (pg/mL) de fibronectina. Os S1P, FTY720, AAL, FTY720-P ou (R)-AFD foram diluídos em 0,1% de ffa-BSA na concentração apropriada. 85 pL das soluções ou do meio condicionado de HUVEC foram adicionados à câmara inferior. Aproximadamente 5 x 104 células suspendidas em M199 com 0,1% de albumina do soro de bovino foram plaqueadas no compartimento superior. As células foram deixadas migrar durante 4 horas a 37 °C numa câmara humidificada com 5% de CO2. Após o período de incubação, o filtro foi removido e as células foram coradas em violeta de cristal e eluídas com 10% de ácido acético em placas de 96 poços. A quantificação foi efectuada com base na absorvência a 575 nanómetros (nm) por um leitor de placas Spectramax 340 (Molecular Devices). 20 A activação de FTY720 e (R)-AAL por células endoteliais foi efectuada pela lavagem das células três vezes com meio simples M199 e incubando com 0,1% de BSA isenta de ácidos gordos contendo diferentes concentrações de FTY720 ou (R)-AAL durante três horas.

Após incubação, o meio condicionado foi removido, centrifugado a 1000 x g durante 10 minutos e utilizado no ensaio de migração. A Figura 1 mostra os resultados de uma experiência de migração com HUVEC (barras brancas: controlo, barras pretas: tratamento com toxina de Pertussis) utilizando os seguintes quimioatractivos: S1P (100 nanomolar (nM), concentrações variáveis de FTY720 (FTY) e AAL, meio condicionado de células endoteliais após uma incubação de 3 horas com as concentrações indicadas de FTY720 (FTY), (R)-AAL ou (S)-AAL. Dados = média ± SE de valores triplicados de uma experiência representativa repetida três vezes (N=3). *p<0,01 vs. veículo de controlo, #p<0,01 vs Células sem toxina de Pertussis.

Nem FTY720 nem o seu análogo estrutural (R)-AAL induziu a migração da célula endotelial num vasto intervalo de concentração (Figura 1). Contudo, quando FTY720 ou (R)-AAL foram incubados com HUVEC durante 3 horas, estes foram activados em potentes quimioatractivos para células endoteliais. Esta migração induzida pelo meio condicionado foi dependente da dose e sensível à toxina de Pertussis, indicando o envolvimento de um receptor acoplado a Gi. Em contraste, o enantiómero (S)-AAL, que não pode ser fosforilado pela cinase da esfingosina (SK), não induz migração após incubação com células endoteliais. Estes dados são consistentes com a hipótese de que as células 21 endoteliais fosforilam e activam FTY720 e (R)-AAL nos seus derivados fosforilados que são quimioatractivos para células endoteliais. A presença dos transcritos SK1 e SK2 foi detectada em células HUVEC por RT-PCR utilizando os iniciadores SEQ ID N0:1-4; TGGAGTATGAATGCCCCTAC, CGCTAACCATCAATTCCCC, para SK1 e GATCACCCCTGACCTGCTAC, GGCATCTTCACAGCTTCCTC para SK2 (dados não apresentados).

De modo a explorar ainda mais a possibilidade de que SK1 e SK2 estão envolvidos na fosforilação de FTY720, DMS, um inibidor SK, foi testado para o bloqueio da conversão de FTY720 e (R)-AAL em formas activas. A Figura 2 mostra os resultados de uma experiência de migração com HUVEC utilizando: S1P (100 nM) ou meio condicionado de células endoteliais, após 3 horas de incubação com 100 nM de FTY720 (FTY) ou 100 nM de (R)-AAL, na ausência (barras brancas) ou presença (barras pretas) de 10 μΜ de DMS. *p<0,01, DMS vs veículo de controlo. O tratamento com DMS (10 μΜ) inibiu potentemente a capacidade das células endoteliais activarem FTY720 e (R)-AAL (Figura 2). Estes resultados sugerem que a actividade de SK presente em HUVEC foi capaz de fosforilar e activar FTY720 e (R)-AAL.

