RU2644652C2 - Способ получения полипептидов в периплазме прокариотических клеток - Google Patents
Способ получения полипептидов в периплазме прокариотических клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2644652C2 RU2644652C2 RU2015114092A RU2015114092A RU2644652C2 RU 2644652 C2 RU2644652 C2 RU 2644652C2 RU 2015114092 A RU2015114092 A RU 2015114092A RU 2015114092 A RU2015114092 A RU 2015114092A RU 2644652 C2 RU2644652 C2 RU 2644652C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- concentration
- tris
- polypeptide
- edta
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 50
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 28
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 title claims abstract description 26
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 18
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 7
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 claims description 6
- 210000005256 gram-negative cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 18
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 14
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 13
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 5
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 3-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCC(CO)(CO)NCC(O)CS(O)(=O)=O RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 3
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 description 3
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700016232 Arg(2)-Sar(4)- dermorphin (1-4) Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCS(O)(=O)=O YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- DUYCTCQXNHFCSJ-UHFFFAOYSA-N dtpmp Chemical compound OP(=O)(O)CN(CP(O)(O)=O)CCN(CP(O)(=O)O)CCN(CP(O)(O)=O)CP(O)(O)=O DUYCTCQXNHFCSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NFDRPXJGHKJRLJ-UHFFFAOYSA-N edtmp Chemical compound OP(O)(=O)CN(CP(O)(O)=O)CCN(CP(O)(O)=O)CP(O)(O)=O NFDRPXJGHKJRLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- JREYOWJEWZVAOR-UHFFFAOYSA-N triazanium;[3-methylbut-3-enoxy(oxido)phosphoryl] phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].CC(=C)CCOP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O JREYOWJEWZVAOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- FYIHPNCKLYPALH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-aminophenoxy)ethenoxy]aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1OC=COC1=CC=CC=C1N FYIHPNCKLYPALH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 201000007075 ADULT syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 108010055851 Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- FTEDXVNDVHYDQW-UHFFFAOYSA-N BAPTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C1=CC=CC=C1OCCOC1=CC=CC=C1N(CC(O)=O)CC(O)=O FTEDXVNDVHYDQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229940120146 EDTMP Drugs 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010014824 Endotoxic shock Diseases 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 102100030122 Protein O-GlcNAcase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000495426 Thiobacter Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N m-aminophenylboronic acid Chemical compound NC1=CC=CC(B(O)O)=C1 JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol Chemical compound CNCO IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Chemical group 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения полипептида, рекомбинантно продуцируемого в периплазму прокариотическими клетками. Способ включает инкубирование прокариотических клеток в растворе, содержащем Трис в концентрации от 10 мМ до 95 мМ и ЭДТК в концентрации от 2 мМ до 6 мМ и ЭДТК, при рН от 7 до 10 в течение от 15 мин до 6 ч при температуре от 20°С до 33°С. Изобретение обеспечивает выделение рекомбинантно продуцируемого полипептида с высоким выходом. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.
Description
В настоящем изобретении предложен способ получения полипептидов в прокариотических клетках, в котором рекомбинантно продуцируемый полипептид выделяют из периплазмы прокариотических клеток с использованием стадии инкубации в забуференной системе в присутствии хелатирующего агента при определенном значении pH и определенной температуре.
Предпосылки создания изобретения
При наличии соответствующей сигнальной последовательности рекомбинантно продуцируемые полипептиды могут секретироваться в периплазматическое пространство клеток E. coli (Joly J.С. и Laird M.W. в: The Periplasm, под ред. Ehrmann М., изд-во ASM Press, Washington D.C., 2007, cc. 345-360). Среда, содержащая химические окисляющие агенты, благоприятствует образованию дисульфидных связей и тем самым правильной укладке полипептидов. Целесообразно осуществлять избирательное выделение указанных полипептидов из периплазматического пространства E. coli для того, чтобы избегать загрязнения белками клетки-хозяина (НСР). Тем самым облегчается последующая очистка полипептидов.
Примером метода выделения является метод осмотического шока, описанный у Ren G. и др., J. of Bacteriology 189, 2007, сс. 2777-2786. При использовании этого метода ЭДТК, растворенная в Трис-буфере (pH 7,2), дестабилизирует наружную мембрану прокариотических клеток, что позволяет сахарозе проникать в периплазматическое пространство. Внутренняя мембрана является непроницаемой для сахарозы. После этого Трис-ЭДТК-буфер удаляют путем центрифугирования и клетки быстро ресуспендируют в охлажденной на льду дистиллированной воде. При этом вода проникает в наполненное сахарозой периплазматическое пространство и происходит разрушение дестабилизированной наружной мембраны в результате увеличения периплазматического объема. Добавление MgCl2 приводит к восстановлению стабилизации наружной мембраны.
Описание других методов можно почерпнуть у Humphreys D.P. (в: The Periplasm, под ред. Ehrmann М., изд-во ASM Press, Washington, D.C., 2007, cc. 361-388) и Middelberg А.Р. (Biotechnol. Adv. 13, 1995, cc. 491-551).
Согласно Joly Laird (см. выше) «общепринятые методы выделения периплазматических фракций, применяемые для маломасштабного получения, такие как обработка, приводящая к образованию сферопластов, или воздействие осмотическим шоком, практически не осуществляют, когда объемы культур достигают 10 л или более». «Выделение белка из внешней среды или после разрушения лишь наружной мембраны и пептидогликана представляет собой цель, которая все еще не реализована на практике в случае крупномасштабного получения» (c. 354).
