PL215168B1 - Formulacja polipeptydowa - Google Patents

Description

Dla obecnego zgłoszenia zastrzega się korzyści wynikające z tymczasowego zgłoszenia dokonanego w Stanach Zjednoczonych Am. za numerem 60/360,257, dnia 27 lutego 2002 roku, włączonego tu na zasadzie odnośnika literaturowego.

Dziedzina techniki

Obecny wynalazek dotyczy wodnej kompozycji farmaceutycznej nadającej się do długookresowego przechowywania polipeptydów zawierających domenę Fc immunoglobuliny, sposobów wytwarzania takiej kompozycji, sposobów jej podawania oraz zestawów zawierających tę kompozycję.

Tło wynalazku

Po wytworzeniu - typowo, polipeptydy muszą być składowane przed ich wykorzystaniem. Często, kiedy polipeptydy przechowuje się przez długie okresy w roztworze są one niestabilne. (Manning i wsp., 1989, Pharm. Res. 6:903-918). W związku z tym, wprowadzono dodatkowe etapy przetwarzania, które zapewnią dłuższy czas przechowywania na półkach magazynowych, w tym suszenie, przykładowo przez liofilizację. Jednakże, zliofilizowane kompozycje farmaceutyczne są mniej dogodne dla końcowego użytkownika.

Typowe zabiegi mające na celu poprawę stabilności polipeptydu obejmują zmianę stężenia składników w formulacji, lub dodawanie zaróbek w celu modyfikacji formulacji (patenty nr US 5,580,856 oraz 6,171,586). Stosowanie dodatków, choć może poprawić wyniki przechowywania, może jednak spowodować inaktywację polipeptydów. Dodatkowo, w przypadku liofilizacji, także etap rehydratacji może wprowadzić warunki, które prowadzą do inaktywacji polipeptydu poprzez przykładowo, agregację lub denaturację (Hora i wsp., 1992, Pharm. Res., 9:33-36; Liu i wsp., 1991, Biotechnol. Bioeng., 37:177-184). W rzeczywistości agregacja polipeptydów jest niepożądana i może powodować immunogeniczność (Cleland i wsp., 1993, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10:307-377 oraz Robbins i wsp., 1987, Diabetes, 36:838-845).

Obecny wynalazek odnosi się do tych problemów zapewniając nową stabilną ciekłą formulację, która pozwala na przechowywanie przez długi czas polipeptydu zawierającego domenę Fc immunoglobuliny.

Podsumowanie wynalazku

Wynalazek dotyczy - w części, stabilnej wodnej kompozycji farmaceutycznej zawierającej terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu obejmującego domenę Fc, inhibitor agregacji wybrany z grupy obejmującej L-argininę oraz L-cysteinę. Ewentualnie, kompozycja może zawierać bufor, modyfikator toniczności oraz jedną lub więcej niż jedną zaróbkę. W pewnym aspekcie, bufor utrzymuje pH kompozycji w przedziale około 6,0 oraz około 7,0. Korzystnie, polipeptyd zawierający domenę Fc jest stabilny w obecnej formulacji przez co najmniej trzy miesiące w temperaturze 2-8°C i/lub jest stabilny po jednym lub więcej niż jednym cyklu zamrażania i rozmrażania formulacji.

Wynalazek dotyczy także sposobu formułowania kompozycji farmaceutycznej, kompozycji polipeptydu zawierającego domenę Fc z inhibitorem agregacji wybranym spośród L-argininy oraz L-cysteiny. Ewentualnie, do kompozycji farmaceutycznej można również dodać bufor, modyfikator toniczności i/lub zaróbkę. W pewnym aspekcie, kompozycja farmaceutyczna jest tak sformułowana, że ma pH w przedziale między 6,0 oraz 7,0.

Wynalazek dotyczy także sposobu leczenia ssaków obejmującego podawanie terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji farmaceutycznej tu opisanej, w którym chory lub dotknięty zaburzeniami ssak może być z dobroczynnym skutkiem leczony polipeptydem zawierającym domenę Fc w formie obecnej kompozycji.

Wynalazek dotyczy także sposobu przyspieszonego badania stabilności polipeptydu zawierającego domenę Fc w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, obejmujący etapy przechowywania kompozycji w temperaturze 37°C przez jeden miesiąc oraz mierzenia stabilności polipeptydu.

W innym wykonaniu, obecny wynalazek odnosi się do zestawu lub pojemnika, które zawierają wodną kompozycję farmaceutyczną według obecnego wynalazku. Zestaw może być także zaopatrzony w instrukcje stosowania.

Krótki opis rysunków

Fig. 1: Dane z badań metodą chromatografii typu „size exclusion” (SEC) dla partii A, B, C i D oraz partii 1, przechowywanych przez okres do jednego roku w temperaturze 2-8°C.

Fig. 2: Dane z badań metodą SEC dla partii A, B, C i D oraz partii 1, przechowywanych przez okres do jednego roku w temperaturze 37°C.

PL 215 168 B1

Fig. 3: Dane z badań metodą SEC (dSEC) partii A, B, C i D oraz partii 1, po denaturacji, przechowywanych przez okres do jednego roku w temperaturze 2-8°C.

Fig. 4: Dane z badań metodą dSEC dla partii A, B, C i D oraz partii 1 przechowywanych przez okres do jednego roku w temperaturze 37°C.

Fig. 5: Dane z badań metodą chromatograficzną oddziaływania hydrofobowego (HIC) dotyczące piku 1 i pre-piku 1 dla partii A, B, C i D oraz partii 1, przechowywanych przez okres do jednego roku w temperaturze 2-8°C.

Fig. 6: Dane z badań metodą HIC dotyczące piku 1 i pre-piku 1 dla partii A, B, C i D oraz partii 1, przechowywanych przez okres do jednego roku w temperaturze 37°C.

Fig. 7: Dane z badań metodą HIC dotyczące piku 2 dla partii A, B, C i D oraz partii 1, przechowywanych przez okres do jednego roku w temperaturze 2-8°C.

Fig. 8: Dane z badań metodą HIC dotyczące piku 2 dla partii A, B, C i D oraz partii 1, przechowywanych przez okres do jednego roku w temperaturze 37°C.

Fig. 9: Dane z badań metodą HIC dotyczące piku 3 dla partii A, B, C i D oraz partii 1, przechowywanych przez okres do jednego roku w temperaturze 2-8°C.

Fig. 10: Dane z badań metodą HIC dotyczące piku 3 dla partii A, B, C i D oraz partii 1, przechowywanych przez okres do jednego roku w temperaturze 37°C.

Fig. 11: Aktywność wiązania dla partii A, B, C i D oraz partii 1, przechowywanych przez 12 miesięcy w temperaturze -70, 2-8, 30, oraz 37°C.

Fig. 12: Aktywność biologiczna dla partii A, B, C i D oraz partii 1, przechowywanych przez 12 miesięcy w temperaturze -70, 2-8, 30, oraz 37°C.

Szczegółowy opis wynalazku

W czasie długotrwałego przechowywania kompozycji farmaceutycznych zawierających polipeptydy, w tym wodnych oraz liofilizowanych formulacji, aktywne polipeptydy mogą być utracone na skutek agregacji i/lub degradacji. Zatem, obecny wynalazek odnosi się do wodnej formulacji, która nieoczekiwanie umożliwia stabilne, długookresowe przechowywanie kompozycji farmaceutycznej, w której aktywnym składnikiem kompozycji jest polipeptyd zawierający domenę Fc przeciwciała. Formulacja taka jest przydatna, po części dlatego że jest bardziej dogodna dla pacjenta do stosowania, ponieważ formulacja ta nie wymaga przeprowadzenia jakichkolwiek dodatkowych etapów, takich jak rehydratacja.

W znaczeniu tutaj stosowanym, należy rozumieć, że określenie kompozycja farmaceutyczna odnosi się do formulacji zawierającej wytworzony polipeptyd, takiej, że jest odpowiednia do iniekcji i/lub podawania pacjentowi, któremu jest to potrzebne. W szczególności, kompozycja farmaceutyczna jest zasadniczo sterylna i nie zawiera jakichkolwiek środków, które są bez potrzeby toksyczne lub powodują infekcję u odbiorcy. Ponadto, rozumie się że, w znaczeniu tutaj użytym, roztwór lub ciekła formulacja oznacza ciekły preparat, który zawiera jedną lub więcej niż jedną chemiczną substancję rozpuszczoną w odpowiednim rozpuszczalniku lub mieszaninie mieszających się ze sobą rozpuszczalników.

