[go: up one dir, main page]

PL205897B1 - Komórka gospodarza E. coli i sposób wytwarzania polipeptydu - Google Patents

Komórka gospodarza E. coli i sposób wytwarzania polipeptydu

Info

Publication number
PL205897B1
PL205897B1 PL366194A PL36619401A PL205897B1 PL 205897 B1 PL205897 B1 PL 205897B1 PL 366194 A PL366194 A PL 366194A PL 36619401 A PL36619401 A PL 36619401A PL 205897 B1 PL205897 B1 PL 205897B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
strain
fab
polypeptide
prc
Prior art date
Application number
PL366194A
Other languages
English (en)
Other versions
PL366194A1 (pl
Inventor
Christina Yu-Ching Chen
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of PL366194A1 publication Critical patent/PL366194A1/pl
Publication of PL205897B1 publication Critical patent/PL205897B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy komórki gospodarza E. coli pozbawionej chromosomowych degP i prc oraz sposobu wytwarzania polipeptydu z wykorzystaniem takiej komórki gospodarza.
Dziedzina wynalazku
Wynalazek dotyczy bakteryjnych szczepów gospodarza z niedoborem proteolizy. Dokładniej wynalazek dotyczy takich szczepów gospodarza, które eliminują degradację polipeptydów heterologicznych i zwiększają wydajność otrzymywania takich peptydów.
Stan techniki
Znane są szczepy E. coli z niedoborem proteaz lub genów kontrolujących regulację proteaz. Patrz przykładowo Beckwith i Strauch, WO 88/05821 opublikowana 11 sierpnia 1988; Chaundhury i Smith, J. Bacteriol., 160: 788-791 (1984); Elish i wsp., J. Gen. Microbiol. 134: 1355-1364 (1988); Baneyx i Georgiou, „Expression of proteolytically sensitive polypeptides in Escherichia coli, w Stability of Protein Pharmaceuticals, tom 3: Chemical and Physical Pathways of Protein Degradation, Ahern i Manning, wyd. (Plenum Press, Nowy Jork, 1922), str. 69-108.
Niektóre z tych szczepów były stosowane w próbach wydajnego wytwarzania białek wrażliwych na proteolizę, szczególnie tych o potencjalnym znaczeniu medycznym lub komercyjnym. Patent US nr 5,508,192 (dla Georgiou i wsp.) opisuje konstrukcję wielu bakteryjnych szczepów gospodarza z niedoborem proteazy i/lub z niedoborem białka szoku cieplnego. Tacy gospodarze obejmują bakterie z niedoborem jednej, dwóch, trzech lub czterech proteaz i bakterii z jedną proteazą, które również posiadają mutację w genie rpoA. Przykłady tych ujawnionych szczepów z niedoborem proteazy obejmują te, pozbawione degP, ompT, ptr3 i/lub prc (tsp) i degP, rpoH, o których donoszono, że wytwarzają w E. coli wysokie miana zrekombinowanych białek. Park i wsp., Biotechnol. Prog., 15:164-167 (1999) donoszą również, że szczep (HM114) z niedoborem dwóch proteaz z otoczki komórkowej (degP, prc) rośnie nieznacznie szybciej i wytwarza więcej białek fuzyjnych niż inne szczepy z niedoborem większej liczby proteaz. Zastrzeżono, że szczep ten rośnie do osiągnięcia suchej masy komórkowej
47,86 g/L w ciągu 29 godzin przy stabilnym pH, hodowli półciągłej. Wytworzonym białkiem było białko fuzyjne Α-β-laktamazy co daje o 30% wyższą aktywność β-laktamazy niż ta otrzymana z wyjściowego szczepu KS272.
Białko Prc było najpierw wyizolowane przez Hara i wsp., J. Bacterid., 173:4799-4813 (1991) jako proteza peryplazmatyczna tnąca peryplazmatyczne końce karboksylowe białka 3 wiążącego penicylinę (PBP3). Następnie było ono również zidentyfikowane jako proteaza wybiórczo degradująca białka niepolarnych C końców i zmieniono jej nazwę na Tsp (Silber i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)). Pokazano, że gen prc koduje białko o masie 75 kDa wymagane dla ochrony komórki przed równoczesnym stresem termicznym i osmotycznym (Hara i wsp., powyżej). Potwierdzono, że sekwencje C-końcowe określają preferencję substratowa (Keiler i sp., Protein Sci., 4: 1507-1515 (1995)). Poziom cięcia jest wrażliwy na określone reszty lub grupy funkcyjne na C-końcu białka będącego substratem. Obecność wolnej grupy δ-karboksylowej jest ważna dla określenia czy ściśle spokrewnione peptydy z niepolarnymi sekwencjami C-końcowymi są wydajnie cięte przez Prc.
Homologi Prc zostały zidentyfikowane u różnych grup prokariontów włącznie z szeregiem cjanobakterii (Brand i wsp., Plant Mol. Biol., 20: 481-491 (1992); Shestakov i wsp., J. Biol. Chem., 269: 19354-19359 (1994)), Neisseria gonorheae (Black i wsp., J. Bacteriol., 177: 1952-1958 (1995)), Haemophilus influenzae (Fleischmann i wsp., Science, 269: 496-512 (1995)) i Bartonella bacilliformis (numer dostępu GenBank L37094). Domena w białkach z rodziny Prc jest podobna do domeny w białkach wiążących retinol, co wskazuje na wspólną domenę przestrzenną, która może tworzyć kieszeń wiążącą tych białek dla hydrofobowych substratów (Silber i wsp., powyżej; Shestakov i wsp., powyżej).
Hara i wsp., wyżej, odkryli, że rewertanty niewrażliwe na temperaturę mutantów prc zawierają pozagenowe mutacje supresorowe (spr). Ponadto zidentyfikowali oni produkt dzikiego typu genu będący lipoproteiną z frakcji otoczki. Oczekiwali, że dzikiego typu gen spr będzie enzymem hydrolizującym peptydoglikan (Hara i wsp., Mirobial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)). Gdy spr nie był funkcjonalny w tle prc-+ to supresor mutacji spr zidentyfikowano jako PBP7, kolejne białko wiążące penicylinę (Hara i wsp., 1996, powyżej). Klonowanie spr i przygotowanie mutanta .\prc. w którym Spr nie jest degradowane przez proteazę jest również opisane w Hara i wsp., Abstract for Table Ronde Roussel Uclat No. 86, Wersal, maj 1997, gdzie autorzy dochodzą do wniosku, że prc i spr są supresorami warunkowymi.
PL 205 897 B1
Wyizolowano również trzy wielokopiowe supresory prc wykorzystując warunkowo letalny fenotyp szczepów E. coli bez prc (tsp) (Bass i wsp., J. Bacteriol., 178: 1154-1161 (1996)). Żaden z nich nie odpowiadał genowi spr. Jeden zestaw tych supresorów to dwa potencjalne geny proteazy tworzące tandem mapujący się w 72,5 min. chromosomu. Te dwa geny są homologami htrA kodującymi białka, które są odpowiednio w 58 i 35% identyczne z proteazą serynową HtrA (DegP). Innym typem zidentyfikowanego supresora jest gen dksA (supresor dnak), który jest również wielokopiowym supresorem z defektem w genach szoku cieplnego dank, dnaj i grpE. Gen dksA został również niezależ nie wyizolowany jako wielokopiowy supresor mutacji mukB, który jest wymagany dla partycji chromosomu. Trzecim typem jest skrócony gen lipoproteiny A (rlpA).
Gen degP wydaje się kontrolować syntezę proteazy otoczki komórki DegP (HtrA). Mutant z niedoborem degP został najpierw skonstruowany i wrekombinowany do chromosomu E. coli przez Beckwith i Strauch, powyżej. HtrA ma wysoką masę cząsteczkową około 500 kDa i jest białkiem szoku cielnego, którego aktywność proteolityczna jest kluczowa dla przeżycia E. coli w wyższych temperaturach, takich jak powyżej 42°C (Skorko-Glonek i wsp., Gene, 163: 47-52 (1995)). Szereg normalnie niestabilnych białek otoczki komórkowej może być ustabilizowanych przez mutację degP (Strauch i Beckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1676-1580 (1988)). Obecnie donoszono, ż e białko HtrA zachowuje się jak dodekamer zbudowany z dwóch przylegających do siebie heksamerowych pierścieni, co udokumentowano przez analizę w mikroskopie elektronowym i sieciowanie chemiczne (Kim i wsp., J. Mol. Biol., 294: 1363-1374 (1999)). Rozwinię cie substratów biał kowych takie jak w wyniku wystawienia na wysoką temperaturę lub redukcji wiązań dwusiarczkowych jest kluczowe dla ich dostępu do wewnętrznej komory HtrA, o kształcie podwójnego pierścienia, gdzie zajść może cięcie wiązania peptydowego (Kim i wsp., powyżej).
Wiele heterologicznych peptydów wytworzono w różnych szczepach z niedoborem proteaz. Jednakże, wiele szczepów dawało względnie niskie miano produktu i/lub słaby wzrost. Istnieje potrzeba dostarczenia szczepu bakteryjnego z niedoborem proteaz, który nie prowadzi do skracania produktu i daje wysokie miano produktu.
Podsumowanie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza E. coli pozbawiona chromosomowych degp i prc kodujących odpowiednio proteazę DegP i Prc oraz niosąca zmutowany gen spr, przy czym produkt tego zmutowanego genu spr zawiera sekwencję oznaczoną SEQ ID NO: 12, w której względem dzikiego typu tryptofan w pozycji 148 jest zamieniony na argininę.
Korzystnie nie jest ona pozbawiona chromosomowego ptr3 kodującego proteazę III lub chromosomowego ompT kodującego proteazę OmpT.
Korzystnie komórka ta zawiera kwas nukleinowy kodujący heterologiczny dla tego szczepu polipeptyd, korzystniej polipeptyd wrażliwy na proteolizę albo polipeptyd eukariotyczny, jeszcze korzystniej polipeptyd ssaczy.
Korzystniej komórka gospodarza transformowana jest kwasem nukleinowym.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania polipeptydu, polegający na tym, że (a) hoduje się komórkę gospodarza E. coli pozbawioną chromosomowego genu prc kodującego proteazę Prc i niosącą zmutowany gen spr, przy czym produkt tego zmutowanego genu spr zawiera sekwencję oznaczoną SEQ ID NO: 12, w której względem dzikiego typu tryptofan w pozycji 148 jest zamieniony na argininę, która to komórka gospodarza zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla tej komórki, tak że kwas nukleinowy ulega ekspresji i (b) odzyskuje się z komórki gospodarza heterologiczny polipeptyd.
Korzystnie stosuje się polipeptyd heterologiczny wrażliwy na proteolizę.
Korzystnie hodowlę prowadzi się w fermentorze.
Korzystniej hodowlę prowadzi się w warunkach fermentacji przy wysokiej gęstości komórek.
Korzystniej hodowlę prowadzi się w warunkach fermentacji przy niskiej gęstości komórek.
Korzystnie polipeptyd odzyskuje się z przestrzeni peryplazmatycznej lub pożywki hodowlanej, w której hodowano komórkę gospodarza.
Korzystnie jako polipeptyd stosuje się przeciwciało lub ligand Apo2.
Korzystniej jako polipeptyd stosuje się przeciwciało.
Korzystniej jako przeciwciało stosuje się przeciwciało humanizowane.
Korzystniej jako przeciwciało stosuje się przeciwciało pełnej długości.
Korzystniej jako przeciwciało stosuje się przeciwciało anty-CD18, anty-VEGF, anty-czynnik tkankowy, 2C4, anty-Her-2, anty-CD20, anty-CD40 lub przeciwciało anty-CD11a.
PL 205 897 B1
Korzystniej jako przeciwciało stosuje się fragment przeciwciała.
Jeszcze korzystniej stosuje się fragment przeciwciała posiadający łańcuch lekki.
Najkorzystniej jako łańcuch lekki stosuje się łańcuch lekki kappa.
Jeszcze korzystniej jako fragment przeciwciała stosuje się Fab, Fab', Fab'2 lub fuzję Fab'2-suwak leucynowy.
Jeszcze bardziej korzystnie jako fragment przeciwciała stosuje się fuzję anty-CD18 Fab'2-suwak leucynowy, fuzję anty-czynnik tkankowy Fab'2-suwak leucynowy lub anty-VEGF-Fab, z lub bez znacznika histydynowego lub lizynowego.
Jeszcze bardziej korzystnie jako fragment przeciwciała stosuje się fuzję anty-CD18 Fab'2-suwak leucynowy, fuzję anty-czynnik tkankowy Fab'2-suwak leucynowy z 6-histydynowym znacznikiem, fuzję anty-VEGF Fab, anty-CD18 Fab'2-suwak leucynowy z 6-histydynowym znacznikiem i fuzję anty-CD18 Fab'2-suwak leucynowy z 6-lizynowym znacznikiem.
Zgodnie z wynalazkiem szczepy E. coli pozbawione są chromosomowych sekwencji degP i prc kodujących odpowiednio proteazy DegP i Prc, i niosą lub zawierają produkt zmutowanego genu spr, który to gen znosi fenotypy wzrostowe ujawniane przez szczepy z mutacją prc. Korzystnie szczep nie jest pozbawiony chromosomowej sekwencji ptr3 kodującej Proteazę III i/lub chromosomowego ompT kodującego proteazę OmpT. Korzystnie, szczep E. coli jest zmodyfikowany przez wprowadzenie zmutowanego genu spr do szczepu degPΔ prcE dla przeżycia w fazie stacjonarnej procesu fermentacji przy wysokiej gęstości komórek E. coli.
Zgodnie z wynalazkiem szczep korzystnie zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla tego szczepu, korzystniej polipeptyd wrażliwy na proteolizę i jeszcze korzystniej polipeptyd eukariotyczny.
W sposobie według wynalazku wytwarzany jest heterologiczny polipeptyd tj. taki, który jest heterologiczny dla szczepu. Sposób ten obejmuje hodowlę szczepu E. coli według wynalazku. Szczep ten zawiera również kwas nukleinowy kodujący heterologiczny polipeptyd. Hodowlę prowadzi się tak, że kwas nukleinowy ulega ekspresji. W drugim etapie tego sposobu polipeptyd odzyskuje się ze szczepu zarówno z cytoplazmy, peryplazmy lub pożywki hodowlanej, korzystnie peryplazmy lub pożywki hodowlanej i najkorzystniej z pełnej pożywki fermentacyjnej. Korzystnie, polipeptyd jest ligandem Apo2 lub przeciwciałem, włącznie z fragmentem przeciwciała.
Krótki opis figur
Fig. 1A-1E przedstawia pełną sekwencję nukleotydową i kodowane sekwencje aminokwasowe (odpowiednio SEQ ID NO: 1 i 2) kasetki ekspresyjnej do przygotowania pY0317, plazmidu produkcyjnego dla Fab anty-VEGF. Pogrubione reszty oznaczają reszty CDR z oryginalnego mysiego przeciwciała A.4.6.1. Reszty podane wersalikami i podkreślone opisują mysie reszty zrębu, które są wymagane dla wiązania antygenu.
Fig. 2A i 2B przedstawiają schemat plazmidu pY0317 (fig. 2A) jak również konstrukcję plazmidu pY0317tet20 (fig. 2A i 2B).
Fig. 3 przedstawia schemat plazmidu pAPApo2-P2RU.
Fig. 4 przedstawia sekwencję nukleotydową cDNA ludzkiego liganda Apo-2 (SEQ ID NO:3) i pochodnej jemu sekwencji aminokwasowej (SEQ ID NO:4). „N w pozycji nukleotydowej 447 (na SEQ ID NO:3) jest użyty w celu wyjaśnienia, że zasadą może być „T lub „G.
Fig. 5 przedstawia schemat wyprowadzenia szczepów E. coli 59A7, 49A5 i 43H1.
Fig. 6 przedstawia wynik żelu 2-D dla fermentacji osadzonych komórek wyprowadzonych ze szczepu 49A5 (szczep prc-plus) wyrażającego jako heterologiczny polipeptyd fuzję rhuFab'2 antyCD18-LZ. Wszystkie plamki związane z LC są zakreślone.
Fig. 7 przedstawia wynik żelu 2-D dla fermentacji osadzonych komórek wyprowadzonych ze szczepu 43H1 (szczep prc-minus) wyrażającego jako heterologiczny polipeptyd fuzję rhuFab'2 antyCD18-LZ. W żelu zanikły wszystkie produkty cięcia LC.
Fig. 8 przedstawia pięć maksimów rozdzielonych z użyciem oznaczenia z zastosowaniem AME5™/kolumny z odwróconą fazą i co za tym idzie dostarcza porównania rozmieszczenia tak rozdzielonych fragmentów przeciwciała rhuFab'2 LZ (xCD18). Oś y jest obszarem specyficznych maksimów 1 do 5. Oś x przedstawia trzy szczepy produkcyjne rhuFab'2 LZ (xCD18), 43H1 (prc-), 49A5 (prc+) i 58H2 (prc-naprawiony 43H1). Szary słupek z grubym obrzeżeniem oznacza LC-115; czarny słupek oznacza LC, biały słupek oznacza dimer LC, szary słupek z wąskim obrzeżem oznacza cząsteczkę typu Fab i słupek o wzorze cegiełkowym oznacza Fab'2LZ. Można dostrzec, że maksimum 1 (LC-115) zanikło w przypadku szczepu z delecją prc.
PL 205 897 B1
Fig. 9 przedstawia wzór wzrostu dla typowej fermentacji przy wysokiej gęstości komórek w szczepach prc-minus bez zmutowanego genu spr (58B3 stransformowany pS1130) (kwadraty) i prc-minus ze zmutowanym genem spr (59A7 stransformowany pS1130) (kara), wyrażonych jako OD550 w funkcji czasu fermentacji.
Fig. 10 przedstawia humanizowaną sekwencję LC łańcucha kappa anty-CD18 (SEQ ID NO:5) z obliczonymi wartościami pI dla postulowanych produktów degradacji LC. Podkreślone cięcia zaznaczone ukośnikami potwierdzono przez spektrometrię masową. Patrz poniżej tabela 3.
Fig. 11 przedstawia żel z siedmioma ścieżkami dla różnych gospodarzy i trzech typów białek. Żel ten pokazuje, że pasmo LC20-kD (LC-182) nie występuje w komórkach 43H1 (prc-) wyrażających Fab anty-VEGF i fuzyjne cząsteczki przeciw tkankowemu czynnikowi Fab'2-LZ. Ścieżka 1 jest dla przeciwciała przeciwko czynnikowi tkankowemu F(ab')2 LZ 6xHis, szczep gospodarza 33B6, ścieżka 2 dla przeciwciała przeciwko czynnikowi tkankowemu F(ab')2 LZ 6xHis, szczep gospodarza 43H1, ścieżka 3 dla anty-CD18 F(ab')2 LZ 6xHis, szczep gospodarza 49a5, ścieżka 4 jest dla F(ab')2 LZ 6xHis anty-CD18, szczep gospodarza 41H1, ścieżka 5 jest dla pBR322, szczep gospodarza 49A5, ścieżka 6 jest dla Fab anty-VEGF, szczep gospodarza 43H1 i ścieżka 7 jest dla Fab anty-VEGF, szczep gospodarza 43E7. Oznaczenia HC i H oznaczają łańcuch ciężki a LC i L oznaczają łańcuch lekki.
Fig. 12 przedstawia wynik żelu 2-D dla osadu komórkowego z wytrząsanych kolb otrzymanego dla szczepu 59A7 (szczep prc-minus) wyrażającego jako peptyd heterologiczny Fab anty-VEGF (pY0317tet20). W żelu tym produkty cięcia LC i dwa przecięte fragmenty HC obecne w komórkach prc-plus zanikły. Przedstawiono również dwa oddzielne prążki HC wykryte jedynie w 59A7, które są albo produktami cięcia OmpT albo Ptr3.
Fig. 13 przedstawia wynik żelu 2-D dla osadu komórek z wytrząsanej kolby otrzymanego ze szczepu 60C1 (szczep prc-plus) wyrażającego Fab anty-VEGF (pY0317tet20) jako polipeptyd heterologiczny. W żelu tym wykryto liczne fragmenty cięcia LC i dwa fragmenty cięcia HC.
Szczegółowy opis postaci realizacji
Definicje
W użytym tu znaczeniu „polipeptyd ogólnie określa polipeptydy i białka posiadające więcej niż około 10 aminokwasów. „Heterologiczne polipeptydy są tymi obcymi polipeptydami z komórki gospodarza, które są wykorzystywane jako ludzkie białko wytwarzane przez E. coli. Polipeptydy te mogą być polipeptydami prokariotycznymi lub eukariotycznymi, zwłaszcza eukariotycznymi, w szczególności ssaczymi.
Przykłady ssaczych polipeptydów obejmują cząsteczki takie jak np. renina, hormon wzrostu włącznie z ludzkim hormonem wzrostu, bydlęcym hormonem wzrostu, czynnikiem uwalniającym hormon wzrostu, hormon przytarczyczny; hormon pobudzający tarczycę; lipoproteiny; 1-anty trypsyna; łańcuch A insuliny; łańcuch B insuliny; proinsulina; trombopoetyna; hormon pobudzający folikulogenezę; kalcytonina; hormon luteinizujący; glukagon; czynniki krzepnięcia takie jak czynnik VIIIC, czynnik IX, czynnik tkankowy i czynnik von Willebranda; czynniki przeciw krzepnięciu takie jak białko C; czynnik przedsionkowy powodujący wydalanie sodu z moczem; płucny czynnik obniżający napięcie powierzchniowe; aktywator plazminogenu taki jak urokinaza lub ludzki moczowy lub tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA); bombezyna; trombina; hematopoetyczny czynnik wzrostowy; czynniki martwicy nowotworu alfa i beta; przeciwciała przeciw domenie(om) ErbB2 takie jak 2C4 (WO 01/00245; hybrydoma ATCC HB-12697), wiążące obszar w zewnątrzkomórkowej domenie ErbB2 (np. jakakolwiek reszta lub więcej reszt w obszarze ErbB2 od reszty 22 do około 584 włącznie), enkefalinaza; albumina surowicy taka jak albumina surowicy ludzkiej; substancja hamująca mulerynę; łańcuch A relaksyny; łańcuch B relaksyny; prorelaksyna; peptyd towarzyszący mysiej gonadotropinie; pochodzące z mikroorganizmów białko takie jak betalaktamaza; DNAza; inhibina; aktywina; czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF); receptory dla hormonów lub czynników wzrostu; integryna; białko A lub B; czynniki reumatoidalne; czynnik neurotropowy taki jak pochodzący z mózgu czynnik neurotropowy (BDNF), neurotropina-3, -4, -5 lub -6 (NT-3, NT-4, NT-5 lub NT-6) lub czynnik wzrostu nerwu taki jak NGF; kardiotrofiny (czynnik hipertrofii serca) takie jak kardiotrofina-1 (CT-1); czynnik wzrostu pochodzący z pł ytek (PDGF); czynnik wzrostu fibroblastów taki jak aFGF i bFGF; czynnik wzrostu nabł onka (FGF); transformujący czynnik wzrostu (TGF) taki jak TGF-alfa i TGF-beta, włącznie z TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 lub TGF-5; czynnik wzrostu typu insuliny I i II (IGF-1 i IGF-2); des(1-3)-IGF-1 (mózgowy IGF-1), białka wiążące czynnik wzrostu typu insuliny; białka CD takie jak CD-3, CD-4, CD-8 i CD-19; erytropoetyna; czynniki osteoindukujące; immunotoksyny; morfogeniczne białko kości (BMP); interferon taki
PL 205 897 B1 jak interferon alfa, beta i gamma; albumina surowicy, taka jak albumina surowicy ludzkiej (HSA) lub albumina surowicy bydlęcej (BSA); czynniki stymulujące kolonie (CSF) np. M-CSF, GM-CSF i G-CSF; interleukiny (Ils), np. IL-1 do IL-10; przeciwciało anty-HER-2; ligand Apo2; dysmutaza nadtlenkowa; receptory komórki T; białka błony powierzchniowej; czynnik przyspieszający rozkład; antygen wirusowy taki jak przykładowo część otoczki AIDS; białka transportujące; receptory osadzające; adresyny; białka regulatorowe; przeciwciała i fragmenty z któregokolwiek z wyżej wymienionych polipeptydów.
