PL201770B1

PL201770B1 - Struktura do stosowania w wysokowydajnych badaniach przesiewowych, sposób jej wytwarzania i wysokowydajne w badaniach przesiewowych urządzenie

Info

Publication number: PL201770B1
Application number: PL345272A
Authority: PL
Inventors: David Geraint Owen; Nicholas Gerard Byrne
Original assignee: Xention Discovery Ltd
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-06-14
Publication date: 2009-05-29
Also published as: ES2249041T3; US6936462B1; DK1621888T3; US8449825B2; CA2334770C; US7846389B2; NO20006295D0; AU4283599A; EP1621888A1; US20130288289A1; IL140199A; US20050221282A1; EP1084410B3; EP1621888B1; HUP0102915A2; ATE302951T1; MXPA00012345A; ZA200007296B; EP1084410A1; US20160054298A9

Abstract

Wynalazek obecny dotyczy struktury zawie- rajacej b lon e biologiczn a przylegaj ac a scis lym po laczeniem o wysokiej oporno sci do porowa- tego lub perforowanego pod loza, do stosowania w wysokowydajnych badaniach przesiewowych oraz wysokowydajnego urz adzenia do wykry- wania i testowania zwi azków o aktywno sci na bramkowanych napi eciem kana lach jonowych oraz sposobów wytwarzania struktury wed lug wynalazku. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest struktura do stosowania w wysokowydajnych badaniach przesiewowych, sposób jej wytwarzania i wysokowydajne w badaniach przesiewowych urządzenie.

Strukturę i urządzenie wykorzystuje się w badaniach przesiewowych w krótkim czasie dużej liczby związków wpływających na kanały jonowe lub aktywność transporterów. W kontekście niniejszego opisu stosowany wyraz „zawiera” i nie oznacza „jest ograniczony wyłącznie do”.

Kanały jonowe są transbłonowymi białkami, które tworzą pory w błonie, umożliwiające przechodzenie jonów z jednej strony na drugą (Hille, 1992). Kanały te mogą wykazywać swoistość jonową, umożliwiając swoistym jonom dyfuzję bierną przez błonę zgodnie z ich gradientami elektrochemicznymi. Jakkolwiek pewne typy kanałów są średnio otwarte cały czas i przy wszystkich fizjologicznych potencjałach błonowych (tak zwane kanały upływu), to jednak wiele kanałów ma „bramki”, które otwierają się w odpowiedzi na specyficzne zakłócenie błony. Zakłócenia, o których wiadomo, że powodują otwieranie kanałów jonowych, obejmują zmianę w potencjale elektrycznym w poprzek błony (kanały bramkowane napięciem), stymulację mechaniczną (kanały bramkowane mechanicznie) lub wiązanie cząsteczek sygnałowych (kanały bramkowane ligandem).

Transportery są białkami w błonie komórkowej, które katalizują ruch jonów nieorganicznych, takich jak Na⁺ i K⁺ jak również cząsteczek organicznych, takich jak neurotransmitery, jak w przypadku tak zwanych pomp wychwytu zwrotnego, np. GABA, dopamina i glicyna. Dwie rozróżniające cechy nośników w zależności od porów stanowią (1) ich kinetyka - ruch jonów przez transportery jest znacznie powolniejszy niż > 10⁶ jonów na sekundę, jak w przypadku kanałów jonowych i (2) kanały jonowe przewodzą zgodnie z gradientami elektrochemicznymi, zaś transportery mogą „pompować” wstępujące, to jest przeciw gradientom stężenia (Hille, 1992). Ten ostatni proces jest zwykle zależny bezpośrednio od energii dostarczanej w sposób stechiometryczny.

Wynalazek ma główne zastosowanie do pomiaru aktywności kanału jonowego ale również transporterów, stanowiących transportery elektrogeniczne, np. Na⁺/K⁺; Na⁺/Ca²⁺; transporter wychwytu zwrotnego glutaminianu (Brew i Attwell, 1987).

Aktywność kanału jonowego bada się z zastosowaniem techniki określanej jako „technika łatkowa” „ang. patch camping” (Hamill i in., 1981). Według tej techniki zwykle izoluje się małą łatkę błony komórkowej jest zwykle izolowaną na końcówce mikropipety przez przyciskanie końcówki do błony. Sugerowano, że jeżeli między mikropipetą i łatką błony zostanie utworzone ścisłe złączenie, wówczas przez mikropipetę może przepływać prąd elektryczny tylko przez kanały jonowe w łatce błony. Jeżeli uzyska się taki stan, wówczas można monitorować aktywność kanałów jonowych i ich wpływ na potencjał błony, oporność i prąd. Jeżeli potencjał elektryczny w poprzek błony pozostaje stały, to dostarczany do niej prąd jest równy prądowi przepływającemu przez kanały jonowe w błonie. Jeżeli kanały jonowe w błonie zamykają się, wówczas oporność błony wzrasta. Jeżeli prąd przyłożony pozostaje stały, wówczas wzrost oporności jest wprost proporcjonalny do wzrostu potencjału elektrycznego w poprzek bł ony.

O wielu lekach wiadomo, że działają przez modulowanie kanałów jonowych, jednakże rozwój nowych związków oddziaływujących na kanały jest poważnie hamowany przez trudność ich przeszukiwania pod kątem aktywności z dużą wydajnością. Konwencjonalne metody elektrofizjologiczne, takie jak technika łatkowa (ang. patch clamp) lub technika stabilizacji napięcia (ang. voltage-clamp) dostarczają określonej informacji mechanistycznej, jednakże nie są dostosowane do szybkiego przesiewania testowanych związków.

W WO96/13721 opisano urządzenie do przeprowadzania techniki łatkowej wykorzystywanej w badaniach wpł ywu pewnych substancji na kanał y przenoszenia jonów w tkance biologicznej. Ujawniono urządzenie do techniki łatkowej wykorzystujące automat do pobierania próbek, taki jak stosowane z urządzeniem do HPLC, dla uzyskania większej wydajności niż można uzyskać konwencjonalną techniką łatkową. Urządzenie to ma wady polegające na tym, że jedynie częściowo automatyzuje układ dostarczania leku, bez rejestrowania techniki łatkowej. Z tego względu ma ono te same ograniczenia co tradycyjna technika łątkowa w odniesieniu do prędkości badania związków i w żaden sposób nie może być traktowane jako układ o dużej wydajności. Układ taki stale wymaga liniowego przetwarzania (to jest przetwarzania danych otrzymywanych z kolejnych komórek). Wynalazek obecny stanowi wyraźne przeciwieństwo, bowiem zapewnia równoległe przetwarzanie i tym samym umożliwia rzeczywiście wysoką wydajność badania związków.

PL 201 770 B1

Stosowane tu określenie „błona biologiczna” obejmuje sztuczne błony, takie jak lipidowe dwuwarstwy i inne błony znane specjalistom z tej dziedziny.

Wynalazek rozwiązuje problemy towarzyszące znanym metodom przesiewowym i urządzeniom do ich przeprowadzania.

