PL197407B1 - Komórka rośliny transgenicznej, roślina transgeniczna, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, materiał rozmnożeniowy rośliny, zastosowanie cząsteczek kwasu nukleinowego i sposób wytwarzania zmodyfikowanej skrobi - Google Patents

Abstract

1. Komórka ro sliny transgenicznej, która jest genetycznie zmodyfikowana, znamienna tym, ze modyfikacj a genetyczn a jest wprowadzenie cz asteczki obcego kwasu nukleinowego, który koduje plastydow a translokaz e ADP/ATP i którego ekspresja prowadzi do podwy zszenia aktywno sci plasty- dowej translokazy ADP/ATP, w porównaniu z odpowiadaj acymi niezmodyfikowanymi genetycznie komórkami ro slinnymi z ro slin typu dzikiego, przy czym komórka wspomnianej ro sliny transgenicznej wykazuje zwi ekszon a zawartosc skrobi w porównaniu z odpowiadaj acymi genetycznie niezmodyfiko- wanymi komórkami ro slinnymi i/lub syntetyzuje skrobi e wykazuj ac a podwy zszon a zawarto sc amylozy w porównaniu z odpowiadaj acymi genetycznie niezmodyfikowanymi komórkami ro slinnymi. PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	(12) OPIS PATENTOWY (19) PL	(11) 197407
	(21) Numet cgłksceeik: 344751	(13) B1
βΙβΙ	(22) Dktk cgłksceeik: 12.05.1999	(51) let.Cl.
UiząO Pkkeekown Rceycnpkspklikej Potokiej	(86) Dktk i eumet cgłksceeik mięOcnektkOkwegk: 12.05.1999, PCT/EP99/03292 (87) Dktk i eumet publikkcji cgłksceeik mięOcnektkOkwegk: 18.11.1999, WO99/58654 PCT Gazette zr 46/99	C12N 15/82 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01) C07K 14/415 (2006.01) C12N 15/28 (2006.01)

Komórka roślizy trazsgeziczzej, rośliza trazsgeziczza, sposób wytwarzazia roślizy (54) rrasggznizznej , materiałrozmnoezniowyrośliyy,zsstosowznie zząstczekk Wassu zukleizowego i sposób wytwarzazia zmodyfikowazej skrobi
(30) Pierwsceństwk:	(73) Uptkweioen c pkteetu: Bayer BioSciezce GmbH.,Poczdam,DE
13.05.1998,DE,19821442.1	(72) Twótckty) wneklkcku: Ekkehard Neuhaus,Oszabruck,DE Torstez Moehlmazz,Buzde,DE
(43) Zgłksceeie osłonc^o: 19.11.2001 BUP 24/01	Karl-Heizz Graeve-Kampfezkel,MaizzKostheim,DE
(45) O uOcieleeiu pkteetu ostancno: 31.03.2008 WUP 03/08	Joachim Tjadez,Oszabruck,DE Jozef Schell,Kolz,DE Norbert Martizi,Kolz,DE (74) Pełekmkyeik: Urszula Bartzik, POLSERVICE, Kazcelaria Rzeczzików Pateztowych Sp. z o.o.

(57) 1. Komórka rośliny transgenicznej, która jest genetycznie zmodyfikowana, znamienna tym, że mrOnfikkcją seeetycceą jenk wptrwkOcezie ycąnkeycki obcego kwrnu zukleierwesr, który krOuje plknSnOrwą ktkznlrkkcę ADP/ATP i którego eknptesjk ptrwkOci Ok prOwyżncezik kktyweoóci plkntyOrwej Stkenlokkcn ADP/ATP, w potówekeiu c kOpowikOkjącnmi eiecmoOnfikkwkenmi seeetycceie komótkkmi toólieenmi c toólie typu Ocikieso, ptzn ccnm komótkk wnpomeikeej toólien ktkznseeicceej wnkkcuje cwiękncoeą ckwkrtoóć nktobi w potówekeiu c oOpowikOkjącnmi seeetycceie eiecmoOnfikowkenmi komótkkmi toólieenmi i/lub nneketycuje nktobię wnkkcującą poOwnżncoeą ckwkrtoóć kmnlocn w potówekeiu c oOpowikOkjącnmi seeetycceie eiecmoOnfikowkenmi komótkkmi toólieenmi.

PL 197 407 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest komórka rośliny transgenicznej, roślina transgeniczna, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, materiał rozmnożeniowy rośliny, zastosowanie cząsteczek kwasu nukleinowego i sposób wytwarzania zmodyfikowanej skrobi.

Transgeniczne komórki i rośliny według wynalazku mają zwiększoną aktywność plastydową translokazy ADP/ATP. Takie komórki i rośliny wykazują podwyższoną wydajność, korzystnie podwyższoną zawartość skrobi oraz korzystnie syntetyzują skrobię o podwyższonej zawartości amylozy.

W dziedzinie rolnictwa i leśnictwa podejmuje się ciągłe starania dostarczenia roślin o podwyższonej wydajności, w szczególności w celu zapewnienia dostarczania żywności dla ciągle rosnącej populacji na świecie oraz zagwarantowania odnawialności surowców. Tradycyjnie próbowano uzyskiwać wysokowydajne rośliny przez hodowlę. Jednakże jest to czasochłonne i kosztowne. Ponadto, związane z tym programy hodowlane muszą być prowadzone dla każdego odpowiedniego gatunku rośliny.

Postępu dokonano, częściowo, dzięki manipulacjom genetycznym roślin, tj. dzięki celowemu wprowadzaniu i ekspresji zrekombinowanych cząsteczek kwasów nukleinowych w roślinach. Podejścia tego rodzaju mają, ogólnie rzecz biorąc tę zaletę, że nie ograniczają się do jednego gatunku rośliny, ale można je przenosić również na inne gatunki roślin.

W europejskim zgłoszeniu patentowym numer EP 0 511 979 opisano na przykład, że ekspresja prokariotycznej syntetazy asparaginowej w komórkach roślinnych prowadzi między innymi do zwiększenia produkcji biomasy. Publikacja międzynarodowa numer WO 96/21737 opisuje na przykład wzrost wydajności roślin w wyniku ekspresji deregulowanej lub nieregulowanej fruktozo-1,6-bis-fosfatazy w wyniku wzrostu szybkości fotosyntezy. Nie mniej jednak, ciągle występuje zapotrzebowanie na sposoby ogólnego stosowania do poprawy wydajności roślin w dziedzinach rolnictwa lub leśnictwa.

Ponadto, biorąc pod uwagę fakt, że substancje zawarte w roślinach odgrywają coraz większą rolę jako odnawialne źródła surowców, jednym z problemów w badaniach biotechnologicznych jest dostosowanie surowców roślinnych do wymagań przemysłu przetwórczego. W celu umożliwienia stosowania surowców odnawialnych w tak wielu dziedzinach, jak to możliwe, konieczne jest ponadto uzyskiwanie szerokiego zakresu substancji. Ponadto, konieczne jest podwyższanie wydajności pod względem zawartości tych substancji w roślinach w celu zwiększania skuteczności wytwarzania odnawialnych źródeł surowców pochodzących z roślin.

Oprócz tłuszczów i białek, zasadniczymi odnawialnymi surowcami roślinnymi są oleje i polisacharydy. Główną rolę wśród polisacharydów, poza celulozą, odgrywa skrobia, która jest jedną z najważniejszych substancji zapasowych w roślinach wyższych. Spośród tych roślin, szczególnie ziemniak i kukurydza są roślinami godnymi zainteresowania, ponieważ są one ważnymi roślinami uprawnymi do produkcji skrobi. Polisacharyd - skrobia, który jest jedną z najważniejszych substancji zapasowych w świecie roślin, poza swoim zastosowaniem w przemyśle spożywczym, jest szeroko stosowana jako odnawialny surowiec do produkcji produktów przemysłowych.

Przemysł skrobiowy jest bardzo zainteresowany roślinami o podwyższonej zawartości skrobi, co z reguły oznacza podwyższoną suchą masę. Podwyższona sucha masa podnosi wartość roślin przetwarzanych w przemyśle skrobiowym (kukurydzy, ziemniaka, tapioki, pszenicy, jęczmienia, ryżu itp.) ze względu na zwiększoną wydajność skrobi. Dodatkowo, komórki i organy roślinne zawierające wyższe ilości skrobi posiadają zalety pod względem przetwarzania w przemyśle spożywczym, ponieważ wchłaniają mniej tłuszczu i oleju do smażenia, dając „zdrowsze” produkty o obniżonej kaloryczności. Właściwość ta jest bardzo istotna na przykład przy produkcji prażonej kukurydzy, płatków kukurydzianych z kukurydzy lub chipsów, frytek bądź naleśników ziemniaczanych z ziemniaków.

Dla przemysłu przetwarzającego skrobię ziemniaczaną sucha masa (zawartość skrobi) jest parametrem o krytycznym znaczeniu, ponieważ determinuje ona koszty przetwarzania. Zwiększona sucha masa (zawartość skrobi) oznacza, że przy tej samej wydajności zbiorów, zawartość wody w bulwach ziemniaczanych jest obniżona. Obniżona zawartość wody prowadzi do zmniejszenia kosztów transportu i skracania dokładnie określanego czasu koniecznego do gotowania.

Dlatego też, wydaje się pożądane zapewnienie komórek roślinnych i roślin wykazujących podwyższoną zawartość skrobi, jak również sposobów wytwarzania takich komórek roślinnych i roślin.

Ponadto, pożądanym jest dostarczenie skrobi, w których zawartość amylozy i amylopektyny spełnia wymagania przemysłu przetwórczego. W tym kontekście, zarówno skrobie o podwyższonej zawartości amylozy, jak i skrobie o obniżonej zawartości amylozy są przedmiotem zainteresowania, ponieważ oba ich rodzaje są szczególnie odpowiednie do określonych zastosowań.

PL 197 407 B1

A zatem, problemem stanowiącym podstawę niniejszego wynalazku jest zapewnienie komórek roślinnych i roślin, które w porównaniu z odpowiadającymi niezmodyfikowanymi komórkami roślinnymi typu dzikiego i roślinami typu dzikiego wykazują podwyższoną wydajność, korzystnie pod względem oleju i/lub skrobi, i/lub syntetyzują skrobię o zmodyfikowanej zawartości amylozy.

A zatem, niniejszy wynalazek dotyczy komórki rośliny transgenicznej, która jest genetycznie zmodyfikowana i charakteryzującej się tym, że modyfikacją genetyczną jest wprowadzenie cząsteczki obcego kwasu nukleinowego, który koduje plastydową translokazę ADP/ATP i którego ekspresja prowadzi do podwyższenia aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP, w porównaniu z odpowiadającymi niezmodyfikowanymi genetycznie komórkami roślinnymi z roślin typu dzikiego, przy czym komórka wspomnianej rośliny transgenicznej wykazuje zwiększoną zawartość skrobi w porównaniu z odpowiadającymi genetycznie niezmodyfikowanymi komórkami roślinnymi i/lub syntetyzuje skrobię wykazującą podwyższoną zawartość amylozy w porównaniu z odpowiadającymi genetycznie niezmodyfikowanymi komórkami roślinnymi.

Korzystnie, komórka rośliny transgenicznej charakteryzuje się tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego koduje plastydową translokazę ADP/ATP z Arabidopsis thaliana.

Następnym przedmiotem wynalazku jest roślina transgeniczna, która zawiera komórki rośliny transgenicznej według wynalazku, jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie jest to roślina transgeniczna magazynująca skrobię, a bardziej korzystnie rośliną tą jest kukurydza, pszenica lub ziemniak.

Kolejno, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny transgenicznej wykazującej podwyższoną zawartość skrobi w porównaniu z roślinami typu dzikiego i/lub, której skrobia wykazuje zwiększoną zawartość amylozy w porównaniu ze skrobią z roślin typu dzikiego, polegający na tym, że komórkę roślinną modyfikuje się genetycznie poprzez wprowadzenie cząsteczki obcego kwasu nukleinowego, który koduje plastydową translokazę ADP/ATP i którego ekspresja prowadzi do podwyższenia aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP w komórce (etap a); następnie w etapie (b) regeneruje się roślinę z komórki wytworzonej zgodnie z etapem (a); oraz ewentualnie w etapie (c) wytwarza się rośliny z roślin wytworzonych zgodnie z etapem (b).