Zalecane polipeptydy będące przedmiotem zainteresowania obejmują polipeptydy takie jak HSA, BSA, anty-IgE, anty-CD20, anty-IgG, t-PA, gp120, anty-CD11a, anty-CD18, 2C4, anty-VEGF, VEGF, TGF-beta, aktywina, inhibina, anty-HER-2, DNAza, IGF-I, IGF-II, mózgowy IGF-I, hormon wzrostu, łańcuchy relaksyny, czynnik uwalniający hormonu wzrostu, łańcuchy insuliny lub proinsuliny, NGF, NT-3, BDNF, ligand Apo2 i urokinaza. Szczególnie zalecanymi ssaczymi polipeptydami są przeciwciała obejmujące pełnej długości przeciwciała, fragmenty przeciwciała i ligand Apo2, zwłaszcza przeciwciała ludzkie bądź humanizowane. Obejmują one np. anty-IgE, anty-IgG, anty-Her-2, antyCD11a, anty-CD18, anty-CD20 i anty-VEGF, 2C4, BSA lub HSA. Jeszcze bardziej zalecane przeciwciało to przeciwciało anty-CD18, anty-VEGF, anty-czynnik tkankowy, 2C4, anty-Her-2, anty-CD20, anty-CD40 lub anty-CD11a. Fragmenty przeciwciała objęte definicją polipeptydu obejmują przykładowo Fab, Fab', Fab'2 lub suwak leucynowy Fab'2 (LZ) i zwłaszcza Fab'2-LZ anty-CD18, Fab'2 LZ-6xHis anty-czynnik tkankowy, Fab anty-VEGF, Fab'2 LZ anty-CD8 wyznakowane His i Fab'2LZ anty-CD18 wyznakowane Lys.
W uż ytym tu znaczeniu okreś lenie „wraż liwy na proteolizę w stosunku do polipeptydu okreś la polipeptyd podatny na cięcie, podlegający cięciu lub cięty przez jedną lub więcej proteaz z E. coli zarówno w stanie natywnym lub podczas wydzielania.
„Wysoka gęstość komórek w fermentacji lub hodowli określa proces, podczas którego typowo najpierw dodawane są partiami pewne substancje odżywcze umożliwiając komórce wzrost i czerpanie korzyści z zależności pomiędzy wykorzystywaniem O2 i wykorzystywaniem glukozy dla użycia rozpuszczonego tlenu, co można łatwo zmierzyć kontrolując dodatek glukozy. Dla osiągnięcia wysokich gęstości komórek w sposób ciągły dodawany może być amoniak i dodatkowe mniej istotne substancje odżywcze (przykładowo P, K, S i Mg) mogą być dodawane w określonych momentach fermentacji dla podtrzymania wzrostu, jak podano szczegółowo poniżej w przykładach.
„Zmutowany gen spr, którego produkt tłumi fenotypy wzrostowe ujawniane przez szczepy niosące mutację prc określa supresor prc E. coli (spr) (kodujący Prcsup) o sekwencji podanej przez Hara i wsp., 1996, powyżej lub taki, który jest zmieniony przez mutację powodując ą, ż e produkt genu działa jako supresor fenotypów wzrostowych szczepów z mutacją prc. Dogodnie, mutacja składa się z jednej mutacji punktowej. Najbardziej zalecaną mutacją punktową jest W148R, gdzie kodon TGG jest zmieniony w CGG, czego wynikiem jest zamiana aminokwasu w pozycji 148, z tryptofanu na argininę.
Termin „przeciwciało jest stosowany tu w szerokim znaczeniu i specyficznie odnosi się do niezmienionych przeciwciał monoklonalnych, przeciwciał poliklonalnych, przeciwciał wielo-specyficznych (np. przeciwciał bispecyficznych) utworzonych z przynajmniej dwóch niezmienionych przeciwciał i fragmentów przeciwciał pod warunkiem, że ujawniają one pożądaną aktywność biologiczną.
Termin „przeciwciało monoklonalne w użytym tu znaczeniu określa przeciwciało otrzymane z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała zawarte w populacji są identyczne z wyjątkiem potencjalnych naturalnych mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne i są skierowane przeciw jednemu miejscu antygenowemu. Ponadto, w przeciwieństwie do przeciwciał poliklonalnych, które zawierają różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciw pojedynczej determinancie antygenowej. Dodatkowo do ich specyficzności, przeciwciała monoklonalne są zalecane, ponieważ mogą być syntetyzowane w postaci niezanieczyszczonej przez inne przeciwciała. Przymiotnik „monoklonalny wskazuje na charakter przeciwciała jako otrzymanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał i nie jest utworzony dla określenia wymagania wytwarzania przeciwciała jakimkolwiek szczególnym sposobem. Przykładowo, przeciwciała monoklonalne, które będą stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być sporządzone przy pomocy hybrydomy jak to po raz pierwszy opisali Koehler i wsp., Nature, 256: 495 (1975) lub mogą być przygotowane sposobami rekombinacji DNA (patrz np. patent US nr 4,816,567). „Przeciwciała monoklonalne mogą być również wyizolowane z bibliotek fagowych przeciwciał przy pomocy sposobów opisanych w przykładowo Clackson i wsp., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks i wsp., J. Mol. Biol., 22: 581-597 (1991).
PL 205 897 B1
Przeciwciała monoklonalne obejmują tu szczególnie przeciwciała „chimerowe, w których część łańcucha ciężkiego i/lub łańcucha lekkiego jest identyczna z homologiem dla odpowiednich sekwencji w przeciwciał ach pochodzą cych ze specyficznego gatunku lub nale żących do szczególnej klasy lub podklasy przeciwciał, podczas gdy reszta łańcucha(ów) jest identyczna lub homologiczna z odpowiednimi sekwencjami w przeciwciałach z innych gatunków lub należących do innej klasy lub podklasy przeciwciał, jak również fragmentów takich przeciwciał, pod warunkiem, że ujawniają one pożądaną aktywność biologiczną (patent US nr 4,816,567; i Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Chimerowe przeciwciała będące przedmiotem zainteresowania przeciwciała „unaczelnione zawierające domenę zmienną sekwencji wiążących antygen pochodzącą z nie będących człowiekiem naczelnych (np. małpy starego świata, małpy, itp.) i ludzkie sekwencje rejonu stałego.
„Fragmenty przeciwciała zawierają część niezmienionego przeciwciała, dogodnie zawierają jego region wiążący antygen lub region zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciała obejmują Fab, Fab', F(ab')2 i fragmenty Fv; diaciała (ang. diabodies); liniowe przeciwciała; cząsteczki jednołańcuchowego przeciwciała i wielospecyficzne przeciwciała utworzone z fragmentu(ów) przeciwciała.
„Niezmienione przeciwciało jest takim, które zawiera region zmienny wiążący antygen jak również domenę stałą łańcucha lekkiego (CL) i domeny stałe łańcucha ciężkiego CH1, CH2 i CH3. Domeny stałe mogą być domenami stałymi o natywnych sekwencjach (np. ludzkie domeny stałe o natywnych sekwencjach) lub ich wariantem sekwencji aminokwasowej. Dogodnie, niezmienione przeciwciało posiada jedną lub więcej funkcji efektorowych.
„Funkcje efektorowe przeciwciała odnoszą się do tych aktywności biologicznych związanych z obszarem Fc (natywna sekwencja obszaru Fc lub region Fc o zmienionej sekwencji aminokwasowej) przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowych przeciwciała obejmują wiązanie C1q, cytotoksyczność zależną od dopełniacza, wiązanie receptora Fc, zależną od przeciwciała cytotoksyczność za pośrednictwem komórki (ADCC), fagocytozę, tłumienie receptorów powierzchniowych komórki (np. receptor komórki B; BCR), itp.
Zależnie od sekwencji aminokwasowej domeny stałej ich łańcuchów ciężkich naturalne przeciwciała mogą być zaliczone do różnych „klas. Istnieje pięć głównych klas naturalnych przeciwciał: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM i szereg z nich można dalej podzielić na „podklasy (izotypy), np. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Domeny stałe łańcucha ciężkiego odpowiadające różnym klasom przeciwciał są nazwane odpowiednio α, β, ε, γ i μ. Struktury podjednostek i trójwymiarowy kształt różnych klas immunoglobulin są dobrze znane.
„Zależna od przeciwciała cytotoksyczność za pośrednictwem komórki i „ADCC odnoszą się do reakcji z udziałem komórki, w których niespecyficzne cytotoksyczne komórki wyrażające receptory Fc (FcR) (np. komórki naturalnych zabójców (NK), neutrofile i makrofagi) rozpoznają przeciwciało związane na docelowej komórce i następnie powodują lizę docelowej komórki. Pierwotne komórki uczestniczące w ADCC, komórki NK, wyrażają jedynie FcRIII, podczas gdy monocyty wyrażają FcRI, FcRII i FcRIII. Ekspresja FcR na komórkach hematopoetycznych jest podsumowana w tabeli 3 na stronie 464 publikacji autorstwa Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492 (1991). Dla oceny aktywności ADCC komórek będących przedmiotem zainteresowania przeprowadzić można oznaczenie ADCC in vitro, takie jak opisano w patentach US nr 5,500,352 lub 5,821,337. Użyteczne komórki efektorowe do takich oznaczeń obejmują jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) i komórki naturalnych zabójców (NK). Alternatywnie, lub dodatkowo, aktywność ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania może być oceniona in vitro, np. na modelu zwierzęcym takim jak ujawniony przez Clynes i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 652-656 (1998).
„Ludzkie komórki efektorowe są leukocytami wyrażającymi jeden lub więcej FcR i realizującymi funkcje efektorowe. Dogodnie, komórki wyrażają przynajmniej FcRIII i realizują funkcję efektorową ADCC. Przykłady ludzkich leukocytów uczestniczących w ADCC obejmują jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), komórki naturalnych zabójców (NK), monocyty, komórki T cytotoksyczne i neutrofile, przy czym komórki PBMC i NK są zalecane. Komórki efektorowe mogą być wyizolowane z natywnego źródła np. z krwi lub PBMC jak tu opisano.
„Natywne przeciwciała są zazwyczaj heterotetramerowymi glikoproteinami o masie około 150 tys. daltonów, zbudowanymi z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem dwusiarczkowym, gdzie liczba wiązań dwusiarczkowych różni się pomiędzy łańcuchami ciężkimi różnych izotypów immunoglobuliny. Każdy łańcuch ciężki i lekki posiada również regularnie rozmieszczone międzyłańcuchowe mostki dwusiarczkowe. Każdy łańcuch lekki ma na jednym końcu domenę
PL 205 897 B1 zmienną (VL) i na drugim końcu domenę stałą. Domena stała łańcucha lekkiego jest przyrównana z pierwszą domeną stałą łańcucha ciężkiego i domena zmienna łańcucha lekkiego jest przyrównana z domeną zmienną łańcucha ciężkiego. Okreś lone aminokwasy przypuszczalnie tworzą łącznik pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i ciężkiego. Termin „zmienny określa fakt, że określona część domen zmiennych różni się istotnie pomiędzy przeciwciałami i są one używane do wiązania i określają specyficzność każdego szczególnego przeciwciała dla szczególnego antygenu. Jednakże, zmienność nie jest równomiernie rozmieszczona w obrębie domen zmiennych przeciwciał. Koncentruje się ona w trzech segmentach nazwanych regionami hiperzmiennymi domen zmiennych łańcuchów lekkiego i ciężkiego. W najwyższym stopniu konserwowane części domen zmiennych nazywane są regionami zrębowymi (FR). Domeny zmienne natywnego ciężkiego i lekkiego łańcucha zawierają każda cztery FR, w znacznym stopniu przyjmującym konfigurację β-kartki, które są połączone trzema regionami hiperzmiennymi tworzącymi łączące pętle i w pewnych przypadkach, tworzącymi część struktury β-kartki. Regiony hiperzmienne każdego przeciwciała są utrzymywane razem ze sobą w ścisłej bliskości przez FR i obszary hiperzmienne innego łańcucha, uczestnicząc w tworzeniu miejsca wiązania antygenu przeciwciała (patrz Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5te wyd., Public Heath Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Regiony stałe nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu przeciwciała z antygenem, lecz wykazują różne funkcje efektorowe, takie jak udział przeciwciała w zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC).
Stosowany tu termin „region hiperzmienny określa reszty aminokwasowe przeciwciała odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny ogólnie obejmuje reszty aminokwasowe z „regionu określającego komplementarność lub „CDR (np. reszty 24-34 (LI), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5te wyd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/lub reszty z „pętli hiperzmiennej (np. reszty 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) domeny zmiennej łańcucha lekkiego i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) domeny zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)). „Region zrębowy lub „FR zawiera reszty domen zmiennych inne niż reszty regionu hiperzmiennego jakie tu określono.
Trawienie papaina przeciwciała skutkuje powstaniem dwóch identycznych fragmentów wiążących antygen nazwanych fragmentami „Fab, każdy z jednym miejscem wiązania antygenu, i resztkowego fragmentu „Fc, którego nazwa oddaje zdolność do łatwej krystalizacji. Działanie pepsyną skutkuje powstaniem fragmentu F(ab')2 posiadającego dwa miejsca wiązania antygenu i nadal zdolnego do sieciowania antygenów.
„Fv jest minimalnym fragmentem przeciwciała zawierającym pełne miejsce rozpoznawania antygenu i miejsce wiązania antygenu. Region ten zawiera dimer domeny zmiennej jednego łańcucha ciężkiego i jednego łańcucha lekkiego w ścisłym, niekowalencyjnym związku. To jest w konfiguracji, w której trzy hiperzmienne regiony każdej domeny zmiennej oddziałują określając miejsce wiązania antygenu na powierzchni dimeru VH-VL. Sześć hiperzmiennych regionów razem określa specyficzność wiązania antygenu z przeciwciałem. Jednakże, nawet jedna domena zmienna (lub pół Fv zawierającego jedynie trzy regiony hiperzmienne specyficzne dla antygenu) posiada zdolność rozpoznania i związania antygenu, choć z mniejszym powinowactwem niż pełne miejsce wiązania.
Fragment Fab zawiera również domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab dodatkowymi kilkoma resztami na karboksylowym końcu domeny CH1 łańcucha ciężkiego, zawierającymi jedną lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała. Oznaczenie Fab'-SH jest zastosowane tu dla Fab', w którym reszta(reszty) cysteiny domen stałych posiadają przynajmniej jedną wolną grupę tiolową. Fragmenty przeciwciała F(ab')2 wyjściowo zostały wytworzone jako para fragmentów Fab' posiadających pomiędzy nimi zawias cysteinowy. Znane są również inne chemiczne wiązania fragmentów przeciwciał.
„Łańcuchy lekkie przeciwciał z jakichkolwiek gatunków kręgowców mogą być zaklasyfikowane do jednego z dwóch wyraźnie rozróżnianych typów nazwanych kappa (6) i lambda (8) w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domen stałych.
Jednołańcuchowe Fv lub „scFv fragmenty przeciwciała zawierają domeny przeciwciała VH i VL, przy czym domeny te występują w postaci pojedynczego łańcucha polipeptydowego. Dogodnie, polipeptyd Fv zawiera ponadto łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami VH i VL umożliwiający scFv utworzenie pożądanej struktury do wiązania antygenu. Dla przeglądu scFv patrz Ptockthun w The
PL 205 897 B1
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg i Moore wyd. (Springer-Verlag, Nowy Jork, 1994) str. 269-315. Fragmenty scFv przeciwciał anty-ErbB2 są opisane w WO 93/16185; patencie US nr 5,571,894 i patencie US nr 5,587,458.
Termin „diaciała określa małe fragmenty przeciwciała o dwóch miejscach wiązania antygenu, które to fragmenty zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (VH-VL). Przez zastosowanie łącznika, który jest zbyt krótki aby pozwolić na parowanie pomiędzy dwoma domenami tego samego łańcucha domeny są zmuszane do parowania z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzenia dwóch miejsc wiązania antygenu. Diaciała są pełniej opisane przykładowo w EP 404,097; WO 93/11161 i Hollinger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
„Humanizowane postaci przeciwciał nie pochodzących od człowieka (np. gryzonia) są chimerowymi przeciwciałami zawierającymi minimalną sekwencję immunoglobuliny nie pochodzącej od człowieka. W większości przeciwciała humanizowane są ludzkimi przeciwciałami (przeciwciało biorcy), w których reszty regionu hiperzmiennego biorcy są zastąpione przez reszty regionu hiperzmiennego pochodzącego z gatunków nie będących człowiekiem (przeciwciało donorowe), takich jak mysz, szczur, królik lub nie będące człowiekiem naczelne, posiadające pożądaną specyficzność, powinowactwo i pojemność. W niektórych przypadkach reszty regionu zrębowego (FR) ludzkiej immunoglobuliny są zastąpione przez odpowiednie reszty nie występujące u człowieka. Ponadto, przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty nie występujące w przeciwciele biorcy lub w przeciwciele dawcy. Modyfikacje te są dokonywane w celu ulepszenia działania przeciwciała. Ogólnie, przeciwciało humanizowane będzie zawierało zasadniczo wszystkie z przynajmniej jednej i typowo dwóch domen zmiennych, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie pętle hiperzmienne odpowiadają tym z immunoglobulin nie pochodzących od człowieka i wszystkie lub zasadniczo wszystkie FR posiadają sekwencje ludzkiej immunoglobuliny. Przeciwciało humanizowane będzie ewentualnie zawierało przynajmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), typowo z ludzkiej immunoglobuliny. Dla dalszych szczegółów patrz Jones i wsp., Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann i wsp., Nature, 332: 323-329 (1988); i Presta, Curr. Opp. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
„Wyizolowane przeciwciało jest takim, które zidentyfikowano, oddzielono i/lub odzyskano ze składników jego naturalnego środowiska. Zanieczyszczające związki z jego środowiska naturalnego są materiałem, który będzie wpływał na diagnostyczne lub terapeutyczne zastosowania przeciwciała i może obejmować enzymy, hormony i inne białkowe lub nie białkowe składniki roztworów. W zalecanych postaciach przeciwciało będzie oczyszczone (1) więcej niż w 95% wagowych przeciwciała, co określono sposobem Lowry'ego, a zwłaszcza w ponad 99% wagowych, (2) w stopniu wystarczającym do uzyskania przynajmniej 15 reszt N-końcowych wewnętrznej sekwencji aminokwasowej z wykorzystaniem separatora wirówkowego lub (3) do homogenności przez SDS-PAGE w redukujących lub nieredukujących warunkach przy pomocy błękitu Coomassie lub zwłaszcza barwienia srebrem. Wyizolowane przeciwciało obejmuje przeciwciało in situ w zrekombinowanych komórkach, przy czym przynajmniej jeden składnik naturalnego środowiska przeciwciała będzie nieobecny. Jednak zazwyczaj wyizolowane przeciwciało będzie przygotowane przez przynajmniej jeden etap oczyszczania.
„Sekwencje kontrolujące ekspresję określają sekwencje DNA niezbędne do ekspresji połączonej z nimi funkcjonalnie sekwencji kodującej, w określonym organizmie gospodarza. Sekwencje kontrolujące użyteczne dla prokariontów obejmują promotor, warunkowo sekwencję operatora i miejsce wiązania rybosomu.
Kwas nukleinowy jest „połączony funkcjonalnie gdy jest umieszczony w funkcjonalnej zależności z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Przykładowo, DNA dla pre-sekwencji lub lidera dla wydzielania jest połączony funkcjonalnie z DNA dla polipeptydu, gdy ulega on ekspresji jako pre-białko uczestniczące w sekrecji polipeptydu; promotor jest połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą gdy wpływa na transkrypcję sekwencji; lub miejsce wiążące rybosom jest połączone funkcjonalnie z sekwencją kodującą, gdy jest umiejscowione tak, że zapewnia translację. Ogólnie, „połączony funkcjonalnie oznacza, że połączone sekwencje DNA są ciągłe, a w przypadku sekwencji liderowej ciągłe i w ramce odczytu. Połączenie jest uzyskane przez ligację w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Jeśli takie miejsca nie występują, użyte mogą być syntetyczne oligonukleotydowe łączniki lub adaptory według tradycyjnej praktyki.
W stosowanym tu znaczeniu określenia „komórka, „linia komórkowa i „hodowla komórkowa używane są wymiennie i każde takie określenie obejmuje potomstwo. Co za tym idzie, słowa „transformanty i „transformowane komórki obejmują komórkę będącą pierwotnym podmiotem i wyprowa10
PL 205 897 B1 dzone z niej hodowle niezależnie od liczby transferów. Zrozumiałym jest, że całe potomstwo może nie być dokładnie takie samo pod względem zawartości DNA, ze względu na zamierzone lub niezamierzone mutacje. Uwzględnione jest zmienione w wyniku mutacji potomstwo posiadające tę samą funkcję lub aktywność biologiczną jaką wykryto w przypadku oryginalnie transformowanych komórek. Gdy wymagane są niezależne oznaczenia, to będzie to jasno wynikało z kontekstu.
Sposoby realizacji wynalazku
Niniejszy wynalazek dostarcza szczepów E. coli pozbawionych w chromosomie degrP i prc kodujących odpowiednio proteazy DegP i Prc i niosących mutację w genie spr, którego produkt ekspresji hamuje fenotyp wzrostowy ujawniany przez szczepy niosące mutację prc. Ponadto, szczep jest warunkowo pozbawiony chromosomowego lokus ptr3 kodującego proteazę III i/lub korzystnie chromosomowego ompT kodującego proteaze OmpT.
W korzystnej postaci szczep zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla szczepu. Szczep jest korzystnie transformowany kwasem nukleinowym, zwłaszcza DNA (cDNA lub genomowy DNA), przykładowo przez zastosowanie zrekombinowanego wektora ekspresyjnego.
W dalszej postaci wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania takich heterologicznych polipeptydów. W sposobie tym powyższy szczep E. coli, który zawiera również kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, hoduje się tak, że kwas nukleinowy ulega ekspresji. Następnie polipeptyd odzyskuje się ze szczepu. Odzyskiwanie może być przeprowadzane z peryplazmy lub pożywki, w której hodowano szczep. Korzystnie hodowla prowadzona jest w fermentorze i korzystniej w warunkach fermentacji przy wysokiej gęstości komórek.
Zastosowane parametry prowadzenia hodowli i wytwarzania polipeptydu są dobierane w tradycyjny sposób, tak jak w procedurach opisanych poniżej.
A. Selekcja kwasu nukleinowego i jego modyfikacja
Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania stanowi dogodnie RNA, cDNA lub genomowy DNA z jakiegokolwiek źródła, dostarczony tak, że koduje polipeptyd(polipeptydy) będący przedmiotem zainteresowania. Dobrze znane są sposoby selekcji odpowiedniego kwasu nukleinowego do ekspresji heterologicznych polipeptydów (włącznie z jego wariantami) w E. coli.
