PT1453505E - Utilização de pramipexol para tratamento da esclerose lateral amiotrófica - Google Patents

Description

ΕΡ 1 453 505/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Utilização de pramipexol para tratamento da esclerose lateral amiotrófica"

Campo do invento 0 presente invento refere-se à utilização de pramipexol (2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol) para o tratamento da esclerose lateral amiotrófica (ELA). Mais particularmente, o invento está direccionado para a utilização do estereoisómero substancialmente puro R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol e dos seus sais farmacologicamente aceitáveis como agente neuroprotector para o tratamento da esclerose lateral amiotrófica (ELA).

Na composição utilizada é, por conseguinte, disponibilizado pramipexol, em que mais de 99% dos compostos pramipexol estão na conformação R(+).

Antecedentes do invento

As doenças neurodegenerativas (DND), como a doença de Alzheimer (DA) e a doença de Parkinson (DP), resultam da perda acelerada de determinadas populações de neurónios no cérebro. As doenças de Parkinson (DP) e de Alzheimer (DA) surgem geralmente de maneira esporádica sem quaisquer padrões de hereditariedade Mendeliana óbvios, mas poderão mostrar tendências maternas. Embora existam formas hereditárias raras ou pouco comuns de DND em adultos, a relevância da patogénese nestas variantes genéticas autossómicas face às formas esporádicas muito mais comuns é assunto de intenso debate.

Indícios acumulados sustentam de forma convincente o facto de uma componente etiológica primária da DND esporádica em adultos estar relacionada com uma disfunção mitocondrial e com o resultante aumento do stress oxidativo celular. 0 cérebro na DP e na DA e outros tecidos que não pertencem ao SNC apresentam reduções da actividade da cadeia de transporte de electrões (CTE) mitocondrial. Quando são 2 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ amplificados selectivamente em modelos celulares de híbridos citoplasmáticos ("cíbridos"), os genes mitocondriais de sujeitos com DP (Swerdlow et al., Exp Neurol 153:135-42, 1998) e DA (Swerdlow et al., Exp Neurol 153:135-42, 1997) recapitulam os défices da CTE e produzem maior stress oxidativo e uma variedade de outras disfunções celulares e mitocondriais importantes. 0 peso combinado das indicações provenientes de estudos tecidulares e de modelos cíbridos da DP e DA esporádicas sugere que o alívio do stress oxidativo por meio de agentes capazes de captar os radicais livres de oxigénio e proteger as células da morte celular mitocondrialmente gerada seja considerado uma característica primária dos compostos desenvolvidos como agentes neuroprotectores para estas doenças (Beal, Exp Neurol 153:135-42, 2000) . O stress oxidativo também tem sido associado à perturbação neurodegenerativa fatal que é a esclerose lateral amiotrófica (ELA). A ELA, também conhecida por doença de Lou Gehrig, é uma perturbação neurodegenerativa progressiva e fatal que envolve os neurónios motores do córtex, tronco cerebral e medula espinal. Ela é uma doença degenerativa dos neurónios motores superiores e inferiores, que produz uma debilidade progressiva dos músculos voluntários com eventual morte. O inicio da doença tem geralmente lugar na quarta ou quinta década de vida, e os indivíduos afectados sucumbem no espaço de 2 a 5 anos desde o surgimento da doença. A ELA ocorre em ambas as formas esporádica e familiar.

Cerca de 10% de todos os doentes com ELA são casos familiares, dos quais 20% possuem mutações no gene da superóxido dismutase 1 (SOD 1) (anteriormente conhecida por Cu,Zn-SOD), sugerindo que uma enzima Cu,Zn-SOD com um funcionamento anómalo poderá desempenhar um papel central na patogénese e progressão da esclerose lateral amiotrófica familiar (ELAF). Crê-se que a geração acrescida de radicais livres de oxigénio, especialmente de radicais hidroxilo, pela SODl mutante seja o factor iniciador que resulta na sequência de eventos conducente à morte dos neurónios motores na ELAF. Esta hipótese é sustentada por comunicações recentes de que a transfecção de células precursoras 3 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ neuronais com SODl mutante resulta numa produção acrescida de radicais hidroxilo e numa maior velocidade de morte celular por apoptose. Adicionalmente, os requerentes acreditam que o stress oxidativo é também responsável pela morte dos neurónios motores em formas esporádicas da ELA.

Muitas publicações discutem as causas possíveis da DP (Doença de Parkinson), da DA (Doença de Alzheimer) e da esclerose lateral amiotrófica (ELA), apenas algumas delas sugerindo um tratamento específico para a ela.

Em WO 96/18395 descreve-se a utilização de pramipexol como agente neuroprotector, em que as doenças específicas aí mencionadas incluem a DP (Doença de Parkinson) e a DA (Doença de Alzheimer) . Em WO 96/18395 não se descreve a utilização de pramipexol para o tratamento de doentes com esclerose lateral amiotrófica (ELA). Em WO 96/18395 também não se descreve uma composição farmacêutica compreendendo pramipexol, em que pelo menos mais de 99% do pramipexol na referida composição seja o R( + )-2-amino-4,5,6, 7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol.

Deigner et al. (ver Deigner et al., "Apoptosis modulators in the therapy of neurodegenerative diseases", Expert opinion on investigational drugs, Ashley Publications Ltd., London, GB, vol. 9, No. 4, April 2000, pp. 747-764) descrevem uma revisão geral do envolvimento da apoptose em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson ou a doença de Huntington e os conceitos terapêuticos que estão a ser utilizados ou propostos para tratar as doenças neurodegenerativas. Deigner et al. (2000) mencionam doenças neurodegenerativas como a EM (Esclerose múltipla), a DA, a DH (Doença de Huntington) ou a DP (consultar pp. 747, resumo), mas nenhuma composição farmacêutica compreendendo pramipexol ou o tratamento de doentes com ELA.

Worker ("Novel therapeutic strategies", IDRUGS, Current Drugs Ltd, GB, vol. 2, No. 9, 1999, pp. 848-852) descreve a modulação de mecanismos mitocondriais como um alvo potencial das terapêuticas para tratar a neurodegeneração. Worker (1999) descreve adicionalmente o envolvimento do glutamato, 4 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ especificamente na perda de potencial da membrana mitocondrial via acumulação intracelular de cálcio. Segundo Worker (1999), a prevenção da acumulação intracelular de cálcio poderá evitar a forma necrótica da lesão pelo glutamato e tornou-se uma estratégia terapêutica na neurodegeneração. Contudo, Worker (1999) não menciona composições farmacêuticas adequadas para o tratamento da neurodegeneração. Além disso, Worker (1999) não menciona a ELA, ou o tratamento da neurodegeneração da ELA em geral, como uma doença neurodegenerativa.

Abramova et al. (ver Journal of Neuroscience Research, 15 Feb 2002, US, vol. 67, No. 4, pp. 494-500) descrevem a inibição da activação de caspases e da morte celular induzida pelo ião metilpiridinio ou pelo péptido beta-amilóide em células de neuroblastoma humano por R(+) ou (S-)-pramipexol no tratamento da DA ou da DP. Abramova et al. (2002) não discutem quaisquer abordagens para o tratamento da ELA.

Cassarino et al. (ver Brain Research Revlews, vol. 29, No. 1, 1999, pp. 1-25) referem o stress oxidativo como uma implicação importante nas principais doenças neuro-degenerativas: DA, DP e ELA. Apesar de Cassarino et al. (1999) descreverem a implicação mitocondrial nestas doenças e discutirem marcas patológicas, a cadeia de transporte de electrões mitocondrial, as indicações de stress oxidativo influenciado por enzimas, as enzimas antioxidantes e os sistemas de modelos de cibridos, Cassarino et al. (1999) não mencionam composições farmacêuticas adequadas para o tratamento da neurodegeneração, particularmente composições farmacêuticas adequadas incluindo pramipexol para o tratamento da neurodegeneração na ELA.

