PT100810B - Mutantes de deleccao do virus de herpes bovino tipo 1, vacinas a base desses mutantes e equipamentos de diagnostico para a deteccao de virus do herpes bovino tipo 1 - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um mutante de delecção do vírus de herpes bovino tipo 1 que apresenta uma delecção no gene da glicoproteína gE. O mutante pode ainda apresentar uma delecção no gene da quinase de timidina e/ou no gene da glicoproteína gl, ou apresentar uma inserção de um gene heterólogo; a um ãcido nucleico recombinante que inclui o gene gE ou uma parte deste; à glicoproteína gE, peptídeos à base desta e complexos formados pelas glicoproteínas gE e gl, e anticorpos contra estes; a vacinas e equipamentos (kits) de diagnóstico que incluem qualquer um destes materiais.

ÂMBITO DO INVENTO

Este invente diz respeito aos campos da vacinação e do diagnóstico relativamente a doenças que são provocadas por agentes patogénicos e envolve a utilização, tanto dos métodos clássicos usados para chegar a uma vacina viva atenuada ou a uma vacina inactivada, como os modernos métodos com base na tecnologia de recombinação de DNA.

Mais especificamente, o invento diz respeito a vacinas vivas atenuadas e a vacinas inactivadas para protecção de animais, especialmente de gado bovino, relativamente ao vírus de herpes bovino tipo 1 (bovine herspesvirus type 1 ou BHV-1), sendos essas vacinas concebidas de modo tal que não só são seguras e eficazes como criam também a possibilidade de distinguir, numa população vacinada, os animais infectados daqueles que não estão infectados.

Os kits de diagnóstico que podem ser utilizados num teste do tipo atrás referido para distinguir, numa população vacinada, os animais infectados daqueles que não estão infectados, constituem também um aspecto do presente invento.

ANTECEDENTES DO INVENTO

BHV-1, incluindo o vírus da rinotraqueiite bovina infecciosa (infectious bovine rhinotracheitis virus ou IBRV) e o vírus da vulvovaginite pustular infecciosa (infectious pustular vulvovaginitis virus ou IPVV), desempenha um papel importante no desenvolvimento de doenças respiratórias e de afecções relacionadas com a fertilidade no gado bovino. Após infecção aguda, o BHV-1 permanece frequentemente no hospedeiro sob forma latente. Um vírus presente sob forma latente pode ser reactivado sob a influência de, entre outros factores, stress, que pode ser, ou não, acompanhado por fenómenos clínicos - e posteriormente excretado. Consequentemente, o gado infectado deve ser encarado como constituindo durante toda a vida uma fonte potencial de disseminação de BHV-1. Calcula-se que a infecção por meio de BHV-1 ocorre de modo endémico em 75% das criações de gado holandesas. Especialmente o gado mais velho revela-se serologicamente positivo.

Existem diversas vacinas inactivadas (mortas) e uma série de vacinas atenuadas (vivas) para inoculação contra infecções provocadas por BHV-1. As vacinas inactivadas são preparadas matando o vírus BHV-1, por exemplo mediante tratamento térmico, irradiação ou tratamento com etanol ou formalina. Todavia, estas vacinas conferem frequentemente uma protecçâo insuficiente. As vacinas atenuadas são preparadas através de um grande número de passagens em células homólogas (de bovino) ou em células heterólogas tais como células de porco ou cão, sendo por vezes os vírus tratados também por métodos físicos ou químicos nessa ocasião. Desse modo se desenvolvem mutações/delecções desconhecidas no genoma do vírus que reduzem, frequentemente, as propriedades de produção de doença do vírus. As vacinas vivas atenuadas conferem uma melhor protecçâo do que as vacinas inactivadas, entre outras razões porque apresentam ao sistema imunitário do hospedeiro uma maior quantidade de antigénios virais. Uma outra vantagem importante das vacinas vivas consiste no facto de poderem ser administradas por via intranasal, isto é, no local onde ocorre a primeira multiplicação do vírus tipo selvagem (wild type) após a infecção. E, contudo, persistem nas vacinas vivas áreas onde são possíveis melhoramentos. Algumas vacinas vivas parecem continuar a possuir propriedades abortogénicas, que se manifestam em particular após administração intramuscular. Além disso, todas as vacinas vivas permanecem provavelmente num estado de latència nas vacas vacinadas. Para mais, existe a possibilidade de ocorrer um fenómeno de reversão e um regresso ao estado de virulência no caso de a vacina diferir apenas ligeiramente do vírus tipo selvagem. Mas um dos principais problemas consiste no facto de as vacinas de BHV-l não evitarem as infecções provocadas por vírus tipo selvagem. 0 que significa que o gado vacinado pode também disseminar BHV-l tipo selvagem.

Para um programa de controlo de BHV-l adequado, é necessário dispor de uma vacina eficaz e segura que se distinga do vírus tipo selvagem, uma vez que a aplicação de uma vacina eficaz pode reduzir consideravelmente a circulação de BHV-l e um teste que consiga distinguir entre uma vacina e um vírus tipo selvagem torna possível a detecção (e posterior remoção) do gado infectado numa população vacinada.

Entretanto, têm sido desenvolvidas vacinas de BHV-l que parecem ser mais seguras do que as vacinas convencionais e que se distinguem do vírus tipo selvagem. Foi isolado um mutante de delecção de kinase de timidina que é menos abortogénico, se torna latente com menor frequência e não pode ser reactivado. Além disso, e usando técnicas de recombinação de DNA, foi criada uma vacina de BHV-l que apresenta uma delecção no gene da glicoproteína glll, o que permite distinguir esta vacina de BHV-l tipo selvagem utilizando técnicas serológicas. Todavia, persistem algumas objecções relativamente a estas vacinas. Por um lado, o gene de quinase de timidina está implicado na replicação virai e um menor grau de replicação pode provocar um menor grau de protecção. Por outro lado, a glicoproteína glll é importante para a produção de anticorpos protectores, o que torna uma vacina com delecção de glll menos eficaz. Um problema prático consiste, no facto de a administração intranasal, que geralrnente proporciona a melhor protecção, de vacinas recombinantes não ser permitida nalguns países. Consequentemente, existe a necessidade de uma vacina gue seja não só segura como eficaz e que, contudo, possa ser distinguida de BHV-1 tipo selvagem, sendo ainda desejável que pelo menos uma dessas vacinas se baseie num vírus atenuado seguindo uma via tradicional em vez de se basear num vírus construído por técnicas de recombinação de DNA.

Por intermédio de passagens em culturas de células, obteve-se agora uma estirpe de BHV-1 que não possui o gene da glicoproteína gE. Os primeiros resultados das nossas pesquisa indicam que esse gene é bastante útil para se estabelecer uma distinção serológica relativamente a BHV-1 tipo selvagem e que estã envolvido na expressão da virulência. Por conseguinte, a sua delecção contribui para a segurança e pode tornar supérflua a utilização de delecções de quinase de timidina. A glicoproteína gE parece ser menos importante na indução de protecção do que a glicoproteína glll. Uma estirpe de BHV-l atenuada de modo convencional que possa ser distinguida serologicamente de vírus tipo selvagem é única. A localização e sequência de DNA do gene gE aqui descritas pela primeira vez não eram previamente conhecidas, tal como não eram conhecidos oligonucleõtidos, polipéptidos e olipéptidos que possam ser dele derivados. Um teste permitindo estabelecer uma distinção serológica com base no gene gE é igualmente único.

Uma vantagem importante deste mutante de delecção de gE convencional (a designação convencional diz respeito à utilização de um método convencional para isolar um vírus atenuado) consiste no facto de que serã possível administrã-lo por via intranasal em países onde tal é proibido, no que dis respeito a vacinas recombinantes. Contudo, e tendo em conta os diferentes pontos de vista existentes relativamente à questão da segurança, foram também construídas, para além desta vacina de delecção de gu convencional, versões recombinantes bem definidas. Estas vacinas recombinantes apresentam também uma delecção de gE podendo apresentar ou não apresentar também uma delecção no gene de quinase de timidina - e podem ser usadas também também como vectores para expressão de genes heterólogos. Todas estas vacinas recombinantes podem ser distinguidas do vírus tipo selvagem por intermédio do mesmo teste gE-específico. A utilização de um teste padronizado para um conjunto de diferentes vacinas pode constituir uma grande vantagem no combate ao BHV-1, enquanto esforço internacional. Uma tal abordagem do problema não tinha sido previamente descrita no campo das vacinas de BHV-1.

A anãlise serológica da reacção anti-BHV 1 em gado revelou que uma fracção importante dos anticorpos anti-gE é dirigida contra um complexo formado pela glicoproteína gE e por outro glicoproteína de BHV-1: a glicoproteína gl. Os testes serolõgicos que demonstram (também) a presença desses anticorpos específicos relatívamente ao complexo podem, por conseguinte, revelar-se mais sensíveis do que os testes que conseguem detectar apenas anticorpos anti-gE. O gado vacinado com um único mutante de delecção de gE pode produzir anticorpos anti-gl que podem interferir com a detecção de anticorpos anti-gl/gE. Consequentemente, este invento inclui também uma vacina com uma delecção dupla de gl/gE.

SUMÁRIO DO INVENTO

Em primeiro lugar, este invento proporciona um mutante de delecção de BHV-1 que apresenta uma delecção no gene da glicoproteína gE. A expressão uma delecção no pretende abranger uma delecção da totalidade do gene.

Uma forma de realização preferida deste invento é constituída por um mutante de delecção de BHV-1 que apresenta uma delecção no gene da glicoproteína gE que foi provocada por um processo de atenuação, tal como o mutante de delecção Difivac-1 que adiante se descreve.

Outras formas de realização preferidas do invento consistem num mutante de delecção de BHV-1 que inclui uma delecção no gene da glicoproteína gE que foi construída por meio de técnicas de recombinação de DNA, tal como os mutantes de delecção 1B7 ou 1B8 que adiante se descrevem.

Uma outra forma de realização preferida deste invento consiste num mutante de delecção dupla de BHV-1 que inclui uma delecção no gene da glicoproteína gE e uma delecção no gene da glicoproteína gl, tal como o mutante de delecção dupla de gl/ggE Difivac-IE que adiante se descreve.

Além disso, com a finalidade de obter o máximo de segurança, prefere-se de acordo com o invento um mutante de delecção de BHV-1 que apresenta uma delecção no gene da glicoproteína gE e uma delecção no gene de quinase de timidina. Este invento abrange também um mutante de delecção de BHV-1 que apresenta uma delecção no gene da glicoproteína gE, no gene da glicoproteína gl e no gene de quinase de timidina.

O invento proporciona uma vacina para vacinação de animais, em particular mamíferos, mais especificamente gado bovino, com o objectivo de os proteger de BHV-1, que inclui um mutante de delecção tal como foi atrás definido e um veículo ou adjuvante adequados. Essa composição pode, ser uma vacina viva ou inactivada.

O invento tem outra úas suas formas de realização num mutante de BHV-1 que apresenta uma delecção no gene da glicoproteína gE e contém um gene heterólogo introduzido por meio de técnicas de recombinação de DNA. Este diz respeito, de preferência, a um mutante de BHV-1 que contém um gene heterólogo introduzido por meio de técnicas de recombinação de DNA no local do gene da glicoproteína gE, gene heterólogo esse que estã sob o controlo das sequências reguladoras do gene gE e está facultativamente ligado à parte do gene gE que codifica um péptido sinal. O referido gene heterólogo pode também estar sob o controlo de um promotor diferente de BHV-1, ou sob o controlo de um promotor heterólogo. Quando o mutante de BHV-1 apresenta outras delecções para além da delecção no gene da glicoproteína gE, tal como uma delecção no gene de quinase de timidina e/ou uma delecção no gene da glicoproteína gl, o referido gene heterólogo pode também ser inserido no local desta(s) delecção(ões) adicional(ais). As inserções múltiplas são outras possibilidade, quer em conjunto no local de uma delecção, quer distribuídas pelos locais de diversas delecções.

O gene heterólogo introduzido codifica, de preferência, uma proteína ou péptido ou proteína imunogénicos de outro agente patogénico, ou uma citoquina que promove a reacção imunitária. Constituem exemplos de citoquinas adequadas a interleuquina 2, o interferon-alfa e o interferon-gama.

O invento proporciona também uma vacina (viva ou inactivada) para a vacinação de animais, em particular mamíferos, mais especificamente gado bovino, a fim de os proteger de um agente patogénio (diferente), que inclui um mutante de BHV-1 apresentando um qene heterólogo que codifica um péptido ou proteína imunogénicos desse outro agente patogénico, e um veículo ou adjuvante adequados. É claro que a protecção pode dizer respeito a mais de um agente patogénico, isto é, a uma vacina multivalente em que o mutante apresenta uma diversidade de genes heterólogos.

invento diz ainda respeito a uma composição que inclui um ácido nucleíco recombinante que inclui o gene da glicoproteína gE de BHV-1, uma parte deste gene da glicoproteína gE ou uma sequência de nucleótidos derivada deste gene da glicoproteína gE. Esta composição pode incluir um vector de clonagem ou expressão apresentando uma inserção de um ácido nucleíco recombinante que inclui o gene da glicoproteína gE de BHV-1 , uma parte deste gene da glicoproteína gE ou uma sequência de nucleótidos derivada deste gene da glicoproteína gE.

Este invento inclui também uma composição que inclui a glicoproteína gE de BHV-1, uma parte desta glicoproteína gE, um péptido derivado desta glicoproteína gE, ou um complexo das glicoproteínas gE e gl, e uma composição que inclui um anticorpo que é específico relativamente à glicoproteína gE de BHV-1, a uma parte desta glicoproteína gE, a um péptido derivado desta glicoproteína gE ou a um complexo das glicoproteínas gE e gl. A expressão anticorpo deve ser entendida como dizendo respeito tanto a uma preparação de anticorpo policlonal como a um anticorpo monoclonal preferido para a maioria das aplicações. As expressões uma parte da glicoproteína gE e um péptido derivado da glicoproteína gE devem ser entendidas como referindo-se a sequências de aminoácidos específicas de gE gue, de um modo geral, terão um comprimento de pelo menos 8 aminoácidos.