Przedmiotem wynalazku jest również materiał rozmnożeniowy rośliny, charakteryzujący się tym, że zawiera komórki transgeniczne według wynalazku, jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących plastydową translokazę ADP/ATP, do wytwarzania roślin transgenicznych wykazujących podwyższoną zawartość skrobi i/lub syntetyzujących skrobię wykazującą zwiększoną zawartość amylozy w porównaniu ze skrobią z roślin typu dzikiego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zmodyfikowanej skrobi, który obejmuje ekstrakcję skrobi z rośliny według wynalazku lub z materiału rozmnożeniowego według wynalazku.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem modyfikacją genetyczną może być jakakolwiek modyfikacja genetyczna prowadząca do podwyższenia aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP. Jedną możliwością, na przykład, jest tak zwana „aktywacja in situ’’, gdzie genetyczną modyfikacją jest zmiana regionów regulujących endogennych genów translokazy ADP/ATP, która prowadzi do podwyższenia ekspresji wspomnianych genów. Można to osiągnąć, na przykład, przez wprowadzenie bardzo silnego promotora przed odpowiednimi genami, np. przez rekombinację homologiczną.

Ponadto, istnieje możliwość stosowania metody tak zwanej „aktywacji przez element dodatkowy” (np. Walden i in., Plant J. (1991), 281-288; Walden i in., Plant Mol. Biol. 26 (1994), 1521-1528). Metoda ta opiera się na aktywacji endogennych promotorów za pomocą elementów wzmacniających, takich jak sekwencja wzmacniająca promotora 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora lub sekwencja wzmacniająca syntazy oktopinowej. W korzystnym rozwiązaniu modyfikacja genetyczna obejmuje, jednakże, wprowadzenie cząsteczki obcego kwasu nukleinowego, kodującego plastydową translokazę ADP/ATP, do genomu komórki roślinnej.

Dlatego też, termin „transgeniczna” oznacza, że komórka roślinna według wynalazku zawiera co najmniej jedną cząsteczkę obcego kwasu nukleinowego, kodującego plastydową translokazę ADP/ATP, w stabilny sposób zintegrowaną z genomem, korzystnie cząsteczkę kwasu nukleinowego.

Termin „cząsteczka obcego kwasu nukleinowego” korzystnie oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje białko wykazujące aktywność biologiczną plastydowej translokazy ADP/ATP i albo nie występuje naturalnie w odpowiadających komórkach roślinnych, albo nie występuje naturalnie w dokładnie tym samym uporządkowaniu przestrzennym, albo która jest położona w miejscu genomu komórki roślinnej, w którym naturalnie nie występuje.

PL 197 407 B1

Korzystnie, cząsteczka obcego kwasu nukleinowego jest cząsteczką zrekombinowaną, która składa się z różnych elementów, których kombinacja lub określone uporządkowanie przestrzenne nie występuje naturalnie w komórce roślinnej. Roślinne komórki transgeniczne według wynalazku zawierają co najmniej jedną cząsteczkę obcego kwasu nukleinowego, kodującą białko wykazujące biologiczną aktywność plastydowej translokazy ADP/ATP, przy czym ta cząsteczka kwasu nukleinowego jest korzystnie połączona z regulującymi elementami DNA zapewniającymi transkrypcję w komórkach roślinnych, w szczególności z promotorem.

Zasadniczo, cząsteczką obcego kwasu nukleinowego może być każda cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego translokazę ADP/ATP, która, po ekspresji, zlokalizowana jest w wewnętrznej błonie plastydów. W tym kontekście, plastydowa translokaza ADP/ATP jest białkiem katalizującym transport ATP do plastydów i ADP z plastydów. Takie cząsteczki kwasu nukleinowego są znane, na przykład, z Arabidopsis thaliana (Kampfenkel i in., FEBS Lett. 374 (1995), 351-355; numery dostępu w Genebank K94626 i Z49227) lub z ziemniaka (numer dostępu w Genebank Y10821). Za pomocą takich znanych cząsteczek kwasu nukleinowego, specjalista w tej dziedzinie może, zgodnie ze standardowymi metodami, na przykład przeszukiwania heterologiczną sondą, wyizolować odpowiadające sekwencje z innych organizmów, szczególnie organizmów roślinnych. W szczególności, można także stosować nie roślinne cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują translokazę ADP/ATP i są połączone z sekwencją kierującą, zapewniającą lokalizację w wewnętrznej błonie plastydu. W tym kontekście, na przykład, znana jest translokaza ADP/ATP z Rickettsia prowazekii (Williamson i in., Gene 80 (1989), 269-278) oraz Chlamydia trachomatis. W korzystnym rozwiązaniu, cząsteczka obcego kwasu nukleinowego koduje plastydową translokazę ADP/ATP z Arabidopsis thaliana, w szczególności białko AATP1 opisane w Kampfenkel i in. (1995, loc. cit.).

Komórki według wynalazku można odróżnić od naturalnie występujących komórek roślinnych, między innymi dzięki temu, że zawierają one cząsteczkę obcego kwasu nukleinowego, która nie występuje naturalnie w tych komórkach, bądź dzięki temu, że wspomniana cząsteczka jest zintegrowana z genomem w takim miejscu, w którym normalnie nie występuje, tj. w innym otoczeniu genomowym. Ponadto, komórki rośliny transgenicznej według wynalazku można odróżniać od naturalnie występujących komórek roślinnych dzięki temu, że zawierają one co najmniej jedną kopię cząsteczki obcego kwasu nukleinowego w stabilny sposób zintegrowaną z ich genomem, ewentualnie jako dodatek do kopii wspomnianej naturalnie występującej w komórkach cząsteczki. Jeśli cząsteczka(ki) kwasu nukleinowego wprowadzona(ne) do komórek jest (są) dodatkową(wymi) kopią(kopiami) cząsteczek naturalnie występujących w komórkach, to komórki według wynalazku można odróżnić od naturalnie występujących komórek roślinnych szczególnie dzięki temu, że ta (te) dodatkowa(we) kopia(ie) jest(są) położona(ne) w takim miejscu w genomie, w którym nie występuje(ją) ona(one) naturalnie. Można to, na przykład określać poprzez analizę techniką blottingu Southern.

Komórki roślinne według wynalazku można ponadto korzystnie odróżniać od naturalnie występujących komórek roślinnych dzięki co najmniej jednej z następujących cech: jeśli cząsteczka kwasu nukleinowego jest heterologiczna w stosunku do komórki roślinnej, komórki roślin transgenicznych wykazują obecność transkryptów wprowadzonych cząsteczek kwasu nukleinowego, które można wykryć przez na przykład analizę przez blotting typu Northern. Korzystnie, komórki roślinne według wynalazku zawierają białko, które jest kodowane przez wprowadzoną cząsteczkę kwasu nukleinowego. Można je wykrywać np. metodami immunologicznymi, szczególnie poprzez analizę przez blotting typu Western. Jeśli cząsteczka kwasu nukleinowego jest homologiczna w stosunku do komórki roślinnej, komórki według wynalazku można odróżniać od naturalnie występujących komórek, na przykład dzięki dodatkowej ekspresji wprowadzonych obcych cząsteczek kwasu nukleinowego. Korzystnie, komórki roślin transgenicznych zawierają więcej transkryptów cząsteczek obcego kwasu nukleinowego. Można je wykrywać poprzez np. analizę przez blotting typu Northern.

Termin „genetycznie zmodyfikowana” oznacza, że komórka roślinna została zmodyfikowana pod względem swojej informacji genetycznej przez wprowadzenie cząsteczki obcego kwasu nukleinowego oraz, że obecność lub ekspresja cząsteczki obcego kwasu nukleinowego prowadzi do zmiany fenotypowej. W tym kontekście, zmiana fenotypowa oznacza, korzystnie, dającą się zmierzyć zmianę jednej lub więcej funkcji komórki. Na przykład, genetycznie zmodyfikowane komórki roślinne według wynalazku wykazują wzrost aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP w wyniku występowania, lub po ekspresji wprowadzonej cząsteczki obecnego kwasu nukleinowego.

PL 197 407 B1

W niniejszym wynalazku, termin „podwyższona aktywność” oznacza zwiększenie ekspresji genu plastydowej translokazy ADP/ATP, zwiększenie ilości białka będącego plastydową translokazą ADP/ATP i/lub zwiększenie aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP w komórkach.

Podwyższenie ekspresji można, na przykład, określić przez pomiar ilości transkryptów kodujących translokazę ADP/ATP, na przykład poprzez analizę przez blotting typu Northern. W tym kontekście, podwyższenie korzystnie oznacza wzrost ilości transkryptów w porównaniu z odpowiadającymi, genetycznie niezmodyfikowanymi komórkami o co najmniej 10%, korzystnie o co najmniej 20%, szczególnie o co najmniej 50%, a szczególnie korzystnie o co najmniej 75%. Wzrost ilości białka będącego translokazą ADP/ATP można, na przykład, określać poprzez analizę przez blotting typu Western. W tym kontekście, wzrost korzystnie oznacza wzrost ilości białka będącego translokazą ADP/ATP w porównaniu z odpowiadającymi, genetycznie niezmodyfikowanymi komórkami o co najmniej 10%, korzystnie o co najmniej 20%, szczególnie o co najmniej 50%, a szczególnie korzystnie o co najmniej 75%.

Aktywność plastydowej translokazy ADP/ATP można określać, na przykład, przez izolowanie plastydów z odpowiedniej tkanki i określanie wartości V_max transportu ATP do wewnątrz metodą sączenia z olejem silikonowym. Oczyszczanie różnych rodzajów plastydów opisano np. w Neuhaus i in. (Biochem. J. 296 (1993), 395-401). Metodę filtracji z olejem silikonowym opisano np. w Quick i in. (Plant Physiol. 109 (1995), 113-121).

Nieoczekiwanie stwierdzono, że dla roślin zawierających komórki roślinne o podwyższonej aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP wydajność zawartości substancji i/lub biomasy jest zwiększona w porównaniu z odpowiadającymi niezmodyfikowanymi roślinami typu dzikiego. Stwierdzono, na przykład, że zawartość oleju i/lub zawartość skrobi w roślinach według wynalazku jest podwyższona i/lub również zawartość amylozy w tych skrobiach jest podwyższona w porównaniu z niezmodyfikowanymi roślinami typu dzikiego.

W tym kontekście, termin „roślina typu dzikiego” odnosi się do roślin, które służą jako materiał wyjściowy do tworzenia opisanych roślin, to jest roślin, których informacja genetyczna, poza wprowadzonymi modyfikacjami genetycznymi, jest identyczna z informacją genetyczną rośliny według wynalazku.

Termin „podwyższona wydajność” oznacza, że część zawartych substancji, korzystnie skrobi lub oleju, w komórkach roślinnych według wynalazku jest podwyższona o co najmniej 10%, korzystnie o co najmniej 20%, korzystniej o co najmniej 30%, a najkorzystniej o około 40% w porównaniu z komórkami roślinnymi niezmodyfikowanych roślin typu dzikiego.

Termin „podwyższona zawartość skrobi” oznacza, że zawartość skrobi w komórkach roślinnych według wynalazku jest podwyższona o co najmniej 10%, korzystnie o co najmniej 20%, korzystniej o co najmniej 30%, a najkorzystniej o około 40% w porównaniu z komórkami roślinnymi niezmodyfikowanych roślin typu dzikiego.

Określanie zawartości skrobi przeprowadza się zgodnie ze sposobami opisanymi w dołączonych przykładach.

Termin „podwyższona zawartość amylozy” oznacza, że zawartość amylozy w skrobi syntetyzowanej w komórkach roślinnych według wynalazku jest podwyższona o co najmniej 10%, korzystnie o co najmniej 20%, korzystniej o co najmniej 30%, a najkorzystniej o około 40% w porównaniu z komórkami roślinnymi niezmodyfikowanych roślin typu dzikiego.

Zawartość amylozy określa się sposobami opisanymi w dołączonych przykładach.

Jak wspomniano powyżej, plastydowa translokaza ADP/ATP jest białkiem transportującym, które zlokalizowane jest w błonie wewnętrznej plastydów (Heldt i in., FEBS Lett. 5 1969), 11-14; Pozueta-Romero i in., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88 (1991), 5769-5773; Neuhaus, Plant Physiol. 101 (1993) 573-578; Schunemann i in., Plant Physiol. 103 (1993), 131-137) i które katalizuje transport ATP do plastydów i ADP z plastydów. A zatem, plastydowa translokaza ADP/ATP dostarcza cytozolowy ATP do stromy.

