[go: up one dir, main page]

PL207576B1 - Białko, DNA, rekombinowany wektor, transformant, sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, szczep Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306) oraz sensor glukozy i zestaw do oznaczania glukozy - Google Patents

Białko, DNA, rekombinowany wektor, transformant, sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, szczep Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306) oraz sensor glukozy i zestaw do oznaczania glukozy

Info

Publication number
PL207576B1
PL207576B1 PL362301A PL36230101A PL207576B1 PL 207576 B1 PL207576 B1 PL 207576B1 PL 362301 A PL362301 A PL 362301A PL 36230101 A PL36230101 A PL 36230101A PL 207576 B1 PL207576 B1 PL 207576B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna
enzyme
ala
leu
gly
Prior art date
Application number
PL362301A
Other languages
English (en)
Other versions
PL362301A1 (pl
Inventor
Koji Sode
Original Assignee
Koji Sode
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Koji Sode filed Critical Koji Sode
Publication of PL362301A1 publication Critical patent/PL362301A1/pl
Publication of PL207576B1 publication Critical patent/PL207576B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy nowej dehydrogenazy glukozowej i sposobu jej wytwarzania, DNA kodującego ten enzym, rekombinowanego wektora zawierającego DNA kodujący ten enzym, transformanta stransformowanego zrekombinowanym wektorem, nowego mikroorganizmu wytwarzającego ten enzym, sensora glukozy wykorzystującego elektrodę enzymatyczną zawierającą ten enzym oraz zestawu do oznaczania glukozy.
Biosensory wykorzystujące enzym, który specyficznie reaguje z określonym substratem aktywnie opracowuje się w różnych dziedzinach przemysłu. Sensor glukozy jest jednym z biosensorów w sposobach pomiaru i urządzeniach wykorzystujących takie sposoby opracowywanych w dziedzinach związanych z medycyną.
Historia sensora glukozy liczy około 40 lat, odkąd Clark i Lyons w 1962 roku po raz pierwszy opisali biosensor zawierający oksydazę glukozową i elektrodę tlenową, w połączeniu, (L.C. Clark, J. i Lyonas, C. „Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann. n. y. Acad. Sci., 105: 20-45).
A zatem, stosowanie oksydazy glukozowej jako enzymu sensora glukozy ma długą historię. Jest to spowodowane tym, że oksydaza glukozowa wykazuje wysoką specyficzność substratowa i lepszą stabilność termiczną . Enzym ten moż na też wytwarzać na dużą skalę a koszt jego produkcji jest niższy niż pozostałych enzymów.
Wysoka specyficzność substratowa oznacza, że enzym ten nie reaguje z sacharydami innymi niż glukoza, co stanowi jego zaletę, ponieważ można uzyskiwać właściwe pomiary bez błędu wartości pomiaru.
Ponadto, lepsza stabilność termiczna oznacza, że można zaradzić problemom związanym z denaturacją enzymu i inaktywacją jego aktywności enzymatycznej powodowanym przez ciepło, co stanowi zaletę, ponieważ właściwy pomiar można przeprowadzać w ciągu długiego czasu.
Jednakże, chociaż oksydaza glukozowa wykazuje wysoką specyficzność substratową i lepszą stabilność termiczną i może być produkowana przy niskich kosztach, istnieje problem polegający na tym, że na ten enzym oddziałuje rozpuszczony tlen a to wpływa na wyniki pomiarów.
Tymczasem, oprócz oksydazy glukozowej, opracowano również sensor glukozy wykorzystujący dehydrogenazę glukozową. Enzym ten znaleziono również w mikroorganizmach.
Na przykład, znana jest dehydrogenaza glukozowa pochodząca z bakterii z rodzaju Bacillus (EC 1.1.1.47) i dehydrogenaza glukozowa pochodząca z bakterii z rodzaju Cryptococcus (EC 1.1.1.119).
Pierwsza dehydrogenaza glukozowa (EC 1.1.1.47) jest enzymem, który katalizuje reakcję β-D-glukoza + NAD (P)+ D-ó-glukonolakton + NAD (P)H + H+, a druga dehydrogenaza glukozowa (EC 1.1.1.119) jest enzymem, który katalizuje reakcję
D-glukoza + NADP+ D-ó-glukonolakton + NADPH + H+.
Dehydrogenazy glukozowe pochodzące z mikroorganizmów są już w sprzedaży. Zaletą tych dehydrogenaz glukozowych jest to, że nie oddziałują one z tlenem rozpuszczonym w mierzonej próbce. Stanowi to ich istotną zaletę bo można uzyskiwać właściwe pomiary bez błędów w wynikach, nawet jeśli pomiar przeprowadza się w środowisku, w którym ciśnienie cząstkowe tlenu jest niskie lub do pomiaru stosuje się próbkę o wysokim stężeniu wymagającą dużej ilości tlenu.
Jednakże, chociaż na dehydrogenazę glukozową nie oddziałuje rozpuszczony tlen, to istnieje problem z jej stabilnością termiczną i słabszą specyficznością substratową niż w przypadku oksydazy glukozowej.
Dlatego też, pożądany jest enzym, który pokonałby wady obu enzymów, oksydazy glukozowej i dehydrogenazy glukozowej.
Twórcy wynalazku podawali wyniki swoich badań, dotyczących dehydrogenazy glukozowej z wykorzystaniem próbek zebranych z gleby w pobliż u gorą cych ź ródeł , w Sode K., Tsugawa W., Yamazaki T., Watanabe M., Ogasawara N. i Tanaka M., Enzyme Microb. Technol., 19, 82-85 (1996); Yamazaki T., Tsugawa W. i Sode K., Appli. Biochemi. and Biotec. Lett., 21, 199-202 (1999).
Jednakże, na tym etapie badań nie zidentyfikowano szczepu bakteryjnego posiadającego zdolność wytwarzania tlenu.
Przedmiotem wynalazku jest białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 3 i DNA kodujący to białko, który zawiera sekwencję nukleotydową od numeru 764 do 2380 w sekwencji
PL 207 576 B1 nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1. Rekombinowany wektor według wynalazku zawiera taki DNA. Transformant jest stransformowany określonym DNA lub rekombinowanym wektorem.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, który obejmuje etapy hodowania opisanego transformanta w celu wytwarzania dehydrogenazy glukozowej jako produktu ekspresji DNA i etap zbierania go.
Sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej obejmuje etapy hodowania mikroorganizmu z rodzaju Burkhorderia o zdolności do wytwarzania w pożywce określonego białka i etap zbierania biał ka lub kompleksu zawieraj ącego biał ko z poż ywki i/lub komórek mikroorganizmu.
Mikroorganizmem stosowanym w sposobie według wynalazku jest korzystnie Burkhorderia cepacia, a zwłaszcza szczep Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306).
Sensor glukozy według wynalazku wykorzystuje elektrodę enzymatyczną obejmującą określone białko, transformant lub szczep.
Zestaw do oznaczania glukozy obejmuje białko według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest także białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 i DNA kodujący to białko, który zawiera sekwencję nukleotydową od numeru od 258 do 761 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1. DNA, korzystnie obejmuje DNA w określonej kolejności.
Korzystnie DNA zawiera sekwencję nukleotydową od numeru 258 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1. Rekombinowany wektor zawiera DNA określony według wynalazku.
Transformant, jest stransformowany tym DNA lub zrekombinowanym wektorem.
Sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej według wynalazku, obejmuje etapy hodowania transformanta w celu wytwarzania produktu ekspresji DNA określonego i etap zbierania go.
Celem wynalazku jest uzyskanie enzymu, który nie ma wad obu znanych enzymów, oksydazy glukozowej i dehydrogenazy glukozowej, tj. enzymu, który wykazuje wysoką specyficzność substratowa i lepszą stabilność termiczną, który można wytwarzać przy niskich kosztach i który nie oddziałuje z tlenem rozpuszczonym w badanej próbce.
Twórcy wynalazku z powodzeniem wyizolowali z gleby w pobliżu gorących źródeł Burkhorderia cepacia wytwarzający enzym spełniający założone cele i tak zrealizowali wynalazek.
<1> Nowy szczep bakteryjny wytwarzający dehydrogenazę glukozową
Enzym (dalej określany jako „enzym lub „GDH) może być wytwarzany przez bakterię należącą do rodzaju Burkhorderia. Nie ma szczególnych ograniczeń dotyczących bakterii z rodzaju Burkhorderia stosowanej w wynalazku, tak długo jak jest ona bakterią z rodzaju Burkhorderia posiadającą zdolność wytwarzania enzymu. Jednakże, preferowana jest Burkhorderia cepacia, a w szczególności szczep KSl Burkhorderia cepacia. Ten szczep bakteryjny jest nowym szczepem bakteryjnym wyizolowanym przez twórców wynalazku z gleby w pobliżu gorących źródeł w Japonii, jak opisano w przykładach i zidentyfikowanym jako Burkhorderia cepacia, na podstawie jego właściwości bakteriologicznych. Wcześniej nie było wiadomo, że mikroorganizm należący do rodzaju Burkhorderia może wytwarzać dehydrogenazę glukozową. Ten bakteryjny szczep oznaczono jako szczep KS1 i zdeponowano w International Patent Organizm Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, kod pocztowy: 305-8566) 25 września 2000 roku i otrzymano numer dostępu mikroorganizmu FERM BP-7306.
Twórcy wynalazku uzyskali kilka szczepów Burkhorderia cepacia innych niż szczep KSl Burkhorderia cepacia, które zdeponowali w Institute of Fermentation (Osaka, IFO) lub w Japan Collection of Microorganisms (JCM), The Institute of Physical and Chemical Research, i mierzyli aktywność dehydrogenazy glukozowej. W wyniku pomiarów potwierdzono, że wszystkie te szczepy bakteryjne wykazują aktywność.
<2> Dehydrogenaza glukozowa według wynalazku
Jeśli bakterię Burkhorderia wykazującą zdolność wytwarzania dehydrogenazy glukozowej, na przykład szczep KS1 Burkhorderia cepacia, hoduje się w podłożu hodowlanym stosowanym do zwykłych hodowli mikroorganizmów, korzystnie w podłożu zawierającym glukozę lub substancję zawierającą glukozę w celu podwyższenia zdolności wytwarzania enzymu, to wytwarzana jest dehydrogenaza glukozowa według wynalazku i akumuluje się ona w produkcie hodowlanym lub w komórkach hodowanych. Dlatego, zbiera się ją znanymi metodami. Sposób wytwarzania enzymu szczegółowo wyjaśniono na przykładzie szczepu KS1 Burkhorderia cepacia.
PL 207 576 B1
Najpierw, szczep KS1 Burkhorderia cepacia hoduje się w odpowiednim podłożu hodowlanym, na przykład, w podłożu zawierającym odpowiednie źródło węgla, źródło azotu, sole nieorganiczne, glukozę lub substancje zawierające je w celu wytworzenia i zakumulowania enzymu w produkcie hodowlanym lub hodowanych komórkach.
Jako źródła węgla, można stosować dowolne substancje, które mogą być asymilowane, na przykład, D-glukozę, L-arabinozę, D-ksylozę, D-mannozę, skrobię, różne peptony i inne. Jako źródła azotu, można stosować ekstrakt drożdżowy, ekstrakt słodowy, różne peptony, różne ekstrakty mięsne, namok kukurydziany, roztwory aminokwasów oraz organiczne i nieorganiczne związki azotu, takie jak sole amonowe lub substancje je zawierające. Jako sole nieorganiczne, można stosować różne sole kwasu fosforowego oraz sole magnezu, potasu, sodu, wapnia i inne. Ponadto, jeśli jest to pożądane, do podłoża można dodawać różne substancje nieorganiczne i organiczne wymagane do wzrostu bakterii lub wytwarzania enzymu, na przykład, olej silikonowy, olej sezamowy, środki przeciw-spienianiu, takie jak różne środki powierzchniowo czynne oraz witaminy.
Jeśli chodzi o samą metodę hodowli, to chociaż można stosować zarówno hodowlę płynną jak i stałą, to zazwyczaj preferuje się hodowlę pł ynną .
Enzym według wynalazku można otrzymać z podłoża i/lub hodowli komórek. Enzym, znajdujący się w komórkach, można otrzymać jako ekstrakt komórkowy poprzez rozerwanie lub lizę komórek.
Dehydrogenazę glukozową w produkcie hodowlanym lub w ekstrakcie komórkowym można oczyszczać stosując odpowiednią kombinację technik chromatograficznych wykorzystując wymieniacz jonowy, nośnik do filtracji żelowej, nośnik hydrofobowy i inne.
Aktywność enzymu można mierzyć stosując te same metody jakie są znane do mierzenia aktywności dehydrogenazy glukozowej. W szczególności, aktywność można mierzyć metodą opisaną w przykładach.
