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ES2287164T3 - Nueva glucosa deshidrogenasa y procedimiento para producir la deshidrogenasa. - Google Patents

Nueva glucosa deshidrogenasa y procedimiento para producir la deshidrogenasa. Download PDF

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ES2287164T3
ES2287164T3 ES01978979T ES01978979T ES2287164T3 ES 2287164 T3 ES2287164 T3 ES 2287164T3 ES 01978979 T ES01978979 T ES 01978979T ES 01978979 T ES01978979 T ES 01978979T ES 2287164 T3 ES2287164 T3 ES 2287164T3
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dna
protein
enzyme
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glucose
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ES01978979T
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Koji Sode
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Abstract

Una proteína que se define en los siguientes (A) o (B): (A) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3; (B) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3 incluyendo la substitución, deleción, inserción o adición de 1 a 10 residuos de aminoácidos y tiene una actividad de glucosa deshidrogenasa.

Description

Nueva glucosa deshidrogenasa y procedimiento para producir la deshidrogenasa.
Campo técnico
La presente invención se refiere a una nueva glucosa deshidrogenasa y a un método para producir la misma, a un DNA que codifica la enzima, a un vector recombinante que comprende el DNA que codifica la enzima, a un transformante transformado con el vector recombinante, a un nuevo microorganismo que produce la enzima, a un sensor para glucosa que usa un electrodo enzimático que incluye la enzima, al transformante o al microorganismo y a un estuche de ensayo para glucosa.
Técnica anterior
Biosensores que usan una enzima que reacciona específicamente con un substrato particular se están desarrollando activamente en diversos campos industriales. Como para un sensor para glucosa, que es uno de los biosensores, en particular, métodos de medida y dispositivos que utilizan tales métodos se están desarrollando activamente principalmente en los campos médicos.
El sensor para glucosa tiene una historia de aproximadamente 40 años desde que Clark y Lyons dieron cuenta en primer lugar acerca de un biosensor que comprendía glucosa oxidasa y un electrodo de oxígeno en combinación en 1962 (L.c. Clark, J. y Lyonas, C. "Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery" Ann. n. y. Acad. Sci., 105: 20-45).
Así, la adopción de glucosa oxidasa como una enzima del sensor para glucosa tiene una larga historia. Esto es debido a que la glucosa oxidasa muestra alta especificidad hacia el substrato para glucosa y superior estabilidad térmica, esta enzima puede producirse además a gran escala y su coste de producción es inferior que los de otras enzimas.
La alta especificidad hacia el substrato significa que esta enzima no reacciona con un sacárido distinto de la glucosa, y esto conduce a la ventaja de que puede alcanzarse una medida exacta sin error en los valores de medida.
Además, la estabilidad térmica superior significa que pueden evitarse problemas relativos a la desnaturalización de la enzima y la inactivación de su actividad enzimática debido al calor, y esto conduce a la ventaja de que puede realizarse una medida exacta a lo largo de un período de tiempo prolongado.
Sin embargo, aunque la glucosa oxidasa tiene alta especificidad hacia el substrato y estabilidad térmica superior y puede producirse a bajo coste, tiene el problema de que la enzima se ve afectada por el oxígeno disuelto como se describe posteriormente y esto afecta a los resultados de medida.
Mientras tanto, además de la glucosa oxidasa, también se ha desarrollado un sensor para glucosa que utiliza glucosa deshidrogenasa. Esta enzima también se encuentra en microorganismos.
Por ejemplo, se conoce glucosa deshidrogenasa derivada de bacterias Bacillus (EC 1.1.1.47) y glucosa deshidrogenasa derivada de bacterias Cryptococcus (EC 1.1.1.119).
La primera glucosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.47) es una enzima que cataliza una reacción de \beta-D-glucosa + NAD(P)^{+} D-\delta-gluconolactona + NAD(P)H + H^{+}, y la última glucosa deshidrogenasa (EC1.1.1.119) es una enzima que cataliza una reacción de D-glucosa + NADP^{+} D-\delta-gluconolactona + NADPH + H^{+}. Las glucosa deshidrogenasas mencionadas anteriormente derivan de microorganismos que ya están comercializados.
Estas glucosa deshidrogenasas tienen la ventaja de que no se ven afectadas por oxígeno disuelto en una muestra de medida. Esto conduce a la ventaja de que puede alcanzarse una medida exacta sin provocar errores en los resultados de medida aun cuando la medida se realice en un ambiente en el que la presión parcial de oxígeno sea baja, o se use para la medida una muestra de alta concentración que requiere una gran cantidad de oxígeno.
Sin embargo, aunque la glucosa deshidrogenasa no se ve afectada por el oxígeno disuelto, tiene problemas de escasa estabilidad térmica y una especificidad hacia el substrato más pobre que la de la glucosa oxidasa. Por lo tanto, se desea una enzima que venza las desventajas tanto de la glucosa oxidasa como de la glucosa deshidrogenasa.
Los inventores de la presente invención presentaron resultados de sus estudios acerca de la glucosa deshidrogenasa usando muestras recogidas de suelo cerca de fuentes termales en Sode K., Tsugawa W., Yamazaki T., Watanabe M., Ogasawara N. y Tanaka M., Enzyme Microb. Technol., 19, 82-85 (1996); Yamazaki T., Tsugawa W. y Sode K., Appli. Biochemi. and Biotec., 77-79/0325 (1999); y Yamazaki T., Tsugawa W. y Sode K., Biotec. Lett., 21, 199-202 (1999).
Sin embargo, una cepa bacteriana que tenga capacidad reductora de oxígeno no se ha identificado en la fase de estos estudios.
Descripción de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una enzima que venza las desventajas tanto de la glucosa oxidasa como de la glucosa deshidrogenasa conocidas, es decir, una enzima que muestre alta especificidad hacia el substrato y estabilidad térmica superior, pueda producirse a un coste bajo y no esté afectada por oxígeno disuelto en una muestra de medida.
Además, otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir la enzima mencionada anteriormente, una proteína que utiliza las características de la enzima y un nuevo microorganismo que produzca la enzima.
Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un DNA que codifique la enzima mencionada anteriormente, un vector recombinante que contenga el DNA que codifica la enzima y un transformante transformado con el vector recombinante.
Un objetivo adicional más de la presente invención es proporcionar un sensor para glucosa usando un electrodo enzimático que incluya la enzima, el transformante o el microorganismo mencionados anteriormente y un estuche de ensayo para glucosa que incluya la enzima mencionada anteriormente.
Los inventores de la presente invención aislaron satisfactoriamente Burkhorderia cepacia que produce una enzima que alcanza los objetivos mencionados anteriormente de suelo cerca de fuentes termales, y así lograron la presente invención.
Posteriormente, la presente invención se explicará aquí con detalle.
<1> Nueva cepa bacteriana que produce glucosa deshidrogenasa de la presente invención
La enzima de la presente invención (en lo sucesivo también denominada aquí "la enzima" o "GDH") puede producirse mediante una bacteria perteneciente al género Burkhorderia. La bacteria Burkhorderia usada para la presente invención no está particularmente limitada con tal de que sea una bacteria Burkhorderia que tenga capacidad para producir la enzima. Sin embargo, se prefiere la Burkhorderia cepacia, en particular la cepa KS1 de Burkhorderia cepacia. La cepa bacteriana es una nueva cepa bacteriana aislada por los inventores de la presente invención de suelo cerca de fuentes termales según se describe posteriormente en los ejemplos y se identificó como Burkhorderia cepacia basándose en sus propiedades bacteriológicas. Convencionalmente, no se ha sabido que un microorganismo perteneciente al género Burkhorderia pudiera producir glucosa deshidrogenasa. Esta cepa bacteriana se denominó cepa KS1. Esta cepa se depositó en International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón, código postal: 305-8566) el 25 de septiembre de 2000 y recibió un número de registro del microorganismo de FERM BP-7306.
Los inventores de la presente invención obtuvieron algunas cepas de Burkhorderia cepacia distintas de la cepa KS1 de Burkhorderia cepacia, que se depositaron en Institute for Fermentation (Osaka, IFO) o Japan Collection of Microorganisms (JCM), the Institute of Physical and Chemical Research, y se midieron sus actividades de glucosa deshidrogenasa. Como resultado, confirmaron que todas estas cepas bacterianas tenían la actividad.
<2> Glucosa deshidrogenasa de la presente invención
Si una bacteria Burkhorderia que tiene capacidad productora de glucosa deshidrogenasa, por ejemplo, la cepa KS1 de Burkhorderia cepacia, se cultiva en un medio nutritivo usado para el cultivo habitual de un microorganismo, preferiblemente un medio que contiene glucosa o una substancia que contiene glucosa para incrementar la capacidad productora de enzima, la glucosa deshidrogenasa de la presente invención se produce y se acumula en un producto de cultivo o células cultivadas. Por lo tanto, puede recogerse mediante un método conocido. El método para producir la enzima se explicará específicamente ejemplificando la cepa KS1 de Burkhorderia cepacia. En primer lugar, la cepa KS1 de Burkhorderia cepacia se cultiva en un medio nutritivo adecuado, por ejemplo, un medio que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas, glucosa, adecuadas, o substancias que contienen estas, etc., para producir y acumular la enzima en el producto de cultivo o las células cultivadas.
