PL210710B1

PL210710B1 - Krystaliczne postaci 2-(4-metoksybenzylo) fenylo-6-O-etoksykarbonylo-ß-D-glukopiranozydu, ich zastosowanie oraz zawierająca je kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL210710B1
Application number: PL372415A
Authority: PL
Inventors: Akira Iyobe; Hirotaka Teranishi; Kazuya Tatani; Shigeru Yonekubo; Masayuki Isaji
Original assignee: Kissei Pharmaceutical
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2003-03-04
Publication date: 2012-02-29
Also published as: KR100945455B1; CN1642965A; AU2003211543B2; CN1307190C; PL372415A1; BR0308653A; NZ535230A; JPWO2003080635A1; MXPA04009229A; EP1489089A4; NO20044426L; KR20040099347A; HK1077830A1; AU2003211543A1; WO2003080635A1; CA2476800A1; NO330297B1; US7371730B2; EP1489089A1; CA2476800C

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy krystalicznych postaci 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu zawierającej je kompozycji farmaceutycznej oraz ich zastosowania zwłaszcza do zapobiegania lub leczenia choroby związanej z hiperglikemią.

2-(4-metoksybenzylofenylo)-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozyd przedstawiony wzorem (I):

jest nowym związkiem, nieznanym dotychczas w dziedzinie i nieujawnionym w literaturze, który to związek został wytworzony przez twórców niniejszego wynalazku. Związek ten in vivo ulega konwersji w aktywną postać 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-e-D-glukopiranozydu, która z kolei wykazuje doskonałe działanie hamujące wobec SGLT2 i jest użyteczna do leczenia lub zapobiegania chorobom związanym z hiperglikemią, takim jak cukrzyca, powikłania cukrzycowe, otyłość, itp. Do tej pory w stanie techniki nie była znana żadna z krystalicznych postaci tego związku.

Zgodnie z dotychczasową wiedzą 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozyd można było otrzymać jedynie w postaci amorficznej. Do wytworzenia wysoce czystej amorficznej postaci tego związku konieczne było prowadzenie kłopotliwych etapów oczyszczania. Ponadto, amorficzna postać charakteryzowała się niezadowalającą trwałością, a preparaty trudno było uzyskać z uwagi na jej lepkość.

Twórcy niniejszego wynalazku prowadzili intensywne badania nad krystalicznymi postaciami 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu, charakteryzującymi się podczas przechowywania wysoką trwałością i nadającymi się do wytwarzania preparatów farmaceutycznych i stwierdzili, że 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozyd występuje w dwóch różnych postaciach krystalicznych, „krystalicznej postaci α oraz „krystalicznej postaci β. Ponadto, twórcy wynalazku stwierdzili, że te postaci krystaliczne można uzyskać w postaci o wysokim stopniu czystości, stosując wygodny sposób oczyszczania, i że charakteryzują się one dobrą stabilnością podczas przechowywania i sypkością, a zatem nadają się do wytwarzania preparatów. Wynalazek zrealizowano w oparciu o powyższe stwierdzenia.

Tak więc, niniejszy wynalazek dotyczy:

(1) krystalicznej postaci 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu, która charakteryzuje się wzorem dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich z charakterystycznymi pikami przy kącie dyfrakcyjnym (2θ ± 0,1) 5,6, 13,8, 14,6, 16,8, 17,7 i 20,8 stopnia (określanej dalej jako „krystaliczna postać α);

(2) krystalicznej postaci 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu, która charakteryzuje się wzorem dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich z charakterystycznymi pikami przy kącie dyfrakcyjnym (2θ ± 0,1) 4,7, 5,5, 7,3, 8,6, 14,5 i 16,7 stopnia (określanej dalej jako „krystaliczna postać β);

(3) kompozycji farmaceutycznej, która jako składnik aktywny zawiera krystaliczną postać określoną powyżej w punktach (1) albo (2);

(4) kompozycji farmaceutycznej określonej w punkcie (3) do zapobiegania lub leczenia choroby związanej z hiperglikemią;

(5) zastosowania postaci krystalicznej, określonej w powyższych punktach (1) albo (2), do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia choroby związanej z hiperglikemią. Niniejszy wynalazek zilustrowano na rysunku, na którym:

Na Fig. 1 przedstawiono wzór dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich dla krystalicznej postaci α 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu, wytworzonej w przykładzie 1, gdzie na osi rzędnych pokazano natężenie promieniowania rentgenowskiego w cps (zliczenia na sekundę), a na osi odciętych pokazano kąt dyfrakcji w stopniach 2θ.