Przy wytwarzaniu przeciwciała monoklonalnego DNA kodujący przeciwciało monoklonalne izoluje się i sekwencjonuje przy pomocy tradycyjnych sposobów (np. przez zastosowanie sond oligonukleotydowych zdolnych do wiązania specyficznych genów kodujących łańcuchy ciężkie i lekkie mysich przeciwciał). Zalecanym źródłem takiego DNA są komórki hybrydomy. Po wyizolowaniu DNA może być umieszczony w wektorach ekspresyjnych, którymi następnie transformuje się bakteryjne komórki gospodarza w celu uzyskania syntezy przeciwciał monoklonalnych w rekombinowanych komórkach gospodarza. Artykuły przeglądowe dotyczące rekombinacyjnej ekspresji w bakteriach DNA kodującego przeciwciała obejmują Skerra i wsp., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) i Ptockthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).
Sposoby humanizowania nie-ludzkich przeciwciał zostały opisane w dziedzinie. Dogodnie przeciwciało humanizowane zawiera jedną lub więcej reszt wprowadzonych do niego ze źródła innego niż człowiek. Te nie pochodzące od człowieka aminokwasy są często określone jako reszty „importowane, które typowo pochodzą z „importowanej domeny zmiennej. Humanizowanie może być zasadniczo przeprowadzone zgodnie ze sposobem Winter i wsp. (Jones i wsp., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann i wsp., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen i wsp., Science 239: 1534-1536 (1988)) przez podstawienie sekwencji regionu hiperzmiennego odpowiednimi sekwencjami ludzkiego przeciwciała. Zgodnie z tym takie „humanizowane przeciwciała są przeciwciałami chimerowymi (patent US nr 4,816,567), przy czym zasadniczo mniej niż pełna ludzka domena zmienna jest podstawiana za odpowiadającą jej sekwencję z gatunków innych niż człowiek. W praktyce przeciwciała humanizowane są typowo ludzkimi przeciwciałami, w których pewne reszty regionu zmiennego i przypuszczalnie niektóre reszty FR są zastąpione przez analogiczne reszty z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzonia.
Wybór ludzkich domen zmiennych zarówno lekkich jak i ciężkich do zastosowania do wytwarzania przeciwciał humanizowanych jest bardzo ważny dla ograniczenia antygenowości. Zgodnie z tak zwanym sposobem „najlepszego dopasowania sekwencje domeny zmiennej przeciwciała gryzonia przeszukuje się względem pełnej biblioteki znanych ludzkich sekwencji domeny zmiennej. Ludzka sekwencja, która jest najbliższa odpowiedniej sekwencji gryzonia jest następnie uznawana jako ludzki region zrębowy (FR) dla przeciwciała humanizowanego (Sims i wsp., J. Immunol., 151: 2296 (1993);
PL 205 897 B1
Chothia i wsp., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). W innych sposobach wykorzystuje się szczególny region zrębowy pochodzący z sekwencji najwyższej zgodności wszystkich ludzkich przeciwciał ze szczególnej podgrupy łańcuchów lekkich lub ciężkich. Ten sam zrąb może być użyty dla szeregu różnych przeciwciał humanizowanych (Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta i wsp., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
Ponadto, ważnym jest aby przeciwciała były humanizowane z zachowaniem wysokiego powinowactwa dla antygenu i innych biologicznie pożądanych właściwości. Dla osiągnięcia tego celu, zgodnie z zalecanym sposobem, przeciwciała humanizowane wytwarza się przez analizę wyjściowych sekwencji i różnych koncepcyjnych humanizowanych produktów, przy pomocy trójwymiarowych modeli sekwencji wyjściowej i sekwencji humanizowanej. Trójwymiarowe modele immunoglobuliny są powszechnie dostępne i są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe ilustrujące i prezentujące przypuszczalne trójwymiarowe struktury konformacyjne wybranych, kandydujących sekwencji immunoglobuliny. Zbadanie tych prezentacji pozwala na analizę przypuszczalnej roli reszt w funkcjonowaniu kandydującej sekwencji immunoglobulinowej, tj. badanie reszt wpływających na zdolność kandydującej immunoglobuliny do wiązania jej antygenu. W ten sposób wybrane mogą być reszty FR i połączone z sekwencjami biorcy i importowanymi tak, że uzyskiwana jest pożądana charakterystyka przeciwciała, tj. zwiększenie powinowactwa do docelowego antygenu (antygenów). Ogólnie, reszty w obszarze hiperzmiennym bezpośrednio i w sposób najbardziej znaczący wpływają na wiązanie antygenu.
Różne postaci przeciwciała humanizowanego lub przeciwciała dojrzałego pod względem powinowactwa są rozważane. Przykładowo, przeciwciało humanizowane lub przeciwciało dojrzałe pod względem powinowactwa może być fragmentem przeciwciała takim jak Fab, który jest ewentualnie skoniugowany z jednym lub większą liczbą czynników docelowych celem wytworzenia immunokoniugatu. Alternatywnie, przeciwciało humanizowane lub przeciwciało dojrzałe pod względem powinowactwa może być przeciwciałem niezmienionym, takim jak niezmienione przeciwciało IgGl.
Fragmenty Fab'-SH mogą być bezpośrednio odzyskiwane z E. coli i wiązane chemicznie z wytworzeniem F(ab')2 (Carter i wsp., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). Zgodnie z innym podejściem fragmenty F(ab')2 mogą być izolowane bezpośrednio z hodowli rekombinowanych komórek gospodarza. Inne techniki produkcji fragmentów przeciwciał będą oczywiste dla specjalistów w dziedzinie. W innych postaciach, wybrane przeciwciało jest jednołańcuchowym fragmentem Fv (scFv) (WO 93/16185; patent US nr: 5,571,894 i 5,587,485). Fragment przeciwciała może być również „przeciwciałem liniowym np. opisanym w patencie US nr 5,641,870. Takie fragmenty przeciwciała liniowego mogą być monospecyficzne lub bispecyficzne.
Bispecyficzne przeciwciała są przeciwciałami wiążącymi specyficznie co najmniej dwa różne epitopy. Przykładowe bispecyficzne przeciwciała mogą wiązać dwa różne epitopy białka Dkk-1. Bispecyficzne przeciwciała mogą być przygotowane jako pełnej długości przeciwciała lub fragmenty przeciwciał (np. bispecyficzne przeciwciała F(ab')2).
Zgodnie z różnymi podejściami domeny zmienne przeciwciała o pożądanej specyficzności wiązania (miejsca łączące przeciwciało-antygen) są poddane fuzji z sekwencjami domeny stałej immunoglobuliny. Fuzja jest dogodnie w domenie stałej łańcucha ciężkiego immunoglobuliny zawierającej przynajmniej część zawiasu, regiony CH2 i CH3. Zalecane jest posiadanie pierwszego regionu stałego łańcucha ciężkiego (CH1) posiadającego miejsce niezbędne dla wiązania łańcucha lekkiego obecnego w przynajmniej jednej z fuzji. DNA kodujące fuzje łańcucha ciężkiego immunoglobuliny i, jeśli to pożądane, łańcucha lekkiego immunoglobuliny są wbudowywane do odrębnych wektorów ekspresyjnych i wprowadzane przez kotransformację do dogodnego bakteryjnego organizmu gospodarza. Zapewnia to dużą plastyczność w ustalaniu wzajemnych proporcji trzech fragmentów polipeptydów, w przypadku realizacji gdzie wymagane są nierówne proporcje trzech łańcuchów polipeptydowych użytych w konstrukcji dla optymalnej wydajności. Jednakże jest możliwe wbudowanie sekwencji kodujących dla dwóch lub wszystkich trzech łańcuchów polipeptydowych do jednego wektora ekspresyjnego, gdzie ekspresja przynajmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych proporcjach daje wysokie wydajności, lub gdy proporcje nie mają szczególnego znaczenia.
W zalecanej postaci tego podejścia bispecyficzne przeciwciała są zbudowane z hybrydowego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny z pierwszym miejscem specyficznego wiązania w jednym ramieniu i hybrydowej pary łańcucha ciężkiego-łańcucha lekkiego immunoglobuliny (dostarczających drugie miejsce specyficznego wiązania) w innym ramieniu. Stwierdzono, że taka asymetryczna struktura ułatwia rozdział pożądanego bispecyficznego związku od niepożądanych kombinacji łańcuchów
PL 205 897 B1 immunoglobuliny, bowiem obecność lekkiego łańcucha immunoglobuliny tylko w jednej połowie bispecyficznej cząsteczki dostarcza łatwego sposobu rozdziału. Takie podejście jest ujawnione w WO 94/04690. Dla dalszych szczegółów wytwarzania bispecyficznych przeciwciał patrz przykładowo Suresh i wsp., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
Zgodnie z kolejnym podejściem opisanym w patencie US nr 5,731,168 w celu maksymalizacji odsetka heterodimerów, które są odzyskiwane z hodowli rekombinowanych komórek skonstruowany może być łącznik pomiędzy parą cząsteczek przeciwciał. Zalecany łącznik zawiera przynajmniej część domeny CH3 domeny stałej przeciwciała. W sposobie tym jeden lub więcej małych łańcuchów bocznych aminokwasu z łącznika cząsteczki pierwszego przeciwciała jest zastępowanych większymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyna lub tryptofan). Kompensujące „jamy o identycznej lub podobnej wielkości z dużymi łańcuchami bocznymi są wytwarzane na łączniku cząsteczki drugiego przeciwciała przez zastępowanie dużych łańcuchów bocznych aminokwasu, mniejszymi (np. alanina lub treonina). Dostarcza to mechanizmu dla zwiększania wydajności otrzymywania heterodimerów względem innych niepożądanych produktów końcowych, takich jak homodimery.
Bispecyficzne przeciwciała obejmują przeciwciała sieciowane i przeciwciała „heterokoniugatowe. Przykładowo, jedno z przeciwciał w heterokoniugacie może być połączone z awidyną, a inne z biotyną. Takie przeciwciała zaproponowano dla adresowania komórek układu immunologicznego do niepożądanych komórek (patent US nr 4,676,980) i dla leczenia infekcji HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 i EP 03089). Przeciwciała heterokoniugatowe mogą być wytwarzane przy pomocy jakiejkolwiek dogodnej metody sieciowania. Użyteczne czynniki sieciujące są dobrze znane w dziedzinie i ujawnione w patencie US nr 4,676,980 wraz z szeregiem technik sieciowania.
Techniki wytwarzania bispecyficznych przeciwciał z fragmentów przeciwciał zostały również opisane w literaturze. Przykładowo, bispecyficzne przeciwciała mogą być wytwarzane przy pomocy wiązania chemicznego. Brennan i wsp., Science, 229: 81 (1985) opisuje procedurę, w której niezmienione przeciwciała są cięte proteolitycznie z wytworzeniem fragmentów F(ab')2. Fragmenty te są redukowane w obecności czynnika kompleksującego grupę ditiolową, arsenianu sodowego, w celu stabilizacji sąsiadujących grup ditiolowych i zapobieganiu powstawania międzycząsteczkowych mostków disiarczkowych. Wytworzone fragmenty Fab' są następnie przekształcane do pochodnych tionitrobenzoesanu (TNB). Jedna z pochodnych Fab'-TNB jest następnie przekształcana z powrotem do Fab'-tiolu przez redukcję merkaptoetyloaminą i mieszana z równą objętością drugiej pochodnej Fab'-TNB tworząc bispecyficzne przeciwciało. Wytworzone bispecyficzne przeciwciała mogą być stosowane jako czynniki do wybiórczego unieruchamiania enzymów.
Ponadto, fragmenty Fab'-SH mogą być bezpośrednio odzyskiwane z E. coli i wiązane chemicznie z wytworzeniem bispecyficznych przeciwciał (Shalaby i wsp., J. Exp. Med., 175 : 217-225 (1992)).
Opisano również różne techniki wytwarzania i izolowania fragmentów bispecyficznych przeciwciał bezpośrednio z hodowli rekombinowanych komórek. Przykładowo, bispecyficzne przeciwciała zostały wytworzone przy pomocy suwaków leucynowych (Kostelny i wsp., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992)). Peptydy suwaka leucynowego z białek Fos i Jun są łączone z częściami Fab' dwóch różnych przeciwciał przez fuzję genową. Homodimery przeciwciała są redukowane w regionie zawiasowym z wytworzeniem monomerów i następnie ponownie utleniane z wytworzeniem heterodimerów przeciwciała. Sposób ten może również być wykorzystany do wytwarzania homodimerów przeciwciał. Technologia „diaciała opisana przez Hollinger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) dostarczyła alternatywnego mechanizmu do wytwarzania fragmentów bispecyficznych przeciwciał. Fragmenty zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) przez łącznik, który jest zbyt krótki dla umożliwienia parowania pomiędzy dwoma domenami tego samego łańcucha. Zgodnie z tym, domeny VH i VL jednego fragmentu są zmuszone do parowania z komplementarnymi domenami VL i VH innego fragmentu tym samym tworząc dwa miejsca wiązania antygenu. Donoszono również o innej strategii wytwarzania bispecyficznych fragmentów przeciwciał przez zastosowanie dimerów jedno-łańcuchowych Fv (sFv) dimerów (Gruber i wsp., J. Immunol., 152: 5368 (1994)).
Przeciwciała o więcej niż dwóch wartościowościach są także rozważane. Przykładowo mogą być wytwarzane przeciwciała trójspecyficzne (Tutt i wsp., J. Immunol., 147: 60 (1991)).
Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące warianty polipeptydu wytwarza się różnymi sposobami znanymi w dziedzinie. Sposoby te nieograniczająco obejmują izolację z naturalnego źródła (w przypadku naturalnie występujących wariantów sekwencji aminokwasowych) lub wytwarzanie przez
PL 205 897 B1 mutagenezę przy pomocy oligonukleotydu (lub miejscowo specyficzną), mutagenezę PCR lub mutagenezę kasetą wcześniej wytworzonej wersji wariantu lub nie będącej wariantem wersji polipeptydu.
Pożądane może być zmodyfikowanie przeciwciała tu opisanego pod względem funkcji eżektorowej, np. tak aby zwiększyć wiązanie receptora Fc. Może być to osiągnięte przez wprowadzenie jednej lub większej liczby podstawień aminokwasowych do regionu Fc przeciwciała. Alternatywnie lub dodatkowo reszta(reszty) cysteiny mogą być wprowadzane do regionu Fc, pozwalając tym samym na tworzenie w tym regionie międzyłańcuchowych wiązań disiarczkowych.
W celu zwię kszenia okresu pół trwania przeciwciał a w surowicy moż na wbudować do przeciwciała epitop wiążący receptor ochronny (ang. salvage receptor binding epitope) (szczególnie fragment przeciwciała) jaki opisano przykładowo w patencie US 5,739,277. W użytym tu znaczeniu termin „epitop wiążący receptor ochronny określa epitop regionu Fc cząsteczki IgG (np. IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4), który jest odpowiedzialny za zwiększenie in vivo okresu półtrwania cząsteczki IgG w surowicy.
Inne modyfikacje przeciwciała są tu rozważane. Przykładowo, przeciwciało może być połączone z jednym z wielu nie-białkowych polimerów np. glikolem polietylenowym, glikolem polipropylenowym, polioksyalkenami lub kopolimerami glikolu polietylenowego i glikolu polipropylenowego.
B. Wbudowanie kwasu nukleinowego do wektora zdolnego do replikacji
Heterologiczny kwas nukleinowy (np. cDNA lub genomowy DNA) odpowiednio wprowadza się do wektora ulegającego replikacji w celu ekspresji w bakterii pod kontrolą odpowiedniego promotora. Do tego celu dostępnych jest wiele wektorów i selekcja odpowiedniego wektora będzie zależała głównie od wielkości wprowadzanego do wektora kwasu nukleinowego i szczególnej komórki gospodarza, która będzie transformowana wektorem. Każdy wektor zawiera różne składniki zależnie od szczególnej komórki gospodarza, z którą jest zgodny. Zależnie od szczególnego typu gospodarza składniki wektorowe ogólnie obejmują, nieograniczająco, jedną lub więcej następujących sekwencji: sygnałową, miejsca inicjacji replikacji, jednego lub więcej genów znacznikowych, promotora i sekwencji terminacji transkrypcji.
Ogólnie, wektory plazmidowe zawierające replikon i sekwencje kontrolujące pochodzące z gatunków zgodnych z komórką gospodarza są stosowane w połączeniu z gospodarzami E. coli. Wektor normalnie przenosi miejsce replikacji jak również sekwencję znacznikową zdolną do zapewnienia selekcji genotypowej w stransformowanych komórkach. Przykładowo, E. coli jest typowo transformowana przy pomocy plazmidu pBR322 pochodzącego z gatunku E. coli (patrz np. Bolivar i wsp., Gene, 2: 95 (1977)). Plazmid pBR322 zawiera geny warunkujące oporność na ampicylinę i tetracyklinę, i tym samym zapewnia łatwe sposoby identyfikacji stransformowanych komórek. Plazmid pBR322 lub inny plazmid bakteryjny lub fag zawierają również ogólnie lub są tak zmodyfikowane, że zawierają promotory, które mogą być wykorzystane przez gospodarza E. coli do ekspresji genów znacznika selekcyjnego.
(i) Sekwencja sygnałowa
DNA kodujący polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania może być eksprymowany nie tylko bezpośrednio lecz również jako fuzja z innym polipeptydem, zwłaszcza sekwencją sygnałową, lub innym polipeptydem posiadającym specyficzne miejsce cięcia na N-końcu dojrzałego polipeptydu. Ogólnie, sekwencja sygnałowa może być składnikiem wektora lub może być częścią polipeptydu, który jest wbudowany do wektora. Wybrana heterologiczna sekwencja sygnałowa powinna być taką, która jest rozpoznawana i poddawana obróbce (np. przecięta przez peptydazę sygnałową) przez komórkę gospodarza.
W przypadku prokariotycznych komórek gospodarza, które nie rozpoznają i nie poddają obróbce natywnej lub eukariotycznej sekwencji polipeptydu sygnałowego, sekwencja sygnałowa jest zastępowana przez prokariotyczną sekwencję sygnałową wybraną przykładowo z grupy obejmującej sekwencje liderowe alkalicznej fosfatazy, penicylinazy, lpp lub termostabilnej enterotoksyny II.
(ii) Miejsce inicjacji replikacji
Wektory ekspresyjne zawierają sekwencję kwasu nukleinowego pozwalają na replikację w jednej lub większej liczbie wybranych komórek gospodarza. Takie sekwencje są dobrze znane dla różnych bakterii. Miejsce inicjacji replikacji plazmidu pBR322 jest użyteczne w przypadku większości bakterii Gram-ujemnych, takich jak E. coli.
(iii) Gen selekcyjny
Wektory ekspresyjne ogólnie zawierają gen selekcyjny określany również jako znacznik selekcyjny. Gen ten koduje białko niezbędne do przeżycia lub wzrostu transformowanych komórek gospodarza w pożywce selekcyjnej. Komórki gospodarza nietransformowane wektorem zawierającym gen
PL 205 897 B1 selekcyjny nie przeżyją w pożywce hodowlanej. Ten znacznik selekcyjny jest odrębny od znaczników genetycznych wykorzystywanych i określonych w tym wynalazku. Typowe geny selekcyjne kodują białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylinę, neomycynę, metotreksat lub tetracyklinę, (b) komplementują auksotroficzne niedobory inne niż te powodowane obecnością znacznika (znaczników) genetycznych lub (c) dostarczają krytycznych substancji odżywczych niedostępnych ze złożonych pożywek np. gen kodujący racemazę D-alaninową w przypadku Bacillus.
Jeden przykład schematu selekcji wykorzystuje lek do zahamowania wzrostu komórki gospodarza. W tym przypadku, te komórki, które są pomyślnie stransformowane kwasem nukleinowym będącym przedmiotem zainteresowania wytwarzają polipeptyd nadający oporność na lek i co za tym idzie przeżywają w warunkach selekcyjnych. Przykłady takiej dominującej selekcji wykorzystują leki neomycynę (Southern i wsp., J. Molec. Apply. Genet., 1: 327 (1982), kwas mykofenolowy (Mulligan i wsp., Science, 209: 1422 (1980)) lub higromycynę (Sugden i wsp., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 (1985). Trzy powyższe przykłady wykorzystują bakteryjne geny pod kontrolą elementów eukariotycznych aby zapewnić oporność na odpowiedni lek G418 lub neomycynę (genetycyna), xgpt (kwas mykofenolowy) lub higromycynę.
(iv) Promotor
Wektor ekspresyjny do produkcji polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania zawiera odpowiedni promotor rozpoznawany przez organizm gospodarza i połączony funkcjonalnie z kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. Promotory odpowiednie do zastosowania w komórkach prokariotycznego gospodarza obejmują systemy promotora betalaktamazy i laktozy (Chang i wsp., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel i wsp., Nature, 281: 544 (1979)), system promotora arabinozy (Guzman i wsp., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992)), fosfatazy alkalicznej, system promotora tryptofanowego (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) i EP 36,776) i promotory hybrydowe, takie jak promotor tac (deBoer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)). Jednakże, użyteczne są inne znane promotory bakteryjne. Ich sekwencje nukleotydowe zostały opublikowane umożliwiając w ten sposób specjaliście w dziedzinie ich funkcjonalne połączenie z DNA kodującym polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania (Siebenlist i wsp., Cell, 20: 269 (1980)) przy pomocy łączników lub adaptorów dostarczających jakiekolwiek wymagane miejsca restrykcyjne.
Promotory do zastosowania w systemach bakteryjnych ogólnie zawierają również sekwencje Shine-Dalgarno (S-D) połączoną funkcjonalnie z DNA kodującym polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. Promotor może być usunięty z bakteryjnego źródła DNA przez trawienie enzymem restrykcyjnym i wbudowany do wektora zawierającego pożądany DNA.
(v) Konstrukcja i analiza wektorów
Do konstrukcji odpowiednich wektorów zawierających jeden lub więcej wyżej wymienionych składników wykorzystuje się typowe techniki ligacji. Wyizolowane plazmidy lub fragmenty DNA tnie się, skraca i ponownie liguje w postaci pożądanej do wytworzenia wymaganych plazmidów.
Do analizy mającej na celu potwierdzenie prawidłowości sekwencji w skonstruowanych plazmidach mieszaniny ligacyjne stosuje się do transformacji E. coli K12 szczepu 294 (ATCC 31,446) lub innych szczepów i uzyskane transformanty selekcjonuje się odpowiednio ze względu na oporność na ampicylinę lub tetracyklinę. Z transformantów otrzymuje się plazmidy, które analizuje się przez trawienie endonukleazą restrykcyjną i/lub sekwencjonuje metodą Sanger'a i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977) lub Messing'a i wsp., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981), lub sposobem Maxam'a i wsp., Methods in Enzymology 65: 499 (1980).