Como las fuentes de carbono, puede usarse cualquier substancia que pueda ser asimilada, y ejemplos incluyen, por ejemplo, D-glucosa, L-arabinosa, D-xilosa, D-manosa, almidón, diversas peptonas, etc. Como la fuente de nitrógeno, puede usarse extracto de levadura, extracto de malta, diversas peptonas, diversos extractos de carne, licor de impregnación de maíz, soluciones de aminoácidos y compuestos nitrogenados orgánicos e inorgánicos tales como sales amónicas o substancias que contienen estos. Como las sales inorgánicas, pueden usarse diversas sales de ácido fosfórico y sales de magnesio, potasio, sodio, calcio, etc. Además, según se requiera, pueden añadirse al medio diversas substancias inorgánicas y orgánicas requeridas para el crecimiento de la bacteria o la producción de la enzima, por ejemplo aceite silicónico, aceite de sésamo, agentes antiespumantes, tales como diversos tensioactivos, y vitaminas.
Como para el método de cultivo, aunque puede usarse bien un cultivo líquido o bien un cultivo sólido, habitualmente se prefiere un cultivo líquido.
La enzima de la presente invención puede obtenerse a partir del medio y/o las células en el cultivo obtenido según se describe anteriormente. La enzima que existe en las células puede obtenerse como un extracto celular rompiendo o sometiendo a lisis a las células. La glucosa deshidrogenasa en el producto de cultivo o el extracto de células puede purificarse mediante una combinación adecuada de técnicas cromatográficas usando un intercambiador iónico, un portador de filtración en gel, un portador hidrófobo, etc.
La actividad de la enzima puede medirse mediante los mismos métodos que los métodos conocidos para la medida de la actividad de glucosa deshidrogenasa. Específicamente, la actividad puede medirse mediante, por ejemplo, el método descrito más tarde en los ejemplos.
Las propiedades fisicoquímicas de la nueva glucosa deshidrogenasa de la presente invención son como sigue:
(i)
la enzima tiene una acción de catalizar la reacción de deshidrogenación de glucosa;
(ii)
la enzima consiste en subunidades que muestran un peso molecular de aproximadamente 60 kDa y un peso molecular de aproximadamente 43 kDa en electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS bajo una condición reductora;
(iii)
la enzima muestra un peso molecular de aproximadamente 380 kDa en la cromatografía de filtración en gel usando TSK Gel G3000SW (Tosoh Corporation); y
(iv)
la enzima muestra una temperatura de reacción óptima a alrededor de 45ºC (tampón de Tris-HCl, pH 8,0).
La glucosa deshidrogenasa muestra un máximo de actividad a alrededor de 45ºC bajo la condición mencionada anteriormente y también muestra un máximo de actividad a alrededor de 75ºC (remítase a la Fig. 3(a)). No se ha sabido que la GDH muestre el máximo de actividad en dos de las regiones de temperatura que se describen anteriormente.
El peso molecular y la temperatura óptima pueden medirse mediante los métodos descritos más tarde en los ejemplos.
La glucosa deshidrogenasa mencionada anteriormente de la presente invención consiste en dos polipéptidos separados, la subunidad \alpha que tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kDa y la subunidad \beta que tiene un peso molecular de aproximadamente 43 kDa (en lo sucesivo aquí esta glucosa deshidrogenasa también se denomina "enzima multímera"). Los inventores de la presente invención investigaron adicionalmente estas dos subunidades con detalle.
Se ha encontrado que la subunidad \beta era citocromo C (según se muestra más tarde en los ejemplos). Una proteína que contiene solo la subunidad \alpha exhibe las siguientes propiedades fisicoquímicas:
(i)
la proteína puede constituir la glucosa deshidrogenasa como una subunidad;
(ii)
la proteína tiene una actividad de glucosa deshidrogenasa;
(iii)
la proteína muestra un peso molecular de aproximadamente 60 kDa en electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS bajo una condición reductora; y
(iv)
la proteína muestra una temperatura de reacción óptima a alrededor de 75ºC (tampón de Tris-HCl, pH 8,0).
La temperatura óptima puede medirse mediante el método descrito más tarde en los ejemplos.
Ya que esta proteína tiene por sí misma la actividad enzimática, la proteína puede denominarse opcionalmente "enzima peptídica" o "enzima" dependiendo del contenido de la explicación.
Como una modalidad específica de la enzima peptídica de la presente invención, puede mencionarse una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3. Además, esta enzima peptídica puede ser una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene la substitución, deleción, inserción o adición de uno o más residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido del Nº ID SEC: 3, con tal de que tenga la actividad de GDH. Aunque una secuencia de aminoácidos que puede ser codificada por la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 1 se muestra como Nº ID SEC: 3, el residuo de metionina en el extremo N puede eliminarse después de la traducción.
Además, como una modalidad específica de la enzima multímera de la presente invención, puede mencionarse un multímero que contiene una proteína de la que la subunidad \alpha tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3. Además, la enzima multímera mencionada anteriormente puede ser un multímero que tiene una proteína de la que la subunidad \alpha tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3, incluyendo la substitución, deleción, inserción o adición de uno o más residuos de aminoácido, con tal de que tenga la actividad de GDH.
En la presente invención, "uno o más" significa un número de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 5, de forma particularmente preferible de 1 a 3.
Los inventores de la presente invención confirmaron la existencia de una subunidad \gamma además de la subunidad \alpha y la subunidad \beta mencionadas anteriormente.
En los ejemplos descritos más tarde, la subunidad \gamma se retiró en la fase de purificación de la enzima de la presente invención de un sobrenadante de cultivo o extracelular, y por lo tanto la subunidad \gamma no se confirmaba en la enzima purificada. Sin embargo, según se muestra en los ejemplos, cuando la subunidad \gamma se expresaba junto con la subunidad \alpha, se obtenía una alta actividad enzimática en comparación con el caso en que se expresaba la subunidad \alpha. Esto sugería que la subunidad \gamma era una proteína implicada en la producción de la subunidad \alpha en una célula microbiana de algún modo. Suponiendo que la actividad específica de la subunidad \alpha (actividad enzimática por proteína) es la misma en cualquier caso, una actividad enzimática inferior indica una cantidad menor de la subunidad \alpha como una enzima, ya que la actividad enzimática refleja la cantidad de la enzima. Por otra parte, la subunidad \alpha producida puede protegerse mediante la subunidad \gamma de una cierta manera, o, aunque la subunidad \alpha como una proteína se exprese completamente, no puede tener la estructura dimensional para exhibir la actividad enzimática debido a la ausencia de subunidad \gamma, y así la actividad enzimática puede hacerse baja. En cualquier caso, puede obtenerse una alta actividad enzimática cuando la subunidad \gamma se expresa junto con la subunidad \alpha.
<3> DNA de la presente invención
El DNA de la presente invención puede obtenerse a partir de un microorganismo que contiene DNA de la presente invención, por ejemplo Burkhorderia cepacia. El DNA de la presente invención se aisló de DNA cromosómico de Burkhorderia cepacia en el procedimiento para llevar a cabo la presente invención. Sin embargo, puesto que esta secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótidos eran elucidadas por la presente invención, el DNA también puede obtenerse mediante síntesis química basándose en esta secuencia. Además, el DNA de la presente invención también puede obtenerse de DNA cromosómico de Burkhorderia cepacia o similares mediante hibridación o PCR usando un oligonucleótido preparado basándose en las secuencias mencionadas anteriormente como una sonda o un cebador.
Además de DNA que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3, el DNA de la presente invención puede ser un DNA que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3 que contiene una substitución, deleción, inserción o adición de uno o más residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos y tiene la actividad de GDH.
Como el DNA de la presente invención, puede mencionarse específicamente un DNA que comprende la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 764 a 2380 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 1. La secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 764 a 2380 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 1 codifica la subunidad \alpha de GDH que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3.
Además, el DNA de la presente invención también puede ser un DNA que sea hibridable con la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 764 a 2380 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 2 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que tiene la actividad de GDH.
Se estima que la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 258 a 761 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 1 codifica la subunidad \gamma. La secuencia de aminoácidos se muestra en el Nº ID SEC: 2. Se considera que, puesto que el gen estructural de la subunidad \gamma está incluido en una región aguas arriba de la de la subunidad \alpha, y así la subunidad \gamma se expresa en primer lugar y ya existe como una proteína durante la producción de la subunidad \alpha por un microorganismo, la subunidad \alpha puede producirse eficazmente en el microorganismo. Por lo tanto, el DNA de la presente invención puede incluir un DNA que codifica la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 2 además del DNA mencionado anteriormente.
Un DNA que codifica una proteína substancialmente idéntica a la proteína mencionada anteriormente que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3 puede obtenerse mediante, por ejemplo, un método tal como el tratamiento de mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis. La actividad de GDH de una proteína codificada por un DNA introducido por una mutación puede medirse, por ejemplo, como sigue.
Una muestra de enzima y glucosa como un substrato se añaden a tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 7,0) que contiene metosulfato de metilfenazina (mPMS) 594 \muM y 2,6-diclorofenolindofenol (DCIP) 5,94 \muM y se incubaron a 37ºC. El cambio en la absorbancia del DCIP a 600 nm se verifica usando un espectrofotómetro y la velocidad de disminución de absorbancia se mide como una velocidad de reacción enzimática.