Właściwości fizykochemiczne nowej dehydrogenazy glukozowej według wynalazku są następujące:
(i) enzym posiada zdolność katalizowania reakcji dehydrogenacji glukozy;
(ii) enzym składa się z podjednostek mających masę cząsteczkową około 60 kDa i około 43 kDa w elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS w warunkach redukujących;
(iii) enzym ma masę cząsteczkową około 380 kDa w chromatografii żelowej z zastosowaniem żelu TSK G3000SW (Tosoh Corporation) oraz (iv) enzym wykazuje optymalną temperaturę reakcji około 45°C (bufor Tris-HCl, pH 8,0).
Dehydrogenaza glukozowa wykazuje pik aktywności w temperaturze około 45°C w uprzednio podanych warunkach, jak również wykazuje pik aktywności w temperaturze około 75°C (patrz. fig. 3 (a)). Nie jest znana żadna GDH, która wykazywałaby pik aktywności w obu zakresach temperatury, jak opisano powyżej.
Masę cząsteczkową i optymalną temperaturę można mierzyć metodami opisanymi w przykładach.
Dehydrogenaza glukozowa według wynalazku składa się z dwóch odrębnych polipeptydów, podjednostki α posiadającej masę cząsteczkową około 60 kDa i podjednostki β posiadającej masę cząsteczkową około 43 kDa (dalej w opisie, ta dehydrogenaza glukozowa określana jest również jako „enzym multimeryczny). Twórcy wynalazku szczegółowo badali dalej te dwie podjednostki.
Stwierdzono, że podjednostka β to cytochrom C (jak pokazano później w przykładach). Białko zawierające tylko podjednostkę α wykazuje następujące właściwości fizykochemiczne:
(i) białko może tworzyć dehydrogenazę glukozową jako podjednostka;
(ii) białko posiada aktywność dehydrogenazy glukozowej;
(iii) białko ma masę cząsteczkową około 60 kDa w elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS w warunkach redukują cych oraz (iv) białko wykazuje optymalną temperaturę reakcji około 75°C (bufor Tris-HCl, pH 8,0).
Optymalną temperaturę można mierzyć metodą opisaną w przykładach.
Ponieważ białko to samo wykazuje aktywność enzymatyczną, to białko można dowolnie nazywać „enzymem peptydowym lub „enzymem, w zależności od istoty wyjaśnienia.
Jako szczególne rozwiązanie enzymu peptydowego według wynalazku można wymienić białko posiadające sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3. Ponadto, ten enzym peptydowy może być białkiem posiadającym sekwencję aminokwasową zawierającą podstawienie, delecję, insercję lub addycję jednej lub więcej reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 3, tak długo jak długo zachowuje ono aktywność GDH. Chociaż sekwencja aminokwasowa, która może być kodowana przez sekwencję nukleotydową o numerze identyfikacyjnym: 1,
PL 207 576 B1 jest przedstawiona jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3, reszty metioniny w końcu N mogą zostać wyeliminowane po translacji.
Ponadto, jako szczególne rozwiązanie multimerycznego enzymu według wynalazku, można wymienić multimer zawierający białko, którego podjednostka α posiada sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3. Ponadto, enzym multimeryczny moż e być multimerem zawierają cym białko, którego podjednostka α posiada sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3, obejmującą podstawienie, delecję, insercję lub addycję jednej lub więcej reszt aminokwasowych, tak długo jak długo zachowuje ona aktywność GDH.
„Jedna lub więcej oznacza liczbę od 1 do 10, korzystnie od 1 do 5, szczególnie korzystnie od 1 do 3.
Twórcy wynalazku potwierdzili istnienie podjednostki γ, oprócz podjednostki α i podjednostki β.
W przykł adach opisano, ż e podjednostkę γ usuni ę to z supernatantu hodowlanego lub ekstraktu komórkowego na etapie oczyszczania enzymu, i dlatego nie potwierdzono obecności podjednostki γ w oczyszczonym enzymie. Jednakże, jak pokazano w przykładach, jeś li podjednostka γ ulegała ekspresji razem z podjednostka α, uzyskiwano wysoką aktywność enzymatyczną w porównaniu z przypadkiem, gdy ekspresji ulegała tylko podjednostka α. Sugeruje to, że podjednostka γ była białkiem w jakiś sposób zaangaż owanym w wytwarzanie podjednostki α w komórkach mikroorganizmu. Przyjmując, że aktywność właściwa podjednostki α (aktywność enzymatyczna na białko) jest taka sama w obu przypadkach, niższa aktywność enzymatyczna wskazuje na mniejszą ilość podjednostki α, ponieważ aktywność enzymatyczna odzwierciedla ilość enzymu. Z drugiej strony, wytworzona podjednostka α może być w jakiś sposób zablokowana przez podjednostkę γ, albo mimo, że podjednostka α ulega pełnej ekspresji jako białko, to nie może osiągnąć trójwymiarowej struktury dla przejawiania aktywności enzymatycznej z powodu braku podjednostki γ, i w ten sposób aktywność enzymatyczna staje się niska. W obu przypadkach, wysoką aktywność enzymatyczną można uzyskać, jeśli podjednostka γ ulega ekspresji razem z podjednostka α.
<3> DNA według wynalazku
DNA według wynalazku można otrzymać z mikroorganizmu zawierającego DNA, na przykład Burkhorderia cepacia. DNA wyizolowano z chromosomalnego DNA Burkhorderia cepacia. Jednakże, ujawnienie jego sekwencji nukleotydowej oraz sekwencji aminokwasowej kodowanej przez tę sekwencję nukleotydową pozwala by to DNA również otrzymać przez syntezę chemiczną w oparciu o te sekwencje. Ponadto, DNA według wynalazku można również otrzymać z chromosomalnego DNA Burkhorderia cepacia lub podobnie przez hybrydyzację, bądź PCR stosując, jako sondę lub starter, oligonukleotyd przygotowany na podstawie tej sekwencji.
W dodatku DNA, który koduje białko posiadające sekwencję aminokwasową według sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3, DNA wed ł ug wynalazku mo ż e być DNA, który koduje białko posiadają ce sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3, obejmującą podstawienie, delecję, insercję lub addycję jednej lub więcej reszt aminokwasowych i wykazujące aktywność GDH.
Jako DNA według wynalazku, można w szczególności wymienić DNA posiadający sekwencję nukleotydową nukleotydów o numerach od 764 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1. Sekwencja nukleotydowa nukleotydów o numerach od 764 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1 koduje podjednostkę α GDH posiadającą sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3.
Ponadto, DNA według wynalazku może również być DNA, który jest zdolny do hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową nukleotydów o numerach od 764 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1 lub z sondą, którą można przygotować z sekwencji w ostrych warunkach, i który koduje białko wykazujące aktywność GDH.
Uważa się, że sekwencja nukleotydowa nukleotydów o numerach od 258 do 761 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1 koduje podjednostkę γ. Sekwencję aminokwasową przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2. Uważa się, że ponieważ gen strukturalny podjednostki γ znajduje się w regionie przed regionem genu podjednostki α, i w ten sposób podjednostka γ ulega ekspresji jako pierwsza i istnieje już jako białko podczas wytwarzania podjednostki α przez mikroorganizm, to podjednostka α może być wydajnie wytwarzana w mikroorganizmie. Dlatego też, DNA według wynalazku może obejmować DNA, kodujący sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 2, w dodatku do uprzednio wspomnianego DNA.
DNA, kodujący białko zasadniczo identyczne z białkiem posiadającym sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 3, można otrzymać, na przykład metodą taką jak mutageneza ukierunkowana lub traktowanie mutagenem. Aktywność GDH białka kodowanego przez DNA z wprowa6
PL 207 576 B1 dzoną mutacją można mierzyć, na przykład, następująco: Próbkę enzymu i glukozę, jako substrat, dodaje się do 10 mM buforu fosforanu potasu (pH 7,0) zawierającego 594 μΜ metosiarczanu metylofenazyny (mPMS) oraz 5,94 μM 2,6-dichlorofenoloindofenolu (DCIP) i inkubuje się w temperaturze 37°C. Stosując spektrofotometr, monitoruje się zmiany absorbancji DCIP przy fali o długości 600 nm a szybkość zmniejszania się absorbancji jest miarą szybkości reakcji enzymatycznej.
Ponadto, sekwencję nukleotydową składającą się z nukleotydu numer 2386 i sekwencji znajdującej się za nukleotydem numer 2386 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1 uważa się za kodującą podjednostkę β. Ponadto, sekwencję nukleotydową nukleotydów o numerach od 2386 do 2451 uważa się za kodującą peptyd sygnałowy podjednostki β. Oszacowana sekwencja aminokwasowa tego peptydu sygnałowego jest sekwencją aminokwasową aminokwasów o numerach 1 do 22 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4. Peptyd sygnałowy jest peptydem koniecznym, aby białko syntetyzowane w rybosomie ulegało sekrecji przez błonę i stwierdzono, że zawiera on 15 do 30 hydrofobowych reszt aminokwasowych. Dlatego też, ponieważ ilość białek w supernatancie hodowlanym wzrasta dzięki obecności peptydu sygnałowego, jest to peptyd wydajnie działający w sposobie wytwarzania białka.
Wyjaśniono sposób otrzymywania DNA według wynalazku.
Chromosomalny DNA izoluje się z mikroorganizmu, takiego jak Burkhorderia cepacia i oczyszcza a następnie chromosomalny DNA rozszczepia się przez rozbijanie ultradźwiękami, traktowanie enzymami restrykcyjnymi lub podobnie, liguje z liniowym wektorem ekspresyjnym i przeprowadza w postać kolistą, stosując ligazę DNA lub podobnie, w celu skonstruowania rekombinowanego wektora. Otrzymany rekombinowany wektor wprowadza się do gospodarza będącego mikroorganizmem, w którym wektor ulega autonomicznej replikacji i transformanty przeszukuje się, stosując jako wskaźniki marker wektora i aktywność enzymatyczną, w celu otrzymania mikroorganizmu niosącego rekombinowany wektor, zawierający gen kodujący GDH. Oczekuje się, że rekombinowany wektor, zawarty w otrzymanym mikroorganizmie, zawiera co najmniej sekwencję nukleotydową kodującą podjednostkę α. Ponadto, jeśli sklonowany fragment posiada właściwą wielkość, jest bardzo prawdopodobne, że zawiera on również sekwencję nukleotydową kodującą podjednostkę γ.
Następnie, mikroorganizm posiadający rekombinowany wektor można hodować, rekombinowany wektor można izolować z komórek hodowanego mikroorganizmu i oczyszczać, a gen kodujący GDH można odzyskać z wektora ekspresyjnego. Na przykład, chromosomalny DNA służący jako donor genu szczególnie odzyskuje się, na przykład następująco:
Mikroorganizm będący donorem genu można hodować na wytrząsarce, na przykład, przez 1 do 3 dni a komórki zbierać przez wirowanie z otrzymanej brzeczki hodowlanej, a następnie lizować w celu przygotowania lizatu komórkowego zawierającego gen GDH. Jako metodę lizy komórki traktuje się enzymem bakteriolitycznym, takim jak lizozym i inne enzymy, takie jak proteaza oraz czynniki powierzchniowo czynne, takie jak siarczan sodowy dodecylu (SDS), stosowane w połączeniu, jeśli jest to pożądane. Można również wykorzystywać w połączeniu fizyczne metody niszczenia komórek, takie jak zamrażanie i rozmrażanie oraz traktowanie z zastosowaniem prasy francuskiej.
DNA można izolować i oczyszczać z lizatu, otrzymanego w sposób opisany powyżej, w konwencjonalny sposób, na przykład przez odpowiednią kombinację odbiałczania przez traktowanie fenolem lub traktowanie proteazą, traktowanie rybonukleazą, wytrącanie alkoholem i inne.
DNA wyizolowany i oczyszczony z mikroorganizmu można rozszczepiać, na przykład, przez rozbijanie ultradźwiękami, traktowanie enzymami restrykcyjnymi lub podobnie. Korzystnie, odpowiednie jest stosowanie enzymu restrykcyjnego typu II, który działa na specyficzną sekwencję nukleotydową. Stosowany enzym restrykcyjny może tworzyć lepkie końce trawionego końca wektora lub tępe końce trawionego końca można utworzyć stosując arbitralny enzym restrykcyjny i zligować z wektorem.
Jako wektor stosowany do klonowania odpowiedni jest fag, który może autonomicznie namnażać się w mikroorganizmie będącym gospodarzem lub plazmid, który skonstruowano dla rekombinowanego genu. Przykłady fagów obejmują, na przykład, jeśli jako mikroorganizm będący gospodarzem stosuje się Escherichia coli, lambda gt10, lambda gt11 i inne. Ponadto przykłady plazmidów obejmują, jeśli jako mikroorganizm będący gospodarzem stosuje się Escherichia coli, pBR322, pUC18, pUC118, pUC19, pUC119, pTrc99A i pBluescript, jak również SuperCosI, który jest kosmidem.