Struktura według wynalazku do stosowania w wysokowydajnych badaniach przesiewowych zawiera błonę biologiczną przylegającą ścisłym połączeniem o wysokiej oporności do podłoża, przy czym błona biologiczna zawiera kanał jonowy lub transporter, a podłoże jest porowate z powodu perforacji tworzącej pory przez podłoże.

Korzystnie w strukturze według wynalazku błona biologiczna zawiera ciągłą warstwę komórek, która ma zdolność przylegania do podłoża ścisłym połączeniem o wysokiej oporności, przy czym każda komórka tworzy ścisłe połączenie z sąsiednimi komórkami i wyraża kanał jonowy lub transporter, który znajduje się w błonie komórkowej.

Korzystnie komórki są wybrane z grupy obejmującej komórki HEK-293, genetycznie zmodyfikowane komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), podstawową tkankę neuronową taką jak hipokamp, zwoje nerwowe korzenia grzbietowego, górne zwoje szyjne itd., mięsień szkieletowy, mięsień gładki, mięsień sercowy, komórki odpornościowe, komórki nabłonkowe, komórki śródbłonkowe.

Korzystnie struktura zawiera komórki mające kanał jonowy lub transporter, który naturalnie znajduje się w błonie komórkowej lub może być wprowadzony przez transfekcję cDNA i/lub cRNA kodującego kanał jonowy lub transporter.

Korzystnie struktura zawiera liczne kanały jonowe lub transportery, które głównie są uprzednio wybranymi kanałami jonowymi lub transporterami będącymi przedmiotem zainteresowania.

Korzystnie struktura zawiera wytworzone metodami inżynierii genetycznej komórki, które zostały tak wytworzone, aby głównie wyrażały kanał jonowy lub transporter.

Korzystnie struktura zawiera bramkowane napięciem kanały jonowe.

Korzystnie struktura zawiera kanał jonowy o szybkich kinetykach aktywacji i dezaktywacji.

Korzystnie struktura ma kanał jonowy, który wykazuje swoistość dla jonu wybranego z grupy obejmującej jon sodu, potasu, wapnia i jon chlorkowy.

Korzystnie w strukturze ciągła warstwa komórek ma zdolność przylegania ścisłym połączeniem o wysokiej oporności do podł o ż a wybranego z grupy obejmują cej szkł o, tworzywa sztuczne, gumę , politetrafluoroetylen (PTFE), PTFE/włókno szklane i politereftalan etylenu (PETP).

Korzystnie struktura zawiera pseudonabłonek, w którym jedna powierzchnia ciągłej warstwy komórek jest permeabilizowana tym samym tworząc dostęp do wnętrza komórek.

Korzystnie jedna powierzchnia ciągłej warstwy komórek pseudonabłonka jest permeabilizowana antybiotykiem wybranym z grupy obejmującej amfoterycynę i nystatynę lub detergentem wybranym z grupy obejmującej digitoninę i saponinę, lub fizycznym przerwaniem przy użyciu pola o wysokim napięciu, lub enzymatycznym trawieniem części membrany z zastosowaniem odpowiedniego enzymu.

Korzystnie struktura zawiera perforowane przykrycie, korzystnie mające siatkę porów.

Korzystnie podłoże ma pory o średnicach między 0,5 μm i 10 μm, bardziej korzystnie między 1 μm i 7 μm i najkorzystniej pory mają średnicę 1-2 μm.

Korzystnie struktura zawiera perforowane podłoże, które jest wytworzone z materiału wybranego z grupy obejmującej szkło, tworzywa sztuczne, gumę, politetrafluoroetylen (PTFE), PTFE/włókno szklane i politereftalan etylenu (PETP).

W zakres wynalazku wchodzi też wysoko wydajne w badaniach przesiewowych urządzenie do wykrywania i testowania związków o aktywności na bramkowanych napięciem kanałach jonowych, które zawiera strukturę według wynalazku.

Korzystnie urządzenie to zawiera:

liczne komory, z których każda ma permeabilizowaną powierzchnię obwodową dostarczającą podłoża dla błony biologicznej, liczne studzienki, w każdej z których można umieścić komorę i testowany związek w roztworze fizjologicznym lub roztworze niefizjologicznym zawierającym sulfotlenek dimetylu, liczne elektrody odniesienia, mające kontakt elektryczny z każdą studzienką, ruchomą głowicę rejestrującą z przynajmniej jedną elektrodę rejestrującą, środki do pomiaru oporności elektrycznej lub impedancji między elektrodami rejestrującymi i elektrodami odniesienia, przy czym prąd elektryczny może przepływać między elektrodami rejestrującymi i elektrodami odniesienia przez permeabilizowaną powierzchnię obwodową każdej komory tylko przez kanały jonowe lub transportery w błonie biologicznej.

PL 201 770 B1

Korzystnie studzienki są w płytce wielostudzienkowej.

Korzystnie urządzenie zawiera układ kropelek na porowatym podłożu.

Korzystnie urządzenie zawiera głowicę rejestrującą mającą pojedynczą elektrodę rejestrującą zdolną do przesuwania się kolejno do każdej komory lub zawiera głowicę rejestrującą mającą liczne elektrody rejestrujące ułożone w linii, bądź ułożone w matrycy.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania struktury według wynalazku obejmującego etapy wybierania podłoża, perforowania go, wprowadzania błony biologicznej na podłoże i zamykania każdego poru błoną biologiczną.

Korzystnie sposób obejmuje etapy równoczesnego perforowania podłoża i zamykania porów błoną biologiczną.

Błonę biologiczną dla struktury według wynalazku wytwarza się sposobem obejmującym etapy wyboru typu komórki, oceny jej pod względem zdolności do tworzenia ciągłych warstw komórek ze ścisłymi połączeniami i niskiej do nieznacznej liczby kanałów jonowych bramkowanych napięciem, hodowania komórek na podłożu i zapewnienia wzrostu ciągłej warstwy komórek. Perforowane podłoże dla struktury według wynalazku wytwarza się sposobem obejmującym etapy świecenia laserem o wstę pnie wybranym obszarze ogniskowym, zasilaniu lub czasie ekspozycji przy perforowaniu przykrycia. Sposób ten może również obejmować dodatkowy etap modyfikowania obszaru perforowanego przez wystawienie na oddziaływania plazmy i/lub zlokalizowanego ogrzewania w celu uzyskania odpowiedniego poziomu gładkości perforacji.

Sposób przeszukiwania do wykrywania lub testowania związków o aktywności na kanały jonowe z wykorzystaniem urządzenia według wynalazku, obejmuje etapy umieszczania błony biologicznej, która wyraża kanały jonowe będące przedmiotem zainteresowania, w kontakcie z testowanym związkiem w roztworze fizjologicznym lub roztworze niefizjologicznym zawierającym rozpuszczalnik, taki jak dimetylosulfotlenek i pomiaru oporności lub impedancji błony biologicznej pod wpływem testowanego związku.