PL 210 710 B1

Na Fig. 2 przedstawiono wzór dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich dla krystalicznej postaci β 2-(4metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu, wytworzonej w przykładzie 4, gdzie na osi rzędnych pokazano natężenie promieniowania rentgenowskiego w cps (zliczenia na sekundę), a na osi odciętych pokazano kąt dyfrakcji w stopniach 2θ.

Krystaliczne postaci α i β według wynalazku można wytworzyć następującym sposobem.

Kryształy 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksy-e-D-glukopiranozydu otrzymano najpierw przez rozpuszczenie amorficznej postaci tego związku w etanolu z ogrzewaniem, a następnie przez zdrapanie substancji ze ściany naczynia do krystalizacji podczas oziębiania lodem. Kryształy otrzymano jako mieszaninę krystalicznych postaci α i β. Twórcy wynalazku wnikliwie badali warunki krystalizacji i stwierdzili, że krystaliczne postaci α i β według wynalazku można wytworzyć w czystej postaci krystalicznej przez krystalizację z konkretnego rozpuszczalnika, jak opisano poniżej.

Krystaliczną postać α według wynalazku można wytworzyć, jak następuje. Dowolną postać 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu z ogrzewaniem rozpuszcza się w odpowiednim pierwszym rozpuszczalniku (określanym również jako „dobry rozpuszczalnik). Następnie do roztworu dodaje się, w razie potrzeby, drugi rozpuszczalnik (określany również jako „słaby rozpuszczalnik) i uzyskaną mieszaninę miesza się lub pozostawia do wykrystalizowania. Wytrącone kryształy zbiera się, suszy i uzyskuje się krystaliczną postać α. Przykłady pierwszego rozpuszczalnika obejmują etanol, izopropanol, octan etylu, aceton lub keton metylowoetylowy, i można je stosować pojedynczo lub jako mieszaninę jednego lub więcej rozpuszczalników. Ilość pierwszego rozpuszczalnika zmienia się w zależności od rodzaju rozpuszczalnika, i na ogół zawiera się w zakresie od około 2 do około 20 części wagowych w odniesieniu do części wagowych 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu. Przykłady drugiego rozpuszczalnika, który może być mieszany z roztworem związku w pierwszym rozpuszczalniku, obejmują heksan, heptan lub wodę. Ilość drugiego rozpuszczalnika zmienia się w zależności od rodzaju rozpuszczalnika, a zwykle zawiera się w zakresie od około 0,1 do około 5 części wagowych w odniesieniu do części wagowych pierwszego rozpuszczalnika. Dla krystalicznej postaci α temperatura krystalizacji wynosi na ogół poniżej 50°C, a korzystnie zawiera się w zakresie od około 20 do około 50°C. Czas krystalizacji zmienia się w zależności od temperatury krystalizacji i zwykle zawiera się w zakresie około 1 do około 24 godzin.

Krystaliczną postać β według wynalazku można wytworzyć, jak następuje. Dowolną postać 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu z ogrzewaniem rozpuszcza się w metanolu, który na ogół stosuje się w ilości w zakresie od około 3 do około 10 części wagowych, a korzystnie od około 4 do około 6 części wagowych w odniesieniu do części wagowych 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu. Następnie w celu krystalizacji roztwór zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze od około 30°C do około 40°C i wytrącone kryształy zbiera się i suszy, otrzymując krystaliczną postać β. Alternatywnie, krystaliczną postać β można wytworzyć przez ogrzewanie amorficznej postaci 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu w temperaturze od około 120 do około 140 °C przez około 1 do około 4 godzin.

Tak wytworzone krystaliczne postaci α i β można zidentyfikować za pomocą ich charakterystycznych pików dyfrakcyjnych, jak pokazano na wzorach dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich na Fig. 1 lub 2:

(1) krystaliczna postać α ma charakterystyczne piki występujące przy kącie dyfrakcyjnym (2θ ± 0,1) 5,6, 13,8, 14,6, 16,8, 17,7 i 20,8 stopnia, jak przedstawiono na Fig. 1;

(2) krystaliczna postać β ma charakterystyczne piki występujące przy kącie dyfrakcyjnym (2θ ± 0,1) 4,7, 5,5, 7,3, 8,6, 14,5 i 16,7 stopnia, jak przedstawiono na Fig. 2.