Po sklonowaniu, fragment wektora można otrzymać przez trawienie wektora enzymem restrykcyjnym stosowanym do trawienia DNA mikroorganizmu, jako donora genu kodującego GDH. Jednakże, niekoniecznie trzeba zastosować enzym restrykcyjny identyczny jak stosowano do trawienia DNA mikroorganizmu. Metoda ligacji fragmentu DNA mikroorganizmu i fragmentu DNA wektora może być
PL 207 576 B1 znaną metodą z zastosowaniem ligazy DNA. Na przykład, liguje się lepki koniec fragmentu DNA mikroorganizmu i lepki koniec fragmentu wektora a następnie tworzy się rekombinowany wektor zawierający fragment DNA mikroorganizmu i fragment DNA wektora, stosując odpowiednią ligazę DNA. Jeśli jest to pożądane, po ligacji, fragment można również wprowadzić do mikroorganizmu będącego gospodarzem z wykorzystaniem ligazy DNA występującej w mikroorganizmie w celu wytwarzania rekombinowanego wektora.
Nie ma szczególnych ograniczeń dotyczących mikroorganizmu będącego gospodarzem stosowanym do klonowania dopóki rekombinowany wektor jest stabilny i może autonomicznie namnażać się w gospodarzu a obcy gen może ulegać ekspresji w gospodarzu. Generalnie, można stosować
Escherichia coli DH5a, XL-1 BlueMR i inne.
Jako metodę wprowadzania rekombinowanego wektora do mikroorganizmu będącego gospodarzem, na przykład, jeśli mikroorganizmem będącym gospodarzem jest Escherichia coli, można stosować metodę z zastosowaniem komórek kompetentnych z wykorzystaniem traktowania wapniem, elektroporację i podobne.
To czy sklonowany fragment, tak otrzymany, koduje GDH można potwierdzić przez rozszyfrowanie sekwencji nukleotydowej fragmentu w konwencjonalny sposób.
DNA według wynalazku można otrzymać przez odzyskanie rekombinowanego wektora z transformanta, otrzymanego jak opisano powyżej.
GDH można wytwarzać przez hodowanie transformanta zawierającego DNA według wynalazku lub rekombinowany wektor zawierający DNA, w celu wytwarzania GDH jako produktu ekspresji DNA i zbieranie go z komórek lub brzeczki hodowlanej. Chociaż DNA według wynalazku może być DNA kodującym podjednostkę α, to wydajność ekspresji można zwiększyć przez dodatkową ekspresję podjednostki γ, razem z podjednostką α.
Przykłady mikroorganizmu, w którym wytwarza się GDH obejmują bakterie jelitowe, takie jak
Escherichia coli, Gram-ujemne bakterie, takie jak te z rodzaju Pseudomonas i Gluconobacter, Gramdodatnie bakterie, takie jak Bacillus subtilis, drożdże, takie jak Saccharomyces cerevisiae i grzyby nitkowate, takie jak Aspergillus niger. Jednakże, mikroorganizmu nie ogranicza się do tych mikroorganizmów, i jako gospodarza można stosować dowolny mikroorganizm, odpowiedni do wytwarzania obcych białek.
Gen GDH zawarty w wyselekcjonowanym rekombinowanym wektorze zawierającym gen GDH można bez trudu przenosić do rekombinowanego wektora, który może ulegać replikacji w mikroorganizmie przez odzyskiwanie DNA, który jest genem GDH, z rekombinowanego wektora zawierającego gen GDH dzięki zastosowaniu enzymu restrykcyjnego lub przez PCR i ligację z innym fragmentem wektora. Ponadto, mikroorganizm można bez trudu transformować tymi wektorami, na przykład metodą z zastosowaniem komórek kompetentnych w wykorzystaniem traktowania wapniem dla bakterii z rodzaju Escherichia, metodę z zastosowaniem protoplastów dla bakterii z rodzaju Bacillus, metodę KU lub KUR dla drożdży, metodę mikromanipulacji dla grzybów nitkowatych. Ponadto, powszechnie można również stosować metodę elektroporacji.
Mikroorganizm będący gospodarzem, do którego wprowadza się docelowy rekombinowany wektor można selekcjonować przez poszukiwanie mikroorganizmu, w którym jednocześnie ulega ekspresji marker oporności na lek wektora zawierającego docelowy DNA oraz aktywność GDH. Na przykład, można wyselekcjonować mikroorganizm rosnący w podłożu selektywnym, w oparciu o marker oporności na lek, i wytwarzający GDH.
Odnośnie metody hodowli transformanta, warunki hodowli można wybrać uwzględniając wymagania odżywcze i właściwości fizjologiczne gospodarza. W wielu przypadkach, prowadzi się hodowlę płynną. Z punktu widzenia przemysłu, korzystne jest prowadzenie hodowli tlenowej z mieszaniem.
Jeśli chodzi o składniki odżywcze podłoża, te zwykle stosowane do hodowli mikroorganizmów można szeroko stosować. Odnośnie źródeł węgla, można stosować dowolne związki węgla, które mogą być asymilowane, na przykład: glukozę, sacharozę, laktozę, maltozę, laktozę, melasę, kwas pirogronowy i inne. Ponadto, jako źródła azotu, można stosować dowolne związki azotu, które mogą być wykorzystywane - przykładowo pepton, ekstrakty mięsne, ekstrakt drożdżowy, hydrolizat kazeiny, alkaliczny ekstrakt mąki sojowej i inne. Ponadto, jeśli jest to pożądane, stosuje się sole kwasu fosforowego, sole kwasu węglowego, sole kwasu siarkowego, sole magnezu, wapnia, potasu, żelaza, manganu, cynku i inne, określone aminokwasy, określone witaminy i inne.
Chociaż temperatura hodowli może się odpowiednio zmieniać w zakresie, w którym bakterie rosną i wytwarzają GDH, korzystnie wynosi ona od około 20°C do 42°C. Czas hodowli różni się nieco
PL 207 576 B1 w zależ noś ci od warunków. Jednakż e, hodowlę moż na zakończyć we wł a ś ciwym czasie ocenianym jako pozwalający uzyskać maksymalny poziom GDH, a ten czas hodowli wynosi zazwyczaj od około 12 do 72 godzin. Chociaż pH podłoża może się odpowiednio zmieniać w zakresie, w którym bakterie rosną i wytwarzają GDH, korzystnie pozostaje ono w zakresie od pH około 6,0 do 9,0.
Brzeczkę hodowlaną zawierającą komórki wytwarzające GDH w hodowli można zbierać i wykorzystywać jako taką. Jednakże, jeśli GDH znajduje się w brzeczce hodowlanej, brzeczkę hodowlaną zazwyczaj rozdziela się, na roztwór zawierający GDH i komórki mikroorganizmu, stosując filtrację, wirowanie i podobne, a następnie komórki niszczy się metodą mechaniczną lub metodą enzymatyczną, taką jak z zastosowaniem lizozymu, po czym dodaje się czynnik chelatujący, taki jak EDTA i czynnik powierzchniowo czynny dla solubilizacji GDH, jeśli jest to pożądane w celu wyizolowania i zebrania GDH w postaci roztworu wodnego.
GDH można wytrącać z roztworu zawierającego GDH, otrzymanego jak opisano powyżej, na przykład przez zatężanie pod zmniejszonym ciśnieniem, zatężanie membranowe, wysalanie siarczanem amonowym, siarczanem sodowym i podobne, lub przez wytrącanie frakcyjne za pomocą hydrofilowego rozpuszczalnika organicznego, takiego jak metanol, etanol i aceton. Ponadto, wydajnym sposobem oczyszczania może być traktowanie gorącem i w punkcie izoelektrycznym. Następnie, w celu otrzymania oczyszczonej GDH, GDH można oczyszczać przez odpowiednią kombinację filtracji żelowej z zastosowaniem adsorbenta lub czynnika filtracji żelowej, chromatografii absorpcyjnej, chromatografii jonowymiennej oraz chromatografii powinowactwa.
Oczyszczony preparat enzymu można otrzymać przez izolację i oczyszczanie oparte na chromatografii kolumnowej. Chociaż oczyszczony preparat enzymu jest korzystnie oczyszczony w takim stopniu, że w elektroforezie (SDS-PAGE) powinno się uzyskiwać jeden prążek, może on zawierać podjednostkę γ.
Oczyszczony enzym, otrzymany jak opisano powyżej można przygotować w postaci proszku przez, na przykład, liofilizację, suszenie pod zmniejszonym ciśnieniem, suszenie rozpyłowe lub podobnie i rozdzielić.
Ponadto, sekwencję aminokwasową podjednostki β można również określić tak samo jak w przypadku okreś lania sekwencji aminokwasowej podjednostki α , co opisano w przykł adach i w oparciu o sekwencję moż na wyizolować DNA kodują cy podjednostkę β . Ponadto, stosują c otrzymany DNA można również wytworzyć podjednostkę β. Ponadto, można również utworzyć enzym multimeryczny stosując DNA kodujący podjednostkę α oraz DNA kodujący podjednostkę β.
<4> Sensor glukozy według wynalazku
Sensor glukozy, według wynalazku, charakteryzuje się wykorzystaniem enzymu według wynalazku (uprzednio wspomnianego enzymu multimerycznego lub enzymu peptydowego, bądź enzymu multimerycznego lub enzymu peptydowego zawierającego podjednostkę γ), transformanta według wynalazku lub mikroorganizmu według wynalazku (szczep KS1 Burkhorderia cepacia) jako elektrody enzymatycznej. Jako elektrodę można stosować elektrodę węglową, elektrodę złotą, elektrodę platynową i enzym według wynalazku immobilizuje się na tej elektrodzie. Przykłady metod immobilizacji obejmują metodę ze stosowaniem odczynników sieciujących, metodę zamykania enzymu w macierzy polimerycznej, metodę powlekania enzymu membraną dializacyjną, metody ze stosowaniem polimeru, którego sieciowanie zachodzi pod wpływem światła, polimeru przewodzącego, polimeru oksydacyjnoredukującego lub podobnych. Alternatywnie, enzym można immobilizować w polimerze lub na elektrodzie przez adsorpcję razem z mediatorem elektronicznym, którego typowymi przykładami są ferrocen i jego pochodne. Metody te można też stosować w połączeniu. Zazwyczaj, dehydrogenazę glukozową immobilizuje się na elektrodzie węglowej stosując aldehyd glutarowy, i aldehyd glutarowy blokuje się odczynnikiem posiadającym grupę aminową.
Stężenie glukozy można mierzyć następująco: w komorze o stałej temperaturze umieszcza się bufor i dodaje razem z mediatorem, utrzymuje się stałą temperaturę. Jako mediator można stosować żelazicyjanek, metosiarczan fenazyny i tym podobne. Stosuje się elektrodę, na której immobilizowano enzym według wynalazku jako elektrodę roboczą, przeciwelektrodę (np. elektrodę platynową) oraz elektrodę odniesienia (np. elektrodę Ag/AgC). Do elektrody węglowej doprowadza się stałe napięcie i, po uzyskaniu prądu ustalonego, dodaje się próbkę zawierającą glukozę a następnie mierzy się wzrost natężenia prądu. Stężenie glukozy w próbce można obliczać na podstawie krzywej kalibracyjnej, utworzonej przez zastosowanie roztworów glukozy o standardowych stężeniach.
PL 207 576 B1 <5> Zestaw do oznaczania glukozy według wynalazku
Zestaw do oznaczania sacharydów według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje enzym według wynalazku (uprzednio wspomniany enzym multimeryczny lub enzym peptydowy, bądź uprzednio wspomniany enzym multimeryczny lub enzym peptydowy zawierający podjednostkę γ). Zestaw do oznaczania glukozy według wynalazku obejmuje enzym według wynalazku w ilości wystarczającej do co najmniej jednego oznaczenia. Zazwyczaj, zestaw obejmuje, poza enzymem według wynalazku, bufor, mediator, standardowe roztwory glukozy lub podobne do utworzenia krzywej kalibracyjnej, która jest konieczna do oznaczania oraz instrukcję użycia. Enzym według wynalazku można dostarczyć w różnych postaciach, na przykład, jako liofilizowany odczynnik lub roztwór w odpowiednim roztworze do przechowywania.
Krótki opis rysunków
Fig. 1 przedstawia masę cząsteczkową enzymu według wynalazku określoną przez natywną elektroforezę PAGE.
Fig. 2 przedstawia zdjęcie żelu elektroforetycznego pokazujące masę cząsteczkową enzymu według wynalazku w oparciu o elektroforezę SDS-PAGE.