Además, se estima que la secuencia de nucleótidos que consiste en nucleótido del número de nucleótido 2386 y la secuencia después del nucleótido de número de nucleótido 2386 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 2 codifica la solubilidad \beta. Además, se estima que la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 2386 a 2451 codifica el péptido de señal de la subunidad \beta. Una secuencia de aminoácidos estimada de este péptido de señal es la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácido 1 a 22 en el Nº ID SEC: 4. El péptido de señal es un péptido necesario para una proteína sintetizada en el ribosoma que ha de secretarse a través de la membrana y se ha encontrado que comprende de 15 a 30 residuos de aminoácido hidrófobos. Por lo tanto, puesto que la cantidad de proteínas en el sobrenadante de cultivo se incrementa debido a la existencia del péptido de señal, este es un péptido que actúa eficazmente en un método para producir una proteína.
Posteriormente se explicará aquí un ejemplo de un método para obtener el DNA de la presente invención.
DNA cromosómico se aísla de un microorganismo tal como Burkhorderia cepacia y se purifica, y el DNA cromosómico se segmenta mediante ultrasonicación, tratamiento con enzimas de restricción o similares y se liga a un vector de expresión lineal y se cicla usando una DNA ligasa o similares para construir un vector recombinante. El vector recombinante obtenido se introduce en un microorganismo huésped en el que el vector es autónomamente replicable y los transformantes se rastrean usando un marcador vectorial y la expresión de una actividad enzimática como índices para obtener un microorganismo que aloja un vector recombinante que contiene un gen que codifica GDH. Se espera que el vector recombinante contenido en el microorganismo obtenido contenga al menos la secuencia de nucleótidos que codifica la subunidad \alpha. Además, si el fragmento clonado tiene un tamaño suficiente, es muy probable que también esté contenida la secuencia de nucleótidos que codifica la subunidad \gamma.
A continuación, el microorganismo que tiene el vector recombinante puede cultivarse, el vector recombinante puede aislarse de las células del microorganismo cultivado y purificarse y el gen que codifica GDH puede recogerse del vector de expresión. Por ejemplo, DNA cromosómico que sirve como un donante génico se recoge específicamente, por ejemplo como sigue.
El microorganismo donante génico mencionado anteriormente puede cultivarse con agitación durante de 1 a 3 días, por ejemplo, y las células pueden recogerse mediante centrifugación del caldo de cultivo obtenido y a continuación someterse a lisis para preparar un lisado celular que contiene el gen de GDH. Como el método de lisis de las células, se realiza un tratamiento usando una enzima bacteriolítica tal como lisozima y otras enzimas tales como proteasa y tensioactivos tales como dodecilsulfato sódico (SDS) se usan en combinación según se requiera. Además, un método de ruptura física de células tal como congelación y descongelación o tratamiento en prensa de French también puede emplearse en combinación.
El DNA puede aislarse y purificarse del lisado obtenido como se describe anteriormente de manera convencional, por ejemplo, mediante una combinación adecuada de desproteinización mediante tratamiento con fenol o tratamiento con proteasas, tratamiento con ribonucleasas o precipitación con alcohol, etc.
El DNA aislado y purificado de un microorganismo puede segementarse, por ejemplo, mediante ultrasonicación, tratamiento con enzimas de restricción o similares. Preferiblemente, se usa adecuadamente una enzima de restricción tipo II, que actúa sobre una secuencia de nucleótidos específica. La enzima de restricción usada puede generar un extremo que se adapta a un extremo digerido de un vector, o el extremo digerido puede acabarse en extremo romo usando una enzima de restricción arbitraria y ligarse al vector.
Como el vector usado para la clonación, es adecuado un fago que puede crecer autónomamente en un microorganismo huésped o un plásmido que se construye para la recombinación génica. Ejemplos del fago incluyen, por ejemplo, cuando se usa Escherichia coli como el microorganismo huésped, Lambda gt10, Lambda gt11, etc. Además, ejemplos del plásmido incluyen, por ejemplo, cuando se usa Escherichia coli como el microorganismo huésped, pBR322, pUC18, pUC118, pUC19, pUC119, pTrc99A y pBluescript así como SuperCosI, que es un cósmido, etc.
Durante la clonación, puede obtenerse un fragmento de vector digiriendo el vector mencionado anteriormente con una enzima de restricción usada para la digestión de un DNA microbiano como el donante mencionado anteriormente de un gen que codifica GDH. Sin embargo, no tiene que usarse necesariamente una enzima de restricción idéntica a la enzima de restricción usada para la digestión del DNA microbiano. El método para ligar el fragmento de DNA microbiano y el fragmento de DNA vectorial puede ser un método conocido que usa una DNA ligasa. Por ejemplo, un extremo adhesivo del fragmento de DNA microbiano y un extremo adhesivo del fragmento vectorial se ligan y a continuación un vector recombinante que contiene el fragmento de DNA microbiano y el fragmento de DNA vectorial se produce usando una DNA ligasa adecuada. Si se requiere, después de la ligación, el fragmento también puede introducirse en el microorganismo huésped para producir el vector recombinante utilizando una DNA ligasa existente en el microorganismo.
El microorganismo huésped usado para la clonación no está particularmente limitado con tal de que el vector recombinante sea estable y pueda crecer autónomamente en el huésped, y un gen extraño pueda expresarse en el huésped. Pueden usarse generalmente Escherichia coli DH5\alpha, XL-1 BlueMR, etc.
Como el método para introducir el vector recombinante en el microorganismo huésped, por ejemplo, cuando el microorganismo es Escherichia coli, puede usarse el método de células competentes que usa tratamiento con calcio, electroporación o similares.
Si el fragmento clonado obtenido mediante el método obtenido anteriormente codifica GDH, puede confirmarse mediante decodificación la secuencia de nucleótidos del fragmento de manera convencional.
El DNA de la presente invención puede obtenerse recogiendo un vector recombinante del transformante obtenido como se describe anteriormente. Puede producirse GDH cultivando un transformante que contiene DNA de la presente invención o un vector recombinante que contiene el DNA para producir GDH como un producto de expresión del DNA y recogerlo de las células o el caldo de cultivo. Para esta producción, aunque el DNA de la presente invención puede ser un DNA que codifica la subunidad \alpha, la eficacia de expresión puede incrementarse expresando adicionalmente la subunidad \gamma junto con la subunidad \alpha.
Ejemplos del microorganismo en el que se produce GDH incluyen bacterias entéricas tales como Escherichia coli, bacterias Gram negativas tales como las de los géneros Pseudomonas y Gluconobacter, bacterias Gram positivas incluyendo bacterias Bacillus, tales como Bacillus subtilis, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y hongos filamentosos tales como Aspergillus niger. Sin embargo, el microorganismo no está limitado a estos microorganismos, y puede usarse cualquier microorganismo huésped adecuado para la producción de proteínas extrañas.
El gen de GDH contenido en el vector recombinante seleccionado una vez que contiene el gen de GDH puede transferirse fácilmente a un vector recombinante que puede replicarse en un microorganismo recuperando un DNA que es el gen de GDH procedente de vector recombinante que contiene el gen de GDH usando una enzima de restricción o mediante PCR y ligándolo a otro fragmento vectorial. Además, el microorganismo puede transformarse fácilmente con estos vectores, por ejemplo mediante el método de células competentes usando tratamiento con calcio para bacterias Escherichia, el método de los protoplastos para bacterias Bacillus, el método KU o KUR para levaduras, el método de micromanipulación para hongos filamentosos, etc. Además, también puede usarse ampliamente la electroporación.
El microorganismo huésped en el que se introduce un vector recombinante diana puede seleccionarse buscando un microorganismo que expresa simultáneamente un marcador de resistencia a fármaco del vector que contiene el DNA diana y la actividad de GDH. Por ejemplo, puede seleccionarse un microorganismo que crece en un medio selectivo basado en el marcador de resistencia a fármaco y que produce GDH.
Como el método de cultivo para el transformante, las condiciones de cultivo pueden seleccionarse considerando propiedades nutricionales y fisiológicas del huésped. En muchos casos, se realiza un cultivo líquido. Es industrialmente ventajoso realizar cultivo aeróbico con agitación.
Como nutrientes del medio, pueden usarse ampliamente los usados habitualmente para el cultivo de microorganismos. Como fuentes de carbono, pueden usarse cualesquiera compuestos carbonados que puedan ser asimilados, y ejemplos de los mismos incluyen glucosa, sacarosa, lactosa, maltosa, lactosa, melazas, ácido pirúvico, etc. Además, como fuentes de nitrógeno, pueden utilizarse cualesquiera compuestos nitrogenados, y ejemplos de los mismos incluyen peptona, extractos de carne, extracto de levadura, hidrolizado de caseína, extracto alcalino de harina de soja, etc. Además, se usan según se requieran sales de ácido fosfórico, sales de ácido carbónico, sales de ácido sulfúrico, sales de magnesio, calcio, potasio, hierro, manganeso, zinc, etc., aminoácidos particulares, vitaminas particulares, etc.
Aunque la temperatura del cultivo puede cambiarse apropiadamente en un intervalo en el que las bacterias crecen y producen GDH, es preferiblemente de aproximadamente 20ºC a 42ºC. El tiempo de cultivo varía algo dependiendo de las condiciones. Sin embargo, el cultivo puede completarse en un tiempo apropiado estimado para dar el nivel de GDH máximo y el tiempo de cultivo es habitualmente de aproximadamente 12 a 72 horas. Aunque el pH del medio puede cambiarse apropiadamente en un intervalo en el que las bacterias crecen y producen GDH, está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente pH 6,0 a 9,0.