Este invento diz ainda respeito a um kit de diagnóstico para detecção de ácido nucleíco de BHV-1 numa amostra, em particular numa amostra biológica tal como sangue ou soro sanguíneo, células existentes no sangue, leite, fluidos do corpo tais como lágrimas, fluido de lavagem dos pulmões, fluido nasal, esperma, em particular sémen, saliva, expectoração ou tecidos, em particular tecidos do sistema nervoso, proveniente de um animal, em particular de um mamífero, mais especificamente de um bovino, que inclui uma sonda ou primer de ácido nucleico com uma sequência de nucleótidos derivada do gene da glicoproteína gE de BHV-1, e um meio de detecção adequado para um teste de detecção de ácidos nucleicos.

Além disso, o invento diz respeito a um kit de diagnóstico para detecção de anticorpos específicos relativamente a BHV-1, numa amostra, em particular numa amostra biológica tal como sangue ou soro sanguíneo, saliva, expectoração, fluidos do corpo tais como lágrimas, fluido de lavagem dos pulmões, fluido nasal, leite, ou tecidos, proveniente de um animal, em particular de um mamífero, mais especificamente de um bovino, que inclui glicoproteína gE de BHV-l, uma parte desta glicoproteína gE, um péptido derivado desta glicoproteína gE, ou um complexo das glicoproteínas gE e gl, e um meio de detecção adequado para um teste de detecção de anticorpos. Um tal kit de diagnóstico pode incluir adicionalmente um ou mais anticorpos específicos relativamente à glicoproteína gE de BHV-1 ou específicos relativamente a um complexo das glicoproteínas gE e gl de BHV-1.

Este invento diz também respeito a um kit de diagnóstico para detecção de proteínas de BHV-l numa amostra, em particular numa amostra biológica tal como sangue ou soro sanguíneo, células existentes no sangue, leite, fluidos do corpo tais como lágrimas, fluido de lavagem dos pulmões, fluido nasal, esperma, em particular sémen, saliva, expectoração ou tecidos, em particular tecidos do sistema nervoso, proveniente de um animal, em particular de um mamífero, mais especificamente de um bovino, que inclui um ou mais anticorpos específicos relativamente ã glicoprotéina gE de BHV-l ou que são específicos relativamente ao complexo das glicoprotéinas gE e gl de BHV-l, e um meio de detecção adequado para um teste de detecção de proteínas.

invento proporciona ainda um método de determinação de infecção por BHV-l num animal, em particular num mamífero, mais especificamente num bovino, que inclui o exame de uma amostra proveniente do animal, em particular de uma amostra biológica tal como sangue ou soro sanguíneo, células existentes no sangue, esperma, em particular sémen, saliva, expectoração, fluidos do corpo tais como lágrimas, fluido de lavagem dos pulmões, fluido nasal, leite, ou tecidos, em particular tecidos do sistema nervoso, para detecção da presença de ácido nucleico que inclua o gene da glicoprotéina gE de BHV-l, ou da presença da glicoprotéina gE de BHV-l ou de um complexo das glicoprotéinas gE e gl de BHV-l, ou da presença de anticorpos que são específicos relativamente à glicoprotéina gE de BHV-l ou específicos relativamente a um complexo das glicoprotéinas gE e gl de BHV-l, A amostra a examinar pode provir de um animal que não tenha sido previamente vacinado com uma vacina de acordo com o invento ou de um animal que foi previamente vacinado com uma vacina de acordo com o invento.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DO INVENTO

O invento diz respeito a um conjunto de vacinas de BHV-l, tanto vivas como inactivadas, que têm em comum o facto de não apresentarem o gene da glicoprotéina gE, na sua totalidade ou parcialmente. Este conjunto inclui tanto um mutante de delecção de gE natural como mutantes de delecção de gE construídos que podem, ou não, apresentar também uma delecção do gene de quinase de timidína e/ou do gene da glicoprotéina gl, e mutantes de delecção de gE construídos que são usados como vectores para genes heterõlogos. Este invento diz ainda respeito a sequências de nucleótidos que codificam o gene da glicoprotéina gE de BHV-1, a oiigonucleõtidos derivados dessas sequências, à própria glicoproteína gE, a péptídos dela derivados e a anticorpos (monoclonais e policlonais) que dirigidos contra a glicoprotéina gE e a péptídos deles derivados. O invento diz também respeito a complexos das glicoproteínas gE e gl de BHV-1 e a anticorpos dirigidos contra esses complexos.

Estes materiais de acordo com o invento podem ser usados para:

1) vacinar gado contra as doenças provocadas por BHV-1, de tal modo que seja possível distinguir entre os animais infectados por BHV-1 e os animais vacinados; a vacina convencional e a vacina construída podem ser usadas lado a lado;

2) vacinar gado contra doenças provocadas por BHV-1 e doenças provocadas por outros agentes patogénicos, podendo sequências provenientes destes que codificam antigénios protectores ser incorporadas nos mutantes de delecção de BHV-1;

3) testar sangue, soro sanguíneo, leite ou outros fluidos do corpo provenientes de gado a fim de determinar serologicamente ou recorrendo a técnicas de detecção de ácidos nucleicos (por ex. PCR) se os animais foram infectados por um BHV-1 tipo selvagemou se foram vacinados com um mutante de delecção de gE.

Síntese de oligopéptidos, polipéptidos e glicoproteínas derivados da sequência codificadora do gene da glicoprotéina gE e do gene da glicoprotéina gl de BHV-1

Os resultados da análise da sequência de UNA, descrita nos exemplos, do gene da glicoprotéina gE (Fig. 3A) e dos fragmentos de DNA isolado que codificam este gene tornam possível, recorrendo a procedimentos convencionais em biologia molecular, não só sintetizar péptidos da proteína gE (oligo ou polipéptidos) como exprimir a proteína gE na sua totalidade ou numa porção considerável por intermédio da via procariótica (em bactérias) ou da via eucariótica (por exemplo, em células murinas). Por intermédio destas vias é possível obter antigénio específico relativamente a gE que pode, por exemplo, servir para produzir anticorpos monoclonais (monoclonal antibodies ou Mabs) específicos relativamente a gE. Além disso, os antigénios específicos relativamente a gE (e os Mabs específicos relativamente a gE) podem ser usados em testes serológicos para permitir o estabelecimento de uma distinção entre animais vacinados com uma vacina de delecção de gE de BHV-1 e animais infectados com vírus BHV-1 tipo selvagem.

Os resultados da análise parcial da sequência de DNA do gene da glicoprotéina gl - descritos nos exemplos - e dos fragmentos de DNA isolado que codificam este gene, em conjunto com as células eucarióticas que exprimem a glicoprotéina gE, permitem a expressão do complexo gl/gE em células eucarióticas (ver Figuras 13 e 14). Este complexo de glicoproteínas pode ser usado para produzir anticorpos monoclonais específicos relativamente a gl/gE. O complexo gl/gE pode também ser usado como antigénio em testes serológicos para permitir diferenciar entre gado vacinado com um mutante de delecção única de gE de BHV-1 ou com um mutante de delecção dupla de gl/gE de BHV-1 e gado infectado com vírus BHV-1 tipo selvagem.

Péptidos específicos de gE

Com base numa sequência que codifica uma proteína conhecida, e por intermédio de um sintetizador automático, é possível preparar polipéptidos com não menos de 40-50 aminoãcidos Agora que foi revelada a sequência codificadora de proteína da glicoproteína gE da estirpe Lam de BHV-1 (Fig. 3A) , é possível sintetizar polipéptidos desta glicoproteína gE de BHV-1. Com esses polipéptidos, e de acordo com métodos convencionais, é possível imunizar animais experimentais tais como murganhos ou coelhos a fim de produzirem anticorpos específicos relativamente a gE. Além disso, usando estes péptidos específicos de gE, é possível especificar de modo mais completo os locais onde os anticorpos anti-gE reagem com a proteína gE (os epítopos), utilizando, por exemplo o método PEPSCAN (Geysen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 3998-4002). Os oligopéptidos específicos de gE podem também ser usados em testes serológicos que demonstram anticorpos anti-gE.

Expressão procariótica de gE

Para a síntese da proteína gE em bactérias (isto é, para a expressão procariótica de gE), os fragmentos de DNA que codificam a glicoproteína gE ou partes desta têm de ser clonados em vectores de expressão procariótica. Os vectores de expressão procariótica são moléculas circulares de DNA que permanecem no interior de uma bactéria como moléculas que se replicam separadamente (plasmideos). Estes vectores de expressão apresentam um ou mais genes marcadores (marker genes) que codificam uma resistência a um antibiótico, permitindo desse modo a selecção das bactérias que contêm o vector de expressão. Além disso, os vectores de expressão incluem uma região promotora (frequentemente controlável) atrás da qual podem ser ligados fragmentos de DNA que são depois expressos sob a influência do promuLor. Em muitos vectores de expressão procariótica correntes, a proteína desejada é expressa fundida com uma proteína denominada proteína veículo (carrier protein). Com essa finalidade, está localizada no vector, atrãs do promotor, a sequência que codifica a proteína o fragmento de DNA ser ligado imediatamente As proteínas resultantes de fusão são, com frequência, mais estáveis e mais fáceis de reconhecer e/ou de isolar. O estado de equilíbrio que uma proteína resultante de fusão específica pode atingir numa determinada estirpe bacteriana difere de fusão para fusão e de estirpe para estirpe. É vulgar experimentar diversas combinações.

veículo, podendo adjacente a ela

Expressão eucariótica do gene da glicoproteína gE

Embora a expressão procariótica de proteínas apresente certas vantagens, as proteínas não apresentam as modificações, como glicosilação e outras análogas, que ocorrem nas células eucarióticas. Consequentemente, as proteínas expressas eucarioticamente constituem, com frequência, antigénios mais adequados. Para a expressão heteróloga de proteínas em células eucarióticas, tais como células murinas, utilizam-se vectores de expressão eucariótica. Estes vectores são plasmideos que não só se podem multiplicar não apenas em bactérias E. coli mas também subsistem de modo estável em células eucarióticas. Para além de um marcador de selecção procariótica, apresentam também um marcador de selecção eucariótica. Tal como sucede com os vectores de expressão procariótica, os vectores de expressão eucariótica apresentam uma região promotora atrás da qual podem ser ligados os genes desejados. Todavis, as sequências promotoras nos vectores eucarióticos são específicas para células eucarióticas. Além disso, a fusão com proteínas veículo só raramente é utilizada em vectores eucarióticos. Estes vectores são introduzidos nas células eucarióticas por um método de tranfecção convencional (F.L. Graham e A.J. van der Eb, 1973, Virology 52, 456-467). Para além dos vectores plasmídeo eucarióticos existem também vectores virais, em que o gene heterólogo é introduzido no genoma de um vírus (por ex. retrovirus, vírus de herpes e vírus vaccinia). As células eucarióticas podem depois ser infectadas com vírus recombinantes.

De um modo geral, não é possível prever qual o tipo de vector e de célula que são mais adequados para um gene específico. Na maioria dos casos são experimentadas diversas combinações

Expressão eucariótica tanto da glicoproteína gE como da glicoproteína gí

A estrutura final de uma proteína depende da sua sequência primária de aminoácidos, do modo como se dobra sobre si mesma, das modificações pós-translacionais, etc. Um factor importante que contribui para a estrutura de uma proteína consiste na sua interacção com uma ou mais outras proteínas. Descobrimos que também a glicoproteína gE de BHV-l forma um complexo com pelo menos uma outra glicoproteína: a glicoproteína gí de BHV-l. 0 primeiro indício da existência de um tal complexo veio dos nossos resultados com os Mabs anti-gE candidatos: 1, 51, 67, 75 e 78 (ver Quadro 2). Estes Mabs não reagiram com Difivac-1, nem com Lam gE , sendo também incapazes de reconhecer células 3T3 que exprimiam a glicoproteína gE. Todavia, estes Mabs reagiam com células 3T3 que exprimiam gE após infecção com Difivac-1, revelando que eram necessários factores complementares para conferir à glicoproteína gE a conformação antigénica adequada.para estes Mabs. Nalgumas das nossas experiências de rádio-imunoprecipita— ção com Mab 81 verificámos a co-precípitação de uma proteína com um peso molecular aparente de 63 kD. Tendo em conta que a glicoproteína gE do vírus de herpes simplex forma um complexo oom uma proteína de peso molecular comparável (glicoproteína gl de HSVl), concluímos que a glicoproteína gE de BHV-1 forma um complexo com o homólogode BHV-1 da glicoproteína gl. Para podermos estudar este complexo gE/gl de BHV-1 e para produzir antigênio de gE com a estrutura antigénica adequada exprimimos ambas as glicoproteínas numa única célula eucariótica. Para tal, aplicámos os mesmos procedimentos descritos para a expressão eucariótica da glicoproteína gE isoladamente. O único pré-requisito adicional consiste na utilização de vectores de expressão com marcadores de selecção eucariõticos diferentes.