Dodatkowo, w znaczeniu tutaj użytym, przez określenie “około” należy rozumieć, że mogą występować różnice w stężeniu komponenta opisanej tu formulacji, które mogą wynosić do 5%, 10%, 15% lub do 20% podanej wartości. Przykładowo, jeżeli formulacja zawiera około 10 mg/ml polipeptydu zawierającego domenę Fe, to należy rozumieć, że formulacja taka może zawierać między 8 a 12 mg/ml wskazanego polipeptydu.

W pewnym wykonaniu, formulacja zawiera polipeptyd zawierający domenę Fc, inhibitor agregacji wybrany spośród L-argininy oraz L-cysteiny, oraz ewentualnie, bufor, modyfikator toniczności oraz dodatkowe zaróbki, jeżeli to konieczne. Wcześniej stosowano L-argininę jako środek wspomagający ponowne fałdowanie nierozpuszczalnych polipeptydów, w szczególności tych które podlegają ekspresji do wysokich poziomów w ciałach inkluzyjnych w bakteriach. Jednakże, L-argininy nie stosowano z powodzeniem do zwiększenia stabilności polipeptydu zawierającego domeny Fc w kompozycjach farmaceutycznych (Soejima i wsp., 2001, J. Biochem., 130:369-277).

Uwzględniono również, że wytwarzanie kompozycji powinno być wykonywane mając na uwadze ograniczenie dyskomfortu w miejscu dokonania iniekcji. Ponadto uwzględniono i to, że dodatkowe aktywne składniki mogą także być włączone do opisanej obecnie kompozycji, przykładowo, w celu zmniejszenia dyskomfortu w miejscu iniekcji. Takie aktywne składniki obejmują, lecz nie wyłącznie, nie-steroidowe przeciwzapalne leki takie jak, przykładowo, trometamina, w odpowiedniej dawce.

PL 215 168 B1

Polipeptydy

W szczególnym przykładzie realizacji, polipeptydem zawierającym domenę Fc jest rozpuszczalna forma receptora TNF sprzężonego fuzyjnie z domeną Fc (TNFR:Fc), jednakże, co będzie zrozumiałe, że dowolny inny polipeptyd zawierający domenę Fc jest odpowiedni do stosowania w obecnej formulacji. Dostępny w handlu TNFR:Fc jest znany jako etanercept (Enbrel®, Immunex Corporation), będący dimerycznym polipeptydem fuzyjnym zawierającym zewnątrzkomórkową część wiążącą Ugandy ludzkiego receptora czynnika nekrozy nowotworu o 75 kilodaltonach (p75) (TNFR) przyłączoną do części Fc ludzkiej IgG1. Komponent Fc etanerceptu zawiera stałą ciężką domenę-2 (CH2), stałą ciężką domenę-3 (CH3), oraz obszar zawiasowy, lecz nie zawiera stałej ciężkiej domeny-1 (CH1) ludzkiej IgG1. Jest zrozumiałe, że domena Fc może obejmować jedną lub wszystkie domeny wyżej opisane. Etanercept wytwarza się metodą technologii rekombinacyjnego DNA w ssaczym komórkowym systemie ekspresji - w jajniku chińskiego chomika (CHO). Liczy on 934 aminokwasów i ma pozorną masę cząsteczkową około 150 kilodaltonów (Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.).

Inne polipeptydy w szczególności brane pod uwagę jako składniki formulacji według wynalazku obejmują rekombinacyjne polipeptydy fuzyjne, zawierające co najmniej część domeny Fc przeciwciała. Polipeptyd przyłączony do domeny Fc oraz identyczny lub zasadniczo podobny do jednego z następujących polipeptydów, jest odpowiedni do stosowania w obecnej kompozycji farmaceutycznej: ligand flt3, ligand CD40, erytropoetyna, trombopoetyna, kalcytonina, ligand Fas, ligand aktywatora receptora NF-kappa B (RANKL), ligand indukujący apoptozę (TRAIL) pokrewny czynnikowi nekrozy nowotworu (TNF), limfopoetyna pochodząca z komórek zrębowych grasicy, czynnik stymulujący kolonie granulocytów, czynnik stymulujący kolonie granulocytów-makrofagów, czynnik wzrostu komórek tucznych, czynnik wzrostu komórek macierzystych, epidermalny czynnik wzrostu, RANTES, hormon wzrostu, insulina, insulinotropina, czynnik wzrostu podobny do insuliny, hormon przytarczyc, interferony, czynniki wzrostu nerwów, glukagon, interleukiny 1 do 18, czynniki stymulujące kolonie, limfotoksyna-β, czynnik nekrozy nowotworu (TNF), czynnik inhibitowania białaczki, onkostatyna-M, oraz różne ligandy cząsteczek z powierzchni komórek ELK oraz Hek (takie jak ligandy kinaz pokrewnych-eph lub LERKS).

Polipeptydy odpowiednie do formułowania w formację według wynalazku obejmują także rekombinacyjne polipeptydy fuzyjne zawierające domenę Fc przeciwciała plus receptor dowolnego w wyżej wymienionych polipeptydów lub polipeptydów zasadniczo podobnych do takich receptorów. Receptory te obejmują: obie formy TNFR (określane jako p55 oraz p75), receptory interleukiny-1 (typu 1 oraz 2), receptor interleukiny-4, receptor interleukiny-15, receptor interleukiny-17, receptor interleukiny-18, receptor czynnika stymulującego kolonie granulocytów-makrofagów, receptor czynnika stymulującego kolonie granulocytów, receptory onkostatyny-M oraz czynnika inhibitorowego białaczki, aktywator receptora NF-kappa B (RANK), receptory TRAIL (TRAIL receptory 1, 2, 3 oraz 4) oraz receptory które zawierają domeny śmierci, takie jak Fas lub receptor indukujący apoptozę (AIR).

Inne polipeptydy odpowiednie do stosowania w obecnej formulacji obejmują antygeny różnicujące (określone jako polipeptydy CD) lub ich ligandy lub polipeptydy zasadniczo podobne do tych, które są przyłączone do domeny Fc przeciwciała. Antygeny takie ujawniono w: Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani i wsp., wyd., Kobe, Japonia, 1996). Podobne polipeptydy CD ujawniono w materiałach z warsztatów przeprowadzonych po tej konferencji. Przykłady takich antygenów obejmują CD27, CD30, CD39, CD40, oraz ich ligandy (ligand CD27, ligand CD30, etc.). Kilka z antygenów CD jest członami rodziny receptora TNF, która obejmuje także ligand 41BB oraz OX40. Ligandy są często członami rodziny TNF, jak ligand 41BB oraz ligand OX40. W związku z tym, człony rodzin TNF oraz TNFR mogą być formułowane według obecnego wynalazku.

Enzymatycznie aktywne polipeptydy lub ich ligandy można także formułować według wynalazku. Przykłady obejmują rekombinacyjne polipeptydy fuzyjne zawierające domenę Fc przeciwciała przyłączoną do całego lub części jednego z następujących polipeptydów lub ich ligandów lub polipeptydu, zasadniczo podobnego do jednego z następujących: człony rodziny metaloproteinazydezintegrazy, różne kinazy, glukocerebrozydaza, nadtlenek dismutazy, aktywator tkanki plazminogenu, Czynnik VIII, Czynnik IX, apolipoproteina E, apolipoproteina A-I, globiny, oraz antagonista IL-2, antytrypsyna alfa-1, enzym przekształcający TNF-alfa, ligandy któregokolwiek z wyżej wymienionych enzymów oraz liczne inne enzymy oraz ich ligandy.