Pesquisas recentes revelaram que um provável evento incitador da morte neuronal prematura que está associada à ELA é a presença de genes mitocondriais mutados (ADN mitocondrial, ADNmt). Estas mutações no ADNmt conduzem a anomalias no funcionamento das vias de produção de energia nas mitocôndrias, resultando numa geração excessiva de derivados de oxigénio prejudiciais conhecidos por "espécies de oxigénio reactivo" (ROS de "reactive oxygen species"), 5 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ incluindo as entidades designadas por "radicais livres de oxigénio". Quando a produção de ROS ultrapassa a capacidade dos mecanismos celulares para remover/inactivar as ROS, surge a condição conhecida como "stress oxidativo". O stress oxidativo pode danificar muitos componentes celulares. A pesquisa do inventor demonstrou que um componente celular critico que é danificado pelo stress oxidativo, em modelos celulares da DA e da DP, é um complexo proteico mitocondrial particular conhecido por "complexo do poro de transição mitocondrial" (MTPC de "Mitochondrial Transition Pore Complex"). A actividade normal do MTPC é essencial para a manutenção de um potencial bioeléctrico (ΔΨ) através das membranas mitocondriais, o qual, pelo seu lado, é utilizado para a síntese mitocondrial de reagentes químicos de armazenamento de energia como o ATP. A perda de ΔΨ resulta em despolarização das mitocôndrias e inicia uma cascata de reacções bioquímicas que, no final, resulta em morte celular por um mecanismo conhecido por "morte celular programada" ou "apoptose". Os mecanismos de apoptose foram observados não só na DA e na DP, como também em outras DND como a esclerose lateral amiotrófica (ela) e a doença de Huntington.

Por conseguinte, uma estratégia de tratamento destas várias doenças neurodegenerativas envolve a administração de um agente neuroprotector. Os agentes neuroprotectores eficazes para estas doenças debilitantes e fatais devem ser não só eficazes em cultura celular e em modelos animais destas doenças, como também têm que ser tolerados cronicamente em doses suficientemente elevadas para alcançar níveis terapêuticos nos tecidos nervosos. Idealmente, estes agentes também visariam os componentes celulares envolvidos no controlo das vias de morte celular e interromperiam a patofisiologia da doença.

De acordo com uma concretização, o presente invento utiliza pramipexol para o tratamento de uma doença neurodegenerativa como a ELA. A utilização compreende as etapas de administração de pramipexol ao indivíduo numa quantidade eficaz para reduzir o stress oxidativo nesse indivíduo. 6 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ Ο pramipexol (PPX, 2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol) existe como dois estereoisómeros: 6 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ

0 enantiómero S(-) é um agonista potente dos receptores de dopamina da família D2 e é amplamente utilizado no controlo sintomático da DP. A sintese, formulação e administração de pramipexol está descrita nas patentes US n.os 4, 843, 086; 4, 886,812 e 5, 112, 842. Vários grupos demonstraram que o S(-)-PPX é neuroprotector em modelos celulares e animais de aumento do stress oxidativo, incluindo a toxicidade do MPTP para os neurónios dopaminérgicos (ver Patentes US n.os 560,420 e 6,156,777). O S(-)-PPX reduz o stress oxidativo produzido pela neurotoxina parkinsoniana e inibidor do complexo I da CTE, metilpiridinio (MPP+), tanto in vitro como in vivo, e pode bloquear a abertura do poro de transição mitocondrial (MTP) induzida por MPP+ e outros estímulos (Cassarino et al., 1998). A estrutura catiónica lipofílica do PPX sugere a possibilidade de que a concentração nas mitocôndrias através do ΔΨμ, em combinação com o seu baixo potencial de redução (320 mV), poderá justificar estas propriedades neuroprotectoras desejáveis. O doseamento com S(-)-PPX está limitado nos seres humanos pelas suas propriedades agonistas dopaminérgicas potentes e restringe os níveis cerebrais de fármaco que podem ser obtidos. Como o enantiómero R( + ) do PPX possui muito pouca actividade agonista da dopamina (Schneider & Mierau, J Med Chem 30:494-498, 1987), embora possa conservar as propriedades moleculares/antioxidantes desejáveis do S(—)—PPX, sugere-se aqui que este composto é útil como inibidor eficaz da activação das cascatas de morte celular e da perda de viabilidade que ocorre nas doenças neurodegenerativas. 7 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ

Sumário do invento 0 presente invento descreve métodos de prevenção e/ou atraso dos sintomas ou de alivio dos sintomas relacionados com uma grande variedade de doenças neurodegenerativas. Mais particularmente, o invento refere-se à utilização de composições compreendendo pramipexol para o tratamento da esclerose lateral amiotrófica (ELA).

Breve descrição das figuras A Fig. IA representa a libertação de citocromo C induzida por MPP+ em função do tempo, e a Figura 1B representa a activação da caspase 3 induzida por MPP+ em função do tempo. Células SH-SY5Y foram incubadas com MPP+ 5 mM durante períodos de tempo variáveis e colhidas. Na Fig. IA, as células foram homogeneizadas em sacarose isotónica, centrifugadas e 100 μρ da proteína presente no sobrenadante foram sujeitos a electroforese utilizando SDS-PAGE, transferidos para membranas de nylon e imunocorados para o citocromo C com detecção de quimioluminescência reforçada. A banda mais à esquerda (designada por "Oh" no eixo dos xx) corresponde ao citocromo C mitocondrial no tempo "0", e as outras bandas representam a proteína citoplasmática submetida a electroforese e imunocorada para o citocromo C. As posições dos marcadores de peso molecular estão indicadas no eixo dos yy. Outros lotes de células foram analisados quanto à caspase 3 utilizando um sistema comercial, de acordo com as instruções do fabricante (Biomol). Os ensaios da caspase apresentados na Fig. 1B são os resultados de 3-4 experiências independentes. *p<0,05 em comparação com a actividade às 0,25 horas.

A Fig. 2 representa resultados que ilustram a inibição da activação da caspase 3 induzida por MPP+ por PPX, ácido bongkréquico e ácido aristolóquico. Células SH-SY5Y foram incubadas com MPP+ 5 mM durante 24 horas, na ausência ou na presença de S(-)-PPX 1 mM, R(+)-PPX 1 mM, ácido bongkréquico (BKA) 250 μΜ, ácido aristolóquico (ARA) 25 μΜ ou suas combinações. As células foram depois analisadas quanto à actividade da caspase 3. Na Fig. 2 está ilustrada a médiatEPM para 4-5 experiências independentes. As barras A-F 8 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ representam a activação da caspase 3 em células incubadas com os seguintes compostos: A, controlo (ausência de compostos adicionados); B, MPP+; C, MPP+/BKA; D, MPP+/S(-)-PPX; E, MPP+/R( + ) -PPX; F, MPP+/ARA. Para a barra B, p<0,05 em comparação com o controlo; e para as barras C-F, p<0,05 em comparação com as células tratadas com MPP+ (barra B). A Fig. 3 representa resultados que ilustram a inibição da activação da caspase 9 induzida por MPP+ por PPX, ácido bongkréquico e ácido aristolóquico. Células SH-SY5Y foram incubadas com MPP+ 5 mM durante 4 ou 8 horas, na ausência ou na presença de S(-)-PPX 1 mM, R( + )-PPX 1 mM, ácido bongkréquico (BKA) 250 μΜ ou ácido aristolóquico (ARA) 25 μΜ. As células foram depois analisadas quanto à actividade da caspase 9. Na Fig. 3 está ilustrada a médialEPM para 3-4 experiências independentes. As barras A-I representam a activação da caspase 9 em células incubadas com os seguintes compostos: A, controlo (ausência de compostos adicionados); B, 15 min MPP+; C, 4h MPP+; D, 4h MPP + /PPX; E, 8h MPP+; F, 8h MPP+/BKA; G, 8h MPP+/S(-)-PPX; H, 8h MPP+/R(+)-PPX; I, 8h MPP+/ARA. Para as barras C e E, p<0,01 em comparação com o controlo; e para as barras F, G, H e I, p<0,05 em comparação com o controlo.