C. Selekcja i transformacja komórek gospodarza
Komórki gospodarza E. coli odpowiednie jako macierzyste komórki gospodarza dla plazmidów ekspresyjnych obejmują tu E. coli W3110 (ATCC 27,325), E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B i E. coli X 1776 (ATCC 31,537). Przykłady te są raczej ilustrującymi niż ograniczającymi. Zmutowane komórki któregokolwiek z wyżej wspomnianych szczepów mogą być również wykorzystane jako wyjściowi gospodarze, którzych następnie poddaje się mutacji tak, że zawierają przynajmniej minimalny wymagany tu genotyp. Szczep E. coli W3110 jest zalecanym gospodarzem macierzystym, ponieważ jest powszechnie stosowanym szczepem gospodarza do fermentacji produktów rekombinowanego DNA. Przykłady macierzystych gospodarzy E. coli do zastosowania jako macierzyści gospodarze rodzicielscy wraz z ich genotypami, są uwzględnieni w poniższej tabeli:
PL 205 897 B1
Szczep Genotyp
W3110 K-12 F- lambda' IN(rrnD-rrnE)1
1Α2 W3110ΔfhuA
9E4 W3110ΔfhuA ptr3
27A7 W3110ΔfhuA ptr3 ρΙιοΑΔΕ15 ^argF-lac)169
27C6 W3110ΔfhuA ptr3 ρΙιοΑΔΕ15 A(argF-lac)169 ΔοιτιρΤ
27C7 W3110ΔfhuA ptr3 ρΙιοΑΔΕ15 A(argF-lac)169 ΔοτρΤ degP41 ^pstI-kanR)
33D3 W3110ΔfhuA ptr3 laclq lacL8 ΔοτρΤ degP41 ^pstI-kanR)
36F8 W3110ΔfhuA ρΙιοΑΔΕ15 A(argF-lac)169 ptr3 degP41 ^pstI-kanR) ilvG2096R
43D3 W3110ΔfhuA ptr3 ρΙιοΑΔΕ15 A(argF-lac)169 ΔοτρΤ degP41 ^pstI-kanR) ilvG2096R
43E7 W3110ΔfhuA A(argF-lac)169 ΔοτρΤ ptr3 ρΙιοΑΔΕ15 degP41 ^pstl-kans) ilvG2096R
44D6 W3110ΔfhuA ptr3 A(argF-lac)169 degP41 ^pstl-kanS) ΔοτρΤ ilvG2096R
45F8 W3110ΔfhuA ρ^3 A(argF-lac)169 degP41 (^stl-kanS ΔοτρΤ ρήοΘ* (Τ10Υ) ilvG2096R
45F9 W3110ΔfhuA ρ^3 Δ(argF-lac)169 degP41 (^stl-kan3) ΔοτρΤ ilvG2096R ρήοβ* (Τ10Υ) Δcyo::kanR
Odpowiednie są również produkty pośrednie do wytwarzania szczepu 36F8, np. 27B4 (patent USA nr 5,304,472) i 35E7 (spontaniczne kolonie termooporne wyizolowane jako rosnące lepiej niż 27B4). Ponadto, odpowiednim szczepem jest szczep E. coli posiadający mutację w peryplazmatycznej proteazie(proteazach) ujawniony w patencie US nr 4,946,783 nadanych 7 sierpnia 1990.
Szczepy tu opisane mogą być wytworzone przez integrację chromosomu szczepu macierzystego lub innymi sposobami obejmującymi te, podane poniżej w przykładach.
Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd jest wbudowywany do komórek gospodarza. Dogodnie jest to przeprowadzane przez transformację komórek gospodarza wyżej wspomnianymi wektorami ekspresyjnymi i hodowanie w tradycyjnych pożywkach odżywczych zmodyfikowanych ewentualnie dla indukcji różnych promotorów.
Transformacja oznacza wprowadzanie DNA do organizmu tak, że DNA jest replikowany zarówno jako element pozachromosomowy lub w postaci zintegrowanej do chromosomu. Zależnie od użytych komórek gospodarza transformacja jest wykonywana przy pomocy typowych sposobów odpowiednich dla takich komórek. Działanie wapniem wykorzystujące chlorek wapnia jak opisano w rozdziale 1.82 Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nowy Jork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) jest ogólnie stosowane dla komórek prokariotycznych lub innych komórek posiadających istotne bariery jak ściana komórkowa. Inny sposób transformacji wykorzystuje glikol polietylenowy/DMSO jak opisano w Chung i Miller, Nucleic Acids Res., 16: 3580 (1988). W jeszcze innym sposobie stosowana jest technika nazwana elektroporacją.
D. Hodowla komórek gospodarza
Komórki gospodarza używane do produkcji polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania hoduje się w odpowiednich pożywkach jak ogólnie opisano w Sambrook i wsp., powyżej. Warunki hodowli, takie jak temperatura, pH i temu podobne, są takie jak wcześniej stosowano w przypadku komórki gospodarza wybranej do ekspresji i będą oczywiste dla specjalisty o przeciętnych umiejętnościach.
W przypadku zastosowania promotora alkalicznej fosfatazy, komórki E. coli stosowane do produkcji opisanego tu polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania hoduje się w odpowiednich pożywkach, w których promotor alkalicznej fosfatazy może być częściowo lub całkowicie zaindukowany jak to ogólnie opisano np. w Sambrook i wsp., powyżej. Hodowla nigdy nie powinna być przeprowadzana przy braku fosforanu nieorganicznego lub na poziomie głodu fosforanowego.
Najpierw, pożywka zawiera nieorganiczny fosforan w ilości powyżej poziomu indukcji syntezy białka i wystarczającej dla wzrostu bakterii. Wraz ze wzrostem komórek i wykorzystywaniem fosforanu poziom fosforanu w pożywce obniża się, tym samym powodując indukcję syntezy polipeptydu.
Jakikolwiek inny niezbędny składnik pożywek oprócz źródła węgla, azotu i nieorganicznego fosforanu może również być uwzględniony w odpowiednich stężeniach i być wprowadzany sam lub jako
PL 205 897 B1 mieszanina z innym składnikiem lub pożywką taką jak złożone źródło azotu. Pożywka może mieć dowolne pH, około 5-9, w zależności głównie od organizmu gospodarza.
Jeśli promotor jest promotorem indukowanym, dla wystąpienia indukcji komórki zazwyczaj hoduje się aż do osiągnięcia określonej gęstości optycznej, np. A550 około 200 wykorzystując proces hodowli o wysokiej gęstości komórek, gdzie zapoczątkowywana jest punktowa indukcja (np. przez dodanie induktora, przez usunięcie składnika pożywki, itp.), w celu indukcji ekspresji genu kodującego polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania.
E. Wykrywanie ekspresji
Ekspresja genu może być zmierzona w próbce bezpośrednio, przykładowo tradycyjną metodą Southern blot, Northern blot dla ilościowego określenia transkrypcji mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), dot blot (analiza DNA) lub hybrydyzacja in situ przy pomocy odpowiednio wyznakowanej sondy opartej na sekwencjach polipeptydu. Zastosowane mogą być różne znaczniki, najczęściej radioizotopowe, szczególnie 32P. Jednakże inne techniki mogą również być zastosowane, takie jak nukleotydy zmodyfikowane biotyną do wprowadzania do polinukleotydu. Biotyna służy następnie jako miejsce wiązania awidyny lub przeciwciał, które mogą być wyznakowane rozmaitymi znacznikami, takimi jak radionuklidy, związki fluorescencyjne, enzymy lub im podobne. Alternatywnie, można zastosować oznaczenia lub żele do wykrywania białka.
W celu wydzielania produktu ekspresji genu komórka gospodarza jest hodowana w warunkach wystarczających dla wydzielenia produktu genu. Warunki takie obejmują np. temperaturę, substancję odżywczą i gęstość komórek, pozwalające na wydzielanie przez takie komórki. Poza tym warunki te są takimi, w których komórka może realizować podstawowe funkcje komórkowe, transkrypcję, translację i transport białek z jednego kompartmentu komórkowego do drugiego, co jest znane specjalistom w dziedzinie.
F. Oczyszczanie polipeptydów
Następujące procedury, indywidualnie lub w kombinacji są przykładami odpowiednich procedur oczyszczania, przy czym specyficzny sposób (sposoby) wykorzystywany jest w zależności od typu polipeptydu: frakcjonowanie na kolumnach immunopowinowactwa lub jonowymiennych; wytrącanie etanolem; HPLC na odwróconej fazie; chromatografia oddziaływań hydrofobowych; chromatografia na krzemionce; chromatografia na żywicy jonowymiennej takiej jak S-SEPHAROSE™ i DEAE; ogniskowanie chromatograficzne; SDS-PAGE; wytrącanie siarczanem amonu i filtrowanie w żelu przy pomocy, przykładowo SEPHADEX™ G-75.
Przeciwciała monoklonalne mogą być dogodnie oddzielone od pożywki hodowlanej przez tradycyjne procedury oczyszczania przeciwciał, takie jak, przykładowo, chromatografia na SEPHAROSE z białkiem A, chromatografia na hydroksyapatycie; elektroforeza w żelu, dializa lub chromatografia powinowactwa.
Wynalazek będzie w pełni zrozumiały dzięki odniesieniu do poniższych przykładów. Jednak nie są one skonstruowane jako ograniczające zakres wynalazku. Cała literatura i cytowane tu patenty są włączone przez odniesienie literaturowe.
P r z y k ł a d 1
Materiały i metody
A. Ekspresja plazmidów
1. Plazmidy do ekspresji rhuFab'2 LZ (xCD18) i wyznakowanych pochodnych pS1130
Plazmid pS1130 jest plazmidem opartym na pBR322 opisanym w patencie US nr 6,180,367 i 6,258,560. Synteza rhuFab'2 LZ (xCD18) jest regulowana przez promotor alkalicznej fosfatazy (AP) z E. coli. Gdy promotor AP jest indukowany przez zmniejszenie iloś ci (deplecję) fosforanów, tworzy on dwucistronowy mRNA w kolejności sekwencja kodująca peptyd sygnałowy STII - łańcuch lekki kappa; sekwencja kodująca peptyd sygnałowy STII - sekwencja łańcucha ciężkiego, po których następuje sekwencja suwaka leucynowego. Terminator transkrypcji bakteriofaga lambda został umieszczony w pobliż u kodonu terminacji translacji.
pcyc34
Plazmid pcyc34 jest odpowiednikiem pS113 0 z promotorem tacll. pxCD18-7T3
Dwupromotorowy plazmid zawiera dwie oddzielne jednostki translacji, pxCD18-7T3 pozwalające na czasowe rozdzielenie transkrypcji łańcucha lekkiego od transkrypcji łańcucha ciężkiego. Tak jak w pS1130 ł a ń cuch lekki pozostaje pod kontrolą promotora phoA. Jednakż e w pxCD18-7T3 terminator transkrypcji Xto następuje po sekwencji kodującej łańcuch lekki. Poniżej tego terminatora dodany zoPL 205 897 B1 stał promotor tacll do kontrolowania transkrypcji fragmentu łańcucha ciężkiego /C-końcowego suwaka leucynowego (DeBoer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)). Drugi terminator transkrypcji Xto znajduje się poniżej tej sekwencji kodującej. Warianty sekwencji sygnałowej STII z milczącym kodonem użyto do kierowania wydzielaniem obu łańcuchów (Simmons i Yansura, Nature Biotechnology, 14: 629-634 (1996)). Dokładniej nukleotydy w sekwencji sygnałowej STII zostały zmodyfikowane tak, aby łańcuch lekki posiadał względną siłę TIR wynoszącą 7 i łańcuch ciężki posiadał względną siłę TIR wynoszącą 3, a ostatnie trzy nukleotydy sekwencji sygnałowej poprzedzające zarówno łańcuch lekki i łańcuch ciężki były GCT. W tym dwu-promotorowym systemie sekwencja promotora phoA i DNA dla łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała są takie same jak w pS1130.
pAB3
Plazmid pAB3 jest zaprojektowany tak, aby wyrażał przeciwciało anty-CD18 F(ab')2 w peryplazmie E. coli pod kontrolą promotora alkalicznej fosfatazy (Kikuchi i wsp., Nucleic Acids Res., 9 (21): 5671-5678 (1981)) i posiada suwak leucynowy i jest wyznakowany His. Sekwencja sygnałowa termostabilnej enterotoksyny II (Picken i wsp., Infect. Immun., 42: 269-275 (1983)) poprzedza łańcuch lekki i ciężki i na C-końcu łańcucha ciężkiego jest połączona z drożdżowym suwakiem leucynowym GCN4, a następnie sześcioma resztami histydyny. Sekwencje kodujące łańcuch lekki i ciężki są w konfiguracji policistronowej względem terminatora transkrypcji λ0 (Scholtissek i Grosse, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)) po genie łańcucha ciężkiego.
Plazmid pAB3 został skonstruowany przez ligację ze sobą przy pomocy ligazy trzech fragmentów DNA, z których pierwszy był wektorem pS1130, z którego usunięto mały fragment KpnI-SphI. Druga część w ligacji była fragmentem Kpnl-Hindlll o długości około 645 par zasad z pS1130. Końcowa część w ligaćji była syntetycznym dwuniciowym fragmentem DNA o następującej sekwencji:
5'-AGCTTGTCGGGGAGCGCCATCACCATCACCATCACTAAGCATG (SEQ ID NO:6)
ACAGCCCCTCGCGGTAGTGGTAGTGGTAGTGATTC-5' (SEQ ID NO:7) pAB21
Plazmid pAB21 jest pochodną pAB3, w której sześć reszt histydyny na C-końcu łańcucha ciężkiego zastąpiono sześcioma resztami lizyny. Plazmid został skonstruowany w identyczny sposób jak pAB3 z tym wyjątkiem, że syntetyczny DNA użyty w ligacji był jak następuje:
5'-AGCTTGTCGGGGAGCGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGTAAGCATG (SEQ ID NO:8) ACAGCCCCTCGCGTTTTTCTTTTTCTTTTTCATTC-5' (SEQ ID NO:9)
2. Plazmid do ekspresji przeciwciała Fab'2 LZ-6xhis anty-TF
Plazmid D3H44-F(ab')2 (znany również jako pD3h44f2) skonstruowany do kierowania wytwarzaniem przeciwciała przeciw czynnikowi tkankowemu Fab'2 suwak leucynowy-6xhis zawiera dokładnie tę samą sekwencję szkieletową DNA jak pAB3, z tym wyjątkiem, że regiony zmienne HC i LC zostały zmienione z xCD18 VL/VH na xTF VL/VH. Konstrukcję tego plazmidu opisano w WO 01/70984 opublikowanej 27 września 2001.
Dokładniej, najpierw plazmid do ekspresji przeciwciała Fab anty-TF (D3H44-F(ab)) sporządzono jak następuje: plazmid pEMX1 użyty do mutagenezy i ekspresji F(ab) w E. coli opisano w Werther i wsp., J. Immunol., 157: 4986-4995 (1996). W skrócie, plazmid zawiera fragment DNA kodujący sekwencje najwyższej zgodności ludzkiego łańcucha lekkiego κ z podgrupy I (VLkI-CL), sekwencje najwyższej zgodności ludzkiego łańcucha ciężkiego z podgrupy III (VHIII-CHI) i promotor alkalicznej fosfatazy. Zastosowanie sekwencji najwyższej zgodności dla VL i VH opisano w Carter i wsp., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992); Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992).
Mutagenezę ukierunkowaną (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985)) przeprowadzono na matrycy pEMX1 zawierającej deoksyurydynę. Sześć CDR zamieniono na mysią sekwencję D3; reszty zawarte w każdym CDR pochodziły z definicji opartych na sekwencjach CDR (Kabat i wsp., Sequeces of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, Public Health Service (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) z tym wyjątkiem, że CDR-H1, który zdefiniowano przy pomocy połączonych definicji CDR-H1 z Kabat i wsp., wyżej, i Chothia i wsp., Nature 342: 877-833 (1989), tj. CDR-H1 zdefiniowano jako rozciągający się między resztami H26-H35 w łańcuchu ciężkim. Co za tym idzie, D3H44-F(ab) kodował F(ab) składający się z całego ludzkiego zrębu (VLk podgrupa I i VH podgrupa III) z sześcioma całymi mysimi sekwencjami CDR.
D3H44-F(ab')2 wytworzono przez dodanie zawiasu łańcucha ciężkiego (CPPCPAPELLGG; SEQ ID NO:10) do C-końca D3H44-F(ab), następnie suwaka leucynowego GCN4 i znacznika (his)6 do oczyszczania, patrz powyżej opis pAB3 dla suwaka leucynowego i znacznika hisx6).
Plazmidy do ekspresji przeciwciała Fab anty-FEGF pY0317
PL 205 897 B1
Przeciwciało dojrzałe pod względem powinowactwa anty-VEGF Fab białka Y0317 opisano w Chem i wsp., J. Mol. Biol., 293: 865-881 (1999). Do konstrukcji plazmidu, do jego wytwarzania, pY0317, w skrócie, kasetkę ekspresyjną sklonowano w zrębie plazmidu E. coli pBR322 w miejscu EcoRI (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90 (1978). Kasetka ekspresyjna zawierała przynajmniej następujące podstawowe składniki: (1) promotor phoA dla kontroli transkrypcji; (2) terminator λ0 dla zakończenia transkrypcji i (3) sekwencję Shine-Dalgarno z genu trp E. coli lub z genu dla termostabilne j enterotosyny II (STII) lub kombinację obu dla zapewnienia translacji. Podstawowe składniki bakteryjnych kasetek ekspresyjnych są znane w dziedzinie i zostały opisane przykładowo przez Kikuchi i wsp., Nucleic Acids Res., 9(21): 5671-5678 (1981) (dla promotora phoA); Scholtissek i Grosse Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987) (dla terminatora Xto), Yanofsky i wsp., Nucleic Acids Res., 9: 6647-6668 (1981) (dla trp); Picken i wsp., Infect. Immun., 42: 269-275 (1983) (dla STII) i Chang i wsp., Gene, 55: 189-196 (1987) (dla łącznego zastosowania sekwencji trp i Shine-Dalgarno STII). Ponadto, sekwencje sygnałowe STII lub warianty z milczącym kodonem poprzedzały sekwencję kodującą w pY0317 zarówno dla łańcucha lekkiego jak i ciężkiego, dla wytwarzania przeciwciała Fab anty-VEGF i kierowały wydzielaniem białka do peryplazmy. Picken i wsp., Infect. Immun., 42: 269-275 (1983); Simmons i Yansura, Nature Biotechnology, 14: 629-634 (1996). Sekwencje nukleotydową i aminokwasową dla kasetki ekspresyjnej o długości 1952 par zasad wbudowanej w miejsce EcoRI do wytwarzania zrekombinowanego białka przedstawiono na fig. 1 (odpowiednio SEQ ID NO: 1 i 2).
RhuFab V2Y0317 skonstruowano przez humanizowanie mysiego monoklonalnego przeciwciała A.4.6.1 (Presta i wsp., Cancer Res., 57: 4593-4599 (1997)) przy pomocy procesu opisanego wcześniej dla innych przeciwciał (Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992); Presta i wsp., J. Immunol., 151: 2623-2632 (1993); Werther i wsp., J. Immunol. 157: 4986-4995 (1996)). W skrócie, cDNA kodujące łańcuchy zmienny lekki i zmienny ciężki muMAb A. 4.6.1 wyizolowano stosując RT-PCR na komórkach hybrydomy wytwarzających mysie przeciwciało monoklonalne. Te cDNA sklonowano i połączono z ludzkimi domenami CL i CHI (Werther i wsp., J. Immunol., 157: 4986-4995 (1996)), wytwarzając mysie-ludzkie chimerowe Fab. Sześć regionów określających komplementarność (CDR) (zaznaczone na fig. 1 pogrubionym tekstem) przeszczepiono do wektora wcześniej humanizowanego przeciwciała kodującego sekwencje najwyższej zgodności ludzkiego łańcucha lekkiego k z podgrupy I i sekwencje najwyższej zgodności ludzkiego łańcucha ciężkiego z podgrupy III (Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992)). Przenoszenie jedynie reszt CDR do ludzkiego zrębu powodowało 1000-krotne ograniczenie wiązania z antygenem VEGF. Szereg reszt zrębu w pobliżu CDR (zaznaczone na fig. 1 wersalikami i podkreśleniem) również zmieniono w celu poprawy wiązania z celem (Presta i wsp., Cancer Res., 57: 4593-4599 (1997)). We wszystkich zmieniono poza CDR siedem reszt łańcucha ciężkiego i jedną resztę łańcucha lekkiego. Łańcuchy ciężki i lekki następnie przenoszono do wektora do prezentacji na fagu (Baca i wsp., J. Biol. Chem., 272: 10678-10684 (1997)), zastępując gen hGH z phGHam-g3 (Bass i wsp., Proteins, 8: 309-314 (1990)). Mutagenezę ukierunkowaną stosowano do zmiany VL Met4Leu aby zapobiec utlenianiu metioniny i VH Thr231Leu dla ułatwienia klonowania do fuzji genlll. Wektor ten jest nazwany Y0101 i był użyty jako punkt wyjściowy dla optymalizacji wiązania CDR z antygenem VEGF (Muller i wsp., Structure, 6: 1153-1167 (1998)). Jedynie mutacje H1 i H3 w CDR okazały się poprawiać wiązanie i były uwzględnione w końcowej wersji pY0317. Zmiany w plazmidzie pY0101 względem plazmidu pY0317 są następujące: Thr28Asp, Asn31His, His101Tyr, Ser105Thr. Wszystkie te zmiany są w regionie zmiennym łańcucha ciężkiego. Plazmid pY0317 jest fagowym wektorem prezentującym Fab. Schemat plazmidu przedstawiono na fig. 2A.
pY0317tet20
Plazmid pY0317tet20 skonstruowano do kierowania wytwarzaniem rhuFab V-2 w E. coli. Fig. 2A i 2B przedstawiają schemat konstrukcji plazmidu począwszy od pY0317. Plazmid pY0317tet20 jest zmodyfikowaną wersją dobrze scharakteryzowanego plazmidu pBR322. Fragment Aval-Pvul o długości 639 par zasad usunięto z części pBR322 plazmidu. Delecja ta usuwa gen rop uczestniczący w kontroli liczby kopii (Cesareni i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 6313-6317 (1982)). W konsekwencji plazmid posiada nieznacznie zwiększoną, w porównaniu z pBR322, liczbę kopii. Kasetkę ekspresyjną o długości 1952 par zasad (fig. 1) wstawiono w miejsce EcoRI w celu wytwarzania zrekombinowanego białka. Plazmid pY0317tet20 jest oporny zarówno na tetracyklinę, jak i antybiotyki β-laktamowe. Kasetka ekspresyjna zawiera pojedynczą kopię łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego, połączone tandemowo. Transkrypcja każdego genu do pojedynczego dwucistronowego mRNA jest kierowana przez promotor E. coli phoA (Chang i wsp., Gene, 44: 121-125 (1986)). Sygnały inicjacji
PL 205 897 B1 translacji dla każdego łańcucha są dostarczane przez sekwencje Shine-Dalgarno STII z E. coli (termostabilna enetrotoksyna). Translacja każdego łańcucha zaczyna się od reszty 23 peptydu sygnałowego STII (Picken i wsp., Infection and Immunity, 42: 269-275 (1983)), który kieruje translokacją peptydów przez błonę cytoplazmatyczną do przestrzeni peryplazmatycznej. Peptyd sygnałowy STII jest następnie usuwany przez peptydazę liderową E. coli. Łańcuch lekki i ciężki są następnie zwijane do ich natywnych konformacji po wydzieleniu do peryplazmy i kowalencyjnie łączone przez wewnątrzcząsteczkowe wiązania dwusiarczkowe.