PL 215 168 B1

Formulacje oraz sposoby według wynalazku mogą również być stosowane do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych zawierających przeciwciała, ludzkie przeciwciała, humanizowane przeciwciała, chimeryczne przeciwciała, to znaczy przeciwciała posiadające ludzkie stałe domeny immunoglobuliny przeciwciała sprzężone z jedną lub więcej niż jedną zmienną mysią domeną immunoglobuliny przeciwciała i/lub nie-ludzkich przeciwciał, lub ich fragmentów. Specyficzne przykłady przeciwciał odpowiednich do stosowanie w obecnej formulacji obejmują dostępne w handlu przeciwciała takie jak: muromonab-CD3 (Orthoclone OKT-3®, Ortho Biotech), abciximab (ReoPro®, Lilly), rituximab (Rituxan®, IDEC), dacliximab (Zenapax®, Roche Laboratories), basiliximab (Simulect®, Novartis), infliximab (Remicade®, Centocor), palivizumab (Synagis®, Medlmmune), trastuzumab (Herceptin®, Genentech), gemtuzuman ozogamicin (Mylotarg™, Wyeth-Ayerst), oraz alemtuzumab (Campath®, Berlex). Każde z (przeciwciał) wyżej wymienionych jest obecnie dostępne zarówno w postaci liofilizowanego proszku wymagającego rehydratacji, jak i w postaci koncentratu wymagającego rozcieńczenia przed podaniem. Obecna formulacja zapobiega potrzebie jakichkolwiek manipulacji przed podawaniem, przykładowo, rehydratacji lub rozcieńczenia, a jednocześnie zapewnia zachowanie stabilności składników aktywnych w czasie długotrwałego przechowywania.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być także stosowna do przechowywania polipeptydów zawierających przeciwciało sprzężone z cytotoksyczną lub luminescencyjną substancją.

Substancje takie obejmują: pochodne maytanzyny (takie jak DM1); enterotoksyny (takie jak enterotok125 syny staphylococcalne); izotopy zawierające jod (takie jak ¹²⁵J); ); izotopy zawierające technet (takie jak Tc-99m); fluorochromy cyjaninowe (takie jak Cy5.5.18) oraz polipeptydy inaktywujące rybosomy (takie jak bouganin, gelonin, lub saporin-S6).

Przykłady przeciwciał lub koniugatów przeciwciało/cytotoksyna lub przeciwciało/luminofor, które wzięto pod uwagę w odniesieniu do rozwiązania według wynalazku obejmują te z nich, które rozpoznają jeden lub więcej niż jeden z następujących antygenów: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-4,

IL-5, IL-8, IL-10, receptor IL-2, receptor IL-4, receptor IL-6, receptor IL-13, PDGF-β, VEGF, TGF, TGF-P2, TGF-βΙ, receptor EGF, receptor VEGF, komplement C5, IgE, antygen nowotworu CA125, antygen nowotworu MUC1, antygen PEM, LCG (który jest produktem genowym ekspresjonowanym w związku z rakiem płuc), HER-2, glikoproteina związana z nowotworem TAG-72, antygen SK-1, epitopy związane z nowotworem, które występują na zwiększonych poziomach w surowicach pacjentów z rakiem jelita grubego i/lub z rakiem trzustki, epitopy związane z rakiem lub polipeptydy ekspresjonowane przez komórki raka piersi, jelita grubego (okrężnicy), komórek kolczystych, prostaty, trzustki, płuc, i/lub nerek i/lub komórki czerniaka, glejaka, lub nerwiaka niedojrzałego, receptory 1, 2, 3 lub

4TRAIL, nekrotyczny rdzeń guza, integryny alfa 4 beta 7, integryny VLA-4, integryny B2, TNF-α, cząsteczka adhezyjna VAP-1, cząsteczka adhezyjna komórki śródbłonkowej (EpCAM), wewnątrzkomórkowa adhezyjna cząsteczka-3 (ICAM-3), adhezyna leukointegryny, glikoproteina płytki gp Ilb/IIIa, ciężki łańcuch miozyny sercowej, hormon przytarczyc, rNAPc2 (który jest inhibitorem czynnika tkanki-VIIa), MHC I, embrionalny antygen raka (CEA), alfa-fetoproteina (AFP), czynnik nekrozy nowotworu (TNF), CTLA-4 (który jest cytotoksycznym antygenem związanym z limfocytem-T), receptor Fc-y-1, HLA-DR 10 beta, antygen HLA-DR, L-selektyna, IFN-γ, wirusem RSV, wirusem HIV, wirus zapalenia wątroby B (HBV), mutanty gatunków Streptococcus, oraz Staphylococcus aureus.

Formulacje według wynalazku mogą być także stosowne dla przeciwciał anty-idiotypowych, lub zasadniczo podobnych polipeptydów, włączając - lecz nie wyłącznie - anty-idiotypowe przeciwciała przeciw: przeciwciału nakierowanemu ma antygen nowotworu gp72; przeciwciału przeciw gangliozydowi GD3 lub przeciwciału przeciw gangliozydowi GD2.

Polipeptyd zawierający domenę Fc, odpowiedni do przechowywania w obecnej kompozycji farmaceutycznej może być wytworzony w żywych komórkach gospodarzy, które ekspresjonują polipeptyd, takich jak hybrydoma w przypadku przeciwciał lub w komórkach gospodarzy, które genetycznie zmodyfikowano w celu wytwarzania polipeptydu w przypadku polipeptydów fuzyjnych lub przeciwciał. Znane są sposoby genetycznego modyfikowania komórek do wytwarzania polipeptydów. Patrz, przykładowo, Ausubel i wsp., wyd. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York). Sposoby takie obejmują wprowadzenie kwasów nukleinowych, które kodują umożliwiają ekspresję polipeptydu - do żywych komórek gospodarzy. Tymi komórkami gospodarzy mogą być komórki bakteryjne, komórki grzybów, lub, korzystnie, komórki zwierzęce wzrastające w hodowli. Komórki bakteryjnych gospodarzy obejmują, lecz nie wyłącznie, komórki Escherichia coli. Przykłady odpowiednich szczepów E. coli obejmują: HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539 oraz dowolny szczep

PL 215 168 B1

E. coli, w którym nie następuję odszczepienie obcego DNA. Komórki gospodarzy-grzybów, które mogą być stosowane obejmują, lecz nie wyłącznie, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris oraz komórki Aspergillus. Kilka przykładów zwierzęcych linii komórkowych, które mogą być stosowane to: CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3 oraz WI38. Nowe zwierzęce linie komórkowe mogą być wyprowadzone przy użyciu sposobów dobrze znanych biegłym w sztuce (przykładowo, w wyniku transformacji, infekcji wirusowej i/lub selekcji). Ewentualnie, polipeptyd może być wydzielony przez komórki gospodarzy do pożywki.

Oczyszczanie ekspresjonowanej polipeptydu zawierającego domenę Fc może być przeprowadzone standardowa metodą. Jeżeli polipeptyd zawierający domenę Fc jest wytwarzany wewnątrzkomórkowo, usuwa się szczątki komórek, przykładowo, przez odwirowanie lub ultrafiltrację. Jeżeli polipeptyd jest wydzielany do pożywki, supernatanty z takich systemów ekspresji mogą być wpierw zatężone przy użyciu standardowych filtrów do zatężania polipeptydów. Inhibitory proteazy mogą być również dodane w celu inhibitowania proteolizy, a antybiotyki mogą być włączone w celu zapobiegania wzrostowi mikroorganizmów.

Polipeptyd zawierający domenę Fc może być oczyszczany przy użyciu, przykładowo, chromatografii hydroksyapatytowej, elektroforezy na żelu, dializy, oraz chromatografii z powinowactwem, a także dowolną kombinacją znanych technik oczyszczania lub innym sposobem - jeszcze nieodkrytym. Przykładowo, proteina A może być stosowana do oczyszczania polipeptydu zawierającego domenę Fc, opartych na ciężkich ludzkich łańcuchach gamma-1, gamma-2 lub gamma-4 (Lindmark i wsp., 1983, J. Immunol. Meth. 62:1-13). Proteinę G zaleca się dla wszystkich mysich izotypów oraz dla ludzkiej gamma-3 (Guss i wsp., 1986, EMBO J. 5:1567-1575).

Inne techniki oczyszczania polipeptydu, takie jak frakcjonowanie na kolumnie jowowymiennej, wytrącanie etanolem, HPLC z odwróconymi fazami, chromatografia na krzemionce, chromatografia na heparynie SEPHAROSET™, chromatografia na żywicy aniono-wymiennej lub kationo-wymiennej (taka jak kolumna z kwasem poliasparginowym), chromatoogniskowanie, SDS-PAGE, oraz wytrącanie siarczanem amonu może być także wykorzystane w razie potrzeby.