El caldo de cultivo que contiene células que producen GDH en el cultivo puede recogerse y utilizarse como tal. Sin embargo, cuando existe GDH en el caldo de cultivo, el caldo de cultivo habitualmente se separa en una solución que contiene GDH y células de microorganismo mediante filtración, centrifugación o similares, de manera convencional, y a continuación se usa. Cuando existe GDH en las células, las células se recogen del cultivo obtenido por medio de filtración, centrifugación o similares, y a continuación las células se rompen mediante un método mecánico o un método enzimático tal como el uso de lisozima, y se les añaden adicionalmente un agente quelante tal como EDTA y un tensioactivo para solubilizar la GDH, según se requiera, para aislar y recoger la GDH como una solución acuosa.
La GDH puede precipitarse de la solución que contiene GDH obtenida como se describe anteriormente mediante, por ejemplo, concentración a vacío, concentración con membrana, desalado con sulfato amónico, sulfato potásico o similares, o una precipitación fraccionada con un disolvente orgánico hidrófilo tal como metanol, etanol y acetona. Además, el tratamiento térmico y el tratamiento del punto isoeléctrico también son medios de purificación eficaces. A continuación, la GDH puede purificarse mediante una combinación adecuada de filtración en gel usando un adsorbente o un agente de filtración en gel, cromatografía de absorción, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad para obtener GHD pura.
Una preparación enzimática purificada puede obtenerse mediante el aislamiento y la purificación basándose en cromatografía en columna. Aunque la preparación enzimática purificada se purifica preferiblemente hasta tal punto que debe obtenerse una sola banda en la electroforesis (SDS-PAGE), puede contener la subunidad \gamma.
La enzima purificada obtenida como se describe anteriormente puede formarse como un polvo mediante, por ejemplo, liofilización, secado a vacío, secado por pulverización o similares, y distribuirse.
Además, la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta también puede determinarse de la misma manera que en la determinación de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha descrita posteriormente en los ejemplos, y un DNA que codifica la subunidad \beta puede aislarse basándose en la secuencia. Además, la subunidad \beta también puede producirse usando el DNA obtenido. Además, la enzima multímera también puede producirse usando un DNA que codifica la subunidad \alpha y DNA que codifica la subunidad \beta.
<4> Sensor para glucosa de la presente invención
El sensor para glucosa de la presente invención se caracteriza por usar la enzima de la presente invención (la enzima multímera o la enzima peptídica mencionada anteriormente, o la enzima multímera o la enzima peptídica que contiene la subunidad \gamma), el transformante de la presente invención o el microorganismo de la presente invención (cepa KS1 de Burkhorderia cepacia) como un electrodo enzimático. Como el electrodo, puede usarse un electrodo de carbono, un electrodo de oro, un electrodo de platino o similares, y la enzima de la presente invención se inmoviliza sobre este electrodo. Ejemplos del método para la inmovilización incluyen un método de uso de un reactivo de reticulación, un método de atrapamiento de la enzima en una matriz polímera, un método de cobertura de la enzima con una membrana de diálisis, métodos de uso de un polímero de fotorreticulación, un polímero conductor, un polímero de oxidación-reducción o similares. Alternativamente, la enzima puede inmovilizarse en un polímero o inmovilizarse sobre un electrodo mediante adsorción junto con un mediador electrónico del cual son ejemplos típicos el ferroceno y derivados del mismo, o estos métodos pueden usarse en combinación. Típicamente, la glucosa deshidrogenasa de la presente invención se inmoviliza sobre un electrodo de carbono usando glutaraldehído y el glutaraldehído se bloquea mediante un tratamiento con un reactivo que tiene un grupo amino.
La concentración de glucosa puede medirse como sigue. Un tampón se pone en una celdilla de temperatura constante y se añade un mediador, y se mantiene a una temperatura constante. Como el mediador, puede usarse ferricianuro potásico, metosulfato de fenazina, etc. Un electrodo sobre el que la enzima de la presente invención se inmoviliza se usa como el electrodo de trabajo, y se usan un contraelectrodo (por ejemplo, electrodo de platino) y un electrodo de referencia (por ejemplo, electrodo de Ag/AgC). Un voltaje constante se aplica al electrodo de carbono y, después de que se obtenga una corriente en estado estacionario, una muestra que contiene glucosa se añade y se mide el incremento de la corriente. La concentración de glucosa en la muestra puede calcularse de acuerdo con una curva de calibración producida usando soluciones de glucosa que tienen concentraciones estándar.
<5> Estuche de ensayo para glucosa de la presente invención
El estuche de ensayo para sacárido de la presente invención se caracteriza por diluir la enzima de la presente invención (la enzima multímera o la enzima peptídica mencionada anteriormente o la enzima multímera o la enzima peptídica mencionada anteriormente que contiene la subunidad \gamma). El estuche de ensayo para glucosa de la presente invención incluye la enzima de la presente invención en una cantidad suficiente para al menos un ensayo. Típicamente, el estuche incluye, además de la enzima de la presente invención, un tampón, un mediador, soluciones estándar de glucosa o similares para crear una curva de calibración, que son necesarias para el ensayo, y una guía para el uso. La enzima de la presente invención puede proporcionarse en diversas formas, por ejemplo, como un reactivo liofilizado o una solución en una solución de almacenamiento apropiada.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra un peso molecular de la enzima de la presente invención determinado mediante electroforesis de PAGE natural.
La Fig. 2 muestra una fotografía electroforética que muestra un peso molecular de la enzima de la presente invención basada en electroforesis de SDS-PAGE.
La Fig. 3 muestra la temperatura de reacción óptima (a) y la estabilidad térmica (b) de la enzima de la presente invención.
La Fig. 4 muestra la temperatura de reacción óptima (a) y la estabilidad térmica (b) de una enzima peptídica que constituye solo la subunidad \alpha de la enzima de la presente invención.
La Fig. 5 muestra los resultados de análisis espectrofotométrico de la enzima de la presente invención en ausencia o presencia de glucosa antes del tratamiento térmico (a) y el análisis espectrofotométrico de la enzima de la presente invención en ausencia o presencia de glucosa después del tratamiento (b).
La Fig. 6 muestra respuestas de un sensor para glucosa usando GDH obtenida de un transformante para glucosa a diversas temperaturas.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
La presente invención se explicará más específicamente con referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 Adquisición de bacteria que tiene capacidad productora de glucosa deshidrogenasa Rastreo
El microorganismo de la presente invención se obtuvo recogiendo suelo de cerca de diversas fuentes termales en Japón y seleccionando una bacteria que tiene una actividad de glucosa deshidrogenasa entre bacterias que utilizan glucosa como un nutriente del suelo.
Los resultados de la investigación de las características morfológicas, las características de crecimiento y las características fisiológicas de esta cepa se muestran posteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Características Bacteriológicas
Tinción Gram
negativa
Morfología de la célula
conformación de bastón
Con flagelo polar
Movilidad
positiva
Número de fragmentos
> 5
Temperatura de crecimiento óptima
45ºC
Oxidasa
negativa
Catalasa
positiva
Producción de acetoína
negativa
Producción de H_{2}S
negativa
Producción de indol
negativa
Ácido procedente de glucosa
positiva
Arginina dihidrolasa
negativa
Ureasa
negativa
\beta-Glucosidasa
negativa
Proteasa
negativa
\beta-Galactosidasa
positiva
Lisina carboxilasa
negativa
Ornitina carboxilasa
negativa
Reducción de nitrato
positiva
\vskip1.000000\baselineskip
Características de asimilación
Glicerol
positiva
Eritritol
negativa
D-Arabinosa
negativa
L-Arabinosa
positiva
(Continuación)
Ribosa
positiva
D-Xilosa
positiva
L-Xilosa
negativa
Adonitol
positiva
\beta-Metil-xilósido
negativo
Galactosa
positiva
D-Glucosa
positiva
D-Fructosa
positiva
D-Manosa
positiva
L-Sorbosa
negativa
Ramnosa
negativa
Dulcitol
positivo
Inositol
positivo
Manitol
positivo
Sorbitol
positivo
\alpha-Metil-D-manósido
negativo
\alpha-Metil-D-glucósido
negativo
N-Acetilglucosamina
positiva
Amigdalina
negativa
Arbutina
negativa
Esculina
negativa
Salicina
negativa
Celobiosa
negativa
Maltosa
negativa
Lactosa
negativa
Melibiosa
negativa
Sacarosa
negativa
Trehalosa
positiva
Inulina
negativa
Melezitosa
negativa
D-Rafinosa
negativa
Almidón
negativo
Glicógeno
negativo
(Continuación)
\global\parskip0.980000\baselineskip
Xilitol
positiva
\beta-Gentiobiosa
negativa
D-Turanosa
negativa
D-Lixosa
negativa
D-Tagatosa
negativa
D-Fucosa
negativa
L-Fucosa
negativa
D-Arabitol
positivo
L-Arabitol
positivo
Ácido glucónico
positivo
Ácido 2-cetoglucónico
positivo
Ácido 5-cetoglucónico
negativo
Ácido cáprico
positivo
Ácido adípico
positivo
Ácido málico
positivo
Ácido cítrico
positivo
Acetato de fenilo
positivo
\vskip1.000000\baselineskip
Características de oxidación
Glicerol
negativo
Eritritol
negativo
D-Arabinosa
negativa
L-Arabinosa
positiva
Ribosa
positiva
D-Xilosa
positiva
L-Xilosa
negativa
Adonitol
positivo
\beta-Metil-xilósido
negativo
Galactosa
positiva
D-Glucosa
positiva
D-Fructosa
positiva
D-Manosa
positiva
L-Sorbosa
negativa
Ramnosa
negativa
(Continuación)
\global\parskip0.970000\baselineskip
Dulcitol
positivo
Inositol
positivo
Manitol
positivo
Sorbitol
positivo
\alpha-Metil-D-manósido
negativo
\alpha-Metil-D-glucósido
negativo
N-Acetilglucosamina
negativa
Amigdalina
negativa
Arbutina
negativa
Esculina
positiva
Salicina
negativa
Celobiosa
positiva
Maltosa
positiva
Lactosa
positiva
Melibiosa
negativa
Sacarosa
negativa
Trehalosa
positiva
Inulina
negativa
Melezitosa
negativa
D-Rafinosa
negativa
Amidón
negativo
Glicógeno
negativo
Xilitol
negativo
\beta-Gentiobiosa
positiva
D-Turanosa
negativa
D-Lixosa
negativa
D-Tagatosa
negativa
D-Fucosa
positiva
L-Fucosa
negativa
D-Arabitol
positivo
L-Arabitol
positivo
Ácido glucónico
negativo
Ácido 2-cetoglucónico
negativo
Ácido 5-cetoglucónico
negativo
\global\parskip1.000000\baselineskip
La posición taxonómica de la cepa KS1 que tiene las características bacteriológicas mencionadas anteriormente se investigó con referencia al Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, y se identificó que la cepa pertenecía al género Burkhorderia, y era una cepa bacteriana de Burkhorderia cepacia.