Fig. 3 przedstawia optymalną temperaturę reakcji (a) i stabilność termiczną (b) według wynalazku. Fig. 4 przedstawia optymalną temperaturę reakcji (a) i stabilność termiczną (b) enzymu peptydowego stanowiącego tylko podjednostkę α enzymu według wynalazku.
Fig. 5 przedstawia wyniki analiz spektrofotometrycznych enzymu według wynalazku przy nieobecności i obecności glukozy przed traktowaniem ciepłem (a) oraz wyniki analiz spektrofotometrycznych enzymu według wynalazku przy nieobecności i obecności glukozy po traktowaniu ciepłem (b).
Fig. 6 przedstawia odpowiedzi sensora glukozy, wykorzystującego GDH otrzymaną z transformanta, na glukozę w różnych temperaturach.
Wynalazek zostanie wyjaśniony bardziej szczegółowo w poniższych przykładach.
P r z y k ł a d 1:
Zdobycie bakterii wykazującej zdolność wytwarzania dehydrogenazy glukozowej
Mikroorganizm według wynalazku otrzymano przez zbieranie gleby w pobliżu gorących źródeł w Japonii i wyselekcjonowanie bakterii wykazującej aktywność dehydrogenazy glukozowej spośród bakterii wykorzystujących glukozę jako składnik odżywczy z gleby.
Poniżej przedstawiono wyniki badań dotyczących charakterystyki morfologicznej, charakterystyki wzrostu i charakterystyki fizjologicznej szczepu.
[Charakterystyka bakteriologiczna]
barwienie Grama ujemne
morfologia komórki pałeczka z biegunową wicią
ruchliwość dodatnia
liczba fragmentów > 5
optymalna temperatura wzrostu 45°C
oksydaza ujemna
katalaza dodatnia
wytwarzanie acetoiny ujemne
wytwarzanie H2S ujemne
wytwarzanie indolu ujemne
kwas z glukozy dodatni
dihydrolaza argininowa ujemna
ureaza ujemna
β-glukozydaza ujemna
proteaza ujemna
β-galaktozydaza dodatnia
karboksylaza lizynowa ujemna
karboksylaza ornitynowa ujemna
redukcja azotanu dodatnia
[Charakterystyka asymilacji]
glicerol dodatni
erytritol ujemny
PL 207 576 B1
D-arabinoza
L-arabinoza ryboza
D-ksyloza
L-ksyloza adonitol β-metyloksylozyd galaktoza
D-glukoza
D-fruktoza
D-mannoza
L-sorboza ramnoza dulcytol inozytol mannitol sorbitol α-metylo-D-mannozyd α-metylo-D-glukozyd
N-acetyloglukozoamina amigdalina arbutyna eskulina salicyna celobioza maltoza laktoza melibioza sacharoza trehaloza inulina melezytoza
D-rafinoza amidon glikogen ksylitol β-gentiobioza
D-turanoza
G-liksoza
D-tagatoza
D-fukoza
D-arabitol
L-arabitol kwas glukonowy kwas 2-ketoglukonowy kwas 5-ketoglukonowy kwas kaprynowy kwas adypinowy kwas jabłkowy kwas cytrynowy octan fenylu
[Charakterystyka oksydacyjna] glicerol erytritol
D-arabinoza ujemna dodatnia dodatnia dodatnia ujemna dodatni ujemny dodatnia dodatnia dodatnia dodatnia ujemna ujemna dodatnia dodatni dodatni dodatni ujemny ujemny dodatnia ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna dodatnia ujemna ujemna ujemna ujemny ujemny dodatni ujemna ujemna ujemna ujemna ujemna dodatni dodatni dodatni dodatni ujemny dodatni dodatni dodatni dodatni dodatni ujemny ujemny ujemna
PL 207 576 B1
L-arabinoza ryboza
D-ksyloza
L-ksyloza adonitol β-metyloksylozyd galaktoza
D-glukoza
D-fruktoza
D-mannoza
L-sorboza ramnoza dulcytol inozytol mannitol sorbitol α-metylo-D-mannozyd α-metylo-D-glukozyd
N-acetyloglukozoamina amigdalina arbutyna eskulina salicyna celobioza maltoza laktoza melibioza sacharoza trehaloza inulina melezytoza
D-rafinoza amidon glikogen ksylitol β-gentiobioza
D-turanoza
G-liksoza
D-tagatoza
D-fukoza
D-arabitol
L-arabitol kwas glukonowy kwas 2-ketoglukonowy kwas 5-ketoglukonowy dodatnia dodatnia dodatnia ujemna dodatni ujemny dodatnia dodatnia dodatnia dodatnia ujemna ujemna dodatni dodatni dodatni dodatni ujemny ujemny ujemna ujemna ujemna dodatnia ujemna dodatnia dodatnia dodatnia ujemna ujemna dodatnia ujemna ujemna ujemna ujemny ujemny ujemny dodatnia ujemna ujemna ujemna dodatnia dodatni dodatni ujemny ujemny ujemny
Pozycję taksonomiczną szczepu KS1 posiadającego wyżej przedstawione właściwości bakteriologiczne ustalono w odniesieniu do Bergey's Manual of Determinative Bacteriology i szczep identyfikowano jako należący do rodzaju Burkhorderia, i jest on szczepem Burkhorderia cepacia.
Rodzaj Burkhorderia zwyczajowo klasyfikowano do rodzaju Pseudomonas, ale obecnie klasyfikuje się go oddzielnie do rodzaju Burkhorderia (Yabuuchi, E., Kosako, Y., Oyaizu, H., Yano, I., Hotta, H., Hashimoto, Y., Ezaki, T. i Arakawa, M., Microbiol. Immunol. tom 36 (12): 1251-1275 (1992); International Journal of Systematic bacteriology, Apr., 1993, str. 398-399).
Ponadto, twórcy wynalazku otrzymali kilka szczepów Burkhorderia cepacia, innych niż szczep KS1 Burkhorderia cepacia, które zdeponowali w Institute for Fermentation, Osaka lub w Japan Collec12
PL 207 576 B1 tion of Microorganisms (JCM), Institute of Physical and Chemical Research, i mierzyli aktywność dehydrogenazy glukozowej tych szczepów oraz potwierdzili, że wykazują one taką aktywność.
Aktywność dehydrogenazy glukozowej mierzono metodą opisaną w przykładzie 2. Względne aktywności tych szczepów, w odniesieniu do aktywności enzymatycznej frakcji rozpuszczalnej w wodzie szczepu KS1, którą przyjęto jako 100, przedstawiono w tablicy 1.
T a b l i c a 1
Szczep bakteryjny Aktywność dehydrogenazy glukozowej
70°C 45°C
KS1 frakcja rozpuszczalna w wodzie 100 100
JCM5506 frakcja rozpuszczalna w wodzie 100 100
frakcja membranowa 100 100
JCM5507 frakcja rozpuszczalna w wodzie 100 100
frakcja membranowa 100 100
JCM2800 frakcja rozpuszczalna w wodzie 100 100
JCM2801 frakcja rozpuszczalna w wodzie 100 100
IFO15124 frakcja rozpuszczalna w wodzie 100 100
IFO14595 frakcja rozpuszczalna w wodzie 100 100
P r z y k ł a d 2
Ekstrakcja dehydrogenazy glukozowej <1> Hodowla komórek
Jako warunki hodowli bakterii, zastosowano zwykłe warunki hodowli tlenowej. Komórki hodowano w temperaturze 34°C w ciągu 8 godzin w 7 litrach podłoża, zawierającego następujące składniki na litr.
polipepton 10 g
ekstrakt drożdżowy 1 g
NaCl 5 g
KH2PO4 2 g
glukoza 5 g
Einol (ABLE Co., Tokio, Japonia) 0,14 g
całkowita objętość włącznie z wodą destylowaną 1 litr
doprowadzone pH 7,2
Brzeczkę hodowlaną o objętości 7 litrów wirowano przy 9000 x g, w temperaturze 4°C w ciągu
minut, otrzymując około 60 g komórek.
<2> Przygotowanie wstępnie oczyszczonej frakcji
Komórki, w ilości 60 g, zawieszono w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 6,0) i komórki poddano działaniu ciśnienia różnicowego wynoszącego 1500 Kg/cm2 stosując prasę francuską (Otake Corporation, Tokio, Japonia) w celu zniszczenia błon komórkowych. Ekstrakt komórkowy wirowano przy 8000x g w ciągu 10 minut w celu usunięcia stałych pozostałości komórkowych. Następnie, supernatant poddawano ultrawirowaniu przy 69800 x g, w temperaturze 4°C w ciągu 90 minut, otrzymując około 8 g frakcji błonowej w postaci precypitatu.
<3> Oczyszczanie enzymu
Frakcję błonową ponownie zawieszono w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 6,0), zawierającym 1% Triton X-100, jako stężenie końcowe. Następnie zawiesinę wolno mieszano przez noc, w temperaturze 4°C. Po poddaniu zawiesiny ultrawirowaniu (69800 X g, 4°C, 90 minut), frakcję zsolubilizowanych błon ponownie wirowano w temperaturze 4°C, w ciągu 15 minut, przy 15000 x g dla otrzymania supernatantu.
Do zsolubilizowanej frakcji błonowej dodano taką samą objętość 10 mM buforu fosforanu potasu (pH 8,0), zawierającego 0,2% Triton X-100. Roztwór dializowano, a następnie nanoszono na kolumnę DEAE-TOYOPEARL (22 mm średnicy x 20 cm, Tosoh Coporation, Tokio, Japonia), równoważoną 10 mM buforem fosforanu potasu (pH 8,0), zawierającym 0,2% Triton X-100. Białka eluowano,
PL 207 576 B1 stosując gradient liniowy od 0 do 0,15 M NaCl w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 8,0). Szybkość przepływu wynosiła 5 ml/minutę. GDH ulegała elucji przy stężeniu NaCl wynoszącym w przybliżeniu 75 mM. Frakcje wykazujące aktywność GDH zbierano i dializowano przez noc wobec 10 mM buforu fosforanu potasu (pH 8,0; 4°C), zawierającego 0,2% Triton X-100.
Dalej, roztwór dializowanego enzymu nanoszono na kolumnę DEAE-5PW (8,0 mm średnicy x 7,5 cm, Tosoh Corporation, Tokio, Japonia. Kolumnę tą równoważono wcześniej 10 mM buforem fosforanu potasu (pH 6,0), zawierającym 0,2% Triton X-100. Białka eluowano, stosując gradient liniowy od 0 do 100 mM NaCl w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 8,0). Szybkość przepł ywu wynosiła 1 ml/minutę. Frakcje wykazujące aktywność GDH ulegał y elucji przy stężeniu NaCl wynoszą cym w przybliżeniu 20 mM. Frakcje wykazujące aktywność GDH zbierano i odsalano przez noc wobec 10 mM buforu fosforanu potasu (pH 8,0; 4°C), zawierającego 0,2% Triton X-100, w celu otrzymania oczyszczonego enzymu.
W tym i następnych przykł adach, aktywność GDH mierzono zgodnie z poniż ej podaną metodą .
Jako akceptory elektronów stosowano 2,6-dichlorofenoloindofenol (DCIP) i metosiarczan fenazyny (PMS). Reakcję przeprowadzano w rurce polietylenowej we wcześniej ustalonej temperaturze.
Roztwór enzymu o objętości 5 μΐ dodawano do 20 μΐ 25 mM buforu Tris-HCl (pH 8,0), zawierającego 0,75 mM PMS i 0,75 mM DCIP. Mieszaninę pozostawiano uprzednio na 1 minutę w stałej temperaturze. Reakcję rozpoczynano przez dodanie 1 μ!,1 2 M glukozy (stężenie końcowe: 77 mM) i pozostawiano w stałej temperaturze na 2 minuty. Następnie, w celu schłodzenia próbki dodawano 100 μl chłodzonej lodem wody destylowanej lub 120 μl 7,5 M mocznika. Reakcję redukcji akceptorów elektronów spowodowaną dehydrogenacją glukozy monitorowano stosując ultra-mikro komorę pomiarową (100 μθ i spektrofotometr (UV160, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonia, który umożliwia pomiar z zastosowaniem komory. To jest, mierzy się przy 600 nm, co jest długością fali absorpcji DCIP, odbarwianie w czasie, które jest spowodowane redukcją DCIP. Stosowano molowy współczynnik absorpcji DCIP (22, 23 mM X cm-1). Jedną jednostkę (U) enzymu zdefiniowano jako ilość utleniającą 1 μM glukozy na minutę w standardowych warunkach testowych. Stężenie białka mierzono metodą Lowry'ego.