Kompozycja farmaceutyczna

Obecną kompozycję farmaceutyczną wytwarza się przez włączenie, jako dodatku do oczyszczonego polipeptydu opisanego wyżej, inhibitora agregacji. Ponadto, w razie potrzeby, można dodać bufor, modyfikator toniczności oraz dodatkową zaróbkę. Będzie uznane przez biegłego w sztuce, że łączenia różnych komponentów, które będą zawarte w kompozycji, można dokonać w odpowiednim porządku, a mianowicie bufor można dodać w pierwszej kolejności, w fazie pośredniej lub na końcu, zaś modyfikator toniczności także można dodać jako pierwszy, w dalszej kolejności, lub na końcu. Będzie uznane przez biegłego w sztuce, że niektóre z tych związków chemicznych mogą nie pasować (być niekompatybilne) do pewnych kombinacji, a w związku z tym, mogą być łatwo zastąpione różnymi chemikaliami, które posiadają podobne właściwości, lecz pasują i są zgodne z innymi składnikami odnośnej mieszaniny.

Inhibitory agregacji zmniejszają tendencje polipeptydów do wiązania w nieodpowiednie lub niepożądane kompleksy trzeciorzędowe lub czwartorzędowe. Nieoczekiwanie, obecni wynalazcy stwierdzili, że aminokwasy L-arginina i/lub L-cysteina, oddziałują w sposób zmniejszający agregację polipeptydu zawierającego domenę Fc w formulacji przez długie okresy składowania, przykładowo, dwa lata lub więcej. Stężenie inhibitora agregacji w formulacji zawiera się korzystnie między około 1 mM do 1M, korzystniej około 10 mM do około 200 mM, korzystniej około 10 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej około 15 mM do około 75 mM, a jeszcze korzystniej około 25 mM. Związki te są dostępne od komercyjnych dostawców.

Środki buforujące utrzymują pH w odpowiednim przedziale, a różnymi buforami odpowiednimi do stosowania w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku są: histydyna, fosforan potasu, cytrynian sodu lub potasu, kwas maleinowy, octan amonu, tris-(hydroksymetylo)aminometan (tris), różne postacie octanu oraz dietanoloaminy. Jednym z korzystnych buforów jest fosforan sodu, a jego zdolność buforowa występuje przy pH 6,2 lub w bezpośrednim sąsiedztwie tej wartości. Stężenie buforu w formulacji zawiera się korzystnie między około 1 mM do około 1M, korzystniej około 10 mM do około 200 mM. Bufory są dobrze znane w sztuce, są wytwarzane znanymi metodami i są dostępne od komercyjnych dostawców.

Jeśli pH kompozycji farmaceutycznej jest ustalone na poziomie fizjologicznym lub zbliżonym do fizjologicznego, komfort pacjenta przy jej podawaniu jest zmaksymalizowany. W szczególności, jest korzystne, że pH zawiera się w przedziale pH około 5,8 do 8,4, z tym, że korzystniejsze będzie około

PL 215 168 B1

6,2 do 7,4, jednakże, będzie zrozumiałe, że pH można dopasować w razie potrzeby by zmaksymalizować stabilność oraz rozpuszczalność polipeptydu w szczególnej formulacji i jako takie, pH poza zakresami fizjologicznymi, jeszcze tolerowalnymi przez pacjenta, objęte jest zakresem obecnego wynalazku.

Termin „modyfikator toniczności” oznacza cząsteczkę, która wpływa na osmolarność roztworu. Osmolarność kompozycji farmaceutycznej jest korzystnie regulowana w celu maksymalizowania stabilności aktywnego składnika, a także by zminimalizować dyskomfort pacjenta po podawaniu, przy czym surowica ma około 300 +/- 50 miliosmolali na kilogram. Ogólnie korzystne jest, że kompozycja farmaceutyczna ma być izotoniczna z surowicą, to znaczy, ma posiadać taką samą lub podobną osmolarność, którą osiąga się przez dodanie modyfikatora toniczności, a zatem uwzględnia się, że osmolarność będzie zawierać się w przedziale od około 180 do około 420 miliosmolali, jednakże, będzie zrozumiałe, że osmolarność może być zarówno wyższa jak i niższa zgodnie z wymogami specyficznych stanów. Przykładami modyfikatorów toniczności odpowiednimi do modyfikowania osmolarności są, lecz nie wyłącznie: aminokwasy (przykładowo, arginina, cysteina, histydyna oraz glicyna), sole (przykładowo, chlorek sodu, chlorek potasu oraz cytrynian sodu) i/lub sacharydy (przykładowo, sacharoza, glukoza oraz mannitol). Stężenie modyfikatora toniczności w formulacji zawiera się korzystnie między około 1 mM do 1M, korzystnej około 10 mM do około 200 mM. Modyfikatory toniczności są dobrze znane w stanie techniki, i są wytwarzane znanymi metodami oraz dostępne są od komercyjnych dostawców.

Zaróbki, zwane również chemicznymi dodatkami, współ-roztwarzanymi substancjami (co-solutes) lub ko-rozpuszczalnikami (co-solvents), które stabilizują polipeptyd w roztworze (a także w postaci suchej lub zamrożonej) również można dodawać do kompozycji farmaceutycznej. Do przykładów zalicza się, lecz nie wyłącznie: cukry/poliole takie jak: sacharoza, laktoza, gliceryna, ksylitol, sorbitol, mannitol, maltoza, inozyt, trehaloza, glukoza; polimery takie jak: albumina z surowicy (albumina z surowicy bydlęcej (BSA), ludzka SA lub rekombinacyjna HA), dekstran, PVA, hydroksypropylometyloceluloza (HPMC), polietylenoimina, żelatyna, poliwinylopirolidon (PVP), hydroksyetyloceluloza (HEC); niewodne rozpuszczalniki takie jak: alkohole poli-wodorotlenowe, (przykładowo, PEG, glikol etylenowy oraz gliceryna) dimetylosulfotlenek (DMSO) oraz dimetyloformamid (DMF); aminokwasy takie jak: prolina, L-seryna, sól sodowa kwasu glutaminowego, alanina, glicyna, chlorowodorek lizyny, sarkozyna oraz kwas gamma-aminomasłowy; środki powierzchniowo czynne takie jak: Tween-80, Tween-20, SDS, polisorbat, kopolimer polioksyetylenowy oraz różne inne zaróbki takie jak: fosforan potasu, octan sodu, siarczan amonu, siarczan magnezu, siarczan sodu, N-tlenek trimetyloaminy, betaina, jony metali (przykładowo, cynku, miedzi, wapnia, manganu, oraz magnezu), CHAPS, monolaurynian. 2-O-beta-mannoglicerynian lub ich dowolne kombinacje.

Stężenie jednej lub więcej niż jednej zaróbki w formulacji według wynalazku wynosi korzystnie około 0,001 do 5 procent wagowych, korzystnej około 0,1 do 2 procent wagowych. Zaróbki są dobrze znane w stanie techniki, są wytwarzane znanymi metodami i są dostępne od komercyjnych dostawców.

W pewnym wykonaniu będącym ilustracją, formulacja według wynalazku może zawierać około 25 do około 50 mg TNFR:Fc (etanercept), około 10 mM do około 100 mM L-argininy, około 10 mM do około 50 mM fosforanu sodu, około 0,75% do około 1,25% sacharozy, około 50 mM do około 150 mM NaCl, przy pH około 6,0 do około pH 7,0. W innym wykonaniu, L-arginina może być zastąpiona L-cysteiną (w stężeniu około 1 do około 500 mikromolarnym) w obecnej formulacji. W jeszcze innym wykonaniu, pH może wynosić około 7,0. W innym specyficznym wykonaniu, formulacja według wynalazku może zawierać około 25 mg/ml TNFR:Fc, około 25 mM L-argininy, około 25 mM fosforanu sodu, około 98 mM chlorku sodu, oraz około 1% sacharozy z pH około 6,2.

W innym wykonaniu, formulacja według wynalazku może zawierać około 10 do około 100 mg/mL RANK:Fc, w około 10 mM do około 100 mM L-argininie, około 10 mM do około 50 mM fosforanu sodu, około 0,75% do około 1,25% cukru trzcinowego, około 50 mM do około 150 mM NaCl, w pH około 6 do około pH 7. W specyficznym wykonaniu, formulacja według wynalazku zawiera 50 mg/ml RANK:Fc w około 25 mM L-argininie, około 25 mM fosforanu sodu, około 98 mM chlorku sodu, oraz około 1% cukru trzcinowego w pH około 6,2.

