PL210512B1 - Sposób, zestaw i podłoże do diagnozowania stwardnienia rozsianego - Google Patents
Sposób, zestaw i podłoże do diagnozowania stwardnienia rozsianegoInfo
- Publication number
- PL210512B1 PL210512B1 PL374869A PL37486903A PL210512B1 PL 210512 B1 PL210512 B1 PL 210512B1 PL 374869 A PL374869 A PL 374869A PL 37486903 A PL37486903 A PL 37486903A PL 210512 B1 PL210512 B1 PL 210512B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- glc
- antibodies
- glcnac
- gal
- Prior art date
Links
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 title claims abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N diazinon Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC(C)=NC(C(C)C)=N1 FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 95
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 56
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 42
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 claims description 40
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 36
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 24
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 claims description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 15
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 13
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 12
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 11
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 9
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 claims description 8
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 claims description 8
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 92
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 description 56
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 46
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 26
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 208000007718 Stable Angina Diseases 0.000 description 20
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 19
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 19
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 19
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 19
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 10
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 9
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 9
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 9
- 238000003491 array Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 8
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 7
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 6
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 6
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 6
- 238000002586 coronary angiography Methods 0.000 description 6
- 208000026758 coronary atherosclerosis Diseases 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 5
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 4
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 4
- 108010072051 Glatiramer Acetate Proteins 0.000 description 4
- 108010051884 MB Form Creatine Kinase Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- FHEAIOHRHQGZPC-KIWGSFCNSA-N acetic acid;(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound CC(O)=O.C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 FHEAIOHRHQGZPC-KIWGSFCNSA-N 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 3
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 3
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229960003776 glatiramer acetate Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000007658 neurological function Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- -1 glucose oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 1
- 206010048393 Multiple sclerosis relapse Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007400 Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- SSKPSTBQVXGUME-UHFFFAOYSA-N [Eu].[Eu] Chemical compound [Eu].[Eu] SSKPSTBQVXGUME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 229940038717 copaxone Drugs 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000003210 demyelinating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 208000002670 vitamin B12 deficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Testing Of Engines (AREA)
- Heat Treatment Of Steel (AREA)
- Sorption Type Refrigeration Machines (AREA)
- Control Of Electric Motors In General (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób, zestaw i podłoże do diagnozowania stwardnienia rozsianego. Podstawą rozwiązań według wynalazku jest pomiar w próbce biologicznej poziomu przeciwciał skierowanych przeciwko glikanom.
Stwardnienie rozsiane (SM - sclerosis multiplex lub MS od ang. multiple sclerosis) jest przewlekłą autoimmunologiczną chorobą zapalną ośrodkowego układu nerwowego. Jest częstą przyczyną długotrwałego kalectwa u młodych osób. U pacjentów cierpiących na SM system immunologiczny niszczy osłonkę mielinową aksonów w mózgu i w rdzeniu kręgowym, prowadząc do różnorodnych zaburzeń neurologicznych. W najczęstszej postaci SM, zwanej postacią rzutów i remisji (SM-RR), po epizodach ostrego pogorszenia funkcji neurologicznych (zaostrzenie objawów, ataki choroby) następują okresy częściowego lub całkowitego powrotu do zdrowia (remisja), które charakteryzują się stabilnością i są wolne od oznak postępu choroby. Według doniesień naukowych, 90% pacjentów z SM wykazuje początkowo jeden izolowany zespół objawów klinicznych, związany z zapalnym, demielinacyjnym uszkodzeniem nerwu wzrokowego, pnia mózgu, lub rdzenia kręgowego. Około 30% tych pacjentów z izolowanymi objawami klinicznymi wykazuje postępujący rozwój choroby, prowadzący do wykształcenia ostatecznej klinicznie postaci stwardnienia rozsianego w ciągu dwunastu miesięcy od pojawienia się pierwszych objawów. Dalszy postęp choroby może mieć znacznie różniący się przebieg u poszczególnych pacjentów. Postę p ten mo ż e mie ć zakres od przebiegu ł agodnego, poprzez przebieg klasyczny (rzuty i remisje), przebieg przewlekły postępujący, aż do rzadko występującego przebiegu piorunującego.
Sposób diagnozowania SM, który ułatwiałby wczesne wykrywanie zdefiniowanej klinicznie postaci stwardnienia rozsianego, byłby przydatny zarówno w postępowaniu wobec choroby, jak i w dostarczaniu odpowiedniej porady dotkniętemu chorobą pacjentowi. Na przykład pacjentom, u których odpowiednio wcześnie zdiagnozowano zdefiniowaną klinicznie postać stwardnienia rozsianego, można zaoferować leczenie, które modyfikuje przebieg choroby i które okazało się niedawno mieć bardzo korzystny wpływ w przypadku wczesnego SM.
Obecne sposoby oceniania i monitorowania postępu SM oparte są na punktowej ocenie stanu pacjenta w okresach ataków choroby i narastającej podczas tych ataków utraty czynności. Jednym z takich systemów służących do oceniania przebiegu SM jest powszechnie używana skala EDSS (ang. Expanded Disability Stages Scale, rozszeżona skala niewydolności ruchowej). Skala EDSS jest jednak oparta na subiektywnej ocenie stanu pacjenta.
Sposoby diagnozowania mogą również obejmować ocenę zakresu uszkodzeń mózgu przy użyciu obrazowania rezonansem magnetycznym (MRJ - eing. magnetic resonans imaging) lub badania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF - ang. cerebrospinal fluid) w celu wykonania analizy OCB (ang. oligo-clonal banding; prążków oligoklonalnych). MRI jest metodą fizycznej oceny uszkodzeń mózgu, która jest zbyt kosztowna, aby stosować ją do rutynowych badań. Ponadto, korelacja pomiędzy wynikami badania MRI a rozwojem choroby jest stosunkowo słaba. Punkcja rdzeniowo-mózgowa jest procedurą inwazyjną, nieprzyjemną dla pacjenta i nie nadającą się również do rutynowego stosowania. Dodatkowo, oba sposoby umożliwiają ocenę uszkodzeń dopiero po ich wystąpieniu, żadna z nich nie może przewidywać pojawienia się ataków. Inną niedogodnością związaną z wykonywaniem analizy OCB w płynie mózgowo-rdzeniowym oraz z przeprowadzaniem MRI, jako sposobu diagnozowania SM, jest to, że negatywny wynik OCB lub MRI nie wyklucza SM.
Istnieje więc potrzeba opracowania sposobu, który do diagnozowania SM oraz do przewidywania ataków choroby u pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane wykorzystywałby ocenę obiektywnych markerów diagnostycznych.
Wynalazek oparty jest częściowo na odkryciu, że pacjenci z SM wykazują w surowicy podwyższony poziom autoprzeciwciał IgG, IgA i IgM, skierowanych przeciwko strukturom glikanowym Glc(a) lub Glc(a1-4)Glc(a) lub Glc(a1-4) Glc(e), w porównaniu z poziomem tych autoprzeciwciał u zdrowych osób. Ponadto, te same autoprzeciwciała, swoiste wobec powyższych struktur glikanowych, wykazują podwyższony poziom podczas fazy zaostrzenia choroby, w porównaniu z poziomem stwierdzanym u pacjentów w okresie remisji lub u zdrowych osób. Wysoki stopień korelacji obserwowano również dla poziomu przeciwciał IgM anty-Glc(a) w surowicy kobiet, zdiagnozowanych klinicznie jako pacjentki z SM (SM-RR postacią z rzutami i remisją), oraz liczby punktów w kobiecej skali EDSS. Wysoki stopień korelacji wskazuje, że poziom przeciwciał IgM przeciwko α-glukozie w surowicy może służyć jako
PL 210 512 B1 kliniczny marker rozwoju choroby, oraz jako sposób monitorowania skuteczności działania leku podczas przeprowadzania testów klinicznych.
Monitorowanie poziomów wymienionych powyżej przeciwciał w krwi pacjentów, u których podejrzewa się występowanie SM, umożliwia szybkie i ekonomiczne finansowo wczesne wykrywanie pacjentów z SM, a także wczesne przepisywanie im leków modyfikujących przebieg choroby. Monitorowanie poziomu tych przeciwciał w krwi zdiagnozowanych pacjentów z SM umożliwi również szybkie i ekonomiczne monitorowanie skutków dział ania przepisanych leków, a takż e wczesne wykrywanie ataków, umożliwiając w ten sposób wczesną profilaktykę.
Do dodatkowych zalet wynalazku należy fakt, że występowanie SM u pacjentów może być określane na wcześniejszym etapie choroby, gdy jej objawy mogą jeszcze przypominać wiele innych chorób podobnych do SM. Wczesna diagnoza pozwala lekarzom na leczenie SM we wcześniejszym przebiegu tej choroby, przez co minimalizuje się lub zapobiega uszkodzeniom wywoływanym przez destrukcję mieliny (oraz skutkom tych uszkodzeń). Ponadto, przedstawione tu sposoby umożliwiają lekarzom regularną obserwację pacjentów z SM w celu dokonania oceny rozwoju choroby, monitorowania leczenia oraz dokonywania zmian w leczeniu w przypadku pojawiania się objawów nadchodzących ataków. Przykładowo, zmiana markera biologicznego, wskazująca na atak SM, powodowałaby podanie pacjentowi metylopredisonu, będącego ogólnym lekiem przeciwzapalnym, podawanym zwykle podczas ataków.
Przedstawione tu sposoby mogą być również wykorzystane do wyselekcjonowania najlepszego leku dla określonego pacjenta. Przykładowo, leczenie pacjenta może być rozpoczęte przy użyciu określonego leku, a zmiana w poziomie markera będzie wskazywała na jego skuteczność. Powrót poziomu markera do stanu charakterystycznego dla choroby wskazywać natomiast będzie utratę skuteczności leku, a wtedy lek taki może być zastąpiony innym lekiem w krótkim okresie czasu. Bez takiej możliwości lekarz musiałby czekać na wystąpienie kolejnych ataków, aby określić, czy lek jest skuteczny w przypadku danego pacjenta.
Przedstawione tu markery biologiczne mogą ponadto służyć jako tani środek zastępczy przy ocenianiu odpowiedzi pacjenta na testowany lek. Taki zastępczy środek oparty na teście serologicznym może ułatwiać wydajne testowanie nowych potencjalnych leków przeciwko stwardnieniu rozsianemu SM.
W jednym z aspektów wynalazek dotyczy sposobu diagnozowania stwardnienia rozsianego u pacjenta. Sposób ten obejmuje wykrywanie w otrzymanej od osobnika, testowanej próbce przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(1) oraz porównanie poziomów tego przeciwciała w testowanej próbce z prawidłową próbką kontrolną, przy czym podniesiony poziom przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(a) w wyżej wskazanej testowanej próbce, w porównaniu z poziomem tego przeciwciała w prawidłowej próbce kontrolnej wskazuje na obecność stwardnienia rozsianego, przez co diagnozuje się stwardnienie rozsiane u tego osobnika.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje ponadto wykrywanie co najmniej jednego dodatkowego przeciwciała wybranego z grupy obejmującej przeciwciało anty-Glc(a), przeciwciało anty-Glc(a1-4)Glc(e), przeciwciało anty-Glc(e), przeciwciało anty-Gal(e), przeciwciało anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e), przeciwciało anty-GlcNAc(e1-4)GlcNAc(e), przeciwciało anty-L-Araf(a), przeciwciało anty-L-Rha(a), przeciwciało anty-Gal(e1-3)[GlcNAc(e1-6)]GalNAc(a), przeciwciało anty-Gal(e1-4)GlcNAc(a), przeciwciało anty-Gal(e1-3)GalNAc(a), przeciwciało anty-Gal(e1-3)GlcNAc(e), przeciwciało anty-GlcA(e) i przeciwciało anty-Xyl(a), oraz porównanie poziomu tego co najmniej jednego dodatkowego przeciwciała w testowanej próbce z poziomami co najmniej jednego dodatkowego przeciwciała w prawidłowej próbce kontrolnej, przy czym podniesiony poziom wyżej wskazanego dodatkowego przeciwciała w testowanej próbce w porównaniu z poziomem tego przeciwciała w prawidłowej próbce kontrolnej wskazuje na obecność stwardnienia rozsianego.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje wykrywanie co najmniej trzech dodatkowych przeciwciał, a korzystniej wykrywanie co najmniej pięciu dodatkowych przeciwciał.
W korzystnej postaci wykonania co najmniej jednym dodatkowym przeciwciałem jest przeciwciało anty-Glc(a).
Korzystnie w sposobie według wynalazku próbkę kontrolną otrzymuje się z populacji obejmującej osoby, u których nie występuje stwardnienie rozsiane.
Testowana próbka może składać się zasadniczo z grupy obejmującej jedną lub większą liczbę osób, które nie wykazują objawów stwardnienia rozsianego albo z grupy osób wykazujących objawy stwardnienia rozsianego. W korzystnej postaci wykonania próbkę kontrolną otrzymuje się od osób,
PL 210 512 B1 u których nieobecność SM moż na okreś lić przy uż yciu technik znanych specjalistom, np. badania z zastosowaniem skali EDSS, badania MRI, albo też obu tych badań .
Testowana próbka jest korzystnie płynem biologicznym. Korzystne przykłady płynów biologicznych obejmują np. pełną krew, surowicę, osocze, płyn z rdzenia kręgowego, mocz lub ślinę.