Testes serológicos

Os métodos serológicos utilizados para estabelecer uma distinção entre gado vacinado com Difivac-1 e gado infectado com BHV-1 tipo selvagem com base em anticorpos anti-gE baseiam-se, de preferência, na utilização de anticorpos monoclonais dirigidos contra gE. Estes podem ser utilizados dos seguintes modos:

a) De acordo com o princípio descrito por Van Oirschot et al. (Journal of Virological Methods 22, 191-206, 1988). Neste procedimento ELISA para a detecção de anticorpos gl contra o vírus da doença de Aujeszky, a demonstração dos anticorpos é feita por intermédio do seu efeito bloqueador da reacção de dois Mabs apresentando dois epítopos diferentes em gl. O teste é levado a cabo tal como a seguir se descreve. Placas de micotitulação são revestidas com Mab 1, permanecendo de um dia para o outro a 37°C, após o que são guardadas, por ex. a 4°C ou a -20°C. 0 soro a analisar é pré-incubado com antigênio em placas de microtitulação diferentes não revestidas, por ex. durante 2 h a 37°C. As placas revestidas com Mab 1 são lavadas, por ex. 5 vezes, após o que se adiciona Mab 2 ligado a peroxidase de rábano as (horseradish peroxidase uu HRPO) <λ essas placas. Depois misturas soro-antigénio pré-incubadas são transferidas para as placas em que estão os dois Mabs, a que se segue incubação, por ex. durante 1 ha 37°C. As placas são lavadas e adiciona-se substrato a cada cavidade. Após por ex. 2 h à temperatura ambiente, as placas são analisadas espectrofotometricamente. São incluídos em cada placa quatro soros de controlo negativos e quatro diluições em série de um soro positivo. O soro que apresenta um valor de densidade óptica (optical density ou OD) inferior a 50% do valor OD médio dos quatro soros de controlo negativos que foram examinados na mesma placa é considerado positivo.

b) De acordo com o princípio de Indirect Double Antibody

Sandwich ou IDAS. Aqui, as placas de microtitulação são revestidas com um Mab ou um soro policlonal dirigido contra a proteína gE. A incubação com uma preparação de antigénio de gE resulta na ligação de gE ao revestimento. Os anticorpos especificamente dirigidos contra gE no soro bovino a ser examinado subsequentemente ligam-se a gE. Este anticorpos ligados são reconhecidos por um conjugado de imunoglobulina anti-bovina. Os anticorpos neste conjugado ligam-se por meio de ligações covalentes à enzima peroxidase. Finalmente, o conjugado ligado é visualizado por adição de um substrato cromogénico. A especificidade da reacção é verificada utilizando o mesmo procedimento com uma preparação de controlo gE-negativa no lugar da preparação de antigénio de gE. Em cada placa de microtitulação incluem-se soros de controlo positivos e negativos. O teste é válido se o soro positivo apresentar um resultado positivo a um determinado valor de diluição. Um soro é positivo se apresentar um valor OD superior em 0,2 ao do soro de controlo negativo convencional.

c) De acordo com o principio idas, tal como foi descrito em b), mas após incubação do soro a examinar utiliza-se um conjugado Mab anti-gE/HRPO em vez do conjugado de imunoglobulina anti-bovina. Podem ser usados um soro de péptido anti-gE ou um soro policlonal anti-gE em vez do Mab anti-gE. As placas são lavadas e a cada cavidade adiciona-se um substrato cromogénico. Após, por ex. 2 h à temperatura ambiente, as placas são analisadas espectrofotometricamente. Incluem-se em cada placa quatro soros de controlo negativos e quatro diluições em série de um soro positivo. O soro que apresenta um valor OD inferior em 50% ao valor OD médio dos quatro soros de controlo negativos examinados na mesma placa é considerado positivo.

d) De acordo com o princípio de um procedimento ELISA de bloqueamento, em que um antigénio de vírus que pode apresentar-se ou não purificado é utilizado para revestir a placa de microtitulação de um dia para o outro. Nestas placas, o soro a examinar é incubado durante, por ex., uma hora ou durante mais tempo a 37°C. Após um procedimento de lavagem, adiciona-se às placas um Mab anti-gE, a que se segue incubação durante, por ex., lha 37°C. Podem ser utilizados um soro de péptido anti-gE ou um soro policlonal anti-gE em vez do Mab anti-gE. As placas são lavadas e a cada cavidade adiciona-se um substrato cromogénico. Após, por ex., 2 h à temperatura, as placas são analisadas espectrofotometricamente. Incluem-se em cada placa quatro soros de controlo negativos e quatro diluições em série de um soro positivo. 0 soro que apresenta um valor OD inferior em 50% ao valor OD médio dos quatro soros de controlo negativos que foram examinados na mesma placa é considerado positivo.

Em todos os procedimentos atrás descritos pode ser usado antigénio de vírus cultivado de modo convencional que contenha gE, mas o mesmo sucede com antigénio de gE cuja expressão tem lugar por meio de proeariunLes ou eueariontes. Em alternativa, poderiam ser usados nos testes de diagnóstico atrás referidos oligopéptidos com base na sequência de gE de BHV-1, em vez de antigénio convencional. Além disso, esses oligopéptidos poderiam ser usados para o desenvolvimento de um designado cow-side test, de acordo com o princípio descrito num artigo de Kemp et al., Science 241, 1352-1354, 1988. Um tal teste basear-se-ia então numa ligação da sequência antigénica do oligopéptido a anticorpos dirigidos contra gE, presentes em animais infectados Para um tal teste, o oligopéptido teria de ser ligado a um Mab dirigido contra eritrócitos de bovino.

Análise de ácidos nucleicos usando a técnica PCR

Os oligonucleótidos (sondas e primers) podem, por exemplo, ser usados numa reacção em cadeia de polimerase a fim de se estabelecer uma distinção entre animais vacinados e infectados A reacção em cadeia de polimerase (polymerase chain reaction ou PCR) é uma técnica por intermédio da qual os ácidos nucleicos de um agente patogénico podem ser multiplicados biliões de vezes num curto espaço de tempo (De polymerase kettingreactie, P.F. Hilderink, J.A. Wagenaar, J.W.B. van der Giessen e B.A.M. van der Zeijst, 1990, Tijdschrift voor Diergeneeskunde deel 115, 1111-1117). Os oligonucleótidos de gE podem ser escolhidos de tal modo que num genoma positivo de gE se forme um produto diferente daquele se forma num genoma negativo. A vantagem disto consiste no facto de um animal que tenha sido vacinado com uma vacina com delecção de gE também originar um sinal positivo num teste PCR. Todavia, esta abordagem depende da presença de ãcidos nucleicos do vírus numa amostra, por exemplo sangue, proveniente do animal que se pretende testar.

Após uma infecção aguda por BIIV-l, existe uma grande probabilidade de poder ser feita no sangue a demonstração de ácidos nucleicos específicos de BHV-1, mas ainda não se estabeleceu se os ácidos nucleicos de BHV-1 podem também ser demosntrados no sangue durante o período de latência.

A utilização de BHV-1 como vector

Para a expressão de genes heterõlogos no genoma de BHV-1, é necessário dispor de informações exactas acerca da área onde se pretende inserir o gene heterólogo. Não devem ser perturbadas quaisquer sequências fundamentais, e as sequências de regulação devem permanecer disponíveis para a expressão do gene heterólogo. Em princípio, o gene da glicoproteína gE constitui um local adequado para a expressão de genes heterólogos. O gene gE não é essencial, não existindo por conseguinte qualquer objecção à substituição do gene gE por um gene heterólogo. Em consequência disso, o gene heterólogo pode ser posicionado de tal modo que se encontre sob a influência das sequências de regulação do gene gE. Todavia, não é necessário utilizar as sequências de regulação do gene gE. A expressão de genes heterõlogos pode ser controlada, alternativamente, por outras sequências de regulação, por ex. mais fortes, de genes diferentes. É também possível ligar o gene heterólogo ao péptido sinal (exportado) do gene gE, de tal modo gue a secreção do produto do gene heterólogo possa ser influenciada. É óbvio que um conhecimento pormenorizado do gene gE e da proteína gE confere a possibilidade de utilização de BHV-1 como vector de um modo muito controlado. Os vectores desenvolvidos podem, além disso, ser distinguidos serologicamente do tipo selvagem. A construção de mutantes de BHV-1 que exprimam genes heterólogos pode ser levada a cabo de modo análogo àquele que foi utilizado para a construção de mutantes com delecção de gE, tal como se descreve nos exemplos. Todavia, os fragmentos de âelecçãu devem depois ser substituídos por um fragmento apresentando um gene heterólogo no local da delecção.

EXEMPLOS

1) Isolamento e identificação de um mutante com delecção de gE natural

a) Isolamento de um mutante natural

Isolou-se DNA genómico de uma série de vacinas atenuadas de modo convencional de acordo com métodos conhecidos, que se analisou utilizando enzimas de restrição. Em particular, procurámos desvios no genoma -que fossem adequados permitindo distinguir o vírus BHV-1 tipo selvagem.

A atenção foi dirigida em particular para a região U_g do genoma de BHV-1, uma vez que estão provavelmente localizados nessa região - por analogia com o vírus de herpes simplex - uma série de genes que codificam glicoproteínas não essenciais [Identification of a herpes simplex virus 1 glycoprotein gene with a gene cluster dispensable for growth in cell culture, R. Longnecker, S. Chatterjee, R.J. Whitley e B. Roizman (1987), Proc. Natl. Acad. Sei. 84, 4303-4307].

Um lote de uma vacina de BHV-1 proveniente da Universidade de Zagreb, Jugoslávia (Lugovic et al., Veterinarski Arhiv 55, 241-245, 1985), após um grande número de passagens em células embrionárias de rim de bovino e células embrionãrias de traqueia de bovino (Ebtr) revelou apresentar uma região U_g apresentando desvio para além de uma região U_g normal. Estas vacina parecia, além disso, dar origem à formação de plaquetas pequenas e grandes em células Etbr. A partir desta população mista isolou-se um

vírus com uma região Ug apresentando desvio, por intermédio de três passos de diluição com limitação, escolhendo-se de cada vez plaquetas pequenas. O vírus isolado por este método foi examinado adicionalmente e designado Difivac-1, tendo sido depositado no Institut Pasteur, Paris, França, a 27 de Maio de 1992, com o número de depósito 1-1213.

b) Identificação da delecção no gene gE em Difivac-1

Para uma análise adicional deste desvio na região U_o, o

O

DNA genómico de Difivac-1 foi isolado de acordo com métodos convencionais e submetidos a uma análise pela técnica Southern blot (Fig. IA). A hibridação deste blot com um fragmento K de 32

HindIII tipo selvagem marcado com P confirmou que o fragmento, localizado na zona central da região Ug, era cerca de 1,0 kilobase (kb) mais curto em Difivac-1. Além disso, foi possível por intermédio desta análise obter a posição aproximada da parte que faltava (Fig. ÍB). Para uma análise adicional desta delecção , a região U da estirpe Lam de BHV-l tipo selvagem foi isolada e

O clonada em vectores procariõticos. Com essa finalidade, e de acordo com métodos convencionais, isolou-se DNA genómico da estirpe Lam (Fig. 2A) que foi clonado nos vectores pUC18, pACYC e pBR322 (Fig. 2B). Compôs-se um mapa físico da área em volta da suposta posição da delecção (Fig. 2C). Partindo deste mapa físico, construíram-se subclones adequados para a determinação da sequências de nucleótidos dessa área nos vectores pKUN19 e pUC18 (Fig. 2D). Usando esses subclones, determinou-se a sequência de nucleótidos das duas cadeias em toda a área (indicada na Fig. 2C), recorrendo ao método Sanger. Esta sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:1) foi analisada usando o programa PC/Gene. Partindo da tradução conceptual, verificou-se que os nucleótidos (nt) 168 a nt 1893 pareciam codificar um quadro de leitura aberto (open reading frame) de 575 aminoácidos (Fig. 3A). Uma análise ulterior revelou que esta sequência de aminoácidos apresenta as características de uma glicoproteína transmembrana, tal como se mostra na Fig. 3B. Na realidade, os primeiros 26 aminoácidos (aa) são reconhecidos como constituindo um sinal de exportação eucariótico típico (export signal) e a ãrea entre aa 423 e aa 450 é reconhecida como constituindo uma região transmembrana. Além disso, existem nesta sequência três locais potenciais de glicosilação N-ligada. Esta sequência prevista de aminoácidos apresenta claras semelhanças com o gene da glicoproteína gE do vírus de herpes simplex (HSV); ver Figs. 4A e 4B. Estas e outras semelhanças justificam a conclusão de que o gene encontrado constitui o homólogo de gE de BHV-1. Por esse motivo, o gene é designado gE· A fim de determinar até que ponto este gene gE de BHV-1 falta em Difivac-1, o fragmento p318 foi isolado. O fragmento p3lS começa no local Alui 55 nt antes do quadro de leitura aberto de gE de BHV-1 postulado e termina 133 nt depois dele. O DNA genómico de Difivac-1 foi analisado com este fragmento p3lS usando a técnica de hibridação de Southern blot. Este procedimento revelou que o Difivac-1 não continha quaisquer sequências detectãveis de p318 (Fig. 5). Esta experiência confirmou que o Difivac-1 apresenta uma delecção e demonstrou claramente que essa delecção abrange a totalidade do gene gE.

Para determinar a dimensão e a posição da região que sofreu delecção, clonaram-se em vectores procarióticos sequências genómicas abrangendo a região U_g de Difivac-1. Ver Figura 11C. O fragmento EcoRI de 14,5 kb foi cionado no vector pACYC e designado ρ775· O fragmento HindIII de 7,4 kb foi cionado independentemente no vector pUC18 e designado p728. A partir do clone p728 isolaram-se dois subclones: o fragmento PstI de 1,4 kb no clone p737 e o fragmento Aluil-PstI de 350 bp no clone p754. A análise com enzimas de restrição e a análise por intermédio da técnica de Southern blot destes clones (resultados não

apresentados) demosntram que a delecção de gE em Difivac-1 tem um comprimento de 2,7 kb, começando imediatamente a 5' do gene gE e terminando na fronteira da região Ug. Estes 2,7 kb foram substituídos por uma duplicação de um segmento de 1 kb, localizado na região U„ gue se opõe ao gene gE, como extensão/aberração da

O região de repetição. Ver Figura 11B. Para confirmar os resultados desta análise e determinar o ponto exacto de recombinação, a sequência de nucleõtidos da maior parte do fragmento inserido (insert) do clone p754 foi determinada e comparada com sequências tipo selvagem. Ver Figura 12. Esta análise mostrou que o ponto de recombinação se situa 77 bp a montante do codão start do gene gE.

c) Avaliação da segurança e eficácia de Difivac-1

O Difivac-1 foi testado em vitelos de sete semanas apresentando seronegatividade específica relativamente a BHV-1 e livres de agentes patogénicos. Sete vitelos foram vacinados por via intranasal com 10 TCID₅₀ em 2 ml, de que se pulverizou 1 ml em cada narina. A oito vitelos de sete semanas apresentando seronegatividade específica relativamente a BHV-1 e livres de agentes patogénicos, mantidos numa unidade de isolamento separada, foram administrados 2 ml de meio de cultura por via intranasal, tendo servido de animais de controlo não vacinados. Cinco semanas após a vacinação, os vitelos vacinados e de controlo 7 foram submetidos a um desafio por via intranasal com 10 TCID^„ 50 da estirpe Iowa, uma estirpe de BHV-1 extremamente virulenta. Seis semanas após o desafio, todos os vitelos foram tratados por via intramuscular com dexametasona durante 5 dias, a fim de serem reactivados vírus latentes putativos. A evolução dos sintomas clínicos, temperaturas rectais e crescimento dos seus corpos foi seguida. Procedeu-se ao isolamento dos vírus a partir de recolhas de material nasal e os títulos dos anticorpos neutralizantes foram determinados em soro.