Fig. 4A & 4B. Inibição da morte celular induzida por MPP+ pelos enantiómeros de PPX. Células SH-SY5Y foram incubadas com MPP+ 5 mM durante 24 horas, na ausência ou na presença de concentrações crescentes de S(-)-PPX (Fig. 4A) ou de R(+)-PPX (Fig. 4B). As barras A-F representam células tratadas com PPX 0 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3 μΜ e 30 μΜ, respectivamente. As células foram depois incubadas com calceina-AM, lavadas e lidas num leitor de placas de fluorescência. O número de experiências independentes está indicado em cada barra, e os valores de P obtidos pelo teste t para comparação com a ausência de PPX (apenas MPP+) estão indicados acima de cada barra. Na presença de MPP+, R(+)-PPX 3 nM causou uma maior retenção de calceina que S(-)-PPX (p=0,035), e S(-)-PPX 3 μΜ provocou uma maior retenção de calceina que R(+)-PPX (p=0,027). A Fig. 5 é uma representação gráfica das variações dos níveis séricos de 2,3-ADHB em função do tempo em sujeitos 9 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ com ELA e sujeitos de controlo (CTL) após a administração de 1,3 g de aspirina. A Fig. 5A apresenta as médiastEPM para as variações da concentração sérica de 2,3-ADHB; a Fig. 5B ilustra a razão da concentração sérica de 2,3-ADHB em relação à concentração de salicilato; e a Fig. 5C ilustra a concentração sérica de salicilato em função do tempo. A Fig. 6 é uma representação gráfica do efeito do pramipexol sobre a concentração sérica de 2,3-ADHB. A Fig. 6A indica as concentrações de adhb em sujeitos individuais antes e após o tratamento com pramipexol. Os sujeitos 2, 3, 7 e 12 não eram ambulatórios. Os sujeitos 3 e 7 dependiam de ventilador. A Fig. 6B fornece a médiaiEPM do nivel sérico de 2.3- ADHB antes e após o tratamento com pramipexol. A Fig. 6C disponibiliza a médiaiEPM da concentração sérica de 2.3- ADHB/salicilato antes e após o tratamento com pramipexol.

Fig. 7. Administrou-se R( + )-PPX a ratinhos na água de beber, depois trataram-se os ratinhos com uma neurotoxina (N-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina, MPTP) que aumenta o stress oxidativo no cérebro e determinaram-se os níveis de 2,3-ADHB no prosencéfalo.

Descrição detalhada do invento

Definições

Na descrição e reivindicações do invento, a terminologia que se segue será utilizada de acordo com as definições apresentadas abaixo.

Tal como aqui utilizado, o termo "purificado" e termos similares referem-se ao isolamento de uma molécula ou composto numa forma que está substancialmente isenta dos contaminantes normalmente associados à molécula ou composto, num ambiente nativo ou natural.

Tal como aqui utilizado, o termo "tratamento" inclui a profilaxia da perturbação ou condição específica, ou o alívio dos sintomas associados a uma perturbação ou condição específica e/ou a prevenção ou eliminação dos referidos sintomas. 10 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ

Tal como aqui utilizada, uma "quantidade eficaz" significa uma quantidade suficiente para produzir um efeito seleccionado. Por exemplo, uma quantidade eficaz de pramipexol compreende uma quantidade que inibirá a geração ou diminuirá os niveis de espécies de oxigénio reactivo presentes num indivíduo.

Tal como aqui utilizado, o termo "halogéneo" significa Cl, Br, F e I. Os halogéneos especialmente preferidos incluem Cl, Br e F. O termo "haloalquilo", tal como aqui utilizado, refere-se a um radical alquilo em C1-C4 que transporta pelo menos um substituinte halogéneo, por exemplo, clorometilo, fluoroetilo ou trifluorometilo. O termo "alquilo em Ci-Cn" em que n é um número inteiro, tal como aqui utilizado, representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada possuindo entre um e o número especificado de átomos de carbono. Tipicamente, os grupos alquilo em Ci-Cê incluem metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, s-butilo, ter-butilo, pentilo e hexilo. O termo "alcenilo em C2-Cn" em que n é um número inteiro, tal como aqui utilizado, representa um grupo olefinicamente insaturado, de cadeia linear ou ramificada, possuindo entre 2 e o número especificado de átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla. Os exemplos destes grupos incluem 1-propenilo, 2-propenilo, 1,3-butadienilo, 1-butenilo, hexenilo e pentenilo. O termo "alcinilo em C2-Cn" em que n é um número inteiro refere-se a um grupo insaturado, de cadeia linear ou ramificada, possuindo entre 2 e o número especificado de átomos de carbono e pelo menos uma ligação tripla. Os exemplos destes grupos incluem 1-propinilo, 2-propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo e 1-pentinilo. O termo "cicloalquilo em C3-Cn" em que n=8 representa ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo e ciclooctilo. 11 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ

Tal como aqui utilizado, o termo "arilo" refere-se a um sistema de anéis carbociclico monocíclico ou bicíclico possuindo um ou dois anéis aromáticos, incluindo fenilo, benzilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, indanilo e indenilo. 0 termo (alquilo em C5-C8) arilo refere-se a qualquer grupo arilo que está ligado à porção parental através do grupo alquilo. 0 termo "grupo heterociclico" refere-se a um sistema de anéis carbociclico monocíclico ou biciclico contendo entre um e três heteroátomos, em que os heteroátomos são seleccionados entre o grupo que consiste em oxigénio, enxofre e azoto.

Tal como aqui utilizado, o termo "heteroarilo" refere-se a um sistema de anéis carbociclico monocíclico ou bicíclico possuindo um ou dois anéis aromáticos que contêm entre um e três heteroátomos e inclui furilo, tienilo e piridilo. 0 termo "biciclico" representa um anel de carbono biciclico estável, com 7 a 12 membros, em ponte ou fundido, saturado ou insaturado. 0 anel bicíclico poderá estar ligado ao nível de qualquer átomo de carbono que forneça uma estrutura estável. 0 termo inclui naftilo, diciclo-hexilo e diciclo-hexenilo.

Tal como aqui utilizado, o termo agente neuroprotector refere-se a um agente que previne ou retarda a progressão da degeneração neuronal e/ou previne a morte das células neuronais. 0 invento 0 presente invento refere-se à utilização de pramipexol, um tetra-hidrobentiazol, para o tratamento da ELA. Mais particularmente, os tetra-hidrobentiazóis possuem a estrutura geral: 12 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ

em que Ri, R2, R3 e R4 são seleccionados, de modo independente, entre o grupo que consiste em H, alquilo em C1-C3 e alceno em C1-C3. Em um caso, o grupo NR3R4 está na posição 6. Em outro caso, Ri, R2 e R4 são H, R3 é alquilo em C4-C3 e o grupo NR3R4 está na posição 6. Em um caso, o composto possui a estrutura geral de fórmula I, em que R4 e R2 são H e R3 e R4 são H ou alquilo em C4-C3. 0 presente invento refere-se à utilização de pramipexol para o tratamento da ELA. A utilização envolve uma quantidade eficaz de pramipexol, em que o componente pramipexol consiste essencialmente em R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol, ou outros sais farmacologicamente aceitáveis, substancialmente isento do seu enantiómero S(-). Na composição utilizada é, por conseguinte, disponibilizado pramipexol, em que mais de 99% dos compostos pramipexol estão na conformação R(+).

Numa concretização, é disponibilizada uma composição que compreende um agente activo consistindo essencialmente em dicloridrato de R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propil-aminobenzatiazol, ou outros sais farmacologicamente aceitáveis deste, e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Esta composição pode ser administrada oralmente numa base crónica para prevenir a perda de células neuronais na ELA (e, mais particularmente, reduzir o stress oxidativo em doentes com ELA). 0 efeito neuroprotector das composições utilizadas de acordo com o presente invento deriva, pelo menos em parte, da capacidade do composto activo para prevenir a morte das células neurais mediante pelo menos um de três mecanismos. Primeiro, os presentes tetra-hidrobenzatiazóis são capazes de reduzir a formação de ROS (tanto in vivo em cérebros de rato, como in vitro em células com uma produção mitocondrial de energia limitada) induzida por neurotoxinas que conseguem 13 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ mimetizar a DP. Desta forma, os tetra-hidrobenzatiazóis funcionam como "captadores de radicais livres". Segundo, os tetra-hidrobenzatiazóis podem restaurar parcialmente ο ΔΨ diminuído que está correlacionado com as mitocôndrias na DA e DP. Terceiro, os tetra-hidrobenzatiazóis podem bloquear as vias de morte celular apoptótica que são produzidas por modelos farmacológicos da disfunção mitocondrial na DA e DP.