В WO 2012/013930 описан метод очистки рекомбинантного белка из образца или экстракта грамотрицательной бактериальной клетки-хозяина, экспрессирующей рекомбинантный белок и дисульфидизомеразу DsbC, в котором осуществляют регулирование значения pH образца или экстракта с целью осаждения и отделения DsbC. В WO 01/94585 описано новое антитело, специфическое в отношении человеческого фактора некроза опухоли TNF-альфа, которое можно применять для лечения опосредуемых TNF-альфа заболеваний, таких, например, как застойная сердечная недостаточность, септический или эндотоксический шок, кахексия и респираторный дистресс-синдром взрослых. В US 2005/048056 описан метод получения антитела к фактору некроза опухоли-альфа, которое имеет тяжелую и легкую цепь, заключающийся в том, что осуществляют ферментацию клеточной смеси, получают клеточный дебрис и дают клеточному дебрису выстояться в течение определенного времени.
В WO 2007/106120 описан метод модулирования распределения пептидной молекулы в ткани, заключающийся в том, что вводят в ткань молекулу конъюгата, которая содержит пептид, связывающий сывороточный альбумин. В WO 01/45746 описаны пептидные лиганды, обладающие аффинностью в отношении иммуноглобулина (Ig) G, IgM и/или человеческого сывороточного альбумина, которые можно применять для конъюгации и использовать для удлинения времени полувыведения действующих веществ из кровотока. В US 2004/001827 описан метод модулирования распределения в ткани пептидной молекулы, предназначенный для повышения терапевтической эффективности и снижения побочных действий, заключающийся в том, что вводят в ткань молекулу конъюгата, содержащую домен пептидного лиганда и обладающий активностью домен.
Краткое изложение сущности изобретения
При создании настоящего изобретения было установлено, что рекомбинантно продуцируемый полипептид можно выделять из периплазмы прокариотической клетки путем приведения в контакт или посредством инкубации клетки с раствором, содержащим забуферивающий агент (например, Трис) и хелатирующий агент (например, ЭДТК), при значении pH, составляющем примерно 8, и комнатной температуре. Способ позволяет выделять рекомбинантно продуцируемый полипептид с высоким выходом и чистотой в процессе крупномасштабного производства. Выделенный полипептид отличается высокой степенью пригодности для дальнейших процессов обработки (например, очистки).
Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения полипептида, заключающийся в том, что осуществляют стадию, на которой инкубируют прокариотические клетки в растворе, содержащем забуферивающий агент в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ и хелатирующий агент в концентрации от примерно 0,5 мМ до примерно 9,5 мМ, при значении pH, составляющем от примерно 7 до примерно 10, в течение периода времени, составляющего от примерно 15 мин до примерно 6 ч.
В одном из вариантов осуществления изобретения хелатирующий агент выбирают из группы, включающей этилендиамин, нитрилоуксусную кислоту (НУК), этиленгликольтетрауксусную кислоту (ЭГТК), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (ДТПК), 1,2-бис(орто-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (ВАРТА), этилендиамин-N,N'-диянтарную кислоту (EDDS), фосфонаты (например, этилендиаминтетра(метиленфосфоновую кислоту) EDTMP или диэтилентриаминпента(метиленфосфоновую кислоту) DTPMP), цитрат, порфирины (например, гем, хлорофилл или витамин В12). В одном из вариантов осуществления изобретения хелатирующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК).
Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения полипептида, заключающийся в том, что осуществляют стадию, на которой инкубируют (ресуспендированные) прокариотические клетки в растворе, содержащем Трис-HCl в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ и ЭДТК в концентрации от примерно 2 мМ до примерно 6 мМ, при значении pH, составляющем от примерно 7 до примерно 10, в течение периода времени, составляющего от примерно 15 мин до примерно 6 ч, при температуре примерно 25°С.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения полипептида, заключающийся в том, что осуществляют стадию, на которой инкубируют (ресуспендированные) прокариотические клетки в растворе, содержащем Трис-HCl в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ и ЭДТК в концентрации от примерно 2 мМ до примерно 4 мМ, при значении pH, составляющем от примерно 7 до примерно 10, в течение периода времени, составляющего от примерно 15 мин до примерно 6 ч, при температуре примерно 25°С.
В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 1 мМ до примерно 6 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 1 мМ до примерно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 1 мМ до примерно 3 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 2 мМ до примерно 6 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 2 мМ до примерно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет примерно 2 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет примерно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет примерно 6 мМ.
В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация ЭДТК составляет от примерно 0,5 мМ до 9,5 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация ЭДТК составляет от примерно 1 мМ до примерно 3 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация ЭДТК составляет примерно 2 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация ЭДТК составляет примерно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация ЭДТК составляет примерно 6 мМ.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 2 мМ.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 4 мМ.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 6 мМ.
В одном из вариантов осуществления изобретения раствор имеет значение pH, составляющее от примерно 7,5 до примерно 8,5. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что значение pH составляет примерно 8.
В одном из вариантов осуществления изобретения время инкубации составляет от примерно 20 мин до примерно 3,5 ч. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что время инкубации составляет примерно 30 мин.