Kampfenkel i in. (FEBS Lett. 374 (1995), 351-355) jako pierwsi wyizolowali cDNA kodujący translokazę ADP/ATP (AATP1) z Arabidpsis thaliana (Neuhaus i in., Plant J. 11 (1997), 73-82), która wykazuje wysokie podobieństwo (66,2%) do translokazy ADP/ATP z Gram-ujemnej bakterii Rickettsia prowazekii. cDNA AATP1 z A. thaliana koduje silnie hydrofobowe białko składające się z 589 aminokwasów, które zawiera 12 przypuszczalnych helis transbłonowych (Kampfenkel i in., FEBS Lett. 374 (1995), 351-355). Wspomniany cDNA może ulegać ekspresji w funkcjonalnej postaci w drożdżach piekarniczych i E. coli. Po ekstrakcji białka i rekonstytucji w proteoliposomach można oznaczyć wzrost

PL 197 407 B1 szybkości transportu ATP (Neuhaus i in., Plant J. 11 (1997), 73-82). Za pomocą przeciwciał skierowanych przeciw fragmentowi peptydowemu AATP1 z A. thaliana można wykazać, że translokaza ADP/ATP AATP1 jest zlokalizowana w błonie wewnętrznej chloroplastów (Neuhaus i in., Plant J. 11 (1997), 73-82).

Nie udało się dotąd jednoznacznie wyjaśnić funkcji plastydowej translokazy ADP/ATP w metabolizmie roślin. Brano pod uwagę różne funkcje, np. to, że zaopatrzenie stromy w cytozolowy ATP może mieć wpływ na transport białek do plastydów, biosyntezę aminokwasów, metabolizm kwasów tłuszczowych lub metabolizm skrobi (Fliigge i Hinz, Eur. J. Biochem. 160 (1986), 563-570; Tetlow i in. Planta 194 (1994), 454-460; Hill i Smith, Planta 185 (1991), 91-96; Kleppinger-Sparace i in., Plant Physiol. 98 (1992), 723-727).

Jednakże fakt, że wzrost aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP prowadzi do wzrostu zawartości skrobi w roślinach transgenicznych był zupełnie nieoczekiwany. Równie zaskakujące było odkrycie, że wzrost aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP miał wpływ na skład molekularny wytwarzanej skrobi. Na przykład, skrobia z bulw roślin ziemniaków według wynalazku wykazuje podwyższoną zawartość amylozy w porównaniu ze skrobią z bulw nie transformowanych roślin ziemniaków.

Dotychczas zakładano, że molekularne właściwości skrobi są całkowicie zdeterminowane przez oddziaływania enzymów syntetyzujących skrobię, takich jak enzymy rozgałęziające (E.C. 2.4.1.18), syntetazy skrobi (E.C. 2.4.1.21) i ADP-glukozopirofosforylaza (E.C. 2.7.7.27). Jednakże fakt, że ekspresja plastydowego białka transportującego wpływa na strukturę skrobi był zupełnie nieoczekiwany.

Komórki roślinne według wynalazku mogą pochodzić z jakiegokolwiek gatunku roślinnego, tj. zarówno z roślin jednoliściennych, jak i dwuliściennych. Korzystnie, komórki roślinne pochodzą od roślin uprawnych, tj. z roślin uprawianych przez człowieka jako żywność lub do celów technicznych, szczególnie do celów przemysłowych. Zasadniczo, korzystne są komórki roślin syntetyzujących olej i/lub skrobię lub z roślin magazynujących olej i/lub skrobię. A zatem, wynalazek korzystnie dotyczy komórek roślin syntetyzujących skrobię lub magazynujących skrobię, takich jak zboża (żyto, jęczmień, owies, pszenica, proso, sago itp.), ryż, groch, kukurydza, groszek, kasawa, ziemniaki, rzepak, soja, konopie, len, słoneczniki lub warzywa (pomidory, cykoria, ogórki, sałata). Korzystne są ziemniaki, słonecznik, soja i ryż. Szczególnie korzystne są kukurydza, pszenica, rzepak i ryż.

Ponadto, przedmiotem wynalazku są rośliny transgeniczne zawierające opisane powyżej transgeniczne komórki roślinne. Rośliny te można tworzyć na przykład przez regenerację z komórek roślinnych według wynalazku. Roślinami transgenicznymi mogą być, w zasadzie, rośliny jakiegokolwiek gatunku, tj. zarówno rośliny jednoliścienne, jak i dwuliścienne. Korzystne są rośliny użytkowe, tj. rośliny uprawiane przez człowieka jako żywność lub do celów technicznych, szczególnie do celów przemysłowych. Roślinami tymi mogą być rośliny syntetyzujące olej i/lub skrobię lub magazynujące olej i/lub skrobię. Wynalazek dotyczy korzystnie takich roślin, jak zboża (żyto, jęczmień, owies, pszenica, proso, sago itp.), ryż, groch, kukurydza, groszek, kasawa, ziemniaki, rzepak, soja, konopie, len, słoneczniki lub warzywa (pomidory, cykoria, ogórki, sałata). Korzystne są ziemniaki, słonecznik, soja i ryż. Szczególnie korzystne są kukurydza, pszenica, rzepak i ryż.

Jak wspomniano powyżej, nieoczekiwanie stwierdzono, że w roślinach magazynujących skrobię, zawierających komórki roślinne według wynalazku o podwyższonej aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP, wzrosła zawartość skrobi w porównaniu z roślinami typu dzikiego i/lub wzrosła również zawartość amylozy w skrobi tych roślin w porównaniu z odpowiadającymi im niezmodyfikowanymi roślinami typu dzikiego.

A zatem, w korzystnym rozwiązaniu, niniejszy wynalazek dotyczy także roślin magazynujących skrobię, które zawierają komórki roślinne według wynalazku i które wykazują podwyższoną zawartość skrobi w porównaniu z niezmodyfikowanymi roślinami typu dzikiego i/lub podwyższoną zawartość amylozy w rzeczonej skrobi w porównaniu z odpowiadającymi im niezmodyfikowanymi roślinami typu dzikiego.

Termin „rośliny magazynujące skrobię” obejmuje wszystkie rośliny posiadające tkanki magazynujące skrobię, takie jak kukurydza, pszenica, ryż, ziemniaki, żyto, jęczmień i owies. Korzystne są ryż, jęczmień i ziemniaki. Szczególnie korzystne są kukurydza i pszenica.

W tym kontekście, terminy wzrost „wydajności” („podwyższona wydajność”), wzrost zawartości skrobi („podwyższona zawartość skrobi”), wzrost zawartości amylozy („podwyższona zawartość amylozy) i „roślina typu dzikiego” stosuje się zgodnie ze znaczeniami powyższych definicji i w tych samych znaczeniach stosuje się je również w poniższych rozwiązaniach wynalazku. Termin „podwyżPL 197 407 B1 szona wydajność” korzystnie oznacza wzrost produkcji zawartych substancji i/lub biomasy, w szczególności jeśli mierzy się ją poprzez mokrą masę na roślinę.

Wzrost wydajności dotyczy części roślin, które można zbierać, takich jak nasiona, owoce, korzenie spichrzowe, korzenie, bulwy, kwiaty, pączki, pędy, łodygi lub drewno.

Wzrost wydajności może wynosić co najmniej 3% w odniesieniu do biomasy i/lub zawartych substancji, w porównaniu z odpowiadającymi nie transformowanymi roślinami o tym samym genotypie, jeśli rośliny hoduje się w takich samych warunkach, korzystnie co najmniej 10%, korzystniej co najmniej 20%, a najkorzystniej co najmniej 30% lub nawet 40%, w porównaniu z roślinami typu dzikiego.

Rośliny według wynalazku posiadają, w porównaniu z innymi roślinami syntetyzującymi skrobię o podwyższonej zawartości amylozy, takimi jak mutanty kukurydzy amylose-extender i dull między innymi tę zaletę, że poza wzrostem zawartości amylozy wykazują nie obniżoną, ale nawet podwyższoną zawartość skrobi.

Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto sposobu tworzenia roślin transgenicznych, które w porównaniu z roślinami typu dzikiego wykazują podwyższoną zawartość skrobi i/lub których skrobia wykazuje podwyższoną zawartość amylozy w porównaniu z odpowiadającymi im roślinami typu dzikiego, w którym: (a) komórkę roślinną modyfikuje się genetycznie przez wprowadzenie cząsteczki obcego kwasu nukleinowego i modyfikacja genetyczna prowadzi do zwiększenia aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP; (b) z komórki regeneruje się roślinę; oraz ewentualnie (c) z rośliny tej tworzy się kolejne rośliny zgodnie z (b). Modyfikacji wprowadzanej do komórki roślinnej według etapu (a) dotyczy to samo, co dyskutowano powyżej w odniesieniu do komórek roślinnych i roślin według wynalazku. Regenerację roślin według etapu (b) można przeprowadzić zgodnie z metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie.

Utworzenie kolejnych roślin według etapu (c) sposobów według wynalazku można osiągnąć przez rozmnażanie wegetatywne (na przykład przez sadzonki, bulwy lub hodowle kalusowe i regenerację całych roślin) lub przez rozmnażanie płciowe.

Korzystnie, rozmnażanie płciowe prowadzi się w sposób kontrolowany, tj. wybrane rośliny o określonych właściwościach krzyżuje się między sobą i rozmnaża.

Niniejszy wynalazek dotyczy także roślin, które można otrzymać sposobem według wynalazku.

Niniejszy wynalazek dotyczy również materiału rozmnożeniowego roślin według wynalazku oraz roślin transgenicznych uzyskanych sposobami według wynalazku, które zawierają genetycznie zmodyfikowane komórki według wynalazku. W tym kontekście, termin materiał rozmnożeniowy obejmuje te części rośliny, które są odpowiednie do tworzenia roślin potomnych na drodze wegetatywnej lub płciowej. Do rozmnażania wegetatywnego odpowiednie są, na przykład, sadzonki, hodowle kalusowe, kłącza i bulwy. Inne materiały rozmnożeniowe obejmują, na przykład, owoce, nasiona, siewki, protoplasty, hodowle komórkowe itp. Korzystnie, materiałem rozmnożeniowym są bulwy, a szczególnie korzystnie nasiona.

Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto zastosowania cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących plastydową translokazę ADP/ATP do tworzenia roślin, które, w porównaniu z roślinami typu dzikiego, wykazują podwyższoną zawartość skrobi w tkance wytwarzającej i/lub magazynującej skrobię, bądź do tworzenia roślin wytwarzających skrobię, która, w porównaniu ze skrobią z roślin typu dzikiego, wykazuje podwyższoną zawartość amylozy. Korzystnie, stosuje się cząsteczki kwasu nukleinowego wymienione powyżej w odniesieniu do komórek według wynalazku.

Termin „transgeniczny” w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie oznacza, że komórki roślinne według wynalazku różnią się pod względem informacji genetycznej od odpowiadających im niezmodyfikowanych komórek roślinnych w wyniku modyfikacji genetycznej, szczególnie wprowadzenia cząsteczki obcego kwasu nukleinowego.

W tym kontekście, termin „zmodyfikowany genetycznie” oznacza, że komórka roślinna została zmodyfikowana pod względem informacji genetycznej w wyniku wprowadzenia cząsteczki obcego kwasu nukleinowego oraz że obecność lub ekspresja cząsteczki obcego kwasu nukleinowego prowadzi do zmiany fenotypowej. Zmiana fenotypowa korzystnie oznacza mierzalną zmianę jednej lub więcej funkcji komórki. Na przykład, genetycznie zmodyfikowane komórki roślinne według wynalazku wykazują obniżenie aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP.

Można także utworzyć komórki roślinne o obniżonej aktywności translokazy ADP/ATP. Można to osiągnąć różnymi metodami znanymi specjaliście w tej dziedzinie, np. metodami prowadzącymi do hamowania ekspresji endogennych genów kodujących plastydową translokazę ADP/ATP. Takie metody obejmują, na przykład, ekspresję odpowiadającego antysensownego RNA, ekspresję sensowne8

PL 197 407 B1 go RNA prowadzącą do uzyskania wpływu kosupresji, ekspresję odpowiednio skonstruowanego rybozymu, który specyficznie przecina transkrypt kodujący translokazę ADP/ATP lub tak zwaną „mutagenezę in vivo. Dla obniżenie aktywności translokazy ADP/ATP w komórkach możliwa jest ekspresja antysensownego RNA.