El género Burkhorderia se clasificaba convencionalmente dentro del género Pseudomonas, pero se clasifican separadamente como el género Burkhorderia en la actualidad (Yabuuchi, E., Kosako, Y., Oyaizu, H., Yano, I., Hotta, H., Hashimoto, Y., Ezaki, T. y Arakawa, M., Microbiol. Immunol. Vol. 36 (12): 1251-1275 (1992); International Journal of Systematic Bacteriology, abril de 1993, pp.398-399).
Además, los inventores de la presente invención obtuvieron varias cepas de Burkhorderia cepacia distintas de la cepa KS1 de Burkhorderia cepacia, que se depositaron en the Institute for Fermentation, Osaka o the Japan Collection of Microorganisms (JCM), Institute of Physical and Chemical Research, y se midieron las actividades de glucosa deshidrogenasa de las cepas, y se confirmó que tenían la actividad. La actividad de glucosa deshidrogenasa se midió mediante el método descrito más tarde en el Ejemplo 2. Las actividades relativas de estas cepas basándose en la actividad enzimática de una fracción soluble en agua de la cepa KS1, que se toma como 100, se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1
1
Ejemplo 2 Extracción de glucosa deshidrogenasa <1> Cultivo de células
Como las condiciones de cultivo de la bacteria, se usaron condiciones de cultivo aeróbicas habituales. Las células se cultivaron a 34ºC durante 8 horas en 7 l de un medio que contenía los siguientes ingredientes por litro.
Polipeptona 10 g
Extracto de levadura 1 g
NaCl 5 g
KH_{2}PO_{4} 2 g
Glucosa 5 g
Einol (ABLE Co., Tokio, Japón) 0,14 g
Volumen total incluyendo agua destilada 1 l
pH ajustado 7,2
Un volumen de 7 l del caldo de cultivo se centrifugó a 9.000 x g a 4ºC durante 10 minutos para obtener aproximadamente 60 g de células.
<2> Preparación de fracción purificada en bruto
Una cantidad de 60 g las células se dispersó en tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 6,0) y una diferencia de presión de 1.500 kg/cm^{2} se aplicó a las células usando una prensa de French (Otake Corporation, Tokio, Japón) para romper las membranas celulares. El extracto de células se centrifugó a 8.000 x g durante 10 minutos para retirar sólido celular. Además, el sobrenadante se sometió a ultracentrifugación a 69.800 x g a 4ºC durante 90 minutos para obtener aproximadamente 8 g de una fracción de membrana como precipitados.
<3> Purificación de enzima
La fracción de membrana se redispersó en tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 6,0) que contenía 1% de Triton X-100 como una concentración final. A continuación, la dispersión se agitó lentamente durante la noche a 4ºC. Después de que la dispersión se sometiera a ultracentrifugación (69.800 x g, 4ºC, 90 minutos), la fracción de membrana solubilizada se centrifugó de nuevo a 4ºC durante 15 minutos a 15.000 x g para obtener un sobrenadante.
Se añadió a la fracción de membrana solubilizada el mismo volumen de tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 8,0) que contenía 0,2% de Triton X-100. La solución se dializó y a continuación se aplicó a una columna DEAE-TOYOPEARL (22 mm de DI x 20 cm, Tosoh Corporation, Tokio, Japón) igualada con tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 8,0) que contenía 0,2% de Triton X-100. Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,15 M en tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 8,0). El caudal era 5 ml/min. La GDH se eluyó a una concentración de NaCl de aproximadamente 75 mM. Las fracciones que exhibían la actividad de GDH se recogieron y se dializaron durante la noche contra tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 8,0, 4ºC) que contenía 0,2% de Triton X-100.
Además, la solución de enzima dializada se aplicó a una columna DEAE-5PW (8,0 mm de DI x 7,5 cm, Tosoh Corporation, Tokio, Japón). Esta columna se equilibró de antemano con tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 6,0) que contenía 0,2% de Triton X-100. Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 100 mM en tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 8,0). El caudal era 1 ml/min. Las fracciones que exhibían la actividad de GDH se eluyeron a una concentración de NaCl de aproximadamente 20 mM. Las fracciones que tenían la actividad de GDH se recogieron y se desalaron durante la noche con tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 8,0) que contenía 0,2% de Triton X-100 para obtener la enzima purificada.
La actividad de GDH se midió de acuerdo con el siguiente método a lo largo de este ejemplo y los siguientes ejemplos.
Como aceptores de electrones, se usaron 2,6-diclorofenolindofenol (DCIP) y metosulfato de fenazina (PMS). La reacción se dejó en un tubo de polietileno a una temperatura predeterminada. Un volumen de 5 \mul de la solución de enzima se añadió a 20 \mul de tampón de Tris-HCl 25 mM (pH 8,0) que contenía PMS 0,75 mM y DCIP 0,75 mM. Esta mezcla se dejó durante 1 minuto de antemano a una temperatura constante. La reacción se inició con la adición de 1 \mul de glucosa 2 M (concentración final: 77 mM) y se dejó a una temperatura constante durante 2 minutos. Subsiguientemente, 100 \mul de agua destilada enfriada con hielo o 120 \mul de urea a 0,75 M se añadieron para enfriar la mezcla. Una reacción de reducción de los aceptores de electrones debida a la deshidrogenación de glucosa se verificó usando una celdilla de ultramicromedida (100 \mul) y un espectrofotómetro (UV160, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón) que permitía la medida usando la celdilla. Esto es, la decoloración con el tiempo debida a la reducción de DCIP se midió a 600 nm, que es la longitud de onda de absorción del DCIP. Se usó el coeficiente de absorbancia molar de DCIP (22,23 mM x cm^{-1}). Una unidad (U) de la enzima se definió como la cantidad para oxidar 1 \muM de glucosa por minuto bajo condiciones de prueba estándar. La concentración de proteína se midió mediante el método de Lowry.
Ejemplo 3
Se realizó electroforesis de PAGE natural para la enzima purificada. La electroforesis se realizó sobre gel de gradiente de poliacrilamida de 8 a 25% usando un sistema tamponador de Tris-alanina que contiene 1% de Triton X-100. El gel se tiñó con nitrato de plata. Como marcadores proteínicos se usaron tiroglobulina (669 kDa), ferritina (440 kDa), catalasa (232 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina de suero bovino (67 kDa), ovalbúmina (43 kDa) y quimotripsinógeno A (25 kDa).
Además, la tinción de actividad se realizó para el gel de PAGE natural incubando el gel en la siguiente solución durante 30 minutos. En los sitios de actividad de GDH, se reducía nitroazul tetrazolio y se producía formazano, dando como resultado el desarrollo de un color púrpura oscuro.
200 mM glucosa
0,1 mM nitroazul tetrazolio
0,3 mM metosulfato de fenazina
20 mM tampón de Tris-HCl (pH 8,0)
A partir de los resultados de la tinción con plata en la PAGE natural, se estimó que la enzima consistía en un solo tipo de enzima y tenía un peso molecular de aproximadamente 400 kDa. Además, cuando el gel se teñía con respecto a la actividad, la actividad se observaba en un sitio de la misma movilidad que en la tinción con plata (véase la Fig. 1). En la figura, el Carril 1 muestra los resultados de tinción con plata de proteínas marcadoras que tienen pesos moleculares estándar, el Carril 2 muestra la tinción con plata de la enzima y el Carril 4 muestra la tinción con respecto a la actividad de la enzima. Cuando la enzima se trataba a 70ºC durante 30 minutos, la actividad permanecía inesperadamente y la enzima se separaba en proteínas, una de las cuales tenía la actividad y mostraba un peso molecular de aproximadamente 85 kDa (véase la Fig. 1. En la figura, el Carril 3 muestra los resultados de la tinción con plata de la enzima calentada a 70ºC durante 30 minutos y el Carril 5 muestra la tinción con respecto a la actividad de la enzima calentada a 70ºC durante 30 minutos). Estos resultados sugieren que la enzima consiste en subunidades.