В одном из вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой субстанцию, которая вступает во взаимодействие с наружной мембраной прокариотических клеток.
В одном из вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой одновалентный органический амин. В одном из вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) или его соли.
В одном из вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент выбирают из группы, включающей фосфорную кислоту или ее соли, морфолин или его соли (MOPS), 3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновую кислоту (TAPS), N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин (Бицин), N-трис(гидроксиметил)метилглицин (Трицин), 3-[N-трис(гидроксиметил)метиламино]-2-гидроксипропансульфоновую кислоту (TAPSO), 4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), 2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновую кислоту (TES), гистидин или его соли, глицин или его соли, или трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) или его соли. В одном из вариантов осуществления изобретения соль представляет собой Трис-HCl.
В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация Трис-HCl составляет от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация Трис-HCl составляет от примерно 15 мМ до примерно 50 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация Трис-HCl составляет от примерно 20 мМ до примерно 60 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация Трис-HCl составляет примерно 20 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация Трис-HCl составляет примерно 40 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация Трис-HCl составляет примерно 60 мМ.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ осуществляют при комнатной температуре. В одном из вариантов осуществления изобретения способ осуществляют при температуре от 20°С до 33°С. В одном из вариантов осуществления изобретения способ осуществляют при температуре примерно 25°С.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ получения полипептида заключается в том, что осуществляю стадию, на которой инкубируют (ресуспендированные) прокариотические клетки в растворе, содержащем Трис-HCl в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ и ЭДТК в концентрации примерно 2 мМ, при значении pH от примерно 7 до примерно 10 в течение периода времени, составляющего от примерно 15 мин до примерно 6 ч, при температуре примерно 25°С.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что прокариотическая клетка представляет собой грамотрицательную клетку.
В одном из вариантов осуществления изобретения прокариотическая клетка представляет собой ресуспендированную клетку.
В одном из вариантов осуществления изобретения прокариотическую клетку выбирают из группы грамотрицательных бактерий, имеющих наружную мембрану. В одном из вариантов осуществления изобретения прокариотическую клетку выбирают из бактерий рода Acetobacter, Bacteroides, Borrelia, Bortadella, Burkholderia, Campylobacter, Chlamydia, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Fusobacterium, Helicobacter, Hemophilus, Klebsiella, Legionella, Leptospiria, Neisseria, Nitrobacter, Proteus, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Serratia, Shigella, Thiobacter, Treponema, Vibrio, Xanthomonas или Yersinia. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что прокариотическая клетка представляет собой клетку E. coli.
В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид представляет собой негликозилированный полипептид.
В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид представляет собой антитело или фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения фрагмент антитела выбирают из Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; димерных антител (диабоди), линейных антител; молекул одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифических антител, созданных из фрагментов антител.
В одном из вариантов осуществления изобретения раствор, применяемый в способе, представленном в настоящем описании, практически не содержит гидролизующих пептидогликаны ферментов. В одном из вариантов осуществления изобретения гидролизующий пептидогликаны фермент выбирают из лизоцимов (мурамидаз), литических трансгликозилаз, N-ацетил-β-D-глюкозаминидаз, N-ацетилмурамил-L-аланинамидаз или эндопептидаз.
В одном из вариантов осуществления изобретения раствор, применяемый в способе, представленном в настоящем описании, практически не содержит сахара. В одном из вариантов осуществления изобретения сахар представляет собой сахарозу.
В одном из вариантов осуществления изобретения раствор, применяемый в способе, представленном в настоящем описании, практически не содержит сахар и практически не содержит гидролизующих протеогликаны ферментов. В одном из вариантов осуществления изобретения раствор, применяемый в способе, представленном в настоящем описании, практически не содержит сахарозу и практически не содержит лизозим.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ дополнительно заключается в том, что после стадии инкубации осуществляют стадию, на которой выделяют полипептид.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ дополнительно заключается в том, что осуществляют стадию, на которой очищают выделенный полипептид.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 2 мМ, значение pH составляет примерно 8, время инкубации составляет примерно 30 мин, концентрация Трис-HCl составляет примерно 20 мМ, температура инкубации составляет примерно 25°С и прокариотическая клетка представляет собой клетку Е. coli.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 4 мМ, значение pH составляет примерно 8, время инкубации составляет примерно 30 мин, концентрация Трис-HCl составляет примерно 40 мМ, температура инкубации составляет примерно 25°С и прокариотическая клетка представляет собой клетку Е. coli.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 6 мМ, значение pH составляет примерно 8, время инкубации составляет примерно 30 мин, концентрация Трис-HCl составляет примерно 60 мМ, температура инкубации составляет примерно 25°С и прокариотическая клетка представляет собой клетку Е. coli. Одним из объектов настоящего изобретения является применение способа, предлагаемого в настоящем изобретении, для выделения периплазматического полипептида из прокариотической клетки.
Описание чертежей
На чертежах показано:
На фиг. 1 - результаты гель-электрофореза (ДСН-ПААГ) экспрессированного в периплазме белка (α-синуклеина), выделенного с помощью представленного в настоящем описании способа крупномасштабного получения; полосы: LS обозначает стандарт длины, WC обозначает целые клетки, Ре обозначает клеточный дебрис, IPP обозначает выделенный периплазматический белок;
на фиг. 2 - результаты гель-электрофореза (ДСН-ПААГ) экзотоксина Pseudomonas (Nlys-PE25-LR8M), выделенного с помощью представленного в настоящем описании способа крупномасштабного получения; полосы: LS обозначает стандарт длины, WC обозначает целые клетки, IPP обозначает выделенный периплазматический белок, Ре обозначает клеточный дебрис.
