PL194800B1 - Polinukleotydy kodujące białko LbpB Neisseria meningitidis, jego fragment lub białko o określonej identyczności z białkiem LbpB Neisseria meningitidis, komórka gospodarza zawierająca taki polinukleotyd i sposób jej wytwarzania, sposoby wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB i pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego zrekombinowny LbpB, nielipidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, rekombinowny polipeptyd oraz polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, jego fragment oraz swoiste immunologiczne przeciwciało wobec polipeptydu LbpB z Neiss - Google Patents

Abstract

1. Izolowany polinukleotyd kodujacy bialko LbpB Neisseria meningitidis, który jest polinukleotydem o Id. Sekw. nr. 1 (od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274), Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 5, Id. Sekw. nr 7 albo Id. Sekw. nr 9. 2. Izolowany polinukleotyd, obejmujacy sekwencje nukleotydowa, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencja o Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274 na calej jej dlugosci lub obejmujacy sekwencje nukleotydowa, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencja o Id. Sekw. nr 2 na calej jej dlugosci. 3. Izolowany polinukleotyd wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze obejmuje sekwencje nukleotydo- wa, która koduje sekwencje aminokwasowa z Id. Sekw. nr 2 od aminokwasu w pozycji 19 do konca C polipeptydu. 4. Izolowany polinukleotyd obejmujacy sekwencje nukleotydowa, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencja o Id. Sekw. nr 3 na calej jej dlugosci lub obejmujacy sekwencje nukleotydowa, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencja o Id. Sekw. nr 4 na calej jej dlugosci. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są polinukleotydy kodujące białko LbpB Neisseria meningitidis, jego fragment lub białko o określonej identyczności z białkiem LbpB Neisseria meningitidis, komórka gospodarza zawierająca taki polinukleotyd i sposób jej wytwarzania, sposoby wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB i pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego zrekombinowany LbpB, nielipidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, rekombinowany polipeptyd oraz polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, jego fragment oraz swoiste immunologiczne przeciwciało wobec polipeptydu LbpB z Neisseria meningitidis, sposób identyfikacji związków hamujących LbpB z Neisseria meningitidis, szczepionki zawierające polipeptydy LbpB z Neisseria meningitidis lub ich fragmenty lub polinukleotydy, oraz zastosowania kompozycji obejmującej nielipidowane białko LbpB z Neisseria meningitidis i kompozycji zawierającej odpowiadający polinukleotyd. W ogólności wynalazek dotyczy nowo zidentyfikowanych polinukleotydów, kodowanych przez nie polipeptydów oraz zastosowania tych polinukleotydów i polipeptydów oraz ich wytwarzania, przy czym wszystkie te rozwiązania są powiązane z rodziną białek błony zewnętrznej Neisseria (OMP), zaś w szczególności białka B wiążącego laktoferrynę (LbpB). Ponadto, wynalazek dotyczy zastosowania terapeutycznego LbpB w szczepieniu przeciwko chorobom wywoływanym przez Neisseria.

Zapalenie opon mózgowych jest pochodzenia bakteryjnego albo wirusowego, przy czym bakteryjne jest znacznie cięższe. Bakteriami odpowiedzialnymi są głównie Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae i Streptococcus pneumoniae. Od wprowadzenia szczepionki przeciwko H. influenzae typu B (HIB) i włączenia jej w rutynowe szczepienia dzieci, N. meningitidis objęła prowadzenie jako wiodąca przyczyna zapalenia opon mózgowych na świecie, zaś jej częstość tylko w Stanach Zjednoczonych ocenia się na 2600 przypadków rocznie.

Gatunek N. meningitidis jest podzielony na 13 grup serologicznych według składu polisacharydów otoczkowych. Oprócz tego, każda z grup serologicznych została dalej podzielona na serotypy, podtypy i immunotypy na podstawie innych składników bakterii. Trzy serogrupy (A, B i C) przyczyniają się do ponad 90% przypadków zapalenia opon mózgowych, zaś w rozwiniętych społeczeństwach uprzemysłowionych, serogrupa B jest odpowiedzialna za 50-80% przypadków.

Istnieją skuteczne szczepionki oparte na polisacharydach otoczkowych, zapobiegające zapaleniu opon mózgowych wywołane przez N. meningitidis serogrupy A i C. Szczepionki polisacharydowe serogrupy C nie wywołują efektu ochronnego u dzieci poniżej 2 roku życia (zakres wieku, w którym istnieje najwyższe ryzyko rozwinięcia zapalenia opon mózgowych), jednakże wadę tę można przezwyciężyć przez koniugację tych polisacharydów z białkiem nośnikowym. Koniugacja ma dodatkowo zaletę wywoływania pamięci immunologicznej przeciwko antygenowi.

W przeciwieństwie, polisacharyd podgrupy B N. meningitidis wykazuje słabą albo żadną immunogenność u ludzi, niezależnie od koniugacji. Stąd, byłoby niezwykle pożądane otrzymanie szczepionki przeciwko chorobom wywoływanym przez N. meningitidis (w szczególności serogrupy B) innej niż szczepionka oparta na polisacharydach.

Obiecującą klasą potencjalnych szczepionek są szczepionki, które mogą dostarczyć antygeny, które są immunogenne i dostępne dla ludzkiej reakcji odpornościowej. OMP odpowiedzialne za wychwyt żelaza do komórki są szczególnie obiecujące.

Żelazo jest niezbędną substancją odżywczą dla większości bakterii. W przedziale zewnątrzkomórkowym ludzkiego organizmu, żelazo jest kompleksowane głównie z transferryną w surowicy i laktoferryną na powierzchniach śluzowych (Finkelstein i in., 1983), z nieznaczną ilością w postaci wolnej. Stąd, skuteczne zdobywanie żelaza jest istotnym czynnikiem zjadliwości dla bakterii patogennych. W odniesieniu szczególnie do N. meningitidis (bezpośredniego patogenu człowieka) zapotrzebowanie na żelazo jest zaspokajane przez zastosowanie receptorów dla ludzkich białek wiążących żelazo, takich jak transferryną i laktoferryną, które umożliwiają komórce wiązanie tych białek, a następnie pobieranie żelaza koniecznego do wzrostu. Synteza tych receptorów białkowych jest indukowana gdy bakterie odczuwają ograniczenie żelaza.

Białka receptorowe związane z wychwytem żelaza z transferryny, TbpA i TbpB (Cornelissen i in., 1992; Legrain i in., 1993; Andersen i in., 1994) oraz białko A wiążące laktoferrynę (LbpA) (Pettersson i in., 1993; 1994b; Biswas i Sparling, 1995) sklonowano i sekwencjonowano. Białka receptora wiążącego transferrynę tworzą kompleks w błonie zewnętrznej. U N. meningitidis zarówno TbpA i TbpB wydają się być konieczne do transportu żelaza (Irwin i in., 1993). TpbA jest białkiem integralnym błony, podczas gdy TbpB jest lipoproteiną zakotwiczoną w błonie tylko domeną lipidową. WspółPL 194 800 B1 czesny model mechanizmu receptora przewiduje, że transferryna wysycona żelazem wiąże się z kompleksem receptora. W tym kompleksie, białko TbpB rozróżnia pomiędzy transferryną z żelazem i apotransferryną. Wiązanie transferryny powoduje zmiany konformacyjne w receptorze, który uwalnia żelazo z transferryny i otwiera bramkowany kanał w TbpA, zaś żelazo może być transportowane przez błonę zewnętrzną (Cornelissen i Sparling, 1994; 1996).

Receptor laktoferryny uważany jest również za istotny czynnik zjadliwości N. meningitidis. Głównym miejscem wniknięcia do organizmu jest nosogardziel, gdzie laktoferryna jest głównym źródłem żelaza. Ponadto, wstępne doniesienia wskazują, że laktoferryna może przekraczać barierę krew-mózg w trakcie ostrego stanu zapalnego (Gschwentner i in., 1997). Możliwe, że laktoferryna jest również istotnym źródłem żelaza dla meningokoków w późniejszych stadiach zapalenia opon mózgowych, gdy bakterie dosięgają opon mózgowych. Przez zastosowanie procedury izolacji przez powinowactwo, zidentyfikowano pojedynczy receptor białkowy laktoferryny (Schryvers i Morris, 1988). Strukturalny gen tego receptora, nazywany LbpA został scharakteryzowany (Pettersson i in.,1993; 1994b; Biswas i Sparling, 1995), jak również zaproponowano jego model topologiczny białka błony zewnętrznej (Pettersson i in., 1994a). Białko wykazuje homologię z TbpA. Oprócz tego, część ewentualnej ramki odczytu zidentyfikowano powyżej genu IbpA, zaś wywnioskowana sekwencja aminokwasowa wykazuje homologię z TbpB (Pettersson i in., 1994a).

TbpB i inne oczyszczone OMP meningokoków są przedmiotem poprzednich zgłoszeń patentowych, w odniesieniu do zastosowania jako szczepionki przeciwko N. meningitidis (np. TbpB, WO 93/07172; białko powierzchniowe 22 kDa, WO 96/29412; receptor hemoglobiny, WO 96/12020; białko poryny, WO 95/03413; białka pilin, WO 94/08013; OMP 64 kDa, EP 474313-B1).

Istnieje potrzeba identyfikacji i charakteryzacji dalszych członków rodziny OMP, którzy odgrywają rolę w zapobieganiu, łagodzeniu albo korygowaniu dysfunkcji albo chorób, w tym, choć nie wyłącznie, chorób wywołanych przez neisseria (np. zapalenie opon mózgowych).

Przeciwciała przeciwko LbpA nie wydają się być zabójcze dla bakterii, stąd ich zastosowanie jako szczepionka może być ograniczone (Pettersson i in., 1993).

Wynalazek identyfikuje i charakteryzuje inne białko wiążące laktoferrynę, białko wiążące laktoferrynę B (LbpB), jego rolę w wykorzystaniu żelaza z laktoferryny i jego zastosowania terapeutyczne.

Istnieje kilka zalet LbpB jako szczepionek nad innymi OMP. Po pierwsze, w etapie krwiopochodnym choroby wywołanej przez meningokoki u człowieka laktoferryna jest niezbędna dla organizmu, ponieważ ma 300-krotnie wyższe powinowactwo do żelaza niż ludzka transferryna, a stąd wykorzystanie laktoferryny jako źródła żelaza jest niezbędne dla organizmu. Po wtóre, laktoferryna wywiera znany efekt przeciwbakteryjny, zaś jej stężenie we krwi rośnie po zakażeniu. Stąd, istotne dla organizmu jest wiązanie ludzkiej laktoferryny dla uzyskania pewnej odporności na ten efekt. Na koniec, ludzka laktoferryna jest głównym źródłem żelaza dla N. meningitidis w miejscu wniknięcia bakterii do organizmu (nosogardziel).

Istotność tych zalet jest taka, że antygeny LbpB powinny być raczej wyrażane na powierzchni większości meningokoków w organizmie, ponieważ domena powierzchniowa LbpB wydaje się być bardzo zakonserwowana z powodu swego działania wiążącego laktoferrynę, oraz, że reakcja odpornościowa skierowana przeciwko antygenowi LbpB może nie tylko zatrzymać zakażenia meningokokowego we krwi, ale również zatrzymać przeniesienie organizmu w nosogardzieli.

Przedmiotem wynalazku jest izolowany polinukleotydy kodujący białko LbpB Neisseria meningitidis, który jest polinukleotydem o Id. Sekw. nr. 1 (od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274), Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 5, Id. Sekw. nr 7 albo Id. Sekw. nr 9.

Wynalazkiem jest objęty również izolowany polinukleotyd, obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1 (od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274), Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 5, Id. Sekw. nr 7, lub Id. Sekw. nr 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny odpowiednio z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, Id. Sekw. nr 4, Id. Sekw. nr 6, Id. Sekw. nr 8 lub Id. Sekw. nr 10 na całej jej długości, a korzystnie od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu.

Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polinukleotyd obejmujący fragment izolowanego polinukleotydu kodującego białko LbpB Neisseria meningitidis, będącego polinukleotydem o Id. Sekw. nr. 1 (od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274), Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 5, Id. Sekw. nr 7 albo Id. Sekw. nr 9, przy czym fragment ten koduje sekwencję aminokwasową o aktywności antygenowej LbpB N. meningitidis. Korzystnie izolowany polinukleotyd według wynalazku obejmuje sekwencję nu4

PL 194 800 B1 kleotydową, która koduje odpowiednio sekwencję aminokwasową z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10, od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, oraz rekombinacyjny układ ekspresyjny, przy czym polinukleotyd jest zdolny do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB w zgodnej komórce gospodarza. Wynalazkiem objęta jest zatem komórka gospodarza obejmująca polinukleotyd zawierająca taki polinukleotyd.

Wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB, obejmującego hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do wytwarzania polipeptydu i odzyskiwanie polipeptydu z hodowli; oraz sposobu wytwarzania komórki wytwarzającej rekombinowany polipeptyd LbpB, obejmującego transformowanie albo transfekowanie komórki gospodarza rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym polinukleotyd według wynalazku, tak, że komórka gospodarza w odpowiednich warunkach hodowli jest zdolna do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego rekombinowany polipeptyd LbpB, który obejmuje transformowanie albo transfekowanie komórki gospodarza rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym polinukleotyd według wynalazku, tak, że komórka gospodarza w odpowiednich warunkach hodowli jest zdolna do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB.

Ponadto wynalazkiem objęty jest nielipidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis obejmujący sekwencję aminokwasową przynajmniej w 65% identyczną z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości; rekombinowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, obejmujący dodatkową sekwencję aminokwasową, która ułatwia oczyszczanie polipeptydu, przy czym polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przynajmniej w 65% identyczną z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości; polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis będący polipeptydem z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10; polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis obejmujący sekwencję aminokwasową odpowiednio z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu oraz jego białka fuzyjne; oraz fragment polipeptydu LbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10, zachowujący aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu, że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, oraz jego białko fuzyjne.

Wynalazek dostarcza również polinukleotydu obejmującego sekwencję nukleotydową kodującą fragment polipeptydu LbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 zachowujący aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, lub jego białko fuzyjne. Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało swoiste immunologicznie wobec polipeptydu LbpB z N. meningitidis według wynalazku.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji związków, które hamują polipeptyd LbpB z N. meningitidis według wynalazku obejmujący etapy (a) doprowadzenia do kontaktu związku kandydującego z komórkami, które wyrażają polipeptyd LbpB; i (b) obserwowania wiązania, albo zahamowania odpowiedzi funkcjonalnej; albo porównywania pod kątem aktywności wobec polipeptydu LbpB zdolności komórek, które doprowadzono do kontaktu ze związkiem kandydującym z takimi samymi komórkami, które nie były kontaktowane.

Wynalazek dostarcza również szczepionkę zawierającą skuteczną ilość polipeptydu LbpB z N. meningitidis według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie szczepionka według wynalazku obejmuje co najmniej jeden antygen N. meningitidis. Inną szczepionką stanowiącą również przedmiot wynalazku jest szczepionka zawierająca skuteczną ilość fragmentu polipeptydu LbpB z N. meningitidis według wynalazku, przy czym fragment zachowuje aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, lub jego białko fuzyjne, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie szczepionka ta zawiera co najmniej jeden antygen N. meningitidis. Przedmiotem wynalazku jest też szczepionka obejmująca skuteczną ilość polinukleotydu według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

PL 194 800 B1

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji obejmującej skuteczną ilość nielipidowanego LbpB z Neisseria meningitidis według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub hamowania choroby wywoływanej u ludzi przez Neisseria. Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania doustnie, podskórnie, doodbytniczo, dotchawiczo, domięśniowo albo donosowo.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie kompozycji obejmującej skuteczną ilość polinukleotydu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub hamowania choroby wywoływanej u ludzi przez Neisseria. Korzystnie lek ten jest przeznaczony do podawania podskórnie, dotchawiczo, domięśniowo albo donosowo.

Krótki opis rysunków

Figura 1. Analiza met. Western blot białek z całych komórek hodowanych przy ograniczeniu żelaza. Ścieżki 1 i 5, szczep BNCV; ścieżki 2 i 6, mutant IbpA CE1452; ścieżki 3 i 7, mutant IbpB CE1454; ścieżki 4 i 8, mutant IbpAB CE1402. Zastosowano surowice odpornościowe skierowane przeciwko peptydom syntetycznym, opartym na sekwencji LbpB. Ścieżki 1-4, surowica 17-3, przeciwko peptydowi C1; ścieżki 5-8, surowica 19-1 przeciwko peptydowi E1. Położenie wzorców ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie w tysiącach. Białko LbpB zaznaczono strzałką po lewej.

