ES2097340T5 - Mutantes por delecion de herpes virus bovino tipo 1, vacunas basadas en los mismos, kits de diagnostico para la deteccion de herpes virus bovino tipo 1. - Google Patents

Abstract

EL MUTANTE DE SUPRESION DE VIRUS HERPES TIPO 1 TIENE UNA SUPRESION EN EL GENE GE DE GLICOPROTEINA. EL MUTANTE PUEDE ADEMAS TENER UNA SUPRESION EN EL GENE DE QUINASA DE TIMIDINA Y/O DEL GENE GI DE GLICOPROTEINA, O TENER UNA INSERCION DE UN GEN HETEROLOGO. ACIDO NUCLEICO RECOMBINANTE QUE COMPRENDE EL GENE GE O PARTE DEL MISMO. GLICOPROTEINA GE, PEPTIDOS BASADOS EN ELLA Y COMPLEJOS DE LAS GLICOPROTEINAS GE Y GI, Y ANTICUERPOS CONTRA ELLOS. VACUNAS Y EQUIPOS DE DIAGNOSTICOS COMPRENDIENDO CUALQUIERA DE ESTOS MATERIALES.

Description

Mutantes por deleción de herpes virus bovino tipo 1, vacunas basadas en los mismos, kits de diagnóstico para la detección de herpes virus bovino tipo 1.

La presente invención se refiere a los sectores de la vacunación y el diagnóstico en relación con enfermedades causadas por agentes patógenos y comprende la utilización de los métodos clásicos para obtener una vacuna viva atenuada y los métodos modernos basados en la tecnología de la recombinación de ADN.

Más específicamente, la invención se refiere a vacunas vivas atenuadas para proteger animales, especialmente bovinos, contra el herpes virus bovino de tipo 1 (BHV-1), vacunas que han sido diseñadas para que no solamente sean seguras y efectivas sino para crear también la posibilidad de distinguir los animales infectados de los no infectados en una población vacunada.

Los kits de diagnóstico que se pueden utilizar para un test de este tipo, para distinguir los animales infectados de los no infectados en una población vacunada, constituyen también un aspecto de la presente invención.

El BHV-1, inclusive el virus de rhinotraqueitis bovina infecciosa (IBRV) y el virus de la vulvo vaginitis pustular infecciosa (IPVV), desempeña una función importante en el desarrollo de las enfermedades respiratorias y los desórdenes de fertilidad en los bovinos. Tras una infección aguda, el BHV-1 suele seguir estando presente en el anfitrión, de forma latente. El virus latente puede ser reactivado bajo la influencia de estrés, entre otros -que puede ir o no acompañado de fenómenos clínicos- y posteriormente excretarse. Como consecuencia de ello, el ganado infectado deberá ser considerado como transmisor potencial en vida de BHV-1. El BHV-1 aparece de forma endémica, según estimaciones, en un 75% de las ganaderías holandesas. Especialmente el ganado más viejo es serológicamente positivo.

Existe cierto número de vacunas inactivas ("muertas") y cierto número de vacunas atenuadas ("vivas"), disponibles para su inoculación contra infecciones por BHV-1. Las vacunas inactivadas se preparan matando el virus BHV-1, p. Ej. mediante tratamiento térmico, radiación o tratamiento con etanol o formalina. No obstante, suelen ofrecer una protección insuficiente. Las vacunas atenuadas se preparan por medio de un gran número de pasadas sobre células homólogas (bovinas) o heterólogas, tales como células porcinas o caninas, y algunas veces los virus también se tratan entonces de forma física o química. De este modo, se desarrollan en el genoma del virus mutaciones/deleciones que suelen reducir las propiedades patógenas del virus. Las vacunas vivas atenuadas ofrecen mejor protección que las vacunas inactivadas, entre otras cosas porque presentan más antígenos virales al sistema inmunitario anfitrión. Otra ventaja importante de las vacunas vivas es que se pueden administrar intra nasalmente, es decir en el lugar en que se produce, tras la infección, la primera multiplicación del virus natural. No obstante, las vacunas vivas pueden mejorarse. Algunas vacunas vivas parecen poseer todavía su capacidad abortógena, que se pone de manifiesto particularmente tras la administración intramuscular. Además, probablemente, todas las vacunas vivas permanecen presentes de forma latente en la vaca vacunada. Existe también la probabilidad de que si la vacuna difiere sólo un poco del virus natural, se produzca una reversión virulenta. Pero uno de los problemas principales es que las vacunas de BHV-1 no pueden evitar la infección por parte de virus naturales. El resultado es que el ganado vacunado también puede transmitir
BHV-1 natural.

Para un programa de control adecuado de BHV-1, es necesario disponer de una vacuna eficaz y segura, que se pueda distinguir del virus natural, ya que la aplicación de una vacuna eficaz puede reducir la circulación de BHV-1 considerablemente y se podrá detectar mediante un test que distinguir entre una vacuna y un virus natural (y luego eliminar) el ganado infectado en una población vacunada.

Entretanto se han desarrollado unas vacunas contra BHV-1 que parecen ser más seguras que las vacunas convencionales y se pueden distinguir del virus natural. Se ha aislado un mutante por deleción de timidina quinasa que es abortógeno en menor grado, se vuelve latente con menor frecuencia y no se puede reactivar. Además, utilizando técnicas de recombinación de ADN se ha construido una vacuna BHV-1, que tiene una deleción en el gen para glucoproteína glll, que hace que se pueda distinguir esta vacuna de BHV-1 natural por medio de técnicas serológicas. No obstante siguen existiendo ciertas objeciones con respecto a estas vacunas. Por una parte, el gen de timidina quinasa está involucrado en la replicación viral y una replicación menor puede conducir a una menor protección. Por otra parte, la glucoproteína glll es importante para generar anticuerpos protectores, que hacen menos eficaz una vacuna por deleción de glll. Un problema práctico es que la administración intranasal, que suele ofrecer la menor protección, de vacunas recombinantes, no está permitida en algunos países. Por ello, se necesita una vacuna que sea segura y eficaz y que se pueda distinguir sin embargo del BHV-1 natural; se desea además que por lo menos una de estas vacunas se base en un virus atenuado por una vía convencional y no en un virus construido mediante técnicas de recombinación de ADN.

Ahora, mediante pases en cultivos celulares, se ha obtenido una cepa de BHV-1 que carece del gen para la glucoproteína gE. Los primeros resultados de nuestra investigación indican que este gen resulta bastante útil para proceder a una distinción serológica con respecto al BHV-1 natural y que está involucrado en la expresión de virulencia. Por consiguiente, su deleción contribuye a la seguridad y puede volver superflua la utilización de deleciones de timidina quinasa. La glucoproteína gE parece ser menos importante para inducir la protección que la glucoproteína glll. Una cepa de BHV-1 convencionalmente atenuado, que pueda distinguirse serológicamente del virus natural, es única. La ubicación y la secuencia de ADN del gen gE aquí descrito por vez primera no se conocían con anterioridad así como tampoco los oligo nucleótidos, polipéptidos y oligo péptidos que se pueden derivar del mismo. También es única la prueba para establecer una distinción serológica sobre la base del gen gE.

Una ventaja importante de este mutante por deleción "convencional" de gE("convencional" se refiere al uso de un método convencional para aislar un virus atenuado) es que será posible administrarlo por vía intranasal en países en los que esto está prohibido, cuando se trata de vacunas recombinantes. Teniendo debidamente en cuenta los diferentes puntos de vista sobre la seguridad, se han construido sin embargo también, además de esta vacuna por deleción convencional gE, unas versiones recombinantes bien definidas. Estas vacunas recombinantes tienen también una deleción de gE -y pueden no tener una deleción en el gen de timidina quinasa también- y se pueden utilizar también como vectores para la expresión de genes heterólogos. Todas estas vacunas recombinantes se pueden distinguir del virus natural con el mismo test específico de gE. La utilización de un test standard para un conjunto de vacunas diferentes puede suponer una gran ventaja en el esfuerzo internacional por combatir el BHV-1. Dicho método no se ha descrito con anterioridad en el sector de las vacunas de BHV-1.

El análisis serológico de la respuesta anti BHV-1 en el ganado mostró que una fracción importante de los anticuerpos anti-gE se dirigen contra un complejo formado por la glucoproteína gE y otra glucoproteína de BHV-1: gluco-proteína gl. Los tests serológicos que pueden demostrar (también) la presencia de dichos anticuerpos específicos del complejo pueden ser, por lo tanto, más sensibles que los tests que sólo pueden detectar anticuerpos anti-gE. El ganado vacunado con un solo mutante por deleción de gE puede producir anticuerpos anti-gl que pueden interferir con la detección de anticuerpos anti-gl/gE. Por ello, la invención incluye también una vacuna con doble deleción gl/gE.

En primer lugar, esta invención proporciona una vacuna que comprende un mutante por deleción de BHV-1, que tiene una deleción en el gen de la glucoproteína gE según se indica en la reivindicación 1. Las palabras "una deleción en" pretenden abarcar una deleción del gen de forma completa.

Una realización preferida de la invención la constituye una vacuna que comprende un mutante por deleción de BHV-1, que tiene una deleción en el gen de glucoproteína gE, causado por un procedimiento de atenuación, como el mutante por deleción Difivac-1 que se describe a continuación.

Otras realizaciones preferidas de la invención consisten en una vacuna que comprende un mutante por deleción de BHV-1, que comprende una deleción en el gen de glucoproteína gE que ha sido construido por técnicas de recombinación de ADN, como los mutantes por deleción 1B7 ó 1B8 que se describen más adelante.

Otra realización preferida de la invención consiste en un mutante por doble deleción de BHV-1, que comprende una deleción en el gen de glucoproteína gE y una deleción en el gen de glucoproteína gl como el mutante por doble deleción gl/gE Difivac-IE que se describe más adelante.

La invención también comprende una composición según la reivindicación 8, y un anticuerpo según la reivindicación 9. Se considera que el término "anticuerpo" designa a una preparación de anticuerpos monoclonales así como a un anticuerpo monoclonal preferido para la mayoría de las aplicaciones.

Además, la invención se refiere al kit de diagnóstico para detectar anticuerpos, según se indica en las reivindicaciones 12 ó 14.

La invención también se refiere a un kits de diagnóstico para detectar proteína según la reivindicación 15.

La invención se refiere así mismo a un método para determinar infección por BHV-1 de un animal según la reivindicación 16 ó 17.

La invención se refiere a un conjunto de vacunas vivas BHV-1, que pueden tener en común el hecho de que carecen del gen de la glucoproteína gE, de forma total o parcial. Este conjunto comprende un mutante por deleción natural de gE y mutantes por deleción construida de gE, que puede no comprender también una deleción del gen de timidina quinasa y/o el gen de la proteína gl, y mutantes por deleción construida de gE que se utilizan como vectores para genes heterólogos. La invención se refiere así mismo a secuencias de nucleotídos que codifican el gen de la glucoproteína gE de BHV-1, oligo nucleótidos derivados de estas secuencias, la glucoproteína gE misma, péptidos derivados de lo anterior y anticuerpos (monoclonales o policlonales) dirigidos contra la glucoproteína gE y péptidos derivados de lo anterior. La invención también se refiere a complejos de las glucoproteínas gE y gl de BHV-1 y a anticuerpos dirigidos contra dichos complejos.