Do ekspresji można stosować zarówno cząsteczkę DNA obejmującą całą sekwencję kodującą translokazę ADP/ATP, włącznie z sekwencjami flankującymi, które mogą być obecne lub cząsteczki DNA obejmujące tylko części sekwencji kodującej, przy czym części te muszą być dostatecznie długie, by prowadzić odpowiedniego wpływu sekwencji antysensownych w komórkach. Generalnie można stosować sekwencje o minimalnej długości tylko 15 bp, lub 100-500 bp, dla wydajnego hamowania przez sekwencje antysensowne, w szczególności można stosować sekwencje o długości ponad 500 bp. Powszechnie stosuje się cząsteczki DNA krótsze niż 5000 bp, korzystnie sekwencje krótsze niż 2500 bp.

Można również stosować sekwencje DNA, które wykazują wysoki stopień homologii do sekwencji występujących endogennie w komórkach roślinnych i które kodują plastydową translokazę ADP/ATP. Minimalna homologia powinna być wyższa niż około 65%. Korzystne powinno być stosowanie sekwencji o homologii pomiędzy 95% a 100%.

Obniżenie aktywności translokazy ADP/ATP w komórkach roślinnych można również osiągnąć poprzez wpływ kosupresji. Metoda ta jest znana specjaliście w tej dziedzinie i została opisana, na przykład, w Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel i in. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell i in. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui i Vaucheret (plant Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret i in. (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne i in. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621) oraz w innych źródłach.

Ekspresja rybozymów w celu obniżenia aktywności określonych białek w komórkach jest również znana specjaliście w tej dziedzinie i została opisana, na przykład, w europejskim opisie patentowym numer EP E1 0 321 201. Ekspresję rybozymów w komórkach roślinnych opisano na przykład w Feyter i in. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338).

Ponadto, obniżenie aktywności translokazy ADP/ATP w komórkach roślinnych można uzyskać za pomocą tak zwanej „mutagenezy in vivo”, w której hybrydowy oligonukleotyd RNA-DNA („chimeroplast”) wprowadza się przez transformacje do komórek (Kipp, P. B. i in., sesja plakatowa na „5^th International Congress of Plant Molecular Biology, 21-27 września 1997, Singapur; R. A. Dixon i C. J. Arntzen, Meeting report on „Metabolic Engineering in Transgenic Plants” Keystone Symposia, Copper Mountain, Co, USA, TIBTECH 15 (1997), 441-447; międzynarodowy zgłoszenie patentowe 95/15972; Kren i in., Hepatology 25 (1997), 1462-1468; Cole-Strauss i in., Science 273 (1996), 1386-1389).

Część składowa DNA oligonukleotydu DNA-RNA jest homologiczna do sekwencji kwasu nukleinowego endogennej translokazy ADP/ATP, ale w porównaniu z nią wykazuje mutację lub zawiera region heterologiczny położony pomiędzy regionami homologicznymi.

Dzięki parowaniu zasad homologicznych regionów oligonukleotydu RNA-DNA i endogennej cząsteczki kwasu nukleinowego, a następnie rekombinacji homologicznej, mutacja regionu heterologicznego obecna w składowej DNA oligonukleotydu RNA-DNA może zostać przeniesiona do genomu komórki roślinnej. Prowadzi to do obniżenia aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP.

Znanych jest wiele technik służących do wprowadzenia DNA do roślinnej komórki gospodarza. Techniki te obejmują transformację komórek roślinnych T-DNA przy użyciu Agrobacterium tumefacieens lub Agrobacterium rhizogenes jako czynnika transformującego, fuzję protoplastów, iniekcję, elektroporację DNA, wprowadzanie DNA przez podejście biolistyczne (pol. strzelba genowa) i inne możliwości.

Stosowanie transformacji komórek roślinnych za pośrednictwem Agrobacteria szczegółowo analizowano dokładnie i w dostatecznym stopniu opisano w europejskim opisie patentowym numer EP 120516; Hoekema, w: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), rozdział V; Fraley i in., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 oraz An i in., EMBO J. 4 (1985), 277-287. O transformacji ziemniaka, patrz np. Rocha-Sosa i in., EMBO J. 8 (1989), 29-33.

Opisano również transformację roślin jednoliściennych przy użyciu wektorów opartych na Agrobacterium (Chan i in., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei i in., Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng I in., Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink i in., Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; May i in., Bio/Technology 13 (1995), 486-492; Connor i Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie I in., Transgenic Res. 2 (1993), 252-265). Alternatywnym układem transformacji roślin jednoliściennych jest transformacja poprzez podejście biolistyczne (Wan i Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil i in. (1993), 1553-1558; Ritala i in., Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer i in., Theor.

PL 197 407 B1

Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), transformacja protoplastów, elektroporacja komórek częściowo permeabilizowanych, wprowadzanie DNA za pomocą włókna szklanego. W szczególności, kilkakrotnie w literaturze opisywano transformację kukurydzy (patrz np. międzynarodowe zgłoszenie numer 95/06128, europejski opis patentowy numer EP 0513849, europejski opis patentowy numer EP 0465875, europejski opis patentowy numer EP 292435; Frtomm i in., Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm i in., Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel i in., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc i in., Theor. Appl. Genet. 80 (1990), 721-726). Opisywano również uwieńczoną powodzeniem transformację innych zbóż, np. jęczmienia (Wan i Lemaux, loc. cit., Ritala i in., loc. cit., Krens i in., Nature 296 (1982), 72-74) i pszenicy (Nehra i in., Plant J. 5 (1994), 285-297).

Dla uzyskania ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących translokazę ADP/ATP w komórkach roślinnych w orientacji sensownej lub antysensownej, wspomniane cząsteczki kwasu nukleinowego korzystnie łączy się z regulującymi elementami DNA, które zapewniają transkrypcję w komórkach roślinnych. Rzeczone elementy obejmują, w szczególności, promotory. Zasadniczo, odpowiedni jest dowolny promotor aktywny w komórkach roślinnych.

Promotor można wybrać w taki sposób, aby ekspresja zachodziła konstytutywnie lub tylko w określonej tkance, w określonym okresie rozwoju rośliny lub w czasie zdeterminowanym przez czynniki zewnętrzne. Zarówno w stosunku do rośliny, jak i do cząsteczki kwasu nukleinowego, promotor może być homologiczny jak i heterologiczny.

Odpowiednimi promotorami są np. promotor RNA 35S wirusa mozaiki kalafiora i promotor ubikwitynowy z kukurydzy do ekspresji konstytutywnej, promotor B33 genu patatyny (Rocha-Sosa i in., EMBO J. 8 (1989), 23-29) do ekspresji specyficznej dla bulw ziemniaka oraz promotor zapewniający ekspresję wyłącznie w tkankach aktywnych fotosyntetycznie, np. promotor ST-LS1 (Stockhaus i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus i in., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) lub do ekspresji w endospermie promotor HMG z pszenicy, promotor USP, promotor faseoliny, promotory genów zeiny z kukurydzy (Pedersen i in., Cell 29 (1982), 1015-1026; Qutroccio i in., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93), promotor gluteliny (Leisy i in., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng i in., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara i in., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218) lub promotor shrunken-1 (Werr i in., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380). Można również wykorzystać promotory aktywowane tylko w czasie zdeterminowanym przez czynniki zewnętrzne (patrz na przykład Publikacja Międzynarodowa WO 9307279). W tym kontekście, szczególnie interesujące mogą być promotory białek szoku cieplnego, umożliwiające łatwą indukcję. Ponadto, można stosować promotory specyficzne dla nasion, takie jak promotor USP z Vicia faba, który zapewnia ekspresję specyficzną dla nasion Vicia faba i innych roślin (Fiedler i in., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Baumlein i in., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).

Uprzednio wymienione rozwiązania z promotorami specyficznymi wobec endospermy są odpowiednie szczególnie do zwiększania zawartości skrobi w endospermie. W przeciwieństwie, stosowanie promotorów specyficznych dla zarodka jest interesujące, w szczególności, przy zwiększaniu zawartości oleju, ponieważ z zasady olej jest magazynowany głównie w zarodku.

A zatem, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, korzystne jest stosowanie promotora, który zapewnia ekspresję w zarodku lub w nasionach. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku promotorem jest promotor globuliny-1 (glb1) z kukurydzy (Styer i Cantliffe, Plant Physiol. 76 (1984), 196-200). W innym rozwiązaniu wynalazku, promotor specyficzny dla zarodka pochodzi z roślin, korzystnie z Cuphea lanceolata, Brassica rapa lub Brassica napus. Szczegónie korzystne są promotory pCIFatBS i pCI-FatB4 (światowy opis patentowy numer 95/07357). Są to promotory genów, odpowiednio, CIFatBS i CIFatB4, które już z powodzeniem stosowano w transgenicznym rzepaku do biosyntezy kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcuchów, a więc wydają się zapewniać specyficzność ekspresji odpowiednią do rozwiązania obecnego problemu.

W innym korzystnym rozwiązaniu stosuje się promotor pCIGPDH (Publikacja Międzynarodowa WO 95/06733), promotor napiny (opisany na przykład w Kridl, Seed Sci. Res. 1 (1991), 209-219; Ellerstrom i in., Plant Mol. Biol. 32 (1996), 1019-1027; Stalberg i in., Planta 199 (1996), 515-519) lub oleozyny (opisany, na przykład, w Keddie, Plant Mol. Biol. 24 (1994), 327-340; Plant i in., Plant Mol. Biol. 25 (1994), 193-205).

Ponadto, może być obecna sekwencja terminacji, która służy do właściwej terminacji transkrypcji i dołączania końcowego odcinka poli A do transkryptu, uważanego za posiadający funkcję stabilizacji transkrypty. Rzeczone elementy opisano w literaturze (patrz na przykład Gielen i in., EMBO J. 8 (1989), 23-29) i są wzajemnie wymienne, jak jest to pożądane.

PL 197 407 B1

Komórki roślin transgenicznych i rośliny transgeniczne według wynalazku syntetyzują, korzystnie w wyniku podwyższenia lub obniżenia aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP, skrobię, która w porównaniu ze skrobią syntetyzowaną przez rośliny typu dzikiego jest zmodyfikowana pod względem właściwości fizykochemicznych, w szczególności stosunku amyloza/amylopektyna. W szczególności, rzeczona skrobia może być zmodyfikowana, w porównaniu ze skrobią typu dzikiego, pod względem lepkości i/lub właściwości tworzenia żeli przez kleje rzeczonej skrobi.

A zatem, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania zmodyfikowanej skrobi, obejmujących etap ekstrakcji skrobi z jednej z roślin transgenicznej według wynalazku i/lub z części tych roślin, w których magazynowana jest skrobia. Sposoby ekstrahowania skrobi z roślin lub części roślin, w których magazynowana jest skrobia, są znane specjalistom w tej dziedzinie. Ponadto, sposoby ekstrahowania skrobi różnych innych roślin magazynujących skrobię opisano, na przykład w „Starch: Chemistry and Technology” (red.: Whistler, BeMiller i Paschall (1994), wydanie II, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; patrz na przykład rozdział XII, strony: 412-468: Maize and sorghum starch: production; Watson; rozdział XIII, strony: 469-479: Starches from tapioca, arrowroot and sago: production; Corbishley i Miller; rozdział XIV, strony: 491-506: Starch from wheat: production, modyfications and uses: Knight i Oson; oraz rozdział XVI, strony: 507-528: Starch from rice: production and uses; Rohmer i Klem; Starch from maize: Eckhoff i in., Cereal Chem. 73 (1996) 54-57, The extraction of starch from maize to industrial standard is usually achieved by socalled “wet milling”). Urządzeniami zwykle stosowanymi w sposobach ekstrakcji skrobi z materiału roślinnego są oddzielacze, dekantery, hydrocyklony, suszarki rozpryskowe i suszarki ze złożem fluidalnym.

Skrobie według wynalazku można modyfikować zgodnie ze sposobami znanymi specjalistom w tej dziedzinie i są one odpowiednie do różnych zastosowań w przemyśle spożywczym lub innym niż spożywczy, w postaci niezmodyfikowanej i zmodyfikowanej.

W zasadzie, możliwości zastosowań można podzielić na dwa duże obszary. Jeden obszar obejmuje produkty hydrolizy skrobi, głównie glukozę i fragmenty glukanowe otrzymane metodami enzymatycznymi lub chemicznymi. Służą one jako materiał wyjściowy do dalszych chemicznych modyfikacji i procesów takich jak fermentacja. Dla zmniejszenia kosztów, istotne może być proste i niedrogie przeprowadzanie sposobu hydrolizy. Obecnie, zasadniczo stosuje się sposób enzymatyczny z wykorzystaniem amyloglukozydazy. Powinno być możliwe ograniczenie kosztów poprzez obniżenie stosowania enzymów. Można to uzyskać przez zmianę struktury skrobi, np. powiększenie powierzchni ziaren, wyższą podatność na trawienie w wyniku niskiego stopnia rozgałęzienia lub struktury przestrzennej ograniczającej możliwość dostępu stosowanych enzymów.