Figura 2. Mapa restrykcyjna fragmentów DNA zawierających gen IbpB i IbpA szczepu BNCV. Wstawki w różnych plazmidach rekombinowanych oraz produkt PCR (PCR) pokazano jako ramki. Plazmidy pAM23 i pAM1 zawierają fragmenty locus IbpBA, który scharakteryzowano uprzednio (Pettersson i in., 1993, 1994a). Otwarte ramki odczytu zaznaczono grubymi strzałkami. Sondy zastosowane do badania przesiewowego biblioteki albo do badania met. Southern'a pokazano powyżej otwartych ramek odczytu. Pozycje starterów zastosowanych do amplifikacji PCR pokazano poniżej otwartych ramek odczytu. Miejsce wprowadzenia kasety oporności na kanamycynę w pAM6K pokazano jako nie wypełniony trójkąt. Miejsce kasety oporności na erytromycynę w pAM23E zaznaczono wypełnionym trójkątem.

Figura 3. Przyrównanie białek LbpB szczepu BNCV i TbpB szczepu B16B6. Aminokwasy identyczne zaznaczono pionową kreską. Liczby po prawej oznaczają pozycje aminokwasowe.

Przerwy (-) wprowadzono w celu optymalizacji przyrównania. Peptydy zastosowane do immunizacji myszy zaznaczono powyżej sekwencji LbpB. Podkreślono dwa ciągi bogate w reszty naładowane ujemnie. Domniemane miejsce odcięcia sygnału przez peptydazę II pokazano strzałką powyżej sekwencji.

Figura 4. Sekwencja promotora powyżej IbpB. Miejsce rozpoczęcia translacji (ATG) zaznaczono wytłuszczoną czcionką. Miejsce wiązania rybosomu, oraz domniemane kasety -10 i -35 podkreślono (odpowiednio, cienką i grubą linią). Domniemaną kasetę Fur wzięto w ramkę.

Figura 5. Analiza met. Western blot białek z całych komórek hodowanych w pożywce TSB (ścieżki 1, 3, 5 i 7) albo w TSB z EDDA (ścieżki 2, 4, 6 i 8). Zastosowanymi przeciwciałami były: monoklonalne mn98k1 i mn98k2, skierowane przeciwko LbpA (panel A) albo surowica odpornościowa 17-3 przeciwko peptydowi C1 LbpA (Panel B). Ścieżki 1 i 2, szczep BNCV; ścieżki 3 i 4, mutant IbpA CE1452; ścieżki 5 i 6, mutant IbpB CE1454; ścieżki 7 i 8, mutant IpbAB CE1402.

Figura 6. A. Analiza met. Western blot białek z błon zewnętrznych szczepu BNCV meningokoków, hodowanego w ograniczeniu żelaza. Białka błony zewnętrznej poddano elektroforezie w warunkach nie denaturujących, i wykrywano białko LbpB przy użyciu surowicy skierowanej przeciwko syntetycznemu peptydowi A1. Ścieżki 1 i 2 pokazują próbki inkubowane w, odpowiednio, 0°C i 95°C przed elektroforezą. Pozycje wzorców ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie w tysiącach. B. Test wiązania laktoferryny na membranach Western, z białkami z kompleksów błony zewnętrznej szczepu BNCV hodowanego w warunkach ograniczenia żelaza. Białka z kompleksów błony zewnętrznej poddano elektroforezie w warunkach nie denaturujących i inkubowano membranę z laktoferryną ludzką sprzęgniętą z peroksydazą. Ścieżki 1-3 pokazują próbki inkubowane w 0°C, 37°C i 95°C, przed elektroforezą. Pozycje wzorców ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie w tysiącach.

Figura 7. Wiązanie laktoferryny z mutantami Ibp w teście ELISA z całymi komórkami. Szczepami, zaznaczonymi po prawej stronie pokryto studzienki. Laktoferrynę dodano w stężeniach 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 i 0 ng/ml (odpowiednio, ścieżki 1-8). Laktoferrynę związaną z komórkami wykrywano surowicą odpornościową swoistą wobec peroksydazie sprzęgniętej z laktoferryną.

Figura 8. Testy płytkowe szczepów z rekombinowaną ludzką laktoferryną. Pokazano jedynie istotną część płytki. Komórki szczepów zaznaczonych po prawej wysiano na płytkach z ograniczeniem żelaza. Pobudzenie wzrostu wokół kropli laktoferryny w zaznaczonym stężeniu śledzono po całonoc6

PL 194 800 B1 nej hodowli. Strzałki pokazują położenie kropli w panelu B. W doświadczeniu zastosowano laktoferrynę wysyconą w 11% żelazem.

Figura 9. Przyrównanie białek LbpB z pięciu szczepów meningokoków. Przyrównanie przeprowadzono przy użyciu programu CLUSTAL (PC Gene, Intelligenetics) i optymalizowano ręcznie. Liczby po prawej stronie oznaczają pozycję aminokwasową. Odstępy (-) wprowadzono w celu optymalizacji przyrównania. Pozycje wszystkich pięciu sekwencji są identyczne, zaznaczone*.

Figura 10. A. Mapa restrykcyjna istotnych części pJP29 (Bosch i in., 1986), pAM31 i pAM32. Pokazano jedynie wstawki. Wektorem jest pACYC184, pJP29 zawierał gen phoE (jasno szary) za swoim promotorem. Promotor i sekwencje flankujące zaznaczono na biało. Miejsce PstI na granicy sekwencji odpowiadało sekwencji sygnałowej i dojrzałemu białku PhoE. pAM31 zawierał od lewej do prawej: promotor phoE (na biało) i rekombinowany gen kodujący sekwencję sygnałową PhoE (jasno szary) i dojrzałe LbpB (czarny). Fragmenty DNA odpowiadające końcowi N LbpA (ciemno szary), końcowi C PhoE (jasno szary) i sekwencje flankujące (białe) są również obecne. pAM32 skonstruowano z pAM31 przez wprowadzenie łącznika (paskowana ramka), kodującego znacznik His i miejsce cięcia czynnika Xa, w miejsce Pstl pAM31. Patrz Przykład 8 opisujący szczegółowo konstruowanie pAM31 i pAM32. Miejsca restrykcyjne na pAM32 zaznaczono nawiasami, ponieważ zostały zniszczone podczas klonowania.

B. Sekwencje aminokwasowe rekombinowanego konstruktu LbpB (poniżej) w porównaniu z sekwencją LbpB typu dzikiego (powyżej). Pokazano jedynie ostatni i pierwszy aminokwas sekwencji sygnałowej LbpB/PhoE i dojrzałej LbpB. Znacznik His i miejsce cięcia czynnika Xa pokazano w całości. Miejsce peptydazy I i II (odpowiednio, Lpasel i II) oraz miejsce cięcia czynnika Xa pokazano strzałkami.

Figura 11. PAGE oczyszczonego rekombinowanego białka LbpB. Ścieżki 1 i 2 pokazują próbki inkubowane, odpowiednio w 0°C i 100°C przed elektroforezą. Położenie wzorców ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie w tysiącach.

Figura 12. Analiza met. Western blot fałdowanych (ścieżki 1, 3, 5, 7 i 9) i denaturowanych (ścieżki 2, 4, 6, 8, i 10) rekombinowanych LbpB pięciu surowic wyzdrowiałych ludzi. Ścieżki 1 i 2, surowica 69; ścieżki 3 i 4, surowica 262439; ścieżki 5 i 6, surowica 262532; ścieżki 7 i 8, surowica 263017; ścieżki 9 i 10, surowica 330. Położenie wzorców ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie w tysiącach. Strzałki po lewej pokazują położenie denaturowanego (dLbpB) i fałdowanego (fLbpB).

Figura 13. Wyniki ELISA przeciwko całym komórkom i przeciwko LbpB (Tabela 7), przeprowadzonych jak to opisano w Przykładzie 10. A. Reakcja przeciwko LbpB u myszy immunizowanych LbpB albo całymi komórkami N. meningitidis szczepu BNCV. Immunizacje kontrolne przeprowadzono przy użyciu roztworu PBS. B. Reakcja przeciwko całym komórkom (szczep BNCV hodowany w warunkach niedoboru żelaza) u myszy immunizowanych LbpB albo całymi komórkami N. meningitidis szczepu BNCV. Immunizacje kontrolne przeprowadzono przy użyciu roztworu PBS. C. Reakcja przeciwko całym komórkom (szczep H44/76 hodowany w warunkach niedoboru żelaza) u myszy immunizowanych LbpB albo całymi komórkami N. meningitidis szczepu BNCV. Immunizacje kontrolne przeprowadzono przy użyciu roztworu PBS.

Figura 14. Wyniki aktywności bakteriobójczych (Tabela 8) surowic przeciwko całym komórkom i przeciwko LbpB szczepu BNCV przeprowadzone jak w Przykładzie 10. A. Miano bakteriobójcze przeciwko szczepowi H44/76 N. meningitidis (hodowanego w warunkach bogatych w żelazo). B. Miano bakteriobójcze przeciwko szczepowi H44/76 N. meningitidis (hodowanego w warunkach pozbawionych żelaza).

Definicje

Poniższe definicje dostarczono w celu ułatwienia zrozumienia pewnych często stosowanych tu określeń.

„LbpB zasadniczo odnosi się do polipeptydu, korzystnie lipoproteiny, o sekwencji aminokwasowej podanej jako Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 albo ich odmian allelicznych.

„Aktywność LbpB albo aktywność polipeptydu LbpB albo „aktywność biologiczna LbpB albo polipeptydu LbpB dotyczy działania metabolicznego albo fizjologicznego LbpB, w tym podobnych aktywności. Konkretnie, aktywność LbpB jest zdolnością do wiązania ludzkiej laktoferryny. Aktywność tą można badać stosując sposób opisany w Przykładzie 6. Włączone do tej definicji są również aktywności antygenowe i immunogenne LbpB. Antygenowość tą można badać stosując metodę badania immunologicznego opisaną w Przykładzie 9, korzystnie stosując surowice poliklonalne przeciwko LbpB szczepu BNCV meningokoków, jak opisano w Przykładzie 10A. Immunogenność można badać przez

PL 194 800 B1 pomiar reakcji przeciwciał (stosując surowice poliklonalne wytworzone przeciwko odmianie) w ELISA z użyciem oczyszczonego LbpB ze szczepu BNCV meningokoków, jak to opisano w Przykładzie 10B.

„Gen IbpB dotyczy polinukleotydu o sekwencji nukleotydowej 100-2271 podanej na Id. Sekw.

nr 1, albo kompletnej sekwencji nukleotydowej podanej jako Id. Sekw. nr 3, 5, 7 albo 9 albo ich odmian allelicznych i/lub sekwencji komplementarnych.

„Przeciwciała w znaczeniu tu zastosowanym obejmują przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, chimeryczne, jednołańcuchowe i humanizowane, jak również fragmenty Fab, w tym produkty bibliotek ekspresyjnych Fab i innych immunoglobulin.

„Izolowane oznacza zmieniony „ręką człowieka stan występowania w naturze. Jeżeli „izolowana kompozycja albo substancja występuje w naturze, została zmieniona albo pobrana z otoczenia albo jedno i drugie. Przykładowo, polinukleotyd albo polipeptyd naturalnie występujący w organizmie zwierzęcia nie jest „izolowany, podczas gdy ten sam polinukleotyd albo polipeptyd oddzielony od substancji współistniejących w stanie naturalnym jest „izolowany w znaczeniu tu zastosowanym.

„Polinukleotyd ogólnie oznacza dowolny polirybonukleotyd albo polidezoksyrybonukleotyd, który może być niemodyfikowanym RNA albo DNA albo modyfikowanym RNA albo DNA. „Polinukleotydy obejmują, bez ograniczania, pojedyncze albo dwuniciowe DNA, DNA stanowiące mieszaninę regionów jedno- i dwuniciowych, jedno- albo dwuniciowe RNA, i RNA stanowiące mieszaninę regionów jedno- i dwuniciowych, cząsteczki hybrydowe obejmujące DNA i RNA, które mogą być jednoniciowe albo częściej dwuniciowe, albo mieszaniny regionów jedno- i dwuniciowych. Oprócz tego, „polinukleotyd oznacza regiony trójniciowe obejmujące RNA albo DNA albo RNA i DNA. Określenie „polinukleotyd obejmuje również DNA i RNA zawierające jedną albo wiele zmodyfikowanych zasad oraz DNA i RNA o szkieletach modyfikowanych dla stabilności albo z innych względów. „Modyfikowane zasady oznaczają, przykładowo zasady trytylowane oraz niezwykłe zasady takie jak inozyna. DNA i RNA modyfikowano w różny sposób, stąd określenie „polinukleotyd obejmuje chemicznie, enzymatycznie albo metabolicznie modyfikowane postaci polinukleotydów zwykle spotykanych w naturze, jak również postaci chemiczne DNA i RNA charakterystyczne dla wirusów i komórek. „Polinukleotydy obejmują również względnie krótkie pollnukleotydy, często określane jako oligonukleotydy.

Określenie „polipeptydy dotyczy dowolnego peptydu albo białka obejmującego dwa albo więcej aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi albo modyfikowanymi wiązaniami peptydowymi, tj. izoestrami peptydowymi. „Polipeptyd dotyczy zarówno krótkich łańcuchów, zwykle określanych jako peptydy, oligopeptydy albo oligomery, jak również dłuższych łańcuchów, zasadniczo określanych jako białka. Polipeptydy mogą zawierać aminokwasy inne niż 20 aminokwasów kodowanych przez geny. „Polipeptydy obejmują sekwencje aminokwasowe modyfikowane procesami naturalnymi, takimi jak obróbka potranslacyjna, albo technikami modyfikacji chemicznej, które są dobrze znane w stanie techniki. Takie modyfikacje są dobrze opisane w podręcznikach i szczegółowych monografiach, jak również w literaturze naukowej. Modyfikacje mogą wystąpić w dowolnym miejscu w polipeptydzie, w tym w szkielecie polipeptydowym, łańcuchach bocznych aminokwasów oraz na końcach aminowych albo karboksylowych. Uwzględnia się, że ten sam rodzaj modyfikacji może występować w tym samym albo różnym stopniu w kilku miejscach w danym polipeptydzie. Dany polipeptyd może również zawierać wiele rodzajów modyfikacji. Polipeptydy mogą być rozgałęzione w wyniku ubikwitynacji albo cykliczne z albo bez rozgałęzień. Cykliczne, rozgałęzione i cykliczne rozgałęzione polipeptydy mogą powstać w wyniku naturalnych procesów potranslacyjnych albo mogą być wytworzone metodami syntetycznymi. Modyfikacje obejmują acetylację, acylację, ADP-rybozylację, amidację, kowalencyjne przyłączenie flawiny, kowalencyjne przyłączenie domeny hemowej, kowalencyjne przyłączenie nukleotydu albo pochodnej nukleotydu, kowalencyjne przyłączenie lipidu albo pochodnej lipidu, kowalencyjne przyłączenie fosfatydyloinozytolu, sieciowanie, cyklizację, tworzenie mostków disiarczkowych, demetylację, tworzenie sieciowania kowalencyjnego, tworzenie cystyny, tworzenie proglutaminianu, formylację, gamma-karboksylację, glikozylację, tworzenie zakotwiczenia GPI, hydroksylację, jodynację, metylację, mirystylację, oksydację, obróbkę proteolityczną, fosforylację, prenylację, racemizację, selenylację, sulfatację, dodanie aminokwasów do białka za pośrednictwem RNA, jak arginylacja i ubikwitynacja, patrz, przykładowo, Proteins Structure and Molecular Properties, wyd. 2, Creighton, Freeman and Company, New York, 1993, i Wold, Posttranslational Protein Modyfications: Perspectives and Prospects, str. 1-12, w Posttranslational Covalent Modification of Proteins, Johnson, Wyd. Academic Press, New York, 1983; Seifert i in., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646 i Rattan i in., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. NY Acad. Sci. (1992) 663:48-62.