EXEMPLO 2: Confirmação da fosforilaçao de FTY720 e R-AAL

Para confirmar que FTY720 e (R)-AAL são fosforilados por células endoteliais, um ensaio de cinase in vitro foi efectuado com extracto celular total e meio condicionado de HUVEC. As células foram lavadas três vezes com meio simples M199 e incubadas com 0,1% de ffa-BSA para as vezes indicadas. Após incubação, o meio condicionado foi removido, centrifugado a 1000 x g durante 10 minutos e utilizado para o ensaio de 22 actividade de cinase. As células foram raspadas a 4 °C com 400 pL de 25 mM de HEPES pH 7,5, 5 mM de MgCl2, lx mistura de inibidores de protease e rebentadas por sonicação breve. Os homogenados celulares foram centrifugados durante 10 minutos, a 4 °C a 20000 x g. No ensaio de cinase, 300 pL de meio condicionado (derivado de 5 xlO5 células durante 3 horas de incubação) ou 10 pg de extracto celular total de HUVEC foram utilizados como uma fonte de actividade de cinase. As reacções continham 20 pM de esfingosina ou 100 pM de FTY720 ou AAL, [γ-32Ρ]ΑΤΡ (10 pCi), 5 mM de MgCl2, 15 mM de NaF, 0,5 mM de 4-desoxipiridoxina, 40 mM de -glicerofosfato e 300 pL de M199 e foram incubados a 37 °C, durante 30 minutos. Os lípidos foram extraídos e as amostras foram ressuspensas em 50 pL de clorofórmio. Os lípidos foram resolvidos por TLC em Sílica Gel G60 utilizando tampão 1-butanol/ácido acético/água (60/20/20 volume/volume) e quantificados com um Phosphorlmager (Molecular Dynamics).

Como mostrado na Figura 3, FTY720 e (R)-AAL foram fosforilados pela actividade de cinase presente em HUVEC (Figura 3, painel superior, actividade específica 3,85±0,75 e 15±0,93 picomol por miligrama por minuto, respectivamente). Como previsto, a esfingosina foi um substrato eficiente para esta actividade de cinase (actividade específica 75,7±6 (picomoles por miligrama por minuto (pmol/mg/min)). Em contraste, a fosforilação de (S)-AAL foi indetectável, de acordo com os resultados obtidos com o ensaio de migração. A fosforilação de FTY720 e (R)-AAL foi inibida por DMS (50 pM) . Do mesmo modo, a actividade de cinase foi detectada no meio condicionado de HUVEC (Figura 3, painel inferior) e foi inibido por Triton X-100 e aumentado por KC1 (200 mM) (dados não mostrados), que são condições que favorecem a actividade enzimática de SK. 23

EXEMPLO 3: Confirmação do papel de SK2 na fosforilaçao de FTY720 e (R)-AAL

De modo a confirmar o papel de SK2 na fosforilação de FTY720 e (R)-AAL, as células HEK293T foram transientemente transfectadas com um vector de expressão pcDNA3.1/Neo contendo ADNc de SK1 ou SK2, e verificadas para fosforilação de FTY720, (R)-AAL e (S)-AAL. A Figura 4 mostra uma autorradiografia de TLC de um ensaio de cinase in vitro conduzido com extractos de células 293T de controlo da Vector (2931), a sobre-expressão de SK1 em células 293T (SK1-293T) e a sobre-expressão de SK2 em células 293T (SK2-293T). Veiculo de controlo = (C) , 100 μΜ de FTY720 = (F), 100 μΜ de (R)-AAL = (R) , 100 μΜ de (S)-AAL = (S) ou 20 μΜ de esfingosina = (SG) são utilizados como substratos. Foi incluído 50 μΜ de DMS quando indicado ( + ) . É mostrada uma experiência representativa de N=3-5. O número de vezes de indução de actividade específica de SK1-293T (barras brancas) e SK2-293T (barras pretas) vs 293T transfectadas com vector é mostrado no painel inferior. As setas indicam o composto fosforilado.