Korzystnie, błona biologiczna zawiera komórki mające kanał jonowy lub transporter, który w sposób naturalny wystę puje w ich bł onie komórkowej lub moż e być wprowadzony przez transfekcję cDNA i/lub cRNA kodującym kanał jonowy lub transporter. Wynalazek zatem ma tę zaletę, że umożliwia badania natywnych kanałów lub transporterów o nie znanym dokładnie składzie podjednostkowym lub gdzie rzeczywiście całkowicie nieznana jest tożsamość cząsteczkowa (tj. jeszcze niesklonowana), ale również heterogenicznie wyrażonych sklonowanych kanałów lub transporterów, gdzie znana jest tożsamość kanału natywnego lub transportera lub gdzie potrzebna jest dokładna wiedza odnośnie wzajemnego oddziaływania struktur związku i ugrupowań chemicznych kanału jonowego lub transportera. Z tego względu układ jest zasadniczo znacznie bardziej wszechstronny niż istniejące podejścia, które nie są czułe i wymagają dostarczania wysokich stężeń komórek (co nie zawsze jest możliwe w przypadku neuronów) i wysokich stosunków sygnału do poziomu szumów, które ograniczają ich stosowanie tylko do niektórych typów komórek i kanałów jonowych.

Korzystnie błona biologiczna obejmuje liczne kanały jonowe lub transportery, które są głównie wstępnie wyselekcjonowanymi kanałami jonowymi lub transporterami będącymi przedmiotem zainteresowania. Daje to korzyść umożliwiającą równoległe przeszukiwanie różnych kanałów, zapewniając potencjalnie nawet większą wydajność związków.

Bardziej korzystne wykonanie błony biologicznej obejmuje komórki uzyskane metodami inżynierii genetycznej, które skonstruowano aby głównie wyrażały kanał jonowy lub transporter. Korzystnie kanały jonowe są kanałami jonowymi bramkowanymi napięciem.

Korzystne błona biologiczna obejmuje, modyfikowane genetycznie komórki jajowe chomika chińskiego (CHO). Komórki CHO i subklony CHO, takie jak CHO-K1 i CHO-dhfr (również znane jako Dukx) mają wyjątkowo niskie poziomy ekspresji endogennego kanału jonowego, tym samym wykazującą doskonały sygnał do charakterystyki szumów w obrębie środowiska komórek ssaków. Podobnie, komórki HEK-293 (nerki embrionu ludzkiego) wyrażają niskie poziomy kanałów natywnych i dostarczają „tła” ludzkiej ekspresji. Obydwa te układy ekspresyjne są bezsprzecznie korzystne dla stosowanej częstokroć techniki oocytowej Xenopus, gdzie nie tylko występują kanały natywne i obfite podjednostki, ale środowisko komórek płazów różni się w istotny sposób od komórek ssaków.

W korzystnym wykonaniu błona biologiczna obejmuje kanały jonowe o szybkich kinetykach aktywacji i dezaktywacji, których nie można rozdzielić istniejącymi metodami wysokowydajnych badań przesiewowych. Z tego względu istniejące układy uśredniały nietrwałe sygnały kanałów jonowych częstokroć w okresach wielu sekund. Zatem istniejące układy uśredniają przejściowe kanały jonowe częPL 201 770 B1 sto przez wiele sekund. Kanały inaktywują się w stałych czasowych rzędu milisekund i bez obecności w stanie ustalonym. Jednakż e prezentowany tutaj wynalazek ma zaletę polegają c ą na tym, ż e z ł atwością rozwiązuje problemy związane z tego rodzaju kinetyką, tak jak w przypadku tradycyjnej techniki łątkowej, ale przy dużej wydajności.

W korzystnym wykonaniu biologiczna bł ona zawiera pseudonabł onek, w którym jedna powierzchnia ciągłej warstwy komórek jest permeabilizowana, tym samym tworząc dostęp do wnętrza komórek. Ma to tę zaletę, że dostarcza środków dla prądu i stabilizacji napięcia, co nie jest możliwe w przypadku jakichkolwiek istniejących układów wysokowydajnych badań przesiewowych. Umożliwia to nie tylko rejestrowanie z dużą rozdzielczością czasową, ale również dostarcza środków do stymulowania lub aktywowania bramkowanych napięciem kanałów jonowych w sposób precyzyjny i kontrolowany. Przykładowo, nie jest konieczne aby zmieniać skład jonowy, np. przez podwyższanie K⁺w celu depolaryzacji komórek, który samoistnie moż e modulować kinetyki kanał ów jonowych (np. kanałów K⁺) i również tłumić aktywność nowych ligandów przez konkurencję przy miejscach wiązania kanałów jonowych. Jest to wielka korzyść w stosunku do wszystkich istniejących układów. Permeabilizacja również umożliwia wprowadzenie do cytosolu związków, które inaczej nie mogłyby być wprowadzone z powodu ciężaru cząsteczkowego lub właściwości fizykochemicznych.

W korzystnym wykonaniu błona biologiczna zawiera ciągłą warstwę komórek, która jest permeabilizowana antybiotykiem wybranym z grupy obejmującej amfoterycynę i nystatynę lub też detergentem wybranym z grupy, która obejmuje digitoninę i saponinę, lub przez fizyczne przerwanie przy użyciu pola o wysokim napięciu, lub też enzymatyczne trawienie części błony z zastosowaniem odpowiedniego enzymu.

Korzyść ze stosowania wysokonapięciowych pól do permeabilizacji błony (elektropermeabilizacja) polega na tym, że tego rodzaju techniką można permeabilizować błonę plazmatyczną przy jednoczesnym oszczędzaniu mniejszych struktur wewnątrzkomórkowych, takich jak mitochondria i reticulum endoplazmatyczne. Technika taka może również być bardzo precyzyjnie kontrolowana i nie wymaga wyposażenia do wymiany roztworów w dolnej komorze urządzenia rejestrującego.

W korzystnym wykonaniu podł o ż e zawiera siatkę porów w liczbie wię kszej niż 4, ale mniejszej niż 10. Ma to tę zaletę, że dostarcza dopuszczalnej statystycznie liczby równoległych zapisów (tj. >4) w każdym traktowaniu, jednakże wystarczająco małej aby stosunek porów do komórek mógł być bardzo mały i tym samym prawdopodobieństwo, że por jest zamknięty i tym samym zaokludowany przez komórkę jest bardzo wysokie.

Urządzenie według wynalazku korzystnie zawiera studzienki, które są utworzone przez płytę wielostudzienkową. Zaletą takiego rozwiązania jest to, że można osiągnąć wysoką wydajność stosując standardowe w przemyśle komponenty, które mogą być przetwarzane z zastosowaniem dostępnego na rynku zautomatyzowanego wyposażenia i robotyki. Użytkownicy będą mieli możliwość stosowania istniejącego wyposażenia do obróbki płytek, tym samym utrzymując koszty w obrębie kosztów wytwarzania znanych urządzeń elektrofizjologicznych o wysokiej wydajność.