Oporność na tetracyklinę umieszczono na ostatecznym wektorze przez modyfikacje pY0317 (patrz fig. 2A i 2B). Fragment Sapl/Apal plazmidu pY0317 o długości 3642 pary zasad, zawierający miejsce inicjacji replikacji z pBR322, gen β-laktamazy, promotor phoA, cały łańcuch lekki i aminokońcową połowę łańcucha ciężkiego (VH), połączono przez ligację z fragmentem Sapl/Apal p6G4VHN35A.PEG o długości 2738 par zasad. Ten drugi fragment zawiera region CH1 łańcucha ciężkiego i gen oporności na tetracyklinę z pBR322. Fragment ten zawiera również cztery dodatkowe aminokwasy na karboksylowym końcu łańcucha ciężkiego dla miejscowo specyficznej modyfikacji białka. Region zawierający cztery dodatkowe reszty i region CHI usunięto przez trawienie BssHII/Hpal i zastąpiono fragmentem BssHll/Xbal plazmidu pY0317, odtwarzając oryginalną sekwencję łańcucha ciężkiego i usuwając region miejscowo-specyficznej modyfikacji. Najpierw przeprowadzono trawienie Xbal a wystające sekwencje wypełniono fragmentem polimerazy Klenowa i deoksynukleotydami. Po czym przeprowadzono oczyszczenie przez w żelu otrzymanego w wyniku trawienia BssHII fragmentu o długości 433 par zasad. Końcową manipulację plazmidu przeprowadzono zastępując fragment Nhel do Ndel z pBR322 fragmentem Nhel/Ndel z PBR322 zawierającym delecję Aval-PvuII o długości 639 par zasad. Końcowy plazmid pY0317tet20 jest oporny na tetracyklinę i antybiotyki β-laktamowe, i zawiera promotor phoA i geny kodujące łańcuchy lekki i ciężki przeciwciała anty-VEGF.
4. Plazmid do ekspresji Apo2L
Plazmid pAPApo2-P2RU jest opisany w WO 01/00832 opublikowanej 4 styczna 2001. W skrócie, plazmid ten, którego konstrukt jest przedstawiony na fig. 3, koduje koekspresję Apo-2L (reszty aminokwasowe 114-281) i tRNA kodowane przez pro2 i argU, która to koekspresja jest regulowana przez promotor alkalicznej fosfatazy. Plazmidu opartego na pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90 (1978)) pAPApo2-P2RU użyto do produkcji Apo-2L w E. coli. Sekwencje wymagane dla ekspresji na poziomie transkrypcji i translacji Apo-2L są dostarczone przez promotor alkalicznej fosfatazy i Shine-Dalgarno z trp, jak to opisano dla plazmidu phGH (Chang i wsp., Gene, 55: 189-196 (1987)). Sekwencja kodująca dla Apo-2L (od 114-281) jest zlokalizowana poniżej sekwencji promotora i Shine-Dalgarno, i poprzedzona przez inicjacyjną metioninę. Sekwencja kodująca obejmuje nukleotydy (przedstawione na fig. 4) kodujące reszty 114-281 Apo-2L (fig. 4 (SEQ ID NO: 3 i 4, odpowiednio dla sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej)) z tym wyjątkiem, że kodon kodujący resztę Pro119 jest zamieniony na „CCG zamiast „CCT dla wyeliminowania potencjalnej struktury drugorzędowej. Sekwencja kodująca terminator transkrypcji to z lambda (Scholtissek i wsp., Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)) następuje po sekwencji kodującej Apo-2L.
Ponadto, plazmid ten zawiera również sekwencje dla ekspresji tRNA pro2 (Komine i wsp., J. Mol. Biol., 212: 579 598 (1990)) i argU/dnaY (Garcia i wsp., Cell, 45: 453-459 (1986)). Geny te sklonowano przez PCR z E. coli W3110 i umieszczono poniżej sekwencji terminatora transkrypcji to z bakteriofaga lambda. Plazmid ten nadaje gospodarzowi produkcyjnemu zarówno oporność na tetracyklinę jak i ampicylinę.
B. Transformacje komórki
Kompetentne komórki odpowiedniego szczepu przygotowano i transformowano odpowiednim plazmidem stosując typowe procedury i uzyskane transformanty wyselekcjonowano i hodowano. W przypadku plazmidów, które były oporne na tetracyklinę transformanty przeniesiono z szalek LB zawierających 20 μg/ml tetracykliny (LB+Tet20), oczyszczono posiewem redukcyjnym i hodowano na pożywce LB z 20 μg/ml tetracykliny w 30°C w inkubatorze z wytrząsaniem zanim przechowywano je w DMSO w -80°C.
W przypadku plazmidów pxCD18-7T3 i pcyc34 kotransformowano dodatkowy plazmid pMS421 wraz z pxCD18-7T3 lub pcyc34. Plazmid pMS421 jest plazmidem opartym na pSC101 z nadekspresją supresora laclq, który tłumi indukcję promotora tacll aż do momentu dodania IPTG w celu usunięcia jego supresji i który również warunkuje oporność na spektynomycynę i streptomycynę. Plazmid ten dostarcza dodatkowe kopie chromosomowego genu laclq pod kontrolą jego własnego promotora ze szczepu laclq, który to gen jest umieszczony w zgodnym plazmidzie pSC101.
PL 205 897 B1
C. Ekstrakcja przeciwciała
Rozpuszczalną frakcję komórek E. coli przygotowano przez zawieszenie osadu 20 OD-ml w 500 μί 200 mM TRIS-HCl (pH 8,0) z 20 μί 0,1 M EDTA (pH 8,0) i 10 μί lizozymu (6 mg/ml). Mieszaninę tę wytrząsano, poddawano 7-10 pulsom ultradźwięków, następnie wirowano przy 15 tys. obr/min. przez 15 min w 4°C. Frakcja nadsączu po wirowaniu jest nazywana ekstraktem w wysokiej soli (HSE). Pozostały osad stosowano do analizy frakcji nierozpuszczalnej.
D. Identyfikacja białka
Jednokierunkową elektroforezę SDS-PAGE przeprowadzono w 4-12% liniowym gradientowym żelu akryloamidowym z Novex. Dokładniej, użyty system był systemem NOVEX® NuPage™, składającym się z żeli NuPAGE Bis-TRIS Pre-Cast (dla niskocząsteczkowych białek i białek o średniej masie cząsteczkowej).
Dwu-kierunkową elektroforezę w żelu przeprowadzono jak to opisano przez Champion i wsp., Electrophoresis, 20 (4-5): 994-1000 (1990)) z unieruchomionymi gradientami pH (pH 3-10) w pierwszym wymiarze i liniowym gradientem akrylamidu (9-18% T) w drugim wymiarze, dostarczonym z Amersham Pharmacia Biotech. Identyfikacji białka dokonano stosując łączone barwienie srebrem/Coomassie, sekwencjonowanie końca NH2 i analizę spektrometrii masowej. Dla żeli analitycznych lizaty komórek E. coli (-40 μg białka) połączono z roztworem uwadniającym opisanym przez Champion i wsp., powyżej. 18 cm nie-liniowy unieruchomiony gradient pH (IPG) w formie pasków żelu (Amersham Pharmacia Biotech) użyto dla izoelektroogniskowania łącznie przy 50 tys. Vh.
Żele preparatywne przenoszono na błony z difluorku poliwinylidenu (PVDF) (ProBlott, Applied Biosystems) jak opisał wytwórca. Sekwencjonowanie końca NH2 wykonano stosując 20 min. cykl Edmana i poziomy reaktor przepływowy dla wielu próbek dla analizy sekwencji białka unieruchomionego na PVDF (Henzel i wsp., Analytical Biochemistry, 267: 148-160 (1999)). Masę cząsteczkową plamek specyficznych dla łańcucha lekkiego oszacowano przez spektrometrię masową MALDI-TOF i kapilarną LC-MS próbek wyeluowanych z żeli (Champion i wsp., powyżej).
E. Pomiar docelowych rodzajów białka
Oznaczenie na podwójnej kolumnie z odwróconą fazą AME5™ (oznaczenie na podwójnej kolumnie AME5™/RP) stosowano do określenia miana przeciwciała anty-CD18 F(ab')2 LZ jak to opisano poniżej.
F. Oznaczenie na podwójnej kolumnie AME5™/RP 1.
Oprzyrządowanie i wyposażenie
Stację roboczą INTEGRAL™ (z PerSeptive Biosystems) ustawiono w konfiguracji z dwukolumnowym gradientem. Kolumnę powinowactwa zawierającą przeciwciało Fab przeciw łańcuchowi lekkiemu (kappa) (AME5™) unieruchomionemu na szkle o kontrolowanej porowatości (CPG), stosowano do wychwycenia docelowego białka. Dla dalszego rozdziału wychwyconych rodzajów białka stosowano kolumny z odwróconą fazą z kontrolowaną temperaturą 60°C. Aktywowana aldehydem żywica powinowactwa immunologicznego (AL-20), żywice z odwróconą fazą POROS (R220) i urządzenia do pakowania kolumny otrzymano z PerSeptive Biosystems, (Cambridge, MA, USA). Kolumny CPG Empty PEEK, 30x2,1 mm (100 μθ otrzymano z Upchurch Scientific (Oak Harbor, WA, USA). Próbki E. coli przefiltrowano stosując strzykawkę ACRODISC™ PF z filtrami 5-mikronów (z Gelman Sciences).
2. Oczyszczanie przeciwciała AME5™ Fab przeciw ludzkiemu łańcuchowi kappa (His-Gly)4 His-(Lys)
Buforowany fosforanem fizjologiczny roztwór soli pH 7,2 (PBS) zawierający 9,4 mM fosforan sodu, 136,9 mM chlorek sodu i 2,7 mM chlorek potasu jest określany tu jako bufor do nanoszenia. Przeciwciała monoklonalne otrzymano z mysich FAb, AME5™ FAb (His-Gly)4 His-(Lys)3, które oczyszczono z pasty E. coli i nazwano tu AME5™ Fab hgk. Pastę E. coli otrzymano z 10 litrowej fermentacji komórek 27C7. Mikrofluidyzer użyto do homogenizacji komórek po ich zawieszeniu w 20 mM fosforanie sodu, 0,25 M chlorku sodu, 10 mM chlorku magnezu i 2 mM imidazolu o pH 7,0. Ekstrakt E. coli sklarowano przez dodanie 0,2% polietylenoiminy (PEI) i wirowano. Sklarowany ekstrakt oczyszczono stosując kombinację wymiany jonowej i chromatografii na unieruchomionym chelatującym jonie metalu (IMAC). Chelatujące żywice SEPHAROSE FAST FLOW™ i SP SEPHAROSE FAST FLOW™ pochodziły z Amersham Pharmacia.
3. Unieruchomienie AME5™ FAb HGK na aktywowanych CPG opłaszczonych glicerolem
Oczyszczone FAb unieruchomiono na aktywowanym nadjodanem szkle o kontrolowanych porach opłaszczonym glicerolem (CPG) dla otrzymania żywicy powinowactwa. Przeciwciało Fab hgk immobilizowano na opłaszczonych glicerolem CPG z użyciem modyfikacji metody Roy i wsp., J. Chromatography, 303: 225-228 (1984).
PL 205 897 B1
Suche CPG zwilżono oczyszczoną wodą, naniesiono na kolumnę chromatograficzną i aktywowano przez 30 min przez recyrkulowanie 1% metanadjodanu sodu (Sigma S-1878™) przez kolumnę. Następnie aktywowaną żywicę wypłukano do 20 mM fosforanu sodu, 0,15 M chlorku sodu, pH 7,2 (bufor do sprzęgania).
Przeciwciało AME%™ FAb hgk w stężeniu około 5 mg/ml w buforze do sprzęgania zawierającym 1 mg/ml czynnika redukującego cyjanoborowodorku sodu (Sigma S8628) recyrkulowano przez złoże z aktywowaną żywicą. Sprzęganie przeciwciała z żywicą śledzono przez obniżenie absorpcji przy 280 nm. Gdy nie było dalszego obniżenia absorpcji, jakiekolwiek pozostałe przeciwciało wypłukiwano buforem do sprzęgania i odzyskiwano. Gęstość sprzęgania określano przez różnicę pomiędzy wyjściową ilością i ilością odzyskaną po zakończeniu reakcji i jest ona podana w mg FAb na ml żywicy.
Jakiekolwiek pozostające aktywne miejsca na żywicy następnie poddawano reakcji przez recyrkulację 1 M etanoloaminy, pH 8,0 (#katalog. ICN151078) w obecności 1 μg/ml cyjanoborowodorku sodowego przez 2 godziny. Następnie żywice wypłukano buforem do sprzęgania zawierającym 0,01% timerosal (GDL International) do przechowywania. Żywicę płukano trzykrotnie pomiędzy buforem równoważącym i buforem do wymywania przed zastosowaniem i naniesieniem na nią jakiegolwiek białka.
4. Odczynniki i sposób oznaczania
Zbiorniki z roztworem zawierały: Roztwór 1A, bufor do nanoszenia do chromatografii powinowactwa; Roztwór 1B, bufor wodny odwróconej fazy i bufor do wymywania na kolumnie powinowactwa; 0,1% TFA w wodzie; Roztwór 2A, woda. Roztwór 2B, bufor organiczny do wymywania na kolumnie z odwróconą fazą, 0,09% TFA/80% acetonitryl. Wstrzykiwano 50 μl HSE z E. coli (rozcieńczonych 1:2) lub nadsącz z pożywki fermentacyjnej w buforze do nanoszenia. Wszystkie postaci przeciwciał antyCD18 znalezione w fermentacyjnych ekstraktach komórkowych wychwycono przez to przeciwciało AME5™, co określono przez porównanie żeli 2-D bez właściwego rozdziału, z rozdziałem preparatywnym i materiału wychwyconego przez chromatografię powinowactwa (AME5™) z etapu produkcyjnego. Po ograniczeniu niespecyficznej adsorpcji (przez płukanie PBS) kolumnę powinowactwa umieszczono w ciągu z kolumną z odwróconą fazą i wychwycone składniki przeniesiono przez wypłukiwanie rozcieńczonym kwasem. Składniki te następnie rozdzielono przez wymywanie kolumny z odwróconą fazą płaskim gradientem acetonitrylu. Wykrywanie przeprowadzano przez pomiar absorbancji przy 280 nm i niezmienione przeciwciało oznaczano ilościowo przez porównanie powierzchni maksimów absorbancji podobnie potraktowanych standardów.
G. Identyfikacja maksimów na chromatogramie
Oznaczenie to rozdziela fragmenty anty-CDl8 na pięć maksimów związanych z przeciwciałem, które odpowiadają poniższym fragmentom przeciwciała:
Maksimum 1: LC-115 (115-aminokwasowy produkt degradacji łańcucha lekkiego kappa);
Maksimum 2: niezłożony, wolny łańcuch lekki i glutationowany łańcuch lekki;
Maksimum 3: dimer łańcucha lekkiego;
Maksimum 4: fragment typu Fab;
Maksimum 5: fragment Fab'2-LZ lub Fab'2.
Jako standard zastosowano oczyszczony, pełny, uwolniony materiał anty-CD18 F(ab)'2. Ekstrakt E. coli pochodzący z fermentacji przy wysokiej gęstości komórek 49A5/pS1130 zamrożono w -70°C i zastosowano jako kontrolę pozytywną. Naniesiono równe masy komórek dla wszystkich porównywanych próbek.
H. Oznaczenie całkowitych HC/LC z odwróconą fazą POROS™
Dla oceny całkowitej ilości fragmentów łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego wyprodukowanych w fermentacjach, zastosowano alternatywne oznaczenie HPLC z odwróconą fazą (RP-HPLC). Do całkowitej ekspresji przeciwciała 100 μl pełnego bulionu dodano ze 100 μl 0,2 M TRIS 8,0. Po ultradźwiękowym rozbiciu 10 pulsami dodano 650 μl chlorowodorku guanidyny/50 mM TRIS pH 9 i 50 μl 2 M DTT i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przed naniesieniem na kolumnę dodano 200 μl acetonitrylu i przefiltrowano przez kolumnę dzielącą zależnie od wielkości cząsteczek (Pharmacia). 5 μl takiej zawiesiny badano przez oznaczenie z odwróconą fazą POROS™.
Do metodologii odwróconej fazy zastosowano Hewlett Packard™ 1100 HPLC z kolumną z odwróconą fazą Perseptive POROS™ R-l. Analizy prowadzono stosując kolumnę ogrzaną do 60°C i śledząc absorbancję UV przy 278 nm. Kolumnę równoważono 28% roztworem acetonitrylu w wodzie z 0,1% kwasem trójfluorooctowym. 25 μl próbki nanoszono następnie na kolumnę i wymywanie prowadzono liniowym gradientem od 28% do 38% acetonitrylu przez 20 min, a następnie prowadzono 17 minutowy okres regeneracji 95% acetonitrylem i ponowne równoważenie 28% acetonitrylem. Dla porów22
PL 205 897 B1 nania maksima dla rodzajów pokrewnych łańcuchowi lekkiemu i łańcuchowi ciężkiemu zidentyfikowano przez porównanie ze standardami i analizę przy pomocy detektora różnic mas HEWLETT-PACKARD™. Próbki z fermentacji ślepej próby, w której użyty był ten sam gospodarz z wyjątkiem plazmidu, który nie zawierał sekwencji dla łańcucha ciężkiego i lekkiego, przygotowano podobnie zbadano celem określenia odpowiednich poziomów podstawowych dla analiz. Integrację obszarów maksimów przeprowadzono przy pomocy oprogramowania HEWLETT-PACKARD™ 1100 i uwzględniono standardy w ślepych próbkach dla otrzymania krzywej kalibracyjnej dla określenia względnych ilości różnych rodzajów w próbkach.
W przypadku próbek rozpuszczalnych przygotowano lizaty jak dla oznaczenia jonowymiennego. Typowo 100 ul próbki rozcieńczono 650 μl 6M chlorowodorku guanidyny, 50 mM TRIS-HCl, pH 9. Dodano 50 μl 2 M ditiotreitiolu (świeżo rozmrożonego), a następnie 200 μl acetonitrylu, po czym przefiltrowano przez filtr 0,2 um przed naniesieniem na HPLC.
Próbki nierozpuszczalne lizatu analizowano podobnie przez ponowne zawieszenie wypłukanych PBS nierozpuszczalnych osadów otrzymanych po ekstrakcji komórek w 100 ul 0,2 M TRIS 8,0 i dokładne mieszanie. Następnie dodano 650 ul 6 M chlorowodorku guanidyny/50 mM TRIS-HCl pH 9, 50 ul
M DTT i 200 ul acetonitrylu. Następnie próbki przefiltrowano i 10 ul przefiltrowanych próbek badano stosując ten sam sposób jak dla rozpuszczalnych próbek lizatu.
I. Oznaczenie CSX
Trawienie anty-CD18 Fab'2 LZ badano przez kationowymienną chromatografię HPLC. Dokładniej, próbki rozcieńczano przynajmniej 1:1 i 250 ul nanoszono na kolumnę karboksysulfonylową BAKERBONDJ™ (CsX) 50 x 4,6 mm (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) utrzymywaną w 55°C w systemie Hewlett-Packard 1090 HPLC. Próbki eluowano przy pomocy gradientu około 5 do 50 mM fosforanu sodu (pH 7,0) przez 14 minut i maksima monitorowano przez pomiar absorbancji w 278 nm. Maksimum zawierające przeciwciało anty-CD18 Fab'2-suwak leucynowy zidentyfikowano i oceniono ilościowo przez porównanie z oczyszczonymi standardami.
J. Konstrukcje linii komórkowych
Gospodarze użyci w fermentacji rhu Fab'2 LZ (xCD18) są pochodnymi E. coli W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, tom 2 (Waszyngton DC: American Society for Microbiology, 1987, str. 1190-1219) i są oznaczeni jak następuje: 49A5, 58B3, 59A7, 43H1, 58H2, 45F8, 41H1 i 33D3. Fig. 5 przedstawia diagram wyprowadzenia szczepów E. coli 59A7, 49A5 i 43H1.
1. Szczep 49A5
Pełny genotyp 49A5 to ΔfhuA phoA ΔΕ15Δ (argF-lac)169 deoC2 degP41 (.-\pst7-Kan) IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Vaf) .\fucP ΔmalE. Wyjściowy szczep E. coli W3110 jest pochodną E. coli K-12, która jest F' i lambda-minus. Pokazano, że niesie inwersję chromosomu pomiędzy rrnD i rrnE. (Bachmann, wyżej; Hill i Harnish, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7069-7072 (1981)). Gen fhuA (wcześniej oznaczony tonA) został usunięty z W3110 przez niedokładne wycięcie Tn10, po jego wbudowaniu do genu fhuA. Otrzymany szczep 1A2 jest oporny na bakteriofaga T1, T5 i Φ80.
Dwie mutacje delecyjne phoA ΔΕ15 (Sarthy A. i wsp., J. Bacterid., 145: 288-292 (1981)) i Δ (arg-lac) 169 (Schweizer i wsp., Mol. Gen. Genet., 192: 293-294 (1983)) były równocześnie wprowadzone do szczepu 1A2 przez kotransdukcję P1 ze sprzężoną insercją Tn5 w genie proC. Dokładne wycięcie transpozonu odtwarzało gen proC. Mutacja phoA ΔΕ15 wyklucza ekspresję alkalicznej fosfatazy, a mutacja ^(argF-lać) 169 jest odpowiedzialna za fenotyp lac tego szczepu, który jest oznaczony 7C1.
Mutację deoC2, która eliminowała ekspresję aldolazy deoksyrybozo fosforanowej, wprowadzono przez kotransdukcję P1. Lokus deoC jest sprzężony z lokus dla biosyntezy treoniny. Auksotrofię treoninową wytworzono przez insercję Tn10 i niedokładne wycięcie. Następnie auksotrofię treoninową transdukowano do prototrofa treoninowego przy pomocy faga P1 rosnącego na mutancie deoC2. Obecność mutacji deoC2 potwierdzono przez niezdolność otrzymanego szczepu, 16C9, do wzrostu na 0,2% tymidynie jako źródle węgla.
Mutację degP41 ^Pst1-Kanr), mutacja w genie dla peryplazmatycznej proteazy, wprowadzono przez transdukcję. Mutację tę skonstruowano in vitro przez zastąpienie fragmentu genu degp genem oporności na kanamycynę (Strauch i Beckwith, J. Bacteriol., 171: 2689-2696 (1989)). Nie jest to transpozon, lecz pozwala na selekcję delecji przy pomocy oporności na kanamycynę. Otrzymany szczep jest oznaczony 23E3.
Mutację ilvG2096 (Valr) (Lawther i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 922-925 (1981)) wprowadzono przez homogenizację. Mutacja ta naprawia zmianę ramki odczytu powodującą, że dziki szczep E. coli K-12 jest wrażliwy na walinę. Szczep 23E3 transformowano plazmidem pAH29 (LaPL 205 897 B1 wther i wsp., powyżej) zawierającym znacznik ilvG2096 (Valr) i gen oporności na ampicylinę. Szczep oznaczony 33B6, który spontanicznie utracił plazmid, i który wymagał pożądanego allelu zidentyfikowano przez badanie klonów wrażliwych na ampicylinę pod kątem oporności oporności na walinę.
Ostatecznie wprowadzono dwie mutacje w szlaku wykorzystywania węglowodanów, aby umożliwić odróżnianie tego gospodarza od innych rekombinowanych gospodarzy przez prosty test wykorzystywania węglowodanów. Mutacje typu delecji fucP i malE skonstruowano przez PCR i wbudowano niezależnie do wektora plazmidowego kodującego beta-laktamazę i sacharazę lewanu (Bass i wsp., powyżej). Każdy cały plazmid rekombinowano do chromosomu pochodnej W3110, która nie mogła podtrzymać niezależnej replikacji wektora plazmidowego (Bass i wsp., powyżej). Szczep 33B6 następnie transdukowano do oporności na karbenicylinę przy pomocy faga P1 rosnącego na pochodnej W3110 niosącego plazmid z delecją fucP wbudowany do jej chromosomu. Pochodne nie wyrażają już sacharazy lewanu i co za tym idzie wyselekcjonowano szczepy oporne na sacharozę i sprawdzono pod kątem utraty oporności na karbenicylinę i niezdolność do wykorzystania fukozy. Przy pomocy PCR stwierdzono, że uzyskany szczep, 49B2, niesie zaplanowaną delecję fucP.