Após a vacinação, o comportamento, apetite, temperatura rectal e taxa de crescimento dos vitelos permaneceram normais, mas os animais vacinados apresentavam descargas nasais de soro e alguma hipersalivação. Não foram observadas lesões na mucosa nasal. Verificou-se a excreção de Difivac-1 em recolhas de material nasal após a vacinação (Fig. 17). Todos os vitelos vacinados produziram anticorpos neutralizantes relativamente a BHV-1.

Após o desafio, todos os vitelos não vacinados apresentavam sinais de apatia, perda de apetite, descargas oculares e nasais, gengivas do maxilar inferior mais vermelhas, lesões graves das mucosas nasais até 14 dias após o desafio e uma interrupção do crescimento de 4 dias. Os vitelos vacinados apresentavam pequenas lesões das mucosas nasais que rapidamente saravam e não apresentavam qualquer interrupção do processo de crescimento. Nas Figs. 18, 19 e 20 apresentam-se os valores clínicos, as temperaturas rectais e o desenvolvimento do processo de crescimento diários após o desafio. Após o desafio, todos os vitelos libertavam vírus pelo focinho, embora a quantidade da excreção e o período durante o qual ela ocorria fosse marcadamente mais reduzidos nos vitelos vacinados (Fig. 21). Nos vitelos vacinados teve lugar uma reacção de anticorpos secundária e os vitelos não vacinados produziram todos anticorpos após o desafio.

Após a reactivação, o vírus do desafio foi isolado a partir de um vitelo vacinado e de 5 vitelos não vacinados. Não foi possível reactivar Difivac-1.

Os resultados atrás referidos demonstram que Difivac-1 praticamente não induzia quaisquer sintomas de doença em vitelos jovens e não podia ser reactivado. 0 Difivac-1 reduzia acentuadamente a gravidade da doença e a quantidade de excreção de vírus após o desafio.

Em conclusão, o Difivac-1 constitui uma vacina segura e eficaz para utilização em gado bovino contra infecções provocadas por BHV-1.

2) Construção de mutantes de delecção de gE de BHV-1 recombinantes

A fim de se poder dispor de vacinas de BHV-1 diferenciáveis que, de um ponto de vista molecular, estivessem mais bem definidas do que Difivac-1 e que, caso se desejasse, apresentassem uma delecção, por exemplo, no gene da quinase de timidina, para além de uma delecção no gene gE, construíram-se, para além de Difivac-1, mutantes de delecção de gE recombinantes. Partindo da posição determinada do gene da glicoproteína gE e utilizando os fragmentos de DNA clonados que flanqueiam o gene gE, foi possível construir um fragmento de delecção de gE. Utilizando uma técnica convencional (F.L. Graham e A.J. van der Eb, 1973, Virology 52, 456-467), foi possível recombinar este fragmento de delecção no genoma de uma estirpe de BHV-1 tipo selvagem, de que resultou um mutante de delecção de gE.

a) A construção do fragmento de delecção de gE

Para a construção do fragmento de delecção de gE, teve-se como objectivo a obtenção de uro fragmento a que, por um lado, faltasse a totalidade da sequência gE e que, por outro, apresentasse uma sequência flanqueadora com extensão suficiente para permitir recombinação com o genoma tipo selvagem. Do lado 5' (a montante), foi escolhido o fragmento PstI-AsuII de 1,2 kb que termina 18 nt antes do codão start do gene gE. Para o fragmento 3' (a jusante) foi escolhido o fragmento EcoNI-Dral de

1,2 kb, que começa 2 nt antes do codão stop do gene gE (fig. 6) ·

Para a construção do fragmento de delecção de gE, o fragmento PstI-Smal de 1,4 kb proveniente do fragmento HindIII K de 8,4 kb da estirpe Lam de BHV-l, localizado no lado 5' do gene gE, foi subclonado no local Smal e PstI do plasmídeo pUC18. Este clone foi designado p515. O fragmento EcoNI-Smal localizado no lado 3' de gE e proveniente do clone HindIII-EcoRI de 4,1 kb foi clonado no único local AsuII de p515. Deste modo se completou a construção do fragmento de delecção de gE, tendo o clone assim construído sido designado p519. Embora, em princípio, a totalidade do fragmento inserido (insert) PstI-Smal de p519 pudesse ser usada como fragmento de delecção de gE, tal não era aconselhável. De facto, o fragmento PstI-Smal prolonga-se por cerca de 100-150 pares de bases (bp) para o interior da sequência de repetição (repeat sequence) que flanqueia a região U_g. Este fragmento de 100-150 bp pode, em princípio, recombinar-se com a sequência de repetição do outro lado da área U_g onde o gene gE não está localizado, dando origem desse modo a produtos de recombinação não desejados. Por esse motivo, foi escolhido o fragmento PstI-Dral para a experiência de recombinação, pelo que 100 bp da sequência de repetição são removidos.

b) Recombinação do fragmento de delecção de gE com o genoma de BHV-l tipo selvagem

Com o objectivo de levar a cabo a recombinação entre o fragmento de delecção de gE construído e o genoma de BHV-1 tipo selvagem, cotransfectaram-se quantidades da ordem dos microgramas das duas moléculas de DNA para células embrionárias de traqueia de bovino (Ebtr) de acordo com a técnica convencional de F.L. Graham c A.J. van der Eb (1973 , Virologia 52, 456-467) . Os mecanismos de recombinação celular proporcionam a recombinação de uma pequema percentagem das moléculas de DNA (2-4%) que foram incorporadas pelas células. Para efeitos de selecção dos mutantes de delecção de gE recombinados, a mistura de vírus que se forma após a transfecção é disseminada numa cultura fresca de células de Ebtr. Na maioria dos casos, as diferentes populações de vírus que desse modo se desenvolvem (plaquetas) têm origem num vírus. Para o isolamento dos mutantes de delecção de gE da estirpe Lam de BHV-1, isolaram-se 230 dessas plaquetas que foram examinadas de acordo com métodos imunológicos convencionais, recorrendo a anticorpos monoclonais específicos relativamente a BHV-1 (Mabs) que não reagem com células infectadas por Difivac-1. Estes Mabs são dirigidos contra a glicoproteína gE. Cinco das

230 plaquetas não reagiram com	esses Mabs.	Procedeu-se	a	uma
anãlise	adicional do	DNA dessas	5 plaquetas.
c)	Anãlise do	DNA dos	mutantes de	delecção de	gE	da
estirpe	Lam de BHV-1	construídos
	Preparações	de DNA de	3 (1B7, 1B8	e 2H10) dos 5	mutan-

tes de delecção de gE candidatos atrás referidos foram analisados adicionalmente utilizando a técnica convencional de análise Southern blot (Sambrook et al. 1989). Digestões duplas destas preparações de DNA com PstI e Dral, seguidas por electroforese sobre gel e hibridação pela técnica Southern blot com o fragmento de delecção PstI-Dral de 2,3 kb funcionando como sonda revelaram que o gene gE do genoma das populações de vírus 1B7 e 1B8 tinha sido removido exactamento do modo desejado; ver Figs.

7Α e 7B. A população 2H10 apresentava um fragmento PstI-Dral que se desviava dessa situação. Hibridações pela técnica de Southern blot com uma sonda específica relativamente a gE revelaram não existirem quaisquer sequências gE localizadas em qualquer uma das três preparações de DNA (resultados não apresentados) . As populações de vírus BHV-1 1B7 e 1B8 foram consideradas populações de mutantes de delecção de gE recombinantes. A população de vírus BHV-1 1B7 foi testada relativamente às suas possíveis propriedades como vacina.

d) Construção de mutantes de delecção dupla quinase de timidina/gE

Uma vez que os mutates de delecção recombinantes de BHV-1 com uma delecção em apenas um gene podem não apresentar uma virulência suficientemente reduzida, proporcionaram-se também delecções no gene da quinase de timidina (thymidine kinase ou TK) das estirpes Lam e Harberink de BHV-1. Estes mutantes foram construídos de modo análogo àquele que foi utilizado para os mutantes de delecção de gE atrás referidos (resultados não apresentados). Estes mutantes de delecção de TK foram usados para construir mutantes de delecção dupla TK/gE.

e) Construção de mutantes de delecção dupla glicoproteína gl/glicoproteína gE

Uma vez que o gado vacinado com um mutante de delecção única gE pode produzir anticorpos anti-gl que podem interferir com a detecção de anticorpos anti-gl/gE (situação adiante analisada) , inventámos também uma vacina com uma delecção dupla gl/gE. Um tal mutante de delecção dupla gT/gF pode, ser construído usando os mesmos procedimentos que foram utilizados para a construção do mutante de delecção única gE. A análise parcial da sequência de nucleótidos da extremidade a montante do fragmento PstI de 1,8 kb - que cobre a extremidade 5' do gene gE - revelou um quadro de leitura aberto apresentando uma homologia significativa relativamente a homólogos de gl encontrados noutros vírus de herpes. Ver Figuras 13 e 14. Utilizando 0 fragmento Smal-PstI de 350 bp que inclui a extremidade 5' putativa do gene gl e o fragmento EcoNI-Smal, situado a jusante do gene gE, é possível construir um fragmento de delecção de gE/gí- Este fragmento pode ser recombinado com o genoma selvagem tipo selvagem a fim de proporcionar um mutante de delecção de gl/gE de BHV-1. Ver Figura 16. Os 80-90 aminoácidos que, em teoria, podem ainda ser produzidos, serão incapazes de promover o aparecimento de anticorpos que possam, de algum modo, interferir com a detecção de anticorpos anti-gl/gE. Uma análise mais completa da sequência de nucleótidos do gene gl permitirá construir uma delecç:ão de gl que abranja a totalidade da região que codifica gl. Este mutante de delecção dupla gl/gE foi baptizado Difivac-IE.

f) Avaliação da segurança e eficácia dos mutantes Lam gE e Lam gE ,TK

As propriedades como vacinas das estirpes mutantes de

BHV-1 Lam gE~ e Lam gE^-,TK^- foram testadas em vitelos com sete semanas, seronegativos relativamente a BHV-1 e livres de agentes patogénicos específicos. Cada uma das estirpes mutantes foi administrada a 6 vitelos por meio de pulverização intranasal. A 5 cada vitelo foi administrada uma dose total de 10 ΤΟΙϋ^θ em 2 ml de meio de cultura, de que se pulverizou 1 ml em cada narina. Seis outros vitelos foram pulverizados por via intranasal com meio de cultura sem vírus, e serviram de animais de controlo não vacinados. Cinco semanas após a vacinação , todos os vitelos, tanto aqueles que tinham sido vacinados como os controlos, foram submetidos a um desafio por via intranasal com 10⁷ TCID₅₀ da estirpe lowa, uma estirpe extremamente virulenta de BHV-1. Após a vacinação e após o desafio, a evolução dos sintomas clínicos, temperaturas rectais e pesos corporais foi seguida. Foi recolhido material nasal a fim de se determinar o número de dias de libertação de vírus por via nasal.

Após a vacinação, o comportamento, apetite, temperatura rectal e taxa de crescimento dos vitelos permaneceu normal. Em todos os vitelos vacinados foram observadas descarga nasal de soro e pequenas lesões da mucosa nasal. Foi possível isolar vírus a partir dos focinhos dos vitelos vacinados durante cerca de 7 dias (Quadro 1).

Após o desafio, todos os vitelos não vacinados revelaram apatia, falta de apetite, descargas oculares e nasais, gengivas do maxilar inferior avermelhadas, lesões graves das mucosas nasais e crescimento reduzido. Os vitelos vacinados com Lam gE ,TK desenvolveram todos alguma descarga nasal e revelaram ligeiras lesões das mucosas nasais. Nem todos os vitelos vacinados com Lam gE desenvolveram descargas nasais ou lesões das mucosas nasais. Nos vitelos vacinados não se observaram apatia, falta de apetite ou outros sintomas clínicos da doença. As temperaturas rectais, o crescimento e os valores clínicos após o desafio são apresentados nas Figs. 22, 23 e 24. Os vitelos não vacinados libertaram vírus pelo focinho durante o dobro do tempo dos vitelos vacinados (Quadro 1).

Os resultados atrás referidos demonstram que as estirpes mutantes de BHV-l Lam gE e Lam gE ,TK praticamente não induzem quaisquer sintomas clínicos da doença em vitelos jovens. Ambas as estirpes mutantes evitaram a doença após o desafio e reduziram o período de libertação nasal do vírus em 50%.

As estirpes mutantes de BHV-1 Lam gE e Lam gE , TK são seguras e eficazes, podendo ser usadas na vacinação de gado bovino contra infecções provocadas por BHV-1.

3)

Expressão procariótica de gE

Para a expressão procariótica do gene da glicoproteína gE de BHV-1 têm sido utilizados, até agora, vectores de expressão pGEX (D.B. Smith e K.S.

vectores pGEX codificam glutationa (glutathione

Johnson, Gene 67 (1988) 31-40). Os a proteína veículo S-transferase de S-transferase ou GTS) de Schistosoma japonicum que está sob a influência do promotor tac que pode ser induzido a exprimir-se por meio de Isopropiltiogalactosídeo (Isopropylthiogalactoside ou IPTG). Constitui um exemplo de uma proteína de fusão GST~gE o produto do material construído pGEX-2T600s3 (Fig. 8A). Neste material construído recorrendo a técnicas de biologia molecular convencionais (Sambrook et al., 1989) , um fragmento Smal de 600 bp que codifica uma região N-terminal de 200 aminoácidos da proteína gE foi ligado atrás do gene de GST. Este material construído foi concebido em triplicado, sendo ligado ao GST de cada vez um quadro de leitura diferente do fragmento de 600 bp. Os três materiais construídos foram introduzidos na estirpe DH5a de Escherichia coli, induzidos com IPTG e as proteínas que se formaram foram tranferidas para nitrocelulose após electroforése sobre gel de poliacrilamida por meio da técnica de Western blotting. A detecção imunológica com anticorpos anti-GST revelou que apenas o quadro de leitura adequado (ο N2 3) que codifica a área da proteína gE origina a expressão de uma proteína de fusão proeminente com a dimensão prevista de 27k (GST) + 20k (gE) = 47k. Três dos Mabs isolados por nós que não reagem com Difivac-1 reconhecem a proteína de fusão de 47 kD GST-gE numa análise pela técnica Western blot; ver figura 8B.