Korzystnie osobą poddaną testowi może być zarówno kobieta jak i mężczyzna.
Ponadto korzystnie wykrywane przeciwciało anty-Glc(a1-4)Glc(a) może być np. przeciwciałem z klasy IgM, klasy IgA lub klasy IgG, a przeciwciało anty-Glc(a) przeciwciałem typu IgM.
Również w korzystnej postaci wykonania w sposobie według wynalazku diagnoza jest wczesną diagnozą stwardnienia rozsianego.
Niniejszym ujawniono również sposób diagnozowania stadium zaostrzenia stwardnienia rozsianego u pacjenta. Sposób ten obejmuje dostarczenie testowanej próbki, pochodzącej od pacjenta, oraz wykrywanie przeciwciała anty-Glc(a) klasy IgM i/lub przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(a) klasy IgM w testowanej próbce. Poziom przeciwciała w testowanej próbce porównywany jest z poziomem w próbce kontrolnej, pochodzącej od jednej lub większej liczby osób o określonym stadium SM.
Próbka kontrolna może składać się z grupy obejmującej jedną lub większą liczbę osób, które nie wykazują objawów zaostrzania się stwardnienia rozsianego i które znajdują się w stadium remisji. Stadium zaostrzania się stwardnienia rozsianego diagnozowane jest u danej osoby, jeśli w próbce kontrolnej wykrywa się więcej przeciwciał anty-Glc(a) lub przeciwciał anty-Glc(a1-4)Glc(a) niż w próbce kontrolnej. Próbka kontrolna może składać się z grupy obejmującej jedną lub większą liczbę osób, które wykazują objawy zaostrzania się stwardnienia rozsianego, a zaostrzanie się stwardnienia rozsianego jest wykrywane (diagnozowane), jeśli poziom przeciwciał anty-Glc(a) klasy IgM i/lub przeciwciał anty-Glc(a1-4)Glc(a) klasy IgM jest podobny w próbce testowanej i próbce kontrolnej.
Testowana próbka może być, na przykład, płynem biologicznym. Przykłady płynów biologicznych obejmują np. pełną krew, surowicę, osocze, płyn z rdzenia kręgowego, mocz lub ślinę.
Testowaną osobą może być zarówno kobieta jak i mężczyzna.
Wykrywane przeciwciało może być np. przeciwciałem klasy IgM, klasy IgA lub klasy IgG, a diagnozą jest wczesna diagnoza zaostrzania się stwardnienia rozsianego.
W niektórych przypadkach, leczona osoba poddawana jest działaniu czynnika leczniczego SM, np. interferonu β lub octanu glatirameru, podawanych podskórnie.
Niniejszym opisano także sposób oceniania zaawansowania stwardnienia rozsianego u pacjenta. Sposób ten obejmuje dostarczenie testowanej próbki, pochodzącej od pacjenta, oraz wykrywanie przeciwciała anty-GIc(a) klasy IgM i/lub przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(a) klasy IgM w testowanej próbce. Poziom przeciwciała w testowanej próbce porównywany jest z poziomem w próbce kontrolnej, pochodzącej od jednej lub większej liczby osób o określonym poziomie zaawansowania stwardnienia rozsianego.
Próbka kontrolna może składać się z grupy obejmującej jedną lub większa liczbę osób, u których poziom zaawansowania stwardnienia rozsianego określono przy użyciu badania EDSS, zmian obserwowanych w skali EDSS, lub badania MRI.
Testowana próbka może być, na przykład, płynem biologicznym. Przykłady płynów biologicznych obejmują np. pełną krew, surowicę, osocze, płyn z rdzenia kręgowego, mocz lub ślinę.
Opisane powyżej sposoby mogą ponadto obejmować wybór czynnika leczniczego wobec stwardnienia rozsianego, dokonywany poprzez wyselekcjonowanie czynnika leczniczego oraz sposobu jego dawkowania w oparciu o względny poziom przeciwciała lub przeciwciał w testowanej próbce oraz próbce kontrolnej.
Wyższy poziom przeciwciał w testowanej próbce, w porównaniu z próbką kontrolną, wskazuje na wybór czynnika leczniczego (oraz sposobu jego dawkowania), którym jest podawany podskórnie interferon β (BETAFERON®, AVONEX®, REBIF®) lub podskórne podawanie octanu glatirameru (COPAXONE®).
Badaną osobą może być zarówno kobieta jak i mężczyzna.
Wynalazek dotyczy ponadto zestawu do diagnozowania stwardnienia rozsianego składającego się z:
pierwszego odczynnika, który swoiście wiąże się z przeciwciałem anty-Glc(a1-4)Glc(a) przez oddziaływanie antygen - przeciwciało; oraz drugiego odczynnika, który swoiście wiąże się z drugim przeciwciałem przez oddziaływanie antygen - przeciwciało, przy czym to drugie przeciwciało jest wybrane z grupy składającej się z przeciwciała anty-Glc(a), przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(e), przeciwciała anty-Glc(e), przeciwciała anty-Gal(e),
PL 210 512 B1 przeciwciała anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e), przeciwciała anty-GlcNAc(ei-4)GlcNAc(e), przeciwciała anty-L-Araf(a), przeciwciała anty-L-Rha(a), przeciwciała anty-Gal(ei-3)[GlcNAc(ei-6)]-GalNAc(a), przeciwciała anty-Gal(ei-4)GlcNAc(a), przeciwciała anty-Gal(ei-3)GalNAc(a), przeciwciała antyGal(ei-3)GlcNAc(e), przeciwciała anty-GlcA(e) i przeciwciała anty-Xyl(a), przy czym odczynniki są połączone kowalencyjnie ze stałym podłożem końcem redukującym.
Korzystnie w zestawie według wynalazku odczynniki swoiście wykrywają przeciwciało typu IgM.
Zakresem niniejszego wynalazku objęte są także podłoża stałe do diagnozowania stwardnienia rozsianego, składające się z odczynnika swoiście wiążącego się z przeciwciałem swoistym wobec Glc(a1-4)Glc(a) przez oddziaływanie antygen przeciwciało, przy czym odczynnik jest połączony kowalencyjnie ze stałym podłożem końcem redukującym.
Przedmiotem wynalazku jest także podłoże stałe do diagnozowania stwardnienia rozsianego, które składa się z odczynnika swoiście wiążącego się z przeciwciałem swoistym wobec Glc(a1-4)Glc(a) przez oddziaływanie antygen - przeciwciało oraz dodatkowego odczynnika swoiście wiążącego się z przeciwciałem wybranym z grupy składającej się z przeciwciała anty-Glc(a), przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(e), przeciwciała anty-Glc(e), przeciwciała anty-Gal(e), przeciwciała anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e), przeciwciała anty-GlcNAc(e1-4)GlcNAc(e), przeciwciała anty-L-Araf(a), przeciwciała anty-L-Rha(a), przeciwciała anty-Gal(e1-3)[GlcNAc(e1-6)]GalNAc(a), przeciwciała anty-Gal(e1-4)-GlcNAc(a), przeciwciała anty-Gal(e1-3)GalNAc(a), przeciwciała anty-Gal(e1-3)GlcNAc(e), przeciwciała anty-GlcA(e) i przeciwciała anty-Xyl(a), przy czym odczynnik jest połączony kowalencyjnie ze stałym podłożem końcem redukującym.
Korzystnie odczynnik w podłożu według wynalazku wykrywa przeciwciało anty-Glc(a) lub przeciwciało anty-L-Rha(a).
Również korzystnie według wynalazku jest podłożem płaskim albo jest dostarczone jako studzienka płytki do mikromiareczkowania, odczynnik jest monosacharydem lub oligosacharydem.
Niniejszym ujawniono także sposób selekcjonowania czynnika leczniczego wobec stwardnienia rozsianego. Sposób ten obejmuje dostarczenie testowanej próbki, pochodzącej od osoby ze zdiagnozowanym stwardnieniem rozsianym lub osoby o podwyższonym ryzyku wystąpienia tej choroby, oraz określenie, czy testowana próbka zawiera przeciwciało anty-Glc(a). Poziom przeciwciała w testowanej próbce jest porównywany z poziomem przeciwciała w próbce kontrolnej, obejmującej jedną lub większą liczbę osób o określonym stopniu zaawansowania stwardnienia rozsianego. Czynnik leczniczy oraz sposób jego dawkowania wybierane są w oparciu o względny poziom przeciwciał w testowanej próbce oraz próbce kontrolnej.
W niektórych wykonaniach, sposób według wynalazku obejmuje ponadto określenie, czy testowana próbka zawiera przeciwciało anty-Glc(a1-4)Glc(a), oraz porównanie poziomu przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(a) w testowanej próbce do poziomu tego przeciwciała w próbce kontrolnej, składającej się zasadniczo z jednej lub większej liczby osób o określonym stopniu zaawansowania stwardnienia rozsianego.
Próbka kontrolna może się składać z jednej lub większej liczby osób nie cierpiących na stwardnienie rozsiane, lub osób w stabilnym stadium stwardnienia rozsianego.
O ile nie jest to inaczej zaznaczone, wszystkie użyte tu terminy techniczne i naukowe mają to samo znaczenie, jakie przyjmowane jest przez specjalistów z dziedziny niniejszego wynalazku. Choć sposoby i materiały podobne lub równoważne tym, które zostały tutaj opisane, mogą być również wykorzystane w praktyce lub w ramach testowania prezentowanego w wynalazku, odpowiednie sposoby i materiały przedstawiono poniżej. W przypadku jakichkolwiek sprzeczności, prezentowany tutaj opis, włącznie z definicjami, ma charakter wiążący. Dodatkowo, prezentowane tu materiały, sposoby oraz przykłady mają jedynie charakter ilustracyjny, a nie wiążący.
Inne cechy i zalety niniejszego wynalazku będą w sposób oczywisty wynikały z przedstawionego poniżej szczegółowego opisu i zastrzeżeń.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia schemat postępowania diagnostycznego, stosowany w celu określenia, czy u pacjenta podejrzanego o SM rzeczywiście występuje stwardnienie rozsiane.
Figura 2 przedstawia schemat postępowania w procesie dokonywania selekcji leku i dawki dla pacjenta z SM w oparciu o poziom przeciwciał anty-Glc(a1-4)Glc(a) lub Glc(a).
Figura 3 przedstawia schemat postępowania, stosowany w przypadku przewidywania i wczesnej diagnozy stadium ataków u pacjenta z SM.
PL 210 512 B1
Figura 4 jest tabelą przedstawiającą względną wartość sygnału fluorescencyjnego, odpowiadającego wiązaniu różnych przeciwciał skierowanych przeciwko glikanom, dla pacjentów z stwardnieniem rozsianym (oznaczonych jako SM) oraz dla osób kontrolnych (oznaczonych jako NC). Struktury glikanów przedstawiono w górnym wierszu tabeli przy użyciu kodu LINEARCODE®.
Figura 5 przedstawia wartość średniej i mediany dla sygnału odpowiadającego przeciwciałom skierowanym przeciwko różnym glikanom w surowicy pacjentów z SM i osób kontrolnych (NC). Struktury glikanów przedstawiono przy użyciu kodu LINEARCODE®.
Figura 6 jest wykresem przedstawiającym różnice pomiędzy średnimi wartościami sygnału dla osób z SM i osób zdrowych (z zaznaczeniem wartości odchylenia standardowego). Struktury glikanów przedstawiono przy użyciu kodu LINEARCODE®.
Figura 7A jest wykresem przedstawiającym średnią wartość sygnału, odpowiadającego wiązaniu IgM anty-Glc(a) (Glikan #11) oraz IgM anty-Glc(a1-4)Glc(a) (Glikan #12) w grupie osób z SM i grupie osób zdrowych.
Figura 7B jest wykresem przedstawiającym średnią wartość sygnału, odpowiadającego wiązaniu IgM anty-Glc(a) (Glikan #11) oraz IgM anty-Glc(a1-4)Glc(a) (Glikan #12) w grupie osób w stadium ataków, w grupie osób ze stabilnym SM, w oraz grupie osób zdrowych.
Figura 8 jest wykresem przedstawiającym korelację między wartością względnej fluorescencji, otrzymanej w wyniku adhezji przeciwciał klasy IgM skierowanych przeciwko glukozie a u pacjentów z SM, pozytywnych (lewy panel) lub negatywnych (prawy panel) względem przeciwciał anty-Glc(a), a wynikami badania EDSS.
Figura 9 jest wykresem przedstawiającym stabilność sygnału, odpowiadającego wiązaniu przeciwciał klasy IgM, IgG i IgA skierowanym przeciwko glikanom, w ciągu 13 tygodni u 7 zdrowych osób.
Figury 10A-10E przedstawiają macierze glikanowe: strukturę chemiczną, swoistość wiązania lektyny oraz powtarzalność uzyskiwanych wyników.
Figura 10A przedstawia cząsteczkę p-aminofenylo-P-sacharydu połączonego kowalencyjnie swym redukującym końcem (przy pomocy łącznika) ze stałym podłożem.
Figura 10B przedstawia powtarzalność reakcji wiązania biotynylowanego WGA na macierzach glikanowych (pochodzących z różnych serii produkcyjnych). Przy użyciu biotynylowanego WGA analizowano jednocześnie trzy oddzielne serie macierzy.