Estos materiales según la invención pueden utilizarse para:

1) La vacunación del ganado contra las enfermedades causadas por BHV-1, de forma que se pueda establecer una distinción entre animales infectados por BHV-1 y animales vacunados: la vacuna convencional y la vacuna construida se pueden utilizar paralelamente;

2) La vacunación de ganado contra enfermedades por BHV-1 y enfermedades causadas por otros patógenos, cuyas secuencias de codificación para antígenos protectores se pueden incorporar en los mutantes por deleción de BHV-1;

3) Pruebas de sangre, suero, leche y otros fluidos corporales del ganado para determinar serológicamente o por medio de técnicas de detección de ácido nucléico (p. Ej. PCR) si ha sido infectado por un BHV-1 natural o ha sido vacunado con un mutante por deleción gE.

Síntesis de oligopéptidos, polipéptidos y glucoproteínas derivados de la secuencia de codificación del gen de la glucoproteína gE y el gen de la glucoproteína gl de BHV-1.

Los resultados del análisis de la secuencia de ADN descritos en los ejemplos, del gen de la glucoproteína gE (figura 3A) y los fragmentos aislados de ADN que codifican este gen, permiten, utilizando procedimientos standard de biología molecular, sintetizar péptidos de la proteína gE (oligo o poli péptidos) y expresar la proteína gE en su totalidad o en grandes partes por medio de la vía procariótica (en bacteria) o la vía eucariótica (p. Ej. en células murinas). A través de estas vías, se puede obtener antígeno gE específico que puede servir, p. Ej., para generar anticuerpos monoclonales gE-específicos (Mabs). Además, se puede utilizar el antígeno gE-específico (y Mabs gE-específico) en pruebas serológicas para poder realizar una distinción entre animales vacunados con vacuna por deleción de gE de BHV-1 y animales infectados con virus BHV-1 natural.

Los resultados del análisis de la secuencia parcial de ADN del gen de la glucoproteína gl -descrito en los ejemplos- y los fragmentos aislados de ADN que codifican este gen, junto con las células eucarióticas que expresan la glucoproteína gE, permiten la expresión del complejo gl/gE en células eucarióticas (véase figs. 13 y 14). Este complejo de glucoproteína se puede utilizar para producir anticuerpos monoclonales gl/gE específicos. El complejo gl/gE se puede utilizar también como antígeno en pruebas serológicas para diferenciar entre ganado vacunado con un solo mutante por deleción gE de BHV-1 o con un mutante por deleción doble gl/gE de BHV-1 y ganado infectado con virus BHV-1 natural.

Péptidos gE específicos

Sobre la base de una secuencia de codificación de proteína conocida, por medio de un sintetizador automático, se pueden obtener polipéptidos de no menos de 40-50 amino ácidos aproximadamente. Ahora que se ha desenmarañado la secuencia codificadora de proteína de la glucoproteína gE de la cepa Lam de BHV-1 (fig. 3A), se pueden sintetizar polipéptidos de esta glucoproteína gE de BHV-1. Con estos polipéptidos, y según el método standard, se pueden inmunizar animales experimentales como ratones o conejos para generar anticuerpos gE-específicos. Además, utilizando estos péptidos gE-específicos, se pueden especificar además las ubicaciones en las que los anticuerpos anti-gE reaccionan con la proteína gE (los epítopos), p. Ej. con el método PEPSCAN (Geysen et al., 1984. roc.Natl.Acad. Sci. USA 81, 3998-4002). Se pueden utilizar también oligopéptidos gE específicos en pruebas serológicas que demuestran anticuerpos anti-gE.

Expresión procariótica de gE

Para la síntesis de la proteína gE en bacterias (es decir la expresión procariótica de gE) se tienen que clonar en vectores de expresión procariótica fragmentos de ADN que codifican para la glucoproteína gE o partes de la misma. Los vectores de expresión procariótica son moléculas circulares de ADN, que se pueden mantener en una bacteria como moléculas que replican por separado (plásmido). Estos vectores de expresión contienen uno o más genes marcadores quecodifican para una resistencia antibiótica y permiten por lo tanto la selección de bacterias con el vector de expresión. Además, los vectores de expresión comprenden una región promotora (a menudo controlable), más allá de la cual se pueden ligar fragmentos de ADN que se expresan entonces bajo la influencia del promotor. En muchos vectores de expresión procarióticos actuales, la proteína deseada se expresa mientras se fusiona a una denominada proteína portadora. Para ello, en el vector se encuentra, detrás del promotor, la secuencia de codificación para la proteína portadora, pudiéndose ligar de forma directamente adyacente a la misma el fragmento de ADN deseado. Las proteínas de fusión suelen ser más estables y fáciles de reconocer y/o de aislar. El nivel estacionario que puede alcanzar una proteína de fusión particular en cierta cepa bacteriana difiere de una fusión a otra y de una cepa a otra. Lo habitual es probar combinaciones diferentes.

Expresión eucariótica del gen de la glucoproteína gE

Aunque la expresión procariótica de proteínas ofrece ciertas ventajas, las proteínas carecen de las modificaciones, como la glicosilación y similares, que se producen en las células eucarióticas. Como resultado de ello, la proteína expresada eucarióticamente suele ser un antígeno más adecuado. Para la expresión heteróloga de proteínas en células eucarióticas, tales como células murinas, se utilizan vectores de expresión eucariótica. Estos vectores son plasmidos que no solamente se pueden multiplicar en células de E. coli, sino que subsisten de forma estable en células eucarióticas. Además de un marcador de selección procariótica, comprenden también un marcador de selección eucariótica. Análogamente a los vectores de expresión procariótica, los vectores de expresión eucariótica contienen una región promotora, más allá de la cual se pueden ligar los genes deseados. Sin embargo, las secuencias promotoras en vectores eucarióticos son especificas de células eucarióticas. Además, en los vectores eucarióticos solo se utiliza la fusión en proteínas portadoras. Estos vectores se introducen en las células eucarióticas utilizando un método de transfección standard (F.L. Graham y A.J. van der Eb, 1973, Virology 52, 456-467). Además de los vectores plasmidos eucarióticos, hay también vectores virales, en los que el gen heterólogo se introduce en el genoma de un virus (por ejemplo retrovirus, herpes virus y vaccinia virus). Las células eucarióticas se pueden infectar entonces con virus recombinantes.

En general, no se puede predecir qué tipo de vector y célula son los más adecuados para un producto génico particular. Por lo general, se prueban varias combinaciones.

Expresión eucariótica de la glucoproteína gE y gl

La estructura final que obtiene una proteína depende de la secuencia primaria de amino ácidos, su pliegue, sus modificaciones post-traslacionales, etc. Un factor importante que contribuye a la estructura de una proteína es su interacción con una o más proteínas. Hemos comprobado que también la glucoproteína gE de BHV-1 forma un complejo con por lo menos otra glucoproteína: la glucoproteína gl de BHV-1. La primera indicación de un complejo de este tipo procede de nuestros resultados con anti-gE candidatos Mabs 1, 51, 67, 75 y 78 (véase cuadro 2). Estos Mabs no reaccionaron con Difivac-1, ni con Lam gE pero tampoco reconocieron las células 3T3 que expresan la glucoproteína gE. No obstante, estos Mabs reaccionaron con células 3T3 que expresan gE después de infección con Difivac-1, lo cual muestra que se necesitan factores complementarios para otorgar a la glucoproteína gE la conformación antígena propia para esos Mabs. En algunos de nuestros experimentos de radio-inmunoprecipitación con Mabs 81 comprobamos la co-precipitación de una proteína con un peso molecular aparente de 63 kD. A la vista de que la glucoproteína gE del virus herpes simplex forma un complejo con una proteína con un peso molecular comparable (glucoproteína gl de HSV1), supusimos que la glucoproteína gE de BHV-1 forma un complejo con el homólogo BHV-1 de la glucoproteína gl. Para estudiar este complejo BHV-1 gE/gl y producir un antígeno gE con la estructura antígena propia, expresamos ambas glucoproteínas en una célula eucariótica. Para ello, aplicamos los mismos procedimientos que los descritos para la expresión eucariótica de glucoproteína gE sola. El único requisito previo adicional es la utilización de vectores de expresión con marcadores eucarióticos seleccionables diferentes.

Pruebas serológicas

Los métodos serológicos para establecer una distinción entre el ganado vacunado con Difivac-1 y el ganado infectado con BHV-1 natural sobre la base de anticuerpos contra gE se basan de preferencia en la utilización de anticuerpos monoclonales dirigidos contra gE. Estos se pueden utilizar de las siguientes formas:

a) Según el principio descrito por Van Oirschot et al., (Journal of Virological Methods 22, 1991-206, 1988). En este ELISA para la detección de anticuerpos gl contra el virus de la enfermedad de Aujeszky, se ha comprobado que los anticuerpos, por su efecto bloqueante sobre la reacción de dos Mabs, tienen dos epítopos diferentes sobre gl. El ensayo se realiza de la siguiente forma. Se recubren placas de micro valoración con Mab 1, durante la noche a 37ºC, y después se almacenan, por ejemplo a 4ºC ó -20ºC. El suero que se va a examinar se pre-incuba con antígeno en placas de micro valoración separadas no recubiertas, p. Ej. durante 2 horas a 37ºC. Las placas recubiertas con Mabs 1 se lavan, p. Ej. 5 veces, después de lo cual se añade Mab 2 junto con peroxidasa de rábano picante (HRPO) a estas placas. Se transfiere entonces las mezclas suero-antígeno pre-incubadas a las placas en las que se encuentran los dos Mabs, seguido de incubación p. Ej. durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavan y se añade substrato a cada pocillo. Después de p. Ej. 2 horas a temperatura ambiente, se procede a la lectura espectro-fotométrica de las placas. Se incluyen en cada placa cuatro sueros de control negativo y cuatro diluciones sucesivas de un suero positivo. El suero que tiene un valor de densidad óptica (OD) inferior al 50% del valor medio OD de los cuatro sueros de control negativo que han sido examinados en la misma placa, se considera positivo.

b) Según el principio de Sandwich Anticuerpo Doble Indirecto (IDAS). Aquí las placas de micro valoración se recubren con un Mab o un suero policlonal dirigido contra la proteína gE. La incubación con una preparación de antígeno gE tiene como resultado la fijación de gE al recubrimiento. Los anticuerpos específicamente dirigidos contra gE en el suero bovino a examinar interaccionan ulteriormente con el gE. Estos anticuerpos fijados son reconocidos por un conjugado de inmunoglobulina anti-bovino. Los anticuerpos en este conjugado se unen de forma covalente con enzima peroxidasa. Finalmente, el conjugado fijado se visualiza añadiendo un substrato cromógeno. La especificidad de la reacción se comprueba, realizando el mismo procedimiento con un preparado de control gE-negativo en lugar de un preparado gE-antígeno. En cada placa de microvaloración se incluyen sueros de control positivos y negativos. La prueba es válida si el suero positivo da una puntuación positiva en cierta dilución. Un suero es positivo si da un OD 0,2 superior al suero de control negativo standard.

c) Según el principio IDAS descrito en 2, pero tras la incubación del suero a examinar, se utiliza un anti-gE Mab/ HRPO en lugar del conjugado de inmuno globulina antibovino. Un suero de péptido anti-gE o un suero policlonal anti-gE se puede utilizar en lugar del anti-gE Mab. Las placas se lavan y se añade a cada pocillo un sustrato cromógeno. Después de p. Ej. 2 horas a temperatura ambiente, se procede a la lectura espectro fotométrica de las placas. Se incluyen en cada placa cuatro sueros de control negativo y cuatro diluciones sucesivas de un suero positivo. El suero que tiene un valor OD inferior al 50% de la media del valor OD de los cuatro sueros de control negativo que se han examinado en la misma placa, se considera positivo.

d) Según el principio de un ELISA de bloqueo, donde el antígeno del virus que puede estar purificado o no, se recubre sobre la placa de micro valoración durante la noche. En estas placas, el suero a examinar se incuba p. Ej. durante 1 hora o más tiempo a 37ºC. Después de un procedimiento de lavado, se añade a las placas un anti-gE Mab, seguido de incubación p. Ej. durante 1 hora a 37ºC. Se pueden utilizar un suero de péptido anti-gE o suero policlonal anti-gE en lugar del anti-gE Mab. Las placas se lavan y se añade a cada pocillo un substrato cromógeno. Después de p. Ej. 2 horas a temperatura ambiente, se procede a la lectura espectro fotométrica de las placas. Se incluyen en cada placa cuatro sueros de control negativo y cuatro diluciones sucesivas de un suero positivo. El suero que tiene un valor OD inferior al 50% del valor OD medio de los cuatro sueros de control negativo que se han examinado en la misma placa, se considera positivo.