Ejemplo 4
La solución de enzima purificada se sometió a SDS-PAGE. La SDS-PAGE se realizó en gel de poliacrilamida de 8 a 25% usando un tampón de Tris-tricina. Las proteínas del gel se tiñeron con nitrato de plata. La separación y el revelado se realizaron automáticamente usando Phast System (Pharmacia). La masa molecular se determinó basándose en las migraciones relativas de las proteínas estándar. La enzima se separó en proteínas que tenían pesos moleculares de aproximadamente 60 kDa y 43 kDa mediante SDS-PAGE (Véase la Fig. 2. La Fig. 2 es una fotografía electroforética). En la figura, el Carril 1 muestra los resultados de tinción con nitrato de plata de las proteínas marcadoras que tienen pesos moleculares estándar y el Carril 2 muestra los resultados de la tinción con nitrato de plata de la enzima). Así, se sugería que la subunidad \alpha de 60 kDa y la subunidad \beta de 43 kDa estaban unidas en la enzima, y se esperaba que un octámero fuera formado por cuatro de cada una de estas subunidades que se unían entre sí.
La subunidad \beta, una proteína de 43 kDa separada por SDS-PAGE, se transformó en una membrana de poli(fluoruro de vinilideno) y a continuación la secuencia de aminoácidos en el extremo N de la subunidad \beta se determinó usando un secuenciador de aminoácidos (PPSQ-10, Shimadzu Corporation). Como resultado, se encontró que la secuencia de aminoácidos en el extremo N de la proteína consistía en 16 residuos de la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 5.
Además, los resultados obtenidos con la enzima sometida a un tratamiento térmico a 70ºC durante 30 minutos se muestran como Carril 3 en la Fig. 2. Basándose en este resultado de SDS-PAGE, puede estimarse que la enzima se cambiaba por un solo polipéptido que tenía un peso molecular de 60 kDa después del tratamiento térmico.
Ejemplo 5
La enzima se sometió a cromatografía de filtración en gel. Como el gel, se usó TSK Gel G3000SW (Tosoh Corporation) y la columna de gel (8,0 mm de DI x 30 cm Tosoh Corporation, Tokio, Japón) se equilibró con una solución que contenía NaCl 0,3 M y 0,1% de Triton X-100 en tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 6,0). Se recogieron fracciones (125 \mul). Siete tipos de marcadores proteínicos se usaron para determinar el peso molecular de la enzima purificada. Como los marcadores proteínicos se usaron tiroglobulina (669 kDa), ferritina (440 kDa), catalasa (232 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina de suero bovino (67 kDa), ovalbúmina (43 kDa) y quimotripsinógeno A (25 kDa).
Se confirmó que el peso molecular de la enzima era aproximadamente 380 kDa.
Ejemplo 6
Se examinó la temperatura óptima de la enzima purificada.
La enzima se incubó de antemano en tampón de Tris-HCl (pH 8,0) a una temperatura predeterminada durante 1 minuto y a continuación se inició la reacción. La actividad se midió a una temperatura de reacción predeterminada. La temperatura óptima se observó alrededor de 45ºC (véase la Fig. 3(a)). Además, también se observó un pico alrededor de 75ºC, aunque la actividad era inferior que la actividad alrededor de 45ºC.
Además, para examinar la estabilidad térmica de la enzima, la enzima se dejó a cada temperatura constante durante 30 minutos y la actividad enzimática residual se midió a 45ºC (véase la Fig. 3(b)).
Ejemplo 7
Se examinó la temperatura óptima y la estabilidad térmica de la enzima peptídica que constituye el único oligopéptido que tiene un peso molecular de 60 kDa obtenido calentando la enzima a 70ºC durante 30 minutos.
Esta enzima peptídica mostraba una temperatura óptima superior que la de la enzima no calentada así como estabilidad térmica. No existen informes acerca de una enzima que tenga tal dependencia de la temperatura.
La enzima se incubó de antemano en tampón de Tris-HCl (pH 8,0) a una temperatura predeterminada durante 1 minuto, y a continuación la reacción se inició. La actividad se midió a una temperatura de reacción predeterminada. La temperatura óptima se observó alrededor de 75ºC (véase la Fig. 4(a)).
Además, para examinar la actividad térmica de la enzima, la enzima se dejó a cada temperatura constante durante 30 minutos y la actividad enzimática residual se midió a 70ºC (véase la Fig. 4(b)).
Ejemplo 8
Para investigar un papel de cada subunidad, se realizó análisis espectrofotométrico para GDH antes y después del tratamiento térmico. Las Figs. 5(a) y (b) muestran absorciones de GDHs oxidada y reducida antes y después del tratamiento térmico (en presencia de glucosa). La longitud de onda de absorción de la GDH oxidada antes del tratamiento térmico, que da la GDH original, mostraba un pico característico a 409 nm. Además, el pico cambiaba hasta 417 nm en presencia de glucosa y se observan dos picos más a 523 nm y 550 nm (Fig. 5(a)). En contraste, la GDH después del tratamiento térmico ya no mostraba el pico característico a 409 nm (Fig. 5(b)) y no se observaba diferencia entre las GDHs oxidada y reducida.
La longitud de onda de absorción de la GDH oxidada antes del tratamiento térmico, que era la GDH original, era similar a la longitud de onda de absorción de alcohol deshidrogenasa o aldehído deshidrogenasa que comprende un complejo de deshidrogenasa-citocromo de especies de Gluconobacter o especies de Acetobacter (refiérase a las siguientes referencias: Adachi, O., Tayama, K., Shinagawa, E., Matsushita, K. y Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 42, 2045-2056 (1978); Adachi, O., Miyagawa, E., Matsushita, K. y Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 42, 2331-2340 (1978); Ameyama, M. y Adachi, O., Methods Enzymol., 89, 450-457 (1982); Adachi, O., Tayama, K., Shinagawa, E., Matsushita, K. y Ameyama, M., Agr. Biol. Chem., 44, 503-515 (1980); Ameyama, M. y Adachi, O., Methods Enzymol., 89, 491-497 (1982)).
Los resultados indicaban una posibilidad de que el complejo oligómero de la GDH contuviera citocromo. Por lo tanto, puede considerarse que la longitud de onda observada similar a la del citocromo C es atribuible a la subunidad \beta y se perdía durante el tratamiento térmico, y así la subunidad \beta consiste en citocromo C.
Ejemplo 9
Una banda que contiene la subunidad \beta obtenida mediante la electroforesis en el Ejemplo 4 se cortó y la secuencia de aminoácidos se analizó usando un secuenciador de péptidos (PPSQ-10, Shimadzu Corporation). Como resultado, podía obtenerse la secuencia de aminoácidos del extremo N que consistía en 16 residuos mostrados en el Nº ID SEC: 5.
Se intentó amplificar una región génica que codifica la secuencia de aminoácidos del extremo N de 16 residuos mencionada anteriormente mediante PCR basada en la secuencia peptídica, esto es, se diseñaron dos cebadores de PCR, que tenían una secuencia de nucleótidos en el lado directo (Nº ID SEC: 6) correspondiente a 5 residuos en el extremo N y una secuencia de nucleótidos en el lado inverso (Nº ID SEC: 7) correspondiente a la hebra antisentido de 5 residuos en el extremo C en la cadena peptídica de los 16 residuos. Cuando se realizaba PCR de manera convencional para el genoma de la cepa KS1 usando este par de cebadores de PCR, se amplificaba un fragmento génico de aproximadamente 50 pb. Cuando la secuencia de nucleótidos de este fragmento génico se determinaba de manera convencional, se descodificaba una secuencia de nucleótidos de 58 nucleótidos que contenía el par de cebadores de PCR. Entre estos nucleótidos, se analizaron 18 nucleótidos excluyendo los cebadores de PCR y se encontró una secuencia génica correspondiente a una región desde Pro, que era el 6º residuo desde el lado del extremo N de los 16 residuos mencionados anteriormente en el extremo N de la subunidad \beta, hasta Arg, que era el residuo 11º, (Nº ID SEC: 8). Así, se encontró que el fragmento génico amplificado incluía el fragmento génico de la subunidad \beta.
Además, también se encontró que la subunidad \beta existía después de 22 residuos de aminoácido tras la subunidad \alpha. Esto se basaba en el hallazgo de que, puesto que la secuencia de aminoácidos en el extremo N de la subunidad \beta purificada determinada en el Ejemplo 4 se adaptaba a 5 residuos de aminoácido traducidos desde la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 2452 a 2466 en el Nº ID SEC: 1, estas secuencias son idénticas.
Por otra parte, se infiere que la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 2386 a 2451 en el Nº ID SEC: 1 es el péptido de señal de la subunidad \beta. La secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótidos corresponde a los números de aminoácido 1 a 22 en la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 4.
Ejemplo 10
La enzima purificada y una NAD coenzima GDH (abreviada como "NAD-GDH") disponible comercialmente se añadieron y se mezclaron en tampón de fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) que contenía 0,1% de Triton X-100 y CaCl_{2} 1 mM a una concentración de 100 U/l cada una. Cada solución se puso en un depósito caliente a 60ºC y se midió la actividad residual.
TABLA 2 Actividad residual relativa (%)
2
Se confirmó que la enzima tenía una estabilidad térmica sorprendente en comparación con la de la enzima GDH actualmente disponible comercialmente. Se encontró que la enzima era una nueva enzima que es totalmente diferente de la NAD-GDH disponible comercialmente.