Figura 10C przedstawia wyniki testu kom petycyjnego przy użyciu ConA wiążącego Man(a). Różne wzrastające stężenia rozpuszczalnej mannozy lub Gal(e1-4)Glc inkubowano z biotynylowanym ConA (1,5 μg/ml) przez 1 godzinę, a następnie przeprowadzano detekcję przy użyciu streptawidyny sprzężonej z europem.
Figura 10D przedstawia swoistość wiązania lecytyny przez różne anomery (wiązanie ConA przez stanowiący kontrolę negatywną glicerol (19), oraz Man(a) (26) i Man(e) (27), a także wiązanie GSI przez Gal(a) (1), Gal(P) (2), GalNAc(a) (7) i GalNAc(e) (8).
Figura 10E przedstawia powtarzalność wyników otrzymywanych na różnych płytkach macierzy glikanowych. Pięć identycznych płytek prezentujących GlcNAc(e) sondowano biotynylowanym WGA.
Figura 11 przedstawia profil wiązania glikanów dla populacji zdrowych osób. Przedstawiono wiązanie przeciwciał skierowanych przeciwko węglowodanom przez wybrane glikany (patrz tabela 5 zawierająca opis struktury glikanów) w próbkach surowicy od 72 osób, co oceniano na podstawie pomiaru biotynylowanego białka A. Każda kropka reprezentuje średnią z dwóch doświadczeń, z których każde obejmowało cztery powtórzenia. Prostokątny słupek odpowiada sygnałom obejmującym 50% populacji. Gruba i cienka linia wewnątrz słupka odpowiada wartościom średniej i mediany. Dolna granica słupka odpowiada 25 percentylowi, a górna granica odpowiada 75 percentylowi. Kreski powyżej i poniżej słupka odpowiadają 90 i 10 percentylowi. Poziom niespecyficznego sygnału (tła) określano doświadczalnie. Glikany, dla których poziom przeciwciał był relatywnie niski i wysoce zmienny w poszczególnych doświadczeniach, wyznaczano do określenia poziomu tła (dane nie przedstawione). Obliczano średnie wartości sygnałów dla tych glikanów i odejmowano je od sygnałów otrzymanych dla każdej próbki surowicy i badanego glikanu. Przeciętny poziom tła wynosił 3 x 105RFU. TBST oznacza roztwór soli zbuforowany Trisem (ang. Tris-buffered Saline), z dodatkiem Tween-20 (patrz Protokół Doświadczalny).
Figura 12 przedstawia sygnały dla poszczególnych surowic otrzymane wobec serii glikanów. Wartości odpowiadające wiązaniu przeciwciał skierowanych przeciwko glikanom, mierzonemu we względnych jednostkach fluorescencji (RFU - ang. relative fluorescence units), przekształcano przy użyciu histogramowego sposobu wyrównywania wartości, wykorzystującego monotoniczne mapowanie
PL 210 512 B1 nieliniowe. W ten sposób wartości RFU zamieniane są w wartości z zakresu od 0 (barwa niebieska) do 255 (barwa czerwona). Otrzymane dane grupowano przy użyciu symulacyjnego algorytmu dopasowywania.
Figury 13A-13C przedstawiają profil wiązania oczyszczanych (przy użyciu powinowactwa) przeciwciał (A) anty-L-Rha(a), (B) anty-GlcNAc(a) i anty-GlcNAc(ei-4)GlcNAc(e), oraz (C) anty-Glc(e1-4)Glc(ei-4)Glc(e) i anty-GlcNAc(ei-4)GlcNAc(e) do macierzy 33 glikanów. Struktury glikanów opisano w tabeli 5. Poziom związanych przeciwciał mierzono przy użyciu biotynylowanego koziego przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkim immunoglobulinom IgG.
Figury 14A i 14B przedstawiają swoistość przeciwciała anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e). (A) Kompetytywne hamowanie wiązania przeciwciała anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e). Hamowanie wiązania oczyszczanych drogą powinowactwa przeciwciał anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e) przez cząsteczki p-aminofenylo-e-anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e) immobilizowane na powierzchni studzienki, jako funkcja stężenia anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc lub Gal(e1-4)Glc. Ilość związanego przeciwciała mierzono przy użyciu biotynylowanego koziego przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkim immunoglobulinom IgG. (B) Wiązanie przeciwciał anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e) oraz anty-L-Rha(a) przez pokrewne cukry po inkubacji z krystaliczną lub bezpostaciową celulozą. Ilość związanego przeciwciała mierzono przy użyciu biotynylowanego koziego przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkim immunoglobulinom IgG.
Figury 15A-15C stanowią graficzne przedstawienie wiązania izotypów IgG, IgA i IgM zdrowych osób przez wskazane glikany.
Figura 16A przedstawia macierz glikanów wykorzystanych do testowania surowic pacjentów z miażdżycą tętnic, cierpiących na stabilną i niestabilną dusznicę bolesną. Glikany, dla których stwierdzono znaczące różnice w poziomie przeciwciał pomiędzy różnymi grupami pacjentów oznaczono wypełnionymi kwadratami. Listę glikanów przedstawiono w tabeli 4.
Figura 16B jest graficznym przedstawieniem poziomu przeciwciał skierowanych przeciwko glikanom #2 i #29 w trzech grupach pacjentów, niestabilnej, stabilnej oraz bez miażdżycy tętnic. Słupek odpowiada sygnałom obejmującym 50% populacji. Gruba i cienka linia wewnątrz słupka odpowiadają wartościom średniej i mediany. Dolna granica słupka wskazuje 25 percentyl, a górna granica wskazuje 75 percentyl. Kreski powyżej i poniżej słupków wskazują odpowiednio 90 i 10 percentyl.
Figura 17 jest histogramem przedstawiającym liczbę próbek pozytywnych względem przeciwciał anty-IgA skierowanych przeciwko glikanowi #2 lub glikanowi #29 (w trzech grupach pacjentów).
Figura 18A jest histogramem przedstawiającym rozkład poziomów przeciwciał skierowanych przeciwko glikanom #2 i #15 w trzech grupach pacjentów. Słupek odpowiada sygnałom obejmującym 50% populacji. Gruba i cienka linia wewnątrz słupka odpowiadają wartościom średniej i mediany. Dolna granica słupka wskazuje 25 percentyl, a górna granica wskazuje 75 percentyl. Kreski powyżej i poniżej słupków wskazują odpowiednio 90 i 10 percentyl.
Figura 18B jest histogramem przedstawiającym liczbę próbek pozytywnych względem przeciwciał anty-IgA skierowanych przeciwko glikanowi #2 lub glikanowi #15 (w trzech grupach pacjentów).
Figura 19 jest graficznym przedstawieniem swoistości i czułości testu w oparciu o poziom przeciwciał IgA skierowanych przeciwko glikanowi #2, glikanowi #15, glikanowi #17 oraz glikanowi #49. A - miażdżyca tętnic, S - stabilna, US - niestabilna, NA - brak miażdżycy tętnic.
Figura 20 jest histogramem przedstawiającym profil wiązania komórek CD4+, pochodzących od pojedynczej osoby, przez różne glikany. Struktury glikanów przedstawiono przy użyciu kodu LINEARCODE®.
Figura 21A jest wykresem przedstawiającym wartość mediany dla względnej fluorescencji otrzymanej dla komórek CD4+ od każdej z siedmiu osób. Struktury glikanów przedstawiono przy użyciu kodu LINEARCODE®.
Figura 21B przedstawia sygnały odpowiadające poszczególnym surowicom testowanym wobec serii glikanów. Wartości odpowiadające wiązaniu przeciwciał, mierzonemu we względnych jednostkach fluorescencji (RFU), przekształcano przy użyciu histogramowego sposobu wyrównywania wartości, wykorzystującego monofoniczne mapowanie nieliniowe. W ten sposób wartości RFU zamieniane są w wartości z zakresu od 0 (barwa niebieska) do 255 (barwa czerwona). Otrzymane dane grupowano przy użyciu symulacyjnego algorytmu dopasowywania.
Szczegółowy opis wynalazku
Sposoby dostarczane niniejszym pozwalają na wczesną diagnozę początkowej fazy i nawrotów stwardnienia rozsianego przy użyciu obiektywnie ocenianych poziomów markerów biologicznych.
PL 210 512 B1
Stosowany obecnie schemat postępowania diagnostycznego dla pacjenta podejrzanego o SM opisany jest na fig. 1. Pacjent wykazujący ostre pogorszenie się funkcji neurologicznych musi być najpierw zdiagnozowany jako pacjent o określonej postaci SM, zanim będzie mógł być poddany leczeniu przy użyciu leków modyfikujących przebieg choroby. Lekarz będzie więc musiał określić, czy pacjent ma jedynie objawy przypominające SM (takie jak udar Youngera, toczeń, niedobór witaminy B-12, zespół antyfosfolipidowy, ciężka migrena), czy też rzeczywiście cierpi na SM. Pacjent będzie musiał doświadczyć drugiego ostrego pogorszenia się funkcji neurologicznych (ataku), zanim zostanie zdiagnozowany jako pacjent z SM, i będzie mógł rozpocząć ciągłe leczenie przy użyciu czynnika leczniczego dla SM, takiego jak interferon P lub octan glatirameru.
Lekarze stosują obecnie MRI w celu zidentyfikowania uszkodzeń w mózgu i/lub analizy płynu mózgowo-rdzeniowego pod kątem OCB. Jeśli wynik badania MRI świadczy jednoznacznie o obecności uszkodzeń w mózgu lub obecności OCB w CSF lekarz może natychmiast rozpocząć leczenie w celu zapobież enia bezobjawowym uszkodzeniom mózgu. Ostateczna diagnoza SM jest obecnie stawiana dopiero po wystąpieniu drugiego ataku. W przypadku gdy badanie MRI nie dostarcza jednoznacznego wyniku, lub gdy brak jest OCB w CSF pacjentów, nie stawia się diagnozy SM, a leczenie opóźnia się do momentu wystąpienia drugiego ataku.
Opisany tu sposób może być przeprowadzony przy użyciu krwi pobranej od pacjenta, wykazującego ostre pogorszenie się funkcji neurologicznych i podejrzanego o SM. Sposób ten może identyfikować SM dzięki dokonywaniu pomiaru poziomu przeciwciał IgM anty-Glc(a) oraz anty-Glc(a1-4)Glc(a). Jeśli poziom przynajmniej jednego z tych przeciwciał jest znacząco wyższy niż przeciętny poziom przeciwciał w surowicy zdrowych osób, pacjent jest diagnozowany jako pacjent cierpiący na SM, bez potrzeby oczekiwania na drugi atak. Ponadto, szybka diagnoza pozwala na natychmiastowe rozpoczęcie leczenia.
Lekiem stosowanym z wyboru do leczenia SM jest interferon β (np. INFe-1a oraz INFe-1b). Bieżąca ocena skuteczności i wymaganego dawkowania leku oparta jest na ciągłym monitorowaniu obrazu klinicznego ocenianego przy użyciu kilku skal punktacji. Obecnie głównym parametrem klinicznym, użytecznym w prowadzeniu chorego, jest punktacja w skali EDSS i jej zmiana w określonym czasie (np. porównanie punktacji EDSS w odstępach 3-6 miesięcy). Istotnym składnikiem oceny jest poziom zmęczenia i depresji wykazywanych przez pacjenta. Zmęczenie i/lub depresja mogą być objawami SM, ale także choroby autoimmunologicznej, lub też mogą być ubocznym efektem stosowania interferonu β. Identyfikacja przyczyny zmęczenia jest ważna z punktu widzenia prowadzenia dalszego leczenia. Przykładowo, jeśli zmęczenie jest efektem ubocznym stosowania interferonu, lekarz będzie rozważał obniżenie dawki lub nawet zastąpienie interferonu innym lekiem. Jednak jeśli zmęczenie jest wynikiem objawów SM, lekarz będzie musiał rozważyć zwiększenie dawki leku (patrz fig. 2).
Badanie krwi pacjenta i określenie poziomu przedstawionych tu markerów biologicznych, np. przeciwciał IgM anty-Glc(a) i anty-Glc(a1-4)Glc(a) pozwala na dokładne monitorowanie leczenia. Znaczący spadek poziomu przeciwciał wskazuje na to, że pacjent wykazuje prawidłową odpowiedź na podany lek.
Wczesne wykrywanie ataków
W chwili obecnej nie ma sposobu, umożliwiającego przewidywanie momentu wystąpienia ataków u pacjentów z SM. Badanie MRI oraz kliniczna ocena pacjentów może jedynie ujawnić uszkodzenia, które już wystąpiły. Okresowe pomiary poziomu kilku przeciwciał skierowanych przeciwko glikanom (na przykład IgM anty-Glc(a) lub IgM anty-Glc(a1-4)Glc(a)) w krwi pacjenta, przeprowadzane według opisywanego tu sposobu pozwalają lekarzowi rozpoznać nadchodzące ataki w oparciu o wzrost poziomu tych przeciwciał. Poziom tych przeciwciał jest znacząco wyższy w krwi pacjentów z SM w stadium ataków, niż u pacjentów w stadium stabilnym (patrz fig. 7). Po wykryciu wzrostu poziomu badanych przeciwciał, lekarz może rozpocząć agresywne leczenie sterydami prowadzące do redukcji stanu zapalnego i zapobiegające uszkodzeniu mieliny (patrz fig. 3).