W jeszcze innym wykonaniu, formulacja według wynalazku może zawierać skuteczną ilość polipeptydu zawierającego domenę Fc, około 10 mM do około 100 mM L-argininy, około 10 mM do około 50 mM fosforanu sodu, około 0 do 5% mannitolu oraz 0 do 0.2% Tween-20 w około pH 6 do 7. W innym wykonaniu, formulacja według wynalazku może zawierać skuteczną ilość przeciwciała, ta8

PL 215 168 B1 kiego jak Emab (przeciwciało specyficzne względem anty-CD22), około 25 mM L-argininy, około 25 mM fosforanu sodu, około 4% mannitolu, około 0,02%) Tween-20 oraz w pH około 6,0.

W jeszcze innym wykonaniu, wynalazek zapewnia sposób leczenia ssaków obejmujący podawanie terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji farmaceutycznej tutaj opisanej, gdzie ssaki chorują lub mają zaburzenia które mogą być z dobrym skutkiem leczone polipeptydem zawierającym domenę Fc w obecnej kompozycji. W jeszcze innym wykonaniu, polipeptyd zawierający domenę Fc pochodzi z tych samych gatunków ssaków jak te, które mają być leczone obecną kompozycją. W szczególnym przykładzie realizacji, ssakiem jest człowiek-pacjent potrzebujący takiego leczenia. Jeżeli polipeptydem zawierającym domenę Fc w kompozycji jest TNFR:Fc, przykłady chorób lub zaburzeń które mogą być nią leczone obejmują, lecz nie wyłącznie: reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie kręgosłupa, chorobę Wegener'a (granulomatozę), chorobę Crohn'a (lub stan zapalny jelit), chroniczną obstrukcyjną chorobę płuc (COPD), zapalenie wątroby typu C, endometriozę, astmę, kacheksję, łuszczycę, oraz atopiczne zapalenie skóry. Dodatkowe choroby lub zaburzenia, które mogą być leczone TNFR:Fc obejmują te opisane w: WO 00/62790, WO 01/62272 oraz w zgłoszeniu patentowym nr US 2001/0021380, z których to pozycji szczególnie ważne części włączono tutaj na zasadzie odnośników literaturowych.

W jeszcze innym wykonaniu, wynalazek zapewnia sposób przyspieszonego badania stabilności polipeptydu zawierającego domenę Fc w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, obejmujący etap badania aktywności polipeptydu w formulacji według wynalazku przed przechowywaniem, to znaczy, w czasie „zero”, etap przechowywania kompozycji w temperaturze 37°C przez jeden miesiąc oraz pomiary stabilności polipeptydu i porównanie stabilności po jednym miesiącu przechowywania ze stanem w czasie „zero”. Informacja ta jest użyteczna dla wczesnej eliminacji partii lub szarży produkcyjnych, które ocenia się, że mają dobrą początkową stabilność, lecz nie dadzą się przechować w dobrym stanie przez dłuższe okresy.

Ponadto, obecna kompozycja farmaceutyczna zapewnia poprawę warunków długoterminowego przechowywania, tak że składnik aktywny, przykładowo, polipeptyd zawierający domenę Fc, jest stabilny w całym okresie przechowywania zarówno w postaci ciekłej, jak i w postaci zamrożonej. W znaczeniu tutaj stosowanym, przez frazę długoterminowe lub długookresowe” przechowywanie należy rozumieć, że kompozycja farmaceutyczna może być przechowywana przez trzy miesiące lub dłużej, przez sześć miesięcy lub dłużej, a korzystnie przez jeden rok lub dłużej. Należy rozumieć, że określenie przechowywanie długookresowe oznacza, że kompozycja farmaceutyczna jest przechowywana zarówno w postaci ciekłej w temperaturze 2-8°C lub jest zamrożona, przykładowo, w temperaturze 20°C lub niższej. Brano pod uwagę także, że kompozycję można wielokrotnie zamrażać i odmrażać. Przez określenie stabilne w odniesieniu do długookresowego przechowywania rozumie się, że aktywny polipeptyd kompozycji farmaceutycznej nie utraci więcej niż 20%, lub korzystniej 15%, lub jeszcze korzystniej 10%, a najkorzystniej 5% jej aktywności względem aktywności kompozycji na początku przechowywania.

Skuteczna dawka kompozycji farmaceutycznej

Odpowiednie dawkowanie lub terapeutycznie skuteczna ilość polipeptydu zawierającego domenę Fc w formulacji, będzie zależało od stanu który ma być leczony, ostrości stanu (chorobowego) przed terapią i historii leczenia pacjenta oraz odpowiedzi na środek terapeutyczny. Właściwą dawkę, jaka może być podana pacjentowi jednorazowo lub w postaci serii, można dopasować na podstawie oceny lekarza prowadzącego. Kompozycja farmaceutyczna może być podawana jako jedyny środek leczniczy lub w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi, w razie potrzeby.

W pewnym wykonaniu, skuteczna ilość polipeptydu zawierającego domenę Fc w przypadku do2 2 2 rosłych zawiera się od około 1-500 mg/m² lub od około 1-200 mg/m², lub od około 1-40 mg/m² lub ₂ około 5-25 mg/m². Alternatywnie, można podawać płaską dawkę, której ilość może mieścić się w zakresie od 2-500 mg/dawkę, 2-100 mg/dawkę lub od około 10-80 mg/dawkę. Jeżeli dawkę ma podawać się częściej niż raz w tygodniu, przykładowy zakres dawki jest taki sam jak w przypadku wyżej opisanych zakresów dawek lub niższy i korzystnie lek podawany dwa lub więcej razy na tydzień przy dawkowaniu w zakresie 25-100 mg/dawkę. W innym wykonaniu, możliwa do przyjęcia dawka do podawania na drodze iniekcji zawiera 80-100 mg/dawkę, lub alternatywnie, zawiera 80 mg na dawkę. Dawka może być podawana raz na dwa tygodnie, raz na tydzień lub w odstępach kilku tygodni (przykładowo 2 do 8). W tym przykładzie TNFR:Fc (etanercept) jest zasadniczo podawany w ilości 25 mg na pojedynczą podskórną (SC) iniekcję.

PL 215 168 B1

W wielu przypadkach, poprawę stanu pacjenta osiągnie się po podaniu dawki do około 100 mg kompozycji farmaceutycznej raz do trzech razy na tydzień w ciągu co najmniej trzech tygodni, aczkolwiek leczenie przez dłuższe okresy może być konieczne w celu indukowania pożądanego stopnia poprawy. W przypadku nieuleczalnych chronicznych stanów powyższy reżim dawkowania można kontynuować bezterminowo. W przypadku pacjentów-dzieci (wiek 4-17 lat), odpowiedni reżim obejmuje dawkę od 0.4 mg/kg do 5 mg/kg polipeptydów według wynalazku, podawaną jeden lub więcej niż jeden raz tygodniowo.

W innym wykonaniu, uwzględniono, że farmaceutyczna formulacja według wynalazku wytwarzana jest w postaci objętościowej formulacji i wówczas składniki kompozycji farmaceutycznej są stosowane w stężeniach wyższych niż byłyby wymagane przy podawaniu i kompozycje takie wymagają odpowiedniego rozcieńczenia przez podaniem.

Podawanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku

Kompozycje farmaceutyczne według obecnego wynalazku są w szczególności przydatne do podawania pozajelitowego, to znaczy, podskórnie, domięśniowo, dożylnie, dootrzewnowo, domózgowo-dokręgosłupowo, dostawowo i/lub doosłonkowo. Podawanie pozajelitowe może polegać na podaniu jednej dużej dawki (bolus) w iniekcji lub przez ciągłą infuzję. Kompozycje farmaceutyczne do iniekcji mogą występować w postaci jednostkowej dawki, przykładowo w ampułach lub w wielodawkowych zbiornikach, z dodanym środkiem konserwującym. Ponadto, ostatnio opracowano szereg nowych podejść do kwestii podawania leków a kompozycje farmaceutyczne według obecnego wynalazku nadają się do podawania tymi nowymi sposobami, przykładowo przy użyciu Inject-ease™, Genject™, iniektorów w ołówku takich jak GenPen™, a także urządzeń bezigłowych takich jak MediJector™ i BioJector™. Obecna kompozycja farmaceutyczna może być również zaadoptowana do takich sposobów podawania, które dopiero zostaną odkryte. Patrz także, 1990, Science, 249:1527-1533.