4) Expressão eucariótica do gene da glicoproteína gE

Para a expressão eucariótica do gene da glicoproteína gE foi escolhido, anteriormente e entre outros, o vector pRVHis. O vector pEVHis apresenta, como marcador eucariótico (eukaryotic marker), o gene HisD que codifica a desidrogenase de histidinol [EC 1.1.1.23] (C. Hartmann e R. Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 8047-8051) que leva a células a sobreviverem à concentração tóxica de histidinol 2,5 mM. Este vector inclui, ainda, a região promotora do gene precoce imediato (immediate early gene) do citomegalovírus humano (human cytomegalovirus ou HCMV), com locais de enzimas de restrição únicos situados atrás dele. Para a construção de um vector de expressão pEVHis/gE foi utilizado um fragmento que incluía a totalidade da região codificadora do gene da glicoproteína gE. Esta tem início no local Alui 55 bp antes do quadro de leitura aberto de gE que foi postulado e termina 133 bp atrás dele. Esta região foi cionada atrás do promotor de HCMV do vector pEVHis, tendo desse modo sido obtido o material construído (construct) pEVHis/gE (Fig. 9). O pEVHis/gE foi amplificado em células de E. coli DH5a e purificado por meio de um gradiente de cloreto de césio (Sambrook et al., 1989). Este DNA purificado foi transfectado para células Balb/C-3T3 de acordo com o método de Graham e Van der Eb. As células transformadas foram seleccionadas com histidinol, o que permitiu o isolamento de vinte colónias resistentes ao histidinol. Estas colónias foram examinadas com Mab 81 por meio de um ensaio do tipo Immuno Peroxidase Monolayer Assay (IPMA). Quatro colónias revelaram exprimir a proteína gE. Destas quatro colónias, foi utilizado o clone 9 de 3T3 gE para isolar um subclone apresentando uma elevada expressão de gE. O clone isolado por este método (denominado 3T3gE 9.5) foi utilizado para a caracterização de anticorpos monoclonais anti-gE candidatos.

5) Expressão eucariótica da glicoproteína gE de BHV-1 e da glicoproteína gl de BHV-1 na mesma célula

A fim de exprimirmos a glicoproteína gl de BHV-l na mesma célula da glicoproteína gE de BHV-1 determinamos em primeiro lugar a posição putativa do gene gl de BHV-1. Uma vez que o gene da glicoproteína gl do vírus herpes simplex se situa imediatamente a montante do gene da glicoproteína gE, inferiu-se gue o gene gl de BHV-l se situaria numa posição correspondente. Para testar esta hipótese, determinou-se a sequência de uma região de 283 nucleôtidos, localizada cerca de 1 kb a montante do início do gene gE de BHV-1. A tradução conceptual desta região revelou que o segundo quadro de leitura codifica uma sequência de 94 aminoãcidos que é homóloga da glicoproteína gl do vírus herpes simplex (figuras 13 e 14). Uma vez que o segmento homólogo se situa a cerca de 80 aminoácidos do codão start, calcula-se que o start putativo do quadro de leitura aberto do gene gl de BHV-1 se situe cerca de 250 nt a montante da região cuja sequência foi determinada. Daqui inferiu-se que o fragmento Smal de 1,7 kb que se inicia 400 nt a montante da região cuja sequência foi determinada e que termina no interior do gene gE deveria conter a totalidade da região codificadora do gene gl de BHV-1. Este fragmento Smal de 1,7 kb foi cionado no vector eucariótico MSV-neo (Ver figura 15). Este vector inclui o promotor forte do Vírus de Sarcoma Murino (Murine Sarcoma Virus ou MSV) e o gene selector neo que codifica a resistência ao antibiótico G-418 sulphate Geneticin. O material construído resultante MSVneo Gl foi amplificado em células E. coli DH5a e foi transfectado para células 3T3gE 9.5 utilizando o método de Graham e Van der Eb. As células transfectadas foram seleccionadas com 400 gg de GeneLiein/ml de meio de cultura e as colónias resistentes foram isoladas e testadas com Mabs anti-gE candidatos que não reagiam com células 3T3gE 9.5. A partir daqui seleccionámos o clone

3T3gE/gI R20 que reagia com, por ex., Mab 66, tão bem como o BHV-1 tipo selvagem.

6) Caracterizaçao dos Mabs anti-gE candidatos

Produziram-se Mabs relativamente a BHV-1 tipo selvagem, que se seleccionaram em relação á sua incapacidade para reagirem com células embrionárias de traqueia de bovino (embryonic bovine trachea cells ou Ebtr) infectadas com Difivac-1. Estes Mabs são examinados relativamente à sua reactividade em relação a

a) o mutante de delecção Lam gE ;

b) o produto de expressão procariótica atrás descrito num teste do tipo Western blot;

c) as células Balb/c-3T3 exprimindo gE atrás descritas ;

d) células referidas em c) e infectadas com Difivac-1, e

e) células Balb/c-3T3 exprimindo o complexo gE/gl.

Para os testes de reactividade referidos em a, c, d e e foi utilizado um teste do tipo Immuno Peroxidase Monolayer Assay (IPMA). Os resultados apresentados no Quadro 2 revelam que produzimos Mabs dirigidos contra gE (n2 2, 3, 4, 52, 66, 68, 72 e 81) e Mabs (ns 1, 51, 53, 67, 75 e 78) que podem ser dirigidos contra domínios de conformação antigénicos no complexo gE/gl. Um teste IPMA competitivo para estabelecimento de um mapa (mapping) dos domínios antigénicos reconhecidos pelos diferentes Mabs revelou a presença de pelo menos 4 domínios antigénicos na glicoproteína gE e o facto de o complexo gE/gl formar provavelmente um domínio (Quadro 2).

Detecção de anticorpos anti-gE em gado infectado com

BHV-1

Para investigar se no soro de gado infectado estão presentes anticorpos anti-gE, levou-se a cabo um teste do tipo IPMA com bloqueamento indirecto (indirect blocking IPMA) nos 16 gE-Mabs candidatos e nos 8 soros seleccionados que se seguem:

soros de bovinos vacinados com Difivac-1 e submetidos a um desafio com a estirpe virulenta Iowa, que foram recolhidos 14 dias após o desafio;

soros de bovinos infectados experimentalmente com vírus BHV-1 subtipo 1, que foram recolhidos 20 meses após a infecção. Um dos bovinos foi infectado através de contacto;

soros de bovinos infectados experimentalmente com vírus BHV-1 subtipo 2b, que foram recolhidos 20 meses após a infecção. Um dos bovinos foi infectado através de contacto;

um soro de um vitelo livre de agente patogénico específico vacinado com uma vacina de mutante ts e submetido 3 semanas mais tarde a um desafio com o vírus BHV-1 subtipo 2b, que foi recolhido 7 semanas após o desafio;

um soro de um vitelo gnotobiõtico vacinado com uma vacina de mutante ts e submetido 3 semanas mais tarde a um desafio com vírus BHV-1 subtipo 2b, que foi recolhido 7 semanas após o desafio.

O Quadro 2 mostra que todos estes soros continham anticorpos contra os domínios antigénicos III e IV em gE, e contra o domínio antigénico I que estã provavelmente localizado no complexo gE/gl. Podemos concluir que gE parece constituir um marcador serológico adequado para estabelecer a distinção entre gado infectado com BHV-1 e gado vacinado.

7) Detecção de ácidos nucleicos de BHV-1 por meio da técnica PCR utilizando primers específicos relativamente a gE de BHV-1

Partindo da sequência de nucleótidos do gene gE de BHV-1 que foi determinada, seleccionou-se um par de primers adequado para utilização num procedimento PCR, usando o programa de selecção de primers) de Lowe et al. (T. Lowe, J. Sharefkin,

S. Qi Yang e C.W. Dieffenbach, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 1757-1761). Estes primers foram designados P^ e P^ e estão representados na Fig. 10. Os primers estão separados entre si por 159 nt e dão origem à amplificação de um fragmento de 200 nt. As condições para utilização da técnica PCR foram optimizadas recorrendo à utilização dos primers P^ e P₄ e de DNA de BHV-1 isolado. Isto implicou, em particular, a variação da concentração de MgCl₂, da concentração de glicerol e das condições dos ciclos. A solução tampão óptima encontrada para utilização de P^ e P^ na amplificação de DNA de BHV-1 consiste em Tris pH 8,0 10 mM, KC1 50 mM, gelatina a 0,1%, MgCl₂ 2,6 mM e glicerol a 20%. As condições de ciclo óptimas encontradas (Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler) são, para os ciclos 1-5, de 1 min. 98°C, 30 seg. 55°C e 45 seg. 72°C, e para os ciclos 6-35, de 30 seg. 96°C, 30 seg. 55°C e 45 seg. 72°C. Após a amplificação por meio da técnica PCR, o fragmento de DNA de 200 nt obtido foi submetido a electroforese sobre um gel de agarose a 2%, blotted sobre nitrocelulose e, subsequentemente, submetido a uma análise pela 32 técnica Southern blot. A sonda marcada com P dCTP usada para a análise por meio da técnica Southern blot é o fragmento Taql de 137 bp, que está localizado entre os locais de ligação do primer (Fig. 10). Na sequência de uma auto-radiografia dos filtros hibridizados, foi possível observar uma banda de 200 bp.

Utilizando esta via, a amplificação de apenas 10 genomas de BHV-1 -15 · (aprox. 1,5 x 10 ^g de DNA) proporciona ainda assim um smal que pode ser detectado de modo adequado (resultado não apresentado) . De modo análogo, desenvolveu-se um procedimento PCR utilizando primers” com base na sequência codificadora da glicoproteína glll de BHV-1 (D.R. Fitzpatrick, L.A. Babiuk e T. Zamb, 1989, Virology 173, 46-57). Para que fosse possível estabelecer uma distinção entre DNA de BHV-1 tipo selvagem e uma vacina de mutante de delecção de gE, amostras de DNA foram submetidas tanto a análise PCR específica relativamente a gE como a análise PCR específica relativamente a glll. Num teste deste tipo, verificou-se que uma preparação de DNA de Difivac-1 era positiva relativamente a glll e negativa relativamente a gE.

Uma vez que a detecção de DNA de BHV-1 no sémen de bovinos irã constituir uma utilização importante do procedimento PCR específico relativamente a BHV-1, tentou-se utilizar a técnica PCR específica relativamente a gE em sémen de bovinos infectado com BHV-l. Todavia, existem componentes desconhecidos no sémen que exercem um efeito de inibição forte sobre a reacção em cadeia de polimerase. Foi, por conseguinte, desenvolvido um protocolo para isolar o DNA de BHV-1 do sémen de bovinos. Para isolar o DNA do sémen de bovinos, 30 gl de sémen foram incubados com 1 mg/ml de proteinase K (pK) num volume total de 300 gl de NaCl 0,15 M, Na-Sarkosyl a 0,5% e DTT 40 mM, a 60°C. Passada 1 hora, a amostra foi deixada arrefecer para o valor da temperatura ambiente, adicionaram-se 300 gl de Nal 6 M e o conjunto foi incubado durante 5 minutos. O DNA foi isolado a partir desta mistura por meio de uma extracção convencional com clorofórmio/ isoamiletanol , e precipitado com 1 volume de isopropanol. O precipitado foi lavado com NH^Ac 2,5 M/etanol a 70% e suspenso de novo em Tris pH 7,4 10 mM, EDTA lmM, Tween 80 a 0,5% e 0,1 mg/ml de pK para uma nova incubação durante l hora a 60°c. Esta preparação de DNA pode ser submetida directamente à técnica PCR.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1

Análise pela técnica de Southern blot das estirpes Difivac e Iowa de BHV-1

A. Imagem de um auto-radiograma resultante de uma análise pela técnica Southern blot do DNA genómico de Difivac-1 e Iowa. Nas pistas 1 e 3, o DNA de Difivac-1 foi aplicado após digestão com as enzimas de restrição HindIII e PstI, respectivamente. Nas pistas 2 e 4, o DNA de Iowa foi aplicado após digestão com as enzimas de restrição HindIII e PstI, respectivamente. As dimensões dos fragmentos são indicadas em kilobases (kb).

Isolou-se o DNA virai centrifugando o meio de cultura (70 ml/garrafa de rolamento (roller bottle) de cerca de 450 2 cm ) com células Ebtr infectadas com vírus durante 2 horas através de uma almofada de sucrose a 25% (p/p), em Tris pH 7,4 10 mM, NacL 150 mM e EDTA 1 mM a 20 krpm no rotor SW27 da ultracentrifugadora Beckman L5-65. A partir do grânulo de vírus assim obtido isolou-se o DNA de acordo com técnicas convencionais (J. Sambrook, E.F. Fritsch e T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2§ edição, Cold Spring Harbor laboratory Press, Nova Iorque). Este DNA foi submetido a digestões com enzimas de restrição provenientes de Boehringer Manheim nas soluções SuRE/cut buffers fornecidas pelo fabricante.

Após separação sobre um gel de agarose a 0,7% para efeitos de electroforese horizontal e blotting sobre um filtro de nitrocelulose (Schleioher & Schucll, Inc.), o filtro foi pré-hibridizado durante 6 horas a 42°C em formamida a 50%, 3 x SSC (1 x SSC = NaCl 0,15 M e citrato de Na 0,015 M, pH 7,4), 50 μΐ de DNA de esperma de salmão desnaturado (Sigma)/ml e albumina de soro bovino a 0,02%, polivinil pirrolidona a 0,02% e ficoll a

0,02% e e dodecilsulfato de Na (sodium-dodecylsulphate ou SDS) a 0,1%. Depois levou-se a cabo a hibridação, adicionando a essa solução o fragmento HindIIT K marcado com P dCTP (Amersham) (A escolha do fragmento HindIII K baseia-se em: clonagem e estabelecimento do mapa dos locais de clivagem do DNA de vírus de herpes bovino 1 (estirpe Cooper), John F. Mayfield, Peter J. Good, Holly J. VanOort, Alphonso R. Campbell e David A. Reed, Journal of Virology (1983) 259-264). Após 12-14 horas de hibridação, o filtro foi lavado durante 2 horas em SDS a 0,1% e o,l x SSC a 60°C. O fragmento Hind III K foi clonado no vector pUC18 de acordo com procedimentos convencionais de hibridação (J. Sambrook, E.F. Fritsch e T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2§ edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). Após a digestão com HindIII do clone pUC/8,4 HindIIIK o vector pUC18 foi novamente separado do fragmento HindIII K de 8,4 kb por meio de electroforese sobre gel de Low Melting Point Agarose (BRL, Life Technologies, Inc.) a 0,7%, e isolado da agarose por meio de procedimentos convencionais de extracção com fenol e precipitação com etanol. O fragmento HindIII K isolado foi marcado com Random Primed DNA labeling Kit 1004.760 da Boehringer Mannheim. A auto-radiografia dos filtros hibridizados foi obtida mediante exposição durante 36 horas de um filme Kodak XAR a -70°C, utilizando um ecrã reflector.