Подробное описание изобретения
Определения
Понятие «периплазматическое пространство» или «периплазма» обозначает пространство, ограниченное двумя избирательно проницаемыми барьерами, например, биологическими мембранами. В одном из вариантов осуществления изобретения периплазма в грамотрицательных бактериях находится между внутренней мембраной (т.е. цитоплазматической мембраной) и наружной мембраной.
Понятие «хелатирующий агент» обозначает субстанцию, которая может образовывать несколько связей с одним ионом металла. Иными словами, хелатирующий агент представляет собой мультидентатный лиганд.
Понятие «антитело» используют в настоящем описании в его наиболее широком смысле, и оно включает различные структуры антитела, в том числе (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, если они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.
Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примерами фрагментов антитела являются (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; димерные антитела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
В контексте настоящего описания понятие «забуференный» обозначает раствор, в котором изменения значения pH, обусловленные добавлением или высвобождением кислых или основных субстанций, компенсируются забуферивающим агентом. Можно использовать любой забуферивающий агент, обладающий таким действием. В одном из вариантов осуществления изобретения применяют фармацевтически приемлемые забуферивающие агенты, такие, например, как фосфорная кислота или ее соли (пригодный диапазон pH 6,8-8,2), морфолин или его соли (MOPS, пригодный диапазон pH 6,5-7,9), 3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота (TAPS, пригодный диапазон pH 7,7-9,1), N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин (Бицин, пригодный диапазон pH 7,6-9,0), N-трис(гидроксиметил)метилглицин (Трицин, пригодный диапазон pH 7,4-8,8), 3-[N-трис(гидроксиметил)метиламино]-2-гидроксипропансульфоновая кислота (TAPSO, пригодный диапазон pH 7,0-8,2), 4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES, пригодный диапазон pH 6,8-8,2), 2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновая кислота (TES, пригодный диапазон pH 6,8-8,2), гистидин или его соли (5,5-7,5), глицин или его соли (8,7-10,7) или трис(гидроксиметил)аминометан (Трис, пригодный диапазон pH 7,5-9,0) или его соли. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтически приемлемый забуферивающий агент представляет собой фосфорную кислоту или ее соли, или трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) или его соли.
Буферная емкость забуферивающего агента является максимальной при p[Н+]=pKa. Она снижается до 33% от максимальной величины при p[Н+]=pKa±1 и до 10% при p[Н+]=pKa±1,5. По этой причине пригодным диапазоном является примерно pKa±1.
Понятие «рекомбинантная» относится к аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, которая была преднамеренно модифицирована методами рекомбинации. В контексте настоящего описания понятие «рекомбинантная нуклеиновая кислота» относится к нуклеиновой кислоте, первоначально созданной in vitro, как правило, путем обработки нуклеиновой кислоты эндонуклеазами, в форме, которая, как правило, не встречается в естественных условиях. Так, в контексте настоящего изобретения выделенная мутантная нуклеиновая кислота ДНК-полимеразы, находящаяся в линейной форме, или экспрессионный вектор, созданный in vitro посредством сшивания ДНК-молекул, которые в норме не являются соединенными, считаются рекомбинантными. Следует иметь в виду, что, когда рекомбинантная нуклеиновая кислота создана и реинтродуцирована в клетку-хозяина, то она будет реплицироваться нерекомбинантным путем, т.е. посредством присущего клетке-хозяину клеточного механизма in vivo, а не посредством манипуляций in vitro; однако такие нуклеиновые кислоты, которые, созданы путем рекомбинации, но затем реплицируются нерекомбинантным путем, в контексте настоящего изобретения все еще рассматриваются как рекомбинантные. «Рекомбинантный полипептид» представляет собой полипептид, созданный с помощью методов рекомбинации, т.е. путем экспрессии указанной выше рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Он необязательно является выделенным или очищенным.
«Выделенный полипептид» представляет собой полипептид, который практически отделен от загрязняющих клеточных компонентов, таких как углевод, липид, или других белковых примесей, ассоциированных с полипептидом в естественных условиях. Как правило, препарат выделенного полипептида содержит полипептид в высокоочищенной форме, т.е. с чистотой, составляющей по меньшей мере примерно 80%, с чистотой, составляющей по меньшей мере примерно 90%, с чистотой, составляющей по меньшей мере примерно 95%, с чистотой более чем 95% или более чем 99%. Один из путей, позволяющих продемонстрировать, что конкретный белковый препарат содержит выделенный полипептид, заключается в выявлении одиночной полосы после электрофореза белкового препарата в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) и окрашивания геля кумасси бриллиантовым голубым. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид очищают до более чем 95% или 99% чистоты по данным, например, электрофоретического анализа (например, ДСН-ПААГ, изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или хроматографического анализа (например, ионообменной хроматографии или ЖХВР с обращенной фазой). Обзор методов оценки чистоты антитела представлен, например, у Flatman S. и др., J. Chromatogr. В 848, 2007, сс. 79-87. Однако понятие «выделенный» не исключает того, что тот же самый полипептид может находиться в различных физических формах, таких, например, как димеры, дериватизированные формы, формы с неправильной укладкой, формы с неправильными дисульфидными связями или «перемешанные» формы.