Obecna kompozycja farmaceutyczna może być także formułowana jako preparat depozytowy. Takie formulacje o przedłużonym działaniu można podawać przez implantację (przykładowo podskórnie lub domięśniowo) lub na drodze domięśniowej iniekcji. Zatem, przykładowo, formulację można zmodyfikować przy użyciu odpowiednich polimerowych lub hydrofobowych materiałów (przykładowo w postaci emulsji w dopuszczalnym oleju) lub jako żywice jonowymienne, lub też jako trudno rozpuszczalne pochodne, przykładowo, jako trudno rozpuszczalne sole.

Kompozycje farmaceutyczne mogą - jeśli to konieczne - udostępniane we fiolkach, ampułkach lub w urządzeniach do podawania, które mogą zawierać jedną lub więcej jednostkowych dawek kompozycji z aktywnym składnikiem. W pewnym wykonaniu urządzenie do podawania może obejmować strzykawkę zawierającą pojedynczą dawkę ciekłej formulacji gotowej do iniekcji. Do strzykawki może być dołączona instrukcja podawania (użycia).

W innym wykonaniu, obecny wynalazek dotyczy zestawu lub pojemnika, który zawiera wodną kompozycję farmaceutyczną według wynalazku. Stężenie polipeptydu w wodnej kompozycji farmaceutycznej może zmieniać się w szerokim zakresie, lecz generalnie mieści się w przedziale od około 0,05 do około 20,000 mikrogramów na mililitr ^g/ml) wodnej formulacji. Zestaw może być również zaopatrzony w instrukcje obsługi (stosowania).

Poniższe przykłady mają stanowić jedynie ilustrację wynalazku i powinny być interpretowane w sposób nie ograniczający zakresu wynalazku w jakikolwiek sposób.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

W celu ustalenia zaróbki najlepszej pod względem zapobiegania agregacji polipeptydu zawierającego domenę Fe, wytworzono TNFR:Fc i próbki zawierające TNFR:Fc z dodatkiem różnych zarobek poddano badaniu na rozpraszanie światła (Is) po inkubacji w temperaturze 51°C +/-1°C, a następnie porównano z rozpraszaniem światła przez próbkę kontrolną (Ic) zawierającą sam TNFR:Fc, przechowywaną w temperaturze 2-8°C. Mierzono stosunek Is/Ic, oraz wartość 1 tego stosunku stanowi teoretyczny poziom odniesienia, przy którym nie dostrzega się różnicy w rozpraszaniu światła, to znaczy nie odnotowuje się agregacji badanego związku. Testowaniu poddano różne zaróbki. Zaróbki te obejmowały: 5% kwas askorbinowy, 5% mannitol, 10% sacharoza, 1% poliwinylopirolidon (PVP-K15), 0,1% glikol polietylenowy (PEG o ciężarze cząsteczkowym 1000), 0,6% etanol, 1,2% glicynę, 2% L-argininę, 0,01% preparat Pluronic F68, 1,6% betainę oraz 1,5% L-cysteinę. Nieoczekiwanie, L-arginina okazała się jedynym inhibitorem agregacji, dla którego w ciągu całego 200-godzinnego okresu badania stosunek Is/Ic utrzymywał się poniżej jedności.

PL 215 168 B1

P r z y k ł a d 2

Wytworzony TNFR:Fc, oznaczony jako partie A, B, C oraz D porównano z TNFR:Fc wytworzonym innym sposobem i posiadającym wyższy wyjściowy stopień agregacji (partia 1) pod względem stabilności tych partii w ciekłych formulacjach (fosforan - 25 mM, L-arginina - 25 mM, NaCl - 98 mM, sacharoza - 1%, o pH 6,2) przechowywany w strzykawkach lub szklanych fiolkach w temperaturze -70°C, -20°C, 2-8°C, 30^CC oraz 37°C. Próbki poddawano analizie metodą chromatografii typu „size exclusion” (SEC), SEC po denaturacji (dSEC), metodą chromatografii oddziaływania hydrofobowego (HIC), metodą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a także badano na aktywność wiązania oraz na bioaktywność w różnych punktach czasowych. Bioaktywność można mierzyć wykorzystując szereg różnych prób, w tym SEC, dSEC, HIC, próby aktywności wiązania oraz próby na bioaktywność, zgodnie z poniższym omówieniem.

Chromatografia typu “size exclusion”:

Metodę SEC stosowano do oszacowania poziomu cząsteczek o wysokim ciężarze cząsteczkowym (HMW) (powstałych agregatów) w próbce podczas przechowywania. Cząsteczki o niskim ciężarze cząsteczkowym (LMW) są lepiej rozdzielane metoda dSEC, a dane na ten temat można znaleźć w następnej sekcji. Rysunek Fig. 1 przedstawia dane SEC dla próbek przechowywanych w temperaturze 2-8°C, a rysunek Fig. 2 przedstawia dane SEC dla próbek przechowywanych w warunkach przyspieszonego badania trwałości w 37°C.

Zebrano również dane dla próbek przechowywanych w temperaturze 30°C (danych nie przedstawiono), a wartości poziomów cząsteczek HMW były pośrednie pomiędzy wartościami zaobserwowanymi dla temperatury 2-8°C oraz temperatury 37°C. Podczas przechowywania przez 1 rok w temperaturze 2-8°C, poziomy cząstek zagregowanych pozostały stabilne lub wzrosły o mniej niż o 0,6%) w najgorszym przypadku - dla partii A. Nie zaobserwowano znaczących wzrostów agregacji podczas przechowywania w temperaturze 2-8°C. W warunkach przyspieszonego badania podczas przechowywania w temperaturze 37°C, poziomy agregacji dla partii 1 wzrosły do 19% w czasie 12 miesięcy oraz odpowiednio do 14% i 12% dla partii A i B. Nachylenie linii było bardzo podobne wskazując, że cząsteczki ulegały agregacji z taką samą szybkością oraz że różnice między partiami A-D i partią 1 są następstwem różnic w początkowych poziomach agregacji - wyższych dla partii 1 niż dla partii A-D. W przypadku partii B, nie wystąpiły różnice między próbkami przechowywanymi w fiolce w temperaturze -70°C, w strzykawce w temperaturze -70°C, w strzykawce w temperaturze -20°C i w strzykawce po obróbce termicznej i przechowywaniu w temperaturze -20°C (danych nie przedstawiono). Wszystkie wartości zawierały się w obrębie 0,4% względem kontrolnej fiolki przechowywanej w temperaturze -70°C (oraz dla czasu „0”) po 12 miesiącach przechowywania.

Chromatografia typu “size exclusion'' po denaturacji:

Ilościowe oznaczenie cząsteczek o niskim ciężarze cząsteczkowym (LMW) metodą dSEC przedstawiono na rysunku Fig. 3 dla próbek przechowywanych w temperaturze 2-8°C oraz na rysunku Fig. 4 dla próbek przechowywanych w temperaturze 37°C. Partie A-D oraz partię 1 analizowano metodą dSEC po przechowywaniu do 1 roku w temperaturze 2-8°C, lecz partii C oraz D nie analizowano po upływie 6 miesięcy przechowywania w warunkach badania przyspieszonego w temperaturze 37°C. Podczas przechowywania w temperaturze 37°C, partia 1 oraz partie A, B i C wykazały podobne zmiany, podczas gdy partia D wykazała większe zmiany podczas obróbki termicznej (heat stressing) w porównaniu z partią 1 oraz z innymi partiami. Podobieństwo między w partiami A i B oraz partią 1 zaobserwowano także podczas przechowywania w temperaturze 30°C (danych nie przedstawiono), przy czym poziomy zmian miały charakter pośredni pomiędzy poziomami zmian obserwowanych dla temperatury 2-8°C oraz temperatury 37°C. W przypadku partii B, nie wystąpiły różnice między próbkami przechowywanymi we fiolce w temperaturze -70°C, w strzykawce w temperaturze -70°C, w strzykawce w temperaturze -20°C i w strzykawce po obróbce termicznej i przechowywaniu w temperaturze -20°C (danych nie przedstawiono). Wszystkie wartości po 12 miesiącach przechowywania w temperaturze -70°C oraz w temperaturze -20°C zawierały się w obrębie 0,7% względem wartości obserwowanych dla tych próbek w czasie “0”.