Inną dziedzinę, w której stosuje się tak zwaną skrobię natywną z powodu jej polimerycznej struktury, można podzielić na dalsze zakresy stosowania.

1. Stosowanie w artykułach spożywczych

Skrobia jest klasycznym dodatkiem do różnych artykułów spożywczych, w których zasadniczo służy w celu wiązania dodatków wodnych i/lub powoduje zwiększoną lepkość lub zwiększone tworzenie żelu. Ważnymi charakterystycznymi właściwościami są cechy płynności i sorpcji, temperatura pęcznienia i kiełkowania, zdolności lepkości i zagęszczania, rozpuszczalność skrobi, przezroczystość i struktura kleiku, odporność na wysoką temperaturę, na działanie siły poprzecznej i na kwasy, tendencja do retrogradacji, zdolność do tworzenia błony, odporność na zamrażanie/rozmrażanie, podatność na trawienie, jak również zdolność do tworzenia kompleksów, np. z jonami nieorganicznymi lub organicznymi.

2. Stosowanie w artykułach innych niż spożywcze

Inny główny zakres stosowania obejmuje stosowanie skrobi jako środka wspomagającego w różnych procesach produkcyjnych, bądź jako dodatku w produktach technicznych. Głównymi dziedzinami zastosowań, w których wykorzystuje się skrobię jako środek wspomagający są, przede wszystkim, przemysł papierniczy i kartonowy. W tej dziedzinie skrobię stosuje się głównie do zatrzymywania (zachowania substancji stałych), do zaklejania wypełniaczy i drobnych cząstek, jako substancję zestalającą oraz do odwadniania. Ponadto, wykorzystuje się korzystne właściwości skrobi pod względem sztywności, twardości, właściwości akustycznych, przyczepności, połysku, gładkości, wytrzymałości na rozdarcie, jak również powierzchni.

2.1 Przemysł papierniczy i kartonowy

W procesie produkcji papieru można dokonać rozróżnienia pomiędzy czterema zakresami zastosowań, a mianowicie do traktowania powierzchniowego papieru, powlekania, traktowania masy papierniczej i rozpylania. Wymaganiami wobec skrobi w odniesieniu do traktowania powierzchniowego są wysoki stopień jasności, odpowiednia lepkość, wysoka stabilność lepkości, dobre tworzenie błony,

PL 197 407 B1 jak również niskie tworzenie pyłu. Podczas stosowania w powlekaniu, ważną rolę odgrywają zawartość cząstek stałych, odpowiednia lepkość, wysoka zdolność do wiązania, jak również wysokie powinowactwo do barwników. Przy stosowaniu jako dodatek do masy, ważne są szybkie, jednolite rozpraszanie bez strat, wysoka stabilność mechaniczna oraz pewne zatrzymanie w masie papierniczej. Przy stosowaniu skrobi w rozpylaniu, ważne są również odpowiednia zawartość cząstek stałych, wysoka lepkość i wysoka zdolność do wiązania.

2.2 Przemysł środków klejących

Główną dziedziną stosowania jest, na przykład, przemysł środków klejących, gdzie zakres zastosowań podzielono na cztery obszary: stosowanie w postaci kleju z czystej skrobi, stosowanie klejów przygotowywanych ze specjalnymi środkami chemicznymi, stosowanie skrobi jako dodatku do żywic i faz rozproszonych polimerów, jak również stosowanie skrobi jako wypełniaczy do klejów syntetycznych. 90% wszystkich klejów opartych na skrobi stosuje się w produkcji tektury falistej, worków i toreb papierowych, materiałów zespolonych z papieru i aluminium, pudełek i zwilżalnego kleju do kopert, znaczków pocztowych itp.

2.3 Wyroby włókiennicze i produkty konserwujące materiały włókiennicze

Inne możliwe zastosowanie jako środek wspomagający i dodatek dotyczy produkcji wyrobów włókienniczych i produktów konserwujących materiały włókiennicze. W przemyśle włókienniczym można dokonać rozróżnienia pomiędzy następującymi czterema obszarami zastosowań: stosowanie skrobi jako klejonki, tj. jako środka wspomagającego do wygładzania i wzmacniania działania zaklejającego w celu ochrony przed siłami rozciągającymi podczas tkania, jak również do zwiększania odporności na ścieranie podczas tkania, jako czynnik do ulepszania materiałów włókienniczych, głównie po wstępnych obróbkach, które pogarszają jakość, takich jak wybielanie, farbowanie itp., jako zagęszczacz w produkcji past barwników do zapobiegania dyfuzji barwnika, jak również jako dodatek do czynników używanych do tkania osnowy.

2.4 Przemysł budowlany

Ponadto, skrobię można stosować jako dodatek w materiałach budowlanych. Jednym z przykładów jest produkcja gipsowych okładzin tynkowych, w których skrobia domieszana do cienkich tynków zmiękczana jest wodą, dyfunduje na powierzchnię okładziny gipsowej i w ten sposób wiąże karton z płytą. Innymi obszarami zastosowań są domieszanie jej do zaprawy do tynków i włókien mineralnych. W gotowej mieszance betonowej, skrobię można stosować do opóźniania procesu wiązania.

2.5 Stabilizacja gruntu

Ponadto, skrobia jest korzystna do produkcji środków do stabilizacji gruntu, stosowanych do czasowej ochrony cząstek gruntu przed wodą przy sztucznych ruchach ziemi. Zgodnie ze stanem wiedzy, złożone produkty składające się ze skrobi i emulsji polimerów można uważać za posiadające taki sam wpływ obniżania erozji oraz inkrustacji, jak stosowane dotąd produkty, jednakże uważane są one za mniej kosztowne.

2.6 Stosowanie w środkach ochrony roślin i nawozach sztucznych

Inną dziedziną stosowania jest stosowanie skrobi w środkach ochrony roślin do modyfikowania określonych właściwości tych preparatów. Na przykład, skrobię stosuje się do poprawy zwilżania środków ochrony roślin i nawozów sztucznych, do dawkowanego uwalniania składników aktywnych, do przekształcania płynnych, lotnych i/lub zapachowych składników aktywnych w mikrokrystaliczne, stabilne, zdolne do odkształcania substancje, do mieszania niezgodnych ze sobą kompozycji i do wydłużania czasu trwania wpływu w wyniku obniżonej dezintegracji.

2.7 Leki, medycyna i przemysł kosmetyczny

Skrobię można również stosować w dziedzinie leków, medycyny oraz w przemyśle kosmetycznym. W przemyśle farmaceutycznym skrobię można stosować jako lepiszcze do tabletek lub do rozcieńczania lepiszcza w kapsułkach. Ponadto, skrobia jest odpowiednia jako środek rozsadzający do tabletek, ponieważ, po napęcznieniu, absorbuje ona płyn i po krótkim czasie pęcznieje tak bardzo, że uwalniany jest składnik aktywny. Z przyczyn jakościowych, stosowane w medycynie środki poślizgowe i pudry stosowane na rany są dalszymi dziedzinami stosowania. W dziedzinie kosmetyków, skrobię można na przykład stosować jako nośnik w dodatkach w postaci proszków, takich jak substancje zapachowe i kwas salicylowy. W stosunkowo szerokim zakresie skrobię stosuje do past do zębów.

2.8 Skrobia jako dodatek do węgla i brykietów

Skrobię można również stosować jako dodatek do węgla i brykietów. Dzięki dodawaniu skrobi węgiel można ilościowo zbrylać i brykietować z wysoką jakością, zapobiegając w ten sposób przedwczesnemu rozpadowi brykietów. Węgiel grilowy zawiera pomiędzy 4% a 6% dodanej skrobi, a węgiel

PL 197 407 B1 cieplny pomiędzy 0,1 a 0,5%. Ponadto, skrobia jest odpowiednia jako czynnik wiążący, ponieważ jej dodanie do węgla i brykietów może znacząco zmniejszać emisję substancji toksycznych.

2.9 Przetwarzanie szlamu rudy i węgla

Ponadto, skrobię można stosować jako czynnik kłaczkujący w przetwarzaniu szlamu rudy i węgla.

2.10 Dodatek do materiałów odlewniczych

Inną dziedziną stosowania jest stosowanie jako dodatek do obróbki materiałów w odlewnictwie. Do różnych procesów odlewniczych potrzebne są rdzenie wytworzone z piasków zmieszanych z czynnikami wiążącymi. Obecnie, najpowszechniej stosowanym czynnikiem wiążącym jest bentonit zmieszany z modyfikowanymi skrobiami, w większości skrobiami pęczniejącymi. Celem dodawania skrobi jest zwiększanie oporu przepływu, jak również polepszenie siły wiążącej. Ponadto, pęczniejące skrobie mogą spełniać więcej warunków wstępnych dla procesów produkcyjnych, takich jak zdolność rozpraszania w zimnej wodzie, zdolność do rehydratacji, dobra mieszalność z piaskiem oraz wysoka zdolność do wiązania wody.

2.11 Przemysł gumowy

W przemyśle gumowym skrobię można stosować do poprawy jakości technicznej i optycznej. Powodami tego są ulepszone połysk powierzchni, przyczepność i wygląd. W tym celu, skrobię rozprasza się na lepkich gumowanych powierzchniach substancji gumowych przed zimną wulkanizacją. Można ją również stosować do poprawy drukowności gumy.

2.12 Produkcja sztucznych skór

Inną dziedziną stosowania modyfikowanej skrobi jest produkcja sztucznych skór.

2.13 Skrobia w syntetycznych polimerach

W dziedzinie tworzyw sztucznych wyłaniają się następujące zakresy zastosowań: włączanie produktów pochodzących ze skrobi w procesie przetwarzania (skrobia jest tylko wypełniaczem, nie występują bezpośrednie wiązania pomiędzy syntetycznym polimerem a skrobią) lub, alternatywnie, włączanie produktów pochodzących ze skrobi do produkcji polimerów (skrobia i polimer tworzą stabilne wiązania. Stosowanie skrobi jako czystego wypełniacza nie może współzawodniczyć z innymi substancjami, takimi jak talk.

Sytuacja jest inna, gdy określone właściwości skrobi stają się efektywne i profil właściwości produktów końcowych jest zatem wyraźnie zmieniony. Jednym z przykładów jest stosowanie produktów skrobiowych w przetwarzaniu materiałów termoplastycznych, takich jak polietylen. W tym przypadku, skrobię i syntetyczny polimer łączy się w stosunku 1:1 przez utworzenie „szarży głównej”, z której produkuje się różne produkty za pomocą powszechnie stosowanych technik z zastosowaniem granulowanego polietylenu. Włączenie skrobi do polietylenowych błon może powodować zwiększoną przepuszczalność substancji ciałek pustych, poprawioną przepuszczalność dla pary wodnej, ulepszone właściwości elektrostatyczne, ulepszone właściwości przeciwpoślizgowe, jak również ulepszoną drukowność barwnikami wodnymi.

Inną możliwością jest stosowanie skrobi w piankach poliuretanowych. W wyniku adaptacji pochodnych skrobi, jak również w wyniku optymalizacji technik przetwarzania, możliwe jest specyficzne kontrolowanie reakcji pomiędzy syntetycznymi polimerami a grupami hydroksylowymi skrobi. Wynikiem są pianki poliuretanowe posiadające, w wyniku zastosowania skrobi, następujące profile właściwości: obniżony współczynnik rozszerzalności cieplnej, obniżoną kurczliwość, ulepszone zachowanie pod względem działania ciśnienia/napięcia, zwiększoną przepuszczalność dla pary wodnej bez zmiany przyswajalności wody, obniżoną zapalność i gęstość spękań, brak uwalniania części stanowiących substancje palne, brak halogenków i obniżona szybkość starzenia. Wadami, które nadal występują są obniżona odporność na działanie ciśnienia i uderzenia. Opracowywanie produktów w postaci błon nie jest jedyną możliwością. Można również produkować stałe produkty z tworzyw sztucznych o zawartości skrobi powyżej 50%, takie jak donice, talerze i misy. Ponadto, mieszaniny skrobia/polimer posiadają tę zaletę, że znacznie łatwiej ulegają biodegradacji.