W następnym korzystnym wykonaniu urządzenie zawiera opisaną powyżej strukturę lub błonę biologiczną, mającą kanały jonowe będące przedmiotem zainteresowania w układzie kropelek na porowatym podłożu. Korzystnie układ miniaturowych komór rejestrujących jest utworzony przez umieszczanie „wieczka” zawierającego elektrody rejestrujące nad matrycą z kropelek, tak że tworzy się menisk roztworu kropelek. Korzystnie testowany związek w elektrycznie przewodzącym roztworze jest umieszczony w przynajmniej jednej z kropelek lub nakładany przez otwory dostępne w „wieczku”, po czym mierzy się oporność/impedancję (w konfiguracji current-clamp) błony biologicznej lub przewodność (w konfiguracji voltage-clamp) pod wpływem testowanego związku. Zaletą takiego podejścia jest to, że arkusze podłoża mogą być zaprojektowane bez potrzeby przenoszenia kawałków podłoża (np. krążków) do wielostudzienkowych płytek i również omija się stosowanie kompleksowego wzoru komory z uszczelkami, typu pierścieni o-ring i tym podobnymi. Wynalazek może wciąż być dostosowany do dodawania roztworów i ma dodatkową zaletę stosowania bardzo niewielkich objętości i tym samym małych ilości reagentów i komórek. Znakomita izolacja jest wynikiem obecności szczelin powietrznych między sąsiednimi kropelkami.

W korzystnym wykonaniu urządzenia głowica rejestrująca obejmuje pojedynczą elektrodę rejestrującą zdolną do przesuwania się kolejno do każdej komory. Bardziej korzystne rozwiązanie głowicy rejestrującej obejmuje liczne elektrody rejestrujące ułożone szeregowo. Jeszcze bardziej korzystnie, głowica rejestrująca zawiera liczne elektrody rejestrujące ułożone w matrycy. Zaletą takiej konfiguracji

PL 201 770 B1 jest to, że możliwe jest równoczesne rejestrowanie ze wszystkich studzienek przez multipleksowy układ gromadzenia danych.

W korzystnym wykonaniu urzą dzenie jest zdolne do multipleksowania do 384 elementów rejestrujących do układu gromadzenia danych wykorzystującego liczne wzmacniacze voltage-clamp. Ma to tę zaletę, że zapewnia nadzwyczaj dużą rozdzielczość czasową i skuteczny równoczesny pomiar ze wszystkich studzienek. Zaletą, dostarczenia układu TERM o potencjale pozwalającym na uzyskanie wielkości wydajności podobnych do najlepszych możliwych dla konwencjonalnych testów wiązania ligand-receptor opartych na fluorescencji (>150000 związków na tydzień).

W korzystnym wykonaniu sposób wytwarzania struktury według wynalazku obejmuje etapy równoczesnego perforowania przykrycia i zamykania porów błoną biologiczną. To wykonanie ma tę zaletę, że eliminuje etapy w ustalaniu końcowej konfiguracji, a mianowicie wymaganych procedury wymagane dla optymalizacji prawdopodobieństwa zamknięcia komórkami porów w perforowanym podłożu. Daje to korzyść uproszczenia produktu finalnego.

W korzystnym wykonaniu sposób wytwarzania podłoża, do którego przylega błona biologiczna zawarta w strukturze według wynalazku obejmuje etapy regulowania laserem profilu, zwężenia lub średnicy poru.

Korzystnie źródło laserowe jest kontrolowane przez zautomatyzowany etap pod kontrolą komputera i mikroskopu odwróconego z kontrastem fazowym, który zapewnia korzyść polegającą na umożliwieniu wizualnego badania cech porów, np. profilu, zwężenia i średnicy.

W korzystnym wykonaniu sposób wytwarzania perforowanego podłoża obejmuje inne, nie laserowe sposoby, takie jak fototrawienie, odlewanie i fizyczne wycinanie otworów w podłożu.

Sposób przesiewania wykorzystujący wysokowydajne urządzenie według wynalazku korzystnie obejmuje etap pomiaru aktywności kanału jonowego przez monitorowanie pomiarów oporności transnabłonkowej (TERM) w poprzek nietkniętej warstwy komórek.

Sposób przesiewania wykorzystujący wysokowydajne urządzenie do badań przesiewowych służy korzystnie do wykrywania lub analizy związków pod względem aktywności na kanałach jonowych będących przedmiotem zainteresowania układzie kropelek na porowatym podłożu.

Korzystnie sposób przesiewania wykorzystujący wysokowydajne urządzenie do badań przesiewowych obejmuje etap dostarczania leku i przemywania wielostudzienkowej płytki.

Korzystny jest też sposób przesiewania wykorzystujący wysokowydajne urządzenie do badań przesiewowych, który obejmuje etap stymulacji komórek, w którym obejmujący stosuje się fotoaktywowalny „zmiatacz jonów” np. jonów takich jak K⁺. Jednostka aktywna może być uwolniona przez oświetlenie całej płytki naraz ze źródła światła o dużym natężeniu, np. lasera lub lampy ksenonowej. Zaletą takiego układu jest możliwość zmiany potencjału błony przez zmianę rozkładu jonowego w sposób nieinwazyjny i z doskonałą kontrolą czasową.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że błona biologiczna może przylegać ścisłym połączeniem o wysokiej oporności do perforowanego podłoża i że można to wykorzystać w urządzeniu do wysokowydajnych badań przesiewowych do testowanych związków wykazujących aktywność wobec kanałów jonowych. Początkowo nie było to jasne dla specjalistów z tej dziedziny z punktu widzenia faktu, że nie możliwe było uzyskanie złączenia o wysokiej oporności bez nadmiernych kosztów. Ponadto, nie sugerowano do stosowania perforowanych podłoży mających ściśle do nich przylegającą błonę biologiczną w wysokowydajnych badaniach przesiewowych.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że można skonstruować błonę biologiczną zdolną do przylegania ścisłym połączeniem o wysokiej oporności podłoża i wykorzystać w wysokowydajnych badaniach przesiewowych. Nieoczekiwanie stwierdzono, że można skonstruować błonę biologiczną zawierającą kanały jonowe, którymi są głównie kanały będące przedmiotem zainteresowania. Ponadto, nieoczekiwanie stwierdzono, że można skonstruować urządzenie przesiewowe o wysokiej wydajności i stosować je do wykrywania i testowania z wydajnością, która może przekraczać 30000 testowanych związków na tydzień.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że urządzenie może być stosowane do uzyskiwania w dobrej wierze danych elektrofizjologicznych odnoszących się do funkcjonalnej aktywności kanału jonowego.

Błona biologiczna zawarta w strukturze według wynalazku była nieoczywista dla specjalistów z tej dziedziny. Konstrukcja błony biologicznej mającej ścisłe połączenie o wysokiej oporności z podłożem, takim jak perforowane szkło nie była opracowana, ani nie była uważana za możliwą do uzyskania bez nadmiernych trudności. Również konstrukcja błony mającej kanały jonowe, którymi są głównie

PL 201 770 B1 kanały będące przedmiotem zainteresowania nie wydawała się być możliwa do uzyskania bez nadmiernych obciążeń.