B. Mapas físicos do fragmento HindIII K de 8,4 kb de Iowa e do fragmento HindIII de 7,4 kb de Difivac-1. Tendo em conta a co-migração dos fragmentos PstI de 6 kb e a ausência do fragmento PstI de 1,8 kb em Difivac-1, a delecção é postulada na área tracejada.

Figura 2

Subclonagem dos fragmentos de BHV-l tipo selvagem em redor da região em falta em Difivac-1

Em A sao mostrados os componentes do genoma de BHV-l: a região Única Longa (Unique Long ou U ); a região Única Curta

XJ (Unique Short ou U_g) a as duas sequências de repetição (repeats) (Ir e Tr). Este mapa baseia-se na análise publicada da estirpe cooper (John F. Mayfield, Peter J. Good, Holly J. VanOort, Alphonso R. Campbell e David A. Reed, Journal of Virology (1983) 259-264) .

Em B são apresentados os fragmentos da região υθ que foram cionados em vectores procarióticos: um fragmento EcoRl de

15,2 kb em pACYC, um fragmento HindIII de 8,4 kb em pUC18 e um fragmento EcoRI-HindIII de 2,7 kb e de 4,1 kb em pBR322. O isolamento dos fragmentos de DNA virai foi levado a cabo de acordo com os procedimentos que são referidos nas legendes da Fig. IA. A clonagem destes fragmentos nos vários vectores foi executada de acordo com procedimentos convencionais (J. Sambrook, E.F. Fritsch e T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque).

Em C apresenta-se um mapa físico localiza a delecção postulada em Difivac-1.

Em D indicam-se alguns subclones foram utilizados para análises adicionais. PstI foram cionados em pKUNIO e oc restantes da região onde se desta região, que

Os dois fragmentos fragmentos em pUC18.

Figura 3

A: Sequência de nucleõtidos compreendendo 2027 nucleótidos da região U da estirpe Lam de BHV-1 em redor da localizaO , ção postulada que foi eliminada em Difivac-1, tal como se indica na Fig. 2C [do local de reconhecimento de Alui no extremo esquerdo ao local de reconhecimento de HincII no extremo direito]. A sequência de nucleõtidos nos fragmentos de inserção (inserts) dos subclones apresentados na Fig. 2D foi determinada mediante análise das duas cadeias usndo o método de sequenciação didesoxi de Sanger et al. (F. Sanger, S. Nicklen e A.R. Coulson, 1977, Proc. natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467). Com esse fim, foi utilizado ο T7 sequence kit da Pharmacia, de acordo com o procedimento especificado pelo fabricante. Para efeitos 3 5 marcação radioactiva, utilizou-se [ S] dATP (Amersham). anãlise da sequência das regiões ricas em GC com artefactos compressão foi repetida com a variante 7-deaza-dGTP do kit de

A de da

Pharmacia. Por debaixo da sequência utilizando o código de três letras, (aa) do quadro de leitura aberto de de nucleõtidos indica-se, a sequência de aminoãcidos

575 resíduos aa, que foi encontrada após tradução conceptual da sequência de nucleõtidos.

Esta tradução baseia-se no utilizando o programa para 1,03, Novembro 1987). Este código universal e foi determinada computador PC/gene (PC/gene versão quadro de leitura aberto de 575 aa inicia-se com metionina no nt 168 e termina com o codão stop no nucleõtidos 1893.

A anãlise estrutural do quadro de leitura aberto de 575 resíduos aa foi também levada a cabo com o programa de computador PC/gene. Os primeiros 26 aa formam um sinal de exportação eucariõtica identificado na figura pela designação péptido sinal (signal peptide). Com um valor de 6,2, a clivagem desta sequência-sinal é prevista entre aa 26 e aa 27. A sequência de

515 aa apresenta três locais possíveis de glicosilação N-ligada (N-bound glycosylation sites ou NXT/S) indicados por uma linha sob os resíduos aminoácidos. De acordo com o método de Rao e Argos, existe uma região transmembrana entre aa 423 e aa 450, indcntifiçada na figura pela designação hélice transmembrana (transmembrane helix). As sequências (locais) de reconhecimento para as enzimas de restrição AsuII, Smal, HindIII e EconNI estão sublinhadas. O peso molecular calculado deste polipeptido é de 61212.

B: Representação esquemática das caracteristicas estruturais do quadro de leitura aberto de 575 aa atrãs referido.

Figura 4

Comparação de aminoãcidos entre a sequência de aminoãcidos do gene gE de BHV-1 e a sequência de aminoãcidos do gene gE do vírus herpes simplex (HSV) e de outros genes gE homólogos [gl de vírus da pseudo-raiva (pseudo-rabies virus ou PRV) e gpl de vírus varicella-zoster (VZV)]

As sequências utilizadas nesta comparação provêm das seguintes publicações; HSV: Sequence determination and genetic content of the short unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. D.J. McGeoch, A. Dolan, S. Donald e F.J. Rixon (1985) Journal Mol. Biol 181, 1-13. VZV: DNA sequence of the U component of the varicella-zoster virus genome. A.J. Davidson (1983), EMBO Journal 2, 2203-2209. PRV: Use of lambdagtll to isolate genes for two pseudorabies virus glycoproteins with homology to herpes simplex virus and varicella-zoster virus glycoproteins. E.A. Petrovskís, J.G. Timmins e L.E. Post (1986) Journal of Virology 60, 185-193]. Estas sequências foram comparadas usando o programa de análise de sequências Multalin (F. Corpet, 1988, Nucl. Acids Res. 16, 10881-10890).

Em A mostra-se um diagrama em que as quatro sequências de aminoãcidos são apresentadas de modo esquemático. Aqui, as partes transmembrana (TM) previstas são mostradas umas debaixo das outras. Para além das sequências-sinal de exportação previstas (SP) e dos possíveis locais de glicosilação N-ligada (I), apresentam-se duas áreas conservadas em que a posição relativa dos resíduos cisteína permanece com frequência inalterada (CCC).

Em B apresentam-se os meio do programa Multialin, das zadas centralmente nas quatro indicam aminoãcidos idênticos e análogos.

Figura 5

Desenho das fotografias obtidas Difivac-1 e Iowa resultados da comparação, por regiões ricas em cisteína localiversões de gE. Os asteriscos dois pontos indicam aminoãcidos numa análise Southern blot de

Imagem A: DNA genómico de Difivac-1 e Iowa resultante de digestões com as enzimas de restrição Bst (1,2), EcoRI (3,4) e

HindIII (5,6), separado sobre um gel de agarose a 0,7%, blotted sobre nitrocelulose e hibridizado com um fragmento HindIII K 3 2 marcado com P da estirpe Lam de BHV-1 de acordo com os procedimentos especificados nas legendas da Fig. IA.

Imagem B: Blot sobre nitrocelulose do mesmo gel que foi utilizado em A, hibridizado com a sonda p318 específica relativamente a gE de BHV-1. Esta sonda inclui a totalidade da região AluI-HincII indicada na Fig. 2C.

Figura 6

Construção do fragmento de delecção de gE de BHV-1

Em A mostra-sp a posição do gene gE e os clones utilizados. Os componentes do genoma de BHV-1 são: a região Única Longa (Unique Long ou U_L); a região Única Curta (Unique Short ou U ) e as duas sequências de repetição (IR e TR). Para

O se obter a região localizada do lado 5' do gene gE, o fragmento PstI-Smal de 1,4 kb do fragmento HindIII k de 8,4 kb da estirpe Lam de BHV-1 foi subclonado no local Smal e PstI do plasmideo pUC18. Este clone foi designado p515 e é apresentado em B. O fragmento EcoNI-Smal localizado no lado 3' de gE, proveniente do clone HindIII-EcoRI de 4,1 kb, foi clonado no local único AsuII de p515. Para que a ligação da parte EcoNI à parte AsuII, o clone p515 foi digerido com AsuII, e depois tratado com enzima Klenow (Boehringer Mannheim) e dCTP, a fim de proporcionar um resíduo de citosina na parte AsuII de acordo com métodos convencionais (Sambrook et al., 1989). Esta citisina adicional é identificada por um asterisco em D. Depois, o p515 foi também digerido com a enzima Smal, após o que o fragmento EcoNI pôde ser ligado a este vector. O clone assim construído foi designado p519.

Figura 7

A. Desenho de uma fotografia obtida numa análise pela técnica Southern blot de preparações de DNA de 1B7, 1B8 e 2H10. O isolamento do DNA, as digestões com enzimas de restrição, o blotting e a hibridação foram executados de acordo com os procedimentos descritos nas legendas da Fig. IA. Após uma dupla digestão com PstI-Dral das preparações de DNA 1B7, 1B8 e 2H10, os fragmentos foram separados sobre gel de agarose a 0,7% e subsequentemente submetidos a blotting sobre um filtro de nitrocelulose. Este filtro foi hibridizado com o fragmento de 3 2 delecção PstI-Dral de 2,3 kb marcado com P dCTP, utilizado como sonda. Nas pistas 1 a 3, as amostras 1B7, 1B8 e 2H10, respectivamente, foram separadas. Na pista 4 aplicou-se DNA da estirpe Lam de BHV-1 tipo selvagem e na pista 5 o fragmento de delecção de 2,3 kb.

B. Mapa	físico	do fragmento EcoRI de	15,2 kb	da
estirpe Lam de BHV-	•1. O	mapa mostra a	posição ι	dos	locais	de
reconhecimento PstI,	Dral	e HindIII e ι	a posição	da	sonda	de
hibridação referida	em 7A.

Figura 8

Expressão procariótica de gE de BHV-1

Para a expressão procariótica de gE de BHV-1, o fragmento Smal de 600 bp do gene gE foi fundido em três quadros de leitura à região de codificação do gene de glutationa-S-transferase de Schistosoma japonicum no vector pGEX-2T (D.B. Smith e

K.S. Johnson, Gene 67 (1988) 31-40). As moléculas recombinantes com a orientação apropriada (syn) do fragmento Smal foram identificadas por intermédio de uma análise com enzimas de restrição em gue se utilizaram métodos convencionais. Os clones de E. coli DH5a com esta estrutura construída por fusão foram designados pGEX-2T600sl, pGEX-2T-600s2 e pGEX-2T600s3.

A. Diagrama de uma das estruturas construídas pGEX-2T600s. No lado NH₂ da região que codifica o produto de fusão GST-gE está localizada a região promotora tac que pode ser induzida por Isopropiltiogalactosídeo (IPTG) (Isopropylthiogalactoside (IPTG) inducible tac promoter region)

B. Desenho das fotografias obtidas numa análise pela técnica Western blot de preparações totais de proteína de células DH5a transformadas com pGEX-2T600s. Culturas de células DH5a mantidas de um dia para o outro e tranfectadas com as estruturas construídas pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 e pGEX-2T600s3 foram continuadas a 1/10 em meio Luria-Bertani (LB) com 50^g/ml de ampicilina e após 1 hora de crescimento induzidas com IPTG durante 5 horas. Estas culturas induzidas foram centrifugadas durante 5 minutos a 6000 x g e incorporadas em 1 x layermix (SDS a 2%, glicerol a 10%, mercaptoetanol a 5% e azul de bromofenol a 0,01%) [1,5 ml de cultura são incorporados em 500 pl de layermix] e aquecidas a 95°C durante 5 minutos. Depois 50μ1 por pista foram separados num gel de poliacrilamida a 12,5% vertical de acordo com procedimentos convencionais, e subsequentemente submetidos a um processo de semi-dry blotting para um filtro de nitrocelulose utilizando o sistema LKB-multiphor II Nova Blot sob as condições especificadas pelo fabricante.

Nas pistas M aplicou-se proteína-marca pré-tingida (prestained marker protein, BRL Life Technologies, Inc. 236k, 112k, 71k, 44k, 28k, 18k e 15k) e nas pistas 1, 2 e 3 as preparações totais de proteína das células DH5a transfectadas com os três quadros (frames) respectivos: pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 e pGEX-2T600s3.

Na imagem A, pode ver-se o resultado da análise pela técnica Western blot com soro anti-GST. Para o obter, o filtro foi incubado de acordo com procedimentos convencionais (E. Harlow e D. Lane, 1988, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring harbor Laboratory, New York) em solução tampão de bloqueamento (PBS + leite em pó a 2% e Tween 20 a 0,05%) e, subsequentemente, como soro de coelho anti-GST policlonal. Depois o filtro foi lavado e incubado com soro de imonoglobulina de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (horseradish peroxidase (HRPO) conjugated goat-anti-rabbit immunoglobulin serum). Em seguida, os anticorpos de cabra ligados foram detectados imunoquimicamente com cromogénio (diaminobenzidina, cloronaftol e H₂O₂). O produto de fusão GST que é indicado por uma seta tem a dimensão calculada de aproximadamente 47 k apenas no quadro (frame) 3.

Na imagem B, pode ver-se o resultado da anãlise pela técnica Western blot com anticorpo monoclonal Mab 4, que reconhece a proteína gE. Para tal, um filtro duplo tal como na imagem A foi bloqueado, incubado com Mab, lavado e incubado com soro de coelho anti-rato conjugado com HRPO (HRPO conjugated rabbit-anti-mouse serum). Depois, os anticorpos de coelho ligados foram detectados imunoquimicamente com cromogémio. A banda que é visível na pista 3 (quadro 3) tem a dimensão de 47 k e é indicada por uma seta.