Wynalazek dostarcza także sposobów identyfikowania i oceniania osób cierpiących na miażdżycę tętnic, wykazujących podwyższone ryzyko stabilnej lub niestabilnej dusznicy bolesnej, przy użyciu markerów biologicznych będących przeciwciałami swoistych wobec glikanów, a także przy użyciu immobilizowanych glikanów umożliwiających wykrywanie pożądanych komórek.
Niniejszym są rozpatrywane różne struktury glikanowe. Glikany te przedstawiane są albo przy użyciu skróconej postaci nomenklatury węglowodanowej lUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) lub przy użyciu kodu LINEARCODE®, którego zasady opisane są w opracowaniu: Banin E., Neuberger Y., Altshuler Y., Halevi A., Inbar O., Dotan M., oraz Dukler A. (2002) A Novel
PL 210 512 B1
Linear Code Nomenclature for complex Carbohydrates. Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 14(77):127-137. Przekształcenie kodu LINERACODE w lUPAC przedstawiono w tabeli 1. O ile nie jest inaczej zaznaczone, wszystkie struktury glikanowe omawiane w prezentowanym wniosku są połączone (we wskazanym układzie anomerowym α lub β) z nośnikiem fazy stałej (poprzez odpowiedni łącznik), jak opisano w fig. 10A.
Wynalazek zostanie zilustrowany w przedstawionych poniżej przykładach.
P r z y k ł a d 1. Porównanie poziomu przeciwciał antyglikanowych w surowicy pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (SM) i zdrowych osób
Profil dla przeciwciała antyglikanowego (Ig) otrzymywano przy użyciu macierzy GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Izrael, nr kat. 9100). Macierze te konstruowano przy użyciu procedur opisanych w WO00/49412. Porównywano profile przeciwciał antyglikanowych otrzymane dla 40 pacjentów ze stwardnieniem rozsianym oraz dla 40 zdrowych dawców krwi, dopasowanych pod względem wieku.
Wszystkie próbki surowicy testowano na układach GlycoChip® (Glycominds Ltd., Lod, Izrael, nr kat. 9100), które zawierają szereg monosacharydów i oligosacharydów przyłączonych kowalencyjnie do płytki do mikromiareczkowania o zredukowanej objętości (płytki 384-dołkowej). Monosacharydy i oligosacharydy umieszczone na płytce (macierzy) przedstawiono w fig. 4. Przetłumaczenie zapisu w kodzie LineardCodeTM, wykorzystanym do opisu struktury glikanów, na zapis w nomenklaturze lUPAC można znaleźć w tabeli 1.
Surowice pochodzące od zdrowych ochotników oraz od będących również ochotnikami pacjentów z SM, którzy podpisali formularz świadomej zgody, zbierano w opłaszczonych silikonem probówkach próżniowych zawierających żel (Estar Technologies, nr kat. 616603GLV). Surowice oddzielano od komórek krwi i przetrzymywano w postaci zamrożonej w temperaturze -25°C do momentu ponownego wykorzystania. Surowice analizowano w dwóch oddzielnych doświadczeniach, z których każde było powtarzane dwukrotnie w różnych dniach.
Surowice pochodzące od ochotników rozcieńczano (1:20) w TB ST rozporcjowanym (10 μl/dołek) na płytce GlycoChip® przy użyciu automatycznego urządzenia Tecan Genesis Workstation 200 i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 25°C. Na płytce umieszczano cztery powtórzenia dla każdej kombinacji glikanu i surowicy.
Płytki płukano buforem o wysokim stężeniu soli (0,15 M KNa pH 7,2, 2 M NaCl, 0,085 M MgSO4, 0,05% Tween20, 250 μl/dołek) przy użyciu automatycznego urządzenia do płukania płytek (Tecan, PowerWasherTM). Do dołków dodawano ręcznie porcje (10 μl/dołek) biotynylowanego białka A (ICN 62-265, 1 μg/ml w TBST) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 25°C. Płytkę ponownie płukano buforem o wysokim stężeniu soli.
Następnie dodawano ręcznie porcje europu sprzężonego ze streptawidyną (Wallac, AD0062, 1 nl/ml, 10 μl/dołek) i inkubowano w ciemności przez 30 minut w temperaturze 25°C. Powtarzano płukanie płytek buforem o wysokim stężeniu soli, a następnie dodawano do dołków bufor wzmacniający Delfia™ (Wallac, 730232, 10 μl/dołek) i inkubowano płytki przez 30 minut w ciemności. Sygnał fluorescencyjny z dołków odczytywano przy użyciu aparatu Victor 1420 (Wallac) stosując odpowiednie ustawienia czasowe dla pomiaru fluorescencji (emisja 612 nm, wzbudzanie 340 nm).
Profile dla wszystkich badanych pacjentów przedstawiono w fig. 4. Czterdzieści górnych linii (SM) przedstawia poziom przeciwciał antywęglowodanowych w próbkach SM, a czterdzieści dolnych linii (NC) przedstawia poziom przeciwciał antywęglowodanowych w próbkach pochodzących z populacji zdrowych osób kontrolnych. Przedstawione wartości są wartościami absolutnymi, bez uwzględnienia poziomu tła. Ponieważ związane przeciwciała wykrywane są przy użyciu biotynylowanego białka A, które wiąże się z IgG, IgA i IgM, sygnał ten odpowiada całkowitemu wiązaniu się przeciwciał ze wszystkich podtypów IgG, IgA i IgM.
Porównanie wartości średniej i wartości medialnej dla przeciwciał antywęglowodanowych obecnych w populacji SM i w populacji osób zdrowych ujawnia obecność znaczących różnic pomiędzy próbkami pochodzącym od pacjentów z SM i próbek pochodzących z populacji osób zdrowych (patrz fig. 5). Przykładem dużej różnicy dotyczącej tych dwóch grup jest średni sygnał dla glikanu Ga4Gb. Test - t wykazał, że różnica ta jest istotna statystycznie (α=0,05, p<0,001). Innym przykładem może być Ab3(GNb6)ANa (α=0,05, p<0,001). Znaczące statystycznie różnice pomiędzy wartościami mediany dla sygnałów uzyskanych dla populacji SM i populacji osób zdrowych otrzymano w przypadku przeciwciał wiążących się z następującymi glikanami: Glc(a), Glc(a1-4)Glc(a), Glc(a1-4)Glc(e), Glc(e), Gal(P), Glc(p1-4), Glc(p1-4)Glc<P), GlcNAc(e1-4)GlcNAc(e), L-Araf(a), L-Rha(a), Gal(p1-3)[GlcNAc(p1-6)]h GalNAc(a), Gal(p1-4)GlcNAc(a), Gal(e1-3)GalNAc(a), Gal(e1-3)GlcNAc(e), GlcA(P), GlcA(P), Xyl(a).
PL 210 512 B1
Sygnał odpowiadający związanym przeciwciałom w grupie SM jest wyższy, niż sygnał w grupie kontrolnej.
Figura 6 przedstawia różnice pomiędzy średnimi wartościami wiązania przeciwciał antyglikanowych dla różnych populacji.
P r z y k ł a d 2. Różnice w poziomie przeciwciał IgM anty-Glc(a) i anty-Glc(a1-4)Glc(a) w surowicy pacjentów z SM w stadium ataków, w stadium stabilnym, oraz populacji zdrowych osób.
Macierze glikanowe wykorzystywano do wyszukiwania markerów biologicznych wśród zestawu przeciwciał z ludzkiej surowicy wiążących glikany, w celu odróżnienia populacji zdrowych osób od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (SM), oraz odróżnienia pacjentów z SM w stadium zaostrzenia choroby od pacjentów w stadium remisji. Przykład ten wykazuje, że dwa przeciwciała IgM, anty-Glc(a) i anty-Glc(a1-4)Glc(a), wykazują znacząco wyższy poziom u pacjentów z SM niż u zdrowych osób (przy czułości i swoistości wynoszących odpowiednio 60% i 93%), a także u pacjentów z SM w stadium zaostrzenia choroby w porównaniu z pacjentami w stadium remisji (przy czułości i swoistości wynoszących odpowiednio 89%) i 71%)). Przedstawiono również profil przeciwciał antyglikanowych dla populacji osób zdrowych, obejmujący zakres zmienności dla okresu 13 tygodni.
Stabilność profilu przeciwciał antyglikanowych w okresie 13 tygodni dla zdrowych osób była wysoka. Niski poziom przeciwciał IgM anty-Glc(a) i anty-Glc(a1-4)Glc(a) w populacji osób zdrowych, a także wysoki ich poziom u pacjentów z SM i wysoka stabilność przeciwciał antyglikanowych, sugerują, że IgM anty-Glc(a) i anty-Glc(a1-4)Glc(a) mogą służyć jako markery biologiczne dla wczesnej diagnozy, wczesnego przepisywania leków, monitorowania skutków działania leków oraz wczesnego wykrywania ataków.
Wszystkie próbki surowicy testowano przy użyciu GlycoChip® (Glycominds Ltd., Lod, Izrael). Glikany były kowalencyjnie związane z plastikową powierzchnią przy użyciu łącznika, jak opisano wcześniej w WO02/064556. Listę testowanych monosacharydów i oligosacharydów przedstawiono w tabeli 1.
Próbki krwi otrzymywano od zdrowych dawców krwi po podpisaniu formularza świadomej zgody, którego treść uzyskała akceptację komisji etycznych w Belinson Medical Center (Tel-Awiw, Izrael) oraz w Carmel Medical Center (Hajfa, Izrael). Próbki krwi zbierano też od pacjentów z SM przyjmowanych do kliniki SM (Multiple Sclerosis Clinic) w Carmel Medical Center (Hajfa, Izrael). Próbki krwi zbierano do opłaszczonych silikonem probówek próżniowych zawierających żel, w celu oddzielenia surowicy od skrzepu krwi (Estar Technologies). Po skrzepnięciu krwi oddzielano surowicę poprzez wirowanie. Zebraną surowicę przechowywano w postaci zamrożonej w temperaturze -25°C do momentu ponownego użycia.
Objętość wszystkich roztworów dodawanych do macierzy glikanowej wynosiła 10 μl/dołek. Surowicę rozcieńczano (1:20, stężenie wysycające) w buforze TBST (0,15 M Tris-HCl pH 7,2, 0,085 M Mg2SO4, 0,005% Tween 20) zawierającym 1% BSA (Sigma), i umieszczano w porcjach w płytkach macierzy glikanowej przy użyciu automatycznego urządzenia Tecan Genesis Workstation 200, po czym inkubowano przez 60 minut w temperaturze 37°C. Płytki płukano następnie w buforze PBS (250 μl/dołek) zawierającym 0,05% Tween 20 (PBST, Sigma) przy użyciu automatycznego urządzenia do płukania płytek (Tecan, PowerWasherTM). W tym momencie dodawano przy użyciu urządzenia Multidrop 384 (Thermo LabsysteSM) następujące odczynniki rozcieńczone w TBST, zawierającym 1% BSA, i inkubowane następnie przez 60 minut w temperaturze 37°C: w przypadku określania IgG, IgA i IgM - swoiste wobec odpowiednich podtypów biotynylowane kozie przeciwciała skierowane przeciwko ludzkim immunoglobulinom (Jackson, PA, USA) w stężeniu wynoszącym odpowiednio 2,8 μg/ml, 3 μg/ml oraz 0,9 μg/ml, w przypadku określania całkowitego poziomu immunoglobulin (Ig) - biotynylowane białko A (1 μg/ml, ICN Biomedicals). Po płukaniu przy użyciu PBST dodawano do każdego dołka europ sprzężony ze streptawidyną (0,1 μg/ml) rozcieńczony w TBST z 1% BSE, po czym inkubowano w ciemności przez 30 w temperaturze 37°C i płukano w PBST. Do dołków dodawano następnie roztwór wzmacniający Delfia™ i inkubowano płytki w ciemności przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej. Sygnał fluorescencyjny odczytywano przy użyciu urządzenia do sczytywania płytek Victor 1420 (Wallac, Finlandia), stosując odpowiednie ustawienia czasowe dla pomiaru fluorescencji (wzbudzanie 340 nm, emisja 612 nm).
Różnice w poziomie przeciwciał IgM anty-Glc(a) i anty-Glc(a1-4)Glc(a) w surowicy pacjentów z SM w stadium ataków, w stadium stabilnym, oraz populacji zdrowych osób.
Próbki surowicy otrzymywano od pacjentów z SM, przyjmowanych w klinice ambulatoryjnej w celu wykonania rutynowego badania, po podpisaniu przez nich formularza świadomej zgody. W grupie
PL 210 512 B1 pacjentów 80%) stanowiły kobiety, co odpowiadało mniej więcej stosunkowi płci w ogólnej populacji pacjentów z SM. Zgodnie z publikowanymi danymi (Ritchie i wsp., J. Clin. Lab. Anal., 12:363-370, 1998), znacząco wyższy poziom przeciwciał IgM (ale nie IgG lub IgA) obserwowano w surowicy pochodzącej zarówno od zdrowych kobiet, jak i kobiet z SM, w porównaniu z mężczyznami (dane nie przedstawione). Dlatego też ograniczono przeprowadzoną analizę jedynie do kobiet z SM i kobiet zdrowych. Surowice pacjentów z SM badano początkowo pod kątem 54 glikanów (tabela 1), analizując obecność przeciwciał antyglikanowych klasy IgG, IgM i IgA, w celu identyfikacji markerów, które potwierdzałyby diagnozę SM dla pacjentów z pojedynczymi objawami ostrej demielinizacji, oraz identyfikację markerów, które umożliwiałyby różnicowanie między pacjentami w stadium zaostrzenia choroby i pacjentami w stadium remisji. Doświadczenie powtarzano dwukrotnie przy użyciu pięciu spośród 54 glikanów, dla których w początkowych badaniach wykryto pewne różnice w odniesieniu do badanych grup.