Krystaliczne postaci α i β według wynalazku można przechowywać w normalnych warunkach przechowywania, takich jak 25°C/60% wilgotności względnej, lub podobnych, przez długi czas, bez zmiany ich krystalicznych postaci i są one również stabilne chemicznie. Krystaliczne postaci α i β według wynalazku mają doskonałą sypkość i są wygodne do manipulowania, a zatem, stosując konwencjonalne sposoby można z nich wytwarzać proszki, drobne granulki, granulki, tabletki, kapsułki itp.

Gdy stosuje się kompozycję farmaceutyczną zawierającą jako składnik aktywny krystaliczną postać według wynalazku, to w zależności od przeznaczenia można podawać ją w różnych postaciach dawkowania. Przykłady takich postaci obejmują proszki, granulki, drobne granulki, suche syropy, tabletki, kapsułki, preparaty do wstrzykiwania, ciecze, maści, czopki, okłady itp., które podaje się doustnie lub pozajelitowo.

PL 210 710 B1

Kompozycje farmaceutyczne można wytworzyć przez zmieszanie, rozcieńczenie lub rozpuszczenie z odpowiednimi farmaceutycznymi dodatkami, takimi jak substancje pomocnicze, substancje ułatwiające rozpad, substancje wiążące, substancje poślizgowe, rozcieńczalniki, bufory, środki izotoniczne, konserwanty, substancje zwilżające, emulgujące, dyspergujące, czynniki stabilizujące, czynniki solubilizujące itp., zgodnie z konwencjonalnymi sposobami wytwarzania preparatu w zależności od danej postaci dawkowania.

Gdy kompozycję farmaceutyczną stosuje się do leczenia to, dawkę krystalicznej postaci według wynalazku jako składnika aktywnego ustala się odpowiednio w zależności od wieku, płci i ciężaru ciała danego pacjenta, stopnia zaawansowania choroby, leczonego stanu, itp. Przy podawaniu doustnym typowa dawka dla dorosłego człowieka zawiera się w zakresie od około 0,1 mg do około 1000 mg dziennie. Przy podawaniu pozajelitowym typowa dawka dla dorosłego człowieka zawiera się w zakresie od około 0,01 mg do około 300 mg dziennie. Dawki można podawać pojedynczo lub w dawkach podzielonych, na przykład od jednego do kilku razy dziennie.

P R Z Y K Ł A D

Wynalazek zilustrowano szczegółowo w następujących przykładach, przykładach przygotowawczych i przykładach badań. Przykłady te jednakże w żaden sposób nie ograniczają zakresu wynalazku.

Dla każdej postaci krystalicznej wzory dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich otrzymano stosując analizator dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich RINT2100 (Rigaku), pracujący pod napięciem lampy rentgenowskiej 40 kV i natężeniem prądu przepływającego przez lampę 40 mA, z zastosowaniem wią zki Cu.

P r z y k ł a d p r z y g o t o w a w c z y 1

2-(4-metoksybenzylo)fenylo-2,3,4,6-tetra-O-acetylo-e-D-glukopiranozyd

Do roztworu 2-(4-metoksybenzylo)fenolu (46 mg) i 2,3,4,6-tetra-O-acetylo-1-O-trichloroacetoimidoilo-a-D-glukopiranozy (0,13 g) w dichlorometanie (2 ml) dodano kompleks eteru dietylowego trifluorku boru (0,033 ml) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu aminopropylokrzemionkowym (eluent:dichlorometan) i otrzymano 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-2,3,4,6-tetra-O-acetylo-e-D-glukopiranozyd (0,11 g).

¹H-NMR (CDCI3) δ ppm: 1,91 (3H, s), 2,03 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,08 (3H, s), 3,77 (3H, s), 3,80-3,95 (3H, m), 4,17 (1H, dd, J = 2,5, 12,2 Hz), 4,29 (1H, dd, J = 5,5, 12,2 Hz), 5,11 (1H, d, J = 7,5 Hz), 5,10-5,25 (1H, m), 5,25-5,40 (2H, m), 6,75-6,85 (2H, m), 6,95-7,10 (5H, m), 7,10-7,25 (1H, m).