Wysokowydajne urządzenia i sposób według wynalazku były na początku nieoczywiste dla specjalistów z tej dziedziny ze względu na fakt, że nie wydawało się być możliwe bez nadmiernych obciążeń przeszukiwanie o dużej wydajności związków testowanych, co może być uzyskane dzięki wynalazkowi. Oprócz korzyści, jaką jest wysoka wydajność testowanych związków, urządzenie i sposób według wynalazku mogą dostarczać funkcjonalnych testów (na przykład patrz wiązania ligandu), w których sposób oddział ywania (np. blokowanie lub wzmacnianie) testowanego zwią zku na bramkowanych napięciem kanałach jonowych jest mierzone przez zmiany oporności błony lub przez rejestrowanie prądu przepływającego przez kanały jonowe bezpośrednio w błonie.

Przedmiot wynalazku jest dalej opisany w odniesieniu do przykładów korzystnych wykonań i rysunków.

Figura 1 przedstawia wersję z komórkami nabłonka urządzenia według wynalazku.

Figura 2 przedstawia urządzenie według wynalazku z perforowanym podłożem.

Figura 3 przedstawia dostosowanie dostępnej handlowo wielostudzienkowej płytki do stosowania w urządzeniu według wynalazku. Na figurze pokazano integralną wielozapisową wiązkę głowic elektrodowych.

Figura 4 przedstawia wykonanie wykorzystujące ruchomą głowicę rejestrującą, przy czym pojedyncza głowica rejestrująca odczytuje kolejno pojedyncze studzienki.

Figura 5 przedstawia rozwiązanie układu ciekłej matrycy, w którym szereg miniaturowych komór rejestrujących jest utworzony przez naniesienie kropelek na podłoże rejestrujące według wstępnie określonego wzoru i gęstości. Na figurze 5 (f) pokazano pełną „kanapkę” (konfiguracja rejestrująca) układu. Na figurze 6 pokazano następne rozwiązanie układu ciekłej matrycy, w którym liczne szeregi kropelek są ułożone „kanapkowo” razem.

Na figurze 7 pokazano por uformowany w podłożu według wynalazku. Mikrograf świetlny pokazuje por w cienkim podłożu szklanym. Por, który miał średnicę około 2 μm, był wytworzony przez zastosowanie impulsów zogniskowanej energii laserowej, po których następowała kombinacja polerowania ogniowego i modyfikacji plazmowej. Podziałka skali wynosi 10 μm przez.

P r z y k ł a d y

Wykonanie urządzenia według wynalazku obejmuje wielostudzienkową płytkę ze zintegrowanymi urządzeniami rejestrującymi, za pomocą których można dokonać masywnie równoległego voltage-clamp (MPVC) na licznych studzienkach w płytce w krótkim czasie (około 1-60 sekund). Korzystnie stosuje się dostępne handlowo płytki z 96 lub 384 studzienkami, lub też można przystosować format matrycy o 96 lub 384 pozycjach.

Wykonanie urządzenia według wynalazku korzystnie zapewnia wydajność związków badanych przekraczającą 30000 na tydzień z dobrą wiarą elektrofizjologicznego „odczytu” funkcjonalnej aktywności kanału jonowego. Wykonanie urządzenia może dostarczać dużą rozdzielczość zarówno odnośnie czasu, dla 96 studzienkowej płytki z ustawieniem voltage-clamp 1 ms/punkt. Czułość na modulację aktywności kanału wynosi >1%.

Wykonanie według wynalazku dostarcza sposobu obejmującego etapy pomiaru transnabłonkowej oporności elektrycznej w poprzek ciągłej warstwy komórek wyrażających głownie kanał jonowy będący przedmiotem zainteresowania. Dla specjalistów z tej dziedziny oczywiste jest, że sposób zależy od przylegania komórek do podłoża, które umożliwia formowanie ścisłych połączeń pomiędzy sąsiednimi komórkami tak, że powstaje arkusz o wysokiej oporności. Zmiany w aktywności kanałów jonowych wyrażonych na błonach poszczególnych komórek są odzwierciedlane przez zmiany w oporności w poprzek arkusza jako całości. W uzupełnieniu tego wykonania wynalazku, dostęp do wnętrza komórek stanowiących arkusz uzyskuje się środkami umożliwiającymi dokonywanie rejestracji curent-clamp i voltage-clump populacji komórek.

Pomiary oporności transnabłonkowej przeprowadzono następująco:

a) Komórki typu nabłonkowo/śródbłonkowego

Całkowita oporność transnabłonkowa składa się z dwóch głównych składowych, mianowicie sumy przewodności (pełnokomórkowej) poszczególnych komórek tworzących pseudonabłonek i sumy szlaków przewodności wewnątrzkomórkowych.

Naturalnie występujące komórki nabłonkowe (i śródbłonkowe) tworzą względem siebie ścisłe połączenia. To ścisłe upakowanie zmniejsza upływ jonów/solutów między komórkami, dając stosunkowo niewielkie ilości szlaków przewodności wewnątrzkomórkowych w poprzek błony jako całości.

PL 201 770 B1

Tak więc, gdy warunki umożliwiają formowanie ścisłych połączeń, mierzalne są zmiany w przewodności transbłonowej komórki. Jedynym podejściem przeprowadzenia tego sposobu był wybór komórek gospodarza pod względem odpowiednich własności wzrostu. Jako odpowiednie do ekspresji klonowanych kanałów jonowych uważane są również typy komórek, które wyrażają natywne kanały jonowe na niskich poziomach. Dużą przeszkodą dla specjalistów z tej dziedziny w tym podejściu było otrzymanie komórek, w których występuje to ostatnie zjawisko.

b) Pomiar oporności transnabłonkowej w komórkach nienabłonkowych

Alternatywą podejścia opisanego powyżej jest wykorzystanie komórek nienabłonkowych, o których wiadomo, że wyrażają śladowe ilości kanałów jonowych własnych jako podstawowego układu ekspresyjnego dla komórek klonowanych, które wyrażają kanały jonowe będące przedmiotem zainteresowania. Istnieje kilka typów komórek, które spełniają to kryterium. Jednakże dużą przeszkodą dla specjalistów z tej dziedziny był fakt, że nie tworzą one w hodowli ciągłych warstw komórek ze ścisłymi połączeniami. W wykonaniu według wynalazku otrzymano wysoce oporną warstwę „nabłonkową”, w której ta przeszkoda został a pokonana.

Transbłonkowy pomiar prądu (masywnie równoległy voltage-clamp (MPVC).