PL 194 800 B1 „Odmiana w znaczeniu tu zastosowanym oznacza polinukleotyd albo polipeptyd, który różni się do polinukleotydu albo polipeptydu odniesienia, ale zachowuje zasadnicze właściwości biologiczne. Typowe odmiany polinukleotydu różnią się sekwencją nukleotydową od innego polinukleotydu odniesienia. Zmiany w sekwencji nukleotydowej odmiany mogą, ale nie muszą zmieniać sekwencji aminokwasowej polipeptydu kodowanego przez polinukleotyd odniesienia. Zmiany nukleotydowe mogą spowodować zastąpienia, addycję, delecje aminokwasowe, fuzje i okrawanie polipeptydu kodowanego przez polinukleotyd odniesienia. Typowa odmiana polipeptyd różni się sekwencją aminokwasową od polipeptydu odniesienia. Zasadniczo, różnice są ograniczone w taki sposób, że sekwencja polipeptydu odniesienia i odmiany są ogólnie podobne, zaś w wielu regionach identyczne. Odmiana i polipeptyd odniesienia mogą się różnić w sekwencji aminokwasowej jednym albo wieloma zastąpieniami, addycjami, delecjami w dowolnej kombinacji. Zastąpiona albo wprowadzona reszta aminokwasowa może, ale nie musi być kodowana przez kod genetyczny. Odmiany polinukleotydu albo polipeptydu mogą występować w naturze, jak np. odmiany alleliczne (przykładowo, Id. Sekw. nr 3, 5, 7 albo 9 są odmianami polinukleotydu IbpB o Id. Sekw. nr 1, zaś Id. Sekw. nr 4, 6, 8 albo 10 są odmianami polipeptydu LbpB o Id. Sekw. nr 2) albo może być odmianą nie występującą w naturze. Odmiany polinukleotydów albo polipeptydów nie występujące naturalnie można wytworzyć technikami mutagenezy albo bezpośredniej syntezy. Odmiany powinny zachowywać jedną albo wiele aktywności biologicznych polipeptydu LbpB. Powinny być zdolne do wiązania ludzkiej laktoferryny (korzystnie, jak to opisano w teście aktywności w Przykładzie 6), albo mieć podobne właściwości antygenowe albo immunogenne co LbpB. Antygenowość można najlepiej zbadać stosując badanie immunologiczne opisane w Przykładzie 9, korzystnie stosując surowice poliklonalne przeciwko LbpB szczepu BNCV meningokoków, jak to opisano w Przykładzie 10A. Immunogenność można badać przez pomiar reakcji przeciwciał (stosując surowice poliklonalne wytworzone przeciwko odmianie) w ELISA z użyciem oczyszczonego LbpB ze szczepu BNCV meningokoków, jak to opisano w Przykładzie 10B. Korzystnie, odmiana powinna zachowywać wszystkie powyższe aktywności biologiczne.

„Identyczność jest miarą podobieństwa sekwencji nukleotydowych albo aminokwasowych. Ogólnie, sekwencje przyrównuje się w taki sposób, żeby uzyskać najwyższy stopień dopasowania. „Identyczność per se ma znaczenie zrozumiałe w dziedzinie i można ją obliczyć stosując opublikowane techniki. Patrz, nnp Computational Molecular Biology, Lesk i in., wyd. Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith wyd., Academic Press, New York, 1993; Computer analysis of Sequence Data, cz. I, Griffin i Griffin, wyd. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heijne, Academic Press, 1987; i Sequence Analysis Primer, Gribskov i Devereux, wyd. Stockton Press, New York, 1991). O ile istnieje wiele sposobów mierzenia identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami polinukleotydowymi albo polipeptydowymi, określenie, „identyczność jest dobrze znane specjalistom (Carillo i Lipton, SIAM J. Appl. Math. (1988) 48:1073). Sposoby powszechnie stosowane do określania identyczności albo podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami obejmują, choć nie są ograniczone do ujawnionych w Guide to Huge Computers, Martin Bishop, wyd. Academic Press, San Diego, 1994 i Carillo i Lipton SIAM J. Appl. Math. (1988) 48:1073. Sposoby określania identyczności i podobieństwa są określone w programach komputerowych. Korzystne programy komputerowe do określania identyczności i podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami obejmują, choć nie są ograniczone do pakietu programów GCS (Devereux i in., Nucl. Acids. Res. (1984) 12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul i in., J. Molec. Biol. (1990) 215:403).

Jako ilustracja, polinukleotydem o sekwencji nukleotydowej o przynajmniej, przykładowo, 95% „identyczności z sekwencją nukleotydową odniesienia o Id. Sekw. nr 1 jest taki polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej identycznej z sekwencją odniesienia z takim wyjątkiem, że sekwencja może zawierać średnio do 5 punktów mutacji na każde 100 nukleotydów sekwencji nukleotydowej odniesienia o Id. Sekw. nr 1. Innymi słowy, w celu otrzymania polinukleotydu o sekwencji nukleotydowej w przynajmniej 95% identycznej z sekwencją nukleotydową odniesienia, do 5% nukleotydów w sekwencji odniesienia może być usuniętych albo zastąpionych innymi nukleotydami, albo do 5% całkowitej liczby nukleotydów w sekwencji odniesienia można wprowadzić do sekwencji odniesienia. Mutacje sekwencji odniesienia mogą wystąpić na końcu 5' albo 3' sekwencji nukleotydowej odniesienia albo gdziekolwiek pomiędzy pozycjami końcowymi, rozproszone pojedynczo wśród nukleotydów sekwencji odniesienia, albo w jednej albo wielu ciągłych grupach w sekwencji odniesienia.

Podobnie, polipeptydem o sekwencji aminokwasowej o przynajmniej, przykładowo 95% „identyczności z sekwencją aminokwasową odniesienia o Id. Sekw. nr 2 jest taki polipeptyd o sekwencji peptydowej identycznej z sekwencją odniesienia z takim wyjątkiem, że sekwencja może zawierać

PL 194 800 B1 średnio do 5 zmian aminokwasowych na każde 100 aminokwasów sekwencji peptydowej odniesienia o Id. Sekw. nr 2. Innymi słowy, w celu otrzymania polipeptydu o sekwencji peptydowej w przynajmniej 95% identycznej z sekwencją peptydową odniesienia, do 5% aminokwasów w sekwencji odniesienia może być usuniętych albo zastąpionych innymi aminokwasami, albo do 5% całkowitej liczby aminokwasów w sekwencji odniesienia można wprowadzić do sekwencji odniesienia. Zastąpienia w sekwencji odniesienia mogą wystąpić na końcu aminowym albo karboksylowym sekwencji peptydowej odniesienia albo gdziekolwiek pomiędzy pozycjami końcowymi, rozproszone pojedynczo wśród aminokwasów sekwencji odniesienia, albo w jednej albo wielu ciągłych grupach w sekwencji odniesienia.

Polipeptydy według wynalazku

W jednym aspekcie, wynalazek dotyczy polipeptydów LbpB (albo białek LbpB). Polipeptydy LbpB obejmują polipeptydy o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 (reszty 1-18 stanowią naturalną sekwencję sygnałową każdego z białek, zaś reszta Cys19 jest aminokwasem końca N, który jest lipidowany w naturalnym dojrzałym białku); jak również polipeptydy obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10; i polipeptydy obejmujące sekwencję aminokwasową, która wykazuje przynajmniej 65% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 na całej długości, jeszcze korzystniej przynajmniej 70%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 80%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 90% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10. Ponadto, najkorzystniejsze są takie o przynajmniej 95-99% identyczności. Objęte pojęciem polipeptydów LbpB są również polipeptydy o sekwencji aminokwasowej o przynajmniej 65% identyczności z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 na całej długości, jeszcze korzystniej przynajmniej 70%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 80%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 90% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10. Ponadto, najkorzystniejsze są takie o przynajmniej 95-99% identyczności.

Polipeptydy LbpB dostarczone w Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 są polipeptydami LbpB ze szczepów N. meningitidis, odpowiednio, BNCV, M981, H44/76, M990 i 881607.

Polipeptydy LbpB mogą być w postaci białka dojrzałego albo mogą stanowić część większego białka jak białko fuzyjne. Korzystne może być włączenie dodatkowej sekwencji aminokwasowej, która zawiera sekwencje wydzielnicze albo liderowe (takie jak naturalne sekwencje liderowe LbpB; reszty 1-18 Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10), pro-sekwencje, sekwencje wspomagające oczyszczanie, takie jak wielokrotne reszty histydynowe albo dodatkowe sekwencje dla stabilności podczas wytwarzania rekombinacyjnego.

Fragmenty polipeptydów LbpB są również włączone do wynalazku. Fragment polipeptydu o sekwencji aminokwasowej, która stanowi część, ale nie całość, sekwencji aminokwasowej polipeptydów LbpB. Podobnie jak w przypadku polipeptydów LbpB, fragmenty mogą być „wolne albo włączone do większego polipeptydu, które stanowią część albo region, korzystnie jako pojedyncze ciągły region. Reprezentatywne przykłady fragmentów polipeptydowych według wynalazku obejmują, przykładowo, fragmenty o liczbie aminokwasów około 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100 i 101 od końca polipeptydu LbpB. W tym kontekście „około obejmuje poszczególne wymienione zakresy większe albo mniejsze o kilka, 5, 4, 3, 2 albo 1 aminokwas na jednym końcu albo obu końcach.

Korzystne fragmenty obejmują, przykładowo okrojone polipeptydy o sekwencji aminokwasowej polipeptydów LbpB, z wyjątkiem delecji ciągłego szeregu reszt, które obejmują koniec aminowy albo ciągłego szeregu reszt, które obejmują koniec karboksylowy i/lub region śródbłonowy albo delecję dwóch ciągłych szeregów reszt, które obejmują oba końce, aminowy i karboksylowy. Korzystne są również fragmenty charakteryzujące się cechami strukturalnymi albo funkcjonalnymi takie jak fragmenty obejmujące helisę alfa i regiony tworzące helisę alfa, płachtę beta i regiony tworzące płachtę beta, skręt i regiony tworzące skręt, spiralę i regiony tworzące spiralę, regiony hydrofilowe, regiony hydrofobowe, regiony amfipatyczne alfa, regiony amfipatyczne beta, regiony giętkie, regiony tworzące powierzchnie, regiony wiążące substrat i regiony silnie antygenowe. Innymi korzystnymi fragmentami są fragmenty biologicznie czynne. Fragmentami biologicznie czynnymi są takie, które pośredniczą w aktywności LbpB, w tym fragmenty o podobnej aktywności albo lepszej aktywności, albo o zmniejszonej niepożądanej aktywności. Objęte są również takie fragmenty, które są antygenowe albo immunogenne dla zwierząt, zwłaszcza dla człowieka. Fragmenty powinny zachowywać jedną albo wiele aktywności biologicznych polipeptydu LbpB. Korzystnie, fragmenty polipeptydowe powinny stanowić ciąg (ponad 16 aminokwasów sekwencji aminokwasowej pochodzącej z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10, o aktywności biologicznej antygenowej albo immunogennej takiej jak polipeptyd LbpB pełnej długości, z którego pochodzą.

PL 194 800 B1

Odmiany o określonej sekwencji i fragmenty również tworzą część wynalazku. Korzystnymi odmianami są takie odmiany, które różnią się od postaci odniesienia konserwatywnymi zastąpieniami aminokwasowymi, tj. takie, że zastąpiono resztę inną o podobnej charakterystyce. Zwykle, zastąpienia dokonuje się pomiędzy Ala, Leu, Val i Ile; Ser i Thr; resztami kwasowymi Asp i Glu; Asn i Gln; oraz Lys i Arg; Phe i Tyr. Szczególnie korzystnymi odmianami są takie, które różnią się od postaci odniesienia zastąpieniami aminokwasowymi, które spotyka się w strukturalnie równoważnych pozycjach (jak pokazano przez przyrównanie homologii) w innych sekwencjach LbpB (Przykładowo, przyrównania homologii 5 sekwencji LbpB na Fig. 9). Szczególnie korzystne odmiany obejmują sekwencję aminokwasową, która wykazuje przynajmniej 65% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 na całej długości, jeszcze korzystniej przynajmniej 70%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 80%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 90% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10. Ponadto, najkorzystniejsze są takie o przynajmniej 95-99% identyczności. Przykładowo, na Figurze 9 jeżeli sekwencją odniesienia jest LbpB z BNCV, odmiana powinna mieć zastąpione reszty 300-308 dowolnymi resztami w równoważnej pozycji sekwencji LbpB szczepu H44/76 (reszty, odpowiednio, 305-313), szczepu M990 (reszty 307-315), szczepu M981 (reszty 302-310) albo szczepu 881607 (reszty 303-311). Sekwencję aminokwasową NPDLAKSHA można zastąpić STDVATNLA [ST (z M981, reszty 302-303), D (z BNCV, reszta 302), V (z 881607, reszta 306), A (z M990, reszta 311), T (z H44/76, reszta 310), NLA (z M990, reszty 313-315)] zaś powstałe białko można zaklasyfikować jako odmianę i polipeptyd według wynalazku.

Takie zastąpienia mogą obejmować delecje, przykładowo reszty 357-366 LbpB szczepu M981 (ponieważ nie ma równoważników pozycji aminokwasowych w LbpB szczepu BNCV - patrz, Fig.9), takie białko może stanowić odmianę i polipeptyd według wynalazku.

Oprócz tego, dobrze wiadomo, że genomy N. meningitidis i innych szczepów neisseria (przykładowo N. gonorrhoeae) są genomowo bardzo homologiczne ze sobą. Genomy N. meningitidis i Moraxella catharralis (dawniej Neisseria catharralis) są również wystarczająco homologiczne aby umożliwić wymianę genu. Białka równoważne LbpB (albo odmiany alleliczne LbpB) szczepów neisseria i Moraxella catharralis również stanowią polipeptydy według wynalazku, ponieważ spełniają opisane wyżej kryteria % identyczności sekwencji. Oprócz tego, taki równoważnik powinien stanowić polipeptyd według wynalazku, jeżeli wykazuje wspólną, przynajmniej 65% podobieństwo sekwencji z jedną z sekwencji odniesienia (Ld. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10) na całej długości, mierzone programem BLAST (Altschul i in., (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Karlin i Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin i Atschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7), jeszcze korzystniej przynajmniej 70%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 80%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 90% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10. Ponadto, najkorzystniejsze są takie o przynajmniej 95-99% identyczności. Białka takie powinny wiązać ludzką laktoferrynę (z definicji) i powinny być zdolne do reakcji krzyżowej z surowicami poliklonalnymi przeciwko LbpB ze szczepów meningokoków. Dokładną sekwencję aminokwasową tych odmian można łatwo określić stosując informację o sekwencjach polinukleotydowych i polipeptydowych o Id. Sekw. nr 1-10.

Polipeptydy LbpB według wynalazku można wytworzyć w dowolny sposób. Polipeptydy takie obejmują izolowane, występujące naturalnie lipopolipeptydy, polipeptydy albo lipopolipeptydy wytworzone rekombinacyjnie, polipeptydy wytworzone syntetycznie albo polipeptydy wytworzone kombinacją tych sposobów. Sposoby wytwarzania takich polipeptydów są dobrze znane w dziedzinie wiedzy.

Polinukleotydy według wynalazku

Inny aspekt wynalazku dotyczy polinukleotydów LbpB. Polinukleotydy LbpB obejmują izolowane polinukleotydy, które kodują polipeptydy i fragmenty LbpB, i blisko z nimi spokrewnione polinukleotydy. Konkretnie, polinukleotyd LbpB według wynalazku obejmuje polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową zawartą w Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9, kodujących polipeptyd LbpB o, odpowiednio, Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10, i polinukleotydy o konkretnej sekwencji o Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9. Polinukleotydy LbpB dalej obejmują polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową wykazującą przynajmniej 65% identyczności na całej długości z sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd LbpB o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 i polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową wykazującą przynajmniej 65% identyczności z Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274, i polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z Id. Sekw. Nr 3, 5, 7 albo 9. Pod tym względem, bardziej korzystny jest polinukleotyd wykazujący przynajmniej 70% identyczności, szczególnie korzystne są polinukleotydy wykazujące przynajmniej 80% identyczności, zaś szczególnie korzystne są polinukleotydy wykazujące przynajmniej 90% identyczności. Ponadto,

PL 194 800 B1 polinukleotydy o 95% identyczności są niezwykle korzystne, zaś najkorzystniejsze są polinukleotydy o 98-99% identyczności, przy czym najkorzystniejsze są przynajmniej 99%. Pod pojęciem polinukleotydów LbpB mieszczą się również sekwencje nukleotydowe, które wykazują wystarczającą identyczność z sekwencją nukleotydową zawartą w Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 albo 9, do hybrydyzacji w warunkach umożliwiających amplifikację albo zastosowanie jako sondę albo znacznik. Wynalazek dostarcza również polinukleotydów, które są komplementarne z takimi polinukleotydami LbpB.

Polinukleotydy LbpB dostarczone jako Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9 są polinukleotydami LbpB ze szczepów N. meningitidis, odpowiednio, BNCV, M981, H44/76, M990 i 881607.

Sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd LbpB o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 może być identyczna z sekwencją kodującą polipeptyd, zawartą w nukleotydach od 100 do 2274 Id. Sekw. nr 1, albo sekwencją kodującą polipeptyd, zawartą w Id. Sekw. nr 3, 5, 7 albo 9, albo może być sekwencją, która w wyniku nadmiarowości (redundancji) kodu genetycznego również koduje polipeptyd o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10.

Jeżeli polinukleotydy według wynalazku stosuje się do rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu LbpB, polinukleotyd może obejmować sekwencję kodującą dojrzały polipeptyd (reszty 19 do końca C Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10) albo jej fragment; Sekwencja kodująca dojrzały polipeptyd albo fragment w ramce odczytu z inną sekwencją kodującą, jak sekwencje kodujące sekwencję liderową albo wydzielniczą, sekwencję pre- albo pro- albo pre-pro-białka, albo inne części białka fuzyjnego (przykładowo reszty 1 do 18 Id. Sekw. nr 2, naturalna sekwencja sygnałowa LbpB). Przykładowo, może kodować sekwencję znacznika ułatwiającego oczyszczanie polipeptydu fuzyjnego. W konkretnych korzystnych wykonaniach tego aspektu wynalazku, sekwencją znacznika jest heksapeptyd histydynowy, jak wprowadzany przez wektor pQE (QIAgen, Inc.) i opisany przez Gentz i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:821-824, albo jest znacznikiem HA, albo transferazy S glutationowej. Korzystna jest również fuzja LbpB z naturalną sekwencją sygnałową (reszty 1 do 18 Id. Sekw. nr 2). Polinukleotyd może również zawierać nie kodujące sekwencje 5' i 3', takie jak ulegające transkrypcji, nie ulegające translacji, sekwencje sygnały składania transkryptu i poliadenylacji, miejsca włączania rybosomu i sekwencje stabilizujące mRNA.