Os níveis modestos de actividade endógena da cinase da esfingosina foram detectados em células transfectadas por vectores (Figura 4). Os extractos celulares de SK1 apresentam actividades de cinase FTY720 ou (R)-AAL semelhantes à das células 293T de controlo enquanto a fosforilação da esfingosina foi significativamente aumentada em células SK1-293T (actividade específica de 48,1 pmol/mg/min vs 10,5 em 293T, Figura 4). Contudo as células SK2-293T mostraram actividade de cinase de FTY720 e (R)-AAL aumentada versus as células 293T de controlo (indução de 3,7 e 7 vezes, respectivamente). A actividade específica em SK2-293T foi de 41,6, 199,5 e 319,9 pmol/min/mg 24 para FTY720, (R)-AAL e esfingosina, respectivamente. A fosforilação de (S)-AAL por células 293T, SK1-293T e SK2-293T foi dificilmente detectada. A actividade de FTY720, (R)-AAL e cinase da esfingosina foi bloqueada pela incubação com DMS (50 μΜ) . Estes resultados sugerem um papel para SK2 na fosforilação de FTY720 e (R)-AAL e, deste modo, na activação destes compostos em agonistas do receptor S1P. Além disso, os resultados indicam que as HUVEC foram capazes de fosforilar e activar FTY720 e (R)-AAL presentes no meio extracelular. EXEMPLO 4: Efeitos de FTY720-P nas respostas das células endoteliais

Os efeitos de FTY720-P e o seu análogo (R)-AFD foram estudados em HUVEC. Na Figura 5, Dados = media ± SE de triplicados. N=3. *p<0,01, tratamentos vs veiculo de controlo, #p<0,01 vs Células sem toxina de Pertussis. FTY720-P e (R)-AFD foram potentes quimioatractivos para HUVEC (Figura 5). Ambos apresentaram o seu efeito máximo a 10 nM (indução de 13 e 9 vezes, respectivamente), embora S1P fosse ligeiramente mais potente (indução de 14 vezes). A migração induzida por FTY720-P e (R)-AFD foi bloqueada pela toxina de Pertussis (200 ng/mL), indicando que é um efeito mediado pela via do Gi heterotrimérico. A morfogénese da célula endotelial, um fenómeno que requer a migração, sobrevivência e junção de aderência da célula endotelial, é mediada pela activação dependente do ligando dos receptores SlPi e S1P3. Verificou-se que S1P induzia a fosforilação da cinase de proteína Akt e da cinase de proteína ERK em células endoteliais e a fosforilação mediada por Akt do receptor SlPi/EDG-1 é necessária para a migração induzida por 25 S1P. Os feitos de FTY720-P e análogos na fosforilação de Akt e ERK em HUVEC foram estudados numa análise de transferência de Western. As culturas confluentes de células HUVEC foram colocadas em jejum de soro, durante duas horas, em 0,1% ffa-BSA M199 antes dos tratamentos. Depois, estas foram lavadas com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) arrefecido em gelo contendo 1 mM de fluoreto de sódio e 1 mM de ortovanadato de sódio e homogeneizadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de NP-40, 1 mM de ortovanadato de sódio, 50 mM de β-glicerofosfato e lx mistura de inibidores de proteases) . As amostras foram centrifugadas a 10000 x g durante 10 minutos e as concentrações de proteína dos sobrenadantes foram determinados pelo ensaio de Bradford (BioRad Protein Dye Reagent). Quantidades iguais de proteína foram separadas num gel a 10% de poliacrilamida e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A análise de imunotransferência foi efectuada utilizando anticorpos Fosfo-Akt, Akt, fosfo-ERKl/2 ou ERK-1/2.

Ambos FTY720-P e (R)-AFD induziram um aumento em Akt (3,7 e 4,5 vezes a 100 nM, respectivamente, Figura 6) e ERK-1/2 (9,3 e 8,2 vezes a 100 nM, respectivamente, Figura 6) níveis de fosforilação após 5 minutos. A duração em tempo desta fosforilação foi semelhante para FTY720-P, (R)-AFD e S1P, sendo os niveis máximos de fosforilação conseguidos após uma estimulação de 5 minutos (dados não mostrados). O efeito de FTY720-P e (R)-AFD em Akt e a fosforilação de ERK foi dependente da dose (dados não mostrados) e a extensão da fosforilação induzida por FTY720-P e (R)-AFD foi superior à induzida por S1P. Contudo, os derivados não fosforilados, FTY720 ou AAL, não induzem níveis de fosfo-Akt ou fosfo-ERK-1/2 em células 26 endoteliais. A fosforilação de Akt e ERK-1 e ERK-2 por S1P, FTY720-P e (R)-AFD foi bloqueada por incubação com a toxina de Pertussis (Figura 7), indicando o envolvimento de um receptor acoplado a Gi. EXEMPLO 5: Efeito de FTY720-P e (R)-AFD na apoptose