De acordo com uma concretização, o pramipexol é utilizado para reduzir o stress oxidativo num doente com ELA. Uma redução do stress oxidativo, para efeitos do presente invento, pretende incluir qualquer redução do nível de espécies de oxigénio reactivo presentes no doente, incluindo, por exemplo, a diminuição dos niveis séricos de ROS detectada por meio da conversão de salicilato em 2,3-ADHB. A utilização envolve uma quantidade eficaz de mais de 99% de R( + )-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilamino-benzatiazol. A quantidade de pramipexol administrada para tratar a ELA variará com base na via de administração, assim como em factores adicionais que incluem a idade, o peso, o estado geral de saúde, a gravidade dos sintomas, a frequência do tratamento e o facto de o tratamento ser ou não acompanhado por fármacos adicionais. A dose do composto activo a administrar é facilmente determinada por procedimentos de rotina conhecidos pelos peritos na especialidade.

Em alternativa, o presente invento refere-se à utilização de pramipexol para incrementar o potencial bioeléctrico (Ψ) através das membranas mitocondriais de células que sofrem de uma produção mitocondrial de energia alterada. A utilização poderá compreender as etapas de contacto das células que têm uma produção mitocondrial de energia alterada com uma composição que compreende um agente activo pramipexol, ou sais farmacologicamente aceitáveis deste, e um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 invento também é seguro para ser administrado aos seres humanos. 0 S(-)-pramipexol, que é um agonista dopaminérgico potente aprovado para o tratamento dos sintomas da DP, é o enantiómero do R(+)-pramipexol. Contudo, o R(+)-pramipexol não possui actividade dopaminérgica 14 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ farmacológica. Por conseguinte, o R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol e os seus sais farmacologicamente aceitáveis podem ser administrados em doses muito superiores ao S(-)-pramipexol e podem atingir níveis no cérebro capazes de proporcionar neuroprotecção. A ELA poderá ser tratada mediante a administração quer de R(+) quer de S(-)-pramipexol; contudo, a administração de R(+)-2-amino-4,5,6, 7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol é preferida porque é possível fornecer doses muito mais elevadas. Tal como indicado no Exemplo 1, os isómeros S(-) e R(+) são aproximadamente equipotentes em termos da redução do stress oxidativo. Contudo, a utilização do isómero R(+) permite administrar doses mais elevadas e, deste modo, obter uma maior redução dos radicais livres de oxigénio tóxicos. Por conseguinte, em uma concretização, é proporcionada a redução da morte de células neuronais em doentes com esclerose lateral amiotrófica (ELA), em que o doente recebe uma composição farmacêutica compreendendo um composto com a estrutura geral:

R<+) A síntese de pramipexol está descrita na patente europeia 186087 e na patente U.S. n.° 4,886,812 sua homóloga.

Numa concretização, o pramipexol e, mais preferencialmente, o R( + )-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol é combinado com agentes aglutinantes para fornecer comprimidos destinados a uma administração oral ou é combinado com substâncias conhecidas na especialidade para fornecer um adesivo transdérmico ("adesivo cutâneo") destinado a uma administração contínua. Em alternativa, o pramipexol pode ser formulado com os agentes estabilizantes necessários para produzir uma solução que pode ser administrada parentericamente (isto é, intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente). As preparações orais e/ou transdérmicas aqui descritas poderão 15 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ ser utilizadas para reduzir a morte de células neurais em doentes com ELA (esclerose lateral amiotrófica). A utilização do R(+)-pramipexol para tratar a ELA, em virtude de ser um estereoisómero relativamente inactivo do agonista dopaminérgico S(-)-pramipexol (Mirapex, Pharmacia and Upjohn), resolve um problema importante associado à utilização do S(-)-pramipexol como agonista dopaminérgico. A dose de Mirapex está limitada por efeitos secundários dopaminérgicos na pressão arterial e na actividade mental. 0 R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol tem 1% ou menos da potência para produzir os efeitos secundários que resultam da utilização do S(-)-pramipexol. Assim, as presentes composições podem ser administradas com maior segurança aos doentes com DA, que são tipicamente intolerantes mesmo a pequenas doses de medicamentos agonistas dopaminérgicos. Adicionalmente, as presentes composições podem ser administradas intravenosamente em doses muito mais elevadas que o S(-)-pramipexol. Assim, ele pode ser utilizado com segurança em condições como o acidente vascular cerebral, em que a redução da pressão arterial pode ser prejudicial.

As utilizações do presente invento para tratamento da ELA reduzem simultaneamente o risco de efeitos secundários dopaminérgicos. As utilizações poderão compreender a etapa de administração de uma composição compreendendo um agente activo pramipexol e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o agente activo pramipexol consiste essencialmente no estereoisómero R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propil-aminobenzatiazol e nos seus sais farmacologicamente aceitáveis. A composição se destina a ser administrada numa dose compreendida entre cerca de 10 mg e cerca de 500 mg por dia de R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilamino-benzatiazol ou dos seus sais farmacologicamente aceitáveis. A dose a utilizar está, naturalmente, dependente da perturbação específica que se pretende tratar, bem como de factores adicionais que incluem a idade, o peso, o estado geral de saúde, a gravidade dos sintomas, a frequência do tratamento e o facto de o tratamento ser ou não acompanhado por fármacos adicionais. As quantidades dos compostos 16 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ activos individuais são facilmente determinadas por procedimentos de rotina conhecidos pelos peritos na especialidade. Por exemplo, o pramipexol utilizado de acordo com o presente invento pode ser administrado oralmente aos seres humanos com ELA, em doses diárias totais compreendidas entre 10 mg e 500 mg.

Numa concretização preferida, o R( + )-2-amino-4,5, 6, 7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol (ou um seu sal farmacologicamente aceitável) se destina a ser administrado a um doente que sofre de uma doença neurodegenerativa, como seja a ELA, para tratar a doença. Tal como aqui utilizado, o termo "tratamento" inclui o alivio dos sintomas associados a uma perturbação ou condição especifica e/ou a prevenção ou eliminação dos referidos sintomas. Mais particularmente, uma composição compreendendo um agente activo pramipexol, ou os seus sais farmacologicamente aceitáveis, e um veículo farmaceuticamente aceitável poderá ser administrada ao doente para prevenir ou reduzir substancialmente a morte das células neuronais. A síntese, formulação e administração de pramipexol está descrita nas patentes U.S. n.os 4,843,086; 4,886,812; e 5,112,842. A geração de radicais hidroxilo nos tecidos de um indivíduo resulta num aumento da conversão de salicilato em ácido 2,3-di-hidroxibenzóico (ADHB) (Floyd et al. (1984) J. Biochem. Biophys. Methods 10:221-235; Hall et al. (1993) J. Neurochem. 60:588-594). Assim, a acumulação de 2,3-ADHB no soro dos indivíduos pode ser utilizada como indicador do nível de stress oxidativo sofrido por esse indivíduo. Investigou-se o efeito do R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol ou do S(-)-2-amino-4,5, 6, 7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol sobre os níveis séricos de ácido 2,3-di-hidroxibenzóico (ADHB). Como ilustrado nas Figuras 5 e 6, os níveis séricos individuais de 2,3-ADHB diminuíram nos doentes com ELA após tratamento com S(-)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol. Estes resultados demonstram que o tratamento com pramipexol diminui o stress oxidativo in vivo em doentes com ELA.

