PL211815B1

PL211815B1 - Enzym esteraza lowastatyny osadzony na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, sposób osadzania enzymu, zastosowanie enzymu esterazy lowastatyny osadzonego na nosniku nierozpuszczalnym w wodzie, przepływowy reaktor biokatalityczny ze złożem oraz sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny

Info

Publication number: PL211815B1
Application number: PL383819A
Authority: PL
Inventors: Ryszard Ostaszewski; Waldemar Kurek; Dorota Patralska; Dominik Koszelewski
Original assignee: Inst Chemii Organicznej Polska Akademia Nauk; Instytut Chemii Organicznej Polska Akademia Nauk
Priority date: 2007-11-19
Filing date: 2007-11-19
Publication date: 2012-06-29
Also published as: EP2240569A1; WO2009067032A1; EP2240569B1; RU2010122385A; PL383819A1; RU2475538C2; CN101848988A; US20100240116A1

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy enzymu, esterazy Iowastatyny, osadzonego na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, sposobu osadzania enzymu, zastosowania enzymu, esterazy Iowastatyny, osadzonego na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, przepływowego reaktora biokatalitycznego ze złożem oraz sposobu wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny.

Symwastatyna i Iowastatyna należą do grupy związków będących inhibitorami reduktazy hydroksy-3-metylo-glutarylo - koenzymu A (HMG-CoA), zwanych statynami. Statyny znacznie zmniejszają ryzyko choroby wieńcowej, udaru mózgu i miażdżycy tętnic obwodowych. Poprzez redukcję złogów cholesterolu stabilizują blaszkę miażdżycową, poprawiają funkcję śródbłonka naczyniowego, hamują rozrost i migrację komórek mięśni gładkich, a także wpływają korzystnie na krzepnięcie krwi, fibrynolizę oraz na aktywność płytek krwi, a także wykazują działanie przeciwzapalne (Tobert J A i współpr., Journal of Clinical lnvestigations, 1982, kwiecień, 69 (4), 913-919; Pedersen T. i współpr., Lancet (1994) 344 1383-89; Czynniki Ryzyka. Pismo Polskiego Towarzystwa Badań nad Miażdżycą 2003, 40, 5-13).

Lowastatyna, związek o wzorze I, jest wytwarzana w procesie fermentacyjnym z udziałem szczepu Aspergillus terreus. Symwastyna, o wzorze II, statyna o wyższej czynności farmakologicznej i niższej toksyczności, jest wytwarzana z Iowastatyny metodą półsyntetyczną .

Opis patentowy USA nr 4,582,915 ujawnia metodę wytwarzania symwastatyny polegającą na modyfikacji łańcucha bocznego Iowastatyny, zgodnie z poniższym schematem

triol”, sól amonowa

Lowastatynę poddaje się zasadowej hydrolizie, a utworzoną sól potasową poddaje działaniu silnej zasady, takiej jak n-butylolit, w obecności aminy drugorzędowej, a następnie czynnika metylującego (np. jodku metylu). W syntezie uzyskuje się stopień konwersji nie przekraczający 95%. Wydzielenie symwastatyny w postaci czystej jest trudne, gdyż zanieczyszczenie resztkową lowastatyną może być oddzielone zasadniczo tylko z użyciem HPLC.

PL 211 815 B1

Enzym esteraza Iowastatyny umożliwia selektywną hydrolizę soli Iowastatyny w obecności soli symwastatyny. Enzym ten jest wytwarzany przez grzyb strzępkowy Clonostachys compactiuscula (ATCC 38009, ATCC 74178). Po przekształceniu w sole amonowe, mieszanina symwastatyny i Iowastatyny poddawana jest reakcji enzymatycznej hydrolizy katalizowanej przez esterazę Iowastatyny, w wyniku której selektywnie hydrolizowana jest sól Iowastatyny do „triolu, pozostawiając sól symwastatyny. Laktonizacja mieszaniny kwasów w warunkach kwaśnych prowadzi do powstania mieszaniny laktonów, które można rozdzielić przez krystalizację.

Wykonanie reakcji hydrolizy enzymatycznej z użyciem natywnego enzymu, esterazy Iowastatyny, prowadzi do jego utracenia, co podnosi koszty przekształcenia Iowastatyny w symwastatynę. Użycie całokomórkowego materiału z hodowli Clonostachys compactiuscula jest możliwe, ale stwarza trudności przy wydzielaniu produktu.

Unieruchomienie (immobilizacja) enzymu na nośniku stałym pozwala na ominięcie tych niedogodności. Ostaszewski R. i współpr., ujawnili w Biotechnology (2006, str. 888-892) próby osadzenia esterazy Iowastatyny na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie. Jednakże uzyskane katalizatory wykazywały niską aktywność, a enzym osadzony na nośniku charakteryzował się brakiem lub znacznym zmniejszeniem selektywności hydrolizowania Iowastatyny wobec symwastatyny, tj. w procesie enzymatycznym hydrolizie ulegała zarówno lowastatyna, jak i symwastatyna.

Celem wynalazku jest dostarczenie enzymu, esterazy Iowastatyny, osadzonego na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, sposobu osadzania enzymu, zastosowania enzymu, esterazy Iowastatyny, osadzonego na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, przepływowego reaktora biokatalitycznego ze złożem oraz sposobu wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny.

Enzym, esteraza Iowastatyny, osadzony na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, według wynalazku charakteryzuje się tym, że enzym jest kowalencyjnie związany ze stałym nośnikiem aktywowanym co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem sprzęgającym, przy czym kombinacja stałego nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego jest tak dobrana, że esteraza Iowastatyny osadzona na nośniku wykazuje co najmniej 5-krotnie wyższą czynność hydrolityczną względem Iowastatyny i jej soli, w obecności symwastatyny i/lub jej soli, niż względem symwastatyny i jej soli, gdzie kombinacje nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego są wybrane z grupy obejmującej: (a) nośnik polisacharydowy, taki jak poligalaktozyd, i jako dwufunkcjonalny reagent aktywujący - związek o wzorze , w którym Y oznacza -SO₂- lub -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, gdzie n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18 a R oznacza atom wodoru lub C1-6 alkil, lub Y oznacza -SO2-Ar-SO2-, gdzie Ar oznacza dwuwartościową grupę arylową powstałą przez usunięcie dwóch atomów wodoru bezpośrednio związanych z atomami węgla pierścienia aromatycznego, która to dwuwartościową grupa arylowa ewentualnie zawiera podstawniki C1-6 alkilowe, lub (b) modyfikowany nośnik polisacharydowy lub krzemionkowy, i jako co najmniej dwufunkcjonalny reagent aktywujący - halogenek cyjanurowy i/lub O-sulfonian kwasu cyjanurowego. Korzystnie, nośnikiem jest poligalaktozyd, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest związek o wzorze , w którym Y oznacza -SO2-. Ewentualnie, modyfikowanym nośnikiem polisacharydowym jest dietyloaminoetyloceluloza, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest chlorek cyjanurowy, albo modyfikowanym nośnikiem krzemionkowym jest aminopropylosilanizowany żel krzemionkowy, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest chlorek cyjanurowy. W szczególności, enzymem jest enzym wytwarzany przez Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, ATCC 74178.

Sposób osadzania enzymu, esterazy Iowastatyny, na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosując pobudzanie mechaniczne, w rozpuszczalniku zestawia się halogenek cyjanurowy z modyfikowanym nośnikiem polisacharydowym, takim jak dimetyloaminoetyloceluloza, lub modyfikowanym nośnikiem krzemionkowym, takim jak aminopropylosilanizowany żel krzemionkowy, oddziela się aktywowany nośnik przez sączenie, suszy się aktywowany nośnik i zawiesza w mieszaninie wodnej zawierającej enzym, esterazę Iowastatyny, do osadzenia enzymu, oddziela się zawieszony materiał przez sączenie, przemywa buforem i suszy się. Korzystnie, jako halogenek cyjanurowy stosuje chlorek cyjanurowy. W szczególności, stosuje się nośnik autoklawowany, jako pobudzanie mechaniczne stosuje się wytrząsanie, a przed przemywaniem buforem, odsączony materiał przemywa się wodą. Halogenek cyjanurowy z nośnikiem zestawia się, zwłaszcza, w obecności zasady i/lub buforu. Korzystnie, jako roztwór wodny zawierający enzym stosuje się frakcję białkową materiału wyługowanego z Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, ATCC 74178.

PL 211 815 B1

Sposób osadzania enzymu, esterazy Iowastatyny, na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosując pobudzanie mechaniczne, w rozpuszczalniku zestawia się związek o wzorze , w którym Y oznacza -SO₂- lub -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, gdzie n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18 a R oznacza atom wodoru lub C1-6 alkil, lub Y oznacza -SO2-Ar-SO2-, gdzie Ar oznacza dwuwartościową grupę arylową powstałą przez usunięcie dwóch atomów wodoru bezpośrednio związanych z atomami węgla pierścienia aromatycznego, która to dwuwartościowa grupa arylowa ewentualnie zawiera podstawniki C1-6 alkilowe, z nośnikiem poligalaktozowym, oddziela się aktywowany nośnik przez sączenie, suszy się aktywowany nośnik i zawiesza w mieszaninie wodnej zawierającej enzym, esterazę Iowastatyny, oddziela się zawieszony materiał przez sączenie, przemywa buforem i suszy się. Korzystnie, związkiem o wzorze c y''c , jest związek, w którym Y oznacza SO2-. Jako pobudzanie mechaniczne stosuje się, zwłaszcza, wytrząsanie. W szczególności, przed przemywaniem buforem, odsączony materiał przemywa się wodą. Korzystnie, jako roztwór wodny zawierający enzym stosuje się frakcję białkową materiału wyługowanego z Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, ATCC 74178.