P r z y k ł a d 3
Natywną elektroforezę PAGE przeprowadzano dla oczyszczonego enzymu. Elektroforezę przeprowadzano w gradiencie od 8 do 25% żelu poliakryloamidowego, stosując układ buforowy Tris-alanina zawierający 1% Triton X-100. Żel wybarwiano azotanem srebra. Jako markery białkowe stosowano tyroglobulinę (669 kDa), ferrytynę (440 kDa), katalazę (232 kDa), aldolazę (158 kDa), albuminę surowicy bydlęcej (67 kDa), albuminę jaja kurzego (43 kDa) i chymotrypsynogen A (25 kDa).
Następnie, wybarwianie aktywności przeprowadzano dla natywnego żelu PAGE, inkubując żel w następującym roztworze w ciągu 30 minut. W miejscach aktywności GDH, błękit nitrotetrazoliowy ulegał redukcji i powstawał formazan, co powodowało powstawanie barwy ciemnopurpurowej.
200 mM glukozy
0,1 mM błękitu nitrotetrazoliowego
0,3 mM metosiarczanu fenazyny mM buforu Tris-HCl (pH 8,0)
Na podstawie wyników barwienia srebrem w natywnej PAGE, oceniono, że enzym składał się z jednego rodzaju enzymu i posiadał masę cząsteczkową wynoszącą około 400 kDa. Następnie, żel wybarwiano pod kątem aktywności; aktywność obserwowano w miejscach o tej samej ruchliwości co w barwieniu srebrem (fig. 1, Ścieżka 1 przedstawia wyniki barwienia srebrem markerów białkowych o standardowych masach cząsteczkowych. Ścieżka 2 przedstawia barwienie srebrem enzymu, a Ścieżka 4 przedstawia barwienie aktywności enzymu). Po ogrzewaniu enzymu w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut, nieoczekiwanie stwierdzono, że aktywność się zachowała, wyizolowano białka enzymu, z których jedno wykazywało aktywność i posiadało masę cząsteczkową wynoszącą około 85 kDa (patrz fig. 1, Ścieżka 3 przedstawia wyniki barwienia srebrem enzymu ogrzewanego w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut, a Ścieżka 5 przedstawia wyniki barwienia aktywności enzymu ogrzewanego w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut). Wyniki te sugerują, że enzym składa się z podjednostek.
P r z y k ł a d 4
Roztwór oczyszczonego enzymu poddawano SDS-PAGE. SDS-PAGE przeprowadzano w gradiencie żelu poliakryloamidowego od 8 do 25%, stosując bufor Tris-trycynowy. Białka w żelu wybarwiano azotanem srebra. Rozdział i rozwijanie przeprowadzano automatycznie stosując Phast System (Pharmacia). Masę cząsteczkową określano, opierając się na względnej migracji białek standardowych. Stosując SDS-PAGE, rozdzielono białka enzymu o masach cząsteczkowych około 60 kDa i 43 kDa. (fig. 2).
PL 207 576 B1
Fig. 2 jest zdjęciem żelu elektroforetycznego. Na tej figurze, Ścieżka 1 przedstawia wyniki barwienia azotanem srebra markerów białkowych posiadających standardowe masy cząsteczkowe, a Ścieżka 2 przedstawia wyniki barwienia azotanem srebra enzymu). A zatem, sugeruje to, że podjednostka a o masie cząsteczkowej 60 kDa i podjednostka β o masie cząsteczkowej 43 kDa łączą się w enzym, i przypuszcza się, że cztery każdej z tych podjednostek tworzą oktamer, łącząc się wzajemnie ze sobą.
Podjednostkę β, białko o masie cząsteczkowej 43 kDa oddzielone przez SDA-PAGE, przeniesiono na membranę z polifluorku winylidenu, a następnie określono sekwencję aminokwasową końca N podjednostki β, stosując sekwenator aminokwasowy (PPSQ-10, Shimadzu Corporation). W wyniku stwierdzono, że sekwencja aminokwasową końca N białka składa się z 16 reszt sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 5.
Ponadto, wyniki otrzymane dla enzymu poddawanego traktowaniu przez ogrzewanie w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut przedstawiono jako Ścieżkę 3 na fig. 2. Na podstawie wyników otrzymanych w SDS-PAGE, można przypuszczać, że enzym zmienił się po traktowaniu przez ogrzewanie w jednołańcuchowy polipeptyd o masie cząsteczkowej 60 kDa.
P r z y k ł a d 5
Enzym poddano chromatografii żelowej. Jako żel zastosowano żel TSK G3000SW (Tosoh Corporation), a kolumnę żelową (8,0 mm średnicy x 30 cm, Tosoh Corporation, Tokio, Japonia) równoważono roztworem zawierającym 0,3 M NaCl i 0,1% Triton X-100 w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 6,0).
Zbierano frakcje (125 μΐ). Do określania masy cząsteczkowej oczyszczonego enzymu stosowano 7 rodzajów markerów białkowych. Jako markery białkowe stosowano: tyroglobulinę (669 kDa), ferrytynę (440 kDa), katalazę (232 kDa), aldolazę (158 kDa), albuminę surowicy bydlęcej (67 kDa), albuminę jaja kurzego (43 kDa) i chymotrypsynogen A (25 kDa).
Potwierdzono, że masa cząsteczkowa enzymu wynosiła około 380 kDa.
P r z y k ł a d 6
Sprawdzano optymalną temperaturę oczyszczonego enzymu.
Enzym inkubowano najpierw w buforze Tris-HCl (pH 8,0) we wcześniej określonej temperaturze w ciągu 1 minuty, a następnie rozpoczynano reakcję. Aktywność mierzono we wcześniej określonej temperaturze reakcji. Optymalną temperaturę obserwowano około 45°C (Fig. 3 (a)). Ponadto, pik obserwowano również około temperatury 75°C, chociaż aktywność była niższa niż aktywność w temperaturze około 45°C.
Ponadto, w celu sprawdzenia stabilności termicznej enzymu, enzym pozostawiono w każdej stałej z tych temperatur na 30 minut i mierzono pozostałą aktywność enzymatyczną w temperaturze 45°C (fig. 3 (b)).
P r z y k ł a d 7
Sprawdzano temperaturę optymalną i stabilność termiczną enzymu peptydowego składającego się z pojedynczego oligopeptydu o masie cząsteczkowej 60 kDa, otrzymanego przez ogrzewanie enzymu w temperaturze 70°C w ciągu 30 minut.
Ten enzym peptydowy wykazywał temperaturę optymalną wyższą niż nieogrzewany enzym, jak również lepszą stabilność termiczną. Nie było dotąd doniesień o enzymie wykazującym takie zależności temperaturowe.
Enzym inkubowano najpierw w buforze Tris-HCl (pH 8,0) we wcześniej określonej temperaturze w ciągu 1 minuty, a następnie rozpoczynano reakcję. Aktywność mierzono we wcześniej określonej temperaturze reakcji. Optymalną temperaturę obserwowano około 75°C (fig. 4 (a)).
Ponadto, w celu sprawdzenia stabilności termicznej enzymu, enzym pozostawiono w każdej stałej z tych temperatur na 30 minut i mierzono pozostałą aktywność enzymatyczną w temperaturze 70°C (Fig. 4 (b)).
P r z y k ł a d 8
W celu zbadania roli każdej podjednostki, przeprowadzano analizę spektrofotometryczną GDH przed i po traktowaniu przez ogrzewanie. Fig. 5 (a) i (b) przedstawiają absorpcję utlenionych i zredukowanych GDH przed i po traktowaniu przez ogrzewanie (w obecności glukozy). Absorpcja przy różnych długościach fali, utlenionej GDH przed traktowaniem przez ogrzewanie, która była oryginalną GDH, wykazywała charakterystyczny pik przy fali o długości 409 nm. Ponadto, pik przesuwał się do fali o długości 417 nm w obecności glukozy i obserwowano dwa dodatkowe piki przy fali o długości 523 nm i 550 nm (fig. 5 (a)). W przeciwieństwie, GDH po traktowaniu przez ogrzewanie nie wykazywała nadal charakterystycznego piku przy fali o długości 409 nm (fig. 5 (b)) i nie obserwowano znaczących różnic pomiędzy utlenioną a zredukowaną GDH.
PL 207 576 B1
Absorpcja przy różnych długościach fali, utlenionej GDH przed traktowaniem przez ogrzewanie, która była oryginalną GDH, była podobna do absorpcji dehydrogenazy alkoholowej lub dehydrogenazy aldehydowej składających się na kompleks dehydrogenaza-cytochrom Gluconobacter sp. lub Acetobacter sp. (Adachi, O., Tayama, K., Shinagawa, E., Matsushita, K. i Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 42, 2045-2056 (1978); Adachi, O., Miyagawa, E., Matsushita, K. i Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 42, 2331-2340 (1978); Ameyama, M. i Adachi, O., Methods Enzymol., 89, 450-457 (1982); Adachi, O., Tayama, K., Shinagawa, E., Matsushita, K. i Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 44, 503-515 (1980); Ameyama, M. i Adachi, O., Methods Enzymol., 89, 491-497, (1982)).
Wyniki wskazują na możliwość, że kompleks oligomeryczny GDH zawiera cytochrom. Dlatego też uważa się, że obserwowane długości fal, podobne do tych dla cytochromu C, można przypisać podjednostce β; zanikły one podczas traktowania przez ogrzewanie, a więc podjednostka β składa się z cytochromu C.
P r z y k ł a d 9
Prążek zawierający podjednostkę β, otrzymany przez elektroforezę w przykładzie 4, wycięto i analizowano sekwencję aminokwasową, stosując sekwenator peptydowy (PPSQ-10, Shimadzu Corporation). W wyniku, można było otrzymać sekwencję aminokwasową końca N, składającą się z 16 reszt przedstawionych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5.
Podjęto próbę zamplifikowania przez PCR regionu genu, kodującego wyżej wspomnianą sekwencję aminokwasową końca N składającą się z 16 reszt, opierając się na sekwencji peptydu. To jest, zaprojektowano dwa startery PCR posiadające sekwencję nukleotydową, od strony przed genem (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6), odpowiadającą 5 resztom końca N i, po przeciwnej stronie (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7), odpowiadającą nici antysensownej 5 reszt końca C w łańcuchu peptydowym składającym się z 16 reszt. Przeprowadzając PCR w konwencjonalny sposób dla genomu szczepu KS1, z wykorzystaniem pary starterów PCR, zamplifikowano fragment genu o wielkości około 50 bp. W wyniku określania, w konwencjonalny sposób, sekwencji nukleotydowej tego fragmentu genu rozpoznano 58 nukleotydów, obejmujących parę starterów PCR. Wśród tych nukleotydów, zanalizowano 18 nukleotydów z wyłączeniem starterów PCR, i stwierdzono sekwencję genu odpowiadającą regionowi od Pro, która była szóstą resztą od końca N wyżej wspomnianego końca N podjednostki β o długości 16 reszt, do Arg, która była jedenastą resztą (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8). A zatem, stwierdzono, że zamplifikowany fragment genu obejmował fragment genu podjednostki β.
Stwierdzono również, że w podjednostce β znajdują się 22 reszty aminokwasowe za podjednostką α. Oparto to na stwierdzeniu, że skoro sekwencja aminokwasową końca N oczyszczonej podjednostki β, określona w przykładzie 4, odpowiada pięciu resztom aminokwasowym otrzymanym w wyniku translacji sekwencji nukleotydowej nukleotydów o numerach od 2452 do 2466 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1, to sekwencje te są identyczne.
Ponadto, zakłada się, że sekwencja nukleotydowa nukleotydów o numerach od 2386 do 2451 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1 jest sekwencją dla peptydu sygnałowego podjednostki β. Sekwencja aminokwasowa kodowana przez tę sekwencję nukleotydową odpowiada aminokwasom o numerach od 1 do 22 w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 4.
P r z y k ł a d 10
Do 50 mM buforu fosforanu potasu (pH 7,5), zawierającego 0,1% Triton X-100 i 1 mM CaCl2, dodawano oczyszczony enzym i dostępny komercyjnie koenzym NAD GDH (w skrócie „NAD-GDH), w stężeniu 100 U/litr każdy i mieszano. Każdy roztwór umieszczano w gorącym zbiorniku w temperaturze 60°C i mierzono pozostałą aktywność.
T a b l i c a 2:
Pozostała aktywność względna (%)
Czas (minuty) NAD-GDH Enzym GDH
0 100 100
15 20 100
30 5 100
PL 207 576 B1
Potwierdzono, że enzym wykazywał zaskakującą stabilność termiczną w porównaniu z aktualnie komercyjnie dostępnym enzymem GDH. Stwierdzono, że enzym był nowym enzymem, który jest całkowicie inny od komercyjnie dostępnego NAD-GDH.