Dalszymi korzystnymi wykonaniami są polinukleotydy kodujące odmiany polipeptydu LbpB opisane wcześniej. Najkorzystniej, obejmują one sekwencję aminokwasową polipeptydu LbpB o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10, w których kilka, 10-25, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 albo 1 reszta aminokwasowa została zastąpiona, usunięta albo dodana, w dowolnej kombinacji i zachowują one aktywności biologiczne polipeptydu LbpB.

Wynalazek dotyczy dalej polinukleotydów, które hybrydyzują z opisanymi tu sekwencjami. Pod tym względem, wynalazek szczególnie dotyczy polinukleotydów, które hybrydyzują w surowych warunkach z opisanymi wyżej polinukleotydami. W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „surowe warunki oznaczają, że hybrydyzacja zajdzie tylko wtedy gdy pomiędzy sekwencjami istnieje przynajmniej 80%, korzystnie przynajmniej 90%, zaś najkorzystniej przynajmniej 95%, jeszcze korzystniej 97-99% identyczność.

Polinukleotydy według wynalazku, które są identyczne albo wystarczająco identyczne z sekwencją nukleotydową zawartą w Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 albo 9 albo ich fragmentach, można zastosować jako sondy hybrydyzacyjne dla cDNA i genomowego DNA, w celu wyizolowania cDNA i klonów genomowych pełnej długości, kodujących polipeptyd LbpB oraz w celu izolowania cDNA i klonów genomowych innych genów (w tym genów kodujących homologi i ortologi gatunków innych niż N. meningitidis), które wykazują wysokie podobieństwo do genu LbpB. Takie techniki hybrydyzacji są znane specjalistom w dziedzinie. Zwykle, te sekwencje nukleotydowe są w 80% identyczne, korzystnie w 90%, jeszcze korzystniej w 95% identyczne z sekwencją odniesienia. Sondy zasadniczo obejmują przynajmniej 15 nukleotydów. Korzystnie, sondy takie powinny mieć przynajmniej 30 nukleotydów i mogą mieć przynajmniej 50 nukleotydów. Szczególnie korzystne są sondy w zakresie od 30 do 50 nukleotydów.

W jednym wykonaniu, w celu otrzymania polinukleotydu kodującego polipeptyd LbpB, w tym homologi i ortologi z gatunków innych niż N. meningitidis, sposób obejmuje etapy testów przesiewowych odpowiedniej biblioteki w surowych warunkach hybrydyzacji ze znakowaną sondą o sekwencji nukleotydowej o Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9 albo ich fragmentem; i izolowania klonów cDNA i genomowych pełnej długości zawierających sekwencje polinukleotydowe. Tak wiec w innym aspekcie, polinukleotydy LbpB według wynalazku, dalej obejmują sekwencję nukleotydową obejmującą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w surowych warunkach z sekwencją nukleotydową o sekwencji nukleotydowej Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9, albo ich fragmentów. Objęte są również polipeptydy LbpB

PL 194 800 B1 obejmujące sekwencje aminokwasowe kodowane przez sekwencje nukleotydowe otrzymane w powyższych surowych warunkach hybrydyzacji. Takie techniki hybrydyzacji są dobrze znane specjalistom. Surowe warunki hybrydyzacji są, jak to podano wyżej, albo alternatywnie warunki inkubacji przez noc w 42°C w roztworze zawierającym: 50% formamid, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trisodu), 50 mM fosforan sodu (pH 7,6), 5X roztwór Denhardta, 10°% siarczan dekstranu i 20 pg/ml denaturowanego, fragmentowanego DNA spermy łosia, a następnie płukanie w 0,1xSSC w około 65°C.

Polinukleotydy i polipeptydy według wynalazku można zastosować jako odczynniki badawcze do badania leczenia i środków diagnostycznych u zwierząt i ludzi.

Wektory, komórki gospodarza, ekspresja

Wynalazek dotyczy również wektorów, które obejmują polinukleotyd albo polinukleotydy według wynalazku, i komórki gospodarza, które zmieniono genetycznie przy użyciu wektorów według wynalazku oraz wytwarzania polipeptydów według wynalazku technikami rekombinacyjnymi. Bezkomórkowe układy translacji można zastosować w celu wytworzenia takich białek stosując mRNA pochodzące z konstruktów DNA według wynalazku.

Do rekombinacyjnego wytwarzania, komórki gospodarza można zmienić genetycznie w taki sposób, że obejmują one układy ekspresyjne albo ich części dla polinukleotydów według wynalazku. Wprowadzanie polinukleotydów do komórki gospodarza można przeprowadzić sposobami opisanymi w wielu standardowych podręcznikach, takich jak Davies i in., Basic Methods in Molecular Biology (1986) i Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, jak transfekcja fosforanem wapnia, transfekcja za pośrednictwem DEAE-dekstranu, transfekcja, mikrowstrzyknięcie, lipofekcja za pośrednictwem lipidu kationowego, elsktroporacja, transdukcja, wprowadzanie balistyczne albo zakażenie.

Reprezentatywne przykłady odpowiednich gospodarzy obejmują komórki bakteryjne, takie jak meningokoki (dwoinki), paciorkowce, E. coli, komórki Streptomyces i Bacillus subtilis; komórki grzybów, takie jak drożdże i Aspergillus, komórki owadów takie jak Drosophila S2 i Spodoptera Sf9, komórki zwierzęce jak CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 i komórki czerniaka Bowesa, oraz komórki roślinne.

Można zastosować szereg układów ekspresyjnych. Układy takie obejmują, między innymi, układy chromosomalne, episomalne i wirusowe, np. wektory pochodzące z plazmidów bakteryjnych, z bakteriofagów, z transpozonów, z episomów drożdży, z elementów insercyjnych, z elementów chromosomów drożdżowych, z wirusów takich jak bakulowirusy, wirusy papova, jak SV40, wirus krowianki, adenowirusy, wirusy ospy drobiu, wirusy pseudowścieklizny i retrowirusy, i wektorów otrzymywanych ich kombinacji, takich jak pochodzące z plazmidu i elementu genetycznego bakteriofaga, jak kosmid i fagemid. Układy ekspresyjne zasadniczo mogą zawierać regiony kontrolne, które regulują jak również zapoczątkowują ekspresję. Zasadniczo, można zastosować dowolny układ albo wektor przydatny do utrzymywania, namnażania albo wyrażania polinukleotydów w celu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza. Odpowiednie sekwencje nukleotydowe można wprowadzać do układu ekspresyjnego przy użyciu licznych i dobrze znanych technik, jak np. patrz, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, (wyżej).

W celu wydzielania białka do światła siateczki śródplazmatycznej, do przestrzeni periplazmatycznej albo do środowiska zewnątrzkomórkowego można włączyć do pożądanego polipeptydu odpowiednie sygnały wydzielnicze. Sygnały te mogą być endogenne dla polipeptydu (reszty 1-18 Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10) albo heterologiczne.

W celu wyrażenia lipidowanego, rekombinowanego LbpB, korzystnie endogenny peptyd sygnałowy kodowany jest przez konstrukt genowy zaś korzystnym układem będzie gospodarz bakteryjny.

Jeżeli polipeptyd LbpB ma być wyrażany do zastosowania w testach przesiewowych, zasadniczo, korzystne jest żeby peptyd był wytwarzany na powierzchni komórki. W tym przypadku, komórki można zebrać przed zastosowaniem ich w teście przesiewowym. Jeżeli polipeptyd LbpB jest wydzielany do pożywki, pożywkę można odzyskiwać w celu odzyskania i oczyszczania polipeptydu; Jeżeli produkowany w komórkach, komórki trzeba najpierw rozłożyć przed odzyskaniem polipeptydu.

Polipeptyd LbpB można odzyskiwać i oczyszczać z hodowli rekombinowanych komórek dobrze znanymi sposobami, w tym przez precypitację siarczanem amonu albo etanolem, ekstrakcję kwaśną, chromatografię jonowymienną anionową albo kationową, chromatografię na fosfocelulozy, chromatografię oddziaływań hydrofobowych, chromatografię powinowactwa, chromatografię na hydroksyapatycie, i chromatografię lektynową. Jeszcze korzystniej, do oczyszczania stosuje się wysokosprawną chromaPL 194 800 B1 tografię ciekłofazową. Dobrze znane techniki ponownego fałdowania białek można zastosować w celu regeneracji aktywnej konformacji, gdy polipeptyd został zdenaturowany podczas izolowania i oczyszczanie.

Testy diagnostyczne

Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania LpbB, przeciwciał przeciwko LpbB i faga prezentującego przeciwciała przeciwko LpbB do wykorzystania jako reagenty diagnostyczne. Wykrywanie LpbB może dostarczyć narzędzia diagnostycznego, które można między innymi dodać do diagnostyki albo zastosować do postawienia diagnozy rzeżączki.

Materiały do diagnostyki można uzyskać z komórek osobnika, takich jak komórki krwi, komórki uzyskane z moczu, śliny, bioptatów tkankowych.

Tak więc w innym, aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy zestawu diagnostycznego do diagnostyki choroby albo podejrzenia choroby, szczególnie rzeżączki, który obejmuje:

(a) pollnukleotyd LpbB, korzystnie sekwencję nukleotydową o Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9, albo jej fragment;

(b) sekwencję nukleotydową komplementarną do (a);

(c) polipeptyd LpbB, korzystnie polipeptyd o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10, albo jego fragment; albo (d) przzciwciało przeciwko pc^llj:^^p3tt^dc^wi LpbB, kotzzstnie przeciwko polippetydowi o I d. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 (i bardziej korzystnie przeciwko reszcie 19 końca C polipeptydu o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10).

(e) fag prezerTujący przeciwciało pr^^^(^i\^ł^o pollpeptydowi LpbB, korzystne ρι^^^(^ϊ\^Ι^ο pollpeptydowi o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 (i bardziej korzystnie przeciwko reszcie 19 końca C polipeptydu o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10).

Będzie korzystnie, gdy w każdy z tych zestawów (a), (b), (c), (d) albo (e) będzie mógł zawierać istotny składnik.

Przeciwciała

Polipeptydy według wynalazku albo ich fragmenty, albo ich analogi, albo komórki je wyrażające można również zastosować jako czynnki immunogenne do wytwarzania przeciwciał immunoswoistych wobec polipeptydu LbpB. Termin „immunoswoiste oznacza, że przeciwciała wykazują znacząco większe powinowactwo do polipeptydów według wynalazku, niż ich powinowactwo do innych pokrewnych polipeptydów we wcześniejszym stanie techniki.

Przeciwciała wytworzone przeciwko polipeptydom LbpB można uzyskać przez podawanie według typowych protokołów polipeptydów albo fragmentów niosących epitop, analogów albo komórek zwierzęciu, korzystnie niebędącemu człowiekiem. W celu uzyskania przeciwciał monoklinalnych można stosować każdą technikę do uzyskiwania przeciwciał wytwarzanych przez stałą hodowlę komórkową. Przykłady obejmują technikę hybrydoma (kohler, G. i Milstein, C. Nature (1975) 256:495-497), technikę trioma, technikę hybrydoma ludzkich limfocytów B (Kozbor i in., Immunology Today (1983) 4:72) i technikę hybrydoma EBV (Cole i in., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, str. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).

Techniki do wytwarzania przeciwciał pojedynczego łańcucha (patent amerykański nr 4 946 778) można również wykorzystać do wytwarzania przeciwciał pojedynczego łańcucha przeciwko polipeptydom według wynalazku. Do wyrażania przeciwciał humanizowanych można wykorzystać również myszy transgeniczne, albo inne organizmy w tym inne ssaki.

Powyżej opisane przeciwciała można wykorzystać do wyizolowania albo do identyfikacji klonów wyrażających polipeptyd albo do oczyszczania polipeptydów chromatografią powinowactwa.

Przeciwciała przeciwko polipeptydom LpbB można również wykorzystać między innymi do leczenia rzeżączki (np. rzeżączkowego zapalenia opon mózgowych). Można je również wykorzystać do diagnostyki choroby.

Szczepionki

Inny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi odpornościowej u ssaka (korzystnie człowieka) obejmującego zaszczepienie ssaka polipeptydem LbpB, albo fragmentami niosącymi epitop, analogami, cząstkami pozabłonowymi, albo komórkami (atenuowanymi lub innymi) wystarczającej do wytworzenia przeciwciała i/lub odpowiedzi odpornościowej limfocytów T w celu między innymi ochrony danego zwierzęcia przed rzeżączką. Jeszcze inny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi odpornościowej u ssaka (korzystnie człowieka) obejmującego dostarczanie polipeptydu LbpB poprzez wektor kierujący ekspresją polinukleotydu LbpB in vivo w celu wywołania takiej odpowiedzi odpornościowej, która powoduje wytwarzanie przeciwciała chroniącego dane zwierzę przed chorobami.

PL 194 800 B1

Kolejny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy kompozycji immunologicznej albo formulacji szczepionki, która po wprowadzeniu do ssaka będącego gospodarzem (korzystnie człowieka) wywołuje odpowiedź odpornościową w tego ssaka wobec polipeptydu LbpB, która to kompozycja obejmuje gen LbpB, albo polipeptyd LbpB, albo fragmenty niosące epitopy, analogi, cząstki zewnątrzbłonowe, albo komórki (atenuowane albo inne). Korzystnie formulacja szczepionki może również zawierać odpowiedni nośnik. Kompozycja szczepionki LbpB jest korzystnie podawana doustnie albo pozajelitowo (w tym zastrzyki podskórne, domięśniowe, dożylne, śródskórne). Formulacje korzystne do podawania pozajelitowego obejmują wodne i niewodne sterylne roztwory do wstrzyknięć, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczalne utrzymujące izotoniczność wobec krwi biorcy, wodne i niewodne sterylne zawiesiny, które mogą zawierać czynniki zawieszające albo czynniki zagęszczające. Formulacje mogą występować w pojemnikach zawierających pojedynczą dawkę, albo wiele dawek, na przykład zatopione ampułki i probówki i mogą być przechowywane w jako liofilizaty wymagające jedynie dodania sterylnego płynnego nośnika bezpośrednio przed użyciem. Formulacje szczepionki mogą również zawierać układ adjuwanta nasilający immunogenność formulacji, taki jak układ olej w wodzie i inne układu znane w stanie techniki. Dawkowanie będzie zależeć od swoistej aktywności szczepionki i może zostać łatwo określone przez standardowe doświadczenia.

Jeszcze inny aspekt dotyczy formulacji odpornościowo/szczepionkowej, która obejmuje polinukleotyd według wynalazku, takie techniki są znane w stanie techniki, patrz na przykład Wolff i in., Science, (1990) 247:1465-8.

Testy przesiewowe

Polipeptyd LbpB według niniejszego wynalazku można wykorzystać do procesu przesiewania związków, które antagonizują (antagoniści, albo inaczej inhibitory) polipeptydu LbpB według niniejszego wynalazku. Tak więc, polipeptydy według wynalazku można również wykorzystać do identyfikacji antagonistów w, na przykład komórkach, preparatach bezkomórkowych, bibliotekach chemicznych i naturalnie wytworzonych mieszaninach. Antagoniści ci mogą być naturalnymi, albo zmodyfikowanymi substratami, ligandami, receptorami, enzymami itp., jako przykład może być polipeptyd według niniejszego wynalazku; albo mogą nimi być strukturalne albo czynnościowe mimetyki polipeptydu według niniejszego wynalazku. Patrz Coligan i in., Current Protocols in Immunology 1(2): Rozdział 5 (1991).

Polipeptydy LbpBsa odpowiedzialne za wiele funkcji biologicznych, w tym wiele patologicznych. Zgodnie z tym, pożądane jest znalezienie związków i leków mogących hamować czynności polipeptydu LbpB. Ogólnie, antagoniści mogą być wykorzystani w różnorodnych leczniczych i terapeutycznych celach w takich stanach jak rzeżączka.

Ogólnie, takie procedury przesiewowe mogą obejmować zastosowanie odpowiednich komórek, które wyrażają polipeptyd LbpB albo odpowiadają polipeptydowi LbpB według wynalazku. Takie komórki obejmują komórki ssaka, drożdży, Drosophila albo E. coli. Komórki, które wyrażają polipeptyd LbpB są następnie kontaktowane ze związkiem testowym w celu obserwacji wiązania, albo zahamowania odpowiedzi czynnościowej. Zdolność komórek, które są kontaktowane z ewentualnymi związkami jest porównywana z takimi samymi komórkami, które nie zostały skontakowane z LbpB.