En todas las disposiciones anteriores, se puede utilizar antígeno de virus cultivado convencionalmente que contiene gE aunque también antígeno gE que se expresa por medio de procariotas o eucariotas. Alternativamente, se podrían utilizar oligopéptidos basados en secuencia gE de BHV-1 en las pruebas diagnósticas anteriores en lugar del antígeno convencional. Además, estos oligopéptidos se podrían utilizar para el desarrollo de una prueba denominada "cow -side" (lateral bovino) según el principio descrito en un artículo Kemp et al., Science 241, 1352-1354, 1988. Esta prueba se podría basar en una fijación de la secuencia an-tígena del oligopéptido por anticuerpos dirigidos contra gE, presentes en animales infectados. Para una prueba de este tipo, el oligopéptido se tendría que acoplar a un Mab dirigido contra eritrocitos bovinos.

Análisis de ácido nucléico utilizando la reacción de cadena de polimerasa

Se pueden utilizar oligonucleótidos (sondas e iniciadores) p. Ej. en la reacción en cadena de la polimerasa para establecer una distinción entre animales vacunados y animales infectados. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica en la que se pueden multiplicar miles de millones de veces los ácidos nucléicos de un patógeno en poco tiempo (De polymerase kettingreactive, P.F. Hilderink, J.A. Wagenaar, J.W.B. van der Giessen and B.A.M. van der Zeijst, 1990, Tijdschrift voor Diergeneeskunde deel 115, 1111-1117). Los oligonucleótidos gE se pueden utilizar de forma que en un genoma positivo gE se forme un producto diferente que en un genoma negativo gE. La ventaja de esto es que también un animal que ha sido vacunado con una vacuna por deleción gE da una señal positiva en una prueba PCR. No obstante, este método depende de la presencia de ácidos uncléicos del virus en una muestra, p. Ej. sangre, procedente del animal que se va a someter a prueba.

Tras una infección aguda por BHV-1, existe grandes probabilidades de que se presenten en la sangre ácidos uncléicos específicos de BHV-1 si bien no se ha determinado todavía si se pueden presentar también ácidos nucléicos de BHV-1 en la sangre durante la latencia.

La utilización de BHV-1 como vector

Para la expresión de genes heterólogos en el genoma de BHV-1, es necesario disponer de información exacta sobre la zona en la que se va a insertar el gen heterólogo. No tiene que haber ninguna alteración de las secuencias esenciales y deben encontrarse disponibles secuencias reguladoras para la expresión del gen heterólogo. En principio, el gen de la glucoproteína gE es un lugar adecuado para expresar genes heterólogos. El gen gE no es esencial, por lo que no existe objeción alguna a la sustitución del gen gE por el gen heterólogo. Por consiguiente, el gen heterólogo se puede disponer de modo que se encuentre bajo la influencia de las secuencias reguladoras del gen gE. Sin embargo, no es necesario utilizar las secuencias reguladoras del gen gE. La expresión de genes heterólogos se puede controlar alternativamente por otras secuencias regulatorias, p. Ej. más fuertes de genes diferentes. También es posible ligar el gen heterólogo al péptido de señal (exportación) del gen gE de modo que se pueda influir en la secreción del producto génico heterólogo. Es evidente que el conocimiento detallado del gen gE y la proteína gE permite utilizar BHV-1 como vector de una forma muy medida. Los vectores desarrollados pueden distinguirse además por medios serológicos del tipo natural. La construcción de mutantes BHV-1 que expresan genes heterólogos se puede realizar del mismo modo que la construcción de mutantes por deleción gE que se muestra en los ejemplos. Sin embargo, los fragmentos de la deleción se tendrán que sustituir por un fragmento sobre el cual se encuentra un gen heterólogo en el lugar de la deleción.

Ejemplos 1) Aislamiento e identificación de un mutante natural por deleción gE a) Aislamiento de un mutante natural

Se aisló ADN genómico de un número de vacunas convencionalmente atenuadas según métodos standard y se analizó utilizando enzimas de restricción. En particular, buscabamos desviaciones genómicas que pudieran distinguir del virus BHV-1 natural.

Se centró particularmente la atención en la región U_{s} del gen BHV-1, ya que en dicha región, por analogía con el virus herpes simples - se encuentra probablemente cierto número de genes codificadores de glucoproteínas no esenciales [identificación de un gen de glucoproteínas de virus herpes simplex 1 dentro de un grupo de genes preparables para el crecimiento en cultivo celular, R Longnecker, S. Chatterjee, R.J. Whitley and B. Roizman (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 4303-4307)].

Se comprobó que un lote de una vacuna BHV-1 procedente de la Universidad de Zagreb, Yugoslavia (Lugovic et al., Veterinarski Arthiv 55, 241-245, 1985), tras un gran número de pases sobre células renales de embrión bovino y células de traquea bovina embrional (Ebtr), tenia una región U_{S} con desviación además de una región U_{s} normal. Además, esta vacuna formaba placas grandes y pequeñas sobre células Ebtr. De esta población mezclada, se aisló una región U_{S} anómala en tres etapas de dilución limitadora, eligiéndose cada vez placas pequeñas. El virus aislado de esta forma se sometió ulteriormente a examen y se denominó Difivac-1. Se depositó en el Institut Pasteur, Paris, Francia el 27 de mayo 1992, con el número de depósito I-1213.

b) Identificación de la deleción en el gen gE en Difivac-1

Para seguir el análisis de esta desviación en la región U_{S}, se aisló ADN genómico de Difivac-1 según métodos standard y se sometió al análisis de transferencia Southern (figura 1A). La hibridación de esta transferencia con un fragmento de HindIII K de tipo natural, marcado ^{32}P confirmó que este fragmento situado centralmente en la región U_{S}, es aproximadamente 1,0 kilobases (kb) más corto en Difivac-1. Además, con este análisis, se pudo determinar aproximadamente la parte que faltaba (figura 1B). Para un análisis ulterior de esta deleción, se aisló la región U_{S} de la cepa Lam de BHV-1 tipo natural y se clonó en vectores procarióticos. Para ello, según métodos standard, se aisló ADN genómico de la cepa Lam (figura 2A) y se clonó en los vectores pUC18 pACYC y pBR322 (figura 2B). Se compuso un mapa físico de la zona en torno a la supuesta posición de la deleción (figura 2C). Partiendo de este mapa físico, se construyeron subclones adecuados para la determinación de la secuencia de nucleotídos de esta zona en los vectores pKUN19 y pUCl8 (figura 2D). Utilizando estos subclones, se determinó la secuencia de nucleotídos de las dos cadenas de toda la zona (indicado en la figura 2C) utilizando el método Sanger. Esta secuencia de nucleotídos (SEQ ID NO: 1) se analizó utilizando el programa PC/gen. Por la traducción conceptual se pudo apreciar que los nucleotídos (nt) 168 a nt 1893 codifican para un marco de lectura abierto de 575 amino ácidos (figura 3A). El análisis ulterior mostró que esta secuencia de amino ácidos tiene la característica de una glucoproteína de transmembrana como se muestra en la figura 3B. El hecho es que los primeros 26 amino ácidos (aa) son reconocidos como una señal de exportación típicamente eucariótica y la zona entre aa 423 y aa 450 se reconoce como región de transmembrana. Además, en esta secuencia se manifiestan tres zonas potenciales de glicosilación N-ligada. Esta secuencia de amino ácidos prevista muestra claramente similaridades con el gen gE de la glucoproteína del virus herpes simplex (HSV), véase figs. 4A y 4B. Estas y otras semejanzas justifican la conclusión de que el gen hallado es el gE homólogo de BHV-1. Por esta razón, el gen se denomina gE. Para determinar el qué medida falta este gen gE de BHV-1 en Difivac-1 se aisló el fragmento p318. El fragmento p318 se inicia en la zona Alul 55 nt antes del marco de lectura abierto postulado gE de BHV-1 y termina 133 nt después de él. Se analizó ADN genómico de Difivac-1 con este fragmento p318 utilizando hibridación por transferencia Southern. Esto reveló que Difivac-1 no contiene ninguna secuencia detectable de p318 (fig. 5). Este experimento confirmó que Difivac-1 contiene una deleción y demuestra claramente que esta deleción se extiende por todo el gen gE.

Para determinar el tamaño y la posición de la región perdida se clonaron secuencias genómicas que cubrían la región U_{S} de Difivac-1 en vectores procarióticos. Véase fig. 11C. El fragmento 14,5 kb EcoRI se clonó en el vector pACYC y se denominó p775. El fragmento 7,4 kb HindIII se clonó independientemente en el vector pUC18 y se llamó p728. Se aislaron dos subclones del clon p728. El fragmento 1,4 kb PstI en el clon p737 y el fragmento 350bp Alul-Pstl en el clon p754. El análisis de enzima de restricción y el de transferencia Southern de estos clones (no se muestran los datos) demostró que la deleción gE en Difivac-1 tiene una longitud de 2,7 kb, comenzando justo 5' a partir del gen gE y terminando el límite de la región U_{S}. Estos 2,7 kb han sido sustituidos por una duplicación de un segmento 1 kb situado en la región U_{S} frente al gen gE, como una extensión aberrante de la región repetida. Véase la fig. 11B. Para confirmar los resultados de este análisis y determinar el punto de recombinación exacto, se determinó la secuencia de nucleotídos de la mayor parte del inserto del clon p754 y se comparó con las secuencias de tipo natural. Véase fig. 12. Este análisis mostró que el punto de recombinación está situado 77bp corriente arriba del codon inicial del gen gE.

c) Evaluación de la seguridad y eficacia de Difivac-1

Se sometió a ensayo Difivac-1, en terneras de 7 semanas de edad, libres de patógeno específico sero negativo BHV-1. Se vacunaron por vía intranasal ocho terneras con 10^{5} TCID_{50} en 2 ml, pulverizándose 1 ml en cada ventana de la nariz. Se administró a 8 terneras de 7 semanas de edad, libres de patógeno específico sero negativo BHV-1, que se alojaron en una unidad de aislamiento separada, 2 ml de un medio de cultivo por vía intranasal, que sirvieron de controles no vacunados. Cinco semanas después de la vacunación, las terneras vacunadas y las de control se sometieron intra nasalmente a la exposición de 10^{7} TCID_{50} de la cepa de BHV-1 altamente virulenta Iowa. Seis semanas después de la exposición se trataron todas las terneras por vía intramuscular con dexametasona durante 5 días para reactivar el virus latente putativo. Se controlaron y siguieron los signos clínicos, temperaturas rectales y crecimiento del cuerpo. Se realizaron aislamientos del virus de algodones nasales y se determinaron en suero las valoraciones de suero neutralizantes.