P r z y k ł a d p r z y g o t o w a w c z y 2

2-(4-metoksybenzylo)fenylo-e-D-glukopiranozyd

Do roztworu 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-2,3,4,6-tetra-O-acetylo-e-D-glukopiranozydu (0,11 g) w metanolu (4 ml) dodano metanolanu sodu (28% roztwór w metanolu; 0,12 ml) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: dichlorometan/metanol = 10/1) i otrzymano 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-e-glukopiranozyd (65 mg).

¹H-NMR (CD3OD) δ ppm: 3,35-3,55 (4H, m), 3,69 (1H, dd, J = 5,1, 12,1 Hz), 3,73 (3H, s), 3,80-4,00 (2H, m), 4,03 (1H, d, J = 15,1 Hz), 4,91 (1H, d, J = 7,4 Hz), 6,75-6,85 (2H, m), 6,85-6,95 (1H, m), 6,95-7,10 (1H, m), 7,10-7,20 (4H, m).

P r z y k ł a d p r z y g o t o w a w c z y 3

2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozyd

Do roztworu 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-e-D-glukopiranozydu (0, 075 g) w 2,4,6-trimetylopirydynie (2 ml) w temperaturze pokojowej dodano chloromrówczanu etylu (0,04 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin, po czym do mieszaniny reakcyjnej dodano nasyconego wodnego roztworu kwasu cytrynowego i mieszaninę ekstrahowano octanem etylu. Ekstrakt przemyto wodą, wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym (eluent: dichlorometan/metanol = 10/1) i otrzymano amorficzną postać 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu (0,032 g). Analiza dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich nie wykazała wyraźnego piku dla postaci amorficznej.

¹H-NMR (CD3OD) δ ppm: 1,23 (3H, t, J = 7,1 Hz), 3,30-3,65 (4H, m), 3,74 (3H, s), 3,93 (1H, d, J = 15,1 Hz), 4,01 (1H, d, J = 15,1 Hz), 4,05-4,20 (2H, m), 4,29 (1H, dd, J = 6,4, 11,7 Hz), 4,45 (1H, dd, J = 2,2, 11,7 Hz), 4,89 (1H, d, J = 7,4 Hz), 6,75-6,85 (2H, m), 6,85-7,05 (2H, m), 7,05-7,2 (4H, m).

PL 210 710 B1

P r z y k ł a d 1

Krystaliczna postać α 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu

Do roztworu 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-e-D-glukopiranozydu (220 g) i 2,6-lutydyny (136 ml) w acetonie (834 ml) podczas mieszania w temperaturze od około 5 do około 10°C dodano chloromrówczanu etylu (84 ml). Następnie mieszaninę mieszano w temperaturze około 10 do około 20°C przez 4 godziny. Do mieszaniny reakcyjnej dodano wody i octanu etylu i oddzielono warstwę organiczną. Warstwę organiczną przemyto kolejno 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, solanką, 10% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką i wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Środek osuszający usunięto przez odsączenie i z przesączu usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość (326 g) podczas ogrzewania rozpuszczono w etanolu (1039 ml) i otrzymany roztwór potraktowano aktywowanym węglem drzewnym (11 g). Mieszaninę mieszano przez 5 minut, po czym nierozpuszczone substancje przesączono przez Celite. W ciągu 45 minut do przesączu w temperaturze od około 30 do około 40°C dodano n-heksanu (2046 ml) i otrzymaną mieszaninę pozostawiono do odstania w temperaturze pokojowej na 17 godzin. Następnie mieszaninę mieszano podczas oziębiania lodem przez 2 godziny, wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie i otrzymano surowe kryształy 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-β-D-glukopiranozydu (202 g).

Opisanym powyżej sposobem, stosując inny 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-e-D-glukopiranozyd (220 g) i 2,6-lutydynę (136 ml) otrzymano surowe kryształy 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu (200 g). Surowe kryształy połączono i 300 g porcję tych surowych kryształów mieszając ogrzewano z izopropanolem (4260 ml) i ketonem metylowo-etylowym (225 ml), aż do otrzymania klarownego roztworu. Roztwór potraktowano aktywowanym węglem drzewnym (15 g), po czym mieszaninę mieszano przez 15 minut i przesączono. W temperaturze około 50°C przesącz zaszczepiono kryształami krystalicznej postaci α i w ciągu 1 godziny podczas mieszania mieszaninę oziębiono do temperatury około 35°C. Następnie mieszaninę pozostawiono do odstania przez noc, po czym mieszano i oziębiano lodem przez 2 godziny. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie, przemyto izopropanolem, wysuszono w temperaturze około 60°C przez 12 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano 240 g kryształów.