Ponadto, z powodu swojej skrajnie wysokiej zdolności do wiązania wody, skrobiowe polimery szczepione posiadają wzrastające ostatnio znaczenie. Są to produkty posiadające szkielet skrobiowy i boczną sieć krystaliczną syntetycznego monomeru zaszczepioną zgodnie z zasadą łańcuchowych mechanizmów rodnikowych. Dostępne obecnie skrobiowe polimery szczepione charakteryzują się ulepszoną zdolnością do wiązania i utrzymywania do 1000 g wody na g skrobi o wysokiej lepkości. Te znakomite absorbery stosuje się głównie w dziedzinie higieny, np. w takich produktach, jak pieluszki i prześcieradła, jak również w rolnictwie, np. w granulkach nasiennych.

PL 197 407 B1

Tym, co decyduje o stosowaniu nowej skrobi zmodyfikowanej poprzez techniki rekombinacji DNA są z jednej strony struktura, zawartość wody, zawartość lipidów, zawartość włókien, zawartość popiołów/fosforanu, stosunek amyloza/amylopektyna, rozkład względnej masy cząsteczkowej, stopień rozgałęzienia, wielkość i kształt granulek, jak również krystalizacja, a z drugiej strony właściwości, których wynikiem są następujące cechy: cechy płynności i sorpcji, temperatura kiełkowania, lepkość, zdolność zagęszczania, rozpuszczalność, struktura kleiku, przezroczystość, odporność na wysoką temperaturę, na działanie siły poprzecznej i na kwasy, tendencja do retrogradacji, zdolność do tworzenia żelu, odporność na zamrażanie/rozmrażanie, zdolność do tworzenia kompleksów, wiązanie jodu, tworzenie błony, siła przylegania, stabilność wobec enzymów, podatność na trawienie oraz reaktywność.

Wytwarzanie zmodyfikowanej skrobi przez oddziaływania genetyczne roślin transgenicznych może modyfikować właściwości skrobi otrzymywanej z roślin w taki sposób, dalsze modyfikacje za pomocą metod chemicznych lub fizycznych staną się zbędne. Z drugiej strony, skrobie modyfikowane za pomocą technik rekombinacji DNA można poddawać dalszym modyfikacjom chemicznym, których wynikiem będzie dalsza poprawa jakości dla niektórych z opisanych powyżej zakresów zastosowań. Te modyfikacje chemiczne są zasadniczo znane.

Są to szczególnie modyfikacje polegające na: - traktowaniu wysoką temperaturą, - traktowaniu kwasami, - utlenianiu oraz - estryfikacji, prowadzącej do tworzenia fosforanu, azotanu, siarczanu, ksantogenianu, octanu i cytrynianu skrobi. Do estryfikacji można również stosować inne kwasy organiczne; - tworzeniu eterów skrobi, alkilowego eteru skrobi, eteru O-alkilowego, eteru hydroksyalkilowego, eteru 0-karboksylometylowego, eterów skrobi zawierających N, eterów skrobi zawierających P oraz eterów skrobi zawierających S; - tworzeniu skrobi rozgałęzionych, - tworzeniu skrobiowych polimerów szczepionych.

Figura 1 przedstawia schematycznie plazmid pJT31 (AATP1 (Arabidopsis thaliana) w orientacji sensownej).

Figura 2 przedstawia schematycznie plazmid pJT32 (AATP1 (Solanum tuberosum) w orientacji antysensownej).

Figura 3 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowych AATP2 z Arabidopsis thaliana z AATP1 (A. thaliana) i z homologicznym białkiem Rickettsia prowazekii (Williamson i in., Gene 80 (1989), 269-278).

Figura 4 przedstawia analizę hydrofilowości AATP2 (A. thaliana), AATP1 (A. thaliana) i translokazy ADP/ATP Rickettsia przeprowadzoną według metody Heijne i in. (Eur. J. Biochem. 180 (1989), 535-545).

Figura 5 przedstawia analizę ekspresji AATP1 (Solanum tuberosum) w liściach i bulwach roślin zawierających antysensowną nić genu trannslokazy ADP/ATP poprzez blotting typu Northern.

Figura 6 przedstawia analizę ekspresji AATP1 (Arabidopsis thaliana) w liściach i bulwach roślin, w których zachodzi nadekspresja translokazy ADP/ATP, poprzez blotting typu Northern.

Figura 7 przedstawia schematyczną mapę kasetki pTE200 zapewniającej ekspresję specyficzną dla zarodka. EcoRI, Smal, BamHI, Xhol, Notl, Xbal, SacI, KpnI, Apal, Sali i Sfil oznaczają miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne. Z przyczyn natury praktycznej, Sfil (A) i Sfil (B) różnią się w zmiennej sekwencji nukleotydowej miejsca rozpoznawania.

Skróty oznaczają odpowiednio: PCIFatB4 = promotor CIFatB4, tCIFatB4 = terminator CIFatB4, amp = bakteryjny gen oporności na ampicylinę, ori ColEl = miejsce początku replikacji z plazmidu ColEl, ori f1(-) = miejsce początku replikacji z faga f1.

Figura 8 przedstawia schematyczną mapę kasetki ekspresyjnej translokazy ADP/ATP pTE208: ta pochodna wektora pTE200 (figura 7) zawiera cDNA kodujący plastydową translokazę ADP/ATP z Solanum tuberosum w orientacji sensownej.

Figura 9 przedstawia schematyczną mapę wektora wahadłowego pMH000-0. Sfil, Sali, CiaI, Hindlll, EcoRI, Nsil, Smal, BamHI, Spel, Notl, KpnI, Bglll, Apal, Xhol, Xbal i BstEII oznaczają miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne. Sfi (A) i Sfi (B) różnią się, jak wspominano, w zmiennej sekwencji nukleotydowej rozpoznawanego miejsca. Zapobiega to odtwarzaniu postaci kolistej wyjściowego plazmidu po trawieniu Sfil i umożliwia bezpośrednie wstawianie kasetki ekspresyjnej z pochodnej pTE200.

Skróty oznaczają odpowiednio: RB, LB = prawy i lewy region graniczny, t35S = sygnał terminacji z genu 35S rna z CaMV, pat = gen acetylotransferazy fosfinotricynowej, p 35S = promotor genu rna 35S z CaMV, tp-sul = gen oporności na sulfonamid z peptydem kierującym, tnos = sygnał terminacji z genu syntetazy nopalinowej, Sm/Sp = bakteryjny gen oporności na streptomycynę i spektynomycy14

PL 197 407 B1 nę, parA, parB i parR = funkcje odpowiedzialne za amplifikację plazmidu w szerokim zakresie gospodarzy, tj. w Agrobacterium tumefaciens i Escherichia coli. Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d 1

Konstruowanie bakteryjnego wektora ekspresyjnego pJT118 i transformacja E. coli

Do końca N białka AATP2 (biblioteka genowa K94626) z Arabidopsis thaliana dołączono „znacznik histydynowy” zawierający 10 aminokwasów.

W tym celu, poprzez PGR wyizolowano cDNA kodujący całe białko AATP2 z Arabidopsis thaliana. Poniższy oligonukleotyd służył jako starter sensowny, który, ponadto, posiadał miejsce restrykcyjne Xhol: cgtgagagatagagagctcgagggtctgattc aaacc (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1); obejmując pary zasad 66-102. Jako starter antysensowny służył oligonukleotyd zawierający dodatkowe miejsce restrykcyjne BamHI: gatacaacaggaatcctggat gaagc (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2); obejmujący pary zasad 1863-1835.

Uzyskany produkt reakcji PGR oczyszczono w żelu agarozoowym, strawiono enzymami restrykcyjnymi Xhol i BamHI i wstawiono we właściwej ramce odczytu do plazmidu pET16b (Novagene, Heidelberg, Niemcy). W ten sposób uzyskano podstawienie znacznika histydynowego w postaci 10 aminokwasów na N-końcu cDNA kodującego całe białko AATP2 z Arabidopsis thaliana (His-AATP2). Wektor ten nazwano pJT118. Sekwencję produktu PGR określono przez zsekwencjonowanie obu nici polinukleotydowych (Eurogentec). Transformacje E. coli C43 (Miroux i Walker, J. Mol. Biol. 260 (1996), 289-298) prowadzono zgodnie ze standardowymi metodami. Szczep E. coli C43 umożliwia heterologiczną ekspresję zwierzęcych (Miroux i Walker, loc. cit.) i roślinnych (Tjaden i in., J. Biol. Chem. (1998) (w druku)) białek błonowych.

Po transformacji tego szczepu wektorem pJT18 przeprowadzono badania wychwytu przy użyciu znakowanych promieniotwórcze ADP i ATP. Badania te wykazały, że His-AATP2 może ulegać funkcjonalnej ekspresji w E. coli C43 w błonie cytoplazmatycznej. Wykazało to, że AATP2 rzeczywiście koduje translokazę ADP/ATP. Obecność N-końcowego znacznika histydynowego prowadzi do wzrostu (2x-3x) aktywności transportującej AATP2 z A. thaliana w E. coli w porównaniu z AATP2 bez N-końcowego znacznika histydynowego.

P r z y k ł a d 2

Konstruowanie plazmidu pJT31 i wprowadzenie go do genomu roślin ziemniaka

W celu skonstruowania wektora do transformacji roślin, po-łączono fragment EcoRV/BamHI cDNA AATP1 z A. thaliana (Kampfenkel i in., FEBS Letters 374 (1995), 351-355) o długości 2230 bp z wektorem pBinAR strawionym Smal, EcoRV i BamHI (Hofgen i Wilmitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221-230). Dzięki wstawieniu fragmentu cDNA utworzono kasetkę ekspresyjną (pJT31), którą skonstruowano w opisany poniżej sposób z fragmentów A, B i C (patrz figura 1).

Fragment A (540 bp) zawiera promotor 35S z wirusa mozaiki kalafiora. Fragment B zawiera, poza regionami flankującymi, region kodujący białko translokazy ADP/ATP A. thaliana (AATP1). Region ten wyizolowano jak opisano powyżej i połączono w orientacji sensownej z promotorem 35S pBinAR. Fragment C (215 bp) zawiera sygnał poliadenylacji genu syntazy oktopinowej z Agrobacterium tumefaciens. Wielkość plazmidu pJT31 wynosi około 14,2 kb. Plazmidem stransformowano rośliny ziemniaka poprzez transformację Agrobacteria, jak opisano w Rocha-Sosa i in. (EMBO J. 8 (1989), 23-29). W wyniku transformacji transgeniczne rośliny ziemniaka wykazywały wzrost poziomu mRNA plastydowej translokazy ADP/ATP.

Wykryto to przez analizę poprzez blotting typu Northern (patrz fig. 6). RNA wyizolowano zgodnie ze standardowymi metodami z tkanek liści i bulw roślin ziemniaka. 50 pg RNA rozdzielono w żelu agarozowym (1,5% agaroza, bufor 1 x MEN, 16,6% formaldehyd). Po elektroforezie RNA przeniesiono na błonę nylonową Hybond N (Amersham, Wielka Brytania) za pomocą transferu kapilarnego w 20 x SSC. RNA utrwalono na błonie przez napromieniowanie światłem ultrafioletowym. Błonę prehybrydyzowano w ciągu 2 godzin w fosforanowym buforze hybrydyzacyjnym (Sambrook i in., loc. cit.), a następnie hybrydyzowano w ciągu 10 godzin przez dodanie sondy wyznakowanej promieniotwórcze.

P r z y k ł a d 3

Konstruowanie plazmidu pJT32 i wprowadzenie go do genomu roślin ziemniaka

W celu skonstruowania wektora do transformacji roślin, fragment BamHI/Ndel regionu kodującego cDNA AATP1 z S. tuberosum (Genebank Y10821) o długości 1265 bp połączono z wektorem pBinAR (Hofgen i Willmitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221-230) strawionym Smal, Ndel i BamHI. Przez wstawienie fragmentu cDNA utworzono kasetkę ekspresyjną, którą skonstruowano w opisany poniżej sposób z fragmentów A, B i C (patrz fig. 2). Fragment A (540 bp) zawiera promotor 35S wirusa mozaiPL 197 407 B1 ki kalafiora. Fragment B zawiera region translokazy ADP/ATP z S. tuberosum (AATP1 S.t.) o długości 1265 bp. Region ten połączono w orientacji antysensownej z promotorem 35S w pBinAR. Fragment C (215 bp) zawiera sygnał poliadenylacji genu syntazy oktopinowej z Agrobacterium tumefaciens. Wielkość plazmidu pJT32 wynosi około 13,3 kb. Plazmid wprowadzono do roślin ziemniaka za pomocą Agrobacteria, jak opisano w Rocha-Sosa i in. (EMBO J. 8 (1989), 23-29).