Tras la vacunación, el comportamiento, el apetito, las temperaturas rectales y las tasas de crecimiento de las terneras siguieron siendo normales pero las terneras vacunadas presentaban cierta descarga nasal serosa y una hipersalivación. No se observó ninguna lesión en la mucosa nasal. Tras la vacunación se segregó Difivac-1 de los algodones nasales (figura 17). Todas las terneras vacunadas produjeron anticuerpos de neutralización para el BHV-1.

Después de la exposición, todas las terneras de control no vacunadas mostraron apatía, pérdida de apetito, descarga ocular y nasal, enrojecimiento de las encías de la mandíbula inferior, lesiones graves de las mucosas nasales hasta 14 días después de la exposición y una interrupción del crecimiento de 4 días. Las terneras vacunadas tenían pequeñas lesiones que cicatrizaron rápidamente en las mucosas nasales y no presentaban ninguna interrupción del crecimiento. Los datos clínicos diarios, la temperatura rectal cantidad y el período de segregación de virus fue notablemente reducido en las terneras vacunadas (figura 21). Se desarrolló una respuesta secundaria al anticuerpo en terneras vacunadas y las terneras no vacunadas produjeron todas ellas anticuerpos después de la exposición.

Tras la reactivación, se aisló el virus de exposición de una ternera vacunada y de 5 terneras no vacunadas. No se pudo reactivar el Difivac-1.

Los resultados anteriores demuestran que el Difivac-1 difícilmente indujo algún signo de enfermedad en terneras jóvenes y no se pudo reactivar. El Difivac-1 redujo notablemente la gravedad de la enfermedad y la cuantía de segregación del virus tras la exposición.

En conclusión, Difivac-1 es una vacuna segura y eficaz a utilizar en el ganado contra las infecciones por BHV-1.

2) Construcción de mutantes por deleción de gE recombinante de BHV-1

Con el fin de disponer de vacunas diferenciables de BHV-1 que están molecularmente mejor definidas que Difivac-1 y que, si desean contienen una deleción en p. Ej. el gen de la timidina quinasa, además de una deleción en el gen gE, se construyeron mutantes por deleción de gE recombinantes, además de Difivac-1. Partiendo de la posición determinada del gen gE de glucoproteínas y utilizando los fragmentos de ADN clonado que bordean el gen gE, se pudo construir un fragmento de deleción de gE. Utilizando la técnica standard (F.L. Graham and A.J. van der Eb, 1973, Virology 52, 456-467), este fragmento de deleción se pudo recombinar en el genoma de una cepa de BHV-1 de tipo natural, dando como resultado un mutante por deleción de gE.

a) La construcción del fragmento de deleción de gE

Para la construcción de este fragmento de deleción de gE, se buscó un fragmento que, de una parte carece de toda la secuencia de gE y de otra parte, contiene una secuencia de borde suficiente para permitir la recombinación con el genoma de tipo natural. En el lado 5' (corriente arriba), se eligió el fragmento 1,2 kb Pstl-Asull que termina 18 nt antes del codon inicial del gen gE. Para el fragmento 3' (corriente abajo) se eligió el fragmento 1,2 kb EcoNI-Dral, que comienza 2 nt antes del codon de terminación del gen gE (figura 6).

Para la construcción del fragmento de deleción gE, el fragmento 1,4 kb Pstl-Smal, del fragmento 8,4 kb HindIII K de la cepa de BHV-1 Lam, situado en el lado 5' del gen gE, se subclonó en la zona Smal y Pstl del plásmido pUC18. Este clon se llamó p515. El fragmento EcoNI-Smal situado en el lado 3' de gE y procedente del clon 4,1 kb HindIII-EcoRI se clonó en la zona única Asull de p515. Por consiguiente, la construcción del fragmento de deleción gE se completó y el clon así construido se denominó p519. Aunque en principio se podía utilizar todo el inserto Pstl-Smal de p519 como fragmento de deleción gE esto no es recomendable. El hecho es que el Pstl-Smal se extiende aproximadamente 100-150 pares de bases (bp) dentro de la secuencia de repetición que flanquea la región U_{S}. Este trozo de 100-150 bp pudo recombinar con la secuencia de repetición en el otro lado de la zona U_{S} donde el gE no está situado y pudo ofrecer por lo tanto productos de recombinación no deseables. Por esta razón, se eligió el fragmento Pstl-Dral para el experimento de recombinación para quitar 100 bp de la repetición.

b) Recombinación del fragmento de deleción gE con el genoma de BHV-1 de tipo natural

Con el fin de realizar la recombinación entre el fragmento de deleción gE construido y el genoma de BHV-1 de tipo natural, se co-transfectaron cantidades del orden del microgramo de las dos moléculas de ADN a las células de la traquea de bovino embrional (Ebtr) según el método standard de F.L. Graham y A.J. van der Eb (1973, Virology 52, 456-467). Los mecanismos de recombinación celular conducen a la recombinación de un porcentaje pequeño de las moléculas de ADN (2-4%) que han sido incorporadas por las células. Para elegir los mutantes por deleción gE recombinados, la mezcla de virus que se forma después de la transfección se disemina sobre un cultivo celular reciente Ebtr. En la mayoría de los casos, las poblaciones de virus separadas que se desarrollan (placas) proceden de un virus. Para aislar mutantes por deleción gE de la cepa de BHV-1 Lam, se aislaron 230 de estas placas y se examinaron según métodos inmunológicos standard con anticuerpos monoclonales específicos de BHV-1 (Mabs) que no reaccionan con células infectadas por Difivac-1. Estos Mabs se dirigen contra la glucoproteína gE. Cinco de las 230 placas no reaccionaron con estos Mabs. El ADN de estas 5 placas se sometió a investigación ulterior.

c) Análisis de ADN de los mutantes por deleción gE construidos de cepa de BHV-1 Lam

Se siguieron examinando preparaciones de ADN de 3 (1B7, 1B8, y 2H10) de los cinco mutantes por deleción gE candidatos mencionados utilizando el análisis de transferencia Southern standard (Sambrook et al., 1989). Las dobles digestiones de estas preparaciones de ADN con Pstl y Dral, seguido de electrofóresis de gel e hibridación de transferencia Southern con el fragmento de deleción 2,3 kb Pstl-Dral como sonda muestran que el gen gE del genoma de poblaciones de virus 1B7 y 1B8 ha sido eliminado en la forma deseaba; véase las figuras 7A y 7B. La población 2H10 tiene un fragmento Pstl-Dral desviante. Las hibridaciones de transferencia Southern con una sonda gE-específica muestran que no hay ninguna secuencia gE situada en ninguna de las tres preparaciones de ADN (no se muestran los resultados). Las poblaciones de virus BHV-1 1B7 y 1B8 son mutantes por deleción gE recombinantes previstas. La población de virus BHV-1 1B7 se ha sometido a test para comprobar las propiedades de la vacuna.

d) Construcción de mutantes por doble deleción gE/timidina quinasa

Debido a que los mutantes por deleción recombinante de BHV-1 con una deleción en sólo un gen pueden no ser de virulencia suficientemente reducida, se aportaron también deleciones en el gen de timidina quinasa (TK) de las cepas de BHV-1 Lam y Harberink. Estos mutantes se construyeron de foma análoga a los utilizados para los mutantes por deleción gE antes citados (no se muestran los resultados). Estos mutantes por deleción TK han sido utilizados para construir mutantes por doble deleción TK/gE.

e) Construcción de mutantes por doble deleción de glucoproteína gl/glucoproteína gE

Debido a que el ganado vacunado con un solo mutante por deleción gE puede producir anticuerpos anti-gl que pueden interferir con la detección de anticuerpos anti-gl/gE (véase tratamiento más adelante), inventamos también una vacuna con doble delecion gl/gE. Este mutante por doble deleción gl/gE se puede construir utilizando los mismos procedimientos empleados para a construcción del mutante por simple deleción gE. El análisis de la secuencia de núcleotídos parcial del extremo corriente arriba del fragmento 1,8 kb Pstl -que cubre el extremo 5' del gen gE- reveló un marco de lectura abierto con homología notable con homólogos gl encontrados en otros herpes virus. Véase figuras 13 y 14. Utilizando el fragmento 350 bp Smal-Pstl que incluye el extremo 5' putativo del gen gl y el fragmento EcoNI-Smal, situado corriente abajo del gen gE, se puede construir un fragmento por deleción gl/gE. Este fragmento se puede recombinar con el genoma de tipo natural para dar un mutante por deleción gl/gE de BHV-1. Véase figura 16. Los amino ácidos 80-90 que -teóricamente- se pueden producir todavía no podrán obtener anticuerpos que puedan interferir con la detección de anticuerpos anti-gl/gE. Un análisis ulterior de la secuencia del gen gl permitirá la construcción de una deleción gl que cubre toda la región de codificación gl. Este mutante por doble deleción gl/gE ha recibido del nombre de Difivac-IE.

f) Evaluación de la seguridad y eficacia de los mutantes Lam gE^{-} y Lam gE^{-}, TK^{-}

Se comprobaron las propiedades de la vacuna de las cepas mutantes de Lam gE^{-} y de Lam gE^{-}, TK^{-} BHV-1 en terneros de siete semanas de edad libres de patógenos específicos, seronegativos de BHV-1. Se procedió a una pulverización intranasal de cada capa de mutante en seis terneros. Se administró a cada ternero una dosis total de 10^{5} TCID_{50} en 2 ml de medio de cultivo del que se pulverizó 1 ml en cada tabique nasal. Se pulverizó por vía intranasal medio de cultivo libre de virus en otros seis terneros y que se utilizaron como controles no vacunados. Cinco semanas después de la vacunación, todos los terneros, los vacunados y los de control, se expusieron por vía intranasal 10^{7} TCID_{50} de la cepa de BHV-1 altamente virulente Iowa. Tras la vacunación y la exposición se controlaron y siguieron los signos clínicos, las temperaturas rectales y el peso corporal. Se tomaron algodones nasales para determinar el número de días de derramamiento de virus nasal.

Tras la vacunación, el comportamiento, apetito, temperatura rectal y las tasas de crecimiento de los terneros siguieron siendo normales. Se observó una descarga nasal serosa y pequeñas lesiones de la mucosa nasal en todos los terneros vacunados. El virus pudo aislarse de las narices de los terneros vacunados durante aprox. 7 días (cuadro 1).

Tras la exposición, todos los terneros de control no vacunados mostraron apatía, pérdida de apetito, descarga ocular y nasal, enrojecimiento de las encías de la mandíbula inferior, lesiones graves de las mucosas nasales y una reducción en el crecimiento. Los terneros vacunados con Lam gE^{-}, TK^{-} desarrollaron todos cierta descarga nasal y mostraron lesiones de menor importancia en las mucosas nasales. No todos los terneros vacunados con Lam gE^{-} presentaron descarga nasal o lesiones de las mucosas nasales. En los terneros vacunados no se observó apatía, pérdida de apetito ni ningún otro síntoma clínico de enfermedad. La temperatura rectal, el crecimiento y los datos clínicos tras la exposición se muestran en las figuras 22, 23 y 24. Los terneros no vacunados desprendieron virus por la nariz dos veces más tiempo que los terneros vacunados (Cuadro 1).