Testy mogą być po prostu testami wiązania ewentualnych związków, w których przyleganie do komórek niosących polipeptyd LbpB jest wykrywane przez znakowanie pośrednie albo bezpośrednie związane z ewentualnym związkiem albo w teście obejmującym współzawodnictwo ze znakowaną substancją współzawodniczącą.

Następnie, testy mogą po prostu obejmować etapy mieszania ewentualnego związku z roztworem zawierającym polipeptyd LbpB w celu stworzenia mieszaniny, pomiaru aktywności LbpB w mieszaninie i porównania aktywności LbpB w mieszaninie w porównaniu ze standardem.

cDNA LbpB, białko i przeciwciała przeciwko białku również można zastosować do zbudowania testów do wykrywania efektu dodawania związków na wytwarzanie mRNA LbpB i białka w komórkach. Na przykład, ELISA wykorzystujące przeciwciała monoklonalne i poliklonalne można zaprojektować do mierzenia wydzielanych albo związanych z komórką poziomów białka LbpB standardowymi sposobami znanymi w stanie techniki, i można to wykorzystać do wykrycia czynników, które mogą hamować wytwarzanie LbpB (zwanego również antogonistą) w odpowiednio przetworzonych komórkach albo tkankach.

Przykłady potencjalnych antagonistów polipeptydu LbpB obejmują przeciwciała, albo w niektórych przypadkach, oligonukleotydy albo białka, które są blisko związane z ligandami, albo substratami polipeptydu LbpB, tj. fragment ligandów albo substratów; albo małe cząstki, które wiążą się z polipepPL 194 800 B1 tydem według niniejszego wynalazku, lecz nie wywołują odpowiedzi, tak wiec aktywność polipeptydu jest zahamowana.

Tak więc w innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy zestawu do przesiewania do identyfikacji antagonistów, ligandów, albo substratów dla LbpB, które obejmują:

(a) polipeptyd LbpB, korzystnie polipeptyd o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10;

(b) rekombinowaną komórkę wyrażającą polipeptyd LbpB, korzystnie polipeptyd o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10;

(c) błonę komórkową wyrażającą pollpeptyd LbpB, korzystnie pollpeptyd o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10;

(d) przeciwciało przeciwko LbpB, przeciwko pollpeptydowi o Id. Sekw.

nr 2, 4, 6, 8 albo 10.

Będzie korzystnie, gdy w każdy z tych zestawów (a), (b), (c), albo (d) będzie mógł zawierać istotny składnik.

Formulacja i podawanie

Peptydy, takie jak rozpuszczalna postać polipeptydów LbpB i peptydy antagoniści albo małe cząstki można formułować w połączeniu z odpowiednim nośnikiem farmaceutycznym. Takie formulacje obejmują terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu albo związku, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik albo zaróbkę. Nośniki takie obejmują, lecz nie są ograniczone do soli fizjologicznej, buforowanej soli fizjologicznej, dekstrosy, wody, glicerolu, etanolu i ich kombinacii. Formulacja powinna odpowidać sposobowi podawania i być dobrze znana w stanie techniki. Wynalazek dotyczy następnie opakowań i zestawów farmaceutycznych obejmujących jeden lub więcej pojemników napełnionych jednym albo więcej składnikami wcześniejszych kompozycji według wynalazku.

Polipeptydy i inne związki według niniejszego wynalazku mogą wykorzystywać jedynie jeden związek albo być w połączeniu z innymi związkami, takimi jak związki terapeutyczne.

Korzystne postaci do podawania układowego kompozycji farmaceutycznych obejmują wstrzyknięcia, typowo wstrzyknięcia dożylne. Mogą być stosowanie inne drogi wstrzykiwania takie jak podskórna, domięśniowa albo dootrzewnowa. Alternatywne sposoby podawania układowego obejmują podawanie przez błony śluzowe i podawanie przezskórnie wykorzystujące środki penetrujące takie jak sole żółciowe albo kwasy fusydowe albo inne detergenty. Dodatkowo, jeśli są poddane prawidłowej formulacji w postaci do podawania dojelitowego albo w postaci kapsułek możliwe jest podawanie doustne. Związki te można podawać domiejscowo, albo lokalnie w postaci maści, past, żeli i podobnych.

Zakres wymaganego dawkowania zależy od wybranego peptydu, drogi podawania, rodzaju formulacji, stanu osobnika i osądu lekarza prowadzącego. Jednakże, odpowiednie dawkowanie waha się w granicach 0,1-100 pg/kg. Jednakże, oczekuje się dużej zmienności potrzebnego dawkowania ze względu na różnorodność dostępnych związków i różniące się skutecznością drogi podawania. Na przykład, podawanie doustne będzie wymagało wyższych dawek, niż podawanie przez wstrzyknięcia dożylne. Zmienności w poziomach dawkowania można dopasować wykorzystując standardowe, empiryczne sposoby optymalizacji, dobrze znane w stanie techniki.

Przykłady

Poniższe przykłady przeprowadzono stosując techniki standardowe, które są rutynowe i znane specjalistom, o ile nie zaznaczono inaczej. Przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając go.

P r z y k ł a d 1: Szczepy bakteryjne i warunki wzrostu

Szczepy bakteryjne wymieniono w Tabeli 1. Meningokoki hodowano przez noc na płytkach z agarem GC (Difco), z dodatkiem Vitox (Oxoid) w nawilżanej atmosferze 5% CO2 w 37°C. Optymalną ekspresję białek regulujących żelazo osiąga się przez dodanie 5 pg/ml chelatora żelaza, kwasu etylenodiamino di-o-hydroksyfenylooctowego (EDDA, Sigma). W celu preparowania próbek do SDS-PAGE, badania immunologicznego i izolowania chromosomalnego DNA, komórki hodowano w opisany wcześniej sposób (Pettersson i in., 1993).

Szczep Y1090 E. coli (Young i Davies, 1983) który zastosowano do namnożenia faga Xgt11, hodowano na podłożu Luria-Bertoldi (LB) z dodatkiem ampicyliny (100 pg/ml), 0,2% maltozy i 10 mM MgCl₂. Szczep DH5a, zastosowany do klonowania, hodowano w pożywce LB z dodatkiem 100 pl/ml ampicyliny, 25 pg/ml kanamycyny albo 100 pg/ml erytromycyny, kiedy konieczna była selekcja rekombinantów. Po transformacji pochodnymi pEMBL19, komórki wysiano na płytki LB z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku i 5-bromo-4-chloro-3-indolo-b-D-galktozydu (40 (pg/ml) i 0,5 mM izopropylo-b-D-tiogalaktopiranozydu w celu poszukiwania plazmidu ze wstawką. Szczep PC2494, zastosowany do

PL 194 800 B1 wytworzenia jednoniciowego DNA trzymano na płytkach z minimalną pożywką, z dodatkiem 5 pg/ml tiaminy i 0,2% glukozy.

P rz y k ła d 2A: Wytwarzanie mysiej surowicy odpornościowej przeciwko peptydom

Peptydy (Fig. 2) syntetyzowano stosując automatyczny syntezator peptydów i sprzęgano z anatoksyną tężcową, jak opisano (van der Ley i in., 1991). Myszy Balb/c immunizowano 50 pg peptydu

20 pg Quil A jako adiuwant. Podawano dwie dawki przypominające. Surowicę zbierano 54 dni po pierwszym wstrzyknięciu.

2B: Identyfikacja produktu genu IbpB

W celu badania czy domniemany gen IbpB koduje białko, wywołano surowice odpornościowe przeciwko syntetycznym peptydom (oznaczone A1-E1 na Fig. 3), które oparte były na wywnioskowanej sekwencji aminokwasowej częściowej ramki odczytu. Surowice badano met. Western blot, wobec całych komórek szczepu BNCV hodowanych w warunkach ograniczonej dostępności żelaza. Surowice przeciwko peptydowi B1 nie wykazywały żadnej reakcji (dane nie pokazane). Surowice przeciwko innym peptydom reagowały z prążkiem wielkości około 95 kDa (Fig. 1). Ponieważ ten prążek nie występował u mutanta IbpB (skonstruowanego, jak to opisano niżej) (Fig. 1, ścieżki 3 i 7), wywnioskowano, że gen IbpB ulega ekspresji w szczepie typu dzikiego, oraz, że koduje białko o ciężarze cząsteczkowym (Mr) 95000. Niektóre z surowic przeciwko peptydom D1 i E1 wykazywały dodatkowo reakcję z prążkiem o Mr 60000 (Fig. 1). Oba te peptydy zawierały sekwencję VVFGAK, która również występowała w TbpB (Fig. 3). Stąd, prążek 68 kDa mógł być TbpB. W celu zbadania tej możliwości, badano met. Western blot mutanta TbpB, N91, oraz szczep rodzicielski B16B6. Surowica 19-1 (przeciwko E1) reagowała z dwoma prążkami 95 kDa i 68 kDa w szczepie B16B6, ale tylko z prążkiem 95 kDa w szczepie N91. Wynik ten wskazuje, że prążek 68 kDa jest rzeczywiście TbpB (dane nie pokazane).

P rz y k ła d 3: SDS-PAGE i badanie immunologiczne

SDS-PAGE białek całych komórek przeprowadzono jak to opisano uprzednio (Pettersson i in., 1990, 1993). W doświadczeniach, w których chciano zapobiec denaturacji LbpB wprowadzono następującą modyfikację. Bufor do próbek nie zawierał b-merkaptoetanolu. Kompleksy błony zewnętrznej nie podgrzewano w 95°C w buforze do próbek przed elektroforezą, ale inkubowano na lodzie albo w 37°C przez 10 minut. W doświadczeniu nad wiązaniem laktoferryny, żel poliakryloamidowy zawierał 5% (wag./obj.) żelu zwykłego i 8% (wag./obj.) żelu zawierającego 0,05% SDS. Bufor elektrod zawierał tylko 0,05% zamiast 0,1% SDS. Elektroforezę przeprowadzono przy stałym napięciu 100 V przez godziny w 4°C. Zastosowano standardowy bufor do próbek z 2% SDS.

Elektoroforezę białek błony zewnętrznej w celu wykrywania pofałdowanych postaci LbpB przeprowadzono na układzie PhastSystem (Pharmacia) według instrukcji producenta, stosując 7,5% (wag./obj.) homogennych żelów poliakryloamidowych z paskami bufora SDS.

Badanie immunologiczne przeprowadzono jak to opisano uprzednio (Pattersson i in., 1990, 1993). W przypadku żelów PhastSystem, bufor zawierał 0,05% SDS), zaś aktywność peroksydazy wykrywano przy użyciu układu ECL według instrukcji producenta (Amersham). Mysie surowice odpornościowe zastosowano w rozcieńczeniu 1:500. Przeciwciała monoklonalne przeciwko LbpA, mn98K1 i mn98K2 (Pattersson i in., 1993) zastosowano jako mieszaninę w rozcieńczeniu 1:2000 każdego.

P rz y k ła d 4:

4A: Strategie klonowania i sekwencjonowania

Biblioteka genowa Xgt11 ze szczepu BNCV została udostępniona przez E.C. Gotschlicht (The Rockefeller University, New York, USA). Bibliotekę namnożono w szczepie Y1090 E. coli i badano przesiewowo sondami DNA BE1 i AP6 (Fig. 2). BE1 wytworzono przez wyizolowanie fragmentu BitEII-EcoRI wielkości 355 bp z plazmidu pAM1 (Pettersson i in., 1993). AP6 była fragmentem EcoRIEcoRV wielkości 417 bp wyizolowanym z plazmidu pAM6. Znakowanie sondy, badanie łysinek i wykrywanie przeprowadzono, jak to opisano (Pettersson i in., 1993), stosując zestaw DIG DNA Labelling and Detection kit (Boehringer Mannheim). λ DNA wyizolowano (Sambrook i in., 1989), po czym wstawkę klonowano do fagemidu pEMBL19. Plazmidowy DNA wyizolowano na minikolumnach Jetstar (Genomed) według instrukcji producenta. Jednołańcuchowy DNA namnożono stosując faga pomocniczego VCSM13 (Stratagene).

Chromosomalny DNA izolowano jak to opisano (ausubel i in., 1989). DNA trawiono AccI i Dral i rozdzielono na 1% żelu agarozowym. Badanie metodą Southern'a przeprowadzono, jak opisano wcześniej (Pettersson i in., 1993). Sondę ES1 (Fig. 2) wytworzono przez wyizolowanie z pAM13 fragmentu EcoRI-Sall wielkości 320 bp i znakowano jak wyżej. Sondę poddano reakcji z fragmentem chromosomalnego DNA trawionego AccI/Dral, wielkości 1,5 kb w badaniu met. Southern'a. Fragmenty

PL 194 800 B1

1,5 kb wy izolowano z żelu i poddano ligacji w pEMBL19. Mieszaninę ligacyjną amplifikowano przez

PCR z uniwersalnym, starterem M13 (Pharmacia) i starterem LB11 (Tabela 2). Polimerazę Goldstar, pochodną polimerazy Taq (Eurogentec) zastosowano do amplifikacji PCR, według instrukcji producenta. Produkt PCR wielkości 1,3 kb oczyszczono z żelu agarozowego.

Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono ręcznie stosując mieszaninę sekwencjonującą deaza-G/A T7 (Pharmacia) albo automatycznie stosując ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer). Do automatycznego sekwencjonowania, znakowanie przeprowadzono stosując zestaw Dye Terminator Cycle Seguencing kit (Perkin Elmer). Startery wewnętrzne (syntetyzowane przez Pharmacia albo Gibco-BRL) oraz startery uniwersalne M13 i startery wsteczne (Pharmacia) zastosowano do sekwencjonowania jednoniciowych DNA, dwuniciowych plazmidowych DNA albo produktu PCR.

Podobne strategie zastosowano do sekwencjonowania genu IbpB ze szczepów H44/76 i M981 N. meningitidis.

4B: Klonowanie i sekwencjonowanie genu IbpB

W celu klonowania brakującej części geny IbpB, bibliotekę genową Xgt11 szczepu BNCV przeszukiwano sondami DNA. Stwierdzono obecność dwóch różnych klonów lambda. Wstawki klonowano do pEMBL19, otrzymując plazmidy pAM6 i pAM13 (Fig. 2) i sekwencjonowano. W ten sposób nie stwierdzono promotora i początku genu IbpB. Kilka innych prób klonowania końca 5' genu zawiodło, co wskazuje, że ekspresja jest toksyczna dla E. coli. W celu uzyskania reszty sekwencji, wytworzony wzbogacony bank chromosomalnego DNA trawionego AccI i Dral. Fragmenty chromosomalnego DNA wielkości około 1,5 kb poddano ligacji z pEMBL19 i przeprowadzono amplifikację PCR bezpośrednio na mieszaninie ligacyjnej, stosując starter (LB11, Fig. 2) oparty na znanej części sekwencji IbpB i starter M13. Powstały produkt PCR (Fig. 2) zastosowano bezpośrednio do sekwencjonowania. Strategia ta pozwalała uniknąć klonowania prawdopodobnie toksycznego dla E. coli genu.

Sekwencjonowanie różnych fragmentów IbpB ujawniło otwartą ramkę odczytu długości 2175 bp. Kodowała ona białko długości 725 aminokwasów (Fig. 3) o ciężarze cząsteczkowym około 79,4 kDa. Analiza sekwencji końca N wykazała charakterystykę sekwencji sygnałowej rozpoznawanej przez peptydazę sygnałową II (von Heijne, 1989). Takie sekwencje sygnałowe występują u prekursorów lipoprotein, które są acylowane na reszcie cysteinowej końca N dojrzałego białka. Podobną sekwencję sygnałową stwierdzono w białku TbpB, które w rzeczywistości było modyfikowane lipidem (Anderson i in., 1994). Dojrzałe białko LbpB ma określony ciężar cząsteczkowy 77,5 kDa, który jest istotnie niższy niż obserwowany w SDS-PAGE ciężar cząsteczkowy 95 kDa, obserwowany podczas elektroforezy na żelu poliakryloamidowym z SDS (SDS-PAGE) (Fig. 1). Badanie przesiewowe bazy danej SwissProt w kierunku podobnych wykazało homologię z TbpB Neisseriae i Actinobacillus pleuropneumoniae. Najwyższą homologię, 33% identyczności (przy użyciu programu PALIGN), stwierdzono dla TbpB N. meningitidis szczepu B16B6 (Legrain i in., 1993) (Fig. 3). W białku TbpB, stwierdzono nieco powtórzeń wewnętrznych i zaproponowano, że cząsteczka ma strukturę dwu-płatową, która wyewoluowała po wewnętrznym podwojeniu (Fuller i in., 1996; Renaud-Mongenie i in., 1996). Gdy 354 aminokwasy końca N dojrzałego LbpB przyrównano z 353 aminokwasami końca C, stwierdzono 30% identyczność i 10% podobieństwo (dane nie pokazane). Wynik ten wskazuje, że LbpB może występować w strukturze dwu-płatowej. Punkt izoelektryczny białka wynosił 4,5. W sekwencji można wyróżnić dwa długie ciągi, bogate w reszty kwasowe (Fig. 3). Ponieważ ciągów tych nie ma w TbpB, mogą być one istotne do wiązania laktoferryny, która, w przeciwieństwie do transferryny jest cząsteczką naładowaną dodatnio.