Além disso, como indicado na Fig. 7, efectuaram-se estudos adicionais com ratinhos e demonstrou-se a eficácia 17 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ do pramipexol na redução do stress oxidativo in vivo. Neste estudo, administrou-se R(+)-PPX aos ratinhos na água de beber durante 8 semanas, em 3 doses diárias diferentes, e depois administrou-se uma neurotoxina (N-metil-4-fenil-1,2,3, β-tetra-hidropiridina, MPTP) que aumenta o stress oxidativo no cérebro. 0 tecido cerebral foi depois analisado quanto à produção de radicais livres de oxigénio. Os resultados mostram que as doses de 30 mg/kg/dia e de 100 mg/kg/dia resultaram numa redução significativa dos niveis de radicais livres no cérebro.

Efectuaram-se também estudos de toxicologia, não se tendo detectado qualquer sinal de efeitos adversos. Em particular, um estudo de toxicologia de 8 semanas foi conduzido nos ratinhos que receberam r(+)-ppx na água de beber. Todos os seus órgãos principais foram examinados patologicamente e não se encontraram quaisquer lesões. Embora isto não aborde a questão da eficácia de R(+)-PPX como neuroprotector, demonstra efectivamente a segurança potencial (e, portanto, a exequibilidade) de administrar doses muito elevadas do fármaco aos seres humanos de maneira crónica. O presente invento refere-se também à utilização das composições farmacêuticas compreendendo pramipexol descritas no presente invento. Mais particularmente, os compostos pramipexol podem ser formulados como composições farmacêuticas utilizando veículos, cargas, agentes solubilizantes e estabilizantes farmaceuticamente estáveis comuns conhecidos pelos peritos na especialidade. As composições farmacêuticas compreendendo pramipexol poderão ser administradas a um indivíduo necessitado das mesmas através de várias vias, incluindo a via tópica, oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual ou rectal. O invento também descreve um conjunto ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas descritas no invento. Por exemplo, é descrito um kit para 18 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ tratamento de um doente com ELA. 0 kit compreende o pramipexol descrito no presente invento e, mais particularmente, o estereoisómero R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol. Estes fármacos podem ser acondicionados numa variedade de recipientes, por exemplo, frasquinhos, tubos, placas de microtitulação, garrafas e recipientes similares. De preferência, o kit também incluirá instruções de utilização.

Exemplo 1 R(+) e S(-)-PPX são inibidores eficazes da activação das cascatas de morte celular

Materiais e métodos

Cultura celular

As células de neuroblastoma humano SH-SY5Y foram obtidas de American Tissue Culture Collection (www.atcc.org) e mantidas em cultura num estado de replicação. Para os ensaios de caspases e os estudos de libertação do citocromo C, elas foram crescidas em frascos T75 com meio DMEM/alto teor de glucose contendo soro fetal de bovino a 10%, antibiótico/ antimicótico (penicilina 100 IU/ml, sulfato de estreptomicina 100 μρ/ιηΐ, anfotericina B 0,25 μρ/ιηΐ), uridina 50 μρ/ηιΐ e piruvato 100 μρ/ιηΐ, numa atmosfera de 5% C02 a 37°C, até uma confluência aproximadamente total (2xl07 células/frasco). Elas foram depois incubadas com iodeto de metilpiridinio 5 mM (MPP+; Sigma; www.sigma-aldrich.com) ou com os péptidos beta-amilóide 25-35 ou 35-25 100 μΜ (Bachem; www.bachem.com) durante tempos variáveis e, em seguida, colhidas. Para os estudos de morte celular, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo preto e crescidas durante 24 horas em meio DMEM antes de serem expostas à toxina.

Ensaios de caspases

Após exposição a MPP+ ou ao péptido beta-amilóide, as células foram colhidas em PBS e centrifugadas a 450 χ g durante 6 minutos a 4°C. Os depósitos celulares foram ressuspensos num tampão de lise celular hipotónico [HEPES 25 19

ΕΡ 1 453 5Ο5/PT mM, MgC]_2 5 mM, EDTA 5 mM, DTT 1M e cocktail de inibidores de protease (Sigma Chemical)] a uma concentração de 2 x 107 células/100 μΐ de tampão de lise. Os lisados foram submetidos a quatro ciclos de congelação e descongelação. Os lisados celulares foram depois centrifugados a 16000xg durante 30 minutos a 4°C. As fracções de sobrenadante foram recolhidas, e o teor de proteína foi medido pelo método de Lowry (BioRad). Utilizaram-se 100 μg de proteína para medir a actividade de caspases em placas de 96 poços e efectuou-se o ensaio em quadruplicado. A actividade foi medida utilizando o tampão de ensaio e o protocolo fornecido pelos fabricantes (Biomol, caspase 3; Promega, caspases 3 e 9) . A actividade das caspases baseia-se na clivagem de substratos peptídicos sintéticos, resultando na libertação de cromogénios coloridos (p-nitroanilina (p-NA), Biomol) ou fluorescentes (aminometilcumarina (AMC, Promega). Somente as caspases activadas são capazes de clivar estes substratos, e a geração de cromogénios é totalmente inibida quando o inibidor de caspases fornecido com cada kit de ensaio é incluído no ensaio. Nas condições de ensaio indicadas, observaram-se velocidades lineares de geração de cromogénios ao longo de 2 horas. A absorvância do cromogénio (p-NA) foi medida num leitor de placas OptiMax e a fluorescência do cromogénio (AMC) num leitor de placas SpectraMax Gemini, no tempo zero e após 30 minutos de incubação a 37°C, para estimar as actividades relativas das caspases. O sinal do cromogénio no tempo zero foi subtraído das leituras aos 30 minutos.

Morte celular A morte celular foi estimada através de medição da perda de retenção de calceína com o ensaio "Live-Dead" (Molecular Probes; www.molecularprobes.com), em células crescidas em placas de 96 poços e incubadas com calceína-AM, de acordo com as instruções do fabricante. Os sinais de calceína foram analisados num leitor de placas de fluorescência ajustável SpectraMax Gemini (Molecular Devices). A fluorescência da calceína proveniente das células pré-incubadas com metanol foi subtraída de todas as leituras como fundo. Cada ensaio foi realizado com 8 poços/condição, tendo sido determinada uma média. Realizaram-se 3-8 experiências independentes para avaliar um intervalo amplo de concentrações de S(-) e R(+)-PPX neste paradigma. 20 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ

Transferência de Western do citocromo C O citocromo C foi detectado por transferência de Western, após electroforese em gel de poliacrilamida de 100 μρ de proteína do sobrenadante das células e transferência para uma membrana de nylon. O anticorpo primário foi um anticorpo monoclonal de ratinho anti-citocromo C, obtido de Pharmingen e utilizado a uma diluição de 1:10000. A detecção foi efectuada com quimioluminescência reforçada (Pierce) e visualizada numa estação de imagens FluorS de BioRad. Fármacos

Os compostos R(+) e S(-)-PPX (ofertas de Pharmacia Corporation) foram obtidos na forma dos seus sais dicloridrato e dissolvidos directamente no meio de cultura. O ácido bongkréquico, um antagonista do local de ligação do ATP no translocador de nucleótidos de adenina, foi disponibilizado como uma solução em NH4OH 1M. O ácido aristolóquico (sal de sódio), um inibidor da fosfolipase A2, foi obtido de Sigma Chemical Co. Nas experiências das caspases, os fármacos foram adicionados 1 hora antes do MPP+ ou do péptido beta-amilóide. Nas experiências de calceína/morte celular, os fármacos foram adicionados 4 horas antes do MPP+.