Los resultados anteriores demuestran que las cepas mutantes Lam gE^{-} y Lam gE^{-}, TK^{-} BHV-1 difícilmente indujeron signos clínicos de enfermedad en terneros jóvenes. Las dos cepas de mutantes previnieron la enfermedad tras la exposición y redujeron el período de derramamiento nasal de virus un 50%.

Las cepas mutantes Lam gE^{-} y Lam gE^{-}, TK^{-} BHV-1 son seguras y eficaces en su utilización como vacuna en el ganado

3) Expresión procariótica de gE

Para la expresión procariótica del gen de la glucoproteína gE de BHV-1, se han utilizado vectores de expresión pGEX (D.B. Smith y K.S. Johnson, Gene 67 (1988) 31-40). Los vectores pGEX codifican la proteína portadora glutaniona S-transferasa (GST) de Schistosoma japonicum que se encuentra bajo la influencia del promotor tac cuya expresión se puede inducir por isopropiltiogalactósido (IPTG). Un ejemplo de una proteína de fusión GST-gE es el producto de constructo pGEX-2T600s3 (figura 8A). En este constructo, utilizando técnicas standard de biología molecular (Sambrook et al. 1989) se ligó detrás del GST un fragmento 60 bp Smal que codifica una región terminal N de 200 amino ácidos de la proteína gE. Este constructo fue diseñado por triplicado con, cada vez, un marco de lectura diferente del fragmento 60 bp ligado al GST. Los tres constructos se introdujeron en cepa de Escherichia coli DH5\alpha, se indujeron de IPTG y las proteínas formadas se transfirieron a nitrocelulosa tras la electrofóresis de gel de poliacrilamida por medio de transferencia Western. La detección inmunológica con anticuerpos anti-GST demostró que únicamente el marco de lectura adecuado (nº3) que codifica la zona de proteína gE conduce a la expresión de una proteína de fusión prominente del tamaño previsto de 27k (GST) + 20k (gE) = 47k. Tres de los Mabs aislados por nosotros que no reaccionan con Difivac-1 reconocen la proteína de fusión 47 kD GST-gE en una transferencia Western; véase figura 8B.

4) Expresión eucariótica del gen de la glucoproteína gE

Para la expresión eucariótica del gen de la glucoproteína gE, se ha elegido hasta ahora entre otros el vector pEVHis. El vector pEVHis tiene, como marcador eucariótico, el gen HisD que codifica la histidinol de hidrogenasa [EC 1.1.1.23] (C. Hartmann y R. Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 85, 8047-8051) que hace que las células sobrevivan a la concentración tóxica de 2,5 mM de histidinol. El vector comprende además la región promotora del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (HCMV) con zonas de enzima de restricción únicas situadas detrás de él. Para la construcción de un vector de expresión pEVHis/gE se utilizó un fragmento que comprendía toda la región de codificación del gen de la glucoproteína gE. Comienza en la zona Alul 55 bp antes del marco de lectura abierto postulado de gE y termina 133 bp detrás de él. Esta región se clonó detrás del promotor HCMV del vector pEVHis, formándose el constructo pEV/His/gE (fig. 9). El pEV/His/gE se amplió en células E. coli DH5\alpha y se purificó por medio de un gradiente de cloruro de cesio (Sambrook et al., 1989). Este ADN purificado se transfectó a células Balb/C-3T3 según el método de Graham y Van der Eb. Las células transformadas se seleccionaron con histidinol, después de lo cual pudieron aislarse 20 colonias resistentes al histidinol. Estas colonias se examinaron con Mab 81 en un ensayo Inmunoperoxidasa Monocapa (IPMA). Se comprobó que 4 colonias expresaban la proteína gE. De estas cuatro colonias, se utilizó el clon 3T3 gE 9 para aislar un subclon que tenia una elevada expresión gE. El clon aislado con este método (denominado 3T3gE 9.5) se utilizó para caracterizar anticuerpos monoclonales anti-gE candidatos.

5) Expresión eucariótica de la glucoproteína gE del BHV-1 y la glucoproteína gl de BHV-1 en la misma célula

Para expresar la glucoproteína gl de BHV-1 en la misma célula que la glucoproteína gE de BHV-1 determinamos en primer lugar la posición putativa del gen gl de BHV-1. Debido a que el gen de la glucoproteína gl del virus herpes simplex está situado justo corriente arriba del gen de la glucoproteína gE, se dedujo que el gen de BHV-1 estaría situado en una posición correspondiente. Para comprobarlo, se determinó la secuencia de una región de 283 nucleótidos, situada aproximadamente 1 kb corriente arriba del comienzo del gen gE de BHV-1. La traducción conceptual de esta región mostró que el segundo marco de lectura codifica una secuencia de 94 amino ácidos homóloga de la glucoproteína gl del virus herpes simplex (figs. 13 y 14). Debido a que el segmento homólogo está a aproximadamente a 80 amino ácidos del codon inicial se estima que el comienzo putativo del marco de lectura abierto del gen gl de BHV-1 está aproximadamente 250 nt corriente arriba de la región secuenciada. De lo anterior se dedujo que el fragmento 1,7 kb Smal que comienza 400 nt corriente arriba de la región secuenciada y finaliza dentro del gen gE deberá contener la región de codificación completa del gen C de BHV-1. Este fragmento 1,7 kb Smal ha sido clonado en el vector eucariótico MSV-neo (véase fig. 15). Este vector contiene el promotor fuerte del virus de la Sarcoma murina y el gen selector neo que codifica la resistencia contra geneticin sulfato de G-418 antibiótico. El constructo resultante MSVneoGI ha sido ampliado en células de E. coli DH5\alpha y transfectado en células 3T3gE 9,5 utilizando el método de Graham y Van der Eb. Las células transfectadas se seleccionaron con 400 \mug de geneticin/ml. de medio de cultivo y se aislaron las colonias resistentes y se comprobaron con Mabs anti-gE candidato que no reaccionaron con células 3T3gE 9,5. De lo anterior seleccionamos el clon 3T3gE/gl R20 que reaccionó con p. Ej. Mab 66 así como lo hace el BHV-1 de tipo natural.

6) Caracterización de Mabs anti-gE candidatos

Se produjeron Mabs contra BHV-1 de tipo natural y se seleccionaron por su incapacidad para reaccionar con células de traquea bovina embriónica (Ebtr) infectadas con Difivac-1. Se examina la reactividad de estos Mabs con:

a) el mutante por deleción Lam gE

b) el producto de expresión procariótica descrito anteriormente en una transferencia Western;

c) las células Balb/c-3T3 de expresión de gE descritas anteriormente;

d) células mencionadas en c) e infectadas con Difivac-1, y

e) células Balb/c-3T3 que expresan el complejo gE/gl.

Para comprobar la reactividad en a, c, d y e se utilizó un ensayo Monocapa de inmuno-peroxidasa (IPMA). Los resultados en el cuadro 2 muestran que hemos producido Mabs dirigidos contra gE (números 2, 3, 4, 52, 66, 68, 72 y 81) y Mabs (números 1, 51, 53, 67, 75 y 78) y que pueden dirigirse contra dominios antígenos conformacionales en el complejo gE/gl. Un IPMA de competencia para delimitar los dominios antigénicos reconocidos por los diversos Mabs indicó que por lo menos 4 dominios antigénicos se encuentran presentes en glucoproteína gE y que un dominio está probablemente formada por el complejo gE/gl (cuadro 2).

Detección de anticuerpos anti-gE en ganado infectado por BHV-1

Para examinar si en el suero de ganado infectado se encuentran anticuerpos contra gE, se realizó un IPMA de bloqueo indirecto con los 16 Mabs gE candidatos y los 8 sueros siguientes elegidos:

- 2 sueros de bovinos vacunados con Difivac-1 y provocados con la cepa Iowa virulenta, que se recolectaron 14 días después de la provocación (challenge);

- 2 sueros de bovinos infectados experimentalmente con virus subtipo 1 de BHV-1, que se recolectaron 20 meses después de la infección. Uno de los bovinos se infectó por exposición de contacto;

- 2 sueros de bovinos infectados experimentalmente con virus subtipo 2b de BHV-1, que se recolectaron 20 meses después de la infección. Uno de los bovinos estaba infectado por exposición de contacto;

- 1 suero de un ternero libre de patógeno específico vacunado con una vacuna mutante ts y provocado tres semanas después con virus subtipo 2b de BHV-1, que se recogió siete semanas después de la provocación;

- 1 suero de ternero gnoto biótico vacunado con una vacuna mutante ts y provocado tres semanas después con virus subtipo 2b de BHV-1, que se recolectó siete semanas después de la provocación.

El cuadro 2 muestra que todos estos sueros contenían anticuerpos contra los dominios antigénicos III y Iv sobre gE, y contra dominio antigénico I situado probablemente en el complejo gE/gl. Podemos concluir que gE parece ser un marcador serológico adecuado para distinguir entre ganado vacunado e infectado por BHV-1.

7) Detección de ácidos nucléicos de BHV-1 por medio del procedimiento PCR utilizando iniciadores gE-específicos de BHV-1

Partiendo de la secuencia de nucleotídos determinada del gen gE de BHV-1, se eligió un par de iniciadores adecuado para el PCR, utilizando el programa de selección de iniciadores de Lowe et al. (T. Lowe, J. Sharefkin, S. Qi Yang y C.W. Dieffenbach, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 1757-1761). Estos iniciadores fueron denominados P_{3} y P_{4} y se muestran en la figura 10. Los iniciadores están separados 159 nt entre sí y conducen a la ampliación/multiplicación de un segmento de 200 nt. Utilizando iniciadores P3 y P4 y ADN de BHV-1 aislado, se optimizaron las condiciones para el procedimiento PCR. Esto suponía en particular modificar la concentración de MgCl_{2}, la concentración de glicerol y las condiciones de clicado. El tampón óptimo hallado para el uso de P3 y P4 para la ampliación de BHV-1 es 10 mM Tris pH 8, 0, 50 mM KC1, 0,01% gelatina, 2,6 mM MgCl_{2} y 20% de glicerol. Las condiciones cíclicas óptimas halladas (Perkin Elber Cetus DNA Thermal Cycler) son para cicli 1-5: 1 minuto, 98ºC, 30 seg. 55ºC y 45 seg. 72ºC y para cicli 6-35: 30 seg. 96ºC, 30 seg. 55ºC y 45 seg. 72ºC. Después de la ampliación PCR, el fragmento de ADN de 200 nt obtenido se sometió a electrofóresis sobre gel de agarosa 2%; se transfirió sobre nitrocelulosa y ulteriormente se sometió al análisis de transferencia Southern. La sonda marcada ^{32}P dCTP utilizada para el análisis de transferencia Southern es el fragmento Taql 137 bp situado entre la zona de fijación del iniciador (fig. 10). Después de la autoradiografía de los filtros hibridados, se puede observar una banda de 200 bp. Por esta vía la ampliación de sólo 10 genomas deBHV-1 (aproximadamente 1,5 x 10^{-15}\mug ADN) conduce todavía a una señal detectable de forma adecuada (no se muestra el resultado). De forma comparable, se desarrolló un procedimiento PCR en el que se utilizan iniciadores basados en la secuencia de codificación de la glucoproteína gIII de BHV-1 (D.R. Fitzpatrick, L.A. Babiuk y T. Zamb, 1989, Virology 173, 46-57). Para poder realizar una distinción entre ADN de BHV-1 de tipo natural y vacuna de mutante por deleción de gE, se sometieron pruebas de ADN a análisis de PCR gE-específico y de PCR gIII-específico. En dicha prueba una preparación de ADN de Difivac-1 era gE negativo y gIII positivo. Debido a que la detección de ADN de BHV-1 en semen de bovino constituirá una utilización importante del procedimiento PCR específico del BHV-1, se intentó realizar el PCR específico de gE en semen de bovino infectado con BHV-1. No obstante, unos componentes desconocidos en el semen tienen un efecto fuertemente inhibitorio en la reacción de la cadena de polimerasa. Por consiguiente se desarrolló un protocolo para aislar el ADN de BHV-1 del semen de bovino. Para aislar el ADN del semen de bovino, se incubaron 30 \mul de semen con 1 mg/ml de proteinaza K (pK) en un volumen total de 300 \mul 0,15M NaCl, 0,5% Na-Sarkosyl y 40 mM DTT, a 60ºC. Después de una hora se dejó enfriar la muestra a temperatura ambiente y se añadieron 300 \mul de 6M Nal y se incubaron durante 5 minutos. Se aisló ADN de esta mezcla con extracción standard de cloroformo/isoamiletanol y se precipitó con un volumen de isopropanol. El precipitado se lavó con 2,5 M NH_{4}Ac/70% etanol y se volvió a suspender en 10 mM Tris pH 7,4, 1 mm EDTA, 0,5% Tween 80 y 0,1 mg/ml pK para una segunda incubación durante 1 hora a 60ºC. Este preparado de ADN se puede someter directamente a la Reacción de la Cadena de Polimerasa.