«Полипептид» представляет собой полимер, состоящий из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, который получен в естественных условиях или путем синтеза. Полипептиды, состоящие менее чем из примерно 20 аминокислотных остатков, обозначают как «пептиды». «Белок» представляет собой молекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей, из которых по меньшей мере одна содержит 100 или более аминокислотных остатков. Полипептиды и белок могут содержать также компоненты, не являющиеся аминокислотами, такие как углеводные группы. Углеводные группы и другие не являющиеся аминокислотами компоненты могут добавляться в клетке, которая продуцирует полипептид или белок, и они могут варьироваться в зависимости от типа клетки. В контексте настоящего описания полипептиды и белки определяют в понятиях структур их аминокислотных каркасов; при этом, как правило, заместители, такие как углеводные группы, не указывают, но, тем не менее, они могут присутствовать.
Способ, предлагаемый в настоящем изобретении
Одним из объектов изобретения, представленного в настоящем описании, является способ получения полипептида, заключающийся в том, что осуществляют стадию, на которой инкубируют прокариотические клетки в растворе, содержащем забуферивающий агент в концентрации, составляющей от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ, и хелатирующий агент в концентрации, составляющей от примерно 0,5 мМ до примерно 9,5 мМ, при значении pH, составляющем от примерно 7 до примерно 10, в течение периода времени от примерно 15 мин до примерно 6 ч.
Для рекомбинантного получения полипептида выделяют нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине.
Клетки-хозяева, пригодные для клонирования или экспрессии кодирующих полипептид векторов, включают прокариотические клетки, указанные в настоящем описании. Например, антитела можно получать в бактериях, прежде всего в тех случаях, когда не требуются гликозилирование и опосредуемая Fc эффекторная функция. Информация об экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях приведена, например, в US 5648237, US 5789199 и US 5840523 (см. также Charlton K.А., в: Methods in Molecular Biology, т. 248, под ред. Lo В.K.С., изд-во Humana Press, Totowa, NJ, 2003, сс. 245-254, где описана экспрессия фрагментов антител в Е. coli). После осуществления экспрессии антитело можно выделять из пасты бактериальных клеток в виде растворимой фракции и можно подвергать дополнительной очистке.
При создании настоящего изобретения было установлено, что рекомбинантно продуцируемый полипептид можно выделять из периплазмы прокариотической клетки путем приведения в контакт или инкубации клетки с раствором, содержащим забуферивающий агент (например, Трис) и хелатирующий агент (например, ЭДТК), при значении pH, составляющем примерно 8, и при комнатной температуре. Способ позволяет выделять рекомбинантно продуцируемый полипептид с высоким выходом и чистотой при осуществлении крупномасштабных процессов производства. Выделенный полипептид отличается высокой степенью пригодности для дальнейших процессов обработки (например, очистки).
С помощью способа, представленного в настоящем описании, периплазматические полипептиды высвобождают из клеток избирательно в отличие, например, от лизиса/механического разрушения целых клеток.
Кроме того, представленный в настоящем описании способ не требует присутствия гидролизующих пептидогликан ферментов, таких как лизоцим, т.е. способ осуществляют в отсутствии лизоцима или любого другого гидролизующего пептидогликан фермента, т.е. раствор практически не содержит лизоцим или другой гидролизующий пептидогликан фермент.
Кроме того, представленный в настоящем описании способ пригоден для получения чувствительных к температуре полипептидов.
Кроме того, представленный в настоящем описании способ не требует присутствия сахарозы или любого другого сахара, т.е. способ осуществляют в отсутствии сахарозы или любого другого сахара, т.е. раствор практически не содержит сахарозу или любой другой сахар.
В представленной ниже таблице приведены примеры выходов, которые могут быть достигнуты в различных условиях.
При инкубации в течение 16 ч в отсутствии ЭДТК может быть достигнут высокий выход белка (сравнительное условие 18).
При создании настоящего изобретения было установлено, что продолжительность инкубации можно уменьшать, если к инкубируемой смеси добавляют ЭДТК в низкой концентрации, например, ниже 10 мМ, например, 2 мМ или 4 мМ, или 6 мМ. В этих условиях в присутствии ЭДТК может быть достигнут выход, сопоставимый с выходом при инкубации в отсутствии ЭДТК.
Было установлено, что повышение температуры до уровня выше примерно 25°С приводит к снижению достигаемого выхода.
Было установлено, что снижение значения pH до уровня ниже примерно 8 (например, pH 6,8) приводит к снижению достигаемого выхода. Повышение значения pH может приводить к увеличению выхода.
Было установлено, что концентрация применяемого Трис-буфера должна быть ниже 100 мМ, например, ниже 50 мМ, например, должна составлять примерно 20 мМ.
Было установлено, что указанные результаты, полученные в условиях маломасштабного производства (выделяемый объем 150 мкл), могут быть перенесены на крупномасштабное выделение периплазматического белка из клеток, культивируемых в ферментерах. Это должно облегчать производство рекомбинантных белков для поставки на рынок.
В некоторых случаях для крупномасштабного получения может оказаться предпочтительным повышать концентрацию забуферивающего и хелатирующего агентов при уменьшении объемов буфера.