W obszarze promotora, można wyróżnić typową sekwencję Shine-Delgarno. Oprócz tego, znaleziono dwie domniemane kasety -10 i -35 (Fig. 4). Sekwencja przypominająca miejsce wiązania Fur nakłada się na kasetę -10. Fur działa, w połączeniu z Fe²⁺, jako represor genów regulowanych żelazem, przez wiązanie z sekwencją 19 bp w regionie promotora (Bagg i Neilands, 1987). Sekwencja zgodności tej kasety Fur na postać:

GATAATGATAATCATTATC, zaś 16 z 19 bp tej sekwencji jest zakonserwowane w tym elemencie w promotorze IbpB. Dalej powyżej promotora, stwierdzono bezpośrednie powtórzenie 131 bp (dane nie pokazane. Sekwencja ta występuje przynajmniej dwukrotnie w tym położeniu, to samo powtórzenie stwierdzono poniżej genu IbpA (Prinz i in., obserwacja niepublikowana). Badanie homologii FASTA wykazało homologie tego powtórzenia z wieloma sekwencjami neisseria, w większości flankującymi ramki odczytu (dane nie pokazane).

Homologia sekwencji pomiędzy białkami LbpB szczepów BNCV i M981 N. meningitidis oraz pomiędzy białkami LbpB szczepów BNCV i H44/76 N. meningitidis wynosiła, odpowiednio, 72,7% i 78,5%.

PL 194 800 B1

P r z y k ł a d 5:

5A: Konstruowanie mutantów izogenicznych

Plazmidy pAM23 i pAM6 zastosowano do insercyjnej aktywacji, odpowiednio, IbpA i IbpB. Kasetę oporności na erytromycynę (Erm') z pER2 (Jennings i in., 1993) wycięto CIaI i HindlII. Fragment traktowano polimerazą DNA T4 i poddano ligacji z pAM23 trawionym EcoRV, otrzymując plazmid pAM23E. Kasetę oporności na kanamycynę (Km') z pUC4K (Pharmacia) wycięto HincII. Plazmid pAM6 linearyzowano BglII i traktowano polimerazą DNA T4. Kasetę Km' poddano ligacji w to miejsce, otrzymując plazmid pAM6K. Łącznik, zbudowany z oligonukleotydów nus1 i nus2 (Tabela 2), który zawierał sekwencję wychwytującą z neisseria (GCCGTCTGAA) i jednoniciowe ciągi zgodne z Kpnl, klonowano w miejsce KpnI pAM6K, otrzymując plazmid pAM6K-nus. Geny oporności na antybiotyki znajdowały się w tym samym kierunku co geny IbpA i IbpB w plazmidach, odpowiednio, pAM23E i pAM6K (-nus). Plazmid pAM23E, linearyzowany KpnI zastosowano do transformacji szczepu H44/76, jak to opisano wcześniej (van der Ley i Poolman, 1992). Transformanty selekcjonowano na płytkach GC zawierających 5 pg erytromycyny na ml. Prawidłowe zastąpienie genu w jednym z transformantów, oznaczonym CE1449, potwierdzono przez PCR stosując startery FW5 i DYAS2 (Tabela 2) oraz analizą metodą Southern'a stosując sondę AP23 (Fig. 2; izolowany jako fragment SspI-Hindlll 148 bp z pAM23). Do badania Southern'a, chromosomalny DNA trawiono ClaI i SalI. Izogeniczne mutanty w szczepie BNCV wytworzono przez elektroporację (Genco i in., 1991) ponieważ ten szczep okazał się nie ulegać transformacji. Chromosomalny DNA z mutanta CE1449 IbpA zastosowano do wytworzenia mutanta IbpA. Transformanty selekcjonowano na płytkach GC z erytromycyną i potwierdzano, jak wspomniano wyżej. Plazmid pAM6K-nus zastosowano do wytworzenia mutanta IbpB. Transformanty selekcjonowano na płytkach GC zawierających 100 pg/ml kanamycyny. Prawidłowe zastąpienie genu potwierdzono przez PCR, stosując startery SDA1 i PR1 (Tabela 2), oraz badaniem Southern^ stosując sondę AP23.

5B: Konstruowanie mutantów izogenicznych

W celu potwierdzenia identyczności białka 94 kDa oraz zbadania roli poszczególnych białek wiążących laktoferrynę w wiązaniu i utylizacji laktoferryny, skonstruowano zestaw izogenicznych pochodnych BNCV pozbawionych LbpA albo LbpB, jak to opisano w Przykładzie 5A. Prawidłowe zastąpienie genu potwierdzono przez PCR i badanie Southern'a (dane nie pokazane). Ekspresję LbpA i LbpB w tych mutantach sprawdzono met. Western blot (Fig. 5). Mutant IbpA CE1452, nie wyrażał LbpA (Fig. 5A, ścieżka 4), zaś mutant IbpB CE1454 nie wyrażał białka 94 kDa (Fig. 5B, ścieżka 6). Te wyniki potwierdzają, że gen IbpB jest rzeczywiście wyrażany przez szczepy typu dzikiego, oraz że koduje on białko o Mr 94000, co wynosi znacznie więcej niż obliczony ciężar cząsteczkowy 77,5 kDa. Ponadto, wyniki z Fig. 4 pokazują, że inaktywacji IbpB nie wywiera efektu polaryzującego na ekspresję LbpA (Fig. 5A, ścieżka 6). Oczekiwano tego, ponieważ kaseta oporności na kanamycynę, którą wprowadzono do IbpB nie zawierała terminatora transkrypcji. Uprzednio opisany spontaniczny mutant IbpA CE 1402 (Pattersson i in., 1994b) pozbawiony był również ekspresji LbpB (Fig. 5B, ścieżka 8). Ponieważ zarówno mutant, jak i BNCV są pochodnymi szczepu M986, jego genetyczne podłoże jest takie same jak innych mutantów. Ekspresja LbpA i LbpB wydaje się być regulowana żelazem (Fig. 5). Słaba ekspresja LbpA obserwowana była w szczepie CE1454, nawet, gdy komórki hodowano bez chelatora żelaza (Fig. 5A, ścieżka 5). Ekspresja ta spowodowana jest prawdopodobnie transkrypcją z promotora genu oporności na kanamycynę w IbpB. Jednakże, również w tym przypadku ekspresja LbpA wzrosła kilkakrotnie, gdy szczep hodowano w obecności chelatora żelaza (Fig 5A, ścieżka 6).

P r z y k ł a d 6:

6A: Test wiązania laktoferryny

Wiązanie laktoferryny z całą komórką badano w teście typu ELISA. Rekombinowana ludzka laktoferryna, wytworzona w Aspergillus avamori została udostępniona przez Agennix Inc., Houston, Texas, USA. Laktoferrynę nasycono żelazem, jak to opisano (van Berkel i in., 1995) z następującymi modyfikacjami. Zamiast Fe(NO3)3 zastosowano FeCh, zaś dializę przeprowadzono wobec 5 mM bufora Na₂HPO4/NaH₂PO4 pH 7,7, przez 4 godziny. Kolonie z płytki zawieszono w roztworze soli buforowanym Tris, pH 7,5 (TBS) i zabito przez podgrzanie przez 30 minut w 56°C. Próbki (100 pl) o gęstości optycznej przy 620 nm, wynoszące 0,05 rozdzielono do studzienek płytki do mikromiareczkowania. Próbki pozostawiono do wyschnięcia przez noc w 37°C. Test przeprowadzono w 37°C. Wiązanie nieswoiste zablokowano 100 pl roztworu blokującego, zawierającego 0,5% Protifar (Nutricia) i 0,1% Tween 20 w TBS przez godzinę. Po zablokowaniu, studzienki wypełniono różnymi stężeniami laktoferryny w roztworze blokującym. Stężenie laktoferryny w studzienkach wahało się od 3,125 do 200 ng. Po

PL 194 800 B1 inkubacji przez godzinę w trzech płukaniach pod wodą bieżącą, dodano do studzienek kompleks peroksydazy sprzęgniętej z króliczą surowicą odpornościową przeciwko ludzkiej laktoferrynie (ICN Biochemicals). Przeciwciało zastosowano w rozcieńczeniu 1:5000 w buforze blokującym. Po inkubacji przez godzinę i trzech płukaniach pod wodą bieżącą, dodano peroksydazę (Abdillahi i Poolman, 1987).

Wiązanie laktoferryny z membraną przeprowadzono w następujący sposób. Nieswoiste wiązanie zablokowano przez inkubowanie membrany w 0,2 M buforze Na₂HPO4ZNaH₂PO4 pH 5,7, zawierającym 0,1% Tweed 20 i 0,5% Protifar (Nutricia) przez 2 godziny. Membranę inkubowano z 1,2 pgZml laktoferryny ludzkiej sprzęgniętej z peroksydazą (Pettersson i in., 1993) w buforze blokującym przez godzinę i płukano trzykrotnie buforem blokującym. Aktywność peroksydazy wykrywano w układzie ECL według instrukcji producenta (Amersham).

6B: Test żywienia na płytkach

Meningokoki hodowano przez noc w TSB z dodatkiem Vitox, jak to opisano w Przykładzie 1. Po całonocnej hodowli, 300 pl zawieszono w 3 ml górnego agaru (1% agar GC z 20 pg EDDA na ml, schłodzone do 42°C) i natychmiast wylano na płytki agarowe z dodatkiem Vitox i 20 pg ml EDDA. Krople (10 pl) rekombinowanej ludzkiej laktoferryny (11 % nasycenia żelazem, albo nasyconej jak opisano wyżej) nakroplono na płytkę. Stężenie laktoferryny w kroplach wynosiło, odpowiednio, 10 i 20 mgZml. Płytki hodowano przez noc.

6C: Wiązanie laktoferryny z fałdowanym LbpB na membranie

W celu zbadania, czy laktoferryna może wiązać LbpB poszukiwano warunków w których LbpB nie uległaby denaturacji (patrz, Przykład 6A). Gdy próbki podgrzano w buforze do próbek przed elektroforezą, można było zaobserwować szybsze poruszanie się postaci LbpB białka, prawdopodobnie stanowiącego natywne, pofałdowane białka (Fig. 6A). Postać ta ma ciężar cząsteczkowy około 80 kDa. Po podgrzaniu przez 10 minut w 95°C białko LbpB jest całkowicie denaturowane i migruje jako 94 kDa (Fig. 6A, ścieżka 2). Co ciekawe, jedynie surowica przeciwko peptydowi A1 (Fig. 2) reagowała z szybciej migrującą postacią białka. Peptyd ten zawierał jeden z dwóch ciągów, bogatych w ujemnie naładowane aminokwasy i prawdopodobnie związany jest z wiązaniem laktoferryny. Wiązanie przeciwciał i z pofałdowanym białkiem sugeruje, że ta część białka jest eksponowana, podczas gdy wszystkie inne epitopy peptydu są schowane w pofałdowanej strukturze LbpB.

Następnie oceniano wiązanie laktoferryny z pofałdowanym białkiem LbpB. Białka błony zewnętrznej szczepy BNCV naniesiono na membranę nitrocelulozową i inkubowano z ludzką laktoferryną sprzęgniętą z peroksydazą. Swoistość wiązania laktoferryny okazała się niezwykle wrażliwa na warunki inkubacji, z czego najistotniejsze było pH. W optymalnych warunkach laktoferryna wiązała się swoiście z prążkiem białka o Mr 80 kDa (Fig. 6B, ścieżki 1 i 2). Nie obserwowano wiązania kiedy próbki podgrzano do 95°C przez 10 minut przed SDS-PAGE (Fig. 6B, ścieżka 3). Prążek nie był wykrywany w próbkach mutanta IbpB CE1454 (dane nie pokazane). Stąd, wywnioskowano, że szybsza migracja postaci białka LbpB, prawdopodobnie stanowi pofałdowaną postać białka, jest zdolna do wiązania laktoferryny.

6D: Wiązanie i utylizacja laktoferryny w całych komórkach

Wiązanie laktoferryny z całymi komórkami badano testem typu ELISA. Płytki ELISA pokryto całymi komórkami szczepu BNCV mutantów izogenicznych, i dodano do studzienek laktoferrynę w różnych stężeniach. Wiązanie laktoferryny z komórkami sondowano przeciwciałem przeciwko ludzkiej laktoferrynie sprzęgniętej z peroksydazą (Fig. 7). Mutant IbpB miał nieco zmniejszoną zdolność wiązania laktoferryny. Mutant IbpA wiązał laktoferrynę jeszcze słabiej, podczas gdy podwójny mutant praktycznie nie wiązał laktoferryny (Fig. 7).

Zdolność do zastosowania laktoferryny jako jedynego źródła żelaza badano w teście płytkowym. Meningokoki hodowano w warunkach ograniczenia żelaza na płytkach, krople rekombinowanej ludzkiej laktoferryny nakraplano na płytki i śledzono pobudzenie wzrostu. Mutant IbpB był zdolny do wzrostu na laktoferrynie, podczas gdy mutant IbpA nie był zdolny (Fig. 8).

Laktoferryna była nasycona żelazem w 11%. Ten sam eksperyment przeprowadzono z laktoferryną nasyconą żelazem zasadniczo z tym samym wynikiem, (dane nie pokazane). Dane te wskazują, że białko LbpB jest konieczne dla wychwytu żelaza przez laktoferrynę podczas gdy samo LbpB nie wydaje się być niezbędne.

P r z y k ł a d 7:

Badanie zmienności białka LbpB meningokoków, sekwencjonowanie genów IbpB od dalszych czterech szczepów: H44Z76, M990, M981,881607 (patrz, Tabela 1).

7A: Sekwencjonowanie IbpB z czterech szczepów meningokoków - Metody

PL 194 800 B1

Bakterie hodowano w sposób opisany w Przykładzie 1. Chromosomalny DNA wyizolowano z bakterii rosnących na płytce. Po całonocnej hodowli, bakterie zdrapano z płytek i zawieszono w 1,5 ml bufora 10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8 i 10 μΙ lizozymu (10 mg/ml). Zawiesinę inkubowano przez. 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodano 1,5 ml 2% Triton X-100, 50 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8. Po 15 minutach inkubacji, dodano 10 μl proteinazy K (10 mg/ml). Probówki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ekstrahowano mieszaniną fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (w stosunku 24:24:1), a następnie chloroformem nasyconym wodą. Chromosomalny DNA precypitowano etanolem.

Chromosomalny DNA zastosowano do amplifikacji genu IbpB przez PCR. Startery LB20 i REV2 (Tabela 3) zastosowano wobec szczepów H44/76, M990 i 881607. Startery LB20 i LB23 zastosowano wobec szczepu M981. Startery oparte były na sekwencji IbpB ze szczepu BNCV. LB20 wiązał się powyżej genu IbpB, zaś LD23 i Rev2 na początku genu IbpA. LB23 miał dodatkowe miejsce BamHI na końcu 5'. Do amplifikacji PCR zastosowano polimerazę Goldstar, pochodną polimerazy Taq (Eurogentec) według instrukcji producenta. Temperatura przyłączania we wszystkich przypadkach wynosiła 50°C i przeprowadzano po 30 cykli. Produkty PCR oczyszczano z żelu agarozowego stosując b-agarazę (New England Biolabs) według instrukcji producenta.

Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono metodą „gene walking stosując startery zaprojektowane dla genów IbpB. Startery syntetyzowano w Gibco BRL. Sekwencjonowanie przeprowadzono automatycznie na urządzeniu ABI Prism 310 Genetic Analyser (Perkin Elmer). Znakowanie przeprowadzono stosując zestaw Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin Elmer).

Do translacji sekwencji nukleotydowej na sekwencję aminokwasową zastosowano programy TRANSL, PALIGN i CLUSTAL z pakietu oprogramowania PC Gene 6.70.

7B: Sekwencjonowanie IbpB z dalszych szczepów meningokoków - Wyniki

Sekwencje nukleotydowe genów IbpB czterech szczepów pokazano jako Id. Sekw. nr 3, 5, 7 i 9. Sekwencje nukleotydowe poddano translacji na sekwencję aminokwasową, zaś przyrównanie pięciu znanych sekwencji białek LbpB przedstawiono na Fig. 9. Na poziomie aminokwasowym, identyczność pomiędzy białkami LbpB różnych szczepów wynosiła 70-80%. Porównanie parami przedstawiono w Tabeli 4.

P r z y k ł a d 8:

Poziom ekspresji LbpB w N. meningitidis jest bardo niski; białka nie można wykryć podczas analizy białek błony zewnętrznej metodą SDS-PAGE. Do badań immunologicznych i strukturalnofunkcjonalnych białka LbpB wytworzono konstrukt do ekspresji białka w E. coli. W celu ułatwienia oczyszczania rekombinowanego białka, białko zawierało znacznik His, zaś modyfikacji lipidem końca N zapobiegnięto przez zastąpienie natywnej sekwencji sygnałowej i pierwszych reszt aminokwasowych domeny dojrzałej.