Enzym, esteraza Iowastatyny, osadzony na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, określony powyżej, według wynalazku stosuje się do wytwarzania i/lub wydzielania i/lub oczyszczania symwastatyny. Korzystnie, enzym stosuje się do oczyszczania i/lub wydzielania symwastatyny z mieszaniny z Iowastatyną, a zwłaszcza do selektywnej hydrolizy soli amonowej Iowastatyny do soli triolu, w obecności soli amonowej symwastatyny.

Korzystnie, enzym stosuje się do selektywnej hydrolizy soli amonowej Iowastatyny do soli triolu, w obecności soli amonowej symwastatyny, w procesie periodycznym. Ewentualnie, enzym stosuje się do selektywnej hydrolizy soli amonowej Iowastatyny do soli triolu, w obecności soli amonowej symwastatyny, w procesie ciągłym.

Przepływowy reaktor biokatalityczny, ze złożem, według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje korpus reaktora z przestrzenią wewnętrzną połączoną z wlotem dla płynu i połączoną z wylotem dla płynu, w której to przestrzeni wewnętrznej umieszczone jest złoże zawierające osadzony na nośniku enzym, esterazę Iowastatyny, który to enzym jest kowalencyjnie związany ze stałym nośnikiem aktywowanym co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem sprzęgającym, przy czym kombinacja stałego nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego jest tak dobrana, że esteraza Iowastatyny osadzona na nośniku wykazuje co najmniej 5-krotnie wyższą czynność hydrolityczną względem Iowastatyny i jej soli, w obecności symwastatyny i/lub jej soli, niż względem symwastatyny i jej soli, gdzie kombinacja nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego jest wybrana z grupy obejmującej: (a) nośnik polisacharydowy, taki jak poligalaktozyd, i jako dwufunkcjonalny reagent aktywujący - związek o wzorze c y''c , w którym Y oznacza -SO₂- lub -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, gdzie n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18 a R oznacza atom wodoru lub C1-6 alkil, lub Y oznacza -SO2-Ar-SO2-, gdzie Ar oznacza dwuwartościową grupę arylową powstałą przez usunięcie dwóch atomów wodoru bezpośrednio związanych z atomami węgla pierścienia aromatycznego, która to dwuwartościowa grupa arylowa ewentualnie zawiera podstawniki C1-6 alkilowe, lub (b) modyfikowany nośnik polisacharydowy lub krzemionkowy, i jako co najmniej dwufunkcjonalny reagent aktywujący halogenek cyjanurowy i/lub O-sulfonian kwasu cyjanurowego. Korzystnie, nośnikiem jest poligalaktozyd, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest związek o wzorze c' y''c , w którym Y oznacza -SO2-. Ewentualnie, nośnikiem jest dietyloaminoetyloceluloza, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest chlorek cyjanurowy. W szczególności, enzymem jest enzym wytwarzany przez Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, ATCC 74178.

Sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny obejmujący traktowanie enzymem, esteraza Iowastatyny, roztworu soli symwastatyny z resztkową zawartością soli Iowastatyny do zhydrolizowania Iowastatyny z wytworzeniem triolu, oddzielenie triolu i wyodrębnienie symwastatyny zasadniczo wolnej od Iowastatyny, w którym roztwór soli symwastatyny z resztkową zawartością soli Iowastatyny doprowadza się do zetknięcia z enzymem, esteraza Iowastatyny, osadzonym na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, według wynalazku charakteryzuje się tym, że enzym jest kowalencyjnie związany ze stałym nośnikiem aktywowanym co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem sprzęgającym, przy czym kombinacja stałego nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego jest tak dobrana, że esteraza Iowastatyny osadzona na nośniku wykazuje co najmniej 5-krotnie wyższą czynność hydrolityczną względem Iowastatyny i jej soli, w obecności symwastatyny i/lub jej soli, niż względem symwastatyny i jej soli, gdzie kombinacje nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego są wybrane z grupy obejmującej: (a) nośnik polisacharydowy, taki jak poligalaktozyd,

PL 211 815 B1 i jako dwufunkcjonalny reagent aktywujący - związek o wzorze , w którym Y oznacza -SO₂lub -SO2-(CHR)n-SO2-, gdzie n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18 a R oznacza atom wodoru lub C1-6 alkil, lub Y oznacza -SO2-Ar-SO2-, gdzie Ar oznacza dwuwartościową grupę arylową powstałą przez usunięcie dwóch atomów wodoru bezpośrednio związanych z atomami węgla pierścienia aromatycznego, która to dwuwartościowa grupa arylowa ewentualnie zawiera podstawniki C1-6 alkilowe, lub (b) modyfikowany nośnik polisacharydowy lub krzemionkowy, i jako co najmniej dwufunkcjonalny reagent aktywujący - halogenek cyjanurowy i/lub O-sulfonian kwasu cyjanurowego. Korzystnie, nośnikiem jest poligalaktozyd, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest związek o wzorze , w którym Y oznacza -SO₂-. Ewentualnie, nośnikiem jest dietyloaminoetyloceluloza, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest chlorek cyjanurowy, albo nośnikiem jest aminopropylosilanizowany żel krzemionkowy a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest chlorek cyjanurowy. W szczególności, zetknięcie z enzymem osadzonym na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, roztworu soli symwastatyny z resztkową zawartością soli Iowastatyny, prowadzi się w temperaturze od 26°C do 50°C. Zetknięcie z enzymem osadzonym na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, roztworu soli symwastatyny z resztkową zawartością soli Iowastatyny, zwłaszcza, prowadzi się metodą ciągłą w reaktorze przepływowym. Korzystnie, enzymem jest enzym wytwarzany przez Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, ATCC 74178.

Immobilizacja enzymu umożliwia wielokrotne zastosowanie tego samego enzymu i przy odpowiednio dobranych parametrach procesu nie prowadzi do utraty jego aktywności. Niezwykle istotnym jest fakt zwiększenia odporności na degradację proteolityczną poszczególnych enzymów, co pozwala na prowadzenie procesów bez zastosowania warunków antyseptycznych, co znacznie obniża koszty.

W jednej z realizacji rozwiązania według wynalazku, enzym osadzony na nośniku jest umieszczony w reaktorze przepływowym. Reaktor jest zasilany mieszaniną statyn, która składa się z 15% Iowastatyny i 85% symwastatyny. Jest to typowa mieszanina uzyskiwana w procesie syntezy chemicznej. Stężenie soli symwastatyny nie ulega zmianie w stopniu przekraczającym 1%, natomiast sól amonowa Iowastatyny ulega hydrolizie w około 87%. Stopień konwersji nie ulega zmianie przez długi okres czasu prowadzenia hydrolizy, a trwałość technologiczna jest zachowywana przez co najmniej 6 miesięcy. A zatem immobilizacja enzymu, esterazy Iowastatyny, daje stabilny biokatalizator o trwałości wystarczającej do technologicznego zastosowania w syntezie symwastatyny.

Rozwiązanie według wynalazku jest zilustrowane rysunkiem, na którym fig. 1 przedstawia widok przepływowego reaktora biokatalitycznego według wynalazku, w przekroju, a fig. 2 przedstawia zmiany stopnia konwersji Iowastatyny w funkcji temperatury.

Termin „triol w obrębie opisu niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych określa związek o wzorze III,

HO

COOM

OH

III w którym M oznacza atom wodoru, a także w którym M oznacza kation metalu, amonowy lub amoniowy, tj. związek w postaci wolnego kwasu lub postaci soli, o ile w konkretnym przypadku nie określono inaczej. Z uwagi, że związek III w postaci wolnego kwasu (M=H) łatwo ulega laktonizacji, termin triol może też obejmować postać laktono-diolu o wzorze IV, o ile w konkretnym przypadku nie określono inaczej.

HO.

.o

IV

PL 211 815 B1

Nazwy „Iowastatyna i „symwastatyna oznaczają, odpowiednio związki o wzorach I i II

W obrębie opisu niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych, nazwy „Iowastatyna i „symwastatyna obejmują takż e postacie kwasów karboksylowych tych związków, o wzorach IV i V (M=H)

a takż e sole zwią zków o wzorach IV i V, o ile w konkretnym przypadku nie okreś lono inaczej. „Sól Iowastatyny oznacza związek o wzorze IV, w którym M oznacza kation metalu, amonowy lub amoniowy, a „sól symwastatyny oznacza związek o wzorze V, w którym M oznacza kation metalu, amonowy lub amoniowy.

„Esteraza Iowastatyny, w obrębie opisu niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych określa materiał komórkowy lub bezkomórkowy pochodzenia naturalnego lub rekombinantowego o czynności enzymatycznej, która to czynność przejawia się w katalizowaniu hydrolizy Iowastatyny i jej soli, z wytworzeniem triolu zdefiniowanego powyż ej lub jego soli, przy czym symwastatyna i jej sole w analogicznych warunkach hydrolizy enzymatycznej nie ulegają hydrolizie tego rodzaju albo ulegają hydrolizie z szybkością co najmniej o rząd wielkości mniejszą.

Nośnik nierozpuszczalny w wodzie, w obrębie opisu niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych, określa nośnik ziarnisty lub włóknisty, który zasadniczo nie ulega solubilizacji w wodzie, tj. nie tworzy płynnego roztworu lub pseudoroztworu wodnego zawierającego powyżej 0,1 g nośnika na 100 g wody.