Podczas przechowywania w temperaturze 30°C (danych nie przedstawiono), % LMW oznaczony metodą dSEC dla partii A pasuje dobrze do danych dla partii B, aczkolwiek obie partie wykazują lekko wyższe poziomy zmian w porównaniu z partią 1 w tej temperaturze. Partia D wykazuje wyższe poziomy cząsteczek typu LMW w temperaturze zarówno 2-8°C, jak i 37°C w każdym punkcie czasowym, łącznie z czasem “0”. Produkty powstające w wyniku zmian w partii D zdają się być większe co do rozmiarów niż to typowo obserwuje się dla próbek TNFR:Fc po stresie termicznym w metodzie

PL 215 168 B1 dSEC. Takie inne cząsteczki są widoczne po przechowywaniu w temperaturze zarówno 2-8°C, jak i 37°C.

Chromatografia oddziaływania hydrofobowego (HIC):

HIC stosowano by rozdzielić różne cząsteczki pokrewne TNFR:Fc. Wykazano, że pik 1 (oraz pik ulegający wcześniejszemu wyeluowaniu określony jako pre-pik 1) zawiera głównie cząsteczki o niskim ciężarze cząsteczkowym. Pik 2 obejmuje sfałdowany nienaruszony dimer (aktywny). Pik 3 obejmuje zagregowany materiał oraz dimery o obniżonej aktywności.

Dane o piku 1 z HIC przedstawiono na rysunku Fig. 5 dla próbek przechowywanych w temperaturze 2-8°C oraz na rysunku Fig. 6 dla próbek przechowywanych w temperaturze 37°C. Dla wszystkich partii za wyjątkiem partii D, poziomy cząsteczek LMW pozostają stosunkowo stałe (w obrębie 1,2% w ciągu 12 miesięcy) dla próbek przechowywanych w temperaturze 2-8°C. Jeżeli przyjąć średnią wartość dla próbek przechowywanych w temperaturze -TO⁰C w miejsce wartości dla czasu “0” dla partii A, to krzywe dla wszystkich partii z wyjątkiem partii D są dobrze dopasowane wzajemnie. Partia D wykazuje większy pik 1 niż inne partie, co pasuje do obserwowanych w metodzie dSEC wysokich poziomów cząsteczek LMW. Po roku poddawania próbek stresowi termicznemu w temperaturze 37°C, partia B oraz partia 1 wykazują 30% piku 1 w metodzie HIC, podczas gdy partia A wykazuje około 45%o piku 1 w metodzie HIC. Partia D wykazała 47% piku 1 w metodzie HIC już po 6 miesiącach stresu termicznego w temperaturze 37°C.

Jak zauważono wyżej, pik 2 w metodzie HIC odpowiada najbardziej pożądanym, aktywnym cząsteczkom. Na rysunku, Fig. 7 oraz Fig. 8 przedstawiono % piku 2 w metodzie HIC dla próbek przechowywanych odpowiednio w temperaturze 2-8°C i w temperaturze 37°C. Chociaż partia 1 ma niższy wyjściowy % piku 2, to zachowuje ona ten poziom aktywnych gatunków podczas przechowywania przez 12 miesięcy w temperaturze 2-8°C. Partie A, B, oraz C także zachowują stały poziom aktywnych cząsteczek podczas 12 miesięcy przechowywania w stanie zamrożonym. W warunkach przyspieszonego badania w temperaturze 37°C, wszystkie testowane partie tracą pik 2 w metodzie HIC podczas przechowywania.

Poziomy piku 3 w metodzie HIC pozostawały zasadniczo stałe podczas całorocznego przechowywania w temperaturze 2-8°C (rysunek Fig. 9). Zmiany w % piku 3 dla wszystkich partii zawierały się między 1 i 3%), to znaczy w granicach błędu całkowania. W przypadku partii A, B, C i D, pik 3 w metodzie HIC nie wykazuje rozdziału względem linii bazowej, co wprowadza większą zmienności całkowania. W przypadku partii 1, pik ten jest lepiej zdefiniowany. Po przechowywaniu w temperaturze 37°C, poziomy piku 3 w metodzie HIC w partii 1 są bardziej zmienne, lecz pozostają zasadniczo stałe, za wyjątkiem możliwego zwiększenia w 12 miesiącu (rysunek Fig. 11). Między partiami A-D, nie zaobserwowano wyraźnych różnic po przechowywaniu w temperaturze 37°C, za wyjątkiem wartości po 12 miesiącach, kiedy partia B wykazuje wzrost poziomu piku 3 w metodzie HIC.

Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu:

Przeprowadzono analizę metodą SDS-PAGE próbek przechowywanych przez 12 miesięcy w temperaturze -70°C, -20°C, 2-8°C, 30°C oraz 37°C. Partia A wykazała wzrost w pasmach związanych z zarówno ~50kD, jak i ~34kD fragmentami po przechowywaniu w temperaturze 2-8°C przez 1 rok. W podwyższonych temperaturach, obserwowano ekstensywną degradację, przejawiającą się w zwiększonej intensywności pasm cząsteczek o niskim ciężarze cząsteczkowym.

Partia 1 nie wykazała żadnej zmiany po 1-rocznym przechowywaniu w temperaturze 2-8°C, lecz wykazała zwiększenie fragmentów o masie ~50kD oraz ~34kD po 1 roku w temperaturze 30 oraz 37°C. Partia B nie wykazała żadnej zmiany podczas przechowywania przez 12 miesięcy w temperaturze -70°C (fiolka lub strzykawka), ani w strzykawkach w temperaturze -20°C, ze stresem termicznym lub bez obróbki termicznej w celu wyeliminowania przechładzania. Jednakże, po 12 miesiącach w temperaturze 2-8°C, pasma odpowiadające obu fragmentom: ~50kD oraz ~34kD powstającym w wyniku rozpadu - wykazały zwiększoną intensywność. Przechowywanie w temperaturze 30 lub 37°C przez 1 rok prowadzi do rozkładu, przejawiającego się w licznych pasmach cząsteczek o niskim ciężarze cząsteczkowym dodatkowych względem wcześniej omówionych pasm cząsteczek o masie ~50kD oraz ~34kD.

Partie C oraz D poddano analizie po przechowywaniu przez 12 miesięcy w temperaturze -70°C oraz 2-8°C. Partia 1 oraz partie B, C i D przeanalizowano po przechowywaniu przez 12 miesięcy w temperaturach -70°C oraz 2-8°C, obserwując podobne schematy degradacji jak opisane wyżej.

PL 215 168 B1

Wiązanie oraz bioaktywność:

Rysunek Fig. 11 przedstawia dane dotyczące aktywności wiążącej uzyskane metodą analizy ELISA, dla partii A-D praz partii 1 przechowywanych przez 6 oraz 12 miesięcy w temperaturze -70°C, 2-8°C, 30°C oraz 37°C. Kolumny błędu dla próbek z -70°C wskazują +/-30%. Jedynie wartości poza tymi kolumnami błędu będą uważane za znaczące, z uwagi na zmienność próby. Partie A oraz B zachowały pełną aktywność wiązania po 6 miesiącach przechowywania w temperaturze 2-8 oraz 30°C, lecz po 12 miesiącach jedynie próbki przechowywane w temperaturze 2-8°C zachowały pełną aktywność wiążącą. Partia 1 zdolna była do zachowania pełnej aktywności przez 12 miesięcy przy przechowywaniu w temperaturze zarówno 2-8 jak i 30°C, mimo iż wykazywała zawartość cząstek LMW na poziomie 13.6% (metoda dSEC; danych nie przedstawiono) oraz zawartość cząstek FIMW na poziomie 8% (metoda SEC; danych nie przedstawiono) po 1 roku w temperaturze 30°C. Partie C oraz D także utrzymały pełną aktywność wiążącą po 1 roku przechowywania w temperaturze 2-8°C, mimo iż partia D wykazywała wyższe poziomy produktów rozkładu w metodach dSEC oraz HIC.

Przykładem biopróby na aktywność TNFR:Fc jest próba inhibitowania negatywnej odpowiedzi wzrostowej linii komórkowej na ludzki TNF-alfa. Obecność TNF-alfa inhibituje wzrost cząsteczek poprzez indukowanie apoptozy. Obecność biologicznie aktywnego rozpuszczalnego receptora rhuTNF (TNFR:Fc) specyficznie neutralizuje TNF-alfa w sposób zależny od dawki. Wzorzec odniesienia dla TNFR, próbki kontrolne oraz próbki badane są wprowadzone na płytkę do mikromiareczkowań o 96 zagłębieniach i poddane mikromiareczkowaniu. Do każdego wgłębienia dodano komórki w znanym stężeniu, a następnie dodano TNF-alfa. Po upływie okresu inkubacji, nie związane komórki usunięto przez łagodne przemywanie przy użyciu solanki buforowanej fosforanem (PBS) a pozostałe - wybarwiono. Po okresie inkubacji, odczytano każde wgłębienie. Ilości jednostek dla każdego wgłębienia są wprost proporcjonalne do aktywności właściwej TNFR. Wyniki próby bioaktywności (rysunek Fig. 12) współgrają z danymi uzyskanymi w próbach wiązania.