8A: Ekspresja rekombinowanego LbpB - Szczepy bakteryjne i warunki wzrostu

Szczep meningokoków BNCV (-:2a:P.2) hodowano przez noc na płytkach z agarem GC (Difco) z dodatkiem Vitox (Oxoid) w nawilżanej atmosferze 5% CO₂ w 37°C. Konstrukt kodujący rekombinowane białko LbpB wyrażono w szczepie E. coli CE1448 (udostępnionym przez C. Jansen), który jest pochodną htrA ompT szczepu CE1224 (Tommassen i in., 1983). Szczep hodowano w 37°C w syntetycznej pożywce buforowanej HEPES (Tomamassen i Lugtenberg, 1980) z dodatkiem substancji odżywczych koniecznych z powodu mutacji auksotroficznej i 1,32 mM K2HPO4 (warunki z fosforanami). Po całonocnej hodowli, hodowle rozcieńczono 1:13,5 w tej samej pożywce, ale bez K2HPO4 (warunek bez fosforanów) i hodowano przez 6 godzin w 37°C.

8B: Ekspresja rekombinowanego LbpB - klonowanie w E. coli

Chromosomalny DNA wyizolowano z komórek meningokoków hodowanych przez noc na płytkach. Bakterie zdrapano z płytek i zawieszono w 1,5 ml bufora 10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8 i 10 μl lizozymu (10 mg/ml). Zawiesinę inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodano 1,5 ml 2% Triton X-100, 50 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8. Po 15 minutach inkubacji, dodano 10 μl proteinazy K (10 mg/ml). Probówki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ekstrahowano mieszaniną fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (w stosunku 24:24:1), a następnie chloroformem nasyconym wodą. Chromosomalny DNA precypitowano etanolem.

Chromosomalny DNA zastosowano jako matrycę do amplifikacji części genu IbpB, odpowiadającej dojrzałemu LbpB przez PCR stosując startery LB22 i LB23 (Tabela 5). Starter LB22 rozpoczynał reakcję w miejscu odpowiadającym części końca N LbpB i wprowadzał miejsce Pstl do produktu PCR. LB23 rozpoczynał reakcję tuż poniżej IbpB na początku genu IbpA i wprowadzał miejsce BamHI. PoPL 194 800 B1 limerazę Pwo (Boehringer Mannheim), enzym nie mylący się, zastosowano do reakcji PCRwip. Temperatura przyłączania wynosiła 60°C i przeprowadzano 30 cykli. Produkt PCR izolowano z żelu stosując β-agarazę (NEB) według instrukcji producenta. Produkt PCR trawiono Pstl i BamHI, po czym poddano ligacji do pJP29 (Fig. 10A), który również trawiono Pstl i BglII. W powstałym konstrukcie, pAM31, znikły miejsca BamHI i Bglll. Białko LbpB ulegało ekspresji w tym konstrukcie pod kontrolą promotora phoE i zawierało sekwencję sygnałową PhoE zamiast autentycznej sekwencji. Ponadto, pierwsze dwie reszty końca N zmieniono z, odpowiednio, Cys i Ile na Ala i Val. W celu ułatwienia oczyszczania białka pomiędzy sekwencję sygnałową i dojrzałą część LbpB wprowadzono znacznik His. pAM31 trawiono Pstl i poddano ligacji z łącznikiem obejmującym oligonukleotydy VGO12a i VGO13a (Tabela 5), otrzymując plazmid pAM32 (Fig. 10A). Miejsce Pstl stracono po pierwszej ligacji. Łącznik kodował sześć reszt His i miejsce cięcia czynnika Xa (Fig. 10B).

8C: Oczyszczanie rekombinowanego LbpB

Rekombinowane LbpB wytwarzanie w szczepie CE1448 zawierającym pAM32. Komórki ograniczane co do fosforanów z 5-litrowej hadowli płukano 500 ml soli fizjologicznej i zawieszono w 150 ml 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8,0. Zawiesinę zamrożono w -20°C na noc. Komórki odmrożono i dodano trzy tabletki mieszaniny inhibitorów proteaz (Complete™, Boehringer Mannheim). Komórki przepuszczono dwukrotnie przez prasę French'a pod ciśnieniem 8000 psi. Nie zniszczone komórki usunięto przez wirowanie na rotorze Sorvall GSA przy prędkości 5000 rpm przez 20 minut. Nadsącz odwirowano na rotorze Beckman T160 przy prędkości 40000 rpm przez 90 minut. Otoczki komórkowe rozpuszczono w 5 mM buforze Na₂HPO4-NaH₂PO4, pH 7,6.

Otoczki komórkowe ekstrachowano dwukrotnie 2% n-oktylooligo-oksyetylenem (Oktylo-POE) w 37°C. Pierwszą ekstrakcję prowadzono przez godzinę, zaś drugą przez 3 godziny, po czym nierozpuszczalne białka zwirowano na rotorze Beckman TLA100.2 przy prędkości 100000 rpm przez godzinę. Nadsącze zawierające białko LbpB połączono i dodano agarozę Ni-NTA. Oczyszczanie białek przeprowadzono partiami w natywnych warunkach, według instrukcji producenta (Qiagen). Stężenie imidazolu i NaCl wynosiło, odpowiednio, 20 mM i 300 mM, podczas wiązania i płukania. W sumie zastosowano 2 ml agarozy Ni-NTA, podzielone na 10 probówek. Elucję przeprowadzono etapowo przy użyciu 3 ml 100 mM, 200 mM i 250 mM imidazolu. Po elucji, białko dializowano dwukrotnie w woreczkach Spectra/Por 2 (Spectrum) wobec 2,5 l roztworu soli buforowanego fosforanem. Białko zatężono w urządzeniu Fugisept Maxi Centrifugal Concentrator (Intersept) o ciężarze odcięcia 10 kDa. Wirowanie przeprowadzono na rotorze Sorvall GSA przy prędkości 5000 rpm do objętości 1-1,5 ml.

Elektroforezę na żelu poliakryloamidowym (PAGE) przeprowadzono w sposób opisany przez Lugtenberg i in., (1975) z niewielkimi modyfikacjami. Żel poliakryloamidowy został skomponowany z 5% żelu stałego i 11% żelu rozpuszczalnego, nie zawierającego SDS. W celu zapobieżenia denaturacji LbpB próbka buforu nie zawierała b-merkaptoetanolu (Lugtenberg i in., 1975), i próbki trzymano w 0°C przed rozpoczęciem elektroforezy. W celu denaturacji LbpB bufor uzupełniono b-merkaptoetanolem, i próbki gotowano przez 5 min. Elektorforezę przeprowadzono w przy prądzie stałym 20 mAmp w temp. 4°C. Żel barwiono błękitem brylantowym Coomassie.

8D: Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanego LbpB - Wyniki

Rekombinowaną postać LbpB N. meningitidis szczepu BNCV wyrażano w E. coli szczepu CE1448. Wytworzono konstrukt, pAM32, kodujący rekombinowane białko obejmujące sekwencję sygnałową PhoE, znacznik His i dojrzałe białko LbpB (Fig. 10A). Białko wyrażano pod kontrolą promotora phoE w warunkach ograniczenia fosforanów. Autentyczną sekwencję sygnałową typu II LbpB zastąpiono sekwencją sygnałową typu I, zaś znacznik His poprzedzał miejsce cięcia czynnika Xa, wprowadzonego pomiędzy sekwencję sygnałową i dojrzałą LbpB. Ponadto, dwa pierwsze aminokwasy dojrzałej LbpB Cys i Ile, zastąpiono, odpowiednio, Ala i Val (Fig. 10B). W konsekwencji, rekombinowane białko nie mogło być modyfikowane lipidem na N-końcowej Cys. Rekombinowane białko LbpB frakcjonowało z błonami komórkowymi, a nie z białkami rozpuszczalnymi (dane nie pokazane). Stąd, ekstrachowano je z błon przy użyciu detergentów. Zastosowano Oktylo-POE, ponieważ rozpuszczał około 50% całkowitej ilości rekombinowanego LbpB z błon. Ponadto, gdy ekstrachowane białko nie jest denaturowane przez gotowanie w buforze do próbek, migruje ono szybciej w PAGE, niż białko denaturowane (dane nie pokazane), co wskazuje, że białko jest prawidłowo fałdowane. Po ekstrakcji, białko znakowane His oczyszczano przez chromatografię powinowactwa z Ni. Większość białka eluowała we frakcji 100 mM i 200 mM imidazolu. Jednakże, wszystkie frakcje połączono przed dializą. Białko było czyste, co sprawdzono przez barwienie żelu błękitem Coomassie (Fig. 11), zaś jego większość występowała w postaci pofałdowanej, która migrowała szybciej podczas PAGE, niż postać de22

PL 194 800 B1 naturowana. Fałdowaną postać LbpB, ale nie postać denaturowaną wiązała laktoferrynę na błonie co wykazano w przykładzie 6.

P r z y k ł a d 9:

W celu zbadania immunogenności białka LbpB u ludzi, badano obecność przeciwciał rozpoznających białko LbpB szczepu BNCV w surowicach ozdrowieńców przy użyciu testu immunologicznego.

9A: Immunogenność LbpB u człowieka - Metody

Dziesięć surowic od ozdrowieńców uzyskano od SmithKline Beecham Biologicals SA, Belgia i siedem od the National Institute of Public Health and the Environment, Holandia (Tabela 6). Osobnicy byli zakażeni szczepami o różnych serotypach i podtypach.

Rekombinowny LbpB wyizolowano stosując procedurę opisaną w Przykładzie 8. Elektroforezę na żelu poliakrylamidowym (PAGE) przeprowadzono w sposób opisany przez Lugtenberga i in., (1975) w kilkoma modyfikacjami. Żel poliakrylamidowy został skomponowany z 5% żelu stałego i 11% żelu rozpuszczalnego, nie zawierającego SDS. W celu zapobieżenia denaturacji LbpB próbka buforu nie zawierała b-merkaptoetanolu (Lugtenberg i in., 1975), i próbki trzymano w 0°C przed rozpoczęciem elektroforezy. W celu denaturacji LbpB bufor uzupełniono b-merkaptoetanolem, i próbki gotowano przez 5 min. Elektorforezę przeprowadzono w przy prądzie stałym 20 mA w temp. 4°C.

Znakowanie immunologiczne przeprowadzono w sposób opisany przez Petterssona i in., (1993). Ludzką surowicę rozcieńczono 1:500. Jako drugie przeciwciało zastosowano skoniugowane z peroksydazą królicze przeciwciało przeciwko ludzkiemu Igg (Dako A/S) w rozcieńczeniu roboczym 1:5000. Aktywność peroksydazy badano stosując system ECL zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta (Amersham).

9B: Immunogenność LbpB u człowieka - Wyniki

Obecność przeciwciał swoistych wobec LbpB w ludzkiej surowicy badano wobec oczyszczonego, rekombinowanego białka LbpB szczepu BNCV (-:2a:P1.2) w prążkach testu immunologicznego. Reaktywność badano zarówno wobec pofałdowanego LbpB i wobec zdenaturowanego białka (patrz na przykład Fig.12). Wyniki przedstawiono sumarycznie w Tabeli 6. Cztery surowice silnie reagowały zarówno ze zdenaturowaną, jak i pofałdowaną postacią LbpB. Pięć surowic reagowało słabo z obiema postaciami, dwie surowice słabo jedynie z postacią pofałdowaną, dwie surowice słabo z jedynie postacią zdenaturowaną, cztery surowice nie reagowały wogóle z LbpB. Wyniki te wskazują na to, że LbpB meningokokowego zapalenia opon mózgowych wywołuje odpowiedź odpornościową u ludzi i sugerują znaczący stopeń wywoływania krzyżowej reaktywności pomiędzy białkiem LbpB pochodzącym z różnych szczepów.

P r z y k ł a d 10: ELISA & Testy baketriobójcze wykorzystujące surowicę uzyskaną od myszy immunizowanych komórkami meningokokowymi albo LbpB

10A: Protokół immunizacji

Immunizacja szczepem BNCV N. meningitidis: Grupy 10 myszy (6-cio tygodniowe Balb/C) immunizowano (100 pi dootrzewnowo albo 100 pi podskórnie) trzykrotnie 5 x 10⁸ CFU inaktywowanymi gorącem całymi komórkami BNCV w adiuwancie SBAS2.

Immunizację przeprowadzono w odstępach 21 dniowych, i krew upuszczono 56 dnia przez nakłucie worka osierdziowego. Surowicę zbierano i dzielono na grupy.

Immunizacja LbpB pochodzącym ze szczepu BNCV N. meningitidis: Przeprowadzono takim samym sposobem jak opisany powyżej za wyjątkem tego, że dwie pierwsze immunizacje przeprowadzono 10 pg nieoczyszczonego LbpB (otoczki komórek E. coli zawierające rekombinowane LbpB) i trzecią immunizacje przeprowadzono 2,5 pg czystego LbpB (przygotowanego w sposób opisany w Przykładzie 8).

10B: Pomiary odpowiedzi w teście ELISA z całymi komórkami (WCE) i w teście ELISA z oczyszczonym LbpB

Zastosowano płaskodenne 96-studzienkowe płytki immunologiczne Nunc. 100 pl inaktywowanych ciepłem Neisseria meningitidis szczepu B [hodowano w warunkach niedoboru żelaza (fe-) z zastosowaniem EDDA jak opisano w Przykładzie 1] (20 pg/ml całkowitego białka) zawieszone w PBS dadawano do poszczególnych studzienek i pozwolono na odparowanie w temp. 37°C przez noc.

Pokryte płytki przemywano czterokrotnie 0,9% NaCl, 0,05% Tween i nasycano 0,3% PBS Casein (Merck) przez 30 min. w temperaturze pokojowej, mieszając i przemywając w tym samym czasie. 100 pl uzyskanej surowicy było 100-krotnie przemyte w 0,05% PBS Tween 20, 0,1% kazeinie dodano do pierwszej studzienki, następnie dwukrotne rozcieńczenie aż do rozcieńczeń 12 krotnych, i płytki inkubowano przez 30 min w temp. 37°C mieszając. Po przemyciu, dodano 100 pl 2000-krotnego rozcieńczenia biotyny przeciwko mysim immunoglobulinom (Dakopatts E0413) w 0,05% PBS Tween 20,

PL 194 800 B1

0,3% kazeina i płytki inkubowano tek samo jak poprzednio. Płytki następnie przemywano i dodano 100 μΙ 4000-krotnego rozcieńczenia kompleksu streptawidyna biotynylowana peroksydaza chrzanowa w 0,05% PBSPBS Tween 0,05% i płytki inkubowano w ten sam sposób. Po przemyciu, dodano 100 μl świeżo przygotowanego roztworu 4 mg barwnika O-fenylodiaminy (OPDA) (sigma P8787) w 0,1 M buforze cytrynowym o pH 4,0 i płytki inkubowano przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemnym pomieszczeniu. Reakcję zatrzymano przez dodanie 50 μl 1 N HCl. Absorbancję mierzono przy 490 nm.

Anty-LbpB ELISA pracowało w ten sam sposób jak WCE za wyjątkiem tego, że pokrycie płytek było inne. Płytki pokryto 100 μl roztworu 0,5 μg/ml czystego LbpB w 0,05 M buforze węglan/biwęglan o pH 9, 6 i inkubowano przez noc w temp. 37°C (nie odparowywano).

10C: Test Bakteryjny

Hodowlę meningokoków grupy B (szczep H44/76) [również hodowany w warunkach niedoboru żelaza (fe-) tak jak to opisano w Przykładzie 1, albo w warunkach bogatych w żelazo (fe+) uzyskanych przez brak dodatku EDTA) w logarytmicznej fazie wzrostu (OD-0,3) zawieszano w sterylnym roztworze Hanksa z 0,3% BSA w celu uzyskania zawiesiny czynnych komórek dopasowanej do 20000 CFU/ml.

Mieszaninę do pierwszej reakcji (75 μ) przygotowano tak, że zawierała 50 μl/studzienkę dwukrotnie rozcieńczone próbki badanej surowicy (przykład 10A) (inaktywowanej ciepłem w 56°C przez 30 min) i 25 μl/studzienkę 20000 CFU/ml fazy logarytmicznej meningokoków grupy B. Probówki reakcyjne przechowywano w 37°C przez 15 min i wstrząsano przy 210 rpm.

Końcowa mieszanina reakcyjna (100 μ) dodatkowo zawierająca 25% wcześniej zbadanej surowicy osesków króliczych jako źródło dodatkowe inkubowano w tych samych warunkach przez 60 min. Sterylne polistyrenowe u-denne 96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania zastosowano w tym teście.