Wykonanie według wynalazku otrzymano przez utworzenie dostępu do wnętrza komórek w „nabłonku” przez przerwanie lub permeabilizację jednej powierzchni każdej komórki współuczestniczącej w warstwie komórkowej. Przeprowadzono to metodami chemicznymi, na przykład przez umożliwienie kontaktu niektórych rodzajów antybiotyków (np. amfoterycyny) lub detergentów (digitoniny) z jedną powierzchnią komórki lub przez fizyczne przerwanie, np. przy użyciu pól o wysokim napięciu (elektroporacja/Integral Zapper).

Elektryczne układy rejestrujące

Opracowano liczne układy, które zestawiono poniżej:

Układy do testowania pilotowego. Dla pilotowego testowania integralności warstw pseudonabłonkowych, mierzono oporność transnabłonkową przy użyciu komory, do której wprowadzono permeabilizowane podłoża do hodowli tkankowej (fig. 1). Komórki narastały w hodowli aż do zlania się na tym podłożu. W przypadku podłoży perforowanych, materiał (np. przykrycie) był wkładany do celowo wbudowanego pierścienia testującego, który umożliwiała zmiany ciśnienia w dolnym kompartmencie i/lub górnej komorze i jednocześnie umożliwiał wykonywanie pomiarów oporności (fig. 2). Dla uniknięcia polaryzacji elektrod, przepuszczano oscylujący sygnał napięciowy w poprzek warstwy komórek za pomocą liniowych lub kolistych elektrod umieszczonych powyżej i poniżej przepuszczalnego podłoża, na którym narastała warstwa komórek, i mierzono impedancję warstwy komórek. W przypadku warstw komórek permeabilizowanych (fig. 1b i 2b) przeprowadzono rejestrację voltage i current-clamp z zastosowaniem wzmacniacza voltage-clamp z interfejsem komputerowym w celu kontrolowania wyników eksperymentalnych i dla próbkowania danych.

Powiększanie skali i układy operacyjne

W handlowych urzą dzeniach TERM albo MPVC stosuje się układ pomiarowy z p ł ytką wielostudzienkową (fig. 3) lub ekwiwalentny (np. z wykorzystaniem matrycy kropelkowej wytwarzanej przy użyciu nanolitrowego piezodozownika). Był on oparty w pewnym stopniu na pierścieniu do testowania pilotowego jednakże wymagał wprowadzenia integralnej głowicy rejestrującej, której wykonania według wynalazku obejmują szereg możliwości. Są one opisane poniżej.

a) pojedyncza głowica rejestrująca która kolejno odczytuje pojedyncze studzienki (fig. 4),

b) ruchomy liniowy szereg głowic rejestrujących (np. 12 dla układu płytki z 96 studzienkami), 24 dla układu 384 studzienek (które są przesuwane przez płytkę w 8 (96 studzienek) lub 16 (384 studzienki) etapach,

c) matryca elektrodowa wbudowana do płytki z multipleksowaniem dla systemu rejestrującego i gromadzą cego dane z headstage. Dla pł ytek o wię kszej gęstoś ci zastosowano liczne voltage-clamp w celu utrzymania cz ę stotliwoś ci próbkowania i tym samym rozdzielczoś ci czasowej (fig. 3).

d) układ kropelkowy (fig. 5).

Adaptacja płytki wielostudzienkowej

Wykonania urządzenia według wynalazku korzystnie obejmują integralną pipetę automatyczną w wersjach roboczych TERM i MPVC.

Korzystnie wykonania urządzenia według wynalazku obejmują urządzenie do przemywania głowic rejestrujących między stosowaniem w oddzielnych rzędach.

Zgodnie z wykonaniem według wynalazku sposób wytwarzania błony biologicznej obejmuje etapy otrzymywania ścisłego połączenia o wysokiej oporności z perforowanym podłożem szklanym

PL 201 770 B1 (lub innym podłożem) i/lub etap otrzymywania linii komórkowej o zdolności do tworzenia arkuszy i mającej małe lub śladowe ilości natywnych kanałów jonowych.

Podejście z komórkami nabłonkowymi.

Rozmnożono występujące naturalnie linie komórkowe i linie komórkowe uzyskane metodami inżynierii genetycznej. Są one opisane poniżej:

Występujące naturalnie linie komórkowe

Przytoczone w literaturze linie komórkowe zostały zanalizowane pod względem przydatności „gotowości”. Początkowe kandydatury obejmowały komórki glejaka ECV-304, RBE4 i C6. Kryteria stosowania były następujące:

a) zdolność do tworzenia ciągłych warstw komórek ze ścisłymi połączeniami, oporność transnabłonkowa rzędu >125 i’cm²,

b) małe do śladowych ilości bramkowanych napięciem kanałów jonowych stanowiących tło, jak oceniono dzięki technice łątkowej w obrębie całej błony komórkowej metodami standardowymi. Korzystnie poziom przewodności wynosił <2 nS na komórkę.

Linie komórkowe uzyskane metodą inżynierii genetycznej

Metodami inżynierii genetycznej przygotowano odpowiednią linię komórkową. Jeżeli przewodności tła naturalnie występujących linii komórkowych były powyżej podanego progu w przypadku b) powyżej, to linię komórkową oceniono jako możliwy „knockout” genów dla inżynieryjnego wytworzenia nowej komórki gospodarza.

Sztuczny nabłonek

Perforowane podłoża

Perforowane podłoża wytworzono jak przedstawiono poniżej:

Podłoża wytworzone laserowo a) Prototypy

Perforowano szklane przykrycie w sposób sekwencyjny (1 otwór w danym czasie) przy użyciu źródła energii laserowej w połączeniu z etapem zautomatyzowanym pod kontrolą komputera i mikroskopu o odwróconej optyce. Umożliwiło to skonstruowanie prototypów z dokładną kontrolą parametrów, takich jak obszar ogniskowy, moc lasera i czas ekspozycji. W ten sposób przetestowano zdolność do uzyskiwania ścisłego połączenia o wysokiej oporności między komórkami i podłożem z zastosowaniem wytworzonych tym sposobem przykryć. Wzory kratkowe były wytwarzane powtarzalnie w zmiennych formatach dzięki kontrolowanemu komputerowo etapowi za pomocą połączonego z laserem komputera. Stosowano przykrycia z rozmaitych materiałów łącznie ze szkłem (jak również tworzywami sztucznymi i innymi materiałami biokompatybilnymi). Ich średnice wynosiły 10 mm (płytka 96studzienkowa) lub 5 mm (płytka z 384 studzienkami) i o zmiennej grubości (około 1-20 μm). Wytworzono pory o średnicach zmiennych pomiędzy 0,5 μm i 10 μm. Profil poru, jego zwężenie i wewnętrzną i zewnętrzną średnicę oceniano dla optymalizacji ścisłego połączenia z testowanymi komórkami. Ważne jest ustalenie odpowiedniego poziomu gładkości poru. Gęstość porów optymalizowano dla otrzymania charakterystyki poziomu sygnału do (zakłóceń) szumu, wierności zapisu voltage-clamp i ze względów statystycznych.