Etapy te powtórzono dla wbudowania delecji malE. Szczep 49B2 transdukowano do opornego na karbenicylinę przy pomocy faga P1 hodowanego na szczepie niosącym plazmid z delecją malE wbudowany do jego chromosomu. Następnie wyselekcjonowano pochodne szczepy oporne na sacharozę i zbadano je pod kątem utraty oporności na karbenicylinę i niezdolności do wykorzystania maltozy, a obecność delecji malE potwierdzono przez PCR.
Ważne właściwości szczepu 49A5 obejmują poniższe:
- jest oporny na faga T1;
- nie nadprodukuje alkalicznej fosfatazy przy niedoborze fosforanów (tj. w warunkach stosowanych do indukcji syntezy produktu);
- utracił proteazę;
- nie jest wrażliwy na toksyczność waliny;
może być odróżniony od innych gospodarzy testem wykorzystania węglowodanów.
2. Szczep 58B3
Szczep 58B3 wyprowadzano również ze szczepu 33B6. Genotyp \prc::pS1080 (Bass i wsp., powyżej; Metcalf i wsp., Gene, 138: 1-720 (1994)) wprowadzono do kans pochodnej szczepu 33B6 (56G4) przez transdukcję P1 selekcjonując kolonie nie rosnące dobrze na dwukrotnie rozcieńczonej pożywce LB z niską solą w 42°C. Szczep kans niosący delecję dagP pochodził z pKS16 (Strauch i Beckwith, 1989, powyżej) co daje fenotyp wrażliwości na kanamycynę. Co za tym idzie szczep 58B3 jest szczepem kans niosącym obie delecje degP i prc.
Pełny genotyp szczepu 58B3 to W3110AfhuA phoAAE15 \argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)1 KansilvG2096 (Vai)\prc.
3. Szczep 59A7
Szczep ten skonstruowano wprowadzając supresor Prc (mutant Spr) do szczepu 58B3. Lizatem faga P1 ze szczepu 51B9 (tonA prc prc sub zeg722::Tn10) transdukowano szczep 58B3 selekcjonując kolonie oporne na tetracyklinę i wyszukując te, o fenotypie supresora Prc (rosnące dobrze na dwukrotnie rozcieńczonej pożywce LB z niską solą w 42°C). Nowy szczep jest nazwany 58F1. Mutant .\prc nie może przeżyć w 42°C. Gen oporności na tetracyklinę usunięto z 58F1 przez wysianie na szalki Malloy co dało szczep wrażliwy -tets oznaczony 59A7. Pełny genotyp szczepu 59A7 to W3110 \fhuA ohoA\E15 \(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)l Kans ilvG2096 (Valr)\prc sprW148R.
Oryginalny szczep 51B9 posiada prc supresor Spr, niosący punktową mutację W148R, taką samą jak Spr w szczepach 43H1 i 59A7.
4. Szczep 43H1
Pełny genotyp szczepu 43H1 jest bardzo podobny do 49A5: W3110 \fhuA phoA\E15 \(argF-lac) 169 degP41 (\pst1-Kanr) IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Valr) ptr3 \ompT prc::kanr sprW148R. niesie on trzy dodatkowe znaczniki proteazowe w porównaniu z 49A3, Ptr3 OmpT i Prc. Szczep ten posiada punktową mutację (W148R) w Spr. Jest on Kanr.
5. Szczep 58H2
Szczep 43H1 transdukowano do tetr fagiem P1 wyhodowanym na szczepie 42E3. Szczep ten (58F9) ma naprawioną mutację prc::kanr; co za tym idzie staje się kans. Szczep ten następnie wysiano na pożywkę minimalną z kwasem glukuronowym dla usunięcia eda::Tn10. Nowy stworzony szczep, 58H2, jest kans i staje się potrójnym mutantem proteazowym o dzikim typie prc. Pełny genotyp szcze24
PL 205 897 B1 pu 58H2 to W3110 \fhuA phoA\E15 \(argF-lac) 169 degP41 \pst1-Kan) IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Valr) ptr3 ΔompT sprW148R.
6. Szczep 45F8
Pełny genotyp szczepu 45F8 to W3110 \fhuA \(argF-lać)169 degP41 Kans \ompT ptr3 ilvG2096 (Valr) phoS* (T104). Jest to szczep phoS z potrójnymi znacznikami proteazowymi.
7. Szczep 41H1
Pełny genotyp szczepu 41H1 to W3110 \fhuA phoS (T104) \(argF-lac)169 degP41 (\pstlKanr) ptr3 ilvG2096 (Valr) T-zaadaptowany w 37°C. Jest to szczep phoS z podwójnymi znacznikami proteazowymi.
8. Szczep 33D3
Kompletny genom szczepu 33D3 to W3110 \fhuA ptr3 laclq lacL8 \ompT degP41 (\pstl-kanR). Opis konstrukcji można znaleźć np. w patencie US nr 5,789,199.
K. Hodowle w wytrząsanych kolbach i hodowle fermentacyjne
Do doświadczenia z wytrząsanymi kolbami zastosowano pożywki Luria-Bertani (LB) i pożywki minimalnej C.R.A.P. z pięcioma μg/ml AMPICILLINE™. Minimalną pożywkę C.R.A.P. Przygotowano jak następuje: 3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g cytrynianu sodu-2H2O, 1,07 g KCl, 5,3 6 g ekstraktu drożdżowego i 5,36 g HYCASE SF-SHEFFIELD zmieszano, pH ustalono KOH na 7,3 i objętość doprowadzono do 872 ml dejonizowaną wodą. Mieszaninę następnie autoklawowano i schłodzono do 55°C. Dodano 110 ml 1 M buforu MOPS o pH 7,3, 11 ml 50% glukozy i 1 M MgSO4.
Zastosowany tutaj proces fermentacji E. coli był procesem przy wysokiej gęstości komórek jak określono powyżej. Dla osiągnięcia wyższych gęstości komórek w sposób ciągły dodawano amoniak i dodatkowe drugorzędowe składniki odżywcze (P, K, S i Mg) dodawano na określonym stadium fermentacji dla podtrzymania wzrostu komórek. Obniżanie ilości składników odżywczych skutkowało innym procesem przy niższej końcowej gęstości optycznej pożywki przy równoważnej jakości produktu, który jest określony tu jako proces przy niskiej gęstości komórek.
Pojedynczą fiolkę zawierającą 1,5 ml hodowli w 10-15% DMSO rozmrażano w 1 l wytrząsanej kolbie zawierającej 500 ml pożywki LB uzupełnionej 0,5 ml roztworu tetracykliny (5 mg/ml) i 2,5 ml 1 M roztworu fosforanu sodu. Tę zaszczepkę hodowli hodowano przez około 16 godzin w 30°C i następnie stosowano do zaszczepienia 10 litrowego fermentora.
Fermentor początkowo zakładano z około 6,5 L pożywki zawierającej około 4,4 g glukozy, 100 ml 1 M siarczanu magnezu, 10 ml roztworu elementów śladowych (100 ml kwasu solnego, 27 g sześciowodnego chlorku żelaza, 8 g siedniowodnego siarczanu cynku, 7 g sześciowodnego chlorku kobaltu, 7 g dwuwodnego molibdenianu sodu, 8 g pięciowodnego siarczanu miedzi, 2 g kwasu bornego i 5 g jednowodnego siarczanu manganowego w końcowej objętości 1 litra), 20 ml roztworu tetracykliny (5 mg/ml w etanolu), 10 ml FERMAX ADJUWANT 2 7™ (lub dowolny równoważny środek przeciw pienieniu), jedna torebka soli HCD (37,5 g siarczanu amonu, 19,5 g dwuzasadowego fosforanu potasu, 9,75 g dwuwodnego jednozasadowego fosforanu sodu, 7,5 g dwuwodnego cytrynianu sodu i 11,3 g jednozasadowego fosforanu potasu), 200 g NZ AmineA (hydrolizat białka). Fermentację prowadzono w 30°C z 10 slpm przepływu powietrza i kontrolując pH 7,0 ± 0,2 (choć czasami występowały wahania przekraczające ten zakres). Ciśnienie zwrotne fermentora i stopień wytrząsania był zróżnicowany, aby manipulować napowietrzaniem w fermentorze i w konsekwencji kontrolować poziom oddychania komórkowego.
Po inokulacji fermentora pożywką zawierającą komórki z wytrząsanej kolby, hodowlę prowadzono w fermentorze do wysokiego stężenia komórek stosując komputerowy algorytm dokarmiania komórek w fermentorze stężonym roztworem glukozy. Wodorotlenek amonu (58% roztwór) i kwas siarkowy (24% roztwór) również dodawano do fermentora w przypadku potrzeby kontrolowania pH. W pewnych przypadkach do kontrolowania pienienia stosowano również dodatek odpieniaczy. Gdy hodowla osiągnęła gęstość komórek około 40 OD550 do fermentora dodawano dodatkowe 100 ml 1 M siarczanu nagnezu. Ponadto, do fermentora dodawano zasilanie stężonymi solami (zawierających około 10 g siarczanu amonu, 26 g fosforanu potasu, 13 g dwuzasadowego jednozasadowego dwuwodnego fosforanu sodu, 2 g dwuwodnego cytrynianu sodu i 15 g jednozasadowego fosforanu potasu w 1 L wody) na poziomie 2,5 ml/min gdy hodowla osiągnęła około 20 OD 550 i kontynuowano do momentu dodania do fermentacji około 1250 ml. Fermentacje typowo prowadzono przez 72-80 godzin.
Podczas fermentacji, gdy osiągnięty został założony poziom rozpuszczonego tlenu dla fermentacji, dodawano roztwór stężonej glukozy na podstawie sygnału sondy rozpuszczonego tlenu w celu kontroli założonego poziomu stężenia rozpuszczonego tlenu. Konsekwentnie, w tym schemacie konPL 205 897 B1 troli manipulowania parametrami pracy fermentora, takimi jak szybkość mieszania lub ciśnienie zwrotne, które wpływają na zdolność rozpuszczania tlenu oodczas fermentacji, odpowiednio manipulowano poziomem oobieranego tlenu lub poziomem metabolizmu komórek.
Spektrometr masowy stosowano do monitorowania składu gazów wyprowadzanych z fermentora, co umożliwiało obliczenie pobierania tlenu i poziomów uwalniania dwutlenku węgla podczas fermentacji.
Gdy hodowla osiągnęła gęstość komórek około 220 OD550 zmniejszano mieszanie z wyjściowego poziomu 1000 obr/min do około 725 obr/min przez około 12 godz.
Dla fermentacji komórek stransformowanych pMS421 i pcyc34 (gdzie użyto promotora tacll do kontroli ekspresji zarówno ciężkiego jak i lekkiego łańcucha) lub komórek stransformowanych pMS421 i dwupromotorowym plazmidem pxCD18-7T3 (gdzie stosowano promotor tacll do kontroli ekspresji łańcucha ciężkiego), 50 ml 200 mM IPTG dodano około 12 godz. po tym jak hodowla osiągnęła gęstość komórek 220 OD550 w celu indukcji syntezy łańcucha ciężkiego i lekkiego w przypadku pcyc34 i syntezy ciężkiego łańcucha w przypadku pxCD18-7T3.
Wyniki
A. Stwierdzone i zidentyfikowane produkty cięcia łańcucha lekkiego kappa
Rozpuszczalne ekstrakty E. coli (patrz HSE w Materiałach i metodach) i pozostałe osady zawieszone w buforze SDS do próbek (powszechnie dostępny komercyjny produkt dla rozdziału w żelu SDS) analizowano przez SDS-PAGE. Próbki pochodziły z osadów 20 OD-ml zebranych w czasie fermentacji E. coli przy wysokiej gęstości komórek (HCD) szczepu 49A5 niosącego plazmid pS1130 dla produkcji rhu F(ab)'2LZ (xCD18). We frakcji rozpuszczalnej zidentyfikowano fragment o długości 115 aminokwasów będący produktem cięcia LC kappa. W nierozpuszczalnej frakcji zidentyfikowano fragment o długości 182 aminokwasów będący produktem cięcia LC kappa. Wszystkie fragmenty przeniesiono na błonę PVDF i zsekwencjonowano. Oba miały prawidłowy N-koniec tak jak postaci LC kappa po obróbce. Masy określono przez analizę spektrometrii masowej odpowiednio na 12488,5 i 19857,2 Da. Miejsca proteolitycznego cięcia znajdowały się pomiędzy resztami Val 115 i Phe 116 dla LC-115 i pomiędzy resztami Ser 182 i Lys 183 dla LC-182. Tylko jedno miejsce wyglądało jak typowe miejsce cięcia Prc.
Kolejny osad E. coli 20 OD-ml na koniec fermentacji nadano przez dwukierunkową elektroferezę w żelu. Lizat comórek E. coli z osadu (~40 μg białka) połączono z roztworem uwadniającym jak opisali Champion i wsp., powyżej. Na żelu 2-D wzorca komórek uzyskanych z fermentacji 19A5/pS1130, plamki specyficzne dla łańcucha lekkiego kappa zidentyfikowano przez porównanie żelu preparatywnego ze ślepą próbą będącą żelem 2-D otrzymanym dla osadów komórek (49A5/pBR322) z fermentacji w podobnym punkcie czasowym. Osady wybrano dla tych samych punktów czasowych dla dwóch fermentacji, zakładając, że komórki powinny być w takim samym stanie metabolicznym. Wszystkie plamki dla LC kappa zidentyfikowano przez blot immunologiczny stosując skoniugowane z alkaliczną fosfatazą przeciwciało przeciw ludzkiemu LC kappa.
Oprócz dwóch głównych skróconych postaci zidentyfikowanych przez analizę w żelu 1-D, żel 2-D ujawnił niezmieniony LC i izoformę niezmienionego LC i przynajmniej pięć poślednich skróconych postaci LC (patrz fig. 6). Odpowiednie plamki wymyto i zsekwencjonowano. Wszystkie peptydy LC-specyficzne posiadały prawidłowy N-koniec dowodząc, że wszystkie podlegały prawidłowej obróbce przez odcięcie sekwencji sygnałowej STII. Wszystkie te peptydy analizowano przy użyciu spektrometra masowego, aby mierzyć przybliżoną masę. Ze względu na śladowe ilości poślednich skróconych postaci poprawna masa nie mogła być uzyskana w celu określenia miejsc skracania tych fragmentów.
Trzy pośrednie skrócone fragmenty grupowały się z pasmem LC kappa 115 przy wartości pl około 9. Czwarte miało wartość pI około 6,5, a piąte miało tę samą wartość pI co skrócona postać LC-182, wynoszącą około 6. Dla określenia rozpuszczalności tych fragmentów LC, HSE identycznego osadu naniesiono na żel 2-D. Fragment LC-182 występował jedynie we frakcji nierozpuszczalnej.
B. Prc jest jedyną proteazą odpowiedzialną za cięcie łańcucha lekkiego kappa
Porównano żele 1-D SDS-PAGE, na które naniesiono nierozpuszczalną frakcję komórek pochodzących z czterech różnych fermentacji mutantów protezowych E. coli, 49A5, 45F8, 41H1 i 43H1, wyrażających cząsteczkę anty-CD18 Fab'2 LZ. Proteolityczne cięcie LC-182 występowało w trzech z czterech próbek (nie w szczepie 43H1 z delecją prc), wskazując, że proteaza Prc może uczestniczyć w cięciu LC cappa. Maksimum 1, odpowiadające skróconej postaci LC-115, występujące w próbkach pochodzących ze szczepu 49A5 (prc-clus), zanikało również w przypadku próbek pochodzących
PL 205 897 B1 z 13H1, przy porównaniu chromatogramów rozdzielonych w dwukolumnowym oznaczeniu AME5™/RP. Oznaczenie to pozwalało wybiórczo adsorbować rodzaje przeciwciał zawierających LC cappa i następnie rozdzielać je na pięć maksimów jak to opisano powyżej w Materiałach i Metodach.
Gdy analizowano żel 2-D z osadów komórek pochodzących z 43H1 stwierdzono, że nie tylko fragmenty LC-115 i LC-182 zanikały z żelu, lecz również zanikały wszystkie inne poślednie typy pokrewne LC (patrz fig. 7). Wynik ten silnie sugeruje, że Prc jest jedynym enzymem odpowiedzialnym za cięcie LC kappa. Ten osad komórek 43H1 pochodził z fermentacji przy niskiej gęstości komórek.
C. Konstrukcja szczepu dla potwierdzenia, że Prc jest jedynym enzymem uczestniczącym w cięciu łańcucha lekkiego kappa
1. Szczep z delecją prc staje się prc-plus
Dowód, że Prc jest jedynym enzymem uczestniczącym w cięciu LC kappa uzyskano naprawiając szczep 43H1 (gospodarz prc-minus z poczwórnymi znacznikami proteazowymi) aby otrzymać trójproteazowy szczep prc-plus (58H2). Szczep 42E3 niesie eda-51::Tn10, który kotransdukuje się z prc. Szczep 43H1 kontransdukowano do tetr fagiem P1 rosnącym na 42E3. Otrzymany szczep (58F9) naprawiono pod względem mutacji prc: :kanR; co za tym idzie stał się on kans. Szczep ten następnie wysiano na pożywkę minimalną z kwasem glukoronowym celem usunięcia eda::Tn10. Nowo wytworzony szczep, 58H2, stał się potrójnym mutantem proteazowym z prc typu dzikiego. Izolat ten jest albo trasduktantem albo spontanicznym izolatem Eda+. Genotyp prc-plus potwierdzono przez PCR. Szczep ten 58H2 nadal niósł supresor prc (sprW148R) pochodzący z 43H1 i był kans. Ponowne pojawienie się skróconych postaci LC w szczepie 58H2 wykryto przez dwukolumnowe oznaczenie z\ME5™/RP (patrz fig. 8).
2. Gen prc usunięto z natywnego szczepu otrzymując prc-minus
Jak opisano powyżej szczep 49A5 był szczepem prc typu dzikiego. Gdy do szczepu tego wprowadzono delecję prc dla konstrukcji szczepu 58B3 i ekstrakty komórkowe oznaczono dwukolumnową metodą AME5™/RP skrócona postać LC-115 (maksimum 1) zanikła. Szczep 58B3 wyprowadzono ze szczepu 33B6 niosącego jedynie znacznik proteazowy DegP. Mutację \prc::pS1080 (Bass i wsp., powyżej; Metcalf i wsp., powyżej) wprowadzono do kans pochodnej 33B6 (56G4) przez transdukcję P1 dla wytworzenia dwuproteazowego szczepu 59A7 degP \prc.
Podsumowanie wyników cięcia dla wszystkich siedmiu szczepów przedstawiono w tabeli 1.
T a b e l a 1
E. coli - szczepy gospodarzy wyrażające anty-CD18 F(ab)'2 suwak leucynowy
Gospodarz E. coli Znacznik proteazowy Degradacja LC
49A5 DegP +
45F8 DegP Ptr3 +
41H1 DegP Ptr3 OmpT +
43H1 DegP Ptr3 OmpT \Prc SprW148R -
58H2 DegP Ptr3 OmpT SprW148R +
58B3 DegP \Prc -
59A7 DegP \Prc SprW148R -
D. Zwiększenie wydajności rhuFab'2 LZ (xCD18) w gospodarzach prc-minus
1. Wyniki hodowli w kolbach z wytrząsaniem
Trzy szczepy (49A5, 43H1 i 58H2) wyrażające rhuFab'2 LZ (xCD18) hodowano najpierw przez noc w 30°C, w pożywce LB+ amp. Następnie wszystkimi hodowlami w równym stopniu inokulowano kolby do wytrząsania zawierające 25 ml ninimalnej pożywki C.R.A.P.+amp. i kontynuowano wytrząsanie przez noc w 30°C. Osady dwadzieścia OD-ml zebrano dla otrzymania rozpuszczalnych lizatów (HSE). Dwadzieścia pięć μl z 530 μl naniesiono na kolumny AME5™/z odwróconą fazą.
Fig. 8 stanowi diagram przedstawiający pięć maksimów rozdzielonych w tym oznaczeniu. Oś Y przedstawia specyficzną powierzchnie maksimum dla maksimów 1 do 5 (patrz Materiały i Metody). Oś X przedstawia szczepy produkujące rhuFab'2 LZ (xCD18). Oba szczepy prc+, 49A5 i 58H2, wytwarzały niemal równe ilości produktu, i oba wykazywały niemal równe ilości fragmentu LC-115 (maksimum 1), w porównaniu z prawie żadnym produktem w maksimum 1 i nieco więcej w maksimum 5 w szczepie \prc(43H1). Wykres ten przedstawiał partycję fragmentów przeciwciał. Większe ilości rozPL 205 897 B1 puszczalnego, wolnego LC i dimeru LC zaobserwowano w gospodarzu 43H1 niż w gospodarzach 49A5 i 58H2. W wytrząsanych kolbach gospodarz prc- wytwarzał niemal pięciokrotnie więcej rhuFab'2 LZ (xCD18) niż natywne szczepy prc.
2. Wyniki fermentacji
Średnie miano rhuFab'2 LZ (xCD18) otrzymane przez standardową fermentację przy wysokiej gęstości komórek (HCD) wynosiło 893 mg/l w gospodarzu będącym szczepem dzikiego typu prc (49A5, n=6), na podstawie dwukolumnowego oznaczenia VME5™/RP. Prawie dwukrotne zwiększenie miana zaobserwowano w przypadku fermentacji 43H1/pS1130. Dramatyczna różnica pomiędzy mianem dla wytrząsania w kolbie (5x) i fermentacji (<2x) odpowiednio dla gospodarzy 43H1 i 49A2, bez wiązania się z żadną teorią, przypuszczalnie wynikała z różnicy w wydajności sekrecji produktów. Gdy analizowano lizaty z osadów z wytrząsanej kolby, jedynie 50% fragmentów przeciwciała podlegało poprawnej obróbce w szczepie prc+, podczas gdy lizat pochodzący z wytrząsanych kolb komórek 13H1 lub wszystkich komórek pochodzących z fermentacji (prc-pIus i minus) wykazywał 100% obróbki. Stwierdzono, że obróbka białka Prc zależy od secY i secA (Hara i wsp., 1991, powyżej). Nie ograniczając się do żadnej teorii uważa się, że wynik hodowli w kolbie z wytrząsaniem pokazuje, że białko Prc współzawodniczy z fragmentami przeciwciała o translokację.
3. Zmierzono całkowitą ekspresję fragmentów przeciwciała
Oznaczenie kolumnowe POROS™ próbek pełnej pożywki z fermentacji przeprowadzono jak to opisano w rozdziale Materiały i Metody dla oceny wydajności składania i zwijania przeciwciała. Gdy porównano równe porcje próbek pełnej pożywki pochodzących z trzech fermentacji anty-CD18 HCD u różnych gospodarzy stwierdzono, że w przypadku fermentacji 13H1 wyrażana jest podobna ilość HC jak w fermentacji 49A5, Lecz większa ilość niezmienionego LC kappa (patrz tabela 2). Miano rhuFab'2 LZ (xCD18) wynosiło 1830 mg/L dla 43H1 w porównaniu z 887,8 mg/l dla 49A5. Fermentacja 59A7 nie tylko wytwarzała dodatkowe fragmenty przeciwciała, dawała również najwyższe miano rhuFab'2 LZ (xCD18) wynoszące 2403 mg/l.