Resultados

Activação das caspases por MPP+ e BA 25-35. A Fig. 1B ilustra a actividade da caspase 3 em função do tempo durante a incubação de células SH-SY5Y com MPP+ 5 mM. O aumento de actividade foi detectável às 4 horas e havia

sofrido um incremento de cerca de 2x às 24 horas. A Fig. IA mostra o resultado da transferência de Western para a

proteína citocromo C libertada para o citoplasma. Semelhante à curva de actividade bioquímica, o citocromo C citoplasmático é detectável em pequenas quantidades às 4 horas e aumenta substancialmente às 12 horas. A Fig. 2 mostra que tanto o enantiómero R(+) como o S(-) do PPX suprimiram a activação da caspase 3 durante a 21 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ exposição a ΜΡΡ+. Os aumentos da actividade da caspase 3 induzidos por MPP+ também foram bloqueados pelo ácido bongkréquico, um antagonista especifico do local de ligação do ATP no sitio da membrana interna do translocador de nucleótidos de adenina. 0 ácido aristolóquico, um inibidor da fosfolipase A2, que previamente se demonstrou bloquear a apoptose de células SH-SY5Y induzida por MPP+ (Fali & Bennett, 1998), também impediu incrementos na actividade da caspase 3. A activação das caspases por MPP+ e pelo péptido BA 25-35 foi bloqueada pelos enantiómeros de PPX e pelos agentes activos ao nivel do poro de transição mitocondrial. 0 S(-)-PPX reduziu em cerca de 70% o aumento da actividade da caspase 3 após incubação com o péptido BA 25-35, e não teve qualquer efeito supressor por si só. A exposição a MPP+ também aumentou a actividade da caspase 9 com uma progressão no tempo similar à activação da caspase 3 (ver Fig. 3) . Os incrementos na actividade da caspase 9 também foram bloqueados por S(-) e R(+)-PPX, ácido bongkréquico e ácido aristolóquico. A Fig. 4 ilustra os efeitos sobre a retenção celular de calceina da incubação de células SH-SY5Y com concentrações variáveis de R( + ) ou S(-)-PPX, antes da exposição a MPP+ 5 mM durante 24 horas. A calceina é um corante fluorescente que é retido no interior das células em função da sua capacidade para manter um potencial da membrana plasmática. Ο MPP+ sozinho reduziu a incorporação de calceina em cerca de 60%. Ambos os enantiómeros de PPX repuseram substancialmente a incorporação de calceina a concentrações de 30 nM, e este efeito protector foi conservado até à concentração de PPX 30 μΜ.

Discussão

Este estudo centrou-se na utilização das neurotoxinas MPP+ e péptido beta-amilóide 25-35 adicionadas a células de neuroblastoma SH-SY5Y em replicação, como modelos de cultura celular, para estudar possíveis compostos neuroprotectores úteis para as doenças de Parkinson e Alzheimer, respectivamente. As células SH-SY5Y são células neoplásicas de origem neuroectodérmica em fase de divisão, não são neurónios primários. Elas são mitóticas em resultado de uma 22 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ mutação Ras, conduzindo à activação crónica da sinalização MAPK/ERK. As células SH-SY5Y são relativamente insensíveis a MPP+ em incubações de curto prazo em comparação com os neurónios primários. Os requerentes constataram que concentrações de MPP+ de 2,5 e 5 mM, mas não de 1 mM,

produziram uma morfologia apoptótica e fragmentos de ADN picnóticos no espaço de 18-24 horas. Contudo, incubações mais prolongadas com concentrações inferiores de MPP+ poderão aproximar-se mais do modelo MPTP in vivo da DP em animais, e foi referido que a exposição de longo prazo a níveis mais baixos de MPP+ ainda consegue activar a cascata de morte celular mitocondrial.

As células SH-SY5Y também são sensíveis aos péptidos beta-amilóide. Li et al. (1996) verificaram que células SH-SY5Y crescidas sem soro mostraram extensa marcação das extremidades do adn cortado após 3 dias de exposição a uma concentração de péptido beta-amilóide 2S-3S de 100 μΜ e exibiram um aumento dependente da concentração do "DNA laddering". A activação das caspases induzida pelo péptido beta-amilóide não foi aparentemente descrita em células SH-SY5Y, mas várias comunicações referiram activações de caspases a partir da exposição a péptidos beta-amilóide em várias linhas de neurónios primários. Estas incluem a activação das caspases 2, 3 e 6 pelo análogo 25-35 em células dos grânulos do cerebelo e a caspase 3 em neurónios corticais primários de rato. Assim, não é surpreendente que tenha sido observada actividade da caspase 3 (DEVDase) em células SH-SY5Y expostas a péptido beta-amilóide 25-35 100 μΜ, mas não tenha sido observada activação da caspase após exposição à sequência inversa 35-25. O foco das presentes experiências consistiu em determinar se os enantiómeros de PPX conseguem evitar a activação das caspases e promover a retenção de calceína como marcador da sobrevivência celular, em modelos de cultura celular de exposição aguda a toxinas das doenças DA e DP. A activação tanto da caspase 9 "iniciadora" como da caspase 3 "executora" foi bloqueada por ambos os enantiómeros de PPX no modelo MPP+ para a DP, e a activação da caspase 3 foi bloqueada por S(-)-PPX no modelo BA 25-35 para a DA. Ambos os enantiómeros de PPX em concentrações 23 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ nanomolares conseguiram promover a sobrevivência celular no modelo MPP+ para a DP. Assim, estas constatações juntam-se ao volume crescente de trabalho que descreve as acções neuroprotectoras do PPX e sugere uma potencial utilidade clinica desta familia de compostos em doenças neurodegenerativas.

Embora este estudo não tenha examinado o local de acção mais imediato do PPX, vários resultados implicam o complexo do poro de transição mitocondrial (MTPC) nestes modelos celulares. Primeiro, o ácido bongkréquico, um antagonista selectivo do translocador de nucleótidos de adenina e inibidor da abertura do MTP, bloqueou a activação induzida por MPP+ de ambas as caspases 9 e 3. Isto seria consistente com o facto de ο MPP+ provocar a abertura do MTP quer directamente quer através de mecanismos que envolvem o stress oxidativo. Em mitocôndrias isoladas do figado, ο MPP+ consegue provocar uma abertura clássica do MTP, que é bloqueada de forma incompleta por enzimas captadoras de radicais livres e é bloqueada de modo mais completo por s(—)— PPX. 0 péptido BA 25-35 neurotóxico também consegue estimular a abertura do MTP em mitocôndrias isoladas. Tanto ο MPP+ como o péptido BA 25-35 aumentam o stress oxidativo em estudos de microdiálise do cérebro in vivo e em culturas de células neurais in vitro, e foi demonstrado que o S(-)-PPX reduz o stress oxidativo induzido por MPP+ in vitro e in vivo.

Exemplo 2

Utilização de pramipexol para tratar a ELA

Foram identificadas anomalias oxidativas tanto na esclerose lateral amiotrófica familiar (ELAF) como na ELA esporádica (ELAE) mais prevalente. O 2,3-ADHB é um subproduto do salicilato hidroxilado que é um marcador fiável in vivo do aumento da actividade de radicais livres e é analisado de modo confiável por HPLC. Após a administração de uma carga oral de salicilato, observaram-se níveis séricos elevados de ácido 2,3-di-hidroxibenzóico (2,3-adhb) e de ADHB/salicilato em sujeitos com ELAE. Como aqui descrito, estudaram-se 12 doentes com ELAE para determinar os níveis de 2,3-ADHB antes e após o tratamento com pramipexol. 24 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ Métodos

Preparação dos participantes 0 presente estudo foi conduzido em duas fases. Na primeira fase, estudaram-se onze sujeitos com ELAE definida que satisfaziam os critérios de Airlie House e 7 controlos. Estes participantes foram sujeitos a uma carga de aspirina com subsequente análise de 2,3-ADHB. Após receberem 1,3 g de aspirina por via oral, recolheu-se sangue 2, 3 e 4 horas mais tarde. 0 soro foi separado, congelado e armazenado a -80°C. Aliquotas de soro foram codificadas e anonimadas para os ensaios de 2,3-ADHB e salicilato.

Na segunda fase, 17 sujeitos com elae definida foram aleatoriamente seleccionados de entre uma população clinica. Os sujeitos receberam 1,3 g de aspirina por via oral e o sangue foi recolhido 3 horas mais tarde. Após a aquisição destas amostras de linha de base, os participantes com ELAE iniciaram a terapia com pramipexol. 0 escalonamento de dose foi realizado de modo similar aos doentes com DP, tendo-se feito uma tentativa para atingir 1,5 mg t.i.d. - q.i.d. como dose final, no seguimento de uma titulação de 7 semanas. Após cada participante estar a receber a sua dose máxima de pramipexol durante três semanas, efectuou-se uma vez mais o estudo de carga de aspirina. Doze dos dezassete sujeitos originais com ELAE conseguiram completar a fase de escalonamento de pramipexol. Destes, todos com excepção de dois foram capazes de chegar a uma dose de pramipexol de 6 mg por dia, e todos os doentes obtiveram pelo menos uma dose de 3 mg por dia. Cada participante recebeu depois a oportunidade de continuar o tratamento com pramipexol.