W wyniku transformacji transgeniczne ziemniaki wykazywały obniżenie poziomu mRNA plastydowej translokazy ADP/ATP. Wykryto to przez analizę poprzez blotting typu Northern (patrz fig. 5). Zgodnie ze standardowymi procedurami z liści i bulw roślin ziemniaka wyizolowano RNA. 50 pg RNA rozdzielano w żelu agarozowym (1,5% agaroza, bufor 1 x MEN, 16,6% formaldehyd). Po elektroforezie RNA przeniesiono na błonę nylonową Hybond N (Amersham, UK) za pomocą transferu kapilarnego w 20 x SSC. RNA utrwalono na błonie przez napromieniowanie światłem ultrafioletowym.

Błonę poddano prehybrydyzacji w ciągu 2 godzin w fosforanowym buforze hybrydyzacyjnym (Sambrook i in., loc. cit.), a następnie hybrydyzowano w ciągu 10 godzin przez dodanie sondy wyznakowanej promieniotwórczo.

P r z y k ł a d 4

Analiza zawartości skrobi, amylozy i cukru w transgenicznych roślinach ziemniaka

Oznaczanie zawartości rozpuszczalnych cukrów prowadzono w sposób opisany w Lowry i Passonneau, „A Flexible System of Enzymatic Analysis”; Academic Press, nowy Jork, USA (1972).

Oznaczanie zawartości skrobi prowadzono w sposób opisany w Batz i in. (Plant Physiol. 100 (1992), 184-190).

T a b e l a 1

Linia/genotyp	Skrobia (pmole jednostek C6/g mokrej masy)	Cukry rozpuszczalne (pmole/g mokrej masy)
Desiree/WT	1094,0	26,49
654/antysensowny-AATP1 (S. tuberosum)	574,2	42,52
594/antysensowny AATP1 (S. tuberosum)	630,2	48,76
595/antysensowny AATP1	531,4	45,92
676/antysensowny AATP1 (S. tuberosum)	883,0	40,60
62/sensowny AATP1 (A. thaliana)	1485,0	30,65
98/sensowny AATP1 (A. thaliana)	1269,0	18,28
78/sensowny AATP1 (A. thaliana)	995,0	20,50

Oznaczanie zawartości amylozy prowadzono zgodnie z metodą opisaną w Hovenkamp-Hermelink i in. (Potato Res. 31 (1988), 241-246).

Linia/genotyp	% amylozy
Desiree/WT	18,8
654/antysensowny AATP1	15,5
594/antysensowny AATP1 (S. tuberosum)	124,3
595/antysensowny AATP1 (S. tuberosum)	18,0
676/antysensowny AATP1 (S. tuberosum)	11,5
62/sensowny AATP1 (A. thaliana)	27,0
98/sensowny AATP1 (A. thaliana)	22,7
78/sensowny AATP1 (A. thaliana)	24,5

PL 197 407 B1

Lista sekwencji <110> PlantTec Biotechnologie GmbH Forschung & Entwicklung Max-Planck-Gesellschaft zur Forde rung der Wissenschaften <120> Rośliny transgeniczne o zmodyfikowanej aktywności plastydowej translokazy ADP/ATP <130> C 1540 PCT <140>

<140>

<160>4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: sztuczna <400> 1 cgtgagagat agagagctcg agggtctgat tcaaacc 37 <210>2 <211> 26 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: sztuczna <400> 2 gatacaacag gaatcctgga tgaagc 66 <210> 3 <211> 56 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: sztuczna <400> 3 gaattcctgc agcccggggg atccactagt ctcgagaagt ggctgggggc ctttcc 66 <210>4 <211> 39 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: sztuczna <400> 4 tctagaggcc aaggcggccg cttcaacgga ctgcagtgc 99 <210> 5 <211> 589 <212> białko <213> Arabidopsis thaliana <400> 5

PL 197 407 B1

Met 1

Glu Ala

Val

Ile 5

Gin

Thr

Arg

Gly

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Pro

Thr 15

Lys

Pro

Ile

Gly

Val

Arg

Ser

Gin

Leu

Gin

Pro

Ser

His

Gly

Leu

Lys

Gin

20

25

30

Arg

Leu

Phe

Ala

Ala

Lys

Pro

Arg

Asn

Leu

His

d-y

Cys

Leu

Tyr

Pro

35

40

45

Leu

Thr

Gly

Thr

Arg

Asn

Phe

Lys

Pro

Leu

Ser

Gin

Pro

Cys

Met

Gly

50

55

60

Phe

Arg

Phe

Pro

Thr

Lys

Arg

Glu

Ala

Pro

Ser

Ser

Tyr

Ala

Arg

Arg

65

70

75

80

Arg

Arg

Gly

Cys

Trp

Arg

Arg

Ser

Cys

Leu

Arg

Arg

Ser

Asp

Ser

Ala

85

90

95

Ala

Val

Val

Ala

Ser

Arg

Lys

Ile

Phe

Gly

Val

Glu

Val

Ala

Thr·

Leu

100

105

110

Lys

Lys

Ile

Ile

Pro

Leu

Gly

Leu

Met

Phe

Phe

Cys

Ile

Leu

Phe

Asn

115

120

125

Tyr

Thr

Ile

Leu

Arg

Asp

Thr

Lys

Asp

Val

Leu

Val

Val

Thr

Ala

Lys

130

135

140

Gly

Ser

Ser

Ala

Glu

Ile

Ile

Pro

Phe

Leu

Lys

Thr

Trp

Val

Asn

Leu

145

150

155

160

Pro

Met

Ala

Ile

Gly

Phe

Met

Leu

Leu

Tyr

Thr

Lys

Leu

Ser

Asn

Val

165

170

175

Leu

Ser

Lys

Lys

Ala

Leu

Phe

Tyr

Thr

Val

Ile

Val

Pro

Phe

Ile

Ile

180

185

190

Tyr

Phe

Gly

Gly

Phe

Gly

Phe

Val

Met

Tyr

Pro

Leu

Ser

Asn

Tyr

Ile

195

200

205

His

Pro

Glu

Ala

Leu

Ala

Asp

Lys

Leu

Leu

Thr

Thr

Leu

Gly

Pro

Arg

210

215

220

Phe

Met

Gly

Pro

Ile

Ala

Ile

Leu

Arg

Ile

Trp

Ser

Phe

Cys

Leu

Phe

225

230

235

240

Tyr

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Trp

Gly

Ser

Val

Val

Val

Ser

Val

Leu

Phe

245

250

255

Trp

Gly

Phe

Ala

Asn

Gin

Ile

Thr

Thr

Val

Asp

Glu

Ala

Lys

Lys

Phe

260

265

270

Tyr

Pro

Leu

Phe

Gly

Ile

Gly

Ala

Asn

Val

Ala

Leu

Ile

Phe

Ser

Gly

275

280

285

Arg

Thr

Val

Lys

Tyr

Phe

Ser

Asn

Leu

Arg

Lys

Asn

Leu

Gly

Pro

Gly

290

295

300

PL 197 407 B1

Val 305

Asp Gly Ser

Phe

Vvl 331

Glu

Ser

His

Asp Glu His 331

Cys

Gly

ny

Asn 320

Gly

Thr

Arg

Ile

Cys

Leu

Ser

Ile

Gly

Gly

Ssu

Asn

Arg

Tyr

Val

Pro

325

330

335

Leu

Pro

Thr

Arg

Ser

Lys

Asn

Lys

Lys

Glu

Lys

Pro

Lys

Met

Gly

Thr

340

345

350

Met

Glu

Ser

Leu

Lys

Phe

Leu

Val

Ser

Ser

Pro

Tyr

Ile

Arg

Asp

Leu

355

360

365

Ala

Thr

Leu

Val

Val

Ala

Tyr

Gly

Ile

Ser

Ile

Asn

Leu

Val

Glu

Val

370

375

380

Thr

Trp

Lys

Ser

Lys

Llu

Lys

Ala

Gin

Phe

Prr

Ser

Pro

Asn

Glu

Tyr

385

398

338

400

Ser

Ala

Phe

Met

Gly

Ala

Phe

Ser

Thr

Cys

Thr

Gly

Val

Ala

Thr '

'Phe

405

410

415

Thr

Met

Met

Leu

Leu

Ser

Gin

Tyr

Val

Phe

Asn

Lys

Tyr

Gly

Trp

Gly

420

425

430

Val

Ala

Ala

Lys

Ile

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Leu

Leu

Thr

Gly

Val

Ala

435

440

445

Phe

Phe

Ser

Leu

Ile

Leu

Phe

Gly

Gly

Pro

Phe

Ala

Pro

Leu

Val

Ala

450

455

460

Lys

Leu

Gly

Met

Thr

Ppo

Leu

Leu

Ala

Ala

Vaa

Tyr

Val

Gly

Ala

Leu

465

477

445

480

Gin

Asn

He

Phe

Ser

Lls

Ser

Ala

Lys

Tyr

Ssu

Leu

Phe

Asp

Pro

Cys

485

480

4 95

Lys

Glu

Met

Ala

Tyr

Ile

Pro

Leu

Asp

Glu

Asp

Thr

Lys

Val

Lys

Gly

500

505

510

Lys

Ala

Ala

Ile

Asp

Val

Val

Cys

Asn

Pro

Leu

Gly

Lys

Ser

Gly

Gly

515

520

525

Ala

Leu

Ile

Gin

Gin

Phe

Met

Ile

Leu

Ser

Phe

Gly

Ser

Leu

Ala

Asn

530

535

540

Ser

Thr

Pro

Typ

Leu

Gly

Met

Ile

Leu

Leu

Val

Ile

Val

Thr

Ala

Trp

545

550

555

560

Leu

Ala

Ala

Ala

Lys

Ser

Leu

Glu

Gly

Gin

Phh

Asn

Ser

Leu

Arg

Leu

5 65

570

575

Lys Lys Ser Leu Arg Arg Lys Trp Arg Glu Leu His Arg 580 585

PL 197 407 Β1 <210> 6 <211> 569 <212> białko <213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