Zgodnie z analizą dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich kryształy te zidentyfikowano jako krystaliczną postać α. Wzór dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich kryształów przedstawiono na Fig. 1.

P r z y k ł a d 2

Mieszaninę 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu (5,0 g) i etanolu (30 ml) ogrzewano w temperaturze od 60 do 65°C podczas mieszania, aż do uzyskania klarownego roztworu. Roztwór ten oziębiono do temperatury 40 do 45°C i mieszano w tej samej temperaturze przez 1 godzinę a w temperaturze 20 do 30°C przez dodatkową 1 godzinę. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie, wysuszono w temperaturze około 70°C przez 4 godziny pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano 3,33 g kryształów.

Zgodnie z analizą dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich kryształy te były zidentyfikowano jako krystaliczną postać α.

P r z y k ł a d 3

Mieszaninę 2-{4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu (90,0 g) i acetonu (300 ml) podczas mieszania ogrzewano w temperaturze 40 do 45°C, aż do uzyskania klarownego roztworu. Roztwór ten oziębiono do temperatury 35°C i w temperaturze od 25 do 35°C dodano n-heksanu (300 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze od 30 do 35°C przez 15 minut, po czym w ciągu 20 minut dodano jeszcze n-heksanu (300 ml). W ciągu 5 minut dodano znowu n-heksanu (300 ml) i otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie, przemyto układem aceton/n-heksan (1:3), wysuszono w temperaturze około 70°C przez 5 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano 81,9 g kryształów.

Zgodnie z analizą dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich kryształy te zidentyfikowano jako krystaliczną postać α.

P r z y k ł a d 4

Krystaliczna postać β 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu

PL 210 710 B1

Amorficzną postać 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu (5,0 g), otrzymaną w przykładzie przygotowawczym 3, umieszczono w piecu i ogrzewano w temperaturze 125°C przez 3 godziny. Po oziębieniu do temperatury pokojowej otrzymano 4,9 g kryształów.

W oparciu o analizę dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich kryształy te zidentyfikowano jako krystaliczną postać β. Wzór dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich dla tych kryształów przedstawiono na Fig. 2.

P r z y k ł a d 5

Mieszaninę 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu (1,0 g) i metanolu (5 ml) ogrzewano podczas mieszania, aż do uzyskania klarownego roztworu. Roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do suchości. Wytrącone kryształy zebrano przez odsączenie, wysuszono w temperaturze około 70°C przez 5 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano 0,9 g kryształów.

W oparciu o analizę dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich kryształy te zidentyfikowano jako krystaliczną postać β.

P r z y k ł a d b a d a n i a 1

B a d a n i e s t a b i l n o ś c i

Badania stabilności krystalicznych postaci α i β prowadzono w następujących warunkach. Resztkowe procentowe zawartości badanych substancji oznaczano metodą HPLC, a zmiany postaci krystalicznej analizowano metodą dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich.

Warunki HPLC:

wykrywanie: 225 nm kolumna: Inertsil ODS-3 temperatura kolumny: 30°C faza ruchoma: 0,02 mol/l układu bufor fosforanowy (pH 3,0): acetonitryl = 58:42 > 30:70 szybkość przepływu: 1,0 ml/min.

Warunki przechowywania:

1) 40°C/75% wilgotności względnej (RH), 2 miesiące, szczelne zamknięcie

2) 60°C, 2 miesiące, szczelne zamknięcie

Wyniki wskazują, że krystaliczne postaci α i β według wynalazku nie wykazują zmian postaci i procentowej zawartości i mają doskonałą stabilność podczas przechowywania.