Ejemplo 10 Aislamiento del gen que codifica la subunidad \alpha de GDH <1> Preparación de DNA cromosómico de cepa KS1 de Burkhorderia cepacia
Se preparó un gen cromosómico de la cepa KS1 de Burkhorderia cepacia de manera convencional. Esto es, la cepa bacteriana se batió durante la noche a 34ºC usando un medio líquido TL (10 g de polipeptona, 1 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 2 g de KH_{2}PO_{4}, 5 g de glucosa en 1 l, pH 7,2). Las células desarrolladas se recogieron usando una centrífuga. Las células se suspendieron en una solución que contenía NaCl 10 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, 0,5% de SDS y 100 \mug/ml de proteinasa K y se trataron a 50ºC durante 6 horas. Esta mezcla se añadió a un volumen equivalente de fenolcloroformo y se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, y a continuación el sobrenadante se recogió usando una centrífuga. Se añadió al sobrenadante acetato sódico hasta una concentración final de 0,3 M y se cubrió con dos veces el volumen de etanol para precipitar DNA cromosómico en la capa intermedia. El DNA se recogió con una barra de vidrio, se lavó con etanol al 70% y se disolvió en una cantidad apropiada de tampón de TE para obtener una solución de DNA cromosómico.
<2> Determinación de la secuencia de aminoácidos del extremo N de la subunidad \alpha de GDH
GDH purificada de la misma manera que en el Ejemplo 2 se concentró mediante liofilización y se reveló mediante electroforesis en SDS usando poliacrilamida al 12,5% para aislar la subunidad \alpha. La subunidad \alpha así obtenida se transfirió sobre una membrana de poli(fluoruro de vinilideno) y a continuación la secuencia de aminoácidos del extremo N se determinó usando un secuenciador de aminoácidos (PPSQ-10, Shimadzu Corporation). Como resultado, se encontró que la enzima incluía una secuencia peptídica que consistía en 11 residuos de los números de aminoácido 2 a 12 en la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3.
<3> Clonación del gen que codifica la subunidad \alpha
Una cantidad de 1 \mug del DNA preparado en <1> se sometió a digestión limitada con una enzima de restricción Sau3AI y se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP). Separadamente, SuperCosI (obtenido de STRATAGENE), que es un cósmido, se trató con BamHI y el fragmento de DNA obtenido mediante la digestión limitada del fragmento de DNA cromosómico derivado de la cepa \alpha-15 con Sau3AI se incorporó en SuperCosI usando DNA ligasa de T4. XL-1 Blue MR de Escherichia coli (obtenido de STRATAGENE) se transformó con el DNA recombinante obtenido. Los transformantes se seleccionaron sobre un medio de agar LB que contenía 10 \mug/ml de neomicina y 25 \mug/ml de ampicilina basándose en la resistencia a neomicina y la resistencia a ampicilina, que son resistencias a antibióticos de SuperCosI. Los transformantes obtenidos se cultivaron en el medio líquido LB. Estas células transformantes se recogieron y se suspendieron en un reactivo para medir la actividad de GDH, y los clones se seleccionaron usando actividad de deshidrogenasa para glucosa como un índice. Como resultado, se obtuvo una cepa clónica que mostraba la actividad de glucosa deshidrogenasa.
<4> Subclonación
Fragmentos de DNA que contienen el gen diana se prepararon a partir del cósmido, SuperCosI, que contiene el gen que codifica la subunidad \alpha obtenida en <3>. Los fragmentos génicos insertados se cortaron del cósmido usando una enzima de restricción NotI. Estos fragmentos de DNA se trataron con una enzima de restricción XbaI y se incorporaron en el plásmido pUC18 digerido con XbaI. La cepa DH5\alphaMCR de Escherichia coli se transformó con el plásmido pUC18 que contenía cada fragmento de inserto y se recogieron colonias desarrolladas sobre un medio de agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Los transformantes obtenidos se cultivaron en un medio LB líquido y se examinaron con respecto a la actividad de GDH en las células de la misma manera que en <3>. Como resultado, una cepa que mostraba la actividad de GDH se obtuvo a partir de un transformante. El plásmido se extrajo de este transformante y el fragmento de DNA insertado se analizó. Como resultado, se confirmó un fragmento de inserto de aproximadamente 8,8 kpb. Este plásmido se denominó pKS1.
<5> Determinación de la secuencia de nucleótidos
La secuencia de nucleótidos del fragmento de DNA insertado en pKS1 se determinó de acuerdo con el análisis con enzimas de restricción y un método convencional. Como resultado, la secuencia del DNA que codifica la secuencia de aminoácidos del extremo N de la subunidad \alpha encontrada en <2> se confirmó en este fragmento de DNA insertado y se encontró un marco de lectura abierto que contenía esta secuencia. La secuencia de nucleótidos determinada y la secuencia de aminoácidos que puede ser codificada por esta secuencia de nucleótidos son como se muestran en los Nº ID SEC: 1 y 3. El peso molecular de una proteína obtenida a partir de la secuencia de aminoácidos era 59.831 Da y se adaptaba substancialmente al peso molecular de 60 kDa obtenido mediante SDS-PAGE de la subunidad \alpha de la cepa KS1 de Burkhorderia cepacia.
Puesto que se determinaba la secuencia de nucleótidos de la subunidad \alpha, se producía un vector usando el gen estructural mencionado anteriormente de la subunidad \alpha y se producía además un transformante con este vector.
En primer lugar, un gen que ha de insertarse en el vector se preparaba como sigue.
La amplificación se realizó mediante PCR usando un fragmento genómico derivado de la cepa KS1 como una plantilla de modo que debe incluirse un sitio de enzima de restricción deseado. El siguiente par de cebadores oligonucleotídicos se usó en PCR.
(Directo)
5'-CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3' (Nº ID SEC: 9)
\vskip1.000000\baselineskip
(Inverso)
5'-GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3' (Nº ID SEC: 10)
\vskip1.000000\baselineskip
El gen amplificado mediante PCR se digirió con una enzima de restricción HindIII y se insertó en el vector de expresión pFLAG-CTS (SIGMA) en su sitio de clonación, sitio HindIII. El plásmido obtenido se denominó pFLAG-CTS/\alpha.
La cepa DH5\alphaMCR de Escherichia coli se transformó con el plásmido mencionado anteriormente pFLAT-CTS/\alpha y se recogió una colonia desarrollada sobre un medio de agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina.
Además, cuando el marco de lectura abierto del fragmento de inserto pKS1 se buscaba aguas arriba de la subunidad \alpha, se encontraba nuevamente un gen estructural de 507 nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende 168 residuos de aminoácido mostrados en el Nº ID SEC: 2 (números de nucleótido 258 a 761 en el Nº ID SEC: 1). Se consideraba que este gen estructural codificaba la subunidad \gamma.
Puesto que se encontraba que la región que codifica la subunidad \gamma existía aguas arriba de la región codificante de la subunidad \alpha, se produjo un vector recombinante que contenía un gen que tenía una estructura policistrónica que incluía continuamente la subunidad \gamma y la subunidad \alpha, y se construyó un transformante introducido con este vector.
En primer lugar, un gen que ha de insertarse en el vector se preparó como sigue.
La amplificación se realizó mediante PCR usando un fragmento genómico de la cepa KS1 que incluye continuamente el gen estructural de la subunidad \gamma y el gen estructural de la subunidad \alpha como una plantilla, de modo que debe incluirse un sitio de enzima de restricción deseado. El siguiente par de cebadores oligonucleotídicos se usó para la PCR.
(Directo)
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3' (Nº ID SEC: 11)
\vskip1.000000\baselineskip
(Inverso)
5'-CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3' (Nº ID SEC: 12)
\vskip1.000000\baselineskip
El extremo 5' y el extremo 3' del gen amplificado mediante PCR se digirió con NcoI y HindIII, respectivamente, y el gen se insertó en el vector pTrc99A (Pharmacia) en su sitio de clonación, sitio NcoI/HindIII. El plásmido obtenido se denominó pTrc99A/\gamma+\alpha.
La cepa DH5\alphaMCR de Escherichia coli se transformó con el plásmido pTrc99A/\gamma+\alpha mencionado anteriormente y se recogió una colonia desarrollada sobre un medio de agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina.
Ejemplo 11 Producción de la subunidad \alpha de GDH mediante Escherichia coli recombinante
La subunidad \alpha se produjo usando la cepa DH5\alphaMCR de Escherichia coli transformada con cada uno de los plásmidos mencionados anteriormente, pKS1 pFLAG-CTS/\alpha y pTrc99A/\gamma+\alpha. Cada transformante se inoculó en 3 ml de medio LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó a 37ºC durante 12 horas, y las células se recogieron usando una centrífuga. Las células se rompieron usando una prensa de French (1500 kgf) y una fracción de membrana (tampón de fosfato potásico 10 mM, pH 6,0) se aisló mediante centrifugación (160.400 x g, 4ºC, 90 minutos).
Ejemplo 12 Ensayo para glucosa
En primer lugar, se confirmó la actividad de GDH en cada una de las fracciones de membrana mencionadas anteriormente. Específicamente, se realizó una determinación visual usando un tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 7,0) que contenía metosulfato de metilfenazina (mPMS) 594 \muM y 2,6-diclorofenolindofenol (DCIP) 5,94 \muM. Los resultados se muestran posteriormente. El número de + representa el grado de cambio de color de azul a incoloro.
Fracción de membrana de transformante cultivo
transformado con pFLAG-CTS/\alpha +
Fracción de membrana de transformante cultivo
transformado con pKS1 ++
Fracción de membrana de transformante cultivo
transformado con pTrc99A/\gamma+\alpha +++
La actividad de GDH de la fracción de membrana del transformante cultivado transformado con pFLAG-CTS/\alpha que incorporaba solo la subunidad \alpha era la más baja, y la actividad de GDH de la fracción de membrana del transformante cultivado transformado con pTrc99A/\gamma+\alpha, con la que se construía eficazmente un vector, era la más alta.