Figura 9

Construção do plasmideo pEVHisgE para a expressão eucariótica do gene gE de BHV-1

Para a expressão eucariótica do gene gE, a totalidade da região codificadora de gE foi clonada na orientação adequada atrás da região promotora de HCMV do vector de expressão pEVHis, utilizando procedimentos convencionais (Sambrook et al., 1989). Para tal, o fragmento Alui de 394 bp que começa 55 bp antes do quadro de leitura aberta do gE foi clonado em pUCIS e designado p201. Depois, após a digestão com HincII de p201, o fragmento HincII de 1740 bp, que inclui a maior parte do gene gE, foi clonado em p201. Daqui resultou o plasmídeo p318 que no polylinker de pUC18 inclui a totalidade da área codificadora de gE, desde o local Alui 55 bp antes do codão start de gE até ao local HincII 133 bp atrás do codão stop de gE. Utilizando os locais das enzimas de restrição no polylinker do vector, este fragmento foi separado de p318 com as enzimas BamHI e Sphl. Primeiro, o p318 foi digerido com Sphl e depois o local Sphl foi preenchido utilizando polimerase de Klenow e dNTPs. Após a digestão com BamHI, o fragmento inserido (insert) de 1,9 kb foi separado do vector pUC18 em Low Melting Point Agarose (Agarose de Baixo Ponto de Fusão) e ligado no vector pEVHis que tinha sido digerido com BamHI e EcoRV com essa finalidade. O plasmídeo que assim se formou foi designado pEVHis/gE.

Figura 10

Posição dos primers específicas relativamente a gE e sonda para o procedimento PCR de detecção de DNA de BHV-1

Na figura mostra-se a sequência de ácidos nucleicos do gene da glicoproteína gE de BHV-1, do nucleótido 1272 ao 2027 [a sequência foi extraída da da Fig. 3]. Os primers para o procedimento PCR específico relativamente a gE foram designados p^ e P₄. Os locais de ligação do primer para P₃ e P₄ estão sublinhados. A sequência de nucleótidos de P₃ é 5'-ACG-TGG-TGG-TGC-CAG-TTA-GC-3' (SEQ ID NO:2). A sequência de nucleótidos de P^ é (complementar à sequência de ligação do primer atrás referida) 5'-ACC-AAA-CTT-TGA-ACC-CAG-AGC-G-3' (SEQ ID NO:3). A sonda que foi usada para a hibridação pela técnica Southern blot para a detecção do DNA amplificado por meio da técnica PCR é o fragmento Taql de 137 bp localizado entre os locais de ligação do primer, estando indicadas as extremidades deste fragmento. Para efeitos de comparação com a Fig. 3, indicam-se também os locais HindlII e EcoNI.

Figura 11

Estabelecimento de um mapa (mapping) da delecção de gE de Difivac-1

A representa o mapa físico do fragmento EcoRI de 15,5 kb da estirpe Lam de BHV-1 tipo selvagem. B representa o mapa físico do fragmento EcoRI de 14,5 kb de Difivac-1. Ambos os fragmentos EcoRI cobrem a totalidade das regiões Únicas Curtas (Unique Short) dos genomas dos vírus respectivos. A posição do gene gE e a posição putativa do gene gl são indicadas por caixas abertas. Os mapas A e B estão dispostos de tal forma que os fragmentos PstI de 6 kb no interior de cada mapa se apresentam alinhados. Em ambos os mapas, as sequências de repetição interna e terminal (internai repeat and terminal repeat) foram indicadas por caixas tracejadas. As setas por baixo das sequências de repetição indicam a orientação dessas sequências.

Em A a parte da região U_g que falta na estirpe Difivac-1 estã indicada.

C representa a posição dos fragmentos de Difivac-1 clonados que foram utilizados para estabelecimento do mapa da delecção de gE e para obtenção do mapa físico apresentado em B. As setas por baixo dos fragmentos inseridos dos clones p728, p737 e p754 indicam as regiões cujas sequências foram estabelecidas para se determinar o ponto de recombinação.

Abreviaturas:

A = Alui, E = EcoRI, P = PstI, H = HindIII, de recombinação, IR = sequência de repetição interna repeat), TR = sequência de repetição terminal repeat) .

r = ponto (internai (terminal

Figura 12

Determinação do ponto de recombinação exacto na região U_g de Difivac-1

Para determinar as fronteiras exactas da delecção de gE encontrada na estirpe de Difivac-1, foram determinadas as sequências do clone p754 e das extremidades dos clones p728 e p737. Os fragmentos inseridos nestes clones foram indicados na Figura 11. Os procedimentos utilizados para estabelecer as sequências foram descritos nas legendas da Figura 3.

Em A apresenta-se a sequência da maior parte do fragmento Alui - PstI. Esta sequência inicia-se na região promotora do gene gE. Uma caixa TATA putativa foi sublinhada. No ponto r ( = ponto de recombinação), esta região promotora funde-se com uma sequência encontrada também no local oposto da região U ,

O designada: sequência de repetição invertida (inverted repeat). O ponto de recombinação exacto foi determinado comparando a sequência de repetição encontrada na região promotora de gE com a cópia da sequência de repetição encontrada no local oposto da região Ug. O ponto onde estas sequências divergem foi identificado em Β (I) por meio de um 'r' . Fez-se uma comparação semelhante com a sequência promotora dc gE encontrada em Difivac—1 e o promotor de gE encontrado na estirpe Lam tipo selvagem. O ponto em que estas sequências divergem foi identificado em Β (II) também por meio de um 'r'. Os pontos de recombinação encontrados são iguais.

Figura 13

Análise parcial da sequência do gene gl de BHV-1

A sequência de 284 nucleótidos no interior da região de codificação de gl de BHV-1 foi determinada utilizando o clone PstI de 1,8 kb da estirpe Lam de BHV-1 que penetra tanto no gene gl como no gene gE de BHV-1 (ver Figura 11). Os procedimentos utilizados para estabelecer a sequência foram descritos nas legendas da Figura 3. código universal por

A sequência foi traduzida com base no meio do programa de computador PC/gene versão 1,03 (Novembro, 1987). A sequência de aminoácidos codificada pelo segundo quadro de leitura é indicada por meio do código de uma única letra sob a sequência de nucleótidos. Esta sequência de aminoácidos é homóloga da região codificadora de outros homólogos de gl de vírus de herpes (ver Figura 14).

Figura 14

Comparação de aminoácidos entre a sequência parcial de aminoãcidos do gene gl de BHV-1 putativo e as partes correspondentes das regiões codificadoras do gene gl do vírus de herpes simplex (herpes simplex virus ou HSV1), do gene gp63 do vírus de pseudo-raiva (pseudorabies virus ou PRV) e do gene gpIV do vírus varicella-zoster (VZV).

A sequência PRV inicia-se no aminoãcido 82, a sequência HSV1 inicia-se no aa 80 e a sequência VZV inicia-se no aa 76 das suas respectivas regiões codificadoras. As sequências utilizadas foram publicadas nos artigos referidos nas legendas da Figura 4.

A comparação foi levada a cabo usando o programa para computador Multalin. Os asteriscos indicam aminoácidos idênticos e os indicam aminoácidos análogos.

Figura 15

Construção do plasmídeo MSVneoGI para a expressão eucariótica do gene gí de BHV-l

A posição putativa do gene gí de BHV-l foi determinada com base na comparação de aminoácidos da sequência parcial do gene gí de BHV-l. Com base nesta determinação, inferiu-se que o fragmento Smal de 1,7 kb deveria conter a totalidade da região codificadora do gene gE de BHV-l. A posição deste fragmento Smal de 1,7 kb é indicada em A. às extremidades rombas (blunt ends) deste fragmento Smal de 1,7 kb foram ligados linkers BamHI, recoorrendo a procedimentos convencionais. O produto resultante foi digerido com BamHI e ligado no vector de expressão eucariótica MSV-neo. 0 vector MSV-neo tem um local único BamHI atrás de MSV-LTR, que apresenta uma intensa actividade promotora. Este vector foi descrito em Rijsewijk et al., 1987 EMBO J. 6, 127-131.

Fiqura 16

Construção de um fragmento de delecção dupla gl/gE de BHV-l

A posição do gene da glicoproteína gE e a posição putativa do gene da glicoproteína gí na região U_g de BHV-l são representadas no diagrama A. 0 blocos tracejados indicam as sequências de repetição que ladeia a região Ug. B representa o mapa físico de alguns locais dc enzimas de restrição essenciais relativamente à posição de ambos os genes. Para construir o fragmento de delecção gl/gE o clone pl.7-SmaI/o contendo o fragmento Srnal de 1,7 kb que abrange o gene gl tem de ser digerido com PstI. As extremidades do local PstI do fragmento inserido Smal-PstI de 350 bp remanescente são tornadas rombas utilizando técnicas de biologia molecular convencionais. As extremidades do fragmento EcoNI-RmaT (ver Figura 6B), isolado a partir do fragmento HindIII-EcoRI de 4,1 kb descrito na Figura 6A são também tornadas rombas e o fragmento é ligado ao local PstI modificado. Este processo é representado em diagrama em C e D. O fragmento Smal-Dral de 1,4 kb pode ser isolado a partir do clone ράΙΕ resultante para ser recombinado com DNA de BHV-1 tipo selvagem.

Abreviaturas:

E = EcoRI, H = HindIII, S = Srnal, P = PstI, ENI = EcoNI, D = Dral, kb = kilobase e U_g = Única Curta (Unique Short).

Figura 17

Libertação média de vírus por via nasal em vitelos após vacinação . = vacinados com Difivac-1, 0 = controlos não vacinados

Figura 18

Valores clínicos diários médios em vitelos após desafio com uma estirpe virulenta de BHV-1, chave tal como na Fig. 17.

Figura 19

Temperatura rectal média em vitelos após desafio com uma estirpe virulenta de BHV-1, chave tal como na Fig. 17.

Figura 20

Crescimento médio da vitelos após desafio com uma estirpe virulenta de BHV-1, chave tal como na Fig. 17.

Figura 21

Libertação média de vírus por via nasal em vitelos após desafio com uma estirpe virulenta de BHV-1, chave tal como na Fig. 17.

Figura 22

Temperatura rectal média em vitelos após desafio com uma estirpe virulenta de BHV-1 . = vacinados com Lam gE , 0 = vacinados com Lam gE /TK , x = controlos não vacinados.

Figura 23

Crescimento médio da vitelos após desafio com uma estirpe virulenta de BHV-1, chave tal como na Fig. 22.

Figura 24

Valores clínicos diários médios em vitelos após desafio com uma estirpe virulenta de BHV-1, chave tal como na Fig. 22.

QUADRO 1

Libertação de vírus por via nasal em vitelos após vacinação com Lam gE~ ou Lam gE /TK e após desafio com uma estirpe de BHV-1 virulenta destes vitelos vacinados <? de controlo

Ns médio de dias de libertação de vírus por via nasal

Grupo

Após vacinação Após desafio

Controlo	0					10,33	+	1,	51
Lam gE	7,	00	+	0,	, 89	4,83	+	1,	17
Lam gE /TK	7,	17	+	1,	, 33	5,17	+	0,	98

QUADRO 2

Caracterização de gE-Mabs

Mab	REACTIVIDADE DE gE-MABS CANDIDATOS	COM
	Difivac-1	Lam	Prok.	3T3	3T3 gE	3T3	Grupo	Gado
	3T3/EBTR	gE_		gE	Dí f ivac-	i gE/gi	Ag	Ab
1	-	-	nd	-	+	7	I	+
2	-	-	-	+	+	+	II	-
3	-	-	+	+	+	+	7	-
4	-	-	+	+	+	+	7	-
42	-	-	nd	-	-	7	V?	+
51	-	-	nd	-	+	+	III	+
52	-	-	+	+	+	+	7	-
53	-	-	nd	-	+	+	III	+
59	-	-	nd	-	-	+	III	+
66	-	-	nd	+	+	+	III	+
67	-	-	nd	-	+	+	III	+
68	-	-	-	+	+	+	IV	+
72	-	-	-	+	+	+	V	+
75	-	-	nd	-	+	7	I	+
78	-	-	nd	-	+	7	nd	-
81	-	-	-	+	+	+	II?	-

+ : Todos os 8 soros testados apresentam um valor de percentagem de bloqueamento > 50% num análise IPMA de bloqueamento indirecto (indirect blocking IPMA).

± : Os soros apresentam um valor de percentagem de bloqueamento de + 50%.

: Os soros apresentam um valor de percentagem de bloqueamento < 50%.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

SEQ ID NO:1

COMPRIMENTO: 2027 nucleótidos, 575 aminoácidos TIPO: nucleótido e aminoácido TIPO DE CADEIA: única

—> eliminado em Difivacl

120

PvxiII

CTC GCC GAC CCG CAC GTC TCG GCG CAG CTG GGT Leu Ala Asp Pro His Vai Ser Ala Gin Leu Gly

130 135

CGC AAC GCG ACC GGG Axc A. s n. Ala T l·? r Gly 140

599

GTG CTG ATC	GCG GCC GCA GCC GAG GAG GAC GG\^ Gv^—	GTG Vai	TAC Tyr	TTC CTG Phe Leu 160	647
Vai 145	Leu lie	Aia A.la Ala A±a Glu Glu 150	Asp	Gly Gly 155
TAC	GAC CGG	CTC ATC GGC GAC GCC GGC	GAC	GAG GAG	ACG	CAG	TTG GCG	695
Tyr	Asn Arg	Leu lie Gly Asp Ala Gly 165	Asp 170	Glu Glu	Thr	Gin	Leu Ala 175
CTG	ACG CTG	CAG GTC GCG ACG GCC GGC	GCG	CAG GGC	GCC	GCG	CGG GAC	743
Leu	Thr Leu	Gin Vai Ala Thr Ala Gly 180 185	Ala	Gin Gly	Ala	Ala 190	Arg Asp
GAG	GAG AGG	GAA CCA GCG ACC G\jG CCC	ACC	CCC GGC	CCG	CCG	CCC CAC	791
Glu	Glu Arg 195	Glu Pro Ala Thr C-iy Pro 20Õ	Thr	Pro Gly	Pro 205	Pro	Pro His
CGC	ACG ACG	ACA CGC GCG CCC CCG CGG	CGG	CAC GGC	GCG	CGC	TTC CGC	839
Arg	Tb 210	Thr Arg Ala Pro Pro Arg 215	Arg	His Gly 220 Saal	Ala	Arg	Phe Arg
GTG	CTG CCG	TAC CAC TCC CAC GTA TAC	AC.C	CCG GGC	GAT	TCC	TCC CTG	887
Vai 225	Leu Pro	Tyr His Ser His Vai Tyr 230	Thr	Pro Gly 235	Asp	Ser	Phe Leu 240
CTA	TCG GTG	CGT CTG CAG TCT GAG TTT	TTC	GAC GAG	GCT	CCC	TTC TCG	935
Leu	Ser Vai	Arg Leu Gin Ser Glu Phe 245	Phe 250	Asp Glu	Ala	Pro	Phe Ser 255
GCC	AGC ATC	GAC TGG TAC TTC CTG CGG	ACG	GCC GGC	GAC	TGC	GCG CTC	983
Ala	Ser lie	Asp Trp Tyr Phe Leu Arg	Thr	Ala Gly	Asp	Cys	Ala Leu