Znaleziono powtarzalne i znaczące statystycznie różnice w poziomie przeciwciał IgM antyGlc(a) i anty-Glc(a1-4)Glc(a) między grupą zdrowych osób i pacjentów z SM (fig. 7A), jednak przedstawiane badania nie wykazały obecności znaczących różnic w poziomie IgG lub IgA (dane nie przedstawione). W surowicy obu grup pacjentów z SM stwierdzono obecność znacząco wyższego poziomu przeciwciał IgM anty-Glc(a) i anty-Glc(a1-4)Glc(a), niż w populacji zdrowych osób. Wyznaczono (w sposób arbitralny) optymalną wartość graniczną (odpowiadającą 97 percentylowi dla „zdrowej populacji) stosowaną w celu identyfikowania próbek pozytywnych (powyżej tej wartości) i negatywnych (poniżej tej wartości). Tak więc sygnały odpowiadające wiązaniu przeciwciał anty-Glc(a) pozwoliły zidentyfikować prawidłowo 19 spośród 42 próbek SM (45% czułości) oraz 42 spośród 44 próbek od osób zdrowych (96%) swoistości). Pomiar wiązania przeciwciał skierowanych przeciwko maltozie umożliwiał poprawną identyfikację 48% surowic SM i 95% surowic od osób zdrowych. Zdefiniowanie próbki pozytywnej, jako próbki, dla której otrzymany sygnał przewyższa wartość graniczną zarówno w przypadku testu anty-Glc(a), jak i anty-Glc(a1-4)Glc(a), zwiększa czułość do 60% i pozostawia swoistość na poziomie 93% (tabela 2). Zróżnicowany rozkład przeciwciał anty-Glc(a) i anty-Glc(a1-4)Glc(a) u pacjentów w stadium zaostrzenia choroby i stadium remisji polegał na znacząco wyższym poziomie przeciwciał w tej drugiej grupie (fig. 7B). Nie znaleziono różnicy pomiędzy pacjentami nie leczonymi i pacjentami leczonymi interferonem β (dane nie przedstawione). Przy użyciu wartości granicznej, odpowiadającej 80 percentylowi dla populacji „stabilnego SM, stwierdzono, że analiza wiązania przeciwciał anty-Glc(a) pozwalała zidentyfikować prawidłowo 15 spośród 18 próbek „atakowych (83% czułości), 19 spośród 24 próbek „stabilnych (79% swoistości, przy uznaniu stadium stabilnego jako wolnego od objawów), oraz 42 spośród 44 „zdrowych próbek (95% swoistości). Pomiar wiązania przeciwciał skierowanych przeciwko maltozie umożliwiał prawidłową identyfikację 72% surowic od pacjentów w stadium ataku, 79% surowic od pacjentów „stabilnych, oraz 97% surowic od osób zdrowych. Zdefiniowanie próbki pozytywnej, jako próbki, dla której otrzymany sygnał przewyższa wartość graniczną zarówno w przypadku przeciwciał anty-Glc(a), jak i testu z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko maltozie, prowadzi do otrzymania czułości wynoszącej 89%, oraz swoistości wynoszącej 71% lub 95%, odpowiednio w stosunku do stabilnych pacjentów z SM i osób zdrowych (tabela 3). Wysoka swoistość i czułość przeciwciał IgM anty-Glc(a) i anty-Glc(a1-4)Glc(a) sprawia, że są one skutecznymi narzędziami we wczesnym diagnozowaniu i definiowaniu pacjentów z SM. Fakt, że poziom tych przeciwciał w momencie występowania ataku SM jest znacznie wyższy, niż w stadium stabilnym, czyni je odpowiednimi narzędziami do wczesnego wykrywania i przewidywania ataków u pacjentów z postacią SM-RR (rzutów i remisji).
Stwierdzono wysoką korelację pomiędzy poziomem przeciwciał IgM anty-Glc(a) u kobiet zdiagnozowanych klinicznie jako pacjentki z SM-RR, a wynikiem EDSS u tych kobiet (patrz fig. 8, lewy panel). Nie stwierdzono korelacji pomiędzy EDSS a poziomem przeciwciał IgM anty-Glc(a) w surowicy kobiet zdiagnozowanych klinicznie jako pacjentki z SM-RR, które określono jako negatywne pod względem obecności przeciwciał IgM anty-Glc(a) (patrz fig. 8, lewy panel). Wysoka korelacja wskazuje, że poziom IgM anty-Glc(a) w surowicy może służyć jako molekularny zastępczy marker biologiczny przy ocenie stadium choroby.
Zmienność czasowa poziomu przeciwciał antyglikanowych
Gdy jakikolwiek parametr biologiczny rozważany jest jako zastępczy marker biologiczny, oczywistym warunkiem zastosowania go w tej roli jest brak zmienności tego markera w czasie, w przypadku populacji zdrowych osób. Dlatego analizowano poziom przeciwciał IgG, IgA i IgM anty-L-Rha(a), anty-GlcNAc(a) oraz anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e) (β-celotriozy) w surowicy siedmiu zdrowych ochotniczek przez okres 13 tygodni (fig. 9). Stężenia przeciwciał w surowicy różniły się między poszczegól12
PL 210 512 B1 nymi osobami, lecz były w miarę stabilne na przestrzeni czasu. Przykładowo, surowice #9161 i #9162 wykazywały wyjątkowo wysokie i stabilne w czasie poziomy przeciwciał, odpowiednio IgA antyGlcNAc(a) i anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e), lecz względnie prawidłowe poziomy przeciwciał IgA antyL-Rha(a) oraz przeciwciał IgG i IgM. Kiedy obserwuje się zmiany poziomu przeciwciał, są one często stopniowe i przebiegają na przestrzeni kilku tygodni (np. w przypadku surowicy #9162, IgA antyGlc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e)), lecz mogą to być również zmiany nagłe (np. w przypadku surowicy #9172, IgM anty-L-Rha(a), gdzie poziom przeciwciała nagle wzrasta pomiędzy tygodniem 4 i 5, a następnie powoli powraca do podstawowego poziomu).
P r z y k ł a d 3. Profil przeciwciał antyglikanowych dla populacji zdrowych osób
Określano całkowite wiązanie przeciwciał Ig (wykrywanie przy użyciu białka A) dla 72 surowic wobec 34 mono- i oligosacharydów (fig. 11 i tabela 5) oraz wiązanie IgG, IgA, IgM z 200 surowic dla 6 mono- i oligosacharydów (fig. 15A-C). Najsilniejszy sygnał stwierdzono w przypadku przeciwciał skierowanych przeciwko GlcNAc(a) oraz L-Rha(a), podczas gdy niższe poziomy obserwowano w przypadku sprzężonych w pozycji β4 oligosacharydów glukozy, GlcNAc(e), GlcNAc(e1-4)GlcNAc(e), Gal(a) oraz Gal(a1-3)Gal(e1-4)GlcNAc(e). Wynik ten jest zgodny z opublikowanymi wcześniej danymi, przedstawiającymi rozkład przeciwciał antyglikanowych w dostępnej komercyjnie puli ludzkich surowic (WO02/064556). Profil przeciwciał antyglikanowych dla klas IgG i IgA przypominał całkowity profil przeciwciał antyglikanowych, podczas gdy w przypadku IgM był on niższy i bardziej jednorodny w odniesieniu do różnych glikanów. Przeciwciała antyglikanowe populacji zdrowych osób wydawały się mieć rozkład odpowiadający normalnemu rozkładowi logarytmicznemu (patrz fig. 15A-15C). Jest oczywiste, że istnieje znaczna zmienność w poziomie przeciwciał antyglikanowych pomiędzy poszczególnymi osobami badanej populacji, który to fakt sugeruje występowanie indywidualnych profilów przeciwciał antyglikanowych, jednak ogranicza poszukiwania markerów do przeciwciał antyglikanowych obecnych w małych ilościach.
Glikany immobilizowane na kulkach były również wykorzystywane do oczyszczania przeciwciał skierowanych przeciwko sprzężonym w pozycji β4 oligosacharydom glukozy i L-Rha(a). Profile tych przeciwciał oraz ich swoistość przedstawiono w fig. 13, 14A i 14B.
P r z y k ł a d 4. Zastosowanie przeciwciał antyglikanowych do różnicowania między pacjentami z miażdżycą tętnic i wrażliwymi płytkami (pacjentów o wysokim ryzyku), a pacjentami z miażdżycą tętnic i stabilnymi płytkami (pacjentami o niskim ryzyku)
Poziom przeciwciał antyglikanowych w surowicy pacjentów z miażdżycą tętnic i wrażliwymi płytkami porównywano z poziomem przeciwciał glikanowych w surowicy pacjentów z miażdżycą tętnic i stabilnymi płytkami, a także z osobami bez miażdżycy tętnic.
Miażdżyca tętnic jest jedną z głównych przyczyn chorób i śmiertelności w krajach rozwiniętych. Jest to układowa choroba ścian naczyń krwionośnych, która prowadzi do rozwoju płytek miażdżycowych w ściankach naczyń krwionośnych. Niektóre z tych płytek stają się później wrażliwe na pęknięcie, co powoduje zakrzepy krwi prowadzące do zawałów serca lub udaru.
Głównymi składnikami płytek miażdżycowych są proteoglikany, lipidy, komórki mięśniowe oraz białe krwinki (limfocyty T i makrofagi). Ponadto, miażdżyca tętnic jest również postrzegana jako choroba autoimmunologiczna, w której jednym z czynników inicjujących jest reakcja krzyżowa pomiędzy przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenom bakteryjnym i antygenami obecnymi w ściankach naczyń krwionośnych.
Ważnym momentem w rozwoju miażdżycy tętnic jest przejście ze stadium stabilnych płytek (SP - ang. stable plaques), związanych z niskim ryzykiem, do zapalnych płytek wrażliwych (VP - ang. vulnerable plaques), które związane są z wysokim ryzykiem. Rozróżnienie pomiędzy SP i VP jest problematyczne od strony klinicznej, gdyż ostateczne zróżnicowanie może być dokonane jedynie w wyniku pośmiertnej autopsji.
Próbki surowicy były dostarczane przez dr Jacoba George'a z Zakładu Kardiologii Centrum Medycznego w Teł Awiwie (Tel-Aviv Medical Center) w Izraelu. Wszyscy pacjenci byli mężczyznami, nie cierpiącymi na cukrzycę, w wieku od 30 do 69 lat. Testowano 39 próbek surowicy pochodzących od pacjentów z następujących grup:
Niestabilna dusznica bolesna - 13 pacjentów z miażdżycą tętnic, scharakteryzowanych jako pacjenci z ostrą chorobą wieńcową (zawał mięśnia sercowego z załamkiem Q lub bez załamka Q). Uważa się, że oba typy zawałów mięśnia sercowego rozwijają się z pęknięcia wrażliwych płytek miażdżycowych. Grupa z niestabilną dusznicą bolesną obejmuje pacjentów z ostrą chorobą wieńcową, przyjętych z powodu bólu w piersiach i zmian w EKG lub podwyższonego markera sercowego. Narzekali oni
PL 210 512 B1 na niedawne (<3 dni) wystąpienie dusznicy bolesnej i byli poddani ciągłemu monitoringowi przy użyciu telemetrycznego badania EKG. Zarejestrowano przynajmniej jeden epizod dusznicy bolesnej spoczynkowej lub jeden epizod trwający powyżej 20 minut w ciągu ostatnich 48 godzin, którym towarzyszył wzrost poziomu kinazy kreatynowej, MB lub troponiny. Członkowie tej grupy byli poddani angiografii wieńcowej (cewnikowaniu), która udokumentowała obecność wieńcowej miażdżycy tętnic.
Stabilna dusznica bolesna - 13 pacjentów z miażdżycą tętnic, scharakteryzowanych jako pacjenci ze stabilną dusznicą bolesną. Członkowie tej grupy byli poddani angiografii wieńcowej (cewnikowaniu), która udokumentowała obecność wieńcowej miażdżycy tętnic. Nie stwierdzono zmian w badaniu EKG, ani wzrostu w poziomie kinazy kreatynowej, MB lub troponiny.
Bez płytek - 13 pacjentów z prawidłowymi naczyniami wieńcowymi. członkowie tej grupy nie wykazywali objawów wieńcowej miażdżycy tętnic w angiografii wieńcowej (cewnikowania).
Profil przeciwciał antyglikanowych otrzymywano przy użyciu macierzy GlycoChip™ (Glycominds, Ltd., Lod, Izrael, nr kat. 9100) skonstruowanych przy użyciu procedur opisanych w WO00/49412. wszystkie próbki surowicy testowano przy użyciu płytek GlycoChip™ (Glycominds, Ltd., Lod, Izrael, nr kat. 9100), które zawierały szereg związanych kowalencyjnie monosacharydów i oligosacharydów na płytce do mikromiareczkowania o zredukowanej objętości (płytce 384-dołkowej). Listę monosacharydów i oligosacharydów zawartych w tej macierzy, a także ich numery seryjne, przedstawiono w tabeli 4.