Aktywność enzymu, w obrębie opisu niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych, oznacza ilość mikromoli substratu (Iowastatyny lub symwastatyny), która jest hydrolizowana w ciągu minuty przez jeden miligram enzymu.

Frakcja białkowa, w obrębie opisu niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych, oznacza porcję mieszaniny uzyskanej podczas oczyszczania preparatu biologicznego, w której to porcji oznaczone stężenie całkowite białek jest większe od zera.

Czynność hydrolityczną enzymu, esterazy Iowastatyny, względem Iowastatyny i jej soli oznacza zdolność do hydrolizy Iowastatyny i jej soli z utworzeniem triolu, zdefiniowanego powyżej.

Czynność hydrolityczną enzymu, esterazy Iowastatyny, względem symwastatyny i jej soli oznacza zdolność do hydrolizy symwastatyny i jej soli z utworzeniem triolu, zdefiniowanego powyżej.

Czynność hydrolityczną enzymu, esterazy Iowastatyny, względem Iowastatyny i jej soli jest co najmniej o rząd wielkości wyższa od czynności hydrolitycznej enzymu, esterazy Iowastatyny, względem symwastatyny i jej soli. Czynność ta może ulec zmianie po osadzeniu enzymu, esterazy Iowastatyny, na nośniku, w szczególności na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie. Nie ograniczając zakresu rozwiązania według wynalazku przez rozważania teoretyczne, należy przypuszczać, że wskutek chemicznego związania enzymu określonego powyżej na powierzchni fazy stałej, mogą następować modyfikacje przestrzennej konfiguracji enzymu, a zatem i wzajemnego rozmieszczenia centrów enzymatycznie czynnych. Stąd też czynność hydrolityczną enzymu, esterazy Iowastatyny, jak i aktywność enzymu po osadzeniu na nośniku może różnić się od czynności i aktywności enzymu w mieszaninie

PL 211 815 B1 wodnej. Różnica ta przejawia się w utracie selektywności w czynności hydrolitycznej po osadzeniu na nośniku i/lub w obniżeniu aktywności.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że szczególna kombinacja nośnika nierozpuszczalnego w wodzie oraz co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego pozwala na uzyskanie enzymu osadzonego na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, który wykazuje co najmniej 5 krotnie wyższą czynność hydrolityczną względem Iowastatyny i jej soli, w obecności symwastatyny i/lub jej soli, niż względem symwastatyny i jej soli, przy czym enzym jest wystarczająco aktywny, aby był stosowany do oczyszczania i/lub wydzielania symwastatyny z mieszaniny z Iowastatyną.

Sposobem według wynalazku, enzym - esteraza Iowastatyny - jest osadzany na złożu poligalaktozowym, takim jak agaroza (korzystnie Sepharose B4), z użyciem co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta o wzorze , w którym Y oznacza -SO₂- lub -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, gdzie n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18 a R oznacza atom wodoru lub C1-6 alkil, lub Y oznacza -SO2-Ar-SO2-, gdzie Ar oznacza dwuwartościową grupę arylową powstałą przez usunięcie dwóch atomów wodoru bezpośrednio związanych z atomami węgla pierścienia aromatycznego, która to dwuwartościowa grupa arylowa ewentualnie zawiera podstawniki C_1-6 alkilowe. Korzystnie reagentem aktywującym nośnik jest związek o wzorze , w którym Y oznacza -SO₂-, tj. diwinylosulfon.

Metoda aktywacji nośnika poligalaktozowego, według wynalazku, polega na zestawieniu go ze związkiem o wzorze , korzystnie diwinylosulfonem, co prowadzi do utworzenia aktywowanego nośnika. Następnie mieszanina zawierająca enzym, esterazę Iowastatyny, przygotowana zgodnie ze znaną procedurą, z użyciem buforu jest zestawiana z aktywowanym nośnikiem przy pobudzaniu mechanicznym, przez okres wystarczający do osadzenia enzymu na nośniku. Po osadzeniu, uzyskany biokatalizator jest wydzielany przez sączenie, korzystnie przemywany wodą i/lub buforem. Enzym osadzony na nośniku według wynalazku jest następnie stosowany w procesach oczyszczania i/lub wydzielania symwastatyny.

Enzym osadzony na nośniku z użyciem diwinylosulfonu jako reagenta sprzęgającego, użyto w reakcji hydrolizy mieszaniny statyn o zawartości 15% Iowastatyny i 85% symwastatyny. Jest to typowa mieszanina uzyskiwana w procesie wytwarzania symwastatyny z Iowastatyny drogą syntezy chemicznej. Do przeprowadzenia reakcji zaprojektowano i wykonano reaktor przepływowy przedstawiony w przekroju na fig. 1. Reaktor przepływowy według wynalazku obejmuje korpus 1 reaktora z przestrzenią 2 wewnętrzną połączoną z wlotem 3 dla płynu i połączoną z wylotem 4 dla płynu. W przestrzeni 2 wewnętrznej umieszczono złoże 5 zawierające osadzony na nośniku enzym. Proces hydrolizy prowadzono w sposób ciągły podając przez wlot 3 dla płynu roztwór mieszaniny soli amonowych Iowastatyny i symwastatyny i odbierając odciek za wylotem 4 dla płynu. Kolejne porcje odcieku poddawano analizie z użyciem HPLC, która wykazała że stężenie soli symwastatyny nie ulegało zmianie w trakcie procesu w stopniu przekraczającym 1%, w relacji do stężenia początkowego. Stopień hydrolizy soli amonowej Iowastatyny wynosił co najmniej 87%. Stopień konwersji nie ulegał zmianie w trakcie procesu prowadzonego nieprzerwanie przez 120 godzin, co dowodzi, że reaktor przepływowy według wynalazku, ze złożem 5 zawierającym osadzony na nośniku enzym, esterazę Iowastatyny, może być efektywnie wykorzystany w procesie wytwarzania, wydzielania i/lub oczyszczania symwastatyny z mieszaniny statyn zawierającej symwastatynę i Iowastatynę.

Trwałość technologiczną reaktora według wynalazku oszacowano powtarzając eksperyment z reakcją hydrolizy mieszaniny statyn o zawartości 15% Iowastatyny i 85% symwastatyny, po 6 miesięcznym przechowywaniu reaktora w temperaturze +4°C. Proces hydrolizy prowadzono w sposób ciągły podając przez wlot 3 dla płynu roztwór mieszaniny soli amonowych Iowastatyny i symwastatyny, i odbierając odciek za wylotem 4 dla płynu. Kolejne porcje odcieku poddawano analizie z użyciem HPLC, która wykazała że stężenie soli symwastatyny nie ulegało zmianie w trakcie procesu w stopniu przekraczającym 1% w relacji do stężenia początkowego. Stopień hydrolizy soli amonowej Iowastatyny wynosił co najmniej 96%. Dane przedstawione w tabeli pokazują, że czas przechowywania reaktora przepływowego nie wpływa zasadniczo na jego sprawność. W ciągu 25 godzin konwersja Iowastatyny praktycznie nie zmieniła się, co dowodzi, że enzym osadzony na nośniku według wynalazku zachowuje swoją aktywność, a także selektywność hydrolizy soli Iowastatyny w obecności soli symwastatyny. A zatem osadzenie enzymu na nośniku (immobilizacja) daje stabilny biokatalizator o trwałości wystarczającej do stosowania w procesie wytwarzania, wydzielania i/lub oczyszczania symwastatyny.

W kolejnej realizacji sposobu osadzania enzymu na nośniku, według wynalazku, aktywowaniu poddano nośnik nierozpuszczalny w wodzie, taki jak żel krzemionkowy, modyfikowany amino-C1-6 alkilotri(C1-6alkoksy)silanem, korzystnie żel krzemionkowy modyfikowany grupami aminopropylosililowymi.

PL 211 815 B1

Do aktywacji użyto co najmniej dwufunkcjonalny reagent aktywujący, którym korzystnie jest pochodna kwasu cyjanurowego (pochodna 1,3,5-triazyno-2,4,6-triolu), taka jak halogenek cyjanurowy, lub w której co najmniej dwie grupy hydroksylowe zastą piono podstawnikiem halogenowym lub grupą O-sulfonianową, taka jak halogenek cyjanurowy i/lub O-sulfonian kwasu cyjanurowego.

Żel krzemionkowy modyfikowany grupami aminopropylosililowymi poddano aktywacji roztworem pochodnej kwasu cyjanurowego, a następnie zawieszono w buforze i dodano mieszaninę zawierającą enzym esterazę Iowastatyny, przy pobudzaniu mechanicznym przez okres wystarczający do osadzenia enzymu na nośniku. Osadzanie przeprowadzano stosując nieoczyszczony enzym, jak i enzym oczyszczony metodą chromatograficzną. Stosując, korzystnie, jako nośnik aminopropylosilanizowany żel krzemionkowy i jako reagent sprzęgający chlorek cyjanurowy, stwierdzono, iż użycie enzymu oczyszczonego prowadzi do większej wydajności osadzania enzymu. Nadto, enzym osadzony na nośniku, według wynalazku, uzyskany z użyciem nieoczyszczonego enzymu, wykazuje niższą aktywność niż enzym osadzony na nośniku, według wynalazku, z użyciem oczyszczonego enzymu.