P r z y k ł a d 11:
Izolacja genu kodującego podjednostkę α GDH <1> Przygotowanie chromosomalnego DNA ze szczepu KS1 Burkhorderia cepacia
Chromosomalny gen wyizolowano ze szczepu KS1 Burkhorderia cepacia metodą konwencjonalną. Szczep bakteryjny wytrząsano przez noc w temperaturze 34°C stosując podłoże płynne TL (10 g polipeptonu, 1 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 2 g KH2PO4, 5 g glukozy w 1 litrze, pH 7,2). Namnożone komórki zbierano stosując wirówkę. Komórki zawieszano w roztworze zawierającym 10 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% SDS i 100 μg/ml proteinazy K i traktowano w temperaturze 50°C w ciągu 6 godzin. Do tej mieszaniny dodano równoważną objętość mieszaniny fenol-chloroform i mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut a następnie zbierano supernatant stosując wirówkę. Do supernatantu dodano octan sodowy w stężeniu końcowym 0,3 M i nawarstwiono na niego dwie objętości etanolu w celu wytrącenia chromosomalnego DNA w warstwie pośredniej. DNA zebrano szklaną bagietką, przemyto 70% etanolem i rozpuszczono w odpowiedniej ilości buforu TE w celu otrzymania roztworu chromosomalnego DNA.
<2> Określanie sekwencji aminokwasowej końca N podjednostki α GDH.
GDH oczyszczoną tak jak w przykładzie 2 zatężono przez liofilizację i rozdzielono przez elektroforezę z SDS stosując 12,5% poliakryloamid w celu wyizolowania podjednostki α. Otrzymaną podjednostkę α przeniesiono na membranę z polifluorku winylidenu, a następnie określano sekwencję aminokwasową końca N, stosując sekwenator aminokwasowy (PPSQ-10, Shimadzu Corporation). W wyniku, stwierdzono, że enzym obejmował sekwencję peptydu składającego się z 11 reszt aminokwasów o numerach od 2 do 12 w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 3.
<3> Klonowanie genu kodującego podjednostkę α μq DNA przygotowanego zgodnie z procedurą opisaną w <1> poddano częściowemu trawieniu enzymem restrykcyjnym Sau3AI i traktowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną (CIAP). Oddzielnie, SuperCosI (otrzymany ze STRATAGENE), który jest kosmidem, traktowano BamHI i fragment DNA otrzymany przez częściowe trawienie Sau3AI fragmentu chromosomalnego DNA pochodzącego ze szczepu α-15 włączono do SuperCosI, stosując ligazę DNA T4. Escherichia coli XL-1 Blue MR (otrzymany ze STRATAGENE) stransformowano uzyskanym rekombinowanym DNA. Transformanty selekcjonowano na podłożu agarowym LB zawierającym 10 μg/ml neomycyny i 25 μg/ml ampicyliny, na podstawie oporności na neomycynę i ampicylinę, które są markerami oporności na antybiotyki SuperCosI. Otrzymane transformanty hodowano w płynnym podłożu LB. Transformanty te zbierano i zawieszano w odczynniku do pomiaru aktywności GDH, i izolowano klony stosując jako wskaźnik aktywność dehydrogenazy wobec glukozy. W wyniku, otrzymano jeden klon szczepu wykazujący aktywność dehydrogenazy glukozowej.
<4> Subklonowanie
Fragmenty DNA zawierające docelowy gen wyizolowano z kosmidu SuperCosI obejmującego gen kodujący podjednostkę α otrzymaną w <3>. Wstawione fragmenty genu wycięto z kosmidu, stosując enzym restrykcyjny Notl. Te fragmenty DNA traktowano enzymem restrykcyjnym Xbal i wstawiono do plazmidu pUC18, strawionego Xbal. Szczep DH5aMCR Escherichia coli transformowano plazmidem pUC18, zawierającym każdy wstawiony fragment i zbierano kolonie, które wyrosły na podłożu agarowym LB, zawierającym 50 μg/ml ampicyliny. Otrzymane transformanty hodowano w płynnym podłożu LB i sprawdzano pod względem aktywności GDH w komórkach, tak jak w <3>. W wyniku, z jednego transformanta uzyskano szczep wykazujący aktywność GDH. Plazmid wyekstrahowano z tego transformanta i analizowano fragment wstawionego DNA. W wyniku, potwierdzono obecność wstawionego fragmentu o wielkości około 8,8 kbp. Plazmid ten oznaczono pKS1.
<5> Określanie sekwencji nukleotydowej
Sekwencję nukleotydową wstawionego fragmentu DNA w pKS1 określano przez analizę enzymami restrykcyjnymi i metodą konwencjonalną. W wyniku, w tym fragmencie DNA potwierdzono obecność sekwencji DNA kodującej koniec N sekwencji aminokwasowej podjednostki α otrzymanej w <2> i stwierdzono otwartą ramkę odczytu zawierającą tę sekwencję. Określoną sekwencję nukleotydową oraz sekwencję aminokwasową, która może być kodowana przez tę sekwencję nukleotydową przedstawiono w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 1 i 3. Masa cząsteczkowa białka
PL 207 576 B1 otrzymanego z sekwencji aminokwasowej wynosiła 59,831 Da i zasadniczo pasowała do masy cząsteczkowej 60 kDa otrzymanej przez SDS-PAGE podjednostki a szczepu KS1 Burkhorderia cepacia.
Ponieważ sekwencja nukleotydowa podjednostki α była określona, utworzono wektor wykorzystując gen strukturalny podjednostki α a następnie utworzono transformanty z tym wektorem.
Najpierw przygotowano gen, który miał być wstawiony do wektora.
Przeprowadzono amplifikację przez PCR stosując fragment genomu pochodzący ze szczepu KS1 jako matrycę tak, że powinno być włączone pożądane miejsce restrykcyjne. W PCR zastosowano następującą parę starterów oligonukleotydowych.
(starter „forward)
5'-CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9) (starter „ reverse)
5'- GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10)
Gen zamplifikowany przez PCR trawiono enzymem restrykcyjnym Hindlll i wstawiono do wektora ekspresyjnego pFLAG-CTS (SIGMA) w jego miejscu do klonowania, miejscu Hindlll. Otrzymany plazmid oznaczono jako pFLAG-CTS/α.
Szczep DH5aMCR Escherichia coli stransformowano plazmidem pFLAG-CTS/α i zbierano kolonie, które wyrosły na podłożu agarowym LB, zawierającym 50 μg/ml ampicyliny.
Następnie, kiedy poszukiwano otwartej ramki odczytu wstawionego fragmentu pKS1 przed podjednostką α, znaleziono gen strukturalny o długości 507 nukleotydów, kodujący polipeptyd zawierający 168 reszt aminokwasowych przedstawionych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 (nukleotydy o numerach od 258 do 761 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1). Uważa się, że ten gen strukturalny koduje podjednostkę γ.
Ponieważ stwierdzono, że region kodujący podjednostkę γ znajduje się przed regionem kodującym podjednostkę α, utworzono rekombinowany wektor zawierający gen, posiadający policistronową strukturę, obejmujący w sposób ciągły podjednostkę γ i podjednostkę α i skonstruowano transformanta z wprowadzonym tym wektorem.
Najpierw, przygotowano gen, który miał być wprowadzony do wektora.
Przeprowadzono amplifikację przez PCR, wykorzystując jako matrycę fragment genomu szczepu KS1 zawierający ciągły gen strukturalny podjednostki γ i gen strukturalny podjednostki α, tak że powinno być włączone pożądane miejsce restrykcyjne. W PCR zastosowano następującą parę starterów oligonukleotydowych.
(starter „forward)
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11) (starter „ reverse)
5'-CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12)
Koniec 5' i koniec 3' zamplifikowanego przez PCR genu trawiono, odpowiednio, Ncol i Hindlll i gen wstawiono do wektora pTrc99A (Pharmacia) w jego miejscu do klonowania, miejscu Ncol/Hindlll. Otrzymany plazmid oznaczono pTrc99A/y+a.
Szczep DH5aMCR Escherichia coli stransformowano plazmidem pTrc99A/Y+a i zbierano kolonie, które wyrosły na podłożu agarowym LB, zawierającym 50 μg/ml ampicyliny.
P r z y k ł a d 12
Wytwarzanie podjednostki α GDH przez rekombinowaną Escherichia coli.
Podjednostkę α wytwarzano stosując szczep DH5aMCR Escherichia coli stransformowany każdym z wymienionych plazmidów pKS1, pFLAG-CTS/α i pTrc99A/Y+a. Każdym transformantem zaszczepiono 3 ml podłoża LB zawierającego 50 μg/ml ampicyliny i prowadzono hodowlę w temperaturze 37°C w ciągu 12 godzin, a następnie zbierano komórki wykorzystując wirówkę. Komórki niszczono stosując prasę francuską (1500 kgf) i izolowano frakcję błonową (10 mM bufor fosforanu potasu, pH 6,0) przez ultrawirowanie (160400 x g, 4°C, 90 minut).
P r z y k ł a d 13
Oznaczenie glukozy
Najpierw, potwierdzano aktywność GDH każdej z frakcji błonowych. Przeprowadzono ocenę wizualną stosując 10 mM bufor fosforanu potasu (pH 7,0) zawierający 594 μM metosiarczanu metylofenazyny (mPMS) i 5,94 μM 2,6-dichlorofenoloindofenolu (DCIP). Wyniki przedstawiono poniżej. Liczba + reprezentuje stopień zmiany koloru z niebieskiego na bezbarwny.
Frakcja błonowa hodowanego transformanta + stransformowanego pFLAG-CTS/α:
Frakcja błonowa hodowanego transformanta ++ stransformowanego pKS1:
PL 207 576 B1
Frakcja błonowa hodowanego transformanta +++ stransformowanego pTrc99A/y+a:
Aktywność GDH frakcji błonowej hodowanego transformanta stransformowanego pFLAG-CTS/α, który posiadał włączoną tylko podjednostkę α była najniższa, a aktywność GDH frakcji błonowej hodowanego transformanta transformowanego pTrc99A//+a była najwyższa.
Chociaż podjednostka α ulegała ekspresji nawet w transformantach stransformowanych wektorem posiadającym tylko gen strukturalny podjednostki α, podjednostkę α można wydajnie otrzymywać stosując wektor zawierający, w połączeniu, gen strukturalny podjednostki γ i gen strukturalny podjednostki α.
Glukozę oznaczano wykorzystując dehydrogenazę glukozową według wynalazku. Aktywność enzymatyczną dehydrogenazy glukozowej (podjednostki α) według wynalazku mierzono stosując glukozę w różnych stężeniach. Aktywność GDH mierzono w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 7,0), zawierającym 594 μM metosiarczanu metylofenazyny (mPMS) i 5,94 μM 2,6-dichlorofenoloindofenolu (DCIP). Dodawano próbkę enzymu oraz glukozę, jako substrat, i inkubowano w temperaturze 37°C; zmiany absorbancji DCIP przy fali o długości 600 nm monitorowano stosując spektrofotometr. Szybkość reakcji enzymatycznej mierzono jako szybkość zmniejszania się absorbancji. Stosując GDH według wynalazku można było określać glukozę ilościowo w zakresie od 0,01 do 1,0 mM.
P r z y k ł a d 14
Przygotowywanie i ocena sensora glukozy
Do dehydrogenazy glukozowej (25 jednostek) według wynalazku, otrzymanej w przykładzie 2, dodano 20 mg pasty węglowej i liofilizowano. Odpowiednio mieszano, nakładano tylko na powierzchnię elektrody węglowej wypełnioną już około 40 mg pasty węglowej i wygładzano bibułą filtracyjną. Elektrodę tę traktowano 10 mM buforem MOPS (pH 7,0), zawierającym 1% aldehyd glutarowy w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut, a następnie traktowano 10 mM buforem MOPS (pH 7,0), zawierającym 20 mM lizyny w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut w celu zablokowania aldehydu glutarowego. Elektrodę tę równoważono w 10 mM buforze MOPS (pH 7,0) w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny lub dłużej. Elektrodę przechowywano w temperaturze 4°C.
Stosując wymienioną elektrodę jako elektrodę roboczą, elektrodę Ag/AgCl jako elektrodę odniesienia oraz elektrodę Pt jako przeciwelektrodę, po dodaniu glukozy mierzono wartość bieżącej odpowiedzi. Jako roztwór reakcyjny wykorzystywano 10 mM bufor fosforanu potasu zawierający 1 mM metoksy-PMS, a do pomiaru stosowano napięcie 100 mV.
Stężenie glukozy mierzono stosując otrzymany sensor enzymatyczny. Stosując sensor enzymatyczny, na którym immobilizowano dehydrogenazę glukozową według wynalazku (fig. 6) można określać ilościowo glukozę w zakresie od 0,05 do 5,0 mM.