P r z y k ł a d b a d a n i a 2

Badanie hamującego wpływu na aktywność ludzkiego SGLT2

1) Konstruowanie wektora plazmidowego wyrażającego ludzki SGLT2

Bibliotekę cDNA do amplifikacji PCR uzyskano metodą odwróconej transkrypcji całego RNA pochodzącego z nerki ludzkiej (gen Ori) z oligo dT jako starterem, stosując układ SUPERSCRIPT Preamplification System (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES). Fragment DNA kodujący ludzki SGLT2 amplifikowano przez reakcję PCR z zastosowaniem polimerazy Pfu DNA (Stratagene), w której jako matrycę stosowano opisaną powyżej bibliotekę cDNA nerki ludzkiej, a jako startery następujące oligonukleotydy: 0702F i 0712R, które przedstawiono odpowiednio jako Sekwencję Numer 1 i Sekwencję Numer 2. Amplifikowany fragment DNA ligowano do wektora do klonowania, pCR-Blunt (Invitrogen), zgodnie ze standardową metodą dla zestawu. Typowym sposobem transformowano odpowiednie komórki, Escherichia coli HB101 (Toyobo), a następnie prowadzono selekcję transformantów na pożywce agarowej LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny. Po tym, jak plazmid DNA ekstrahowano i oczyszczono z jednego z transformantów, prowadzono amplifikację fragmentu DNA kodującego ludzki SGLT2 na drodze reakcji PCR z zastosowaniem polimerazy Pfu DNA (Stratagene), w której jako startery stosowano następujące oligonukleotydy: 0714F i 0715R, przedstawione odpowiednio jako Sekwencja Numer 3 i Sekwencja Numer 4. Amplifikowany fragment DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi Xho I i Hind III, a następnie oczyszczono stosując Układ do oczyszczania Wizard (Wizard Purification System, Promega). Ten oczyszczony fragment DNA wstawiono w odpowiednie miejsca wielokrotnego klonowania pcDNA3.1 (-) Myc/His-B (Invitrogen), wektora wyrażania białka fuzyjnego. Typowym sposobem transformowano odpowiednie komórki, Escherichia coli HB101 (Toyobo), a następnie prowadzono selekcję transformantów na pożywce agarowej LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Po ekstrakcji z transformanta i oczyszczeniu plazmidu DNA analizie poddano zasadową sekwencję fragmentu DNA wstawionego w miejsca wielokrotnego klonowania pcDNA.1 (-) Myc/His-B. Zgodnie z opisem znajdującym się w publikacji Wellsa i in. (Am. J. Physiol., Vol. 263, str. 459-465

PL 210 710 B1 (1992)), w porównaniu do ludzkiego SGLT2 klon ten zawierał jedno zastąpienie zasady (ATC, która koduje izoleucynę-433 zastąpiono GTC). Następnie uzyskano klon, w którym izoleucynę-4 33 zastąpiono waliną. Wektor plazmidowy wyrażający ludzki SGLT2, w którym peptyd przedstawiony jako Sekwencja Numer 5 sprzęgano z karboksylowym końcem reszty alaninowej, oznaczono jako KL29.

Sekwencja Numer 1 Sekwencja Numer 2 Sekwencja Numer 3 Sekwencja Numer 4 Sekwencja Numer 5

ATGGAGGAGCACACAGAGGC GGCATAGAAGCCCCAGAGGA AACCTCGAGATGGAGGAGCACACAGAGGC AACAAGCTTGGCATAGAAGCCCCAGAGGA KLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH 2) Przygotowanie komórek wyrażających przejściowo ludzki SGLT2 Plazmid KL29 kodujący ludzki SGLT2 transfekowano do komórek COS-7 (RIKEN CELL BANK

RCB0539) przez elektroporację. Elektroporację prowadzono stosując aparat GENE PULSER II (BioRad Laboratories) w warunkach: 0,290 kV, 975 gF, 2 x 10⁶ komórek COS-7 i 20 μg KL29 w 50 μΐ pożywki OPTI-MEM I (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES) w 0,4 cm kuwecie. Po przeniesieniu genu komórki zebrano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w pożywce OPTI-MEM I (1 ml/kuwetę). 125 gl otrzymanej zawiesiny komórek dodano do każdej studzienki 96-studzienkowej płytki. Hodowlę prowadzono przez noc w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂, po czym dodano 125 gl pożywki DMEM, zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą (Sanko Jyunyaku) i do każdej studzienki dodano 100 jednostek/ml soli sodowej penicyliny G (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES), 100 gq/gl siarczanu streptomycyny (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES). Hodowlę prowadzono do następnego dnia, po czym uzyskane komórki wykorzystano do pomiaru aktywności hamującej wychwyt metylo-a-D-glukopiranozydu.