При создании настоящего изобретения было установлено, что с помощью способа, предлагаемого в изобретении, можно эффективно выделять представляющий интерес экспрессируемый в периплазму белок (см. фиг. 1).
В конкретных вариантах осуществления изобретения полипептид представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают (но не ограничиваясь только ими) Fab-, Fab'-, Fab'-SH-, F(ab')2-, Fv- и scFv-фрагменты, а также другие, описанные ниже фрагменты. Обзор, посвященный конкретным фрагментам антител, представлен у Hudson P.J. и др., Nat. Med. 9, 2003, cc. 129-134. Обзор, посвященный scFv-фрагментам, представлен, например, у Plueckthun А. в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1994, cc. 269-315; см. также WO 93/16185, а также US 5571894 и US 5587458. Обсуждение Fab- и F(ab')2-фрагментов, содержащих остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, и имеющих увеличенное время полужизни in vivo, см. в US 5869046.
Димерные антитела (диабоди) представляют собой фрагменты антител, имеющие два антигенсвязывающих центра, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, ЕР 0404097; WO 1993/01161; Hudson P.J. и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134; и Holliger Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 6444-6448). Трехмерные антитела (триабоди) и четырехмерные антитела (тетрабоди) описаны также у Hudson P.J. и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134.
Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи антитела или его часть, или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В конкретных вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (фирма Domantis Inc., Уолтэм, шт. Массачусетс; см., например, US 6248516 В1).
Фрагменты антител можно создавать различными методами, включая их производство рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli или фагом), как указано в настоящем описании.
Общие хроматографические методы и их применение известны специалисту в данной области (см., например, Chromatography, 5-е изд., часть А: Fundamentals and Techniques, под ред. Heftmann Е., изд-во Elsevier Science Publishing Company, New York, 1992; Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, под ред. Deyl Z., изд-во Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, 1998; Poole C.F. и Poole S.K., Chromatography Today, изд-во Elsevier Science Publishing Company, New York, 1991, Scopes Protein Purification: Principles and Practice, 1982; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, под ред. Sambrook J. и др., второе изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F.M. и др., изд-во John Wiley & Sons, Inc., New York; или Freitag R., Chromatographical processes in the downstream processing of (recombinant) proteins, Meth. Biotechnol. 24, 2007, cc. 421-453 (Animal cell biotechnology, 2-е изд.)).
Методы очистки полипептидов хорошо разработаны и широко применяются. Их применяют индивидуально или в комбинации. Такими методами являются, например, аффинная хроматография с использованием тиольных лигандов с комплексообразующими ионами металлов (например, с использованием Ni(II)- и Cu(II)-аффинного материала) или выведенных из микроорганизмов белков (например, аффинная хроматография с использованием белка А или белка G), ионообменная хроматография (например, катионообменная (с использованием карбоксиметильных смол), анионообменная (с использованием аминоэтильных смол) и ионообменная хроматография смешанного типа, тиофильная адсорбционная хроматография (например, с использованием бета-меркаптоэтанола и других SH-лигандов), хроматография гидрофобного взаимодействия или адсорбционная хроматография с использованием ароматических сорбентов (например, с использованием фенил-сефарозы, аза-аренофильных смол или мета-аминофенилбороновой кислоты), гель-фильтрация и препаративные электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi М.А., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, сс. 93-102).
Представленные ниже примеры, чертежи и последовательности даны для лучшего понимания настоящего изобретения, истинный объем которого определяется прилагаемой формулой изобретения. Следует иметь в виду, что в представленные процедуры могут быть внесены модификации без отклонения от сущности изобретения.
Примеры
Общий способ, представленный в настоящем описании
Ресуспендируют собранные клетки в 20 мМ Трис-HCl-буфере (pH 8);
Добавляют буфер, содержащий 20 мМ Трис-HCl-4 мМ ЭДТК в соотношении 1:1, (pH 8);
Инкубируют в течение 30 мин при 25°С при встряхивании;
Отделяют клетки от супернатанта, который содержит белки, присутствующие в периплазматическом пространстве.
Пример 1
Определение количества рекомбинантно продуцированного белка В данном примере описано определение количества представляющего интерес рекомбинантно продуцированного белка, который можно выделять из периплазматического пространства Е. coli с помощью различных методов.
Контрольная величина:
Лизат целых клеток, соответствующий 100% представляющего интерес белка, получали путем разрушения клеток без какой-либо предварительной обработки.
Количество образца:
Все методы осуществляли на клетках, содержащихся в культивируемом образце, количество которых соответствовало величинам оптической плотности ОП 3 (3/ОП = мл). Клетки получали путем центрифугирования.
Приготовление образца целых клеток для ДСН-ПААГ-анализа:
Добавляли 150 мкл ЗФР к клеткам, после чего добавляли 150 мкл содержащего ДСН буфера для приготовления образца. После нагревания до 95°С в течение 10 мин при встряхивании, 5 мкл вносили на ДСН-гель.
Приготовление образца клеточных экстрактов с помощью выделения из периплазматического пространства для ДСН-ПААГ-анализа
Клеточный дебрис ресуспендировали с использованием 150 мкл охлажденного на льду ТРИС-буфера с добавлением или без добавления ЭДТК.