Aunque la subunidad \alpha se expresaba incluso en el transformante transformado con un vector usando solo el gen estructural de la subunidad \alpha, la subunidad \alpha podía obtenerse eficazmente usando un vector que contenía el gen estructural de la subunidad \gamma y el gen estructural de la subunidad \alpha en combinación.
La glucosa se ensayó usando la glucosa deshidrogenasa de la presente invención. La actividad enzimática de la glucosa deshidrogenasa (subunidad \alpha) de la presente invención se midió usando glucosa a diversas concentraciones. La actividad de GDH se midió en tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 7,0) que contenía metosulfato de metilfenazina (mPMS) 594 \muM y 2,6-diclorofenol-indofenol (DCIP) 5,94 \muM. Una muestra de enzima y glucosa como un substrato se añadieron y se incubaron a 37ºC, y se verificó el cambio en la absorbancia de DCIP a 600 nm usando un espectrofotómetro. La velocidad de disminución de la absorbancia se midió como una velocidad de reacción enzimática. La glucosa podía cuantificarse en el intervalo de 0,01 a 1,0 mM usando la GDH de la presente invención.
Ejemplo 13 Preparación y evaluación del sensor para glucosa
A la glucosa deshidrogenasa (25 unidades) de la presente invención obtenida en el Ejemplo 2 se le añadieron 20 mg de pasta de carbono y se liofilizó. Se mezclaron suficientemente, se aplicaron solamente sobre una superficie de un electrodo de pasta de carbono ya cargado con aproximadamente 40 mg de pasta de carbono y se pulieron con un papel de filtro. Este electrodo se trató en tampón de MOPS 10 mM (pH 7,0) que contenía 1% de glutaraldehído a temperatura ambiente durante 30 minutos y a continuación se trató en tampón de MOPS 10 mM (pH 7,0) que contenía lisina 20 mM a temperatura ambiente durante 20 minutos para bloquear el glutaraldehído. Este electrodo se equilibró en tampón de MOPS 10 mM (pH 7,0) a temperatura ambiente durante 1 hora o más. El electrodo se almacenó a
4ºC.
Usando el electrodo mencionado anteriormente como un electrodo de trabajo, un electrodo de Ag/AgCl como un electrodo de referencia y un electrodo de Pt como un contraelectrodo, se midió un valor de corriente de respuesta durante la adición de glucosa. El tampón de fosfato potásico 10 mM que contenía metoxi-PMS 1 mM se usó como la solución de reacción, y un potencial de 100 mV se aplicó para la medida.
La concentración de glucosa se midió usando el sensor enzimático producido. La glucosa podía cuantificarse en el intervalo de 0,05 a 5,0 mM usando el sensor enzimático sobre el que se inmovilizaba la glucosa deshidrogenasa de la presente invención (Fig. 6).
Ejemplo 14 Preparación y evaluación del sensor para glucosa mediante GDH obtenida de transformante
A una cantidad de 10 U de la subunidad \alpha (249 U/mg de proteína) de la presente invención obtenida en el Ejemplo 12 se añadieron 50 mg de pasta de carbono y se liofilizaron. Se mezclaron suficientemente, se aplicaron solamente sobre una superficie de un electrodo de pasta de carbono ya cargado con aproximadamente 40 mg de pasta de carbono y se pulieron con un papel de filtro. Este electrodo se trató en tampón de MOPS 10 mM (pH 7,0) que contenía 1% de glutaraldehído a temperatura ambiente durante 30 minutos y a continuación se trataron en tampón de MOPS 10 mM (pH 7,0) que contenía lisina 20 mM a temperatura ambiente durante 20 minutos para bloquear el glutaraldehído. Este electrodo se equilibró en tampón de MOPS 10 mM (pH 7,0) a temperatura ambiente durante 1 hora o más. El electrodo se almacenó a 4ºC.
Usando el electrodo mencionado anteriormente como un electrodo de trabajo, un electrodo de Ag/AgCl como un electrodo de referencia y un electrodo de Pt como un contraelectrodo, se midió un valor de corriente de respuesta durante la adición de glucosa. El tampón de fosfato potásico 10 mM que contenía metoxi-PMS 1 mM se usó como la solución de reacción y la medida se realizó para soluciones acuosas de glucosa de diversas concentraciones a 25ºC y 40ºC aplicando un potencial de 100 mV.
Se confirmó que, cuando la concentración de glucosa se medía usando el sensor enzimático producido, se obtenía una corriente correspondiente a cada concentración.
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invención, puede producirse una enzima que tiene especificidad hacia el substrato alta a un bajo coste y no se ve afectada por el oxígeno disuelto en una muestra de medida, en particular, nueva glucosa deshidrogenasa que tiene estabilidad térmica superior y un método para producir la enzima. Además, se obtenía una nueva cepa bacteriana de Burkhorderia cepacia que produce la enzima. También se proporcionaba un sensor para glucosa eficaz para la medida de glucosa usando un electrodo enzimático que contenía la enzima o la cepa bacteriana.
Además, puesto que se encontraron mediante la presente invención el gen de glucosa deshidrogenasa, un péptido que permite la expresión eficaz del gen y un DNA que codifica ese péptido, una gran cantidad de GDH puede prepararse usando técnicas de DNA recombinante basadas en el gen.
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<110> SODE, Koji
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva Glucosa Deshidrogenasa y Procedimiento para Producir la Deshidrogenasa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> K01262
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2001-10-31
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2000-332085
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<151> 2000-10-31
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<150> JP 2000-357102
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2000-11-24
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2001-276832
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-09-12
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<160> 12
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 2467
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<212> DNA
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<213> Burkhorderia cepacia 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (258)..(761)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (764)..(2380)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (2386)..(2466)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
3
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 168
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<212> PRT
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<213> Burkhorderia cepacia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 539
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<212> PRT
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<213> Burkhorderia cepacia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
7
8 
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<210> 4
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<211> 27
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<212> PRT
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<213> Burkhorderia cepacia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu}
\sac{Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Burkhorderia cepacia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\sa{Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala}
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<210> 6
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggatgcgg cggat 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccagatat tcgcc 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccggcgctgg tgaaacgc 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskip
cccaagcttg ggccgatacc gatacgca 
\hfill
28 
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<210> 10
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 10
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gagaagcttt ccgcacggtc agacttcc 
\hfill
28 
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<210> 11
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 11
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catgccatgg cacacaacga caacact 
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27 
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<210> 12
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<211> 31
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 12
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cccaagcttg ggtcagactt ccttcttcag c 
\hfill
31

Claims (21)

1. Una proteína que se define en los siguientes (A) o (B):
(A)
una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3;
(B)
una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 3 incluyendo la substitución, deleción, inserción o adición de 1 a 10 residuos de aminoácidos y tiene una actividad de glucosa deshidrogenasa.
2. La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el número de substituciones, deleciones, inserciones o adiciones de residuos de aminoácido es 1-5.
3. La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el número de substituciones, deleciones, inserciones o adiciones de residuos de aminoácido es 1-3.
4. Un DNA que codifica la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. El DNA de acuerdo con la reivindicación 4, que es un DNA definido en los siguientes (a) o (b)
(a)
un DNA que comprende la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 764 a 2380 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 1;
(b)
un DNA que es hibridable con una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de los números de nucleótido 764 a 2380 en el Nº ID SEC: 1 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia bajo una condición restrictiva y codifica una proteína que tiene una actividad de glucosa deshidrogenasa.
6. Un vector recombinante que comprende el DNA de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.
7. Un microorganismo transformado con el DNA de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 o el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Un método para producir una proteína que tiene actividad de glucosa deshidrogenasa, que comprende las etapas de cultivar el microorganismo de acuerdo con la reivindicación 7 para producir glucosa deshidrogenasa como un producto de expresión del DNA, y recogerlo.
9. Un método para producir una proteína que tiene actividad de glucosa deshidrogenasa, que comprende las etapas de cultivar un microorganismo perteneciente al género Burkhorderia y que tiene una capacidad para producir la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un medio, y recoger la proteína o el complejo que comprende la proteína del medio y/o las células del microorganismo.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la proteína que tiene actividad de glucosa deshidrogenasa se define en la reivindicación 1 (A) y el microorganismo es una cepa KS1 de Burkhorderia cepacia (FERM BP-7306).
11. Un cepa KS1 de Burkhorderia cepacia (FERM BP-7306).
12. Un sensor para glucosa que usa un electrodo enzimático que comprende la proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el microorganismo de acuerdo con la reivindicación 7 o la cepa de acuerdo con la reivindicación 11.
13. Un estuche de ensayo para glucosa que comprende la proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
14. Una proteína que tiene la secuencia de aminoácido del Nº ID SEC: 2.
15. Un DNA que codifica la proteína de acuerdo con la reivindicación 14.
16. El DNA de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 258 a 761 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 1.
17. Un DNA que comprende el DNA de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 y el DNA de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 en este orden.
18. El DNA de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 258 a 2380 en la secuencia de nucleótidos del Nº ID SEC: 1.
19. Un vector recombinante que comprende el DNA de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18.
20. Un microorganismo transformado con el DNA de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18 o el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 19.
21. Un método para producir una proteína que tiene actividad de glucosa deshidrogenasa, que comprende las etapas de cultivar el microorganismo de acuerdo con la reivindicación 20 para producir un producto de expresión del DNA de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, y recogerlo.
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