Descripción de las figuras

Figura 1

Análisis de transferencia Southern de cepas de BHV-1 Difivac-1 y Iowa

A. Presentación de un autoradiograma de transferencia Southern de Difivac-1 y ADN genómico Iowa. En las vias 1 y 3 se aplicó ADN de Difivac-1 después de digestión de enzima de restricción con HindIII y Pstl, respectivamente. En las vías 2 y 4 se aplicó ADN Iowa después de digestión de enzima de restricción con HindIII y Pstl, respectivamente. El tamaño de los fragmentos se indica en kilobase (kb).

Se aisló ADN viral centrifugando el medio de cultivo (70 ml/botella de rodillos de aproximadamente 450 cm^{2}) con células Ebtr infectadas por virus durante 2 horas por un amortiguador de sacarosa 25% (w/w (peso/peso)) en 10 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl y 1 mM EDTA a 20 krpm en el rotor SW27 de la ultracentrifugadora Beckman L5-65. Del nódulo de virus así obtenido se aisló ADN según método standard (J. Sambrook, E.F. Fristch y Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual (clonación molecular: Manual de laboratorio), 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). En este ADN se realizaron digestiones de enzima de restricción con enzimas de Boehringer Mannheim en los tampones SuRE/cut suministrados por el fabricante.

Tras la separación sobre geles de agarosa 0,7% para la electrofóresis horizontal y la transferencia sobre un filtro de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Inc), se prehibridó el filtro durante 6 horas a 42ºC en formamida 50%, 3x SSC (1x SCC = 0,15M NaCl y 0,015 M citrato Na, pH 7,4), 50 \mul de ADN de esperma de salmón desnaturalizado (Sigma)/ ml y 0,02% de albúmina de suero bovino, 0,02% polivinil pirrolidona y 0,02% ficoll y 0,1% Na-dodecilsulfato (SDS). Luego se realizó la hibridación añadiendo a la misma solución el fragmento HindIII K marcado ^{32}P dCTP (Amersham) (la elección del fragmento HindIII K se basa en: clonación y delimitación de zona de división de ADN de herpes virus bobino 1 (cepa Corp), John F. Mayfield, Peter J. Good, Holly J. VanOort, Alphonso R. Campbell y David A. Reed, Journal of Virology (1983) 259-264). Después de 12-14 horas de hibridación, se lavó el filtro durante 2 horas en 0,1% SDS y 0,1 x SSC a 60ºC. El fragmento HindIII K se clonó en el vector pUC18 según los procedimientos de clonación standard (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: laboratory manual (Clonación molecular: Manual de laboratorio, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Tras la digestión de HindIII del clon pUC/8,4 HindIIIK se separó el vector pUC18 del fragmento HindIII K 8,4 kb nuevamente por electrofóresis sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión 0,7% (BRL, Life Technologies, Inc) y se aisló de la agarosa mediante extracción de fenol y precipitación de etanol standard. El fragmento de HindIIIK aislado se marcó con el kit de marcado de ADN Random Primed 1004.760 de Boehringer Mannheim. La auto-radiografía de los filtros hibridados se realizó mediante 36 horas de exposición de película Kodak XAR a -70ºC utilizando una pantalla de reflexión.

B. Representaciones física del fragmento HindIII 8,4 kb de Iowa y del fragmento HindIII 7,4 kb de Difivac-1. A la vista de la co-migración de los fragmentos Pstl 6 kb y de la ausencia del fragmento Pstl 1,8 kb en Difivac-1, se postuló la deleción en la zona rayada.

Figura 2

Subclonación de fragmentos de BHV-1 de tipo natural entorno a la región que carece de Difivac-1

En A, se muestran los componentes del genoma de BHV-1: la región Larga Única (U_{L}), la región Corta Única (U_{S}) y las dos repeticiones (Ir y Tr). Esta representación se basa en el análisis publicado de la cepa Cooper (John F. Mayfield, Peter J. Good, Holly J. VanOort, Alphonso R. Campbell y David A. Reed, Journal of Virology (1983) 259-264).

En B, se muestran los fragmentos de la región U_{S} que han sido clonados en vectores procarióticos: un fragmento de EcoRI 15,2 kb en pACYC, un fragmento de HindIII 8,4 kb en pUC18 y un fragmento de EcoRI-HindIII de 2,7 kb y 4,1 kb en pBR322. El aislamiento de los fragmentos de ADN virales se realizó según los procedimientos mencionados en las leyendas de la fig. 1A. La clonación de estos fragmentos en los diversos vectores se realizó según procedimiento standard (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: laboratory manual (Clonación molecular: Manual de laboratorio, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

En C, se muestra un mapa físico de la región en el que está localizada la deleción postulada en Difivac-1.

En D, se indican algunos subclones de esta región que se utilizaron para su análisis ulterior. Se clonaron los dos fragmentos PstI en pKUN19 y los fragmentos restantes en pUC18.

Figura 3

A: Secuencia de nucleotídos de 2027 nucleótidos de la región US de cepa de BHV-1 Lam en torno a la ubicación postulada que ha sido suprimida en Difivac-1 según se indica en la figura 2C [de la zona de reconocimiento Alul en la parte extrema izquierda a la zona de reconocimiento HindIII en la parte extrema derecha]. La secuencia de nucleotídos en los insertos de los subclones mostrada en la figura 2D, se determinó analizando en las dos cadenas, utilizando el método de la secuencia dideoxi de Sanger et al. (F. Sanger. S. Nicklen y A.R. Coulson, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). Para ello se utilizó el kit de secuencia T7 de Pharmacia según el procedimiento especificado por el fabricante. Para el marcado radioactivo se utilizó [^{35}S] dATP (Amersham). El análisis de la secuencia de las regiones ricas en GC con artefactos de compresión se repitió con la variante 7-deaza-dGTP del kit de Pharmacia. Tal como se indica a continuación, la secuencia de nucleótidos es, en el código de tres letras, la secuencia de amino ácidos (aa) del marco de lectura abierto de residuos 575 aa, que se encontró tras la traducción conceptual de la secuencia de uncleotidos. Esta traducción se basa en el código universal y se determina utilizando el programa informático PC/gen (PC/gen versión 1.03, Noviembre 1987). Este marco de lectura abierta de 575 aa comienza con la metionina en nt 168 y termina con el codon de terminación en el nucleótido 1893.

Se realizó también el análisis del marco de lectura abierto de residuos 575 aa, con el programa informático PC/gen. Los primeros 26 aa forman una señal de exportación eucariótica indicada en la figura por "péptido de señal". Con una puntuación de 6,2 se prevé la segmentación de esta secuencia de señal se prevé entre aa 26 y aa 27. La secuencia de 575 aa tiene tres posibles zonas de glicosilación unidas por N (NXT/S) indicadas por una línea por debajo de los residuos de amino ácidos. Según el método Rao y Argos hay una región de transmembrana entre aa 423 y aa 450 indicada en la figura por "hélice de transmembrana". Las secuencias de reconocimiento (zonas) para las enzimas de restricción Asull, Smal, HindIII y EcoNI están subrayadas. El peso moléculo calculado de este polipéptido es de 61212.

B: Representación esquemática de características estructurales del precitado marco de lectura abierto 575 aa.

Figura 4

La comparación de los amino ácidos de la secuencia de amino ácidos del gen gE de BHV-1 con la secuencia de amino ácidos del gen gE del virus herpes simplex (HSV) y otros genes homólogos gE [virus pseudorabies (PRV) gl y varicela-zoster (VZV) gpl].

Las secuencias utilizadas para esta comparación proceden de las siguientes publicaciones: HSV: determinación de la secuencia y contenido genético de la región única corta en el genoma del virus herpes simplex tipo 1. D.J. McGeoch, A. Dolan, S. Donald y F.J. Rixon (1985) Journal Mol. Biol. 181, 1-13. VZV: secuencia de ADN del componente U_{S} del genoma del virus varicela-zoster. A.J. Davidson (1983), EMBO Journal 2, 2203-2209. PRV: utilización de \lambdagt11 para aislar genes para 2 glucoproteínas del virus pseudorabies con homología con glucoproteínas del virus herpes simplex y del virus varicela-zoster. E.A. Petrovskis, J.G. Timmins y L.E. Post (1986) Journal of Virology 60, 185-193]. Estas secuencias se compararon utilizando el programa de análisis de secuencia Multalin (F. Corpet, 1988, Nucl. Acids Res. 16, 10881-10890).

En A se muestra un diagrama en el que las cuatro secuencias de amino ácidos aparecen de forma esquemática. Aquí, las partes de transmembrana previstas (TM) se muestran una debajo de la otra. Además de las secuencias de señal de exportación previstas (SP) y de las posibles zonas de glicosilación fijadas por N (I) se muestran dos zonas conservadas, en las cuales suele permanecer invariable la posición relativa de los residuos de cisteína (CCC).

En B, se muestran los resultados de la comparación de Multalin de la región rica en cisteína situada centralmente, de las cuatro versiones de gE. Los asteriscos indican amino ácidos idénticos y los dos puntos amino ácidos análogos.

Figura 5

Fotografías obtenidas en un análisis de transferencia Southern de Difivac-1 e Iowa

Panel A: ADN genómico de digestiones de enzima de restricción Difivac-1 e Iowa con BstI (1,2), EcoRI (3,4) y HindIII (5,6) separadas sobre gel de agarosa 0,7%, y transferidas sobre nitrocelulosa e hibridadas con fragmento HindIII K marcado ^{32}P de cepa de BHV-1 Lam según los procedimientos especificados en las leyendas de la figura 1A.