260 265 270

ACC CGC AGA GAC GAG ACG Ile Arg lie Tyr Glu Thr

275

TGC AGC TGC CAC CCC GAG Cys lie Phe His Pro Glu

230

CGG CAC CCC GCC GAC GCG Leu His Pro Ala Asp Ala

290

CAG TGC AGC TGC GCG GCG Gin Cvs Ser Phe Ala Ser 295 ' 300

GCA CCG C-CC TGC 1031

Ala Pro Ala Cvs

235

CCG TAC CGC TCC 1079 Pro Tyr Arg Ser

GAG ACC GGG GAC AGC CGG Glu Thr Vai Tyr Ser Arg 305 310

CGG GAC GAG CAG TC-C CGC Leu Tyr Glu Gin Cy3 Arg

315

CCG C-AC CCT GCC 1127 Pro Asp Pro Ala

320

GGT C^C TGG CCG CAC GA Glv Arg Trp Pro His Gi

325

TGC GAG GGC GCC GCG TA.C GCG Cvs Glu Glv Ala Ala Tyr Ala 330

GCG CCC GTT Ala Pro Vai 335

1175

GCG

Ala

CAC CTG CGT CCC His Leu Arg Pro

340

GCC AA Ala As

AAC AGC GTA GAC CTG GTC Asn Vai Asp Leu Vai

345

Phe

350

GAC GAC A.SO Asp

1223

GCG

CCG

GCC

G^_G GCC

TCG

GGG

CTT

TAC

GTC

TTT

GTG

CTG

CAG

..v-

AAC

1271

Ala

Pro

Ala

Ala Ala

Ser

C-lv

Leu

Tvr

Vai

Phe

Vai

Leu

Gin

Tvr

Asn

355

360

355

HincZi

T

GGC

CAC

C-TG

GAA_GCC

_ -AVJ

GAC

TAC

AGC

CTA

GTC

GTT

ACT

TCG

GAC

CGT

1319

Glv

His

Vai

Glu Ala

ASO

Tvr

Ser

Leu

Vai

Vai

Thr

Ser

Asp

Arg

370

375

380

TTG GTG CGC GCG GTC ACC GAC CAC ACG CGC CCC GAG GCC GCA GCC GCC 1367

Leu Vai Arg Ala Vai Thr As? His Thr Arg Pro Glu Ala Ala Ala Ala

385 ' 390 ' 395 400

GAC C-CT CCC GAG CCA C-GC CCA CCG CTC ACC AGC GAG CCG GCC- C-GC GCG 1415

Asp Ala Pro Glu Pro Gly Pro Pro Leu Thr Ser Glu Pro Ala Gly Ala

405 410 415

CCC ACC GGG CCC GCG CCC TGG CTT C-TG GTG CTG GTG GC-C GCG CTT GGA 14 53

Pro Thr Gly Pro Ala Pro Trp Leu Vai Vai Leu Vai Gly Ala Leu Gly

420 425 430 =================== HÉLICE transmembrana =======

CTC GCG C-GA CTC- C-TC- GC-C ATC GCA C-CC CTC GCC GTT CGG C-TC- TGC C-C3 1511

Leu Ala Gly Leu Vai Gly lie Ala Ala Leu A.ia Vai Arg Vai Cys Ala

435 440 445

455

460

AAC CCC CCC GGG Asn Pro Phe Gly

AC G.

sr. G

470

CCG CTC GAC GTG GTG GTG Pro Leu .Asp Vai Vai Vai 475 ' 430

1507

CCA C-TT AGC GAC GAC G. Pro Vai Ser Aso Aso G

435

Asp Ser Phe Ala Asp 4 3 S

1555

GAC GAC AGC C-AC GAT GAC GGG CCC GCT AC-C AAC CCC CCT GCG GAT GCC

Asp Asp Ser Asp Asp Asp Gly Pro Ala Ser Asn Pro Pro Ala Asp Ala

500 ' ’ 505 510

1701

TAC GAC CTC GCC C-GC C-CC CCA GAG CCA ACT AGC GGG TTT GCG CGA GCC Tyr Asp Leu Ala Gly Ala Pro C-iu Pro Thr Ser Gly Phe Ala Arg Ala

515 S20 * 525

CCC GCC AAC GGC ACG CGC TCG AGT CGC TCT GGG TTC AAA GTT TGG TTT

Ala A.5C Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ser Gly Phe Ly3 Vai Tro Phe

-30 535 540

AG-o GA.C CCG CTT GA_A GAC GAT GCC GCG CCA GCG CGG ACC CCG GCC GCA

Arg Asp Pro Leu Glu Asp Asp Ala Ala Pro Ala Arg Thr Pro Ala Ala

545 550 555 560

EcoNl

CCA GAT TAC ACC GTG GTA GCA GCG CGA CTC AAG TCC ATC CTC CGC TAG

Pro Asp Tyr Thr Vai Vai Ala Ala Arg Leu Lys Ser lie Leu Arg *

565 570 575

CkjC-AGCGTC

C GCTGTGCCGT CTGACGGAAA GCA.CCCGCGT GTAGGGCTGC .A CAAAC-CCTCG TC-C3GCTGCT TCGAAGGCAT GGAGAC-TCCA

1751

1759

1847

1895

1955

2015

2027

SEQ ID N0:2

COMPRIMENTO: 20 nucleôtidos

TIPO: nucleótido TIPO DE CADEIA: única ACGTGGTGGT GCCAGTTAGC

SEQ ID N0:3

COMPRIMENTO: 22 nucleôtidos

TIPO: nucleótido

TIPO DE CADEIA: única ACCAAACTTT GAACCCAGAG CG

Lisboa, 25 de Agosto de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.⁴ 1200 LISBOA

Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES is - Mutante de delecção do virus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por apresentar uma delecção no gene da glicoprotéina gE.
2. 2a - Mutante de delecção do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por apresentar uma delecção no gene da glicoprotéina gE, delecção essa que foi provocada por um procedimento de atenuação.
3. 3a - Mutante de delecção Difivac-1 do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por apresenta uma delecção no gene da glicoprotéina gE, delecção essa que foi provocada por um procedimento de atenuação.
4. 4§ - Mutante de delecção do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por apresentar uma delecção no gene da glicoprotéina gE, delecção essa gue foi construída por meio de técnicas de recombinação de DNA.
5. 5a - Mutante de delecção 1B7 ou 1B8 do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por apresentar uma delecção no gene da glicoprotéina gE, delecção essa que foi construída por meio de técnicas de recombinação de DNA.
6. 6a - Mutante de delecção do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por apresentar uma delecção no gene da glicoprotéina gE e uma delecção no gene da quinase de timidina.

   - Mutante de delecção do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por apresentar uma delecção no gene da glicoproteína gE e uma delecção no gene da glicoproteína gl.
7. 8ã - Mutante de delecção do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por apresentar uma delecção no gene da glicoproteína gE, uma delecção no gene da quinase de timidina e uma delecção no gene da glicoproteína gl.
8. 9§ - Mutante do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por apresentar uma delecção no gene da glicoproteína gE e conter um gene heterólogo introduzido por meio de técnicas de recombinação de DNA.
9. 10§ - Mutante do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por, na posição do gene da glicoproteína gE, conter um gene heterólogo introduzido por técnicas de recombinação de DNA, o qual está sob o controlo de sequências de regulação, por exemplo, da do gene gE ou de um gene heterólogo, e está facultativamente ligado à parte do gene gE que codifica um peptídeo sinal.

   Hâ - Mutante do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por, para além de uma delecção no gene da glicoproteína gE, apresentar uma delecção no gene da quinase de timidina, uma delecção no gene da glicoproteína gl, ou as duas, e conter um gene heterólogo introduzido por meio de técnicas de recombinação de DNA na posição de pelo menos uma dessas delecções.
10. 12â - Mutante do .vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizado por apresentar uma delecção no gene da glicoproteína gE e conter um gene heterólogo que foi introduzido por meio de técnicas de recombinação de DNA e que codifica uma proteína ou peptídeo imunogénico de outro agente patogénico ou que codifica uma citoquina.
11. 13§ - Composição, caracterizada por compreender um ãcido nucleico recombinante que contém o gene da glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, uma parte deste gene da glicoproteína gE ou uma sequência de nucleótidos derivada deste gene da glicoproteína gE.
12. 14â - Composição, caracterizada por compreender um vector de clonagem ou de expressão apresentando uma inserção de um ãcido nucleico recombinante que contém o gene da glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, uma parte deste gene da glicoproteína gE ou uma sequência de nucleótidos derivada deste gene da glicoproteína gE.
13. 15a - Composição, caracterizada por compreender glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, uma parte desta glicoproteína gE, um peptídeo derivado desta glicoproteína gE, ou um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1.
14. 16a - Composição, caracterizada por compreender um anticorpo que é específico relativamente à glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, a uma parte desta glicoproteína gE, a um peptídeo derivado desta glicoproteína gE, ou a um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1.
15. 17a - Composição, caracterizada por compreender um anticorpo monoclonal que é específico relativamente à glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, a uma parte desta glicoproteína gE, a um peptídeo derivado desta glicoproteína gE, ou a um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1.
16. 18a - composição, caracterizada por compreender um anticorpo policlonal que é específico relativamente à glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, a uma parte desta glicoproteína gE, a um peptídeo derivado desta glicoproteína gE, ou a um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1.
17. 19§ - Composição de vacina para a vacinação de animais, em particular mamíferos, mais especialmente bovinos, com o objectivo de os proteger do vírus de herpes bovino tipo 1, caracterizada por compreender um mutante do vírus de herpes bovino tipo 1 de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-12, e um veículo ou adjuvante adequados.
18. 20ã - Composição de vacina para a vacinação de animais, em particular mamíferos, mais especialmente bovinos, com o objectivo de os proteger de um agente patogénico, caracterizada por compreender um mutante do vírus de herpes bovino tipo 1 que apresenta uma delecção no gene da glicoproteína gE e contém um

    gene heterõlogo que foi introduzido por meio de técnicas de recombinação de DNA e que codifica uma proteína ou peptídeo imunogénicos do agente patogénico, e um veículo ou adjuvante adequados.

    213 - Equipamento (kit) de diagnóstico para a detecção de ácido nucleico de vírus de herpes bovino tipo 1 numa amostra, em particular numa amostra biológica tal como sangue ou soro sanguíneo, células existentes no sangue, leite, fluidos do corpo tais como lágrimas, fluido de lavagem dos pulmões, fluido nasal, esperma, em particular sémen, saliva, expectoração ou tecidos, era particular tecidos do sistema nervoso, proveniente de um animal, em particular de um mamífero, mais especialmente de um bovino, caracterizado por compreender uma sonda ou iniciador de ácido nucleico com uma sequência de nucleótidos derivada do gene da glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, e um meio de detecção adequado para um teste de detecção de ácidos nucleicos .
19. 22S - Equipamento de diagnóstico para a detecção de anticorpos específicos relativamente ao vírus de herpes bovino tipo 1, numa amostra, em particular numa amostra biológica tal como sangue ou soro sanguíneo, saliva, expectoração, fluidos do corpo tais como lágrimas, fluido de lavagem dos pulmões, fluido nasal, leite ou tecidos, proveniente de um animal, em particular de um mamífero, mais especialmente de um bovino, caracterizado por compreender glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, uma parte desta glicoproteína gE, um peptideo derivado desta glicoproteína gE, ou um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1, e um meio de detecção adequado para um teste de detecção de anticorpos.
20. 23a - Equipamento de diagnóstico de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por compreender ainda um ou mais anticorpos específicos relativamente à glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, ou a um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1.
21. 24 § - Equipamento de diagnóstico para a detecção de proteína do vírus de herpes bovino tipo 1, numa amostra, em particular numa amostra biológica tal como sangue ou soro sanguíneo, células existentes no sangue, leite, fluidos do corpo tais como lágrimas, fluido de lavagem dos pulmões, fluido nasal, esperma, em particular sémen, saliva, expectoração ou tecidos, em particular tecidos do sistema nervoso, proveniente de um animal, em particular de um mamífero, mais especialmente de um bovino, caracterizado por compreender um anticorpo específico reiativamente à glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, ou a um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1, e um meio de detecção adequado para um teste de detecção de proteínas.
22. 25§ - Método de determinação da infecção por vírus de herpes bovino tipo 1 num animal, em particular num mamífero, mais especialmente num bovino, caracterizado por compreender o exame de uma amostra proveniente do animal, em particular uma amostra biológica tal como sangue ou soro sanguíneo, células existentes no sangue, esperma, em particular sémen, saliva, expectoração, fluidos do corpo tais como lágrimas, fluido de lavagem dos pulmões, fluido nasal, leite ou tecidos, em particular tecidos do sistema nervoso, reiativamente à presença de ãcido nucleíco que inclua o gene da glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1 ou à presença da glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1 ou de um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1, ou à presença de anticorpos específicos reiativamente à glicoproteína gE do vírus de herpes bovino tipo 1, ou a um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1.

    263 - Método de determinação da infecção por vírus de herpes bovino tipo 1 num animal, em particular num mamífero, mais especialmente num bovino, caracterizado por compreender o exame de uma amostra proveniente do animal, em particular uma amostra biológica tal como sangue ou soro sanguíneo, células existentes no sangue, esperma, em particular sémen, saliva, expectoração, fluidos do corpo tais como lágrimas, fluido de lavagem dos pulmões, fluido nasal, leite ou tecidos, em particular tecidos do sistema nervoso, relativamente à presença de ãcido nucleico que inclua o gene da glicoprotéina gE do vírus de herpes bovino tipo 1 ou à presença do gene da glicoprotéina gE do vírus de herpes bovino tipo 1 ou de um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1, ou à presença de anticorpos específicos relativamente ã glicoprotéina gE do virus de herpes bovino tipo 1 ou a um complexo formado pelas glicoproteínas gE e gl do vírus de herpes bovino tipo 1, sendo a amostra a analisar proveniente de um animal que foi vacinado com uma preparação de vacina de acordo com a reivindicação 19.