Preparação das amostras

Preparação do soro: misturaram-se 0,9 ml de soro a 4°C com 0,2 ml de ácido perclórico 1M e centrifugados a 15000 rpm durante 10 minutos, numa microcentrífuga refrigerada.

Ensaio para o 2,3-ADHB: 20 μΐ de sobrenadante foram injectados, em duplicado, numa coluna Adsorbosphere "Catecholamine" C18 (Alltech) impregnada, utilizando um 25

ΕΡ 1 453 5Ο5/PT caudal de 0,6 ml/min, com tampão constituído por acetonitrilo 125 ml/1; heptanossulfonato de sódio 1,5 g/1; trietilamina 3 ml/1; Na2EDTA 100 mg/1 com o pH final ajustado para 2,8 com ácido fosfórico. A detecção utilizou um detector electroquímico de escoamento CouloChem II (ESA, com as seguintes configurações: célula de guarda = +600 mV; El = -100 mV; E2 = +400 mV). O 2,3-ADHB eluiu aos 10-10,5 minutos nestas condições.

Ensaio para o salicilato: 50 μΐ de sobrenadante foram injectados, em duplicado, numa coluna de HPLC Kromosil C8 (Alltech) impregnada, utilizando um caudal de 0,8-1,0 ml/min, com 70% metanol/30% água/0,5% ácido trifluoro-acético. O salicilato eluiu aos 6-7 minutos nestas condições e foi detectado por absorção no ultravioleta a 315 nm.

Resultados A Figura 5A ilustra o aumento dos níveis séricos de 2.3- ADHB em função do tempo nos 11 sujeitos com ELAE (59,2±12,3 anos) e nos 7 sujeitos de controlo de idade equivalente (56,7±10,7 anos) estudados na primeira fase. Os doentes com ELAE exibiram um intervalo de início dos sintomas de 10 a 156 meses, representando tanto o estado agudo como o crónico desta doença. Os níveis máximos de 2.3- ADHB foram encontrados em doentes com ELAE às 3 horas após a dose de aspirina, e este ponto temporal foi seleccionado para a segunda fase do estudo. Adicionalmente, um teste ANOVA de dois factores revelou uma diferença na produção de 2,3-ADHB quando os grupos ELAE e de controlo foram comparados em relação ao tempo. Esta diferença foi significativa ao nível de p=0,033 para as duas populações; o teste a posteriori (teste Tukey) não revelou quaisquer diferenças significativas entre pontos de tempo individuais.

Como comparação adicional, as razões de 2.3- ADHB/salicilato foram comparadas em relação ao tempo para as duas populações. O grupo de ELA apresentou um aumento aproximado de l,5x deste marcador normalizado da produção de 2,3-ADHB, às 3 horas após a administração de aspirina. O teste ANOVA de dois factores mostrou uma diferença significativa ao nível de p = 0,06 (Figura 5B). Os 26

ΕΡ 1 453 5Ο5/PT níveis séricos de salicilato não foram significativamente diferentes, em relação ao tempo, entre as populações ELA e CTL (controlo) (Figura 5C) . Dos 17 doentes originais que entraram na segunda fase do estudo, 5 desistiram devido a complicações da doença ou por incapacidade de tolerar a medicação. Os restantes participantes consistiram em 8 homens e 4 mulheres. A idade média foi de 63,2 anos. A terapia com pramipexol foi bem tolerada por estes sujeitos com ELA. Estes participantes não apresentaram qualquer sinal de demência clínica, nem apresentaram instabilidade cardiovascular significativa.

Os doentes que ingressaram neste estudo representaram várias fases clínicas de progressão da doença. Quatro doentes não eram ambulatórios, dois dos quais dependiam de ventilador. Os outros oito eram ambulatórios no começo do estudo. O tempo médio desde a entrada no estudo até à recolha de sangue final foi de 76,6 dias com um intervalo de 49-105 dias.

Os níveis séricos de 2,3-adhb foram comparados antes e após o tratamento com pramipexol. Sem excepção, os níveis séricos individuais de 2,3-ADHB foram reduzidos (Figura 6A) . A Figura 6B mostra a médialEPM para a concentração sérica de 2.3- ADHB nos sujeitos com ELA, antes e após alcançarem a dose estável de pramipexol. A redução média foi de cerca de 45% e foi significativa ao nível de p=0,015. Os níveis séricos de salicilato (μΜ) permaneceram inalterados antes (18,8±7,2; D.P.) e durante (20,2±5,5; D.P.) o tratamento com pramipexol. A Figura 6C mostra que os níveis séricos de 2.3- ADHB normalizados pelos níveis de salicilato, para cada sujeito, sofreram uma redução em média de 59% pelo tratamento com pramipexol; o teste t revelou que esta diferença era significativa ao nível de p = 0,010.

Discussão

Este estudo revelou um aumento de aproximadamente 2x do stress oxidativo in vivo em doentes com ELA após uma carga oral de aspirina, com base numa produção acrescida de 2.3- ADHB. O aumento de 2,3-ADHB foi observado em várias fases de progressão clínica da doença, sugerindo que este metabolito poderá servir de marcador fiável do aumento do stress 27 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ oxidativo ao longo de todo o processo da doença, mas particularmente nas fases precoces quando o diagnóstico permanece muitas vezes incerto. Devido ao tamanho pequeno da população, não foi feita qualquer tentativa para correlacionar o nivel de produção de 2,3-ADHB com a fase da doença. 0 presente estudo também revelou que a terapia com pramipexol, nas doses tipicamente toleradas na doença de Parkinson, reduziu o stress oxidativo in vivo em doentes com ELA. 0 soro de 12 doentes, antes e várias semanas após atingirem as doses máximas toleradas de pramipexol, revelou uma redução de cerca de 45% do nivel basal de 2,3-ADHB e de cerca de 59% do nivel basal de 2,3-DHBA normalizado pelo salicilato. É provável que o pramipexol tenha causado esta redução da produção de ROS em resultado das suas propriedades de captação de radicais livres/antioxidantes. Foi demonstrado que o pramipexol é capaz de reduzir a produção de ROS tanto em células de neuroblastoma SY5Y in vitro, como no corpo estriado de rato in vivo exposto de modo agudo a uma inibição do complexo I por metilpiridinio (Cassarino et al., J. Neurochem 1998, 71:295-301). O pramipexol também reduz a produção de ROS no cérebro in vivo após uma infusão da neurotoxina β-hidroxidopamina (Ferger et al., Brain Res 2000, 883:216-23), inibe a libertação do citocromo C e reduz a oxidação lipidica cerebral in vivo após tratamento com a proneurotoxina MPTP.

Uma vez que se observam acções neuroprotectoras aproximadamente equivalentes do pramipexol nos enantiómeros R(+) e S(-) e uma vez que as acções agonistas da dopamina residem principalmente no enantiómero S(-), as acções de captação de ROS provavelmente não têm qualquer relação com as propriedades agonistas dopaminérgicas. Se isto for verdade, então o enantiómero R(+) do pramipexol deve ser tolerado em doses muito mais elevadas que o enantiómero S(-) utilizado no presente estudo, com potencial para incrementar a actividade antioxidante in vivo.

Os agentes estressores oxidativos estão bem estabelecidos na ELA esporádica. Contudo, a etiologia do aumento do stress oxidativo permanece obscura. Os marcadores de danos no SNC causados por stress oxidativo, na ELA, incluem uma coloração 28 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ imuno-histoquímica acrescida para o produto da peroxidação dos lípidos na medula espinal lombar e níveis acrescidos de nitrotirosina e de superóxido dismutase dependente de manganésio nitrosilada no fluido espinal. Estes resultados são consistentes com os maiores danos no tecido de ELA por ROS que incluem derivados do óxido nítrico.