T a b e l a 2
Całkowita ekspresja fragmentów przeciwciała i miana Fab'2-LZ z różnych szczepów wyrażających rhuFab'2 LZ (xCD18) w typowych procesach fermentacji HCD
Próbki ermentacji Gospodarz Całkowite LC (g/l) Całkowite HC (g/l) Całkowite HC+LC (g/D Fab'2-LZ (mg/l) Czas (hr)
1 49A5 2,23 2,27 4,5 40
2 49A5 4,75 3,96 8,71 887,8 72
3 43H1 6,57 4 10,57 62
4 43H1 7,38 4,18 11,56 1830 72
5 59A7 12,49 6,87 19,36 68
6 59A7 13,76 7,46 21,22 2403 72
E. Supresor Prc jest wymagany dla przeżycia w fazie stacjonarnej
Stwierdzono, że szczep 58B3 niosący delecje degP i prc wykazywał lizę podczas przedłużonej fazy wzrostu stacjonarnego przy fermentacji HCD wyrażając cząsteczki anty-CD18 Fab'2 LZ. Liza komórek rozpoczynała się po 50 godzinach po inokulacji. Wytwarzał on jedynie 320 mg/l rhuFab'2 LZ (xCD18), podczas gdy fermentacja 59A7/pS1130 dawała dobry wzrost w fazie stacjonarnej aż do 72 godzin fermentacji HCD osiągając wysoką gęstość komórek (około 300 OD550-ml). Fig. 9 przedstawia porównanie wzrostu tych dwóch fermentacji. W szczepie tym stwierdzono również niezwykle wysoką ekspresję zarówno fragmentów HC, jak i LC, co zwiększało wydajność wytwarzania cząsteczki rhuFab'2 LZ (xCD18) do 2403 mg/l. Ponownie nie stwierdzono skróconych postaci LC kappa w próbkach pochodzących z obu szczepów 58B3 i 59A7 z delecją prc-.
Supresor prc (spr) (kodujący Prcsup) był wyjściowo wyizolowany ze szczepu 40A6 (prc::kan spr) jako spontaniczna mutacja, tj. termooporny rewertant delecji prc. Po ustaleniu sekwencji nukleotydowej genu i mapy koniugacyjnej stwierdzono, że lokalizuje się on w około 48 min chromosomu E. coli.
PL 205 897 B1
Sekwencja nukleotydowa produktu PCR odpowiada tej, dla genu spr E. coli podanej ρ^θζ Hara i wsp., 1996, powyżej, z wyjątkieτ jednej punktowej τutacji w aτinokwasie 148, gdzie kodon Τϋϋ został zastągtony CGG, cg skutkowało z™aną tryptofanu na argininę (W148R). Ten supresor prc ρο wprowadzeniu do szczepu 59Α7 posiadał mutację W148R. O genie spr typu dzikiego donoszono, że koduje lipoproteinę występującą we frakcji otoczki, odnośnie której podejrzewa się, że jest enzyτeτ hydrolizującyτ peptydoglikan (Hara i wsp., 1996, powyżej).
Supresor Prc wprowadzono do szczepu 59Α7 przez związany z tyτ supresoreτ Tn10 i kotransduktanty selekcjonowano dzięki ternu, że były one zarówno oporne na tetracyklinę i zdolne do wzrostu na szalce z dwukrotnie rozcieńczoną pożywką LB o niskiej zawartości soli w 42°C. Nowa mutacja punktowa zaszła w τoτencie gdy Tn10 został usunięty na płytkach Malloy.
Opierając się na wynikach fementacji anty-CD18Fab'2 szczepu 58B3 w porównaniu ze szczeρθτ 59Α7 wykazano, że supresor Prc jest wyτagany do prawidłowego wzrostu mtanta APrc, zwłaszcza podczas fementacji E. coli ρ^γ wysokiej gęstości ko^rek. Szczep oznaczony jako 58B3, posiada dokładnie ten saτ genotyp co 59Α7, z wyjątkieτ spr (W148R) i nie τοζθ zachować żywotności ρο 50 godz. tygowej fementacji HCD.
F. Mutant z delecją prc τοζθ zwiększyć pozioτ wytwarzania różnych ρ^βΟΜΟΐβΙ w zależności od lokalizacji ™ejsc skracania Prc
Fig. 10 przedstawia huτanizowaną sekwencję LC kappa (SEQ ID NO:5). Obliczone wartości ρΙ potencjalnych skróconych postaci Prc przedstawiono w tabeli 3.
Τ a b e l a 3
Obliczone wartości ρΙ potenojalnyoh skróconych Prc
Obliczona wartość PI Miejsce cięcia Τγρ proteazy Skrócone LC
5,97 S/K Serynowo speoyfiozna LC-182
9,14 V/F Prc LC-115
9,14 S/V Serynowo speoyfiozna LC-114
9,14 ν/Α Prc LC-110
Nie ograniczając się żadną teorią, w oparciu o fig. 10 tabelę 3, przypuszcza się, że proteaza Prc rozpoczyna skracać LC kappa od jego C-końca, 9 lub 18 aτinokwasów w sekwencji LC i następnie stopniowo w kierunku N-końca otwierając rnejsce S/K dla działania proteazy serynowej. Być rnoże inne rodzaje LC kappa (przypuszczalnie o innej strukturze przestrzennej) były cięte aż do 115 aτinokwasów. Wele potencjalnych produktów cięcia posiada τasy cząsteczkowe i obliczone wartości ρΙ pasujące całkieτ dobrze do plaτek LC kappa wykrytych na żelu 2-D.
Fig. 11 przedstawia, że szczep z delecją prc (43H1) eli^n^e skrócony LC-182 w ko^rkach wyrażających cząsteczki anty-VEGF Fab, anty-CD18 Fab'2 LZ, anty-CD18 Fab'2-LZ-6xHis i cząsteczki ρ^θ^ czynnikowi tkankowemu Fab'2-LZ-6xHis. Próbki fementacji pochodzące z cab2826 (33B6/D3H44-F(ab')2) i cab2847 (43H1/D3H44-F(ab')2) poddawano fementacji ρ^γ wysokiej gęstości w celu ekspresji cząsteczki ρ^θ^^ czynnikowi tkankowemu Fab'2 LZ-6xhis. Proces fementacji był takrn saτyτ typowyτ proceseτ HCD jaki opisano powyżej dla fementacji anty-CD18 Fab'2 LZ. Cab2793 była fementacją 49Α5/ρΑΒ3 zaperzoną dla ekspresji cząsteczki anty-CD18 Fab'2 LZ-6xhis. Fementacja Cab2846 była fementacją 41 Hl^S1130 zaperzoną dla ekspresji cząsteczki anty-CD18 Fab'2 LZ. Fementacje JJ81 (43Η/ρΥ0317) i JJ67 (43Ε7/ρΥ0317) mały na celu wytwarzanie anty-VEGF Fab. Fementacja Cab 2814 była (49A5/pBR322) ś^ą fementacją, która zawierała podobny szkielet plazτidowy bez genów wyrażających ρ^θ^^ο.
Osady z fementacji 20-OD wyekstrahowano TRIS/EDTA/lizozyτ w celu usunięcia rozpuszczalnych HSE.
Pozostałe osady zawieszono w 400 μl 1xSDS bufor do próbek ρ^ 20 μL beta-τerkaptoetanolu i następnie ogrzewano w 95°C przez 5 mnut w bloku tem^zny™ Następnie 5 μl nanoszono na żel 4-12% NUPAGE™. Szczepy 33B6, 41H1, 49Α5 i 43E7 są szczepaτi prc-plus. Szczep 43H1 był szczepeτ prc-τinus. Wszystkie natywne próbki pochodne szczepu prc zawierały zdegradowany ρωdukt LC 19,8 kD. Próbka z fementacji cab2829 (33Β6^3Η44ΤΒ), która wyrażała anty^F Fab rnoże również wykryć Α^τθΠ o tej saτej wielkości powstały w wyniku degradacji LC. Wszystkie te fragτθ^γ były sekwencja™ aτinokwasowyτi o prawidłowych N-końcach sekwencji LC.
PL 205 897 B1
G. Szczep 59A7 ujawnia doskonałą ekspresję w wytrząsanych kolbach anty-CD18 His, wyznakowanych LysFab'2 LZ i cytoplazmatycznego białka Apo2L
Dodatkowe, przedstawione w tabeli 4, dane dla hodowli w wytrząsanej kolbie dowodzą, że szczep 59A7 wyrażał pAB3 (anty-CD18 wyznakowane HisFab'2 LZ) lepiej niż szczep 43H1 i 49A5. Szczep 59A7 wyraża pAB21 (wyznakowany Lys Fab'2 LZ) 2,4 razy lepiej niż szczep 33B6. Szczepy 59A7 i 43H1 wyrażają pS1130 (Fab'2 LZ bez znacznika) 2,9 razy lepiej niż szczep 49A5. Jednakże, wyniki fermentacji zawsze pokazywały, że szczep 59A7 z pS1130 jest lepszy niż szczep 43H1 pod względem ekspresji pS1130.
Dla nie będącego przeciwciałem cytoplazmatycznego białka Apo2L, specyficzna aktywność jest około 20-30% wyższa gdy ekspresja zachodzi w szczepie 59A7 niż w szczepie 43E7 (w wytrząsanych kolbach). Ponieważ szczep 43E7 dorastał do wyższego OD550, całkowita ekspresja jest podobna. Szczep 43E7 to szczep ompT ptr3 degP bez prc i spr.
T a b e l a 4
Wyższe specyficzne miana różnych białek wyrażone w 59A7 i innych szczepach w hodowlach w wytrząsanych kolbach
Szczep Znacznik (znaczniki) proteazowe pS1130 pAB3 PAB21 Apo2L
mg/l/OD-ml mg/l/OD-ml mg/l/OD-ml mg/l/OD-ml
33B6 DegP N.A. N.A. 0,33 N.A.
49A5 DegP 0,38 0,46 N.A. N.A.
43H1 DegP Ptr3 OmpT Prc SprW148R 1,1 0,3 N.A. N.A.
59A7 DegP SprW148R 1,1 0,7 0,8 14,4 15,2
43E7 DegP Ptr3 OmpT N.A. N.A. N.A. 12,2 11,4
H. Szczep 59A7 wykazywał doskonałą ekspresję fermentacji anty-CD18 Fab'2 LZ.
Tabela 5 wykazuje, że szczep 59A7 był lepszy niż 33D3 w ekspresji anty-CD18 Fab'2 LZ z plazmidu o podwójnym promotorze pxCD18-7T3 i lepszy niż 49A5 w ekspresji anty-CD18 Fab'2 LZ z plazmidu pcyc34.
T a b e l a 5
Wyższe specyficzne miana anty-CD18 Fab'2 LZ wyrażone w 59A7 w porównaniu z 33D3 i 49A5 przy fermentacji i użyciem dwóch różnych plazmidów
Szczep Plazmidy Miano anty-CD18Fab'2LZ oznaczone przez CSX (mg/l) (wartość średnia)
33D3 pxCD18-7T3/pMS421 2500
59A7 pxCD18-7T3/pMS421 4000
49A5 pcyc34/pMS421 341,3
59A7 pcyc34/pMS421 2067,1
Dyskusja
W pracy tej badano degradację LC kappa w komórkach E. coli wyrażających cząsteczkę antyCD18 Fab'2-LZ. Wcześniejsze badania pokazały wiele potencjalnych substratów Prc, lecz na tyle, na ile można być tylko pewnym, nikt nie donosił o odkryciu fragmentów przeciwciała jako substratów tej proteazy. Tutaj wykazano, że w komórkach E. coli Pcr jest proteazą uczestniczącą tylko w cięciu LC w komórkach E. coli. Białko Prc okazuje się ciąć wybiórczo LC kappa w określonych miejscach, co skutkuje powstaniem dwóch głównych skróconych produktów (LC-115 i LC-182) i pięciu dodatkowych pośrednich produktów cięcia, co zaobserwowano z wyników żelu 2-D. Ponieważ jeden główny skrócony produkt był produktem cięcia S/K, co nie pasuje do charakterystyki miejsc skracania Prc (Keiler i wsp., powyżej) przeprowadzono bardziej wnikliwe badania. Stwierdzono obecnie, że degradacja łańcucha lekkiego kappa w komórkach E. coli związana jest z peryplazmatyczną proteazą E. coli (Prc/Tsp). Produkty cięcia łańcucha lekkiego kappa zidentyfikowano metodami analitycznymi (1-D/2-D SDS PAGE, spektrometria masowa i analiza sekwencji N-końcowych) ekstraktów E. coli pochodzą30
PL 205 897 B1 cych z różnych szczepów z niedoborami proteolitycznymi wyrażających cząsteczkę anty-CD18 F(ab)'2 dla potwierdzenia, że Prc/Tsp jest jedyną proteazą odpowiedzialną za cięcie łańcucha lekkiego kappa.
Specjalna kombinacja delecji degrP prc z supresorem prc (mutant spr) okazała się być unikalnym szczepem E. coli zdolnym do wytwarzania bardzo dużych ilości zrekombinowanego białka lub wyższej aktywności specyficznej białka co podano przykładowo tu dla ligandu Apo2 i aktywnego przeciwciała.
Fermentacja przy pomocy szczepu degP prc spr skutkowała wzrostem do wysokiej gęstości komórek (do 300 OD lub więcej) i dużą wydajnością wytwarzania produktu rhux CD18 Fab'2 suwak leucynowy w porównaniu z ekspresją przeciwciał w szczepie typu dzikiego lub innych szczepach z nedoborem proteolitycznym.
Niniejszy proces fermentacji pozwala na wyprodukowanie w ciągu 72 godzin 100-200 g/l suchej masy komórek, przy ponad 200% wzroście wytwarzania aktywnego przeciwciała w jednym preferowanym szczepie, 59A7, posiadającym kombinację degP prc spr. Pełny genotyp szczepu 59A7 to W3110 \fhuA phoA \E15 \(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)1 kans ilvG2096 (Valr) \prc sprW148R. Jego wyjściowym szczepem jest 58B3, który posiada identyczne znaczniki genetyczne jak szczep 59A7 z tym wyjątkiem, że bez supresora prc, spr. Szczep 58B3 był niezdolny do utrzymania wzrostu w fazie stacjonarnej w procesie fermentacji E. coli przy wysokiej gęstości komórek. Wytwarzał on mniej przeciwciała niż natywny szczep prc(49A5), który również niesie znacznik delecyjny degP i niż inne identyczne genotypy jak szczep 59A7 z tym wyjątkiem, że 49A5 jest natywnym szczepem prc opornym na kanamycynę, podczas gdy 59A7 jest wrażliwym na kanamycynę szczepem \prc.
Zatem stwierdzono, że obecność supresora prc(spr) jest krytyczna dla dobrego wzrostu i wysokiego poziomu wytwarzania przeciwciała w szczepie delecyjnym degP prc, szczególnie w procesie fermentacji przy wysokiej gęstości komórek, lecz również w procesie fermentacji przy niskiej gęstości komórek.
Mutant w jednej proteazie DegP\ i inne szczepy z niedoborem wielu proteaz włącznie z degP\ nie wytwarzają niezwykle wysokiego poziomu zrekombinowanych produktów. Dwa wcześniej wspomniane szczepy, degP rpoH i degP prc wytwarzają więcej produktów niż wiele innych szczepów, z którymi były one porównane, lecz nie aż tyle co szczep 59A7. Dokładniej, bez supresora spr szczep 58B3 z kombinacją degP prc nie ujawniał żadnych korzyści dotyczących wytwarzania fragmentów przeciwciała, co przykładowo pokazano dla cząsteczki anty-CD18 Fab'2 LZ.
Dostarczono wyniki analityczne dla potwierdzenia, że cięcie LC kappa w komórkach E. coli wyrażających humanizowaną cząsteczkę anty-CD18 F(ab)'2-suwak leucynowy zależą od peryplazmatycznego białka (Prc) poddającego obróbce C-koniec. Białko Prc jest jedyną proteazą odpowiedzialną za cięcie łańcucha lekkiego kappa, co potwierdzono zarówno przez dwukierunkową elektroforezę w żelu i przez manipulację genetyczną szczepami wytwarzającymi przeciwciało. Dla potwierdzenia, że proteaza Prc jest naprawdę jedynym enzymem uczestniczącym w cięciu LC kappa, gdy szczep \prc został przekształcony do natywnego szczepu prc, ponownie pojawiły się produkty cięcia LC kappa. Podobnie, gdy gen prc usunięto z natywnego szczepu prc produkty cięcia LC zanikły. Konstrukcje obu szczepów wykonano przez transdukcję P1.
Dodatkowo, dostarczono porównania miana cząsteczek anty-CD18 F(ab)'2-suwak leucynowy pochodzących z proteolitycznych mutantów E. coli z lub bez mutacji prc. Dane te potwierdziły, że szczep 59A7 z wysoką wydajnością przeprowadza ekspresję przeciwciała. Opisano różne kwasy nukleinowe skonstruowane dla ekspresji cząsteczki anty-CD18 F(ab)'2-suwak leucynowy; wszystkie plazmidy ekspresyjne transformowano do szczepu 59A7 wytwarzającego większe ilości fragmentów przeciwciała w porównaniu z mutantem w pojedynczej proteazie degP\ lub mutantem degP prc bez spr. Kolejny szczep, 43H1, o genotypie degP prc spr dodatkowo do mutacji ompP i ptr3 nie rósł tak dobrze jak szczep 59A7, choć szczep 43H1 posiada tę samą mutację spr co 59A7, w pozycji 520 zawiera on zmianę T do C, czego wynikiem jest zmiana aminokwasu W do R w pozycji 148. Produkował on antyCD18 Fab'2 LZ z wyższym mianem niż wytwarzane przez szczep degP (49A5), lecz nie tak wysokim jak wytwarzane w fermentorze przez szczep 59A7.
Donoszono, że proteaza Prc tnie swoje substraty w szeregu miejsc, lecz jej specyficzność względem sekwencji jest raczej szeroka (Keiler i wsp., powyżej). Obecnie stwierdzono, że Prc tnie miejsca we fragmencie LC kappa, które są zlokalizowane w obszarze stałym, który jest sekwencją szkieletu powszechnie używaną dla konstrukcji różnych plazmidów wyrażających humanizowane przeciwciała. Opierając się na otrzymanych tu wynikach oczekuje się, że mutant delecyjny Prc będzie poprawiał miana różnych fragmentów przeciwciał, takich jak: Fab, Fab', Fab'2 (z lub bez suwaka leucynowego), włącznie z pełnej długości przeciwciałem, wyrażanych w komórkach Escherichia coli.
PL 205 897 B1
Oczekuje się, że fragment przeciwciała otoczony znacznikiem His lub znacznikiem Lys na C-końcu HC będzie również odpowiedni.
Stwierdzono, że szczep 59A7 jest lepszy od szczepu 49A5 pod względem ekspresji pAB3 i jest lepszy od szczepu 43E7 pod względem specyficznej ekspresji cytoplazmatycznego białka Apo2L w wytrząsanych kolbach, i lepszy od szczepów 43H1 i 49A5 pod względem ekspresji pS1130 i pcyc43 (odpowiednik promotora tacll z pS1130) przy fermentacji. Ponadto, był on lepszy od szczepu 33D3 w ekspresji dwupromotorowego plazmidu pxCD18-7T3.
P r z y k ł a d 2
Materiały i metody
A. Plazmidy ekspresyjne
Plazmid D3H44-F(ab')2 opisany w przykładzie 1.
Plazmid pY0317tet22 opisany w przykładzie 1.
B. Szczepy
Szczep użyty do ekspresji xVEGF Fab jest podobny do innych szczepów opisanych w przykładzie 1. Pochodzi on z E. coli W3110 i jest oznaczony jako 60C1. Pełny genotyp szczepu 50C1 to W3110 \fhuA \(argF-lac) 169 ptr3 degP41 Kans \ompT ilvG2096(Valr) \(nmpc-fepE) \ssrA. Podobnie do szczepu 45F8, niesie on potrójny znacznik proteazowy bez prc.
Szczepy 43H1, 59A7 i 33B6 są wszystkie opisane w przykładzie 1.
C. Sposób hodowli
Hodowlę w wytrząsanych kolbach przeprowadzono jak opisano w przykładzie 1. Wzrost hodowli w wytrząsanej kolbie wyrażających cząsteczkę xTF Fab'2 LZ-6x wydłużono do 42 godzin w 30°C i w różnych stadiach wzrostu pobrano dwa zestawy próbek dla porównania wzrostu. W porównaniu z ekspresją xVEGF Fab, hodowle prowadzono w dwóch powtórzeniach, i pobierano próbę jedynie po 24 godzinach.
D. Identyfikacja białka
Elektroforezę w żelu 2-D przeprowadzono jak opisano w przykładzie 1.
Wyniki
Dane dla hodowli w wytrząsanych kolbach przedstawiono poniżej w tabeli 6. Tak jak w przykładzie 1 dla produkcji rhuFab'2LZ (xCD18), szczepy Prc- 43H1 i 59A7 były lepsze niż szczepy Prc+ 60C1 i 33B6 pod względem ilości wytworzonych produktów (anty-VEGF Fab' i antyczynnik tkankowy Fab'2 LZ6xhis).
Fig. 12 przedstawia żel 2-D pokazujący, że delecja prc (szczep 59A7, szczep prc-minus) wyrażająca anty-VEGF Fab (pY0317tet20) eliminuje wszystkie zdegradowane anty-VEGF LC i dwa zdegradowane fragmenty xVEGF HC (stwierdzone w szczepie prc-plus), choć w 59A7 stwierdzono dwa rozdzielone, skrócone HC, które są produktami cięcia albo OmpT albo Ptr3. Fig. 13 przedstawia żel 2-D pokazujący, że szczep 60C1 (szczep prc-plus) wyrażający anty-VEGF Fab (pY0317tet20) jako heterologiczny polipeptyd, zawierał wiele zdegradowanych anty-VEGF LC i dwa zdegradowane fragmenty HC.
T a b e l a 6
Dane dla hodowli w wytrząsanych kolbach porównujące ekspresję xVEGF Fab w gospodarzu prc+/- i xTF Fab'2 LZ-6x w gospodarzu prc+/-
Szczep 24-godz. hodowli 42-godz. hodowli Stan pst
Anty-VEGF Fab (mg/1/OD)
59A7/pY0317tet20 2,44 -
59A7/pY0317tet20 2,53 -
60C1/pY0317tet20 0,82 +
60C1/pY0317tet20 1,03 +
Anty-TF Fab'2 LZ-6xHis (mg/l/OD)
33B6/pd3h44f2 0,68 0,54 +
43H1/pd3h44f2 1,60 1,88 -
59A7/pd3h44f2 2,18 3,98 -
PL 205 897 B1
Lista sekwencji <110> Genentech» Inc.
<12θ> Komórka gospodarza E. coli i sposób wytwarzania poiipeptydu <130> P1804R1 PCT <140> PCT/US01/47581 <141> 2001 — 12—0“?