W innej realizacji sposobu osadzania enzymu, według wynalazku, aktywowaniu poddano nośnik polisacharydowy nierozpuszczalny w wodzie, taki jak celuloza, modyfikowany grupami di-(C1-6alkilo)amino-C1-6alkilowymi. Przykładem takiego nośnika jest dietyloaminoetyloceluloza. Do aktywacji użyto co najmniej dwufunkcjonalny reagent aktywujący, którym korzystnie jest pochodna kwasu cyjanurowego (pochodna 1,3,5-triazyno-2,4,6-triolu), w której co najmniej dwie grupy hydroksylowe zastąpiono podstawnikiem halogenowym lub grupą O-sulfonianową, taka jak halogenek cyjanurowy i/lub O-sulfonian kwasu cyjanurowego.

Celulozę modyfikowaną grupami dietyloaminoetylowymi aktywowano roztworem pochodnej kwasu cyjanurowego, ewentualnie w obecności zasady, uzyskując aktywowany nośnik. Nośnik zawieszono w buforze i dodano mieszaninę zawierającą enzym esterazę Iowastatyny, przy pobudzaniu mechanicznym przez okres wystarczający do osadzenia enzymu na nośniku. Enzym osadzony na nośniku według wynalazku jest następnie stosowany w procesach wytwarzania, wydzielania i/lub oczyszczania symwastatyny.

Enzym osadzony na nośniku celulozowym modyfikowanym grupami dietyloaminoetylowymi, z uż yciem chlorku cyjanurowego jako reagenta sprzę gają cego, uż yto w reakcji hydrolizy mieszaniny statyn, mieszaniny soli amonowych Iowastatyny i symwastatyny, uzyskując bardzo wysoki stopień konwersji (>99%) soli Iowastatyny do triolu w trakcie kilku godzin. Enzym osadzony na nośniku dietyloaminoetylocelulozowym, o jeszcze wyższej aktywności, uzyskano używając do przygotowania aktywowanego nośnika dietyloaminoetylocelulozę, którą uprzednio poddano operacji wygrzewania w autoklawie.

Przygotowany enzym osadzony na nośniku, według wynalazku, wykorzystano, jako złoże do reaktora według wynalazku, przedstawionego na fig. 1. Reaktor umieszczono w termostatowanym płaszczu, którego temperaturę ustabilizowano na poziomie 28°C. Proces hydrolizy prowadzono w sposób ciągły podając przez wlot 3 dla płynu roztwór mieszaniny soli amonowych Iowastatyny i symwastatyny i odbierając odciek za wylotem 4 dla płynu. Kolejne porcje odcieku poddawano analizie z użyciem HPLC, w odstępach 4-godzinnych. W toku pracy reaktora modyfikowano natężenie przepływu rejestrując zmiany stopnia konwersji Iowastatyny. Stwierdzono, że dla natężeń przepływu przekraczających graniczne natężenie przepływu (maksymalne natężenie przepływu, przy którym stopień konwersji Iowastatyny wynosi 100%) następuje zmniejszenie stopnia konwersji Iowastatyny. Dla natężenia przepływu wyż szego od granicznego natężenia przepływu (to znaczy natężenia przepływu, przy którym stopień konwersji jest znacznie niższy niż przy natężeniu granicznym), wyznaczono zmianę konwersji Iowastatyny w funkcji temperatury reaktora. Przeprowadzono pomiary dla szeregu punktów temperaturowych. Wyniki przedstawiono na wykresie (fig. 2).

Stwierdzono, że w temperaturze 37°C enzym esteraza Iowastatyny, osadzony na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, według wynalazku, wykazuje najwyższą aktywność (fig. 2).

Rozwiązanie według wynalazku jest przedstawione bardziej szczegółowo w poniższych przykładach. W obrębie poniższych przykładów określenie enzym EL oznacza enzym, esterazę Iowastatyny.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Wyizolowanie i oczyszczanie enzymu

Enzym EL jest wytwarzany przez grzyb Clonostachys compactiuscula zdeponowany za numerem ATCC 38009. Grzyb został przygotowany zgodnie z procedurą opisaną w literaturze (opis patentowy USA nr 5,223,415).

PL 211 815 B1

1a. Ekstrakcja enzymu EL z grzybni

Grzybnię Clonostachys compactiuscula (59 g) ze szklanymi kulkami (0,4 g) uciera się przez 8 godzin w ciekłym azocie, następnie ługuje się buforem fosforanowym (60 ml, pH=6,5) i odwirowuje osad stały (12000 obr./min.; 10 min; 4°C). Supernatant oddziela się i powtarza procedurę ekstrakcji buforem (40 ml). Supernatanty łączy się otrzymując, po przesączeniu przez sączek jakościowy, 110 ml przesączu, określanego dalej jako supernatant X1 (C_białek=4180 μg/ml).

lb. Oczyszczanie esterazy Iowastatyny poprzez wysalanie aktywnej frakcji białka

Do supernatantu X1 (20 ml) dodaje się siarczan amonu do stężenia 40% (4,62 g,1 godz., 0°C). Następnie roztwór pozostawia się na 1 godzinę (0°C) i poddaje wirowaniu (12000 obr./min.; 20 min; 4°C). Supernatant ) oddziela się i dodaje siarczan amonu do stężenia 85% (6 g; 1 godz.; (0°C), i poddaje wirowaniu (12000 obr./min.; 20 min; 4°C). Otrzymany osad zbiera się i rozpuszcza w buforze fosforanowym (pH 7,8; 20 mM; 0,5 mol NaCI) otrzymując 0,72 ml roztworu EL, określanego dalej jako roztwór X2, (C_białek=2980 μg/ml) o aktywności specyficznej 6,62 μmol/min·mg.

lc. Oczyszczenie esterazy Iowastatyny metodą chromatograficzną

Kolumnę oddziaływań hydrofobowych z wypełnieniem Phenyl Sepharose 6-fast flow (26 ml) poddaje się stabilizowaniu z buforem fosforanowym (pH=6,5; 1 ml/min; 5 godzin). Następnie na kolumnę podaje się roztwór X2 (15 ml) i kolumnę eluuje się buforem fosforanowym (pH=6,5; 1,4 ml/min), wodą redestylowaną (1,4 ml/min), zbierając frakcje zawierające enzym EL. Po zakończeniu rozdziału kolumnę płucze się ponownie buforem fosforanowym (pH=6,5; 1,4 ml/min; 30 min). Aktywne frakcje zawierające enzym EL łączy się i dodaje bufor węglanowy (1 ml pH=9,4; 50 mmol) otrzymując 12,5 ml roztworu (C_białek=21 μg/ml) określanego dalej jako roztwór X3, o aktywności specyficznej 290 μmol/mg·min (oznaczenie metodą HPLC).

P r z y k ł a d 2. Immobilizacja enzymu EL na Sepharose B4 (żel agarozowy)

2a. Aktywacja nośnika

Sepharose B4 (5 ml), przemyto wodą (20 x 5 ml), buforem fosforanowym 1/15 M, pH=5,6 (20 x 5 ml), wodą (20 x 5 ml), buforem węglanowym 50 mmol pH=9,6 (20 x 5 ml). Próbkę 100 mg uzyskanego złoża wysuszono i poddano analizie.

IR (KBr): 3436 (35%), 2901 (60%), 1650 (55%), 1474 (55%), 1415 (55%), 1376 (50%), 1307 (55%), 1250 (55%), 1190 (35%), 1157 (35%), 1071 (30%), 1042 (%), 988 (55%), 966 (50%), 931 (40%), 891 (45%), 870 (60%), 788 (60%), 772 (55%), 741 (50%), 716 (50%), 693 (50%), 538 (50%), 483 (50%) cm^-1

Analiza elementarna; znaleziono: C 41,61%; H 6,47%; N 0,0%.

Otrzymany nośnik zawiesza się w buforze węglanowym (10 ml, 50 mmol pH=9,6), dodaje diwinylosulfon (1 ml, 10 mmol) i wytrząsa przez 70 min. Nośnik przemywa się wodą (20 x 5 ml), buforem fosforanowym (20 x 5 ml, 1/15 M, pH=5,6), wodą (20 x 5 ml) i buforem węglanowym (20 x 5 ml, 50 mmol, pH=9,6). Próbkę 100 mg uzyskanego nośnika suszy się i poddaje analizie.

PL 211 815 B1

IR (KBr): 3436 (40%), 2902 (65%), 1651 (55%), 1475 (60%), 1413 (55%), 1377 (50%), 1302 (60%), 1251 (60%), 1183 (40%), 1157 (40%), 1076 (30%), 1044 (30%), 988 (60%), 966 (60%), 931 (50%), 891 (60%), 772 (70%), 741 (70%), 715 (70%) cm^-1

Analiza elementarna: znaleziono: C 43,50%; H 6,76%; N 0%; S 0,88%.

2b. Osadzanie na nośniku (immobilizacja) enzymu EL

Do aktywowanego nośnika, po przemyciu wodą (20 x 5 ml), dodaje się bufor węglanowy (5 ml, 50 mM pH=9,6), oraz supernatant X1 wyługowany z mikroorganizmu Clonostachys compactiuscula, (C_białek=21178 μg/ml, aktywność=13,2 μmol/mg·ml) w buforze węglanowym (0,5 ml, 50 mmol, pH=9,6) i wytrząsa się przez 18 godzin. Nośnik oddziela się przez sączenie, zawiesza w buforze glicynowym (10 ml, 50 mmol, pH=9,6), wytrząsa 2 godziny, przemywa wodą (20 x 5 ml), buforem fosforanowym (20 x 5 ml, 1/15 mola, pH=5,6), wodą (20 x 5 ml), oraz buforem glicynowym (20 x 5 ml, 50 mmol, pH=9,6). Osadzeniu (immobilizacji) uległo 910 μg białka.