Met 1

Glu

Gly

Leu

Ile 5

Gin

Thr

Arg

Gly

Ile 10

Leu

Ser

Leu

Pro

Ala 15

Ser

His

Arg

Ser

Glu 20

Lys

Val

Leu

Gin

Pro 25

Ser

His

Gly

Leu

Lys 30

Gin

Arg

Leu

Phe

Thr 35

Thr

Asn

Leu

Pro

Ala 40

Leu

Ser

Leu

Ser

Leu 45

Met

Val

Thr

Arg

Asn 50

Phe

Lys

Pro

Phe

Ser 55

Lys

Ser

His

Leu

Gly 60

Phe

Arg

Phe

Pro

Thr 65

Arg

Arg

Glu

Ala

Glu 70

Asp

Ser

Leu

Ala

Arg 75

Arg

Lys

Leu

Arg

Arg 80

Pro

Arg

Arg

Lys

Cys 85

Val

Asp

Glu

Gly

Asp 90

Thr

Ala

Ala

Met

Ala 95

Val

Ser

Pro

Lys

Ile 100

Phe

Gly

Val

Glu

Val 105

Thr

Thr

Leu

Lys

Lys 110

Ile

Val

Pro

Leu

Gly 115

Leu

Met

Phe

Phe

Cys 120

Ile

Leu

Phe

Asn

Tyr 125

Thr

Ile

Leu

Arg

ASp 130

Thr

Lys

Asp

Val

Leu 135

Val

Val

Thr

Ala

Lys 140

Gly

Ser

Ser

Ala

Glu 145

Ile

Ile

Pro

Phe

Leu 150

Lys

Thr

Trp

Val

Asn 155

Val

Pro

Met

Ala

Ile 160

Gly

Phe

Met

Leu

Leu 165

Tyr

Thr

Lys

Leu

Ser 170

Asn

Val

Leu

Ser

Lys 175

Lys

Ala

Leu

Phe

Tyr 180

Thr

Val

Ile

Val

Pro 185

Phe

Ile

Val

Tyr

Phe 190

Gly

Ala

Phe

Gly

Phe 195

Val

Met

Tyr

Pro

Arg 200

Ser

Asn

Leu

Ile

Gin 205

Pro

Glu

Ala

Leu

Ala 210

Asp

Lys

Leu

Leu

Ala 215

Thr

Leu

Gly

Pro

Arg 220

Phe

Met

Gly

Pro

Leu 225

Ala

Ile

Met

Arg

Ile 230

Trp

Ser

Phe

Cys

Leu 235

Phe

Tyr

Val

Met

Ala 240

PL 197 407 B1

Glu

Leu

Trp Gly Ser 245

Val

Val

Val

Ser Val 250

Leu

Phe

Trp

Gly

Phe 255

Ala

Asn

Gin

Ile

Thr

Thr

Val

Asp

Glu

Ala

Lys

Lys

Phe

Tyr

Pro

Leu

Phe

260

265

270

Gly

Leu

Gly

Ala

Asn

Val

Ala

Leu

Ile

Phe

Ser

Gly

Arg

Thr

Val

Lys

275

280

285

Tyr

Phe

Ser

Asn

Met

Arg

Lys

Asn

Leu

Gly

Pro

Gly

Val

Asp

Gly

Trp

290

295

300

Ala

Val

Ser

Leu

Lys

Ala

Met

Met

Ser

Ile

Val

Val

Gly

Met

Gly

Leu

305

310

315

320

Ala

Ile

Cys

Phe

Leu

Tyr

Trp

Trp

Val

Asn

Arg

Tyr

Val

Pro

Leu

Pro

325

330

335

Thr

Arg

Ser

Lys

Lys

Lys

Lys

Val

Lys

Pro

Gin

Met

Gly

Thr

Met

Glu

340

345

350

Ser

Leu

Lys

Phe

Leu

Val

Ser

Ser

Pro

Tyr

Ile

Arg

Asp

Leu

Ala

Thr

355

360

365

Leu

Val

Val

Ala

Tyr

Gly

Ile

Ser

Ile

Asn

Leu

Val

Glu

Val

Thr

Trp

370

375

380

Lys

Ser

Lys

Leu

Lys

Ser

Gin

Phe

Pro

Ser

Pro

Asn

Glu

Tyr

Ser

Ala

385

390

395

400

Phe

Met

Gly

Asp

Phe

Ser

Thr

Cys

Thr

Gly

Ile

Ala

Thr

Phe

Thr

Met

405

410

415

Met

Leu

Leu

Ser

Gin

Tyr

Val

Phe

Lys

Lys

Tyr

Gly

Trp

Gly

Val

Ala

420·

425

430

Ala

Lys

Ile

Thr

Pro

Thr

Val

Leu

Leu

Leu

Thr

Gly

Val

Ala

Phe

Phe

435

440

445

Ser

Leu

Ile

Leu

Phe

Gly

Gly

Pro

Phe

Ala

Pro

Leu

Val

Ala

Lys

Leu

450

455

460

Gly

Met

Thr

Pro

Leu

Leu

Ala

Ala

Val

Tyr

Val

Val

Pro

Pro

Glu

Val

465

470

475

480

Ser

Ser

Ala

Arg

Val

Gin

Val

Gin

His

Ser

Ser

Thr

Pro

Ser

Ala

Met

485

490

495

Gin

Glu

Cys

Leu

Tyr

Pro

Leu

Asp

Glu

Val

Ser

Lys

Val

Lys

Ala

Lys

500

505

510

Leu

Gin

Leu

Met

Trp

Ser

Ala

Thr

Ile

Gly

Lys

Ser

Gly

Gly

Ala

Leu

515

520

525

Ile

Gin

Gin

Phe

Met

Ile

Leu

Thr

Phe

Gly

Ser

Leu

Ala

Asn

Ser

Thr

530

535

540

PL 197 407 B1

Pro Tyr Leu Gly Val Ile Leu Leu Gly Ile Val Thr Ala Trp Leu Ala 545 550 555 560

Ala Ala Lys Ser Leu Glu Gly Pro Val 565 <210> 7 <211> 498 <212> białko <213> Rickettsia prowazekii <400> 7

Met 1

Ser Thr

Ser

Lys 5

Ser

Glu

Asn

Tyr Leu 10

Ser

Glu

Leu

Arg

Lys 15

Ile

Ile

Trp

Pro

Ile

Glu

Gin

Tyr

Glu

Asn

Lys

Lys

Phe

Leu

Pro

Leu

Ala

20

25

30

Phe

Met

Met

Phe

Cys

Ile

Leu

Leu

Asn

Tyr

Ser

Thr

Leu

Arg

Ser

Ile

35

40

45

Lys

Asp

Gly

Phe

Val

Val

Thr

Asp

Ile

Gly

Thr

Glu

Ser

Ile

Ser

Phe

50

55

60

Leu

Lys

Thr

Tyr

Ile

Val

Leu

Pro

Ser

Ala

Val

Ile

Ala

Met

Ile

Ile

65

70

75

80

Tyr

Val

Lys

Leu

Cys

Asp

Ile

Leu

Lys

Gin

Glu

Asn

Val

Phe

Tyr

Val

85

90

95

Ile

Thr

Ser

Phe

Phe

Leu

Gly

Tyr

Phe

Ala

Leu

Phe

Ala

Phe

Val

Leu

100

105

110

Tyr

Pro

Tyr

Pro

Asp

Leu

Val

His

Pro

Asp

His

Lys

Thr

Ile

Glu

Ser

115

120

125

Leu

Ser

Leu

Ala

Tyr

Pro

Asn

Phe

Lys

Trp

Phe

Ile

Lys

Ile

Val

Gly

130

135

140

Lys

Trp

Ser

Phe

Ala

Ser

Phe

Thr

Ile

Ala

Glu

leu

Trp

Gly

Thr

145

150

155

160

Met

Met

Leu

Ser

Leu

Leu

Phe

Trp

Gin

Phe

Ala

Asn

Gin

Ile

Thr

Lys

165

170

175

Ile

Ala

Glu

Ala

Lys

Arg

Phe

Tyr

Ser

Met

Phe

Gly

Leu

Leu

Ala

Asn

180

185

190

PL 197 407 Β1

Leu Ala

Lys Thr 210

Ile Met 225

Asn Lys

Lys Glu

Met Ile

Ala Tyr 290

Val Lys 305

Gin Phe

Gly Ser

Thr Pro

Phe Phe 370

Ser Pro 385

Ser Lys

Tyr Ile

Glu Val

Ser Thr 450

Pro Tyr 465

Leu

195

Gin

Ile

Asn

Lys

Phe

275

Gly

Glu

Gin

Asn

Leu

355

Asp

Leu

Gly

Pro

Ile

435

Phe

Phe

Pro Val Thr Ser Val Val Ile 200

Ile Val Ala Glu His Leu Lys 215

Thr Ser Ser Phe Leu Ile Ile 230

Val Leu Thr Asp Pro Arg Leu 245 250

Lys Thr Lys Ala Lys Leu Ser 260 265

Thr Ser Lys Tyr Val Gly Tyr 280

Val Ser Val Asn Leu Val Glu 295

Leu Tyr Pro Thr Lys Glu Ala 310

Phe Tyr Gin Gly Trp Val Ala 325 330

Ile Leu Arg Lys Val Ser Trp 340 345

Met Met Phe Ile Thr Gly Ala 360

Ser Val Ile Ala Met Asn Leu 375

Thr Leu Ala Val Met Ile Gly 390

Val Lys Tyr Ser Leu Phe Asp 405 410

Leu Asp Lys Asp Leu Arg Val 420 425

Gly Gly Arg Leu Gly Lys Ser 440

Phe Ile Leu Phe Pro Val Phe 455

Ala Ser Ile Phe Phe Ile Ile 470

Gly Tyr Phe Leu His Glu 205

Phe Val Pro Leu Phe Val 220

Leu Thr Tyr Arg Trp Met 235 240

Tyr Asp Pro Ala Leu Val 255

Phe Ile Glu Ser Leu Lys 270

Ile Ala Leu Leu Ile Ile 285

Gly Val Trp Lys Ser Lys 300

Tyr Thr Ile Tyr Met Gly 315 320

Ile Ala Phe Met Leu Ile 335

Leu Thr Ala Ala Met Ile 350

Ala Phe Phe Ser Phe Ile 365

Thr Gly Ile Leu Ala Ser 380

Met Ile Gin Asn Val Leu 395 400

Ala Thr Lys Asn Met Ala 415

Lys Gly Gin Ala Ala Val 430

Gly Gly Ala Ile Ile Gin 445

Gly Phe Ile Glu Ala Thr 460

Val Ile Leu Trp Ile Phe 475 480

Ala Val Lys Gly Leu Asn Lys Glu Tyr 485

Gin Val Leu Val Asn Lys Asn 490 495

Glu Lys

PL 197 407 B1

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Komórka rośliny transgenicznej, która jest genetycznie zmodyfikowana, zznmieenn tym, że mśycfiOnzją esastcznaą jest wpkdwnynsais znągtsznOi dbcngw Owntu suOlsiadwsew, Otóac koduje plngtcdową tanatldOnnę ADP/ATP i Otóaeed eOgpaegjn prowadzi dd pddwcżgneain nOtywadśzi plngtyywwej tanagldOnnc ADP/ATP, w pdkówanaiu n dypdwinyąjązcmi aienmdycfiOdwnacmi eeaetyznaie OdmóaOnmi kdśliaacmi n adślia tcpu dniOieed, panc zncm OdmóaOn wgpdmainaej adśliac tanageeaiznaej wcOnnuje nwięOgndaą nnwnatdść gOkdbi w pdkówanaiu n dypdwinyąjązcmi eeaetcznaie aienmddcfiOdwnacmi OdmóaOnmi kdśliaacmi i/lub gcatetcnuje gOkdbię wcOnnujązą pddwcżgndaą nnwnatdść nmcldnc w pdaówanaiu n dypdwinyąjązcmi eeaetcznaie aienmdycfiOdwnacmi OdmóaOnmi adśliaacmi.
2. 2. KośiO^o γοΟΙϊι^ϊranegerjicznejjrweługznntrz. 1, zznmieenntym. żż cząsUteznO kO/wnunaOleiadweed Odduje plngtyddwą tanagldOnnę ADP/ATP n Arabidopsis thaliana.
3. 3. ΡοΟΗγ^ϊrkneuenicząe,zznmieenntym, żż znwietakomOrki γοΟΙ^ϊ rkneuenicząejj jk zndjf aidwnad w nngtan. 1.
4. 4. Owślian tanageeaiznan wedłue nngtan. 3, znamienna tym, że jegt adśliaą mnenncaujązą gOawbię.
5. 5. Roślinatrakeuenicząewaeługznktrz.4, zznmieenntym. żż S roślinykakaryCyn,psunnicz lub niemainOn.
6. 6. Sppwśó watwatznkia roślina trakeuenicząej wakoną-eszj ppdwaCsunśy znwaιkośś sgrodi w pdaówanaiu n adślianmi tcpu dniOieed i/lub, Otóaej gOadbin wcOnnuje nwięOgndaą nnwnatdść nmcldnc w pdaówanaiu ne gOadbią n adślia tcpu dniOieed, znamienny tym, że (n) ^οιΟ^ roślinay moddfika-e się genetycząie ppwrzne warkwandnnie cząsteeząi odbzee Owngu auOleiadweed, Otóac Odduje plngtcdwwą tanagldOnnę ADP/ATP i Otóaeed eOgpaegjn paśwndni do pddwcżgneain nOtcwadśzi plngtyddwej tanagldOnnc ADP/ATP w Odmóaze;

   (b) aeeeaeauje gię adśliaę n OdmóaOi wctwdaądaej neddaie n etnpem (n); dann (z) pdandtd, eweatunlaie, wctwnann gię adśliac n adślia wctwdaądaczh neddaie n etnpem (b).
7. 7. Mnteainł adnmadżeaidwc adśliac, znamienny tym, że mnteainł adnaddznc nnwiean OdmóaOi tanageeaiznae jnO ndefiaidwnad w nngtan. 1.
8. 8. Zaktośuwakie cząsteeznn kOw^ nakleinewaee kody-eszch plaktyCdwa trkkeiośonn ADP/ATP, dd wctwnannain adślia tanageeaiznaczh wcOnnujązczh pddwcżgndaą nnwnatdść gOadbi i/lub gcatetcnujązczh gOadbię wcOnnujązą nwięOgndaą nnwnatdść nmcldnc w pdaówanaiu ne gOadbią n adślia tcpu dniOieed.
9. 9. Sppśuówatwatznkiazmoddfikowakej sUioWL zznmieenytym. żż odejmu-eenotrakojęsUtodi n adśliac ndefiaidwnaej w nngtan. 3 lub n mnteainłu adnmadżeaidwegd ndefiaidwnaegd w nngtaz. 7.