Uma vez que a activação de ERK-1 e ERK-2 é necessária para o efeito de sobrevivência de S1P em células endoteliais, foi testado se o FTY720-P e o seu análogo (R)-AFD pode apresentar apoptose induzida por escassez de soro em HUVEC. Neste teste, células HUVEC foram marcadas com {metil-3H}-timidina (1 pCi/mL) durante 16 horas. Depois, estas foram lavadas e foi adicionado 0,1% de ffa-BSA M199 contendo os diferentes tratamentos. Após 8 horas, o ADN fragmentado foi solubilizado e quantificado como descrito.

Os resultados são mostrados nas Figuras 8 e 9. FTY720-P e (R)-AFD protegeram significativamente as células da apoptose de uma forma dependente da dose (Figura 8), com um efeito máximo em concentrações extremamente baixas - 10 nM (-70% de inibição da fragmentação do ADN). Uma inibição semelhante da fragmentação de ADN foi observada com tratamento com S1P mas a uma concentração mais elevada (1 μΜ). Os efeitos anti-apoptóticos de S1P, FTY720-P e (R)-AFD foram também bloqueados por tratamento com a toxina de Pertussis (Figura 9), indicando que a sinalização através de G± foi crucial. 27 EXEMPLO 6: FTY720-P modula a montagem de junção de aderência e a permeabilidade in vitro

Foi avaliado o efeito de FTY720-P e (R)-AFD na montagem de caderina VE, que é necessário para formar junções de aderência, estruturas subcelulares criticas na morfogénese da célula endotelial e permeabilidade. As caderinas são uma família de moléculas de adesão celular que estão envolvidas na formação de contactos específicos célula-célula. Verificou-se que a caderina VE (ou caderina-5) estava localizada nas junções intercelulares (junções de aderência) nos contactos célula-célula. Várias observações experimentais sugerem que esta caderina está envolvida nos vários aspectos da biologia vascular relacionados com a angiogénese, incluindo a montagem de células endoteliais em estruturas tubulares.

Os efeitos de FTY720-P e (R)-AFD na localização da caderina VE foram estudados utilizando análise de imunofluorescência. Neste estudo, foram plaqueadas 2xl05 células em placas de Petri de fundo de vidro de 35 milímetros. Três dias depois, as células foram lavadas e colocadas em jejum de soro durante 3 horas antes dos tratamentos. Depois, as células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, fixas, e foi conduzida a análise de imunofluorescência com anticorpo contra a caderina VE (1 pg/mL de Santa Cruz). A coloração com o anticorpo primário foi visualizada com anti-IgG de murganho de cabra conjugado com Rodamina (1:1000, Cappel). A microscopia confocal foi conduzida num microscópio confocal de varrimento laser Zeiss LSM 510. A fluorescência de rodamina foi excitada utilizando um laser de Hélio/Néon de 543 nm e a fluorescência emitida foi detectada com um filtro de passagem longa de 530 nm. 28 0 tratamento de HUVEC com FTY720-P e (R)-AFD durante 30 minutos resultou num aumento na localização da caderina VE nas regiões de contacto célula-célula (Figura 10). Este efeito foi comparável ao observado para S1P. Contudo, os precursores FTY não fosforilados e (R)-AAL não induziram a translocação da caderina VE nas junções de aderência. Estes resultados indicam que FTY720-P e (R)-AFD actuam nos receptores vasculares S1P para induzir a montagem das junções de aderência nas células endoteliais. Vários estudos mostraram que a caderina VE pode ser um importante determinante de permeabilidade vascular. A fosforilação da tirosina induzida por VEGF na caderina VE resultou em permeabilidade vascular aumentada in vitro. Além disso, foi mostrado que o S1P inibia a permeabilidade paracelular induzida por trombina através de um processo dependente de SlPi/Gi/Rac. Foi utilizado um sistema celular para avaliar os efeitos de S1P, FTY720-P e (R)-AFD na permeabilidade vascular. As células endoteliais embrionárias de murganho (5xl04) foram cultivadas durante 2 dias nos filtros de policarbonato Transwell (6,5 mm diâmetro, 0,4 pm de poros; Costar). O meio de cultura foi substituído com DMEM com soro sem vermelho de fenol (tampão HEPES, L-glutamina e cloridrato de piridoxina) (0,1 mL da câmara superior e 0,6 mL da câmara inferior) . As células foram pré-tratadas com FTY720, derivados ou S1P, durante 1 h. O FITC-dextrano (média de MW=2 000 kDa), foi adicionado ao compartimento superior na ausência ou presença de VEGF recombinante de murino (50 ng/mL). Os meios dos poços inferiores foram retirados após os períodos de tempo indicados (5-45 minutos). As amostras foram colocadas em placas de 96 poços de fundo sólido preto (Costar) e intensidades de fluorescência foram medidas utilizando um leitor de 29 fluorescência de placas multi-poços CytoFluor(R) (Applied Biosystems) a 488 nm de excitação. Dados = média ± SE de duplicados. N=2. *p<0,01 VEGF vs não tratados. #p<0,01 tratamentos + VEGF vs VEGF isolado.