Surowice były rozcieńczane (1:20) w TBST i rozporcjowywane na płytkę GlycoChip™ przy użyciu automatu Tecan Genesis Workstation 200 (10 μl/dołek), a następnie inkubowane przez 30 minut w temperaturze 25°C. Każda kombinacja glikanu i surowicy na płytce była testowana osiem razy.
Płytki płukano buforem o wysokim stężeniu soli (0,15 M KNa pH 7,2, 2 M NaCl, 0,085 M MgSO4, 0,05% Tween20, 250 μl/dołek) przy użyciu automatycznego urządzenia do płukania płytek (Tecan, PowerWasher™). Do dołków dodawano ręcznie porcje (10 μl/dołek) biotynylowanego koziego przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkim IgG, IgM lub IgA (Jackson, PA, USA, 1 μg/ml TBST) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 25°C. Płytkę ponownie płukano buforem o wysokim stężeniu soli.
Następnie dodawano ręcznie porcje europu sprzężonego ze streptawidyną (Wallac, AD0062, μ/ml, 10 μl/dołek) i inkubowano w ciemności przez 30 minut w temperaturze 25°C. Powtarzano płukanie płytek buforem o wysokim stężeniu soli, a następnie dodawano do dołków bufor wzmacniający Delfia™ (Wallac, 730232, 10 μl/dołek) i inkubowano płytki przez 30 minut w ciemności. Sygnał fluorescencyjny z dołków odczytywano przy użyciu aparatu Victor 1420 (Wallac) stosując odpowiednie ustawienia czasowe dla pomiaru fluorescencji (emisja 612 nm, wzbudzanie 340 nm).
Sygnał dla wiązania glikanu, jaki otrzymano dla grupy „Bez płytek, wykorzystano do wyznaczenia wartości granicznych dla każdego glikanu, powyżej których klasyfikowano pacjentów jako pozytywnych. Owe wartości graniczne określano jako średnią wartość sygnału dla grupy „Bez płytek plus jedno lub dwa odchylenia standardowe. Stosując tę definicję zidentyfikowano szereg glikanów, które miały pewną moc różnicowania pomiędzy pacjentami z różnych grup (patrz poniżej). „Różnicowanie oparte na danym glikanie zostało zdefiniowane jako wykrywające przynajmniej 50% (7/13) próbek pozytywnych w grupie z niestabilną dusznicą bolesną lub w grupie ze stabilną dusznicą bolesną, oraz lub mniej pozytywnych próbek w grupie „Bez płytek.
Figura 16A jest macierzą przedstawiającą glikany wykorzystane do analizowania surowic pacjentów cierpiących na niestabilną lub stabilną dusznicę bolesną (struktury glikanów opisano w tabeli 4). Glikany, dla których stwierdzono znaczące różnice w poziomie przeciwciał w różnych grupach pacjentów, oznaczono wypełnionymi kwadratami. Dla wartości granicznej (odpowiadającej wartości średniej plus dwa odchylenia standardowe) „różnicowanie osiągnięto w przypadku wiązania IgA do dwóch różnych glikanów. Jeden glikan umożliwiał różnicowanie w przypadku przeciwciał IgG, lecz nie osiągnięto różnicowania w przypadku przeciwciał IgM. Pojedyncze glikany dające najlepsze różnicowanie przedstawiono poniżej:
| Glikany | Wynik | Niestabilna dusznica bolesna | Stabilna dusznica bolesna | Bez płytek |
| Ab | Pozytywny | 7 | 5 | 0 |
| Negatywny | 6 | 8 | 13 | |
| Fb | Pozytywny | 1 | 9 | 1 |
| Negatywny | 12 | 4 | 12 |
PL 210 512 B1
Niektóre glikany, które nie zostały określone jako „różnicujące, wykazywały wciąż pewien poziom różnicowania. W przypadku wykorzystywania kombinacji takich glikanów można było poprawić różnicowanie, osiągając lepszy wynik niż w przypadku pojedynczych glikanów. Glikany te przedstawiono poniżej:
| Glikany (LinearCode) | Wynik | Niestabilna dusznica bolesna | Stabilna dusznica bolesna | Bez płytek |
| Aa | Pozytywny | 6 | 2 | 0 |
| Negatywny | 7 | 11 | 13 | |
| Xb | Pozytywny | 1 | 6 | 0 |
| Negatywny | 12 | 7 | 13 | |
| Fa | Pozytywny | 5 | 3 | 1 |
| Negatywny | 8 | 10 | 12 | |
| A[3S]b | Pozytywny | 1 | 6 | 1 |
| Negatywny | 12 | 7 | 12 | |
| GNb4GNb | Pozytywny | 5 | 0 | 1 |
| Negatywny | 8 | 13 | 12 |
Figura 16B stanowi graficzne przedstawienie poziomów przeciwciał przeciwko glikanom #2 i #29 w trzech grupach pacjentów. Słupek odpowiada sygnałom obejmującym 50% populacji. Gruba i cienka linia wewnątrz słupka odpowiadają wartościom średniej i mediany. Dolna granica słupka wskazuje 25 percentyl, a górna granica wskazuje 75 percentyl. Kreski powyżej i poniżej słupków wskazują odpowiednio 90 i 10 percentyl.
Figura 17 jest histogramem przedstawiającym liczbę próbek pozytywnych względem przeciwciał anty-IgA skierowanych przeciwko glikanowi #2 lub glikanowi #29 (w trzech grupach pacjentów).
Figura 18A jest histogramem przedstawiającym rozkład poziomów przeciwciał skierowanych przeciwko glikanom #2 i #15 w trzech grupach pacjentów. Słupek odpowiada sygnałom obejmującym 50% populacji. Gruba i cienka linia wewnątrz słupka odpowiadają wartościom średniej i mediany. Dolna granica słupka wskazuje 25 percentyl, a górna granica wskazuje 75 percentyl. Kreski powyżej i poniżej słupków wskazują odpowiednio 90 i 10 percentyl.
Figura 18B jest histogramem przedstawiającym liczbę próbek pozytywnych względem przeciwciał anty-IgA skierowanych przeciwko glikanowi #2 lub glikanowi #15 (w trzech grupach pacjentów). Dla wartości granicznej (odpowiadającej wartości średniej plus dwa odchylenia standardowe) „różnicowanie osiągnięto w przypadku wiązania IgA do sześciu różnych glikanów. Poziomy przeciwciał IgG i IgM nie różniły się w trzech badanych grupach.
Różnicowanie osiągnięte przy użyciu kombinacji glikanów przedstawiono poniżej (zastosowano Aa ponieważ liczba próbek pozytywnych w grupie ze stabilną dusznicą bolesną była niższa, niż w przypadku stosowania Ab, co poprawiało różnicowanie względem grupy z niestabilną dusznicą bolesną):
| Glikany (LinearCode) | Wynik | Niestabilna dusznica bolesna | Stabilna dusznica bolesna | Bez płytek |
| Aa oraz GNb4Nb | Pozytywny dla jednego z glikanów | 8 | 2 | 1 |
| Negatywny dla obu | 5 | 11 | 12 | |
| Aa oraz Ga4Ga | Pozytywny dla jednego z glikanów | 8 | 5 | 0 |
| Negatywny dla obu | 5 | 8 | 13 |
Swoistość i czułość testu wykrywającego „niestabilną dusznicę bolesną przy użyciu Aa oraz GNb4GNb wynosiły więc odpowiednio 62% (8/13) oraz 88% (23/26).
PL 210 512 B1
Zastosowanie kombinacji trzech glikanów, Aa, GNb4GNb oraz Fb, umożliwiło określenie swoistości także dla grupy ze stabilną dusznicą bolesną, która wynosiła w tym wypadku 75% (9/13). Wynika to z faktu, że Fb wykrywa głównie „stabilną dusznicę bolesną. Wartości swoistości i czułości dla testu kombinacyjnego podsumowano w fig. 19.
Wyniki te wykazują, że kombinację glikanów (Gal(a), GlcNAc(e1-4)GlcNAc(e) oraz Fu(e)) można skutecznie stosować do różnicowania pomiędzy populacjami ze stabilną i niestabilną dusznicą bolesną, osiągając swoistość wynoszącą 62%) oraz czułość wynoszącą 88%). Wyniki te pokazują, że możliwe jest opracowanie markera biologicznego, opartego na przeciwciałach IgA wiążących glikany, który różnicuje pacjentów z niestabilną i stabilną dusznicą bolesną.
P r z y k ł a d 5. Zastosowanie przeciwciał antyglikanowych do różnicowania między pacjentami z miażdżycą tętnic i wrażliwymi płytkami (pacjentów o wysokim ryzyku), a pacjentami z miażdżycą tętnic i stabilnymi płytkami (pacjentami o niskim ryzyku)
Poziom przeciwciał antyglikanowych w surowicy pacjentów z miażdżycą tętnic i wrażliwymi płytkami porównywano z poziomem przeciwciał glikanowych w surowicy pacjentów z miażdżycą tętnic i stabilnymi płytkami, a także z osobami bez miażdżycy tętnic.
Miażdżyca tętnic jest jedną z głównych przyczyn chorób i śmiertelności w krajach rozwiniętych. Jest to układowa choroba ścianek naczyń krwionośnych, która prowadzi do rozwoju płytek miażdżycowych w ściankach naczyń krwionośnych. Niektóre z tych płytek stają się później wrażliwe na pęknięcie, co powoduje zakrzepy krwi prowadzące do zawałów serca lub udaru.
Głównymi składnikami płytek miażdżycowych są proteoglikany, lipidy, komórki mięśniowe oraz białe krwinki (limfocyty T i makrofagi). Ponadto, miażdżyca tętnic jest również postrzegana jako choroba autoimmunologiczna, w której jednym z czynników inicjujących jest reakcja krzyżowa pomiędzy przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenom bakteryjnym i antygenami obecnymi w ściankach naczyń krwionośnych.
Ważnym momentem w rozwoju miażdżycy tętnic jest przejście ze stadium stabilnych płytek (SP - ang. stable plaques), związanych z niskim ryzykiem, do zapalnych płytek wrażliwych (VP - ang. vulnerable plaques), które związane są z wysokim ryzykiem. Rozróżnienie pomiędzy SP i VP jest problematyczne od strony klinicznej, gdyż ostateczne zróżnicowanie może być dokonane jedynie w wyniku pośmiertnej autopsji.
Próbki surowicy były dostarczane przez dr Jacoba George'a z Zakładu Kardiologii Centrum Medycznego w Tel Awiwie (Tel-Aviv Medical Center) w Izraelu. Wszyscy pacjenci byli mężczyznami, nie cierpiącymi na cukrzycę, w wieku od 30 do 69 lat. Testowano 72 próbek surowicy pochodzących od pacjentów z następujących grup:
Niestabilna dusznica bolesna - 24 pacjentów z miażdżycą tętnic, scharakteryzowanych jako pacjenci z ostrą chorobą wieńcową (zawał mięśnia sercowego z załamkiem Q lub bez załamka Q). Uważa się, że oba typy zawałów mięśnia sercowego rozwijają się z pęknięcia wrażliwych płytek miażdżycowych. Grupa z niestabilną dusznicą bolesną obejmuje pacjentów z ostrą chorobą wieńcową, przyjętych z powodu bólu w piersiach i zmian w EKG lub podwyższonego markera sercowego. Narzekali oni na niedawne (<3 dni) wystąpienie dusznicy bolesnej i byli poddani ciągłemu monitoringowi przy użyciu telemetrycznego badania EKG. Zarejestrowano przynajmniej jeden epizod dusznicy bolesnej spoczynkowej lub jeden epizod trwający powyżej 20 minut w ciągu ostatnich 48 godzin, którym towarzyszył wzrost poziomu kinazy kreatynowej, MB lub troponiny. Członkowie tej grupy byli poddani angiografii wieńcowej (cewnikowaniu), która udokumentowała obecność wieńcowej miażdżycy tętnic.
Stabilna dusznica bolesna - 24 pacjentów z miażdżycą tętnic, scharakteryzowanych jako pacjenci ze stabilną dusznicą bolesną. Członkowie tej grupy byli poddani angiografii wieńcowej (cewnikowaniu), która udokumentowała obecność wieńcowej miażdżycy tętnic. Nie stwierdzono zmian w badaniu EKG, ani wzrostu w poziomie kinazy kreatynowej, MB lub troponiny.
Bez płytek - 24 pacjentów z prawidłowymi naczyniami wieńcowymi, członkowie tej grupy nie wykazywali objawów wieńcowej miażdżycy tętnic w angiografii wieńcowej (cewnikowania).
Profil przeciwciał antyglikanowych otrzymywano przy użyciu macierzy GlycoChip™ (Glycominds, Ltd., Lod, Izrael, nr kat. 9100) skonstruowanych przy użyciu procedur opisanych w WOOO/49412. wszystkie próbki surowicy testowano przy użyciu płytek GlycoChip™ (Glycominds, Ltd., Lod, Izrael, nr kat. 9100), które zawierały szereg związanych kowalencyjnie monosacharydów i oligosacharydów na płytce do mikromiareczkowania o zredukowanej objętości (płytce 384-dołkowej). Listę monosacharydów i oligosacharydów zawartych w tej macierzy, a także ich numery seryjne, przedstawiono w tabeli 4.