Dla potwierdzenia ścisłości połączenia między komórką i porem, przedsięwzięto szereg podejść (fig. 1). Są one podane poniżej:

i) podciśnienie w dolnym przedziale ciekłym np. z zastosowanie efektu Venturiego wywołanego przez roztwór przepływający przez otwór od spodu, i/lub przez doprowadzanie przepływającego roztworu przy zmniejszonym ciśnieniu całkowitym, ii) nadciśnienie w górnym przedziale ciekłym iii) powlekanie przykrycia (coverslip) materiałem utrudniającym przyleganie, który jest wypalany w obszarze poru podczas procesu wytwarzania poru (tj. indukowane laserem wytwarzanie porów) iv) wyposażenie do przesuwu lub wibracji przykrycia (coverslip) dla spowodowania aby komórki „znajdowały” pory przed przylgnięciem do podłoża w położeniach nie odpowiadających porom.

v) zastosowanie karuzeli z przykryciem lub karuzeli płytki wielostudzienkowej dla umożliwienia odwirowania vi) przyłożenie pola napięcia przez pory dla wprowadzenia komórek do wlotu poru.

Okazało się nieoczekiwanie, że indukowane laserem wytwarzanie porów pozwoliło na otrzymanie znaczących rezultatów.

Na fig. 7 pokazano typowy por wytworzony tym sposobem. Po nałożeniu roztworów fizjologicznych na każdą stronę poru, rutynowo zaobserwowano oporność przez podłoże, zwykle w zakresie

PL 201 770 B1

200 kΩ do 400 kΩ. Po dodaniu komórek, obserwowana oporność wyniosła w przybliżeniu dwukrotność tej liczby. Po dodatkowym zastosowaniu jednego lub więcej podejść wskazanych powyżej, zaobserwowano pomiary oporności zbliżone do zakresu gigaomów.

b) Powiększanie skali

Oceniono dużą ilość perforacji i jednocześnie rejestrując (ścisłe przyleganie). Podejście obejmowało „przemiatanie” światłem ze źródła laserowego o dużej energii całej dolnej powierzchni płytki wielostudzienkowej (lub matrycy równoważnej). Przy odpowiedniej strukturze studzienki znane było precyzyjne położenie żądanych porów i przy odpowiednim miareczkowaniu gęstości komórek uzyskano duże prawdopodobieństwo, że komórki znajdą się „na miejscu”. Płytkę perforowano i prawie równocześnie przerwano powierzchnię spodnią komórek. Wymagało to zastosowania znacznie większej energii laserowej niż energia stosowana w prototypach (powyżej).

c) Typy komórek

Jakkolwiek przy dochodzeniu do wynalazku stosowano komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), jednakże dla specjalistów z tej dziedziny oczywiste jest, że można zastosować dużą rozmaitość linii komórkowych i pierwotnych komórek, takich jak neurony izolowane z nietkniętych tkanek.

Inne sposoby perforowania

Oceniono alternatywne sposoby perforowania szklanych przykryć i innych materiałów, takie jak trawienie, odlewanie szkła lub arkuszy tworzywa sztucznego.

Porowata guma

Podłoża z porowatej gumy są dostępne handlowo do hodowania komórek w hodowli komórkowej. Porowatość oceniano w kontekście oporności i pomiaru prądu jak tu opisano.

Inne materiały

Dla specjalistów z tej dziedziny będzie oczywiste, że zgodnie z wynalazkiem można zastosować inne materiały, takie jak PTFE, PEPT itd. Mają one tę zaletę, że posiadają duże stałe dielektryczne, jak również są wytwarzane w postaci bardzo cienkich arkuszy. Umożliwia to zmniejszanie minimalnej oporności seryjnej w całym układzie, jak również ułatwia wprowadzanie do cytosolu komórkowego substancji egzogennych.

Urządzenie rejestrujące płytki wielostudzienkowe

Podstawowe urządzenie rejestrujące płytki wielostudzienkowe korzystnie zawiera format lokacyjny z 96 studzienkami. Korzystnie konstruuje się wielokrotności formatu 96-studzienkowego z minimalnym powiększeniem do formatu 384-studzienkowego. Korzyść zwiększania gęstości studzienek polega na tym, że zmniejszana jest ilość stosowanego związku testowanego i stosuje się mniej płytek, czemu towarzyszy obniżka pomocniczych kosztów bieżących na testowany związek. Oceniono następujące dwa podejścia:

a) stanowisko TΩRM zaprojektowane do współpracy z dostępnymi w handlu robotami i procesorami płytkowymi;

b) całkowicie zintegrowany samodzielny układ, który zapewnia obsługę płytki, zmianę roztworu i etapy rejestracji.

Układ ciekłej matrycy

Utworzono układ miniaturowych komór rejestrujących przez naniesienie kropelek zawierających zawiesinę komórek na podłoże rejestrujące według wstępnie określonego wzoru i gęstości (patrz fig. 5). Podłoże może być dowolnego rodzaju opisanego powyżej, np. perforowane szkło, tworzywo sztuczne, guma itd. Całkowita konfiguracja rejestrująca jest zrealizowana przez umieszczenie „wieczka” lub ruchomej głowicy rejestrującej, wprowadzenie elektrod rejestrujących nad matrycę z kropelek tak, że zostaje ustalony menisk roztworu kropelki, jak pokazano przykładowo na fig. 5. Układ kropelek może być również wytworzony na odwrotnej stronie porowatego podłoża w celu dostarczenia szlaku przewodności do przynajmniej jednej elektrody odniesienia jak również środków, za pomocą których substancje mogą być nakładane na dolną powierzchnię podłoża, a tym samym na błony komórkowe. Podobnie, odczynniki mogą być stosowane przez następną matrycę kropelkową naniesioną na „płytkę rejestrującą” jak pokazano na fig. 6. Na rejestrującą płytkę „czołową mogą być naniesione roztwory leków, a następnie płytka może być odwrócona i ta odwrócona płytka może później być zestawiana z matrycą komórkową w celu skontaktowania leku z komórkami. Zaleta tego podejścia polega na tym, że można zaprojektować arkusze podłoża bez potrzeby przenoszenia krążków podłoża do płytek wielostudzienkowych i również można uniknąć konieczności stosowania złożonej komory z uszczelnieniami, o-pierścieniami i tym podobnymi. Wynalazek może być przystosowany do dodawania roztworów i zapewnia dodatkową korzyść polegającą na stosowaniu bardzo niewielkich objętości, a tym samym małych ilości odczynników i komórek.

PL 201 770 B1

Literatura

Brew, H and Attwell, D. (1987). Electrogenic glutamate uptake is a major current carrier in the membrane of axolotl retinal glial cells. Nature, 327, 707-9.

Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B. & Sigworth, F. J. (1981). Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pftoger's

Archives, 391, 85-100.

Hille, B. (ed). Ionic channels of excitable membranes. 1992.

Sinauer Associates, Sunderland. Sakmann, B. & Neher, E. (eds). Single-channel recording. 1995. Plenum Press, New York & London.