Os resultados do ensaio da permeabilidade paracelular são mostrados nas Figuras 11 e 12. Sem VEGF, a fluorescência no compartimento inferior aumentou ao longo do tempo (Figura 11) . Contudo, quando as células foram tratadas com VEGF, foi observado um aumento significativo na fluorescência no compartimento inferior, que foi profundamente inibido por S1P, FTY720-P e (R)-AFD (Figura 12, é mostrado o ponto de tempo de 45 minutos). Estes resultados indicam que permeabilidade paracelular induzida por VEGF é antagonizada pelos agonistas do receptor S1P, S1P, FTY720-P e (R)-AFD. EXEMPLO 6: FTY720-P modula a montagem de junção de aderência e a permeabilidade vascular in vivo 0 papel de FTY720-P do plasma ou (R)-AFD na regulação da permeabilidade vascular foi testado in vivo. De modo a testar esta possibilidade, um modelo de permeabilidade in vivo foi utilizado em murganhos pré-tratadas com FTY720, (R)-AFD ou (S)-AAL. Os murganhos normais FVB/N fêmeas ou machos foram tratados por alimentação forçada com FTY720 (50 pg), enantiómero S-AAL (50 pg) , enantiómero R-AAL (50 pg) e água como veiculo de controlo. Cinco horas pós-alimentação forçada, os animais foram anestesiados com 2% de Avertin™ (0,5cc/20 g) e infusionados através da veia da cauda com 100 pL de FITC-dextrano (5 mg/mL, 165 kDa) . Os animais foram colocadas numa mesa aquecida sob um microscópio de dissecação de fluorescência (Zeiss STV11, Zeiss, 30

Inc.) e os vasos centrais na orelha foram visualizados. Foi injectado subdermicamente soro fisiológico de controlo ou factor de crescimento endotelial vascular de murganho (mVEGF, 10 ng/mL) no ouvido médio utilizando uma agulha de calibre 30 (30 yL) . -A vasculatura do ouvido foi visualizada com tempos de exposição fixos numa posição estacionária de 5 minutos a 120 minutos pós-injecção. As imagens de fluorescência foram então quantificadas utilizando limiares com base de pixéis tem ImageProPlus (Media Cybernetics, Inc.) e quantificadas.

Os resultados são mostrados nas Figuras 13 e 14. O pré-tratamento dos murganhos com uma única administração oral 5 horas antes da análise mostrou que FTY720 suprimia profundamente a permeabilidade vascular induzida por VEGF (Figuras 13 e 14). (R)-AAL mas não (S)-AAL também inibiram de forma potente a permeabilidade vascular in vivo. Estes dados sugerem que a fosforilação de FTY-720 e (R)-AAL pela cinase da esfingosina in vivo e a activação dos receptores S1P em células endoteliais resulta na inibição da permeabilidade vascular induzida por VEGF.