P r z y k ł a d 3. Hydroliza mieszaniny soli amonowych statyn z użyciem enzymu EL osadzonym na nośniku, w procesie periodycznym

Enzym EL immobilizowany na nośniku Sepharose B4 (otrzymany w przykładzie 2b; 9,2 mg suchej masy) zawiesza się w mieszaninie soli amonowych statyn (1 ml, Cstatyn=0,8 mg/ml) rozpuszczonych w buforze glicynowym (10 ml, 50 mmol, pH=9,6). Zawiesinę wstrząsa się przez 90 minut w temperaturze 30°C. Enzym EL na nośniku oddziela się przez sączenie i wyznacza czynność hydrolityczną względem soli amonowej Iowastatyny (czynność hydrolityczną L) oraz względem soli amonowej symwastatyny (czynność hydrolityczną S), a także odpowiadające stopnie konwersji, z użyciem analizy metodą HPLC. Enzym EL na nośniku przemywa się wodą (5 x 5 ml) i powtarza proces hydrolizy periodycznej. Po 4 zawróceniach odzyskuje się 5,7 mg (po wysuszeniu do stałej masy) immobilizowanego enzymu EL. Wyniki analiz dla tego biokatalizatora przedstawiono w tablicy 1.

T a b l i c a 1

Krotność użycia	Konwersja L (%)	Czynność hydrolityczną L (pM/mg-ml)	Konwersja S (%)	Czynność hydrolityczna S (μΜ/g-ml)	Selektywność L/S
Enzym EL natywny		10,71		0,06	>100
1	33,4	4,66	8,3	0,81	5,75
2	31,1	4,36	9,9	0,97	4,49
3	28,5	3,97	9,3	0,91	4,36
4	19,4	2,72	9,0	0,88	3,09

P r z y k ł a d 4

Hydroliza mieszaniny soli amonowych statyn z użyciem reaktora przepływowego

Stosując 10 ml Sepharose B4 oraz oczyszczony enzym EL (roztwór X3) z przykładu 1c (C_białek=46,1 μg/ml, aktywność=56,1 nmol/mg-min), przeprowadza się osadzanie zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 3. Osadzeniu (immobilizacji) uległo 123,1 μg całkowitej ilości białka.

Uzyskany biokatalizator wykorzystuje się do przygotowania reaktora przepływowego.

Korpus reaktora stanowi rura ze stali kwasoodpornej (taka jak stosowana do wykonywania kolumn do chromatografii ciśnieniowej), w której przed wylotem dla płynu, poprzecznie do osi kolumny, umieszczono perforowaną płytkę stanowiącą podparcie dla złoża. W przykładzie wykorzystuje się kolumnę chromatograficzną o średnicy 3,7 mm i długości 149 mm (objętość przestrzeni wewnętrznej 1,6 ml), którą u dołu zabezpieczono nakrętką z frytą, a u góry zainstalowano nasadkę przedłużającą. Do tak przygotowanego zestawu wprowadza się enzym osadzony na nośniku, przygotowany powyżej, zawieszony w buforze glicynowym (pH=9,4, 20 mM, 5 ml). Złoże formuje się przepuszczając eluent (przepływ 0,4 ml/min, bufor glicynowy pH=9,4, 20 mM, 5 ml). Formowanie złoża uznaje się za zakończone po uzyskaniu stabilizacji ciśnienia oraz stabilizacji poziomu absorbancji (wyznaczanej za pomocą detektora UV przy λ=254 nm). Następnie zdejmuje się nasadkę przedłużającą i odsłonięte złoże zabezpiecza się nakrętką z frytą. Złoże w reaktorze poddaje się kondycjonowaniu (przepływ 0,4 ml/min) przepuszczając bufor glicynowy (pH=9,4, 20 mM, 5 ml).

PL 211 815 B1

Następnie do reaktora wprowadza się mieszaninę soli amonowych statyn, która zawiera 15% Iowastatyny i 85% symwastatyny, przy przepływie 0,4 ml/min. Pobiera się próbki odcieku co 6 godzin i analizuje skł ad odcieku za pomocą HPLC. Wyniki analiz po przeliczeniu zawartoś ci na stopień hydrolizy zestawiono w tablicy 2. Stężenie soli symwastatyny zmienia się w czasie całego procesu nie więcej niż 1%. Sól amonowa Iowastatyny ulega hydrolizie w około 87%. Konwersja ta nie ulega zmianie w cią gu 120 godzin.

T a b l i c a 2.

Hydroliza mieszaniny statyn w reaktorze przepływowym ze złożem zawierającym enzym EL osadzony na nośniku.

Okres czasu od uruchomienia reaktora do pobrania próbki odcieku (godz.)	Konwersja L (%)	Konwersja S (%)	Selektywność (konwersja L/konwersja S)
0	87,9	<0,1	>100
6	86,6	<0,1	>100
12	86,1	<0,1	>100
18	87,4	<0,1	>100
24	87,0	<0,1	>100
30	86,8	<0,1	>100
36	86,6	<0,1	>100
42	86,9	<0,1	>100
48	86,9	<0,1	>100
54	87,7	<0,1	>100
60	87,1	<0,1	>100
66	86,6	<0,1	>100
72	88,8	<0,1	>100
78	88,4	<0,1	>100
84	87,9	<0,1	>100
90	87,0	<0,1	>100
96	90,6	<0,1	>100
102	87,2	<0,1	>100
108	87,6	<0,1	>100
114	86,6	<0,1	>100
120	87,6	<0,1	>100
126	87,9	<0,1	>100

P r z y k ł a d 5. Oszacowanie trwałości technologicznej reaktora ze złożem zawierającym enzym EL osadzony na nośniku

Wlot i wylot reaktora przepływowego stosowanego w przykładzie 4 zabezpiecza się szczelnie montowanymi zaślepkami, a następnie reaktor przechowuje się przez 6 miesięcy w temperaturze 4°C. Po ustabilizowaniu, reaktor ponownie stosuje się do hydrolizy mieszaniny soli amonowych statyn, postępując według procedury z przykładu 4. Wyniki nad konwersją soli Iowastatyny i symwastatyny zestawiono w tablicy 3.

PL 211 815 B1

T a b l i c a 3.

Hydroliza mieszaniny statyn w reaktorze przepływowym ze złożem zawierającym enzym EL osadzony na nośniku (reaktor po 6 miesięcznym przechowywaniu w 4°C).

Okres czasu od uruchomienia reaktora do pobrania próbki odcieku (godz.)	Konwersja L (%)	Konwersja S (%)	Selektywność (konwersja L/ konwersja S)
0	97,1	<0,1	>100
2	97,7	<0,1	>100
3	98,0	<0,1	>100
5	97,6	<0,1	>100
7	97,3	<0,1	>100
9	97,5	<0,1	>100
11	96,6	<0,1	>100
13	96,8	<0,1	>100
15	96,4	<0,1	>100
17	96,2	<0,1	>100
19	96,1	<0,1	>100
21	96,0	<0,1	>100
23	96,7	<0,1	>100
25	96,6	<0,1	>100

P r z y k ł a d 6. Osadzanie na noś niku enzymu EL z zastosowaniem chlorku cyjanurowego (nośnik - żel krzemionkowy)

Żel krzemionkowy (50 g; 200-300 mesh) umieszcza się na lejku ze spiekiem szklanym i przepłukuje kwasem azotowym (5%; 15 ml) oraz wodą (15 ml). Porcję żelu (30 g) zalewa się toluenem (210 ml) i suszy poprzez oddestylowywanie azeotropu woda - toluen (110°C; 4 godz.). Po ochłodzeniu do 80°C dodaje się (3-aminopropylo)trimetoksysilan (6 ml, 34,3 mmol) i ogrzewa przez 2 godziny w temperaturze 80°C. Otrzymany noś nik są czy się i przemywa toluenem (20 ml), heksanem (20 ml), tetrahydrofuranem (20 ml) i ponownie toluenem (20 ml). Materiał suszy się w temperaturze 80°C do stałej masy uzyskując 24 g nośnika. Analiza elementarna, znaleziono: C4,99%; H 1,12%; N 1,69%.

6b. Aktywowanie nośnika i osadzanie enzymu EL

Do roztworu chlorku cyjanurowego (62,8 mg, 0,34 mmol) w mieszaninie dioksanu (5 ml) i toluenu (1 ml), w temperaturze 12°C, dodaje się aminopropylosililowany żel krzemionkowy otrzymany w przykłaPL 211 815 B1 dzie 6a (250 mg, 200-300 mesh, o zawartości 1 mmol grup aminowych na 1 g nośnika) i wytrząsa na wytrząsarce przez 3 godziny. Nośnik sączy się, przemywa toluenem (15 ml) i acetonem (15 ml), i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Do tak przygotowanego nośnika dodaje się supernatant X1 przygotowany w przykładzie 1a (11,5 ml, Cbiatek=4180 pg/ml) i wytrząsa na wytrząsarce przez 2,5 godziny. Wytworzony biokatalizator (enzym EL na nośniku) sączy się i przemywa buforem węglanowym (50 mmol, pH=9,4;

x 5 ml) uzyskując enzym osadzony na nośniku i przesącz. Wydajność immobilizacji wynosi 16%.