Konkluzje:

Wykazano, że partie B oraz C sformułowane w ciekłe formulacje fosforanowe (fosforan - 25 mM, L-arginina - 25 mM, NaCl - 98 mM, sacharoza - 1%, pH 6,2) są równie stabilne jak partia 1 w takiej samej formulacji, przez 1 rok w temperaturze -70°C lub 2-8°C. Partie A-D wykazały mniejszą agregację niż partia 1 i zachowywały się równocennie pod względem rozpadu na cząsteczki o niższym ciężarze cząsteczkowym (mniej niż 4% LMW metodą dSEC po 12 miesiącach). Zarówno partia 1. jak i partie A-D wykazały zwiększony rozkład i agregację w podwyższonych temperaturach 30 oraz 37°C, lecz partie które zachowywały się tak samo jak partia 1 w okresie do jednego roku w temperaturze 2-8°C wykazywały ekwiwalentność w stosunku do partii 1 podczas stresu termicznego przez 1 rok. Wykazano, że partia D była mniej trwała w przyspieszonym teście na trwałość z wysokimi poziomami produktów rozkładu o niskich ciężarach cząsteczkowych.

Dane z przyspieszonego testowania stabilności w temperaturach 30 oraz 37°C odpowiadają długoterminowej stabilności w temperaturze 2-8°C i dlatego dają podstawy dla przyspieszonego sposobu badania długookresowej stabilności polipeptydu w formulacji przy składowaniu w niskich temperaturach bez konieczności prowadzenia długoterminowej oceny stabilności. Próbki partii B przechowywane w stanie zamrożenia w strzykawkach w temperaturze -70°C oraz w temperaturze -20°C wykazały podobną stabilność jak próbki przechowywane w stanie zamrożonym we fiolkach w temperaturze -70°C, co uzasadnia obecny sposób realizacji wynalazku w zakresie przechowywania napełnionych strzykawek w stanie zamrożonym do czasu podania preparatu pacjentowi.

Ekwiwalenty i odnośniki:

Obecny wynalazek nie może podlegać ograniczeniu co do jego zakresu przez szczegółowe przykłady realizacji tu opisane, które przedstawiono jedynie w charakterze ilustracji poszczególnych aspektów wynalazku, a funkcjonalnie równoważne sposoby i komponenty są objęte zakresem wynalazku. Faktycznie różnorodne modyfikacje wynalazku, poza tym które zostały przedstawione i omówione wyżej staną się jasne dla biegłych w sztuce na podstawie powyższego opisu i załączonych rysunków. Takie modyfikacje objęte są zakresem załączonych zastrzeżeń.

Wszelkie wyżej publikacje, patenty i zgłoszenia wynalazków wymienione w niniejszym opisie są tu włączone na zasadzie odnośników literaturowych, w takim samym zakresie, jak gdyby każda indywidualna publikacja, patent lub zgłoszenie wynalazku zostało odrębnie wskazane jako włączone tu na zasadzie odnośnika literaturowego.

Claims (30)

1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że stanowi stabilną wodną formulację zawierającą polipeptyd obejmujący domenę Fc oraz inhibitor agregacji, przy czym inhibitorem agregacji jest L-arginina.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo zawiera bufor.

3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że bufor jest wybrany z grupy składającej się z fosforanu sodu, histydyny, fosforanu potasu, cytrynianu sodu lub potasu, kwasu maleinowego, octanu amonu, tris-(hydroksymetylo)aminometanu (tris), octanu oraz dietanoloaminy.

4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że L-arginina występuje w stężeniu od około 10 mM do około 100 mM.

5. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienna tym, że dodatkowo zawiera modyfikator toniczności.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że modyfikator toniczności jest wybrany z grupy składającej się z argininy, cysteiny, histydyny, glicyny, chlorku sodu, chlorku potasu, cytrynianu sodu, sacharozy, glukozy oraz mannitolu.

7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że modyfikatorem toniczności jest chlorek sodu.

8. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienna tym, że dodatkowo zawiera zaróbkę.

9. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że dodatkowo zawiera zaróbkę.

10. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że dodatkowo zawiera zaróbkę.

11. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że zaróbka jest wybrana z grupy składającej się z: sacharozy, laktozy, gliceryny, ksylitolu, sorbitolu, mannitolu, maltozy, inozytolu, trehalozy, glukozy, albuminy surowicy bydlęcej (BSA), ludzkiej SA lub rekombinowanej HA, dekstranu, PVA, hydroksypropylometylocelulozy (HPMC), polietylenoiminy, żelatyny, poliwinylopirolidonu (PVP), hydroksyetylocelulozy (HEC), glikolu polietylenowego, glikolu etylenowego, gliceryny, dimetylosulfotlenku (DMSO), dimetyloformamidu (DMF), proliny, L-seryny, soli sodowej kwasu glutaminowego, alaniny, glicyny, chlorowodorku lizyny, sarkozyny, kwasu γ-aminomasłowego, Tween-20, Tween-80, SDS, polisorbatu, kopolimeru polioksyetylenu, fosforanu potasu, octanu sodu, siarczanu amonu, siarczanu magnezu, siarczanu sodu, N-tlenku trimetyloaminy, betainy, jonów cynku, jonów miedzi, jonów wapnia, jonów manganu, jonów magnezu, CHAPS, monolaurynianu sacharozy oraz 2-O-3-mannoglicerynianu.

12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zaróbką jest sacharoza.

13. Stabilna kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera około 10 mg/ml do około 100 mg/ml TNFR:Fc, L-argininy, fosforanu sodu, chlorku sodu oraz sacharozy.

14. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że L-arginina występuje w stężeniu około 10 mM do około 75 mM.

15. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że fosforan sodu występuje w stężeniu około 5 mM do około 100 mM.

16. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że chlorek sodu występuje w stężeniu około 5 mM do około 200 mM.

17. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że sacharoza występuje w stężeniu około 0,5% do około 1,5%.

18. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że jej pH wynosi około 5,5 do około 7,8.

19. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera TNFR:Fc w stężeniu 25 mg/ml, L-argininę w stężeniu 25 mM, fosforan sodu w stężeniu 25 mM, chlorek sodu w stężeniu 98 mM, sacharozę w stężeniu 1% i ma pH 6,2.

20. Kompozycja według zastrz. 1 albo 13, albo 19, znamienna tym, że jest ciekła.

21. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że jest zamrożona.

22. Sposób formulacji kompozycji, znamienny tym, że obejmuje łączenie wyodrębnionego TNFR:Fc z L-argininą.

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etapy łączenia buforu, modyfikatora toniczności oraz zaróbki z tą kompozycją.

24. Sposób według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że kompozycja jest ciekła.

25. Zestaw zawierający kompozycję, znamienny tym, że kompozycja zawiera polipeptyd obejmujący domenę Fc i L-argininę oraz instrukcje do stosowania wskazanej kompozycji.

PL 215 168 B1

26. Zestaw według zastrz. 25, znamienny tym, że kompozycja jest ciekła.

27. Zestaw według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że kompozycja jest przechowywana w napełnionej, sterylnej strzykawce.

28. Zestaw według zastrz. 27, znamienny tym, że wskazana strzykawka jest przechowywana w temperaturze około -20°C do około -70°C.

29. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej według zastrz. 4 albo 13, w terapeutycznie skutecznej ilości, do wytwarzania leku do leczenia ssaka potrzebującego leczenia taką kompozycją.

30. Sposób przyspieszonego badania stabilności polipeptydu zawierającego domenę Fc w kompozycji farmaceutycznej, znamienny tym, że kompozycja zawiera L-argininę, a sposób ten obejmuje etapy przechowywania kompozycji w temperaturze 37°C oraz mierzenia stabilności polipeptydu po upływie co najmniej jednego miesiąca w temperaturze 37°C.