Ресуспендированные клетки инкубировали при определенной температуре при встряхивании. После инкубации смесь центрифугировали при 10000×g в течение 10 мин.
Дебрис отбрасывали.
К супернатанту добавляли 150 мкл содержащего ДСН буфера для приготовления образца. После нагревания до 95°С в течение 10 мин при встряхивании, 5 мкл вносили на ДСН-гель.
Сравнительные используемые в эксперименте параметры и полученные результаты (серия 1):
Сравнительные используемые в эксперименте параметры и полученные результаты (серия 2):
Сравнительные используемые в эксперименте параметры и полученные результаты (серия 3):
Пример 2:
Крупномасштабное получение низкомолекулярного транспортного белка (α-синуклеина)
Клетки Е. coli, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую низкомолекулярный транспортный белок (α-синуклеин), культивировали в 10 л ферментере. После завершения культивирования собирали 9,52 л продукта с величиной ОП, измеренной при 578 нм, равной 78. Это соответствовало 817 г влажной массы клеток.
Из этого количества 110 г клеточного дебриса ресуспендировали в 5 л буфера для инкубации (20 мМ ТРИС, 2 мМ ЭДТК, pH 8). После инкубации в течение 30 мин при 25°С при перемешивании клетки отделяли от супернатанта, который содержал представляющий интерес белок из периплазматического пространства, путем центрифугирования при 4700 об/мин в течение 60 мин при 4°С.
Выход низкомолекулярного транспортного белка избирательно выделенного из периплазматического пространства, составлял 94,9%.
Было установлено, что с помощью способа, предлагаемого в изобретении, можно эффективно выделять экспрессируемый в периплазматическом пространстве представляющий интерес белок (см. фиг. 1).
Пример 3:
Крупномасштабное получение экзотоксина Pseudomonas (Nlys-PE25-LR8M)
Клетки Е. coli, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую экзотоксин Pseudomonas (Nlys-PE25-LR8M), культивировали и собирали согласно методу, описанному в примере 2.
106 г клеточного дебриса ресуспендировали в 5 л буфера для инкубации (20 мМ ТРИС, 2 мМ ЭДТК, pH 8). После инкубации в течение 30 мин при 25°С при перемешивании клетки отделяли от супернатанта, который содержал представляющий интерес белок из периплазматического пространства, путем центрифугирования при 4700 об/мин в течение 60 мин при 4°С.
Экзотоксин Pseudomonas избирательно выделяли из периплазматического пространства.
Было установлено, что с помощью способа, предлагаемого в изобретении, можно эффективно выделять из периплазматического пространства представляющий интерес белок (см. фиг. 2).
Claims (8)
1. Способ получения полипептида, рекомбинантно продуцируемого в периплазму прокариотическими клетками, включающий
- инкубирование прокариотических клеток в растворе, содержащем Трис в концентрации, составляющей от 10 мМ до 95 мМ и ЭДТК в концентрации от 2 мМ до 6 мМ, при значении рН, составляющем от 7 до 10, в течение периода времени от 15 мин до 6 ч при температуре от 20°С до 33°С,
где раствор практически свободен от гидролизующих пептидогликан ферментов и сахара.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что значение рН составляет примерно 8.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что продолжительность инкубации составляет примерно 30 мин.
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что концентрация Трис составляет примерно 20 мМ.
5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что прокариотическая клетка представляет собой грамотрицательную клетку.
6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что прокариотическая клетка представляет собой клетку E. coli.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP12184738.8 | 2012-09-17 | ||
| EP12184738 | 2012-09-17 | ||
| PCT/EP2013/068993 WO2014041116A1 (en) | 2012-09-17 | 2013-09-13 | Method for the production of polypeptides in the periplasm of prokaryotic cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015114092A RU2015114092A (ru) | 2016-11-10 |
| RU2644652C2 true RU2644652C2 (ru) | 2018-02-13 |
Family
ID=47115284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015114092A RU2644652C2 (ru) | 2012-09-17 | 2013-09-13 | Способ получения полипептидов в периплазме прокариотических клеток |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9926582B2 (ru) |
| EP (1) | EP2895497B1 (ru) |
| JP (1) | JP6325544B2 (ru) |
| KR (1) | KR20150056552A (ru) |
| CN (1) | CN104619716B (ru) |
| AU (1) | AU2013314264B2 (ru) |
| BR (1) | BR112015004415A2 (ru) |
| CA (1) | CA2880469A1 (ru) |
| IL (1) | IL237100A0 (ru) |
| MX (1) | MX2015003028A (ru) |
| RU (1) | RU2644652C2 (ru) |
| SG (1) | SG11201501191XA (ru) |
| WO (1) | WO2014041116A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201500792B (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3074718A1 (en) * | 2017-09-05 | 2019-03-14 | Scarab Genomics, Llc | Methods and compositions for improved expression of recombinant proteins |