Panel B: Transferencia de nitrocelulosa del mismo gel que en A, hibridado con la sonda p318 específica de gE d BHV-1. Esta sonda comprende toda la región Alul-HincII indicada en la figura 2C.

Figura 6

Construcción de fragmento de deleción gE de BHV-1

En A se muestra la posición utilizada del gen gE y los clones. Los componentes del genoma de BHV-1 son: la región Larga Única (UL); la región Corta Única (US) y las dos repeticiones (IR y TR). Para obtener la región situada en el lado 5' del gen gE, se subclonó el fragmento 1,4 kb PstI-Smal del fragmento 8,4 kb HindIII K de la cepa de BHV-1 Lam en la zona Smal y PstI, del plásmido pUC18. Este clon se denominó p515 y se muestra en B. El fragmento EcoNI-Smal situado en lado 3' de gE, procedente del clon 4,1 kb HindIII-EcoRI se clonó en la zona única Asull de p515. Para permitir la ligación del resto de EcoNI con el resto Asull, se digerió el clon p515 con Asull, y luego se hizo reaccionar con la enzima Klenow (Boehringer Mannheim) y dCTP para proporcionar un residuo de citosina en el resto Asull según método standard (Sambrook et al., 1989). Esta citosina adicional se indica mediante un asterisco en D. Then, se procedió también a la digestión de p515 con la enzima Smal y después se pudo ligar el fragmento EcoNI en este vector. El clon así construido se denominó p519.

Figura 7

A. Fotografía obtenida en el análisis de transferencia Southern de preparados de ADN de 1B7, 1B8 y 2H10. Se realizó el aislamiento de ADN, las restricciones de enzima de digestión, la transferencia y la hibridación según los procedimientos descritos en las leyendas de la figura 1A. Tras la doble digestión Pstl-Dral de los preparados de ADN 1B7, 1B8 y 2H10 se separaron los fragmentos sobre gel de agarosa 0,7% y después se transfirieron sobre un filtro de nitrocelulosa. Este filtro se hibridó con el fragmento de deleción 2,3 kb Pstl-Dral marcado ^{32}P dCTP como sonda. En las vías 1 a 3, se separaron las muestras 1B7, 1B8 y 2H10 respectivamente. En la vía 4, se aplicó ADN de BHV-1 de tipo natural de la cepa Lam y en la vía 5 el fragmento de deleción 2,3 kb.

B. Mapa físico del fragmento 15,2 kb EcoRl de la cepa Lam de BHV-1. El mapa muestra la posición de las zonas de reconocimiento Pstl, Dral y HindIII y la posición de la sonda de hibridación mencionada en 7A.

\newpage

Figura 8

Expresión procariótica de gE de BHV-1

Para la expresión procariótica de gE de BHV-1, se fusionó el fragmento 600 bp Smal del gen gE en tres marcos de lectura con la región de codificación del gen glutatio-na-S-transferasa de Schistosoma japonicum en el vector pGEX-2T (D.B. Smith y K.S. Johnson, gen 67 (1988) 31-40). Se identificaron moléculas recombinantes con la orientación adecuada (syn) del fragmento Smal por medio de análisis de enzima de restricción utilizando métodos standard. Los clones de E. coli DH5\alpha con este constructo de fusión se denominaron pGEX-2T600s1, pGEX-2T600s2 y pGEX-2T600s3.

A. Diagrama de uno de los constructos pGEX-2T600s. Situada en el lado NH_{2} de la región que codifica para producto de fusión GST-gE se encuentra la región promotora tac inducible de isopropiltiogalactósida (IPTG).

B. Fotografías obtenidas en el análisis de transferencia Western de preparados de proteína totales de células DH5\alpha transformadas con pGEX-2T600s. Se continuaron cultivos de durante la noche de células DH5\alpha transfectadas con los constructos pGEX-2T600s1, pGEX-2T600s2 y pGEX-2T600s3, 1/10 en medio Luria-Bertani (LB) con 50 \mug/ml de ampicilina y después de una hora de crecimiento, inducidos con IPTG durante 5 horas. Estos cultivos inducidos se centrifugaron durante 5 minutos a 6.000 x g y se incorporaron en 1 x layermix (2% SDS, 10% glicerol, 5% mercaptoetanol y 0,01% de vertical 12,5% según procedimiento standard y ulteriormente se transfirieron semisecos a un filtro de nitrocelulosa utilizando el sistema LKB-multiphor II Nova Blot en las condiciones especificadas por el fabricante.

En las vías M, se aplicó proteína marcadora precoloreada (BRL Life Technologies, Inc. 236k, 112k, 71k, 44k, 28k, 18k y 15k) y en las vías 1, 2 y 3 se transfectaron los preparados de proteína total de células DH5\alpha con los tres marcos respectivos pGEX-2T600s2, pGEX-2T600s2 y pGEX-2T600s3.

En el panel A, se puede ver el resultado del análisis de transferencia Western con suero anti-GST. Para ello, se
incubó el filtro según procedimiento standard (E. Harlow y D. Lane, 1988, Anticuerpos: manual de laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) en tampón de bloqueo (PBS + 2% polvo de leche y 0,05% Tween 20) y ulteriormente con suero de conejo anti-GST policlonal. Seguidamente se lavó el filtro y se incubó con suero de inmunoglo-
bulina de cabra-anticonejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRPO). Los anticuerpos de cabra fijados fueron detectados por vía inmuno-química con cromógeno (diaminobencidina, cloronaftol y H_{2}O_{2}). El producto de fusión
GST que se indica mediante una flecha tiene el tamaño previsto de aproximadamente 47 k solamente en el marco 3.

En el panel B se puede ver el resultado del análisis de transferencia Western con Mab 4 de anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína gE. Para ello, se bloqueó un filtro duplo, en el panel A, se incubó con Mab, se lavó e incubó con suero conejo-anti-ratón conjugado con HRPO. Seguidamente, los anticuerpos de conejo fijados se detectaron por vía inmuno-química con cromógeno. La banda visible en la vía 3 (marco 3) tiene un tamaño de 47 k y se indica por medio de una flecha.

Figura 9

Construcción del plásmido pEVHisgE para la expresión eucariótica del gen gE de BHV-1

Para la expresión eucariótica del gen gE, se clonó toda la región de codificación de gE en la orientación adecuada detrás de la región del promotor HCMV del vector de expresión pEVHis utilizando procedimiento standard (Sam-brook et al. 1989). Para ello, el fragmento 349 bp Alul que comienza 55 bp antes del marco de lectura abierto del gE se clonó en pUC18 y se llamó p201. Luego, después de la digestión Hincll de p201, el fragmento 1740 bp Hincll, que comprende la mayor parte del gen gE, se clonó en p201. Esto dio como resultado el plásmido p318 que en el poliligante de pUCl8 comprende toda el área de codificación gE desde la zona Alul 55 bp antes del codon inicial de gE hasta la zona Hincll 133 bp por detrás del codon de terminación de gE. Utilizando las zonas de enzima de restricción en el poliligante del vector, se cortó el fragmento desde p318 con las enzimas BamHl y Sphl. En primer lugar se procedió a la digestión de p318 con Sphl y luego se rellenó la zona Sphl utilizando polimerasa Klenow y dNTP. Tras la digestión con BamHl, se separó el injerto 1,9 kb del vector pUC18 en agarosa de bajo punto de fusión y se ligó en el vector pEVHis que había sido digerido con BamHl y EcoRV a tal efecto. El plásmido así formado se llamó pVEHis/gE.

Figura 10

Posición de los iniciadores específicos de gE y la sonda para el procedimiento PCR para detectar ADN de BHV-1

En la figura se muestra la secuencia de ácido nucléico del gen de la glucoproteína gE de BHV-1 desde el nucleótido 1272 hasta 2027 [la secuencia se ha tomado de la figura 3]. Los iniciadores utilizados para el procedimiento PCR específico de gE se llamaron P_{3} y P_{4}. Las zonas de fijación de iniciador para P_{3} y P_{4} están subrayadas. La secuencia de nucleótidos de P_{3} es 5'-ACG-TGG-TGG-TGC-CAG-TTA-GC-3' (SEQ ID NO:2). La secuencia de nucleótidos de P_{4} es (complementaria de la secuencia de fijación de iniciador especificado anteriormente) 5'-ACC-AAA-CTT-TGA-ACC-CAG-AGC-G-3' (SEQ ID NO:3). La sonda que se utilizó para la hibridación de transferencia Southern para la detección de ADN ampliado por PCR es el fragmento 137 bp Taql situado entre las zonas de fijación de iniciador; se indican los extremos de este fragmento. Para poder comparar con la figura 3, se indican también Hindlll y EcoNl.

Figura 11

Representación de la deleción de gE de Difivac-1

A muestra el mapa físico del fragmento 15,5 kb EcoRl de la cepa de BHV-1 Lam de tipo natural. B muestra el mapa físico del fragmento 14,5 kb EcoRl de Difivac-1. Ambos fragmentos EcoRl cubren las regiones completas Cortas Únicas de los genomas de los virus correspondientes. La posición del gE y la posición putativa del gen gl se indican mediante cajetines abiertos. Los mapas A y B están situados de forma que los fragmentos 6 kb Pstl dentro de cada mapa están alineados. En ambos mapas, las secuencias de repetición interna y de repetición terminal se indican mediante cajetines rayados. Las flechas por debajo de la repetición indican la orientación de estas secuencias.

En A, la parte de la región U_{S} que falta en la cepa de Difivac-1 se ha indicado.

C muestra la posición de los fragmentos clonados de Difivac-1 utilizados para representar la deleción gE y obtener el mapa físico mostrado en B. Las flechas por debajo de los insertos de clones p728, p737 y p754 indican las regiones que han sido secuenciadas para determinar el punto de recombinación.

Abreviaturas

A = Alul, E = EcoRl, P = Pstl, H = Hindlll, r = punto de recombinación, IR = repetición interna, TR = repetición terminal.

Figura 12

Determinación del punto de recombinación exacta en la región U_{S} de Difivac-1

Para determinar los límites exactos de la deleción gE encontrados en la cepa Difivac-1 se han secuenciado el clon p754 y los extremos de los clones p728 y p737. Los insertos de estos clones se indican en la figura 11. Los procedimientos de secuencia utilizados se describen en las leyendas de la fig. 3.

En A, se muestra la secuencia de la mayor parte del fragmento Alul-Pstl. Esta secuencia comienza en la región del promotor del gen gE. Se ha subrayado un cajetín putativo TATA. En el punto r (= punto de recombinación) esta región promotora se fusiona con una secuencia que también se encuentra en el lado opuesto de la región U_{S}, denominado repetición invertida. El punto de recombinación exacto se ha determinado comparando la repetición encontrada en la región promotora gE con la copia de la repetición encontrada en la zona opuesta de la región U_{S}. En el punto en el que divergen estas secuencias se indica en B (en I) con "r". Se ha realizado una comparación similar con la secuencia promotora gE encontrada en Difivac-1 y el promotor gE encontrado en la cepa Lam de tipo natural. El punto en el que estas secuencias divergen se muestra en B (en II) y se indican también con la letra "r". Los puntos de recombinación encontrados son los mismos.