P r z y k ł a d 15
Przygotowywanie i ocena sensora glukozy przez GDH otrzymaną z transformanta
Do 10 U podjednostki α (249 U/mg białka) według wynalazku, otrzymanej w przykładzie 12, dodano 50 mg pasty węglowej i liofilizowano. Odpowiednio mieszano, nakładano tylko na powierzchnię elektrody węglowej wypełnioną już około 40 mg pasty węglowej i wygładzano bibułą filtracyjną. Elektrodę tę traktowano 10 mM buforem MOPS (pH 7,0), zawierającym 1% aldehyd glutarowy w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut, a następnie traktowano 10 mM buforem MOPS (pH 7,0), zawierającym 20 mM lizyny w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut w celu zablokowania aldehydu glutarowego. Elektrodę tę równoważono w 10 mM buforze MOPS (pH 7,0) w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny lub dłużej. Elektrodę przechowywano w temperaturze 4°C.
Stosując wyżej wymienioną elektrodę jako elektrodę roboczą, elektrodę Ag/AgCl jako elektrodę odniesienia oraz elektrodę Pt jako przeciwelektrodę, po dodaniu glukozy mierzono wartość bieżącej odpowiedzi. Jako roztwór reakcyjny wykorzystywano 10 mM bufor fosforanu potasu zawierający 1 mM metoksy-PMS, a pomiar przeprowadzano dla wodnych roztworów glukozy o różnych stężeniach w temperaturze 25°C i 40°C, stosując napięcie 100 mV.
Potwierdzono, że mierząc stężenie glukozy z zastosowaniem wytworzonego sensora glukozy, otrzymywano dane odpowiadające każdemu stężeniu.
Zastosowanie przemysłowe
Przedmiotem wynalazku jest enzym, który wykazuje wysoką specyficzność substratową, który można wytwarzać przy niskich kosztach, i który nie podlega działaniu tlenu rozpuszczonego w mierzonej próbce, a mianowicie nowa dehydrogenaza glukozowa posiadająca lepszą stabilność termiczną oraz sposób otrzymywania tego enzymu. Ponadto, otrzymano nowy szczep bakteryjny Burkhorderia cepacia wytwarzający ten enzym. Ujawniono również sensor glukozy skuteczny w mierzeniu glukozy przez zastosowanie elektrody enzymatycznej zawierającej enzym lub szczep bakteryjny.
PL 207 576 B1
Ponadto, ponieważ wynalazek ujawnił gen dehydrogenazy glukozowej, peptyd, który umożliwia wydajną ekspresję tego genu oraz DNA kodujący ten peptyd, mogą być wytwarzane duże ilości GDH przez zastosowanie technik rekombinowanego DNA opartych na tym genie.
Lista sekwencji <110> SODĘ, Koj i < 120> Nowa dehydrogenaza glukozowa i sposób wytwarzania dehydrogenazy <130> KOI262 <141> 2001-10-31 <150> JP 2000-332085 <15I> 2000-10-31 <150> JP 2000-357102 <151> 2000-11-24 <150> JP 2001-276832 <151> 2001-09-12 <160> 12 <I70> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <2ll> 2467 <212> DNA <213> Burkhorderia cepacia <220>
<221> CDS <222> (258)..(761) <220>
<221> CDS <222> (764)..(2380) <22O>
<221> CDS <222> (2386)..(2466) <400> 1 aagclttctg tttgaltgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60 gcttcgtgtc gcacacgtgl cgcgccgacg acacaaaaal gcagcgaaal ggctgatcgt 120
PL 207 576 B1 tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatglgcgcg 180 tacatltcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240 gtlcgagaga aggaaac alg cac aac gac aac act ccc cac leg cgl cgc 290
Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg
1 5 10
cac ggc gac gca gcc gca t ca ggc atc acg cgg cgl caa tgg t tg caa 338
His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gin Trp Leu Gin
15 20 25
ggc gcg c tg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg c tg aca t tg 386
Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu
30 35 40
cgg gcg cli gca gac aac ccc ggc ac t gcg ccg ctc gat acg ttc atg 434
Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met
45 50 55
acg c 11 tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc 482
Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Yal Ile
60 65 70 75
ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc 530
Gly Glu Arg Leu Leu Gin Ala Leu Gin Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala
80 85 90
gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt leg ctg acg 578
Asp Ser Leu Pro Gin Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr
95 100 105
cci gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc 626
Pro Glu Gin Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu
110 115 120
ggc ale gtc gac aac gtc gtg at t acg tac gag gaa gca t ta atg t tc 674
Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe
125 130 135
ggc glc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa 722
Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Yal Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys
140 145 150 155
ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg alg i gcc 769
Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro I le Glu Arg Gin Ala Met j Ma
160 165 170
gal acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc glc git gga tcg ggt gtc 817
Asp Thr Asp Thr Gin Lys Ala Asp Yal Val Va 1 Yal Gly Ser Gly Yal
175 180 185
gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gig 865
Ala Gly Ala Ile Va 1 Ala His Gin Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Yal
190 195 200
atc c Ig ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag 913
Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Yal Glu
PL 207 576 B1
cgc tle 205 cgc aa t cag ccc gac 210 aag
Arg Phe Arg Asn Gin Pro Asp Lys
leg 220 age ccc tgg gcg ccg 225 cat ccc
Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro
235 ctg atc ctg aag ggc 240 gag cac aag
Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys
gtg ggc ggc acg 255 acg tgg cac tgg
Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp
ccg aac gac 270 t tc aag atg aag age
Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser
ccg ale 285 cag tac gac gat c le 290 gag
Pro He Gin Tyr Asp Asp Leu Glu
gag 300 ctc ggc gtg tgg ggc 305 ccg ggc
Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly
315 cgc aag cag ccg tat 320 ccg atg ccg
Arg Lys Gin Pro Tyr Pro Met Pro
cag acc atc aag 335 acg gcg ctg aac
Gin Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn
gtg acc gag 350 ccg gtc gcg cgc aac
Va 1 Thr Glu Pro Yal Ala Arg Asn
ac t tgt 365 tgc ggc aac aac aac 370 tgc
Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys
alg 380 tac aac ggc atc gtg 385 cac gtc
Met Tyr Asn Gly Ile Val His Yal
395 aag ctg atc gag aac 400 gcg gtc gtc
Lys Leu Ile Glu Asn Ala Va 1 Val
aag cgc atc gtc 415 gcg gcg ctc tac
Lys Arg Ile Va 1 Ala Ala Leu Tyr
430
atg gac ttc atg 215 gcg ccg tac ccg
Met Asp Phe Met Ala Pro Tyr Pro
gag tac ggc 230 ccg ccg aac gac tac
Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr 245 250 ttc aac tcg cag tac atc cgc gcg 1057
Phe Asn Ser Gin Tyr Ile Arg Ala
260 265 gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att 1105
Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile
275 280
gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg
Yal Tyr Gly Yal Gly 295 Arg Asp Trp
ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa
Pro Tyr Tyr Gin 310 Arg Ala Glu Glu
ccc gag gaa gat ctg tac tcg ccg
Pro Glu Glu 325 Asp Leu Tyr Ser Pro 330
ccg ctg ccg ttg tcg t tc aac gag
Pro Leu 340 Pro Leu Ser Phe Asn 345 Glu
aac tac gat ccg aag ttc cat gtc
Asn 355 Tyr Asp Pro Lys Phe 360 His Val
age cgc ccg tac gac ggc cgc ccg
Ser Arg Pro Tyr Asp 375 Gly Arg Pro
atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg
Met Pro Ile Cys 390 Pro Ile Gly Ala
gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg
Glu Lys Ala 405 Glu Arg Ala Gly Ala 410
tac aag ctc gag acg ggc ccg gac
Tyr Lys 420 Leu Glu Thr Gly Pro 425 Asp
aag gac aag acg ggc gcc gag cat
Lys 435 Asp Lys Thr Gly Ala 440 Glu His
PL 207 576 B1
cgc gtc gaa ggc aag tat 1 tc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg 1633
Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr
445 450 455
ccg aag atc c tg c tg atg tcc gcg aac cgc gat 1 tc ccg aac ggt gtc 1681
Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Yal
460 465 470
gcg aac age teg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac ca t ccg ggc 1729
Ala Asn Ser Ser Asp Met Yal Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly
475 480 485 490
acc ggc gtg teg tle tat gcg age gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc 1777
Thr Gly Yal Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly
495 500 505
ccg cag gag atg acg leg ctg atc ggt 1 tc cgc gac ggt ccg t tc cgc 1825
Pro Gin Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg
510 515 520
gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg teg aac ctg teg cgc atc 1873
Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile
525 530 535
gac cag gag acg cag aag atc t tc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc 1921
Asp Gin Glu Thr Gin Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro
540 545 550
gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag 1969
Asp Glu Leu Asp Ala Gin Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Va 1 Gin
555 560 565 570
t tc gac tgc t tc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg 2017
Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gin Pro Glu Asn Arg Ile Yal
575 580 585
ccg age aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag atc 2065
Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile
590 595 600
acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc 2113
Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Yal Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg
605 610 615
gag gtc lac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg 2161
Glu Va 1 Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Yal
620 625 630
tle aac gac gaa t tc gcg ccg aac aal cac atc acg ggc teg acg atc 2209
Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr He
635 640 645 650
alg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg 2257
Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Va 1 Va 1 Asp Lys Asp Cys Arg Thr
655 660 665
ttc gac cat ccg aac clg t tc att teg age age gcg acg alg ccg acc 2305
PL 207 576 B1
Phe Asp His Pro Asn Leu Phe 670 Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr
675 680
gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg clc gcg ctg cgg 2353
Val Gly Thr Val Asn Va 1 Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg
685 690 695
atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc 2403
Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val Val Arg Lys Ser Thr Leu
700 705 710
ac l t tc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg t tg ccg ggc t tc gcg cgc gcg 2451
Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala
715 720 725
gcc gat gcg gcc gat c 2467
Ala Asp Ala Ala Asp
730 <210> 2 <2Ι1> 168 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 2
Met 1 His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala
5 10 15
Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gin Trp Leu Gin Gly Ala Leu Ala Leu
20 25 30
Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp
35 40 45
Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser
50 55 60
Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Va 1 ile Gly Glu Arg Leu Leu
65 70 75 80
Gin Ala Leu Gin Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Gin
85 90 95
Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gin Glu Ser
100 105 110
Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Va 1 Asp Asn
115 120 125
Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Va 1 Val Ser Asp
130 135 140
Thr Leu Va 1 Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys Pro Gly Phe Trp Ala
145 150 155 160
Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gin Ala
165
PL 207 576 B1 <210> 3 <21l> 539 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 3
Met 1 Ala Asp Thr Asp Thr Gin Lys Ala Asp Val Yal Yal Va 1 Gly 15 Ser
5 10
Gly Val Ala Gly Ala Ile Va l Ala His Gin Leu Ala Met Ala Gly Lys
20 25 30
Ala Val Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile
35 40 45
Va 1 Glu Arg Phe Arg Asn Gin Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro
50 55 60
Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn
65 70 75 80
Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gin Tyr Ile
85 90 95
Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg
100 105 110
Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Va 1 Tyr Gly Val Gly Arg
115 120 125
Asp Trp Pro Ile Gin Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gin Arg Ala
130 135 140
Glu Glu Glu Leu Gly Yal Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr
145 150 155 160
Ser Pro Arg Lys Gin Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe
165 170 175
Asn Glu Gin Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe
180 185 190
His Va 1 Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly
195 200 205
Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile
210 215 220
Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Yal His Yal Glu Lys Ala Glu Arg Ala
225 230 235 240
Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Yal Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly
245 250 255
Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala
260 265 270
Glu H i s Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Va 1 Leu Ala Ala Asn Gly Ile
275 280 285
Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn
PL 207 576 B1
290 295 300
Gly Va 1 Ala Asn Ser Ser Asp Met Va 1 Gly Arg Asn Leu Met Asp His
305 310 315 320
Pro Gly Thr Gly Va 1 Ser Phe Tyr A1 a Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly
325 330 335
Arg Gly Pro Gin Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro
340 345 350
Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser
355 360 365
Arg Ile Asp Gin Glu Thr Gin Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met
370 375 380
Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gin I le Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr
385 390 395 400
Val Gin Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gin Pro Glu Asn Arg
405 410 415
Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro
420 425 430
Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His
435 440 445
Thr Arg Glu Va I Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Va I Leu Gly Gly Thr Asp
450 455 460
Va 1 Va 1 Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser
465 470 475 480
Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Va 1 Val Asp Lys Asp Cys
485 490 495
Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe He Ser Ser Ser Ala Thr Met
500 505 510
Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala
515 520 525
Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Va 1
530 535
<210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 4
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu 15 10 15
Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp 20 25
PL 207 576 B1 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Burkhorderia cepacia <400> 5
Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala 15 10 15 <210> 6 <21l> 15 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 6 gcggatgcgg cggat <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 7 cgccagatat tcgcc <21O> 8 <2ll> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Op>s sekwencji sztucznej: starter <400> 8 ccggcgclgg Igaaacgc <210> 9
PL 207 576 B1 <211> 28 <21 2> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 9 cccaagcltg ggccgatacc gatacgca 28 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 10 gagaagcttt ccgcacggtc agacttcc 29 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 11 catgccatgg cacacaacga caacact 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 12 cccaagcttg ggtcagactt ccttcttcag c 31

Claims (20)

1. Białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 3.
2. DNA kodujący białko określone w zastrz. 1.
3. DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową od numeru 764 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1.
4. Rekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera DNA określone w zastrz. 2 albo 3,
5. Transformant, znamienny tym, że jest stransformowany DNA określonym w zastrz. 2 albo 3 lub rekombinowanym wektorem określonym w zastrz. 4.
6. Sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowania transformanta opisanego w zastrz. 5 w celu wytwarzania dehydrogenazy glukozowej jako produktu ekspresji DNA i etap zbierania go.
7. Sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowania mikroorganizmu z rodzaju Burkhorderia o zdolności do wytwarzania w pożywce białka określonego w zastrz. 1 i etap zbierania białka lub kompleksu zawierającego białko z pożywki i/lub komórek mikroorganizmu.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że mikroorganizmem jest Burkhorderia cepacia.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że Burkhorderia cepacia jest szczepem Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306).
10. Szczep Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306).
11. Sensor glukozy, znamienny tym, że wykorzystuje elektrodę enzymatyczną obejmującą białko określone w zastrz. 1, transformant z zastrz. 5 lub szczep z zastrz. 10.
12. Zestaw do oznaczania glukozy, znamienny tym, że obejmuje białko określone w zastrz. 1.
13. Białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2.
14. DNA kodujący białko określone w zastrz.13.
15. DNA według zastrz. 14, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową od numeru od 258 do 761 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1.
16. DNA, znamienny tym, że obejmuje DNA określone w zastrz. 14 lub 15 i DNA określone w zastrz. 2 lub 3, w tej kolejności.
17. DNA według zastrz. 16, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową od numeru 258 do 2380 w sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1.
18. Rekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera DNA określone w zastrz. 16 lub 17.
19. Transformant, znamienny tym, że jest stransformowany DNA z zastrz. 16 lub 17 lub zrekombinowanym wektorem z zastrz. 18.
20. Sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowania transformanta określonego w zastrz. 19 w celu wytwarzania produktu ekspresji DNA określonego w zastrz. 16 lub 17 i etap zbierania go.
PL362301A 2000-10-31 2001-10-31 Białko, DNA, rekombinowany wektor, transformant, sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, szczep Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306) oraz sensor glukozy i zestaw do oznaczania glukozy PL207576B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000332085 2000-10-31
JP2000357102 2000-11-24
JP2001276832 2001-09-12
PCT/JP2001/009556 WO2002036779A1 (fr) 2000-10-31 2001-10-31 Nouvelle glucose deshydrogenase et procede de production de la deshydrogenase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL362301A1 PL362301A1 (pl) 2004-10-18
PL207576B1 true PL207576B1 (pl) 2011-01-31

Family

ID=27345074

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL362301A PL207576B1 (pl) 2000-10-31 2001-10-31 Białko, DNA, rekombinowany wektor, transformant, sposób wytwarzania białka o aktywności dehydrogenazy glukozowej, szczep Burkhorderia cepacia KS1 (FERM BP-7306) oraz sensor glukozy i zestaw do oznaczania glukozy

Country Status (14)

Country Link
US (7) US7741090B2 (pl)
EP (1) EP1331272B1 (pl)
JP (1) JP4107386B2 (pl)
KR (1) KR100753747B1 (pl)
CN (1) CN100482798C (pl)
AT (1) ATE364086T1 (pl)
AU (2) AU1099102A (pl)
CA (1) CA2427031C (pl)
DE (1) DE60128824T2 (pl)
DK (1) DK1331272T3 (pl)
ES (1) ES2287164T3 (pl)
NZ (1) NZ525576A (pl)
PL (1) PL207576B1 (pl)
WO (1) WO2002036779A1 (pl)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2330407T3 (da) * 2001-09-14 2013-06-24 Arkray Inc Fremgangsmåde, værktøj og indretning til at måle en koncentration
EP1498484B1 (en) * 2002-04-26 2007-09-19 Koji Sode Glucose dehydrogenase beta-subunit and dna encoding the same
KR100729307B1 (ko) * 2002-06-17 2007-06-15 아크레이 인코퍼레이티드 글루코스 탈수소효소를 이용한 글루코스 농도 측정방법 및글루코스 센서
EP1535997B1 (en) * 2002-08-30 2011-10-12 ARKRAY, Inc. Method of purifying protein and glucose dehydrogenase
JP4102138B2 (ja) * 2002-08-30 2008-06-18 広司 早出 グルコース脱水素酵素の製造方法
US20060231396A1 (en) * 2002-12-20 2006-10-19 Hideaki Yamaoka Thin analyzing device
DE60331477D1 (de) 2002-12-24 2010-04-08 Ikeda Food Res Co Ltd Coenzymbindende glukosedehydrogenase
JP4318473B2 (ja) * 2003-03-25 2009-08-26 アークレイ株式会社 グルコース脱水素酵素の製造法
EP1661516B1 (en) 2003-09-02 2012-08-15 Koji Sode Glucose sensor and glucose level measuring apparatus
US7780828B2 (en) 2004-01-07 2010-08-24 Arkray, Inc. Analytical instrument having improved arrangement of reagent section and analytical method
KR101186718B1 (ko) * 2004-04-23 2012-09-27 아크레이 가부시키가이샤 변이 글루코오스 탈수소효소
EP2380980B1 (en) 2005-03-25 2014-11-05 Ikeda Food Research Co. Ltd. Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same
JP5021183B2 (ja) 2005-05-20 2012-09-05 アークレイ株式会社 タンパク質固定化膜および固定化方法、ならびにバイオセンサ
ATE455848T1 (de) 2005-06-20 2010-02-15 Arkray Inc Mutante glucose-dehydrogenase
US20070105174A1 (en) * 2005-11-07 2007-05-10 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Novel glucose dehydrogenase
US7553649B2 (en) 2006-03-31 2009-06-30 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for producing glucose dehydrogenase from Aspergillus oryzae
US7741100B2 (en) * 2006-03-31 2010-06-22 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for highly expressing recombinant glucose dehydrogenase derived from filamentous fungi
US20080090278A1 (en) * 2006-03-31 2008-04-17 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for enhancing stability of a composition comprising soluble glucose dehydrogenase (gdh)
US20080003628A1 (en) * 2006-03-31 2008-01-03 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for enhancing stability of a composition comprising soluble glucose dehydrogenase (gdh)
US7494794B2 (en) 2006-03-31 2009-02-24 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Glucose dehydrogenase
CA2699823C (en) 2007-09-18 2016-10-25 Ultizyme International Ltd. Enzyme electrode
EP2093284A1 (de) * 2008-02-19 2009-08-26 F.Hoffmann-La Roche Ag Stabilisierung von Dehydrogenasen mit stabilen Coenzymen
EP2385869B1 (en) * 2009-01-12 2015-11-04 TS-Technology AS Cleaning of oleaginous water iii
JP5616235B2 (ja) 2009-02-09 2014-10-29 アークレイ株式会社 電気化学センサーおよびその作製方法
EP2398909B1 (de) 2009-02-19 2015-07-22 F. Hoffmann-La Roche AG Schnelle reaktionskinetik von enzymen mit niedriger aktivität in trockenen chemieschichten
JP5446414B2 (ja) * 2009-04-16 2014-03-19 ソニー株式会社 光電変換素子
KR20120023038A (ko) 2009-04-30 2012-03-12 이케다 쇼쿠겐 가부시키가이샤 단백질성 전자 메디에이터
JP5824205B2 (ja) 2010-10-27 2015-11-25 アークレイ株式会社 変異グルコース脱水素酵素
US10689626B2 (en) 2014-12-04 2020-06-23 SmartZyme Innovations Ltd. Compositions and methods for measuring blood glucose levels
CN107532152A (zh) * 2014-12-04 2018-01-02 智慧酶生物医药有限公司 用于测量血糖水平的组合物和方法
US10387541B2 (en) 2015-01-29 2019-08-20 Hewlett-Packard Development Company, L.P. High quality setting of text for print, with full control over layout, using a web browser
AU2016295361A1 (en) 2015-07-23 2018-02-22 Smartzyme Biopharma Ltd. Compositions and methods for measuring blood glucose levels
JP6783108B2 (ja) * 2015-10-15 2020-11-11 アークレイ株式会社 酵素電極
JP6856344B2 (ja) 2015-10-29 2021-04-07 アークレイ株式会社 変異グルコース脱水素酵素およびその利用
JP6964000B2 (ja) 2015-10-30 2021-11-10 キッコーマン株式会社 電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法
JP7042085B2 (ja) 2015-11-30 2022-03-29 キッコーマン株式会社 シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法
CN110494568B (zh) 2017-03-31 2024-03-19 龟甲万株式会社 使用fad依赖性葡糖脱氢酶的连续葡萄糖监测
JP7339723B2 (ja) 2017-07-04 2023-09-06 アークレイ株式会社 変異型シトクロムタンパク質およびその利用
US12359238B2 (en) * 2017-08-02 2025-07-15 B. G. Negev Technologies And Applications Ltd., At Ben-Gurion University Recombinant flavin-adenine dinucleotide glucose dehydrogenase and uses thereof
IL253801A0 (en) 2017-08-02 2017-09-28 B G Negev Technologies And Applications Ltd At Ben Gurion Univ Recombinant flavin-adenine dinuclease glucose dehydrogenase and its uses
US11293921B2 (en) * 2018-10-03 2022-04-05 Arkray, Inc. Direct electron transfer-type oxidoreductase-modified molecular recognition element
CN115125221A (zh) 2021-03-29 2022-09-30 北卡罗来纳大学教堂山分校 具有改善的热稳定性的突变体葡萄糖脱氢酶及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2850515B2 (ja) * 1990-09-25 1999-01-27 東洋紡績株式会社 グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造法
JPH11243949A (ja) 1998-03-03 1999-09-14 Toyobo Co Ltd Ｐｑｑを補欠分子族とするグルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造方法
US6656702B1 (en) * 1998-07-03 2003-12-02 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Biosensor containing glucose dehydrogenase
EP1498484B1 (en) * 2002-04-26 2007-09-19 Koji Sode Glucose dehydrogenase beta-subunit and dna encoding the same

Also Published As

Publication number Publication date
NZ525576A (en) 2005-03-24
CN100482798C (zh) 2009-04-29
US7741090B2 (en) 2010-06-22
KR100753747B1 (ko) 2007-08-31
US20090029437A1 (en) 2009-01-29
KR20030055293A (ko) 2003-07-02
CA2427031C (en) 2016-02-09
CN1484703A (zh) 2004-03-24
US20100291655A1 (en) 2010-11-18
US7867742B2 (en) 2011-01-11
WO2002036779A1 (fr) 2002-05-10
EP1331272B1 (en) 2007-06-06
US8715990B2 (en) 2014-05-06
US9187734B2 (en) 2015-11-17
EP1331272A4 (en) 2004-08-18
CA2427031A1 (en) 2003-04-25
DE60128824D1 (de) 2007-07-19
US20140220657A1 (en) 2014-08-07
ES2287164T3 (es) 2007-12-16
US20100193355A1 (en) 2010-08-05
PL362301A1 (pl) 2004-10-18
US20040023330A1 (en) 2004-02-05
DE60128824T2 (de) 2008-02-07
US8367385B2 (en) 2013-02-05
JP4107386B2 (ja) 2008-06-25
US7960156B2 (en) 2011-06-14
AU1099102A (en) 2002-05-15
DK1331272T3 (da) 2007-10-08
EP1331272A1 (en) 2003-07-30
US8715989B2 (en) 2014-05-06
JPWO2002036779A1 (ja) 2004-03-11
US20100285566A1 (en) 2010-11-11
AU2002210991B2 (en) 2006-08-10
ATE364086T1 (de) 2007-06-15
US20110250671A1 (en) 2011-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2427031C (en) Novel glucose dehydrogenase and method for producing the dehydrogenase
US7329519B2 (en) Glucose dehydrogenase β subunit and DNA encoding the same
JP2003274976A (ja) フルクトシルアミン酸化酵素
JP4036667B2 (ja) 新規グルコース脱水素酵素及びそれをコードする遺伝子
JP4195065B2 (ja) 新規グルコース脱水素酵素及び該脱水素酵素の製造方法
US7713718B1 (en) Process for producing glucose dehydrogenases
US7432096B2 (en) Glucose dehydrogenase and production thereof
ZA200303208B (en) Novel glucose dehydrogenase and process for producing the dehydrogenase.
JPH11332569A (ja) アラビニトールデヒドロゲナーゼ遺伝子