Otrzymany biokatalizator zastosowano do hydrolizy mieszaniny soli amonowych statyn uzyskując w ciągu 90 minut 7,1% konwersję Iowastatyny. Uzyskano biokatalizator o selektywności >100. Reakcja hydrolizy przyprowadzona z użyciem enzymu, który nie uległ osadzeniu na nośniku (pozostały w przesączu) przebiega z wydajnością 11,5%.

P r z y k ł a d 7. Osadzanie na nośniku enzymu EL z zastosowaniem chlorku cyjanurowego (nośnik - modyfikowany żel krzemionkowy).

Do roztworu chlorku cyjanurowego (125,9 mg, 0,68 mmol) w mieszaninie dioksan (5 ml) i toluen (1 ml), o temperaturze 9°C, dodaje się aminopropylosililowany żel krzemionkowy otrzymany w przykładzie 6a (500 mg, 200-300 mesh, o zawartości 1 mmol grup aminowych na 1 g złoża) i wytrząsa na wytrząsarce przez 3 godziny. Następnie aktywowany nośnik sączy się, przemywa toluenem (25 ml) i acetonem (25 ml), i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Porcję aktywowanego nośnika (250 mg), zawiesza się w roztworze X2 otrzymanym w przykładzie 1c (11,5 ml Cbiałek=21 pg/ml) i wytrząsa na wytrząsarce przez 2,5 godziny. Uzyskany biokatalizator (enzym EL na nośniku) sączy się i przemywa buforem węglanowym (50 mmol, pH=9,4, 5 x 5 ml) uzyskując enzym osadzony na nośniku i przesącz.

Wydajność immobilizacji wynosi 52%. Otrzymany biokatalizator zastosowano do hydrolizy mieszaniny soli amonowych statyn uzyskując w ciągu 90 minut 34,1% konwersję Iowastatyny. Selektywność biokatalizatora wynosi >100. Ta sama reakcja przeprowadzona z użyciem przesączu nie przebiega, co świadczy o całkowitej immobilizacji EL na nośniku.

P r z y k ł a d 8. Osadzanie na nośniku enzymu EL z zastosowaniem chlorku cyjanurowego (nośnik - modyfikowany żel krzemionkowy).

Do roztworu chlorku cyjanurowego (9,3 mg, 0,05 mmol) w mieszaninie dioksan (5 ml) i toluen (1 ml), w temperaturze 9°C dodaje się aminopropylosililowany żel krzemionkowy otrzymany w przykładzie 6a (500 mg, 200-300 mesh, o zawartości 1 mmol grup aminowych na 1 g złoża) i wytrząsa na wytrząsarce przez 3 godziny. Aktywowany nośnik sączy się, przemywa toluenem (25 ml) i acetonem (25 ml), i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie nośnik (250 mg), zawiesza się w roztworze X3 enzymu EL otrzymanego w przykładzie 1c (11,5 ml, Cbiałek=21 pg/ml) i wytrząsa na wytrząsarce przez 2,5 godziny. Uzyskany biokatalizator sączy się i przemywa buforem węglanowym (50 mmol, pH=9,4, 5 x 5 ml) uzyskując enzym osadzony na nośniku oraz przesącz.

Wydajność immobilizacji wynosi 52%. Otrzymany biokatalizator zastosowano do hydrolizy mieszaniny soli amonowych statyn uzyskując w ciągu 90 minut 16,3% konwersję Iowastatyny. Selektywność biokatalizatora wynosi >100. Ta sama reakcja przeprowadzona z użyciem przesączu nie przebiega, co świadczy o całkowitej immobilizacji EL na nośniku.

Biokatalizator użyty do hydrolizy mieszaniny soli amonowych statyn, po hydrolizie przemywa się buforem węglanowym (50 mmol, pH=9,4, 5 x 5 ml) i przechowuje przez 7 dni w temperaturze 4°C. Następnie biokatalizator ponownie stosuje się do hydrolizy mieszaniny soli amonowych statyn uzyskując w ciągu 90 minut 26,1% konwersję Iowastatyny. Selektywność biokatalizatora wynosi >100.

P r z y k ł a d 9. Osadzanie na nośniku enzymu EL z zastosowaniem chlorku cyjanurowego (nośnik - dietyloaminoetyloceluloza).

PL 211 815 B1

Dietyloaminoetylocelulozę (0,5 g) przemywa się wodą (10 ml), zawiesza w roztworze wodorotlenku sodu (1 mol, 10 ml), wytrząsa (15 min, 250 obr./min.), sączy, przemywa wodą (10 ml) i zawiesza w dioksanie (10 ml). Do otrzymanej zawiesiny dodaje się roztwór chlorku cyjanurowego (1 g, 5,4 mmol) w toluenie (10 ml). Zawiesinę wytrząsa się (30 min, 250 obr./min.), sączy, osad przemywa dioksanem (2 x 10 ml), mieszaniną kwas octowy/woda/dioksan (2/2/4 ml), wodą (10 ml), acetonem (2 x 10 ml), suszy pod zmniejszonym ciśnieniem (0,2 tor). Do aktywowanego nośnika dodaje się roztwór X3 otrzymany w przykładzie 1c (13 ml, aktywność właściwa 313 pmol-min'¹-mg'¹). Zawiesinę wytrząsa się na wytrząsarce przez 18 godzin (250 obr./min.), a następnie biokatalizator sączy się, przemywa wodą (2 x 10 ml), buforem węglanowym (2 x 10 ml, 50 mmol, pH=9,4). Wydajność immobilizacji wynosi 37,2%. Aktywność uzyskanego enzymu osadzonego na nośniku sprawdzono poddając hydrolizie 8 ml mieszaniny soli amonowych statyn, w wyniku czego uzyskano wartość aktywności właściwej 311 pmol-min'¹-mg'¹. Selektywność biokatalizatora wynosi >100.

Do roztworu soli amonowych symwastatyny (294 mg, 0,67 mmol) i Iowastatyny (21,7 mg, 0,05 mmol) w buforze węglanowym (150 ml, 50 mmol, pH=9,4) w temperaturze 30°C, mieszanego z użyciem mieszadła magnetycznego (250 obr./min.), dodaje się otrzymany powyżej enzym EL osadzony na nośniku. Postęp reakcji i selektywność hydrolizy analizuje się metodą HPLC.

T a b l i c a 4.

Konwersja soli Iowastatyny w reakcji katalizowanej enzymem EL osadzonym na dietyloaminoetylocelulozie aktywowanej chlorkiem cyjanurowym.

Czas hydrolizy (min)	Konwersja (%)	Selektywność L/S
0	0
10	11,0	>100
15	14,9	>100
22	18,2	>100
37	30,5	>100
57	39,6	>100
69	44,5	>100
360	100	>100

P r z y k ł a d 10. Osadzanie na nośniku enzymu EL z zastosowaniem chlorku cyjanurowego (nośnik - dietyloaminoetyloceluloza)

Powtarza się procedurę opisaną w przykładzie 9 stosując dietyloaminoetylocelulozę bez wstępnego oczyszczania i poddaną uprzednio wygrzewaniu w autoklawie, oraz enzym EL o aktywności właściwej L 61,2 pmol-min'¹-mg'¹

Otrzymane enzymy EL osadzone na nośniku stosuje się do przeprowadzenia hydrolizy preparatywnej mieszaniny soli amonowych statyn, według procedury opisanej w przykładzie 9.

T a b l i c a 5.

Czas hydrolizy (godz.)	Konwersja Iowastatyny (%)	Selektywność L/S
	Celuloza autoklawowana	Celuloza nieautoklawowana
0	0	0
1,3	15,5	11,6	>100
19,3	85,7	62,8	>100

PL 211 815 B1

Stwierdzono, że wygrzewanie nośnika w autoklawie przed osadzeniem enzymu EL podwyższa aktywność biokatalizatora o 35%, w porównaniu z enzymem EL osadzonym na nieautoklawowanej celulozie. Selektywność biokatalizatora wynosi >100.

P r z y k ł a d 11. Hydroliza mieszaniny soli amonowych statyn z użyciem reaktora przepływowego

Korpus kolumny chromatograficznej (średnica 0,58 cm, długość 9,6 cm, objętość przestrzeni wewnętrznej 2,5 ml) zabezpiecza się na jednym końcu frytą. Na drugi koniec nakłada się nasadkę przedłużającą. Do otrzymanego zestawu wprowadza się enzym EL na nośniku uzyskany w przykładzie 9, w postaci zawiesiny w buforze węglanowym (10 ml, 50 mmol, pH=9,4, 0,2 mg/ml NaN3, 0,3 mg/ml EDTA). Po odcieknięciu buforu przez frytę, zdejmuje się nasadkę przedłużającą i odsłonięte złoże zabezpiecza frytą (ilość złoża odpowiada masie produktu uzyskanego z 0,8 g dietyloaminoetylocelulozy; zawiera 0,62 mg immobilizowanego białka). Złoże w reaktorze formuje się przepływem buforu węglanowego (0,4 ml/min, 50 mmol, pH=9,4, 0,2 mg/ml NaN3, 0,3 mg/ml EDTA) przez godzinę. Następnie przez reaktor (termostatowany w temperaturze 28°C) przetłacza się roztwór soli amonowych symwastatyny (0,74 mg/ml) i Iowastatyny (0,06 mg/ml). Co 4 godziny oznacza się zawartość soli amonowych statyn w wycieku metodą HPLC. Wykonano eksperymenty dla przepływu od 0,175 ml/min do 0,2 ml/min.

T a b l i c a 6.