| WO2022191223A1 (ja) * | 2021-03-10 | 2022-09-15 | 株式会社カネカ | 原核生物細胞から標的タンパク質を抽出する方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003059386A2 (en) * | 2002-01-18 | 2003-07-24 | Cytos Biotechnology Ag | Prion protein carrier-conjugates |
| WO2005017174A2 (en) * | 2003-08-13 | 2005-02-24 | Sandoz Ag | Process for the purification of recombinant polypeptides |
| RU2287574C2 (ru) * | 2000-12-14 | 2006-11-20 | Дженентек, Инк. | БАКТЕРИЯ Е.coli, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, И СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ПОЛИПЕПТИДА |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07184680A (ja) * | 1993-12-28 | 1995-07-25 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ペリプラズムタンパク質の回収法 |
| CA2362546C (en) * | 1999-02-16 | 2012-05-15 | Senesco, Inc. | Dna encoding a plant lipase, transgenic plants and a method for controlling senescence in plants |
| CN1137139C (zh) * | 2000-03-03 | 2004-02-04 | 上海复旦张江生物医药股份有限公司 | 重组淋巴毒素衍生物的生产工艺 |
| GB201001791D0 (en) * | 2010-02-03 | 2010-03-24 | Ucb Pharma Sa | Process for obtaining antibodies |
| RU2488635C1 (ru) | 2012-03-22 | 2013-07-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития | Способ получения рекомбинантного антиангиогенного полипептида |
-
2013
- 2013-09-13 CN CN201380047706.7A patent/CN104619716B/zh active Active
- 2013-09-13 RU RU2015114092A patent/RU2644652C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-09-13 KR KR1020157006657A patent/KR20150056552A/ko not_active Withdrawn
- 2013-09-13 CA CA2880469A patent/CA2880469A1/en not_active Abandoned
- 2013-09-13 BR BR112015004415A patent/BR112015004415A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2013-09-13 SG SG11201501191XA patent/SG11201501191XA/en unknown
- 2013-09-13 WO PCT/EP2013/068993 patent/WO2014041116A1/en not_active Ceased
- 2013-09-13 AU AU2013314264A patent/AU2013314264B2/en not_active Ceased
- 2013-09-13 MX MX2015003028A patent/MX2015003028A/es unknown
- 2013-09-13 EP EP13763039.8A patent/EP2895497B1/en active Active
- 2013-09-13 JP JP2015531568A patent/JP6325544B2/ja active Active
-
2015
- 2015-02-03 ZA ZA2015/00792A patent/ZA201500792B/en unknown
- 2015-02-05 IL IL237100A patent/IL237100A0/en unknown
- 2015-03-16 US US14/659,232 patent/US9926582B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2287574C2 (ru) * | 2000-12-14 | 2006-11-20 | Дженентек, Инк. | БАКТЕРИЯ Е.coli, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, И СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ПОЛИПЕПТИДА |
| WO2003059386A2 (en) * | 2002-01-18 | 2003-07-24 | Cytos Biotechnology Ag | Prion protein carrier-conjugates |
| WO2005017174A2 (en) * | 2003-08-13 | 2005-02-24 | Sandoz Ag | Process for the purification of recombinant polypeptides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104619716B (zh) | 2018-05-11 |
| RU2015114092A (ru) | 2016-11-10 |
| MX2015003028A (es) | 2015-06-10 |
| US9926582B2 (en) | 2018-03-27 |
| US20150275260A1 (en) | 2015-10-01 |
| BR112015004415A2 (pt) | 2017-07-04 |
| HK1210193A1 (en) | 2016-04-15 |
| EP2895497A1 (en) | 2015-07-22 |
| KR20150056552A (ko) | 2015-05-26 |
| CA2880469A1 (en) | 2014-03-20 |
| ZA201500792B (en) | 2016-01-27 |
| CN104619716A (zh) | 2015-05-13 |
| JP2015528477A (ja) | 2015-09-28 |
| AU2013314264B2 (en) | 2017-08-31 |
| AU2013314264A1 (en) | 2015-02-19 |
| WO2014041116A1 (en) | 2014-03-20 |
| JP6325544B2 (ja) | 2018-05-16 |
| SG11201501191XA (en) | 2015-04-29 |
| EP2895497B1 (en) | 2017-11-22 |
| IL237100A0 (en) | 2015-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2834967T3 (es) | Purificación de proteínas | |
| JP4011115B2 (ja) | 新規な融合蛋白回収および精製方法 | |
| KR20150113027A (ko) | 티오-헤테로시클릭 양이온들로 처리에 의한 단백질 제제 내의 응집체 레벨 감소를 위한 방법 | |
| KR20210005172A (ko) | 항체 발현을 최적화하는 방법 | |
| RU2644652C2 (ru) | Способ получения полипептидов в периплазме прокариотических клеток | |
| JP6807326B2 (ja) | タンパク質製造方法 | |
| US10329323B2 (en) | Method for purifying antibodies using PBS | |
| US9447171B2 (en) | Purification process for fragment antibodies | |
| HK1210193B (en) | Method for the production of polypeptides in the periplasm of prokaryotic cells | |
| US20210324001A1 (en) | New purification method | |
| JP5089924B2 (ja) | ＩｇＭ型抗体の精製方法、ＩｇＭ型抗体認識抗原の吸着材 | |
| WO2023285762A1 (fr) | Méthode de purification de glycoprotéines | |
| US20240092883A1 (en) | Methods of purifying ranibizumab or a ranibizumab variant | |
| JP6702984B2 (ja) | タンパク質の単離 | |
| HK1241388B (zh) | 蛋白质制造方法 | |
| HK1240956B (zh) | 蛋白质制造 | |
| Bothmann et al. | Improving Expression of scFv Fragments by Coexpression of Periplasmic Chaperones | |
| HK1241388A1 (en) | Method of protein manufacture |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180914 |