Os agonistas dos receptores endoteliais vasculares S1P mostraram ter efeitos na permeabilidade vascular, apoptose e angiogénese. Em particular, FTY 720 e seus análogos mostraram ser fosforilados in vivo em formas (e. g., FTY720-P) capazes de se ligar a receptores endoteliais vasculares S1P. Os agonistas do receptor endotelial vascular S1P podem ser empregues no tratamento de distúrbios de permeabilidade vascular, distúrbios relacionados com apoptose endotelial vascular excessiva e para crescer novos vasos sanguíneos. 31

Enquanto a invenção foi descrita com referência a uma forma de realização preferida, deve ser entendido pelos especialistas da técnica que podem ser efectuadas várias alterações e equivalentes podem ser substituídos pelos seus elementos sem se desviar do âmbito da invenção como definido pelas reivindicações em anexo. Além disso, podem ser efectuadas muitas modificações para adaptar a uma situação particular ou material, os ensinamentos da invenção sem desvio do seu âmbito essencial como definido pelas reivindicações em anexo. Deste modo, pretende-se que a invenção não seja limitada à forma de realização particular divulgada como o melhor modo contemplado para realizar esta invenção, mas que a invenção inclua todas as formas de realização que caem no âmbito das reivindicações em anexo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Universidade de Connecticut Health Center

Hla, Timothy

Sanchez, Theresa

Paik, Ji-Hye

Claffey, Kevin <120> Métodos de Inibição da Permeabilidade Vascular e Apoptose <130> UCT-0051 <150> 60/482234 <151> 2003-06-24 32 <160> 4 <1 7 0> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Mus musculus <40 0> 1 tggagtatga atgcccctac 20 <210> 2 <211> 19 <212> AND <213> Mus musculus <40 0> 2 cgctaaccat caattcccc 19 <210> 3 <211> 20 <212> AND <213> Mus musculus <400> 3 gatcacccct gacctgctac 20 <210> 4 <211> 20 33 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 4 ggcatcttca cagcttcctc 20

Lisboa, 9 de Junho de 2010 34

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um agonista do receptor da esfingosina-1-fosfato endotelial vascular, uma sua forma farmaceuticamente aceitável, ou uma sua forma fosforilada, para a preparação de um medicamento para o tratamento de apoptose de células endoteliais vasculares indesejada relacionada com um distúrbio relacionado com apoptose, em que o agonista do receptor da esfingosina-l-fosfato endotelial vascular é um 1,2-aminoálcool, um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma sua forma fosforilada, possuindo a fórmula Ft, ÇH2OR3 ^N-Ç-CH2(0)nR3 rs H2C-R| φ em que Ri é uma cadeia de carbono linear ou ramificada substituída ou não substituída possuindo 12 a 22 átomos de carbono e cada de R2, R3, R4 e R5 são independentemente hidrogénio ou alquilo C1-6 e n é 0 ou I, e em que a apoptose de células endoteliais vasculares indesejada não está relacionada com rejeição de transplante.
2. 2. Utilização da Reivindicação 1, em que Ri é interrompido com um fenileno substituído ou não substituído.
3. 3/8

   SIP(nM) FTY-P(nM) (R)-AFD(nM) 100...... 1 10 100 I 10 100 FIG. 6 b) ¢4¾ r^SiSl rí&ftaT· ;t i':-i ppi' . '^XLj^ui t Sfef^ yy-íikj,·· -*-P-Akt ! j V* «ff»1: 0m ρΒΗϋ^:' V . *’ i ,··;.;.* Akt -r;~?nr ?èm *33-,w rsrví "»-fTC â?p« 'ΆΧ^'' ^-P-ERK-1 /...·«.-· •Μ·' Jijmà0 ΙΗ#ί /j! -*-P-ERK-2 [ 1¾¾ y.:H^rrfi··. <'&s 'X.yy-r λΓ v.-Sr* /...... »..» ** · ' ίί^-,ί/ / “ ^-ERK-1 ' l !>n · * t.-.yyr»: ^Φ.: -*-ERK-2 S1P ílOOnM) m + . - m *· n FTY-P(uM) - - 10 100 - • - FTY (lOOnM) - - - - H* - * - (R)-AFD(nM) • • * H 10 100 » (R)-AAL(lOOnM) - - - - - - - + 4/8 FIG.7

   P-Afct Akt P-ERK-1 P-ERK-2 ERK-l ERK-2 ΠΎ-Ρ(ΙΟηΜ) (R)-AFD(IOnM) Ffx (200ng/mL) + » " * + + + + + + FIG. 8

   o 18 16 14 £ Q < (D 112 % 10 8 6 4 2

   a Controlo asip E3F1T-1’ □ |R>AFD E3CGM * r£ à\ * * li Ηφ -¾¾ Cone. (nJVI) - - 1 10 100 1000 5/8 FIG.9