PL 210 512 B1
Surowice były rozcieńczane (1:20) w TBST i rozporcjowywane na płytkę GlycoChipTM przy użyciu automatu Tecan Genesis Workstation 200 (10 μl/dołek), a następnie inkubowane przez 30 minut w temperaturze 25°C. Każda kombinacja glikanu i surowicy na płytce była testowana osiem razy.
Płytki płukano buforem o wysokim stężeniu soli (0,15 M KNa pH 7,2, 2 M NaCl, 0,085 M MgSO4, 0,05% Tween20, 250 μl/dołek), przy użyciu automatycznego urządzenia do płukania płytek (Tecan, Power Washer™). Do dołków dodawano ręcznie porcje (10 μl/dołek) biotynylowanego koziego przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiemu IgA (Jackson, PA, USA, 1 μg/ml TBST) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 25°C. Płytkę ponownie płukano buforem o wysokim stężeniu soli.
Następnie dodawano ręcznie porcje europu (Europium) sprzężonego ze streptawidyną (Wallac, AD0062, 1 μ/ml, 10 μl/dołek) i inkubowano w ciemności przez 30 minut w temperaturze 25°C. Powtarzano płukanie płytek buforem o wysokim stężeniu soli, a następnie dodawano do dołków bufor wzmacniający Delfia™ (Wallac, 730232, 10 μl/dołek) i inkubowano płytki przez 30 minut w ciemności. Sygnał fluorescencyjny z dołków odczytywano przy użyciu aparatu Victor 1420 (Wallac) stosując odpowiednie ustawienia czasowe dla pomiaru fluorescencji (emisja 612 nm, wzbudzanie 340 nm).
Wartość graniczną obliczano korzystając z wartości 80 percentyla dla populacji osób zdrowych. Stosując tę definicję zidentyfikowano szereg glikanów, które wykazywały pewną zdolność różnicowania pomiędzy badanymi grupami pacjentów (patrz poniżej). „Różnicowanie oparte na danym glikanie zostało zdefiniowane jako wykrywające przynajmniej 50% (12/24) próbek pozytywnych w grupie z niestabilną dusznicą bolesną lub w grupie ze stabilną dusznicą bolesną, oraz 5 lub mniej pozytywnych próbek w grupie „Bez płytek.
| Glikany (LinearCode) | Niestabilna dusznica bolesna | Stabilna dusznica bolesna | Bez płytek | |
| Ga4Ga | Pozytywne % Pozytywnych | 12 | 2 | 5 |
| 52 | 8 | 21 | ||
| Gb | Pozytywne % Pozytywnych | 19 | 10 | 5 |
| 83 | 42 | 21 | ||
| ANa | Pozytywne % Pozytywnych | 13 | 8 | 5 |
| 57 | 33 | 21 | ||
| ANb | Pozytywne % Pozytywnych | 15 | 8 | 5 |
| 65 | 33 | 21 | ||
| GNb4GNb | Pozytywne %) Pozytywnych | 13 | 8 | 5 |
| 57 | 33 | 21 | ||
| Xa | Pozytywne % Pozytywnych | 21 | 7 | 5 |
| 100 | 29 | 21 |
Wyniki te wykazują, że kombinację glikanów Glc(a1-4)Glc(a), Glc(e), GalNAc(a), GalNAc(e), GlcNAc(e1-4)GlcNAc(e) oraz Xyl(e) można skutecznie stosować do różnicowania pomiędzy populacjami ze stabilną i niestabilną dusznicą bolesną. Wyniki te wskazują, że możliwe jest opracowanie markera biologicznego, opartego na przeciwciałach IgA wiążących glikany, który różnicować będzie pacjentów z niestabilną i stabilną dusznicą bolesną.
P r z y k ł a d 6. Wiązanie komórek CD4+ przez glikany immobilizowane na stałym podłożu
Badano wiązanie komórek CD4+, pochodzących od 7 zdrowych osób, przez fragmenty glikanów immobilizowane na mikromacierzy.
Materiały i metody
Od każdej z 7 badanych osób pobierano 20 ml świeżej krwi przy użyciu probówek z EDTA o objętości 10 ml. Próbki krwi obwodowej poddawano następnie wirowaniu (230 x g, 900 obrotów na minutę, przez 10 minut w temperaturze pokojowej). Osocze odrzucano a górne 2 ml z frakcji komórkowej przenoszono do probówki o objętości 15 ml. W celu wzbogacenia preparatu w komórki CD4+, do probówek dodawano 10 μl odczynnika RosetteSep i inkubowano w temperaturze pokojowej
PL 210 512 B1 przez 20 minut. Próbki rozcieńczano dwukrotnie w buforze PBS zawierającym 2% FCS, a następnie pod zawiesinę komórek wprowadzano warstwę Ficollu (5 ml) przy użyciu szklanej pipety Pasteura.
Probówki wirowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, przy 2400 obrotach na minutę (około 700 x g), z wyłączonym układem hamulcowym wirówki. Po wirowaniu wyjmowano ostrożnie probówki z wirówki. Górną warstwę usuwano ostrożnie przy użyciu sterylnej pipety, pozostawiając nienaruszoną warstwę limfocytów na granicy faz. Frakcję limfocytów przenoszono do czystej probówki przy użyciu sterylnej pipety, po czym probówkę tę wypełniano całkowicie buforem PBS z 2% FCS. Komórki były dwukrotnie płukane poprzez wirowanie przez 10 minut przy 1000 obrotach na minutę(230 x g), a następnie zawieszane w buforze PBS z 2% FCS.
Komórki rozcieńczano (1:10) w roztworze Turk i zliczano. Po zliczeniu komórek rozcieńczano je do osiągnięcia gęstości 5 x 106 komórek/ml w pożywce RPMI/1640 wzbogaconej 2% FCS, a następnie umieszczano w 24-dołkowej płytce (1 ml/dołek). Zawiesiny komórek inkubowano przez noc w inkubatorze (37°C, 5% CO2, wilgotność 95%).
W celu przeprowadzenia analizy FACS zawieszano 250000 komórek w 1 ml buforu do FACS, a następnie wirowano przez 10 minut w temperaturze 4°C, przy 2000 obrotów na minutę. Supernatant odrzucano, a komórki zawieszano ponownie w 50 μl buforu do FACS i znakowano przeciwciałem anty-CD4 (5 μ^. Komórki inkubowano w lodzie przez 30 minut, chroniąc je przed światłem. Następnie dodawano 1 ml schłodzonego buforu do FACS i wirowano przez 10 minut w temperaturze 4°C, przy 2000 obrotów na minutę. Komórki zawieszano ponownie w 300 μl buforu do FACS, trzymano w lodzie i analizowano w urządzeniu do FACS.
Płytki GlycoChip umieszczano w statywach do preparatów mikroskopowych w plastikowych pojemnikach, wyłożonych wilgotną bibułą w celu utrzymywania odpowiedniej wilgotności. Zawiesinę komórek nakraplano (1,2 μl/dołek) na płytkę i inkubowano przez godzinę w inkubatorze (37°C, 5% CO2, wilgotność 95%). Po inkubacji umieszczano płytki (odwrócone wierzchem do dołu) w pojemniku do wirowania (z buforem PBS). Płytki GlycoChip wirowano przez dwie minuty przy 700 obrotach na minutę (najniższa liczba obrotów, około 50 x g). Płytki oglądano pod mikroskopem i utrwalano w roztworze formaldehydu (3,7%) w PBS przez przynajmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie płukano płytki trzy razy w DDW i suszono na powietrzu.
Przygotowywano roztwór jodku propidu w PBS i dodawano do płytek (1,2 μl/dołek). Płytki inkubowano następnie przez 15 minut w wilgotnych warunkach, a następnie delikatnie przemywano trzy razy, zanurzając je w DDW. Płytki suszono na powietrzu w ciemności i skanowano w urządzeniu do skanowania płytek, stosując ustawienia odpowiednie dla jodku propidu (wzbudzanie 535 nm, emisja 655 nm). Analizowano otrzymany obraz i określano gęstości komórek.
Wyniki
Glikany i kontrole zastosowane w analizie wiązania przedstawiono w fig. 20, prezentowanej poniżej. Struktury glikanów przedstawione są przy użyciu kodu LinearCode™ (patrz objaśnienia w tabeli 1).
W figurze 20 przedstawiono wykres prezentujący profil wiązania komórek CD4+ od jednej badanej osoby przez różne glikany. Zaznaczono wartość wiązania (wyrażoną w DLU/mm2) dla każdego glikanu i każdej kontroli. W fig. 21A przedstawiono wiązanie komórek CD4+ przez glikany i kontrole dla siedmiu badanych osób. Przedstawiono tam wartość mediany dla względnej wartości fluorescencji otrzymanej dla komórek CD4+ od siedmiu badanych osób.
Wyniki te wskazują, że wiązanie komórek CD4+ przez poszczególne glikany wykazuje pewne różnice. Najsilniejsze wiązanie stwierdzono dla następujących glikanów, uszeregowanych według względnego powinowactwa i zapisanych w kodzie LinearCode: Nna3Ab4(Fa3)GNb > Mb4Gb > GNb4GNb > Ma3Ma > Ab6Ab. Stwierdzono również wiązanie komórek CD4+ przez glikany z końcowymi resztami mannozy lub resztami sjalowymi (Lewis X). Wykrywano także różnice między badanymi osobami, dotyczące wiązania komórek CD4+ przez poszczególne glikany.
Inne postaci realizacji
Choć wynalazek ten został przedstawiony wraz z jego szczegółowym opisem, to opis ten ma jedynie charakter ilustracyjny i nie ogranicza zakresu wynalazku, wyznaczonego przez załączone zastrzeżenia. Tak więc inne aspekty, korzyści i modyfikacje mieszczą się również w zakresie przedstawionych poniżej zastrzeżeń.
Claims (25)
1. Sposób diagnozowania stwardnienia rozsianego u osobnika, znamienny tym, że obejmuje wykrywanie w otrzymanej od osobnika, testowanej próbce przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(a) oraz porównanie poziomów tego przeciwciała w testowanej próbce z prawidłową próbką kontrolną, przy czym podniesiony poziom przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(a) w wyżej wskazanej testowanej próbce, w porównaniu z poziomem tego przeciwciała w prawidłowej próbce kontrolnej wskazuje na obecność stwardnienia rozsianego;
przez co diagnozuje się stwardnienie rozsiane u tego osobnika.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto wykrywanie co najmniej jednego dodatkowego przeciwciała wybranego z grupy obejmującej przeciwciało anty-Glc(a), przeciwciało anty-Glc(a1-4)Glc(e), przeciwciało anty-Glc(e), przeciwciało anty-Gal(e), przeciwciało anty-Glc(e14)Glc-(e1-4)Glc(e), przeciwciało anty-GlcNAc(e1-4)GlcNAc(e), przeciwciało anty-L-Araf(a), przeciwciało anty-L-Rha(a), przeciwciało anty-Gal(e1-3)[GlcNAc(e1-6)]GalNAc(1), przeciwciało anty-Gal(e1-4)GlcNAc(a), przeciwciało anty-Gal(e1-3)GalNAc(a), przeciwciało anty-Gal(e1-3)GlcNAc(e), przeciwciało anty-GlcA(e) i przeciwciało anty-Xyl(a), oraz porównanie poziomu tego co najmniej jednego dodatkowego przeciwciała w testowanej próbce z poziomami co najmniej jednego dodatkowego przeciwciała w prawidłowej próbce kontrolnej, przy czym podniesiony poziom wyżej wskazanego dodatkowego przeciwciała w testowanej próbce w porównaniu z poziomem tego przeciwciała w prawidłowej próbce kontrolnej wskazuje na obecność stwardnienia rozsianego.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że obejmuje wykrywanie co najmniej trzech dodatkowych przeciwciał.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że obejmuje wykrywanie co najmniej pięciu dodatkowych przeciwciał.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że co najmniej jednym dodatkowym przeciwciałem jest przeciwciało anty-Glc(a).
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbka kontrolna otrzymywana jest z populacji obejmującej osoby, u których nie występuje stwardnienie rozsiane.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że testowana próbka jest płynem biologicznym.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że płynem biologicznym jest pełna krew, surowica, osocze, płyn z rdzenia kręgowego, mocz lub ślina.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że płynem biologicznym jest surowica.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że osobnikiem jest kobieta.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że osobnikiem jest mężczyzna.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciałem anty-Glc(a1-4)Glc(a) jest przeciwciało typu IgM.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciałem anty-Glc(a1-4)Glc(a) jest przeciwciało typu IgA.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciałem anty-Glc(a1-4)Glc(a) jest przeciwciało typu IgG.
15. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że przeciwciałem anty-Glc(a) jest przeciwciało typu IgM.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że diagnoza jest wczesną diagnozą stwardnienia rozsianego.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę kontrolną otrzymuje się od osób, u których nieobecność stwardnienia rozsianego określa się w oparciu o rozszerzoną skalę niewydolności ruchowej (EDSS) lub w oparciu o obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI).