Figura 13

Análisis de secuencia parcial del gen gl de BHV-1

Utilizando el clon 1,8 kb Pstl de la cepa Lam de BHV-1 que llega hasta el gen gl y gE de BHV-1 (véase figura 11), se determinó la secuencia de 284 nucleótidos dentro de la región de codificación gl de BHV-1. Los procedimientos se secuencia utilizados se describen en las leyendas de la fig. 3. La leyenda se ha traducido sobre la base del código universal mediante el programa informático PC/gen versión 1.03 (Noviembre 1987). La secuencia de aminoácidos codificada por el segundo marco de lectura se da en un código de una letra por debajo de la secuencia de nucleótido. Esta secuencia de amino ácidos es homóloga a la región de codificación de otros homólogos gl del virus herpes (véase fig. 14).

Figura 14

La comparación de los amino ácidos de la secuencia parcial de amino ácidos del gen gl de BHV-1 putativo con las partes correspondientes de las regiones codificadoras del gen gl del virus herpes simplex (HSV1), del gen gp63 del virus pseudorabies (PRV) y del gen gpIV del virus varicela-zoster (VZV).

La secuencia PRV comienza en el amino ácido 82, la secuencia HSV1 comienza en aa 80 y la secuencia VZV comienza en aa 76 de las regiones de codificación respectivas. Las secuencias utilizadas se utilizaron en los artículos mencionados en las leyendas de la figura 4. La comparación se realizó utilizando el programa informático Multalin. Los asteriscos indican amino ácidos idénticos y los dos puntos indican amino ácidos análogos.

Figura 15

Construcción del plásmido MSVneoGI para la expresión eucariótica del gen gl de BHV-1

Sobre la base de la comparación de amino ácidos de la secuencia parcial del gen gl de BHV-1, se ha estimado la expresión putativa del gen gl de BHV-1. Sobre la base de esta estimación, se ha inferido que el fragmento 1,7 kb Smal debe contener la región de codificación completa del gen gE de BHV-1. La posición de este fragmento 1,7 kb Smal se ha indicado en A. En los extremos romos de este fragmento 1,7 kb Smal se han ligado ligantes BamHl, utilizando procedimientos standard. El producto resultante se digerió con BamHl y se ligó en el vector de expresión eucariótica MSV-neo. El vector MSV-neo tiene una zona BamHl única detrás de MSV-LTR, que tiene una fuerte actividad promotora. Este vector se ha descrito en Rijsewijk et al., 1987 EMBO.

Figura 16

Construcción de un fragmento de deleción doble gl/gE de BHV-1

La posición del gen de la glucoproteína gE y la posición putativa del gen de la glucoproteína gl en la región U_{S} de BHV-1 se describen en el diagrama A. Los bloques rayados indican las repeticiones que bordean la región U_{S}. B muestra el mapa físico de algunas zonas de enzima de restricción esenciales con respecto a la posición de ambos genes. Para construir el fragmento de deleción gl/gE se digerió con Pstl el clon p1.7-Smal/o que contiene el fragmento 1,7 kb Smal que abarca el gen gl. La zona Pstl del inserto restante 350 bp Smal-Pstl se hará de extremos romos utilizando procedimientos biológicos moleculares standard. El fragmento EcoNI-Smal (véase figura 6B) aislado del fragmento 4,1 kb Hindlll-EcoRl descrito en la figura 6A se hará también de extremos romos y se ligará a la zona modificada Pstl. Esto se representa en los diagramas C y D. Del clon resultante pAIE se puede aislar el fragmento 1,4 Kb Smal-Dral para recombinar con ADN de BHV-1 de tipo natural.

Abreviaturas

E = EcoRl, H = Hindlll, S = Smal, P = Pstl, ENI = EcoNI, D = Dral, Kb = Kilobase y U_{s} = Corto Unico.

Figura 17

Eliminación nasal medida de virus de terneros tras la vacunación = vacunados con Difivac-1, 0 = control no vacunado.

Figura 18

Puntuación clínica diaria media de terneros tras provocación con una cepa de BHV-1 virulento, clave como la fig. 17.

Figura 19

Temperatura rectal media de los terneros tras provocación con cepa virulenta de BHV-1, clave como la fig. 17.

Figura 20

Crecimiento medio de terneros después de provocación con una cepa virulenta de BHV-1, clave como en la fig. 17.

Figura 21

Eliminación nasal media de virus de terneros tras provocación con cepa virulenta de BHV-1, clave como en la fig. 17.

Figura 22

Temperatura rectal media de terneros tras la provocación con una cepa virulenta de BHV-1 = vacunados con Lam gE^{-}, 0 = vacunados con Lam gE^{-}-/TK^{-}, x = control no vacunado.

Figura 23

Crecimiento medio de terneros tras la provocación con una cepa virulente de BHV-1, clave como en la fig. 22.

Figura 24

Puntuación clínica diaria media de terneros tras provocación con cepa virulenta de BHV-1, clave como en la fig. 22.

CUADRO 1

1

CUADRO 2

2

SEQ ID NO: 1

\vskip1.000000\baselineskip

LONGITUD: 2027 nucleótidos, 575 amino ácidos

\vskip1.000000\baselineskip

TIPO: nucleótido y amino ácido

\vskip1.000000\baselineskip

CADENA: simple

3

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

LONGITUD: 20 nucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

TIPO: nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

CADENA: única

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTGGTGGT GCCAGTTAGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 3

\vskip1.000000\baselineskip

LONGITUD: 22 nucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

TIPO: nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

CADENA: única

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCAAACTTT GAACCCAGAG CG

\hfill

22

Claims (17)

1. Composición de vacuna para la vacunación de animales, en particular de mamíferos, más particularmente de bovinos, para protegerlos contra BHV-1, donde la composición de vacunas es una vacuna viva que contiene un mutante de BHV-1 y un adyuvante o portador adecuado, teniendo dicho mutante de BHV-1 una deleción en el gen de glucoproteína gE pero sin deleción en el gen de timidina quinasa, siendo gE una proteína que, en una cepa particular de BHV-1, tiene la secuencia de amino ácidos mostrada en la figura 3A y se puede distinguir serológicamente del BHV-1 de tipo natural.

2. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha deleción en el gen de gE ha sido causada por un procedimiento de atenuación más que por técnicas de recombinación de ADN.

3. Composición de vacuna según la reivindicación 2 en la que el mutante obtenido es Difivac-1 (Instituto Pasteur Francia, depósito nº I-1213).

4. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha deleción ha sido construida por técnicas de recombinación de ADN.

5. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que el mutante además de la mencionada deleción en el gen de gE, tiene una deleción en el gen de la glucoproteína gl.

6. Composición de vacunación según la reivindicación 1, en la que dicho mutante se elige mediante un proceso de discriminación entre virus BHV-1 que tienen un gen de gE intacto y virus BHV-1 que tiene una deleción en el gen de gE, comprendiendo dicho proceso la etapa de examinar si el ácido nucléico del virus reacciona con iniciadores o sondas específicos de gE derivados de la secuencia de nucleotídos de codificación para gE.

7. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho mutante se elige mediante un proceso de discriminación entre virus BHV-1 que expresan gE y virus BHV-1 que tienen una deleción en el gen de gE, comprendiendo dicho proceso la etapa de examinar si el virus reacciona con anticuerpos específicos de gE producidos contra gE o contra péptidos derivados de la secuencia de amino ácidos de gE.

8. Composición que consiste en un complejo de glucoproteínas gE y gl de BHV-1, siendo gE una proteína que, en una cepa particular de BHV-1, tiene una secuencia de amino ácidos como la mostrada en la figura 3A.

9. Composición que comprende un anticuerpo específico para un complejo de las glucoproteínas gE y gl de BHV-1, siendo gE una proteína que, en una cepa particular de BHV-1, tiene la secuencia de amino ácidos mostrada en la fig. 3A.

10. Composición según la reivindicación 9, que comprende un anticuerpo monoclonal específico para un complejo de las glucoproteínas gE y gl de BHV-1.

11. Composición según la reivindicación 9, que comprende un anticuerpo policlonal específico para un complejo de las glucoproteínas gE y gl de BHV-1.

12. Kit de diagnóstico para detectar anticuerpos específicos para BHV-1, en una muestra, en particular una muestra biológica como sangre o suero sanguíneo, saliva, esputos, fluidos corporales como lágrimas, fluido de lavado de pulmones, fluido nasal, leche o tejido procedente de un animal, en particular de un mamífero, más particularmente un bovino, que comprende un complejo de las glucoproteínas gE y gl de BHV-1, siendo gE una proteína que, en una cepa particular de BHV-1, tiene la secuencia de amino ácidos mostrada en la fig. 3A, y unos medios de detección adecuados para realizar una prueba de detección de anticuerpos.

13. Kit de diagnóstico según la reivindicación 12, que comprende además uno o más anticuerpos específicos para un complejo de las glucoproteínas gE y gl de BHV-1.

14. Kit de diagnóstico para detectar anticuerpos específicos para BHV-1 en una muestra, en particular una muestra biológica como sangre o suero sanguíneo, saliva, esputos, fluidos corporales como lágrimas, fluido de lavado de pulmones, fluido nasal, leche o tejido procedente de un animal, en particular de un mamífero, más particularmente un bovino, que comprende un anticuerpo específico para un complejo de las glucoproteínas gE y gl de BHV-1, siendo gE una proteína que, en una cepa particular de BHV-1, tiene la secuencia de amino ácidos mostrada en la figura 3A, y unos medios de detección adecuados para realizar un ensayo de detección de anticuerpos.

15. Un kit de diagnóstico para detectar una proteína de BHV-1 en una muestra, en particular una muestra biológica como sangre o suero sanguíneo, células sanguíneas, leche, fluidos corporales como lágrimas, fluido de lavado de pulmones, fluido nasal, esperma, en particular fluido seminal, saliva, esputos o tejido, en particular tejido nervioso procedente de un animal, en particular un mamífero, y más particularmente un bovino, que comprende un anticuerpo específico para un complejo de las glucoproteínas gE y gl de BHV-1, siendo gE una proteína que, en una cepa particular de BHV-1, tiene la secuencia de amino ácidos mostrada en la figura 3A y unos medios de detección adecuados para realizar un ensayo de detección de proteína.

16. Método para determinar la infección por BHV-1 de un animal, en particular un mamífero, más particularmente un bovino, que comprende el examen de una muestra procedente del animal, en particular una muestra biológica como sangre o suero sanguíneo, células de la sangre, esperma, en particular fluido seminal, saliva, esputos, fluido corporal como lágrimas, fluido de lavado de pulmones, fluido nasal, leche o tejidos, en particular tejido nervioso, para comprobar la presencia de anticuerpos específicos para un complejo de glucoproteínas gE y gl de BHV-1, siendo gE una proteína que, en una cepa particular de BHV-1, tiene la secuencia de amino ácidos mostrada en la figura 3A.

17. Método para determinar la infección por BHV-1 de un animal, en particular de un mamífero, más en particular un bovino, que comprende el examen de una muestra procedente del animal, en particular una muestra biológica como sangre o suero sanguíneo, células de la sangre, espermas, en particular fluido seminal, saliva, esputos, fluido corporal como lágrimas, fluido de lavado de pulmones, fluido nasal, leche o tejido, en particular tejido nervioso, para comprobar la presencia de un complejo de las glucoproteínas gE y gl de BHV-1, o la presencia de anticuerpos específicos para un complejo de las glucoproteínas gE y gl de BHV-1, siendo gE una proteína que, en una cepa particular de BHV-1, tiene la secuencia de amino ácidos mostrada en la figura 3A y procediendo la muestra que se va a examinar de un animal que ha sido vacunado con una preparación de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.