Os modelos animais e celulares da ELA também fornecem dados sobre o stress oxidativo e a vulnerabilidade neuronal motora. Os neurónios motores da medula espinal na ela possuem uma actividade reduzida da enzima citocromo C-oxidase (estudada histoquimicamente), e esta função reduzida da cadeia de transporte de electrões poderá servir para aumentar a produção de radicais livres de oxigénio. A microdiálise da medula espinal de ratinhos que transportam um gene mutante humano S0D1 de ELAF revelou uma maior produção de ROS e maiores níveis de malondialdeído, o que é consistente com esse conceito. Além disso, foi referido que uma mutação CuZn-SOD ELAF aumentou a vulnerabilidade dos neurónios motores espinais à morte por excitotoxicidade e que o mecanismo envolvia um aumento do stress oxidativo. Finalmente, o aumento do stress oxidativo na ELA poderá ser responsável pelo incremento de marcadores dos processos de morte celular apoptótica observado na medula espinal da ELA e pelo envolvimento das caspases na morte de neurónios motores num modelo de ratinho de ELAF. A patologia mitocondrial ocorre precocemente no decurso da doença neuronal motora experimental. Estas estruturas são não só sensíveis às lesões oxidativas, como a sua disfunção conduz a uma produção acelerada de radicais livres e a possíveis danos no ADN mitocondrial. A visualização da função mitocondrial em biopsias de músculos de casos de ELA revelou uma actividade reduzida do complexo I, e a análise ultra-estrutural das dendrites das células do corno anterior na ELA revelou mitocôndrias escuras e agregadas. A perda selectiva do transportador 2 de aminoácidos excitatórios (EAAT2) glial à volta das células degenerativas do corno anterior na ELA poderá reflectir danos proteicos adicionais que poderiam contribuir para uma maior excitotoxicidade. 29

ΕΡ 1 453 5Ο5/PT

Os danos oxidativos na ELA poderão, assim, representar um processo neurodegenerativo primário, um epifenómeno secundário da patologia mitocondrial dos neurónios motores ou uma combinação de ambos. Os estudos em cibridos com amplificação dos genes mitocondriais da ELAE demonstraram que o acréscimo de stress oxidativo na ELAE pode ser entendido em termos de uma etiologia genética mitocondrial primária. A forma como o ADN mitocondrial fica defeituoso na ELAE não é conhecida; ambos os mecanismos de hereditariedade materna e aquisição esporádica são possíveis. A utilização de uma carga de salicilato e de medições do 2.3- ADHB como estimativa dos níveis relativos de stress oxidativo in vivo tem sido aplicada à diabetes de tipo 2, à disfunção hepática nos alcoólicos e à artrite. Inúmeras espécies oxidantes podem contribuir para a produção de 2.3- ADHB, incluindo o radical hidroxilo e o anião peroxinitrito. Assim, não é possível atribuir uma fonte de ROS particular aos niveis de 2,3-ADHB observados, nem a(s) fonte (s) tecidulares para o aumento da hidroxilação do salicilato podem ser definidas.

Em resumo, verificou-se que os níveis séricos basais de 2.3- ADHB, um marcador do stress oxidativo, estavam aumentados num grupo de sujeitos com ELAE e que estes níveis foram reduzidos após o tratamento com pramipexol. Como está ilustrado na Fig. 6, os niveis séricos individuais de 2.3- ADHB diminuíram nos doentes com ELA após tratamento com S(—)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol. Em particular, os doentes receberam uma dose diária de 3-6 mg de S(—)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol por via oral durante sete semanas. No final das sete semanas, recolheram-se amostras de soro, e a concentração de 2.3- ADHB foi medida e comparada com os niveis de 2,3-ADHB em amostras de soro recolhidas antes do tratamento. Estes resultados demonstram que o tratamento com pramipexol reduz o stress oxidativo in vivo em doentes com ELA. 30 ΕΡ 1 453 505/ΡΤ

Exemplo 3

Eficácia do pramipexol na redução do stress oxidativo induzido por MPTP in vivo Métodos

Ratinhos C57BL/6 macho receberam diariamente dicloridrato de R(+)-pramipexol na água de beber durante 8 semanas, em doses calculadas para fornecer 0, 10, 30 ou 100 mg/kg/dia. No dia do estudo, os ratinhos foram injectados com 30 mg/kg s.c. da neurotoxina N-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP) para aumentar o stress oxidativo no cérebro. Uma hora mais tarde, os ratinhos foram injectados com 100 mg/kg i.p. de salicilato de sódio. Uma hora após a injecção de salicilato, os ratinhos foram mortos e os prosencéfaios analisados quanto ao teor de ácido 2,3-di-hidroxibenzóico (2,3-ADHB).

Como ilustrado na Fig. 7, os resultados mostram que o tratamento com 30 e 100 mg/kg/dia de R(+)-pramipexol reduziu significativamente o stress oxidativo produzido por MPTP no prosencéfalo. Efectuaram-se também estudos de toxicologia e não se detectou qualquer indicio de efeitos adversos. Em particular, realizou-se um estudo de toxicologia de 8 semanas nos ratinhos que receberam R(+)-PPX na água de beber. Todos os seus órgãos principais foram examinados patologicamente e não foram encontradas quaisquer lesões.

Lisboa, 2010-12-07

Claims (10)

1. ΕΡ 1 453 505/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma quantidade eficaz de pramipexol para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento de doentes com esclerose lateral amiotrófica (ELA), em que o pramipexol é mais de 99% R(+)-2-amino- 4.5.6.7- tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol, ou um seu sal farmacologicamente aceitável.
2. 2. Pramipexol numa quantidade eficaz para utilização no tratamento de doentes com esclerose lateral amiotrófica (ELA), em que o pramipexol é mais de 99% R(+)-2-amino- 4.5.6.7- tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol, ou um seu sal farmacologicamente aceitável.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou pramipexol de acordo com a reivindicação 2, em que o pramipexol é R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilamino-benzatiazol.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou pramipexol de acordo com a reivindicação 2, em que o pramipexol se destina a ser administrado numa quantidade eficaz para aliviar e/ou prevenir ou eliminar os sintomas associados à ELA mediante a redução do stress oxidativo no indivíduo.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou pramipexol de acordo com a reivindicação 2, em que o pramipexol e um veículo farmaceuticamente aceitável se destinam a ser administrados numa quantidade eficaz para prevenir ou reduzir substancialmente a morte das células neurais, mediante a redução da formação de espécies de oxigénio reactivo (ROS) e/ou a reposição parcial do potencial bioeléctrico correlacionado com as membranas mitocondriais e/ou o bloqueio das vias de morte celular apoptótica.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou pramipexol de acordo com a reivindicação 2, em que a composição farmacêutica ou o pramipexol se destina a ser administrado numa dose de cerca de 10 mg a cerca de 500 mg ΕΡ 1 453 505/ΡΤ 2/2 por dia de R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilamino-benzatiazol, ou de um seu sal farmacologicamente aceitável.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou pramipexol de acordo com a reivindicação 2, em que o pramipexol se destina a ser administrado numa quantidade de cerca de 3 mg/kg a cerca de 6 mg/kg por dia.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou pramipexol de acordo com a reivindicação 2, em que o pramipexol se destina a ser administrado oralmente a seres humanos com ELA, em doses diárias compreendidas entre 10 mg e 500 mg.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou pramipexol de acordo com a reivindicação 2, em que o pramipexol se destina a ser administrado por uma via seleccionada entre o grupo constituído pelas vias transdérmica, tópica, oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérica, sublingual e rectal.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou pramipexol de acordo com a reivindicação 2, em que a composição ou o pramipexol se destina a ser administrado a uma dosagem de cerca de 10 mg a cerca de 500 mg por dia de mais de 99% de R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetra-hidro-6-propilaminobenzatiazol, ou de um seu sal farmacologicamente aceitável. Lisboa, 2010-12-07