18. Zestaw do diagnozowania stwardnienia rozsianego, znamienny tym, że składa się z: pierwszego odczynnika, który swoiście wiąże się z przeciwciałem anty-Glc(a1-4)Glc(a) przez oddziaływanie antygen - przeciwciało; oraz drugiego odczynnika, który swoiście wiąże się z drugim przeciwciałem przez oddziaływanie antygen - przeciwciało, przy czym to drugie przeciwciało jest wybrane z grupy składającej się z przeciwciała anty-Glc(a), przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(e), przeciwciała anty-Glc(e), przeciwciała anty-Gal(e), przeciwciała anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e), przeciwciała anty-GlcNAc(e1-4)GlcNAc(e), przeciwciała anty-L-Araf(a), przeciwciała anty-L-Rha(a), przeciwciała anty-Gal(e1-3)[GlcNAc(e1-6)]GalNAc(a),
PL 210 512 B1 przeciwciała anty-Gal(e1-4)GlcNAc(a), przeciwciała anty-Gal(e1-3)GalNAc(a), przeciwciała anty-Gal(e1-3)GlcNAc(e), przeciwciała anty-GlcA(e) i przeciwciała anty-Xyl(a), przy czym odczynniki są połączone kowalencyjnie ze stałym podłożem końcem redukującym.
19. Zestaw według zastrz. 18, znamienny tym, że odczynniki swoiście wykrywają przeciwciało typu IgM.
20. Podłoże stałe do diagnozowania stwardnienia rozsianego, znamienne tym, że składa się z odczynnika swoiście wiążącego się z przeciwciałem swoistym wobec Glc(a1-4)Glc(a) przez oddziaływanie antygen - przeciwciało, przy czym odczynnik jest połączony kowalencyjnie ze stałym podłożem końcem redukującym.
21. Podłoże stałe do diagnozowania stwardnienia rozsianego, znamienne tym, że składa się z odczynnika swoiście wiążącego się z przeciwciałem swoistym wobec Glc(a1-4)Glc(a) przez oddziaływanie antygen - przeciwciało oraz dodatkowego odczynnika swoiście wiążącego się z przeciwciałem wybranym z grupy składającej się z przeciwciała anty-Glc(a), przeciwciała anty-Glc(a1-4)Glc(e), przeciwciała anty-Glc(e), przeciwciała anty-Gal(e), przeciwciała anty-Glc(e1-4)Glc(e1-4)Glc(e), przeciwciała anty-GlcNAc(e1-4)GlcNAc(e), przeciwciała anty-L-Araf(a), przeciwciała anty-L-Rha(a), przeciwciała anty-Gal(e1-3)[GlcNAc(e1-6)]GalNAc(a), przeciwciała anty-Gal(e1-4)GlcNAc(a), przeciwciała antyGal(e1-3)GalNAc(a), przeciwciała anty-Gal(e1-3)GlcNAc(e), przeciwciała anty-GlcA(e) i przeciwciała anty-Xyl(a), przy czym odczynnik jest połączony kowalencyjnie ze stałym podłożem końcem redukującym.
22. Podłoże według zastrz. 21, znamienne tym, że odczynnik wykrywa przeciwciało antyGlc(a) lub przeciwciało anty-L-Rha(a).
23. Podłoże według zastrz. 20, znamienne tym, że jest podłożem płaskim.
24. Podłoże według zastrz. 20, znamienne tym, że dostarczone jako studzienka płytki do mikromiareczkowania.
25. Podłoże według zastrz. 20, znamienne tym, że odczynnik jest monosacharydem lub oligosacharydem.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US40091402P | 2002-08-02 | 2002-08-02 | |
| US44707603P | 2003-02-13 | 2003-02-13 | |
| US46298403P | 2003-04-15 | 2003-04-15 | |
| US47323103P | 2003-05-23 | 2003-05-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL374869A1 PL374869A1 (pl) | 2005-11-14 |
| PL210512B1 true PL210512B1 (pl) | 2012-01-31 |
Family
ID=31721743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL374869A PL210512B1 (pl) | 2002-08-02 | 2003-08-04 | Sposób, zestaw i podłoże do diagnozowania stwardnienia rozsianego |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7537900B2 (pl) |
| EP (1) | EP1529216B1 (pl) |
| JP (2) | JP4721703B2 (pl) |
| AT (1) | ATE376672T1 (pl) |
| AU (1) | AU2003263409B2 (pl) |
| BR (1) | BR0313194A (pl) |
| CA (1) | CA2494422A1 (pl) |
| CY (1) | CY1107859T1 (pl) |
| DE (1) | DE60317070T2 (pl) |
| DK (1) | DK1529216T3 (pl) |
| ES (1) | ES2297248T3 (pl) |
| IL (1) | IL166539A (pl) |
| MX (1) | MXPA05001270A (pl) |
| NO (1) | NO20051024L (pl) |
| NZ (1) | NZ585114A (pl) |
| PL (1) | PL210512B1 (pl) |
| PT (1) | PT1529216E (pl) |
| WO (1) | WO2004015420A1 (pl) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003263409B2 (en) * | 2002-08-02 | 2010-05-27 | Glycominds Ltd. | Method for diagnosing multiple sclerosis |
| US7592150B2 (en) | 2003-12-03 | 2009-09-22 | Glycominds, Ltd | Method for diagnosing diseases based on levels of anti-glycan antibodies |
| AU2004294526A1 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-16 | Glycominds, Ltd | Method for diagnosing diseases based on levels of anti-glycan antibodies |
| WO2006002382A2 (en) * | 2004-06-24 | 2006-01-05 | The Scripps Research Institute | Arrays with cleavable linkers |
| US7572592B2 (en) * | 2005-01-31 | 2009-08-11 | Glycominds Ltd | Method for diagnosing multiple sclerosis |
| US8216791B2 (en) | 2005-01-31 | 2012-07-10 | Glycominds Ltd. | Method for diagnosing multiple sclerosis |
| EP2517727A3 (en) * | 2005-09-29 | 2013-10-30 | Caprion Proteomics USA, LLC | Biomarkers for multiple sclerosis and methods of use thereof |
| US20100203569A1 (en) * | 2009-02-12 | 2010-08-12 | Glycominks LTD | Method for Evaluating Risk in Multiple Sclerosis |
| US20120190581A1 (en) * | 2009-08-25 | 2012-07-26 | The Johns Hopkins University | Detection of Auto-Antibodies to Specific Glycans as Diagnostic Tests for Autoimmune Diseases |
| CA2940579A1 (en) | 2014-03-13 | 2015-09-17 | Universitaet Basel | Carbohydrate ligands that bind to igm antibodies against myelin-associated glycoprotein |
| WO2016026143A1 (en) * | 2014-08-22 | 2016-02-25 | Huiru Wang | Saccharide-based biomarkers and therapeutics |
| US10495646B2 (en) | 2015-01-30 | 2019-12-03 | The Regents Of The University Of California | N-acetyl glucosamine as a biomarker of MS disease course |
| AU2016323377B2 (en) | 2015-09-16 | 2021-04-15 | Universität Basel | Carbohydrate ligands that bind to antibodies against glycoepitopes of glycosphingolipids |
| CN115684612A (zh) * | 2016-07-01 | 2023-02-03 | 尊严健康公司 | 复发-缓解型多发性硬化的诊断或预测因子 |
| EP3775911A1 (en) * | 2018-04-03 | 2021-02-17 | Creatics LLC | Methods for cancer detection by evaluation of glycan-binding patterns of immunoglobulins in gastrointestinal lavage fluid samples |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4281061A (en) * | 1979-07-27 | 1981-07-28 | Syva Company | Double antibody for enhanced sensitivity in immunoassay |
| US5030560A (en) * | 1988-11-04 | 1991-07-09 | Immucor, Inc. | Method for drying mammalian cells for use in solid phase immunoassays and articles incorporating same |
| JPH02161357A (ja) * | 1988-12-15 | 1990-06-21 | Tosoh Corp | 免疫測定用材料の安定化方法 |
| US20010051349A1 (en) * | 2000-02-17 | 2001-12-13 | Glycominds Ltd. | Combinatorial complex carbohydrate libraries and methods for the manufacture and uses thereof |
| MXPA01008236A (es) | 1999-02-17 | 2003-07-21 | Glycominds Ltd | Bibliotecas de carbohidratos de combinaciones complejas y metodos para la manufactura y usos de los mismos. |
| US6762032B1 (en) * | 1999-08-23 | 2004-07-13 | Biocrystal, Ltd. | Compositions, assay kits, and methods for use related to a disease condition comprising multiple sclerosis and/or a pro-MS immune response |
| EP1248678A1 (en) * | 2000-01-10 | 2002-10-16 | Genospectra, Inc. | Linear probe carrier |
| AU2001288431A1 (en) * | 2000-08-28 | 2002-03-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Detection of anti-glycolipid antibodies by latex agglutination assay |
| ITFI20010114A1 (it) | 2001-06-22 | 2002-12-22 | Univ Firenze | Glicopeptidi,loro preparazione e loro uso nella diagnosi o nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla |
| US20040241763A1 (en) * | 2002-08-02 | 2004-12-02 | Nir Dotan | Method for diagnosing multiple sclerosis |
| AU2003263409B2 (en) * | 2002-08-02 | 2010-05-27 | Glycominds Ltd. | Method for diagnosing multiple sclerosis |
| US7572592B2 (en) * | 2005-01-31 | 2009-08-11 | Glycominds Ltd | Method for diagnosing multiple sclerosis |
-
2003
- 2003-08-04 AU AU2003263409A patent/AU2003263409B2/en not_active Ceased
- 2003-08-04 US US10/634,309 patent/US7537900B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-04 DK DK03784432T patent/DK1529216T3/da active
- 2003-08-04 DE DE60317070T patent/DE60317070T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-04 CA CA002494422A patent/CA2494422A1/en not_active Abandoned
- 2003-08-04 MX MXPA05001270A patent/MXPA05001270A/es active IP Right Grant
- 2003-08-04 NZ NZ585114A patent/NZ585114A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-08-04 EP EP03784432A patent/EP1529216B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-04 PL PL374869A patent/PL210512B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2003-08-04 ES ES03784432T patent/ES2297248T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-04 PT PT03784432T patent/PT1529216E/pt unknown
- 2003-08-04 BR BR0313194-7A patent/BR0313194A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-08-04 AT AT03784432T patent/ATE376672T1/de active
- 2003-08-04 WO PCT/IB2003/003878 patent/WO2004015420A1/en not_active Ceased
- 2003-08-04 JP JP2004527245A patent/JP4721703B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-01-27 IL IL166539A patent/IL166539A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-02-25 NO NO20051024A patent/NO20051024L/no not_active Application Discontinuation
-
2008
- 2008-01-17 CY CY20081100068T patent/CY1107859T1/el unknown
-
2009
- 2009-05-22 US US12/471,195 patent/US20100081160A1/en not_active Abandoned
- 2009-08-12 JP JP2009187527A patent/JP2009258138A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2297248T3 (es) | 2008-05-01 |
| JP4721703B2 (ja) | 2011-07-13 |
| EP1529216B1 (en) | 2007-10-24 |
| DE60317070D1 (de) | 2007-12-06 |
| AU2003263409A1 (en) | 2004-02-25 |
| PT1529216E (pt) | 2008-01-30 |
| DK1529216T3 (da) | 2008-02-25 |
| IL166539A0 (en) | 2006-01-15 |
| US20100081160A1 (en) | 2010-04-01 |
| JP2009258138A (ja) | 2009-11-05 |
| CA2494422A1 (en) | 2004-02-19 |
| BR0313194A (pt) | 2005-07-12 |
| MXPA05001270A (es) | 2005-08-03 |
| IL166539A (en) | 2010-11-30 |
| US7537900B2 (en) | 2009-05-26 |
| PL374869A1 (pl) | 2005-11-14 |
| WO2004015420A8 (en) | 2004-09-10 |
| WO2004015420A1 (en) | 2004-02-19 |
| ATE376672T1 (de) | 2007-11-15 |
| NO20051024L (no) | 2005-05-02 |
| WO2004015420B1 (en) | 2004-04-29 |
| EP1529216A1 (en) | 2005-05-11 |
| CY1107859T1 (el) | 2013-06-19 |
| DE60317070T2 (de) | 2008-07-24 |
| US20040077023A1 (en) | 2004-04-22 |
| JP2006501441A (ja) | 2006-01-12 |
| AU2003263409B2 (en) | 2010-05-27 |
| NZ585114A (en) | 2011-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100081160A1 (en) | Method for Diagnosing Multiple Sclerosis | |
| KR101678703B1 (ko) | 갈렉틴-３ 면역검정 | |
| US7906291B2 (en) | Method for diagnosing multiple sclerosis | |
| JP2010510528A (ja) | 自己免疫疾患のバイオマーカー | |
| US20150233947A1 (en) | Body Fluid BIN1 as a Marker of Cardiac Health | |
| JPWO2016068226A1 (ja) | 関節リウマチマーカー | |
| RU2369874C2 (ru) | Способ диагностики рассеянного склероза | |
| US20040241763A1 (en) | Method for diagnosing multiple sclerosis | |
| WO2016205740A1 (en) | Methods and compositions for diagnosis and prognosis of appendicitis and differentiation of causes of abdominal pain | |
| Dotan | ANTI-GLYCAN ANTIBODIES |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20140804 |