Margolskee, R. F., McHendry-Rinde, B. And Horn, R. (1993). Panning transfected cells for electrophysiological studies. Biotechniques, 15, 906-911.

Sheng, M. (1996). PDZs and receptor/channel clustering: rounding up the latest suspects. Neuron, 17.

Oznaczenia na rysunku

1 :	komórki
2 :	permeabilizowana powierzchnia komórek
3 :	voltage-clamp
4 :	podłoże porowate
5 :	elektroda
6 :	ściana studzienki
7 :	kanał perfuzyjny roztworu
8 :	linia komórkowa lub główna komórka
9 :	komórka permeabilizowana
10 :	płytka wielostudzienkowa (np. 96 studzienek)
11 :	integralna rejestrująca wiązka głowicowa
12 :	multiplekser
13 :	ADC/ komputer
14 :	poziom cieczy
15 :	por
16 :	O-pierścień
17 :	zespół rejestrujący
18 :	płytka komórkowa
19 :	płytka odniesienia
20 :	płytka rejestrująca
21 :	elektroda odniesienia
22 :	elektroda rejestrująca
23 :	„pół-kanapka”
24 :	pełna „kanapka” (konfiguracja rejestrująca)

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Struktura zawierającą błonę biologiczną przylegającą ścisłym połączeniem o wysokiej oporności do podłoża do stosowania w wysoko wydajnych badaniach przesiewowych, w której błona biologiczna zawiera kanał jonowy lub transporter, a podłoże jest porowate z powodu perforacji tworzącej pory przez podłoże.
2. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że błona biologiczna zawiera ciągłą warstwę komórek, która ma zdolność przylegania do podłoża ścisłym połączeniem o wysokiej oporności, przy czym każda komórka tworzy ścisłe połączenie z sąsiednimi komórkami i wyraża kanał jonowy lub transporter, który znajduje się w błonie komórkowej.
3. Struktura według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera komórki mające kanał jonowy lub transporter, który naturalnie znajduje się w ich błonie komórkowej lub może być wprowadzony przez transfekcję cDNA i/lub cRNA kodującego kanał jonowy lub transporter.
4. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera liczne kanały jonowe lub transportery, które głównie są uprzednio wybranymi kanałami jonowymi lub transporterami będącymi przedmiotem zainteresowania.
5. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera wytworzone metodami inżynierii genetycznej komórki, które zostały tak wytworzone, aby głównie wyrażały kanał jonowy lub transporter.
6. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera bramkowane napięciem kanały jonowe.
7. Struktura według zastrz. 2, znamienna tym, że komórki są wybrane z grupy obejmującej komórki HEK-293, genetycznie zmodyfikowane komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), podstawową tkankę neuronową taką jak hipokamp, zwoje nerwowe korzenia grzbietowego, górne zwoje szyjne itd., mięsień szkieletowy, mięsień gładki, mięsień sercowy, komórki odpornościowe, komórki nabłonkowe, komórki śródbłonkowe.
8. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera kanał jonowy o szybkich kinetykach aktywacji i dezaktywacji.
9. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że ma kanał jonowy, który wykazuje swoistość dla jonu wybranego z grupy obejmującej jon sodu, potasu, wapnia i jon chlorkowy.
10. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że ciągła warstwa komórek ma zdolność przylegania ścisłym połączeniem o wysokiej oporności do podłoża wybranego z grupy obejmującej szkło, tworzywa sztuczne, gumę, politetrafluoroetylen (PTFE), PTFE/włókno szklane i politereftalan etylenu (PETP).
11. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera pseudonabłonek, w którym jedna powierzchnia ciągłej warstwy komórek jest permeabilizowana tym samym tworząc dostęp do wnętrza komórek.
12. Struktura według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera pseudonabłonek, w którym jedna powierzchnia ciągłej warstwy komórek jest permeabilizowana antybiotykiem wybranym z grupy obejmującej amfoterycynę i nystatynę lub detergentem wybranym z grupy obejmującej digitoninę i saponinę, lub przez fizyczne przerwanie przy użyciu pola o wysokim napięciu, lub enzymatyczne trawienie części błony z zastosowaniem odpowiedniego enzymu.
13. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że podłoże jest perforowane.
14. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera perforowane przykrycie.
15. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że podłoże ma pory o średnicach między 0,5 μm i 10 μm.
16. Struktura według zastrz. 15, znamienna tym, że pory mają średnicę między 1 μm i 7 μm.
17. Struktura według zastrz. 15 albo 16, znamienna tym, że pory mają średnicę 1-2 um.
18. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera przykrycie mające siatkę porów.
19. Struktura według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera perforowane podłoże, które jest wytworzone z materiału wybranego z grupy obejmującej szkło, tworzywa sztuczne, gumę, politetrafluoroetylen (PTFE), PTFE/włókno szklane i politereftalan etylenu (PETP).
20. Wysokowydajne w badaniach przesiewowych urządzenie do wykrywania i testowania związków o aktywności na bramkowanych napięciem kanałach jonowych, znamienne tym, że zawiera strukturę określoną w zastrz. 1.
21. Urządzenie według zastrz. 20, znamienne tym, że zawiera:

liczne komory, z których każda ma permeabilizowaną powierzchnię obwodową dostarczającą podłoża dla błony biologicznej,

PL 201 770 B1 liczne studzienki, w każdej z których można umieścić komorę i testowany związek w roztworze fizjologicznym lub roztworze niefizjologicznym zawierającym sulfotlenek dimetylu, liczne elektrody odniesienia, mające kontakt elektryczny z każdą studzienką, ruchomą głowicę rejestrującą z przynajmniej jedną elektrodą rejestrującą, środki do pomiaru oporności elektrycznej lub impedancji między elektrodami rejestrującymi i elektrodami odniesienia, przy czym prąd elektryczny może przepływać między elektrodami rejestrującymi i elektrodami odniesienia przez permeabilizowaną powierzchnię obwodową każdej komory tylko przez kanały jonowe lub transportery w błonie biologicznej.
22. Urządzenie według zastrz. 21, znamienne tym, że studzienki są w płytce wielostudzienkowej.
23. Urządzenie według zastrz. 20, znamienne tym, że zawiera strukturę z kanałami jonowymi w układzie kropelek na porowatym podłożu.
24. Urządzenie według zastrz. 22, znamienne tym, że zawiera głowicę rejestrującą mającą pojedynczą elektrodę rejestrującą zdolną do przesuwania się kolejno do każdej komory.
25. Urządzenie według zastrz. 20, znamienne tym, że zawiera głowicę rejestrującą mającą liczne elektrody rejestrujące ułożone szeregowo.
26. Urządzenie według zastrz. 20, znamienne tym, że zawiera głowicę rejestrującą mającą liczne elektrody rejestrujące ułożone w matrycy.
27. Sposób wytwarzania struktury określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy wybierania podłoża, perforowania go, wprowadzania błony biologicznej na podłoże i zamykania każdego poru błoną biologiczną.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że obejmuje etapy równoczesnego perforowania podłoża i zamykania porów błoną biologiczną.