   SlP(tiM) FTY-P(nM) (R)-AFJD(nM) 10 10 6/8

   3. Utilização da Reivindicação 2, em que o agonista do receptor da esfingosina-l-fosfato endotelial vascular é 1 2-amino-2-[2-(4-octafenil)etil]propan-1,3-diol, 2-amino-2- metil-4-[4-heptoxifenil]butan-l-ol, 2-amino-3-fosfato-2-[2-(4-octafenil)etil]propan-l-ol, ácido 2-amino-2-metil-4-[4-heptoxifenil]—1—difosfórico, ou uma combinação compreendendo um ou mais dos seguintes agonistas, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma sua forma fosforilada.
4. 4. Utilização da Reivindicação 2, em que o agonista do receptor da esfingosina-l-fosfato endotelial vascular é fosforilado por cinase 2 da esfingosina.
5. 5. Utilização da Reivindicação 2, em que o agonista do receptor da esfingosina-l-fosfato endotelial vascular estimula a fosforilação de um cinase de proteína Akt, uma cinase de proteína ERK ou uma combinação compreendendo uma ou mais das cinases acima mencionadas.
6. 6. Utilização da Reivindicação 1, em que o receptor da esfingosina-l-fosfato endotelial vascular é SlPi, SIP2, S1P3, S1P4, SIP5, ou uma combinação compreendendo um ou mais dos receptores acima mencionados.

   7. Utilização da Reivindicação 1, em que o distúrbio relacionado com a apoptose é cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia induzida por fármacos, cardiomiopatia induzida por alcoolismo crónico, cardiomiopatia familiar, miocardite virai, cardiomiopatia virai, enfarte cardíaco, angina cardíaca, trombose periférica, falência congestiva do coração, arritmia, acidente vascular, hemorragia subaracnoidal, enfarte cerebral, trombose cerebral, ou uma 2 combinação anteriores. compreendendo um ou mais dos distúrbios 8. Utilização da Reivindicação 1, em que o distúrbio relacionado com a apoptose é a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrópica ou retinite pigmentosa. 9. Utilização da Reivindicação 3, em que o distúrbio relacionado com a apoptose é cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia induzida por fármacos, cardiomiopatia induzida por alcoolismo crónico, cardiomiopatia familiar, miocardite virai, cardiomiopatia virai, enfarte cardíaco, angina cardíaca, trombose periférica, falência congestiva do coração, arritmia, acidente vascular cerebral, hemorragia subaracnoidal, enfarte cerebral, trombose cerebral, ou uma combinação compreendendo um ou mais dos distúrbios anteriores.

   10. Utilização da Reivindicação 3, em que o distúrbio relacionado com a apoptose é doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrópica ou retinite pigmentosa. Lisboa, 9 de Junho de 2010 3 1/8 FIG. 1

   Cone. (nM) I 10 100 1000 t 10 [00 1000 1 10 100 1000 I 10 100 ÍOOUIO IÓU FTY FTY (R)-AAL (R )-AAL (S ^AAL Incubação de células Incubação de células Incubação de células C) _ 0-4 I 035 «r> r- íTi 03 'h 0.2 CS Í5 0.15 O o O â 0.05 0.1 * 0 SlP(nM) FTY(nM) (R)-ÀAL(aM) FIG. 2 □ Controlo LUnM DMS * 1 f * I too 100 100 2/8 FIG. 3 * · · # '% * « TCE CM C F (R) (S) SG C F (R) (S) SG - - - .++'+ + + DMS FIG. 4 293T SK1-293T ,· · "& . ‘N ΪΜ. Ψ ,'.·# ·* Φ • %' # u . # C F (R) (S) SG C F (R) (S) SG C F (R) (S) SG - - - - - - - -- - 4,4.4.4.4. DMS 293T SK2-293T
7. 7/8 Fluorescência (unid. arbritrárias) Fluorescência (unid. arbritrárias FIG. 11

   FIG. 12

   VEGF +VEGF ο FIG. 13 10 15 30 45 60 min.

   VEGF

   FIG. 14