Wpływ natężenia przepływu na konwersję soli Iowastatyny w reakcji katalizowanej enzymem EL osadzonym na dietyloaminoetylocelulozie aktywowanej chlorkiem cyjanurowym.

Przepływ (ml/min)	Konwersja Iowastatyny (%)	Selektywność L/S
0,175	100	>100
0,185	92	>100
0,2	86	>100

Wykorzystując regulację termostatowania kolumny, wyznaczono zmianę konwersji soli Iowastatyny dla różnych temperatur.

T a b l i c a 7.

Wpływ temperatury na konwersję soli Iowastatyny w reakcji katalizowanej enzymem EL immobilizowanym na dietyloaminoetylocelulozie aktywowanej chlorkiem cyjanurowym.

Temperatura (°C)	Konwersja Iowastatyny (%)	Selektywność L/S
28	52,1	>100
30	50,6	>100
32	50,8	>100
34	58,0	>100
36	61,1	>100
38	59,9	>100
40	41,3	>100
42	31,2	>100
44	20,6	>100

Wyniki przedstawione w tablicy 7 wskazują, że w temperaturze 37°C immobilizowany enzym EL wykazuje najwyższą aktywność.

Przykłady porównawcze

Przykład porównawczy 1. Osadzanie enzymu EL na modyfikowanym żelu krzemionkowym Do mieszaniny γ-aminopropylotrietoksysilanu i toluenu (2% obj., 100 ml) dodaje się 10 g żelu krzemionkowego i ogrzewa do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 10 godzin. Następnie żel sączy się, przemywa acetonem (2 x 5 ml), wodą (5 ml), ponownie acetonem (2 x 5 ml) i suszy suchym po16

PL 211 815 B1 wietrzem przez 10 godzin. Tak przygotowany żel (100 mg) zawiesza się w buforze węglanowym (2 ml, 50 mM, pH 9,4) i dodaje diwinylosulfon (0,25 ml, 2,50 mmol) w temperaturze 20°C. Po 30 minutach nośnik oddziela się i suszy pod próżnią przez 2 godziny. Następnie przemywa się destylowaną wodą (4 x 20 ml), zawiesza w buforze węglanowym (1 ml, 50 mM, pH 9,4) i zalewa roztworem enzymu EL (1 ml, 0,225 mg/ml). Mieszaninę pozostawia się na 20 godzin w temperaturze 20°C. Nośnik z osadzonym enzymem EL sączy się i przemywa destylowaną wodą (2 x 10 ml).

Przykład porównawczy 2. Osadzanie enzymu EL na bawełnie

Małe kawałki bawełny (50 mg) zawiesza się w buforze węglanowym (2 ml, 50 mM, pH 9,4) i następnie dodaje diwinylosulfon (0,25 ml, 2,5 mmol) w temperaturze 20°C. Po 30 minutach bawełnę oddziela się, suszy pod próżnią (2 godziny) i przemywa destylowaną wodą (4 x 20 ml). Nośnik ponownie zawiesza się w buforze węglanowym (1 ml, 50 mM, pH 9,4) i zalewa roztworem enzymu EL (1 ml, 0,225 mg/ml) pozostawiając na 10 godzin w temperaturze pokojowej. Nośnik z osadzonym enzymem EL sączy się i przemywa destylowaną wodą (2 x 10 ml).

Przykład porównawczy 3. Osadzanie enzymu EL metodą zol-żel

Roztwór enzymu EL (0,5 ml, 0,225 mg/ml) miesza się z buforem Tris (0,5 ml, 0,1 M, pH=7,5) i pozostawia na wytrząsarce (10 minut). Następnie dodaje się wodny roztwór alkoholu poliwinylowego (100 pi, 4% obj.), fluorku sodu (50 pi, 1 M) oraz alkohol izopropylowy (100 μ^. Po 5 minutach dodaje się izobutylotrimetoksysilan (2,5 mmol) oraz TMOS (0,5 mmol; 74 pl; 76 mg) i pozostawia na wytrząsarce. Mieszaninę pozostawia się do wyschnięcia na noc w otwartym naczyniu w temperaturze pokojowej, a następnie dodaje się alkohol izopropylowy (10 ml). Żel oddziela się i przemywa wodą (10 ml), alkoholem izopropylowym, (10 ml) i n-pentanem (10 ml). Otrzymany żel po skruszeniu pozostawia się do wyschnięcia na noc, w temperaturze pokojowej.

Przykład porównawczy 4. Osadzanie enzymu EL metodą zol-żel

Stosuje się metodę według przykładu porównawczego 3, z modyfikacją polegającą na dodaniu do roztworu enzymu Tween® 80 (0,1 ml).

Przykład porównawczy 5. Osadzanie enzymu EL metodą zol-żel

Stosuje się metodę według przykładu porównawczego 3, z modyfikacją polegającą na dodaniu do roztworu enzymu soli amonowej Iowastatyny (50 mg).

Przykład porównawczy 6. Osadzanie enzymu EL na Eupergit® C

Liofilizowany enzym EL (17 mg, zawartość białka 2,6%) rozpuszcza się w buforze węglanowym (1 ml, 50 mM, pH 9,4) i do roztworu dodaje Eupergit® C (50 mg) i pozostawia na 1 dzień w temperaturze pokojowej. Następnie enzym na nośniku odsączono i przemyto destylowaną wodą (2 x 10 ml) (Eupergit® C - kopolimer metakryloamidu i metakrylanu glicydylu usieciowany N,N'-metyleno-bisakryloamidem).

Przykład porównawczy 7. Osadzanie enzymu EL poprzez zamykanie w alginianie wapnia

Roztwór oczyszczonego enzymu EL (0,8 ml, 0,225 mg/ml) miesza się starannie z wodnym roztworem alginianu wapnia (8 ml, 2% wag./obj.). Następnie, tak przygotowany roztwór wkrapla się do roztworu wodnego chlorku wapnia (10 ml, 280 mM), miesza się 20 minut, sączy osad, przemywa wodą destylowaną (2 x 10 ml). Uzyskany immobilizat przechowuje się w wodzie destylowanej w 4°C.

Przykład porównawczy 8. Osadzanie enzymu EL poprzez zamykanie w alginianie wapnia

Roztwór oczyszczonego enzymu (0,8 ml, 0,225 mg/ml) miesza się starannie z wodnym roztworem alginianu wapnia (8 ml, 2% wag./obj.). Następnie, tak przygotowany roztwór wkrapla się do roztworu wodnego chlorku wapnia (10 ml, 280 mM), miesza 20 minut, sączy osad, przemywa wodą destylowaną (2 x 10 ml). Uzyskany materiał zawiesza się tetrametoksysilanie (1,0 ml) i miesza przez 15 minut w temperaturze 4°C. Całość pozostawia się do spolimeryzowania na 12 godzin. Immobilizowany enzym sączy się, przemywa wodą destylowaną (2 x 10 ml) i suszy w temperaturze pokojowej.

Przykład porównawczy 9

Do roztworu soli amonowych) symwastatyny (294 mg, 0,67 mmol) i Iowastatyny (21,7 mg, 0,05 mmol) w buforze węglanowym (150 ml, 50 mmol, pH=9,4) w temperaturze 30°C, mieszanego z użyciem mieszadła magnetycznego (250 obr./min.), dodaje się enzym EL osadzony na nośniku, otrzymany w przykładzie porównawczym 1-8. Postęp reakcji i selektywność hydrolizy analizuje się metodą HPLC. Wyniki dla materiałów otrzymanych w przykładach porównawczych 1-8 przedstawiono w tablicy 8.

PL 211 815 B1

T a b l i c a 8

Przykład porównawczy	Wydajność immobilizacji (%)^a	Aktywność specyficzna EL^b	Selektywność^c
Lowastatyna	Symwastatyna
Enzym EL natywny	-	15	0	>99
1	80	<0,5	<0,5	N.O.
2	54	<0,5	<0,5	N.O.
3	74	0,9	3,0	0,3
4	67	10	17,8	0,6
5	61	7,4	6,2	1,2
6	80	8,5	4,2	2,0
7	N.O.	N.O.	N.O.	3,5
8	N.O.	<0,5	<0,5	N.O.

N.O. - nie oznaczono ^a) wydajność immobilizacji wyznaczona jako ilość białka immobilizowanego /całkowita ilość białka-100%;

^b) ilość odpowiedniego substratu hydrolizowanego przez enzym w ciągu minuty, przez milligram białka (μΜ/min-mg);

^c) aktywność specyficzna EL dla Iowastatyny / aktywność specyficzna EL dla symwastatyny.

Claims

1. Enzym, esteraza Iowastatyny, osadzony na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, znamienny tym, że enzym jest kowalencyjnie związany ze stałym nośnikiem aktywowanym co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem sprzęgającym, przy czym kombinacja stałego nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego jest tak dobrana, że esteraza Iowastatyny osadzona na nośniku wykazuje co najmniej 5-krotnie wyższą czynność hydrolityczną względem Iowastatyny i jej soli, w obecności symwastatyny i/lub jej soli, niż względem symwastatyny i jej soli, gdzie kombinacje nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego są wybrane z grupy obejmującej:

a) nośnik polisacharydowy, taki jak poligalaktozyd, i jako dwufunkcjonalny reagent aktywujący związek o wzorze , w którym Y oznacza -SO₂- lub -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, gdzie n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18 a R oznacza atom wodoru lub C1-6 alkil, lub Y oznacza -SO2-Ar-SO2-, gdzie Ar oznacza dwuwartościową grupę arylową powstałą przez usunięcie dwóch atomów wodoru bezpośrednio związanych z atomami węgla pierścienia aromatycznego, która to dwuwartościowa grupa arylowa ewentualnie zawiera podstawniki C1-6 alkilowe,

b) modyfikowany nośnik polisacharydowy lub krzemionkowy, i jako co najmniej dwufunkcjonalny reagent aktywujący - halogenek cyjanurowy i/lub O-sulfonian kwasu cyjanurowego.