<150> US 60/256,162 <1S1> 2000-12-14 <160> 10 <210 1 <211> 1951 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Ssyntetyzowaria sekwencja <4 OO 1 ·
gaattcaact tctccatact ttggataagg aaataeagac at-gaaaaatc 50
tcattgctga gttgttattt aagctttgga gattatcgtc actgcaatgc 100
ttcgcaatat ggcgcaaaat gaccaacagc ggttgattga tcaggtagag 150
ggggcgctgt acgaggtaaa gcccgatgcc ageatt cc tg acgacgatac 200
ggagctgctg egcyat tacy taaayaagtt attgaaąeat cetcgtcagt 250
aaaaagttaa tct tttcaac agetgteata aagttgtcac ggccgagact 300
tatagtcgct ttgttttcat tttttaatgt atttgtaact agaattegag 350
ctcggtaccc ggggatcctc tagaggttga ggtgatttta tgaaaaagaa 4 00
tategeattt ctcctrgcat ctatgttcgt tttttctatt gctacaaacg 450
cgtacgctga tatccagttg acccagtccc egagctccct gtccgcccct 500
gtgggegata gggtcaccat cacctgcagc gcaagtcagg atattageaa 550
ctatttaaac tggtatcaac agaasccagg aaaagctccg aaactactga 600
Cttacttcao ctcctctctc cactetggag teccttctcg ettctctgga 630
tccggttctg ggacggatta cactctgacc atcagcagtc tgcagccaga 700
agacttcgca acttattact gtcaacagta tagcaccgtg ccgtggaegt 750
ttggacaggg taccaaggtg gagatcaaac gaactgtggc tgcaccatct 800
gtcttcatct teecgccatc. tgatgageag ttgaaatctg gaaetgcttc 850
tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 900
ggaaggtgga taacgccctc eaatcgggta aetcccagga gagtgtcaca 930
PL 205 897 B1 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca cectgaeget 1000 gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt cfcaegcetgc gaagtcaccc 105C atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgfc 1100 taagctgatc ctctacgccg gacgoatcgt ggccctagta cgcaactagt 1150 cgtaaaaągg gtatctagag gttgaggtga ttttatgaaa aagaatat cg 1200 cafcttcttct tgcatctatg ttcgttttfct ctattgctac aaacgcgtac 1250 gctgaggttc agćtggtgga gtctggcggt ggcetggtgc agccaggggg 1300 ctcactccgt ttgtcctgtg cagcttctgg ctataccttc accaactatg 1350 gtatgaactg g&tćegtcag gccccgggta agggectgga atgggttgga 1400 tggattaaca cctataccgg tgaaecgacc tatgctgcgg atttcaaacg 1450 tcgttttact atatctgcag acacctccag caacacagtt tacctgcaga 1500 tgaacagcct gcgcgctgag gacactgccg tctattactg tgcaaagtac 1550 ccgcaćtatt atgggagcag ccactggtat ttcgacgtct ggggtcaagg 1600 aaecctggtc accgtctcct cggcctccac caagggccca tcggtcttcc 1650 ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg, ggggcacagc ggccctgggc 1700 tgcctggtca aggaętaętt ecęcgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc 1750 aggcgccctg aecagcggcg tgcacacctt eccggctgtc ctacagtcc.t 1800 caggactcta ctccctcagc agegtggtga ccgtgccctę eagcagcttg 1850 ggcaeceaga cctąeafcctg eaaegtgaat eacaagccca gcaacaęcaa 1900 ggtcgacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaaćt cacctctaga 1950 a 1951 <210> 2 <211> 491 <212> PRT <21.3> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Ssyntetyzowana sekwencja.
<400> 2
Met Lys Lys Asn ne A IM Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe
1 5 10 15
Sec Ile Ala Thr Aan Al-3 Tyr Ala Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser
20 25 30
Pro Sś.K Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Va-1 Thr Ile Thr·
35 40 45
Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin
50 55 60
PL 205 897 B1
Gin Lys Pro· Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser
65 70 75
Ser Leu Hiś ser Gly wal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser-
80 85 90
Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp
95 100 105
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Giń Gin Tyr Ser Thr 'V.a.l Pro Trp. Thr
110 lis 120
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Wal Glu Ile Lys Arg Thr Wal Ala Ala
125 130 135
Pio Ser vai Phe Ile Phe pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys -set
140 145 150
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro A-rg
155 160 165
Glu Ala Lys Va,l. Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala -Lhu Gin Ser Gly
170 175 180
Asn Ser Gin Glu Ser Wal Thr Glu Gin Asp Ser Lys· Asp Ser Thr
185 190 195
Tyr Ser Leu ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr G1.U,
200 205 210
Lys His Lys Wal Tyr Ala Cys Glu Wal Thr His Gin Gly Leń Ser
215 220 225
Ser Pro Wal Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Met Ly3 Lys
230 235 2-40'
Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser. Met Phe- Wal Phe Ser Lle Ala
245 250 255
Thr Asn Al a Tyr Ala: Glu Wal Gin Leu vni GlU Ser Gly Gly Giy
260 265 270
Leu Vał Gin. Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Aia Ala Ser
275 280 285
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile· Arg Giń Ala
290 295 300.
Pro- Gly Lys Gly Leu Glu Trp: Wal Gly Trp ile Asn· Thr Tyr Thr
305- 310 315
Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Ile
320 325 330
Ser Ala Aśp Thr Ser Ser Asn Thr Wal Tyr LeU Gir. Met Asn Ser
335. 340 345
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Wal Tyr Tyr Cys Aia, Lys Tyr Pro
350 355 360'
His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin
365 370 375,
PL 205 897 B1
Gly Thr Leu Val. Thr ual Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
330 38S 390
val Phe Prc Len Ala Pro Sec Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
395 400 405
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Pal Lya Asp Tyr Phe Pro. Glu Pro vai
410 415 4 20
Thr Val Ser T£p Asn Ser Gly Ala Leu The Ser Gly Val His Thr
425 430 435
Phe Pro Ala Val Leu Sin ©er Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser ©eh
440 445 450
Val Tal Thr Val Pro Sar .Ser Ser Leu. Gly Thr Gin Thr Tyr Ile
455 460 465
Ćys Asn Val Asn His Lys- Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys Lys
470 475 480
Val, Glu Pro Lys Ser cys ASp Lys Thr His Leu
485 490 <210 3 <211> 1042 <212> DNA <213> Homo sapiens <4ΰΟ> 3 tttcctcact gactataaaa g.aatagagaa ggaagggctfc cagtgancgg 50 ctgcctggęt gaettacage agtcagacte -tgaeagga.te atggctatga ItfO: tggaggtcca gggggga.ccc agcctgggac agaccigcgt gocgatcgCg 150 atccteacag tgetcctgea gcctctccgt gtggctgtaa cctacgtgta 200 ctttaccaac gagctgaage agatgcagga caagtactcc aaaagtggca 25©· ttgettgttt cttaaaagag gatgacagtt attgggaccc caatgaggąa 300 gagagtatga acagcccetg etggeaagfce aagtggcaac tećgtcagst 350 cgttagaaag atgattttga gaacc.tctga ggaaacęatt tctacagttc flOO aagaaaagca acsaaatatt tctccectag tgagagaaag aggtcctcag 450 agagtagcag etesćstaaó fegggaccaga. ggaagaagća afeaCattgtc 500 Ctctceaaac tccaagaatg aaaaggctct gggecgcaaa ataaactcct 550 gggaatcatc aaggagtggg cattcattcc tgagcaactfc gcacttgagg 600 aatggtgaae tggtcatcca tgaaaaaggg ttttaetaca tctattccca 650 aacatacttt cgatttcsgg aggaaataaa; agaaaacaca aagaacgaca 700 aacaaatggt ceaatatait tacaaataca caagttatcc tgaccctata 730 tcgttgatga aaagcgcta.g a.ąategttgt tggtętaaag atgcagaafca 800 tggactctafc tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg fi5O
PL 205 897 B1 acagaatttt tgtttctgta acaaatgage acttgataga catggaccat 900 gaagccagtfc ttttcggggc ctttttagtt ggctaactga cctggaaaga 950 aaaagcaata aę-ctcaaegt gactattcag fcfcfctcaggat gatacaęfcat 1000 gaagatgttt caaaaaatct gaccaaaaca aacaaacaga aa 1042 <21Q> 4 <211> 281 <212> PRT , <213> Horaó sapiens <4O0> 4
Met Ala Met Met Glu vsl Gin Gly Gly pro ser Leu Gly Gin Thr 10 15
1 Cys Vai Leu 5 Ile Val 20
ile Phe Thr Val Leu Łeu 25 Gin Se” Leu Cyś 30
Val Ala Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Aśn Glu Leg Lys Gin. Met
35 40 45
Gin Asp Lys Tyr Ser LyS .Ser Gly Tle Ais Cys Phe -Lee Lys Gin
5ff 55 60
Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser- Met Asn Ser
65 70 75
'Pro Cys Trp' Gin Val Lys Trp: Giń Leu Arg Gin T.,en Val Arg Lyś
80 SS 90
Met Tle Lag Arg Thr fer Glu Glu Thr ile Ser Thr vai Gin Glu
95 100 105
Lys Gin Gin Asn Ile /Ser pro Leu Val Arg Glu Arg -Gly Pro Gin
110 115 120
Arg vai Ala Ala His Me Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser San Thr
125 130 135
leu Ser Set Pro Asn sec Lys Asn Glu Lys Ala hen Gly Arg Lys
140 145 150
Ile Asn Ser Trp Glu Set Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Len Ser
155 160 165
Asn Leu flis Leu Arg Asm Gly Glu Leu Val Ile Ais. 'Glu Lys Gly,1
170. Π5 ' 180
Phe Tyr Tyr ile Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu
185 190 195
Ile Lys Gin Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met val Gin Tyr ile
200 205 210
Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro- Ile Leu Leu Met Lys Ser
215 220 225
Ala Arg Asm Ser Cys Tfcp- Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
230 235 240'
PL 205 897 B1
Ser Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp. Arg
245 250 255
Ile Phe m Ser Vał Thr Asa Glu Ris Leu Ile Asp Met Asp Hi3
260 265 270
etu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe LWU Val Gly
275 280 <21β> 5 <211> 212 <212> PRT <213> Sż-tu'czilai śekwsńeja <220>
<223> He foyer <400> 5 tę.ją Z5’ Met Thr yntetyz-Gwajią- Gln.. Ser Pro -ser Ser 10 Ala 25 Leu Ser ser Gin Ala Ser Val 15' Asp Ile Asn 30
Asp 1 Gly Ile Asp Gir. Arg
Val 5 Thr 20
Ile Thr Cys Arg
Aśn Tyr Leu Asa Trp Tyr Gin Giń Lys- Pro G'ly Lys 'Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser His Ser- Gly· Val Pro Ser Arg- Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu 'Thr Ile Ser Ser
65 70 75'
Leu Gin Pro Glu ASp Phe Ala The tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn
80 85 90
Thr Leu. Pro Pro Thr Phe- Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
95 100 105
Arg Thr val Ala Ala Pro Ser Vai Phe' Tle Phe Pro Pro Ser- Asp
110 115 120'
Glu Giń Leu Lys Ser Gly thr Ala Ser vai Val Cys Leu Leu Asn
125 130 135
Asn Phe Tyr Pro Arg: Glu Ala Lys Val Giń Trp Lys Val Asp Asn
140 145 150
Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser val Thr Glu Gin Asp
155 160 16-5
Ser Lys Asp Ser Thr 'Tyr 'Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 'Ser
no 175 1,00.
Lys Ala. Asp Tyr Glu- Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
185 190 195
His Gin Gly Leu Ser Sec Pro- val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
200 * 205 210
Glu Cys
PL 205 897 B1 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Sekwencja zsyntetyzowana.
<40Ο> 6 agcttgtcgg ggagcgccat caccatcacc atcactaagc atg 43
<21O> <2U> <212> <213> 7 35 DNA Sekwencja sztuczna
<220 <223> Sekwencja zsyntety:
<4 00> 7
cttagtgatg gtgatggtga tggcgctccc cgaca 35 <210> 8 <211> 43 <212> DNA ' <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja zsyntetyzowana <400> 8 ayctt.gt.cgg ggagegcaaa aagaaaaaga aaaagtaayc atg 43 <210 9 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja zsyntetyzówana <400 9 cttacttttt ctttttcttt ttgcgctcce cgaca 35 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja zsyntetyzówana <400> 10
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 1 5 10
PL 205 897 B1

Claims (24)

1. Komórka gospodarza E. coli pozbawiona chromosomowych degP i prc kodujących odpowiednio proteazę DegP i Prc oraz niosąca zmutowany gen spr, przy czym produkt tego zmutowanego genu spr zawiera sekwencję oznaczoną SEQ ID NO: 12, w której względem dzikiego typu tryptofan w pozycji 148 jest zamieniony na argininę.
2. Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że nie jest pozbawiona chromosomowego ptr3 kodującego proteazę III lub chromosomowego ompT kodującego proteazę OmpT.
3. Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera kwas nukleinowy kodujący heterologiczny dla tego szczepu polipeptyd.
4. Komórka gospodarza według zastrz. 3, znamienna tym, że polipeptyd jest wrażliwy na proteolizę.
5. Komórka gospodarza według zastrz. 3, znamienna tym, że polipeptyd jest polipeptydem eukariotycznym.
6. Komórka gospodarza według zastrz. 5, znamienna tym, że polipeptyd jest polipeptydem ssaczym.
7. Komórka gospodarza według zastrz. 3, znamienna tym, że jest transformowana kwasem nukleinowym.
8. Sposób wytwarzania polipeptydu, znamienny tym, że (a) hoduje się komórkę gospodarza E. coli pozbawioną chromosomowego genu prc kodującego proteazę Prc i niosącą zmutowany gen spr, przy czym produkt tego zmutowanego genu spr zawiera sekwencję oznaczoną SEQ ID NO: 12, w której względem dzikiego typu tryptofan w pozycji 148 jest zamieniony na argininę, która to komórka gospodarza zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla tej komórki, tak że kwas nukleinowy ulega ekspresji i (b) odzyskuje się z komórki gospodarza heterologiczny polipeptyd.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd heterologiczny wrażliwy na proteolizę.
10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w fermentorze.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w warunkach fermentacji przy wysokiej gęstości komórek.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w warunkach fermentacji przy niskiej gęstości komórek.
13. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że polipeptyd odzyskuje się z przestrzeni peryplazmatycznej lub pożywki hodowlanej, w której hodowano komórkę gospodarza.
14. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako polipeptyd stosuje się przeciwciało lub ligand Apo2.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jako polipeptyd stosuje się przeciwciało.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako przeciwciało stosuje się przeciwciało humanizowane.
17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako przeciwciało stosuje się przeciwciało pełnej długości.
18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako przeciwciało stosuje się przeciwciało anty-CD18, anty-VEGF, anty-czynnik tkankowy, 2C4, anty-Her-2, anty-CD20, anty-CD40 lub przeciwciało anty-CD11a.
19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako przeciwciało stosuje się fragment przeciwciała.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się fragment przeciwciała posiadający łańcuch lekki.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że jako łańcuch lekki stosuje się łańcuch lekki kappa.
22. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako fragment przeciwciała stosuje się Fab, Fab', Fab'2 lub fuzję Fab'2-suwak leucynowy.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako fragment przeciwciała stosuje się fuzję anty-CD18 Fab'2-suwak leucynowy, fuzję anty-czynnik tkankowy Fab'2-suwak leucynowy lub antyVEGF-Fab, z lub bez znacznika histydynowego lub lizynowego.
PL 205 897 B1
24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako fragment przeciwciała stosuje się fuzję anty-CD18 Fab'2-suwak leucynowy, fuzję anty-czynnik tkankowy Fab'2-suwak leucynowy z 6-histydynowym znacznikiem, fuzję anty-VEGF Fab, anty-CD18 Fab'2-suwak leucynowy z 6-histydynowym znacznikiem i fuzję anty-CD18 Fab'2-suwak leucynowy z 6-lizynowym znacznikiem.
PL366194A 2000-12-14 2001-12-07 Komórka gospodarza E. coli i sposób wytwarzania polipeptydu PL205897B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25616200P 2000-12-14 2000-12-14
PCT/US2001/047581 WO2002048376A2 (en) 2000-12-14 2001-12-07 Bacterial host strains

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL366194A1 PL366194A1 (pl) 2005-01-24
PL205897B1 true PL205897B1 (pl) 2010-06-30

Family

ID=22971286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL366194A PL205897B1 (pl) 2000-12-14 2001-12-07 Komórka gospodarza E. coli i sposób wytwarzania polipeptydu

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6828121B2 (pl)
EP (1) EP1341899B9 (pl)
JP (1) JP4056880B2 (pl)
KR (1) KR100841486B1 (pl)
CN (1) CN1233820C (pl)
AT (1) ATE318890T1 (pl)
AU (2) AU3957602A (pl)
BR (1) BR0116680A (pl)
CA (1) CA2430249A1 (pl)
CZ (1) CZ304484B6 (pl)
DE (1) DE60117601T2 (pl)
DK (1) DK1341899T3 (pl)
ES (1) ES2259338T3 (pl)
HU (1) HU230065B1 (pl)
IL (2) IL156111A0 (pl)
MX (1) MXPA03005271A (pl)
NO (1) NO328987B1 (pl)
NZ (1) NZ526134A (pl)
PL (1) PL205897B1 (pl)
RU (1) RU2287574C2 (pl)
WO (1) WO2002048376A2 (pl)
ZA (1) ZA200304101B (pl)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6979556B2 (en) * 2000-12-14 2005-12-27 Genentech, Inc. Separate-cistron contructs for secretion of aglycosylated antibodies from prokaryotes
EP1427744B1 (en) * 2001-08-27 2007-12-26 Genentech, Inc. A system for antibody expression and assembly
JP4050559B2 (ja) * 2002-06-28 2008-02-20 富士通株式会社 コンテンツ検索処理プログラム、コンテンツ検索処理プログラムを記録した記録媒体およびオペレータ問合せ処理システム
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
KR101412271B1 (ko) * 2003-05-09 2014-06-25 듀크 유니버시티 Ｃｄ２０-특이적 항체 및 이를 이용한 방법
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
ES2438098T3 (es) 2003-11-13 2014-01-15 Hanmi Science Co., Ltd. Composición farmacéutica que comprende un Fc de inmunoglobulina como vehículo
US8227241B2 (en) 2004-03-12 2012-07-24 Unigene Laboratories, Inc. Bacterial host cell for the direct expression of peptides
EP2412816B1 (en) 2004-07-26 2014-12-03 Pfenex Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
RU2407544C2 (ru) 2005-05-26 2010-12-27 Сиэтл Дженетикс, Инк. Гуманизированные анти-cd40-антитела и способы их применения
CA2685326A1 (en) 2007-04-27 2008-11-06 Dow Global Technologies Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
WO2009021548A1 (en) * 2007-08-10 2009-02-19 Wacker Chemie Ag Expression of full length igg and secretion into the culture medium of prokaryotic cells
US9079953B2 (en) 2009-06-17 2015-07-14 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-VEGF antibodies and their uses
WO2011036455A1 (en) * 2009-09-24 2011-03-31 Ucb Pharma S.A. Bacterial strain for recombinant protein expression, having protease deficient degp retaining chaperone activity, and knocked out tsp and ptr genes
SMT201800549T1 (it) 2009-09-24 2018-11-09 Ucb Biopharma Sprl Ceppo batterico per espressione di proteina ricombinante, avente attivita' di chaperone a conservazione di degp carente di proteasi, e geni tsp e ptr con knockout
CA2780143A1 (en) * 2009-11-05 2011-05-12 Genentech, Inc. Methods and composition for secretion of heterologous polypeptides
GB201000591D0 (en) * 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000590D0 (en) * 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000587D0 (en) * 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201012599D0 (en) 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Process for purifying proteins
MX348738B (es) * 2011-07-13 2017-06-27 Ucb Pharma Sa Cepa huesped bacteriana que expresa dsbc recombinante.
GB201208367D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Biological product
WO2014003709A1 (en) * 2012-06-25 2014-01-03 Empire Technology Development Llc Ultrasound based antigen binding detection
RU2644652C2 (ru) * 2012-09-17 2018-02-13 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения полипептидов в периплазме прокариотических клеток
US20140154255A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
WO2015139046A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Genentech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
JP7033795B2 (ja) * 2017-02-22 2022-03-11 国立大学法人 長崎大学 生体由来材料の透明化用試薬
CN106967658B (zh) * 2017-02-23 2020-09-15 郑州大学 一种提高Fab抗体表达量的方法
EP3774926A1 (en) 2018-04-05 2021-02-17 Bio-Rad ABD Serotec GmbH Display systems for proteins of interest
CN108587992B (zh) * 2018-04-10 2022-03-15 安徽大学 一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株及其构建方法
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
EP3942079A1 (en) 2019-03-18 2022-01-26 Bio-Rad ABD Serotec GmbH Protection of spytag-containing periplasmic fusion proteins from protease tsp and ompt degradation
JP7259131B2 (ja) * 2019-08-05 2023-04-17 ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト 発酵法で組換えタンパク質を放出する細菌株
JPWO2021193566A1 (pl) * 2020-03-23 2021-09-30
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
SE545714C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-19 Xbrane Biopharma Ab Dna contructs for producing a pelb signal peptide
SE545694C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-05 Xbrane Biopharma Ab Dna construct comprising nucleotide sequences encoding amino acid sequences of certolizumab and pelb signal peptides
SE545715C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-19 Xbrane Biopharma Ab Dna contructs comprising tirs for producing recombinant proteins
KR20240099199A (ko) 2021-09-24 2024-06-28 엑스브레인 바이오파마 에이비 재조합 단백질을 발현시키기 위한 dna 구조체 및 숙주 세포

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4439523A (en) * 1981-07-07 1984-03-27 Phillips Petroleum Company Production of single cell protein material
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
RU2091490C1 (ru) * 1985-10-25 1997-09-27 Зимодженетикс, Инк. Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов
ATE122391T1 (de) 1987-01-30 1995-05-15 Harvard College Periplasmische protease-mutanten von escherichia coli.
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5508192A (en) * 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US20020037558A1 (en) 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US6251395B1 (en) * 1993-12-23 2001-06-26 W. Michael Gallatin Methods of inhibiting inflammation at the site of a central nervous system injury with alphaD-specific antibodies
FR2787810B1 (fr) * 1998-12-24 2002-10-31 Inst Nat De La Rech Agronomique Inra Bacteries a gram positif depourvues d'activite proteasique htra, et leurs utilisations

Also Published As

Publication number Publication date
KR100841486B1 (ko) 2008-06-25
PL366194A1 (pl) 2005-01-24
CN1233820C (zh) 2005-12-28
IL156111A (en) 2010-05-31
CA2430249A1 (en) 2002-06-20
CZ304484B6 (cs) 2014-05-21
DK1341899T3 (da) 2006-04-10
DE60117601D1 (de) 2006-04-27
EP1341899B9 (en) 2007-03-21
KR20030057579A (ko) 2003-07-04
US6828121B2 (en) 2004-12-07
ATE318890T1 (de) 2006-03-15
NZ526134A (en) 2005-07-29
NO20032694L (no) 2003-08-14
IL156111A0 (en) 2003-12-23
HUP0303892A2 (hu) 2004-03-01
HU230065B1 (hu) 2015-06-29
MXPA03005271A (es) 2003-09-25
ZA200304101B (en) 2005-07-27
WO2002048376A3 (en) 2003-06-19
WO2002048376A2 (en) 2002-06-20
AU2002239576B2 (en) 2007-03-29
US20020142388A1 (en) 2002-10-03
JP4056880B2 (ja) 2008-03-05
EP1341899B1 (en) 2006-03-01
JP2004537262A (ja) 2004-12-16
HK1058686A1 (en) 2004-05-28
AU3957602A (en) 2002-06-24
NO328987B1 (no) 2010-07-12
CZ20031523A3 (cs) 2003-10-15
CN1526010A (zh) 2004-09-01
RU2287574C2 (ru) 2006-11-20
ES2259338T3 (es) 2006-10-01
HUP0303892A3 (en) 2011-03-28
DE60117601T2 (de) 2006-11-16
NO20032694D0 (no) 2003-06-13
BR0116680A (pt) 2005-04-05
RU2003121232A (ru) 2005-01-20
EP1341899A2 (en) 2003-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL205897B1 (pl) Komórka gospodarza E. coli i sposób wytwarzania polipeptydu
AU2002239576A1 (en) Bacterial host strains
EP1581644B1 (en) Purification of polypeptides
US8389242B2 (en) Process for producing Apo2L
HK1058686B (en) Bacterial host strains
AU2017261489A1 (en) Process for producing polypeptides
HK1103761B (en) Process for producing polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
RECP Rectifications of patent specification