3) Pomiar aktywności hamującej wychwyt metylo-a-D-glukopiranozydu

Badany związek rozpuszczono w sulfotlenku dimetylu i rozcieńczono buforem do wychwytu (bufor o pH 7,4, zawierający 140 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku potasu, 1 mM chlorku wapnia, 1 mM chlorku magnezu, 5 mM metylo-a-D-glukopiranozydu, 10 mM kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowego i 5 mM tris(hydroksylmetylo)aminometanu), a każdy z rozcieńczalników stosowano jako próbkę do pomiaru aktywności hamującej. Z komórek COS-7 przejściowo wyrażających ludzki SGLT2 usunięto pożywkę, po czym do każdej studzienki dodano 200 gl buforu do obróbki wstępnej (pH 7,4, zawierający 140 mM chlorku choliny, 2 mM chlorku potasu, 1 mM chlorku wapnia, 1 mM chlorku magnezu, 10 mM kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowego i 5 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu) i komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 minut. Bufor do obróbki wstępnej usunięto, dodano 200 gl tego samego buforu i komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 minut. Bufor do pomiaru przygotowano przez dodanie do 525 gl przygotowanej próbki do badania 7 gl metylo-a-D-(U-14C)-glukopiranozydu (Amersham Pharmacia Biotech). Do kontroli, przygotowano bufor do pomiaru niezawierający badanego związku. Do oceny wychwytu podstawowego w nieobecności badanego związku i sodu w podobny sposób przygotowano bufor do pomiaru podstawowego wychwytu, który zamiast chlorku sodu zawierał 140 mM chlorku choliny. Bufor do obróbki wstępnej usunięto, do każdej studzienki dodano 75 gl buforu do pomiaru i komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Bufor do pomiaru usunięto, po czym do każdej studzienki dodano 200 gl buforu do przemywania (pH 7,4, zawierający 140 mM chlorku choliny, 2 mM chlorku potasu, 1 mM chlorku wapnia, 1 mM chlorku magnezu, 10 mM metylo-a-D-glukopiranozydu, 10 mM kwasu 2-[4-{2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]-etanosulfonowego i 5 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu) i bufor ten natychmiast usunięto. Komórki przemyto jeszcze dwa razy, a następnie solubilizowano przez dodanie do każdej studzienki 75 gl 0,2 N roztworu wodorotlenku sodu. Lizaty komórkowe przeniesiono do PicoPlate (Packard), do każdej studzienki dodano 150 gl MicroScint-40 (Packard) i zmierzono radioaktywność stosując licznik scyntylacyjny do mikropłytek TopCount (Packard). Różnicę w wychwycie określono jako 100% wartości po odjęciu radioaktywności wychwytu podstawowego od radioaktywności kontroli i na podstawie krzywej stężenie-hamowanie metodą najmniejszych kwadratów obliczono stężenia, przy których zahamowane jest 50% wychwytu (wartość IC50). Wyniki przedstawiono w następującej Tablicy 1.

[T a b l i c a 1]

Badany związek	Wartość IC50 (nM)
Przykład przygotowawczy 2	350

PL 210 710 B1

Zgodnie z wynalazkiem, wykorzystując dogodny sposób oczyszczania można wytworzyć postaci α i β o wysokim stopniu czystości i można je otrzymywać na skalę przemysłową. Krystaliczne postaci α i β według wynalazku charakteryzują się dobrą stabilnością podczas przechowywania i są odpowiednie do wytwarzania i dostarczania leków o pożądanej jakości. Ponadto, krystaliczne postaci α i β według wynalazku charakteryzują się dobrą sypkością i są wygodne do obróbki, a więc nadają się do wytwarzania preparatów farmaceutycznych. Ponadto, krystaliczne postaci α i β według wynalazku są użyteczne jako substancje lecznicze.

Claims

1. Krystaliczna postać 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu znamienna tym, że charakteryzuje się wzorem dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich z charakterystycznymi pikami przy kątach dyfrakcji (2θ ± 0,1) 5,6, 13,8, 14,6, 16,8, 17,7 i 20,8 stopnia.

2. Krystaliczna postać 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu znamienna tym, że charakteryzuje się wzorem dyfrakcji proszkowej promieni rentgenowskich z charakterystycznymi pikami przy kątach dyfrakcji (2θ ± 0,1) 4,7, 5,5, 7,3, 8,6, 14,5 i 16,7 stopnia.

3. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, znamienna tym, że jako składnik aktywny obejmuje postać krystaliczną 2-(4-metoksybenzylo)fenylo-6-O-etoksykarbonylo-e-D-glukopiranozydu określoną w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 albo 2.

4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4, do stosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu choroby związanej z hiperglikemią.

5. Zastosowanie krystalicznej postaci określonej w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 albo 2 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia choroby związanej z hiperglikemią.