2. Enzym według zastrz. 1, znamienny tym, że nośnikiem jest poligalaktozyd, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest związek o wzorze , w którym Y oznacza -SO2-.

3. Enzym według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikowanym nośnikiem polisacharydowym jest dietyloaminoetyloceluloza, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest chlorek cyjanurowy.

4. Enzym według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikowanym nośnikiem krzemionkowym jest aminopropylosilanizowany żel krzemionkowy, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest chlorek cyjanurowy.

5. Enzym według zastrz. 1-4, znamienny tym, że enzymem jest enzym wytwarzany przez Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, ATCC 74178.

6. Sposób osadzania enzymu, esterazy Iowastatyny, na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, znamienny tym, że stosując pobudzanie mechaniczne, w rozpuszczalniku zestawia się halogenek cyjanurowy z modyfikowanym nośnikiem polisacharydowym, takim jak dimetyloaminoetyloceluloza, lub modyfikowanym nośnikiem krzemionkowym, takim jak aminopropylosilanizowany żel krzemionkowy, oddziela się aktywowany nośnik przez sączenie, suszy się aktywowany nośnik i zawiesza w mie18

PL 211 815 B1 szaninie wodnej zawierającej enzym, esterazę Iowastatyny, do osadzenia enzymu, oddziela się zawieszony materiał przez sączenie, przemywa buforem i suszy się.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako halogenek cyjanurowy stosuje chlorek cyjanurowy.

8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się nośnik autoklawowany.

9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako pobudzanie mechaniczne stosuje się wytrząsanie.

10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że przed przemywaniem buforem, odsączony materiał przemywa się wodą.

11. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że halogenek cyjanurowy z nośnikiem zestawia się w obecności zasady i/lub buforu.

12. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako roztwór wodny zawierający enzym stosuje się frakcję białkową materiału wyługowanego z Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, ATCC 74178.

13. Sposób osadzania enzymu, esterazy Iowastatyny, na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, znamienny tym, że stosując pobudzanie mechaniczne, w rozpuszczalniku zestawia się związek o wzorze , w którym Y oznacza -SO₂- lub -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, gdzie n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18 a R oznacza atom wodoru lub C1-6 alkil, lub Y oznacza -SO2-Ar-SO2-, gdzie Ar oznacza dwuwartościową grupę arylową powstałą przez usunięcie dwóch atomów wodoru bezpośrednio związanych z atomami węgla pierścienia aromatycznego, która to dwuwartościowa grupa arylowa ewentualnie zawiera podstawniki C1-6 alkilowe, z nośnikiem poligalaktozowym, oddziela się aktywowany nośnik przez sączenie, suszy się aktywowany nośnik i zawiesza w mieszaninie wodnej zawierającej enzym, esterazę Iowastatyny, oddziela się zawieszony materiał przez sączenie, przemywa buforem i suszy się.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że związkiem o wzorze ^ y''·'-·- , jest związek, w którym Y oznacza -SO2-.

15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako pobudzanie mechaniczne stosuje się wytrząsanie.

16. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że przed przemywaniem buforem, odsączony materiał przemywa się wodą.

17. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako roztwór wodny zawierający enzym stosuje się frakcję białkową materiału wyługowanego z Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, ATCC 74178.

18. Zastosowanie enzymu, esterazy Iowastatyny, osadzonego na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie określonego w zastrz. 1, do wytwarzania i/lub wydzielania i/lub oczyszczania symwastatyny.

19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że enzym stosuje się do oczyszczania i/lub wydzielania symwastatyny z mieszaniny z Iowastatyną.

20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że enzym stosuje się do selektywnej hydrolizy soli amonowej Iowastatyny do soli triolu, w obecności soli amonowej symwastatyny.

21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że enzym stosuje się do selektywnej hydrolizy soli amonowej Iowastatyny do soli triolu, w obecności soli amonowej symwastatyny, w procesie periodycznym.

22. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że enzym stosuje się do selektywnej hydrolizy soli amonowej Iowastatyny do soli triolu, w obecności soli amonowej symwastatyny, w procesie ciągłym.

23. Przepływowy reaktor biokatalityczny, ze złożem, znamienny tym, że obejmuje korpus (1) reaktora z przestrzenią (2) wewnętrzną połączoną z wlotem (3) dla płynu i połączoną z wylotem (4) dla płynu, w której to przestrzeni (2) wewnętrznej umieszczone jest złoże (5) zawierające osadzony na nośniku enzym, esterazę Iowastatyny, który to enzym jest kowalencyjnie związany ze stałym nośnikiem aktywowanym co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem sprzęgającym, przy czym kombinacja stałego nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego jest tak dobrana, że esteraza Iowastatyny osadzona na nośniku wykazuje co najmniej 5-krotnie wyższą czynność hydrolityczną względem Iowastatyny i jej soli, w obecności symwastatyny i/lub jej soli, niż względem symwastatyny i jej soli, gdzie kombinacja nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego jest wybrana z grupy obejmującej:

a) nośnik polisacharydowy, taki jak poligalaktozyd, i jako dwufunkcjonalny reagent aktywujący związek o wzorze ^ y''·'-·- , w którym Y oznacza -SO₂- lub -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, gdzie n oznacza liczbę

PL 211 815 B1 całkowitą od 1 do 18 a R oznacza atom wodoru lub C1-6 alkil, lub Y oznacza -SO2-Ar-SO2-, gdzie Ar oznacza dwuwartościową grupę arylową powstałą przez usunięcie dwóch atomów wodoru bezpośrednio związanych z atomami węgla pierścienia aromatycznego, która to dwuwartościowa grupa arylowa ewentualnie zawiera podstawniki C1-6 alkilowe,

24. Przepływowy reaktor według zastrz. 23, znamienny tym, że nośnikiem jest poligalaktozyd, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest związek o wzorze c ' , w którym Y oznacza -SO2-.

25. Przepływowy reaktor według zastrz. 23, znamienny tym, że nośnikiem jest dietyloaminoetyloceluloza, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest chlorek cyjanurowy.

26. Przepływowy reaktor według zastrz. 23, znamienny tym, że enzymem jest enzym wytwarzany przez Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, ATCC 74178.

27. Sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny obejmujący traktowanie enzymem, esteraza Iowastatyny, roztworu soli symwastatyny z resztkową zawartością soli Iowastatyny do zhydrolizowania Iowastatyny z wytworzeniem triolu, oddzielenie triolu i wyodrębnienie symwastatyny zasadniczo wolnej od Iowastatyny, w którym roztwór soli symwastatyny z resztkową zawartością soli Iowastatyny doprowadza się do zetknięcia z enzymem, esterazą Iowastatyny, osadzonym na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, znamienny tym, że enzym jest kowalencyjnie związany ze stałym nośnikiem aktywowanym co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem sprzęgającym, przy czym kombinacja stałego nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego jest tak dobrana, że esteraza Iowastatyny osadzona na nośniku wykazuje co najmniej 5-krotnie wyższą czynność hydrolityczną względem Iowastatyny i jej soli, w obecności symwastatyny i/lub jej soli, niż względem symwastatyny i jej soli, gdzie kombinacje nośnika i co najmniej dwufunkcjonalnego reagenta sprzęgającego są wybrane z grupy obejmującej:

a) nośnik polisacharydowy, taki jak poligalaktozyd, i jako dwufunkcjonalny reagent aktywujący związek o wzorze c y''c , w którym Y oznacza -SO₂- lub -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, gdzie n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18 a R oznacza atom wodoru lub C1-6 alkil, lub Y oznacza -SO2-Ar-SO2-, gdzie Ar oznacza dwuwartościową grupę arylową powstałą przez usunięcie dwóch atomów wodoru bezpośrednio związanych z atomami węgla pierścienia aromatycznego, która to dwuwartościowa grupa arylowa ewentualnie zawiera podstawniki C1-6 alkilowe,

28. Sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny według zastrz. 27, znamienny tym, że nośnikiem jest poligalaktozyd, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest związek o wzorze ^;ii Y^^<: , w którym Y oznacza -SO₂-.

29. Sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny według zastrz. 27, znamienny tym, że nośnikiem jest dietyloaminoetyloceluloza, a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest chlorek cyjanurowy.

30. Sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny według zastrz. 27, znamienny tym, że nośnikiem jest aminopropylosilanizowany żel krzemionkowy a co najmniej dwufunkcjonalnym reagentem aktywującym nośnik jest chlorek cyjanurowy.

31. Sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny według zastrz. 27, znamienny tym, że zetknięcie z enzymem osadzonym na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, roztworu soli symwastatyny z resztkową zawartością soli Iowastatyny, prowadzi się w temperaturze od 26°C do 50°C.

32. Sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny według zastrz. 27, znamienny tym, że zetknięcie z enzymem osadzonym na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, roztworu soli symwastatyny z resztkową zawartością soli Iowastatyny, prowadzi się metodą ciągłą w reaktorze przepływowym.

33. Sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny według zastrz. 27, znamienny tym, że enzymem jest enzym wytwarzany przez Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, ATCC 74178.