μl próbki pobrano z każdej studzienki stosując wielokanałową pipetę i nakraplano na płytki agarowe Mueller-Hinton zawierające 1% Izovitaleksu i 1% inaktywowanej ciepłem surowicy końskiej i inkubowano przez 18 godz. w temp. 37°C, w 5% CO2. Poszczególne kolonie mogły być liczone do 80 CFU na próbkę.

Następujące trzy próbki badane wykorzystane jako kontrole: bufor+bakteria+dopełniacz; bufor+bakteria+inaktywowany dopełniacz; surowica+bakteria+inaktywowany dopełniacz.

Miana kalkulowano stosując procedurę programu Excel (Mikrosoft). Procedura ta dała możliwość precyzyjnych pomiarów rozcieńczeń odpowiadających 50% zabitych komórek przez wyliczenia regresyjne.

P rzykła d 10: Wyniki

Tabela 7 i Figura 13 pokazują, że immunizacja LbpB wywołuje dobrą odpowiedź przeciwko LbpB (Fig 13A), jak rónież przeciwko próbkom całych komórek ze szczepu BNCV (źródło rekombinowanego LbpB) i szczepu H44/76 (LbpB wykazujący jedynie 78,5% identyczności sekwencji z BNCV) (Figura 13B i C). Uzyskana surowica z wykorzystaniem schematu immunizacji obejmuje jedynie rekombinowane LbpB dające podobne rezultaty (dane nie pokazane). Przejrzysta immunizacja przeciwko całym komórkom szczepem BNCV prowadzi do wyższych poziomów w teście ELISA pełnokomórkowym zarówno dla komórek BNCV, jak i H44/76 (odpowiednio Fig. 13B i C).

Dodatkowo, immunizacja rekombinowanym LbpB ze szczepu N. meningitidis BNCV wywołuje przeciwciała, które wiążą białko o podobnym ciężarze cząsteczkowym w próbkach pełnokomórkowych z Moraxella catarrhalis przepuszczonych na żeli elektroforetycznych co przeprowadzono jak opisano w Przykładzie 9 (dane nie pokazane).

Tabela 8 i Fig. 14 pokazują, że przeciwciała wytwarzane w surowicy po immunizacji rekombinowanym LbpB (ze szczepu BNCV) są bakteriobójcze wobec heterologicznego szczepu (H44/76), którego LbpB wykazuje jedynie 78,5% identyczności sekwencji z BNCV. Istnieje również przykład wykorzystujący surowicę uzyskaną po schemacie immunizacji obejmującym jedynie rekombinowany LbpB (dane nie pokazane). Jest to prawdziwe, gdy H44/76 hodowany jest w otoczeniu zawierającym żelazo (Fig. 14A) i pozbawionym żelaza (Fig. 14B). Wydaje się, jak należało tego oczekiwać, że jest to większy efekt w otoczeniu pozbawionym żelaza, LbpB jest wyrażane w większej ilości, gdy bakterie są w tych warunkach.

Tak więc LbpB jest antygenem immunoochronnym i następnie, pokazano dowody dostarczające krzyżową ochronę immunologiczną przeciwko heterologicznym szczepom N. meningitidis.

PL 194 800 B1

T a b e l a 1. Zastosowane szczepy bakteryjne i plazmidy

Szczep	a Opis	Odnośnik/Źródło
N. meningitidis
H44/76	B:15:P1.7,16	E. Holten
CE1449	H44/76 /óp4::Ermr	Niniejsze zgłoszenie
BNCV	-;2a:P1.2 Nonencapsułated derivative of M986	E.C. Gotschiich
CE1452	BNCV /M4::Erm	Niniejsze- zgłoszenie
CE1452	BNCV IbpB. :Kmr	Niniejsze zgłoszenie
CE1402	M986 IbpA, IbpB	Pettersson et al. 1994a
M990	B:6:P1.6
881607	B:nt:P1.12
B16B6	B:2a:P1.2	A. Schryvers
N91	B16B6 /óp£	A. Schryvers
M98!	B:4:nt
£ coli
DH5a		Laboratory stock
Y1090	Ampr	Young and Davis, 1983
PC2494	hsdR derivative of JM 101	Phabagen Collection
Plazmidy
pEMBL19	Ampr	Laboratory stock
pUC4K	Kmr-box, Ampr	Pharmacia Biotech
pER2	Ermr-box in pBiuescript, Ampr	jennings et al., 1993
pAM6	pEMBL19 carrymg par^t.s' of IbpA and IbpB	Niniejsze zgłoszenie
pAMÓK	pAM6 with a ΚπΕ-Εοχ from pUC4K inserted in the Bg/1l site of IbpB	Niniejsze zgłoszenie
pAM6K-nus	pAM6K with a neisserial uptake seguence inserted in the Ap/rZsite of the multiple cloning site of the vector	Niniejsze zgłoszenie
pAMB	pEMBL19 carrying parts of IbpA and IbpB	Niniejsze zgłoszenie
pAMl	pUC 19 carrying parts of IbpA and IbpB	Pettersson et al. 1993
ΡΑΜ23	pLC19 carrying IbpA and part of IbpB	Pettersson et al. 1994b
pAM23E	pAM23 with an Erm^- box inserted in the £coRV-site of IbpA	Niniejsze zgłoszenie

Wspomniane są: grupa serologiczna, serotyp albo podtyp ; nt: niemożliwe do typowania

PL 194 800 B1

T a b e l a 2. Startery zastosowane do klonowania przez PCR albo łączniki

Nazwa

Sekwencja

Uwagi

DVAS2	AGACCGACCCrTCGACGACTTCGG
FW5	C^AA^C^/^G?^?^(j(^(^>TT(^GT(^(^(jG
SDA1	CCTCrTTAGTATCTTTCTTCGCAC
LB11	ctt^tttcatcttttccc
PR1	CA\T^^^TA^CTKG^TTG.Tr'AGTK^^^^3·	Wiąże się a kasetą Km'
nusl	TTCAGACGGCTGTAC	Sekwencja wychwytu Neissena komplementarna a nusl
nus2	AGCCGTCTGAAGTAC

Tabela 3. Startery zastosowane do amplifikacji czterech dalszych genów IbpB

Nazwa

Sekwencja

LB20

LB23 CGGGATCCAGCC/ATGGCAGTCAGGGTAAGC

REV2 GCACGGACGGTTTCCTCTTTCAG<

T a b e l a 4. Identyczność oceniana parami sekwencji LbpB, w %

	H44/76	M990	M981	881607
BNCV	78.5	73.8	72.7	71.4
H44/76		72.5	74.1	78.5
M990			70.5	71.3
M981				80.6

T a b e l a 5. Startery zastosowane do wyrażania rekombinowanego LbpB

Sekwencja Nazwa

LB22 AACTTCTCTrCCTKTCTTATrrcGGTTTGCA

LB23 TGCGATCCACCTTTCGCAGTCAGGGTt^GC

VCO 12a TACC ATT ACCACC ACC ACGTGATCGAGGGGCGTGC A

VCO13a TCTTTTTTCATTATGTGGTGGTGGTGGTGCTGTGCA

PL 194 800 Β1

Tabela 6. Wyniki badania immunologicznego ludzkich surowic przeciwko oczyszczonemu LbpB

Surowica	Charakterystyka	Natywne	Denaturowane	Źródło
262439	B:NT:P1.4	+	+	SKB
262532	B:15:P1.7,16	+	+	SKB
262658	B:NT:P1.15	-	-	SKB
262716	B:15:P1.7,16	-	+	SKB
262892	B:2b:P1.10	++	++	SKB
262917	B:4:NT	++	++	SKB
262941	B:1:P1.15	+	+	SKB
262987	B:2a:P1.15	+	+	SKB
263017	B:4:NT	-	-	SKB
263021	B:4:P1.4	-	-	SKB
69	B:15:P1.16	+	-	RIVM
322	B:15:P1.5	+	-	RIVM
329	B:1:P1.4	-	-	RIVM
330	B:1:P1.4	++	++	RIVM
187	-	-	+	RIVM
195	-	++	++	RIVM
118	-	+	+	RIVM

^aZaznaczono sero- i podtypy szczepu, którym zakażony byt pacjent, jeżeli wiadomy. NT: niemożliwy do typowania. ^b++ wskazuje na silną reakcję, + słaba reakcja i - brak reakcji z natywną albo denaturowaną postacią białka ^CSKB: SmithKline Beecham Biologicals, RIVM: Natioonal Institute of Public Health and the Environment

Tabela 7. Wyniki ELISA z całymi komórkami i anty-LbpB przeprowadzone jak to opisano w Przykładzie 10.

reakcja anty-LbpB
	100'	200	400	800	1600	3200	6400	12800	25600	51200	102400	204800
BNCV	0.341b	0.196	0.107	0.063	0.033	0.018	0.014	0.011	0.013	0.012	0.009	0.012
LbpB	2.772	2.918	2.794	2.867	2.687	2.487	2.046	1.504	1.043	0.668	0.405	0.202
PBS	OJ 4	0.079	0.044	0.028	0.016	0.018	0.012	0.01	0 01	0.008	0.012	0.01
reakcja anty-BNCV(Fe-)’
	100	200	400	800	1600	3200	6400	12800	25600	51200	102400	204800
BNCV	2.476	3.09	3.04	3.154	3.034	3J12	3.111	2.905	2.745	2.436	1.659	1.056
LbpB	1.783	1.856	1.292	0.914	0.622	0.385	0.257	0.185	0.122	0.106	0.096	0.089
PBS	0.687	0.55	0.358	0.243	0.154	0J23	0.099	0.088	0.083	0.081	0.031	0.081
reakcja anty-H44/76(Fe-)
	100	200	400	800	1600	3200	6400	12800	25600	51200	102400	204800
BNCV	2.814	3.003	2.966	2.976	2.873	2.66	2.371	1.862	1.312	0.873	0.591	0.452
LbpB	2.653	2.287	1.683	1.123	0.748	0.536	0.409	0.35	0.309	0.298	0.289	0.295
PBS	1.646	1.049	0.695	0.47	0.338	0.271	0.238	0.226	0.226	0.251	0.284	0.285

Rozcieńczenie surowicy; ^bgęstość optyczna przy 490 nm

PL 194 800 B1

T a b e l a 8. Wyniki aktywności bakteriobójczej surowic przeciwko całym komórkom i przeciwko LbpB przeprowadzone jak opisano w Przykładzie 10

Miano bakteriobójcze przeciwko H44/76(Fe-)
	200.0 a	400.0	800.0	1600.0	3200.0	6400.0	12800.0	25600.0
H44/76	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	97.2
BNCV	100.0	94.4	93.0	83.2	81.8	63.7	48.3	34.4
LbpB	10.6	-0.5	-0.5	-0.5	-0.5	-0.5	-0.5	-0.5
PBS	-0.5	-0.5	-0.5	-0.5	-0.5	-0.5	-0.5	-0.5
Miano bakteriobójcze przeciwko H44/76(Fe-)
	200.0	400.0	800.0	1600.0	3200.0	6400.0	12800.0	25600.0
H44/76	100	98	100	100	100	100	100	98
BNCV	100	98	96	85	83	70	64	32
LbpB	34	25	0	0	0	0	0	0
PBS	0	0	0	0	0	0	0	0

^arozcieńczenie surowicy

Wszystkie Publikacje, w tym, choć nie wyłącznie patenty i zgłoszenia patentowe, cytowane w niniejszym opisie są włączone jako odnośniki.

PL 194 800 Β1

Odnośniki

Abdillahi, H., and Poolman, J. Τ. (19S7) Whole-cell ELISA for typing of Neisseria meningitidis with monoclonal antibodies. FEMS Microbiol. Lett 48: 367-371.

Anderson. J. E., Sparling, P. F., and Comelissen, C. N. (1994) Gonococcal transferrinbinding protein 2 facilitates but is not essential for transferrin utilization. J Bacteriol

176: 3162-3170.

Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore. D. M., Seidman, J. G., Smith. J. A., and Struhl, K. (1989) Current protocols in molecular biology. Brooklyn, NY: Greene Publishing Associates.

Bagg. A., and Neilands, J. B. (1987) Ferric uptake regulation protein acts as a repressor, employing iron (II) as a cofactor to bind the operator of an iron transport operon in Escherichia coli. Biochemistry 26: 5471-5477.

Biswas, G. D„ and Sparling, P. F. (1995) Characterisation of IbpA, the structura! gene for a lactofemn receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infect Immun 63: 2958-2967.

Bosch. D.. Leunissen, J., Yerbakel. J., de Jong, M., van Erp, H., and Tommassen, J.

(1986) Periplasmic accumulation of truncated forms of outer membranę PhoE protein of Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol. 189:449-455.

Comelissen, C. N., Biswas, G. D.. Tsai. J.. Paruchuri, D. K., Thompson, S. A., and

Sparling. P. F. (1992) Gonnococcal transferrin-binding protein 1 is required for transfemn utilization and is homologous to TonB-dependent outer membranę receptors. JBacteriol 174: 5788-5797.

Finkelstein. R. A., Sciortino, C. V., and Mclntosh. M. A. (1983) Role of iron in microbehost interactions. Rev Infect Dis 5: S759-S777.

Fuller, C. A., Retzer, M. D., Jacobs, E., and Schryvers, A. B. (1996) Evidence for a bi-lobed structure for meningococcal transferrin binding protein B. In Pathogenic Neisseria. Zollinger, W. D., Frasch, C. E., and Deal, C. D. (eds). Abstract book from the lOth Pathogenic Neisseria Conference. pp 572-573.

Genco, C, A., Chen, C. Y., Arko, R. J., Kapczynski, D. R., and Morse, S. A. (1991)

Isolation and characterization of a mutant of Neisseria gonorrhoeae that is defective

PL 194 800 Β1 in the uptake of iron from transferrin and hemoglobin and is avirulent in mouse subcutaneous chambers. J Gen Microbiol 137: 1313-1321.

Gschwentner, C„ Lassman, H„ and Huettinger, M. (1997) Lactoferrin and its receptor(s): modulators of inflammation? Abstracts of Third Internationa! Conference on Lactoferrin. p.68.

Irwin. S. W., Averil, N. A.. Cheng, C. Y., and Schrvvers, A. B. (1993) Preparation and analysis of isogenic mutants in the transferrin receptor protein genes, tbpA and tbpB. from Neisseria meningilidis. Mol Microbiol 8: 1125-1133.

Jennings, Μ. P., van der Ley, P., Wilks, Κ. E., Maskell, D. J., Poolman, J. T., and Μοχοη,

E. R. (1993) Cloning and molecular analysis of the galE gene of Neisseria meningitidis and its role in lipopolysaccharide biosynthesis. Mol Microbiol 10; 361369.

Legrain. M.. Marazin, V., Irwin. S. W., Bouchon. B., Quentin-Millet, M.-J., Jacobs, E.. and Schryvers, A. B. (1993) Cloning and characterisation of Neisseria meningitidis genes encoding the transferrin-binding proteins Tbpl and Tbp2. Gene 130: 73-80.

Lugtenberg. B., Meyers. J., Peters. R... van der Hoek, P.. and van Alphen. L. (1975)

Electrophoretic resolution of the major outer membranę protein of Escherichia coli K-12 into four bands. FEBS Lett. 58:254-258.

Pettersson, A., Kuipers. B., Pelzer, M., Verhagen, E., Tiesjema, R. H„ Tommassen, J., and Poolman. J. T. (1990) Monoclonal antibodies against the 70-kiłodalton ironregulated protein of Neisseria meningitidis are bactericidal and strain specific. Infect Immun 58. 3036-3041.

Pettersson, A., van der Ley, P„ Poolman, J. T., and Tommassen, J., (1993) Molecular characterization of the 98-kilodalton iron-regulated outer membranę protein of Neisseria meningitidis. Infect Immun 61: 4724-4733.

Pettersson, A., Klarenbeek, V.. van Deurzen, J., Poolman, J. T., and Tommassen, J., (1994a) Molecular characterization of the structural gene for the lactorferrin receptor of the meningococcal strain H44/76. Microbial Pathogen 17: 395-408.

Pettersson, A., Maas, A., and Tommassen, J., (1994b) Identification ofthe iroA gene product of Neisseria meningitidis as a lactoferrin receptor. J Bacteriol 176: 17641766.

PL 194 800 Β1

Renauld-Mongenie, G., Poncet. D.. and Quentin-Millet, M. J. (1996) Study of human transferrin binding sites within the transferrin binding protein Tbp2 from N.

meningitidis M982 using the pMAL expression system. In Pathogenic Neisseria.

Zollinger, W. D., Frasch, C. E., and Deal. C. D. (eds). Abstract book from the lOth

Pathogenic Neisseria Conference. pp 585-586.

Sambrook, J„ Fritsch, E. F„ and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edn. Cold Spnng Harbor, NY: Cold Spnng Harbor Laboratory Press.

Schryvers, A. B., and Morris, L. J. (1988) Identification and characterization of the human lactofemn-binding protein from Neisseria meningitidis. Infect Immun 56: 11441149.

Tommascn, J., and Lugtenberg, B. (1980) Outer membranę protein e of Escherichia coli K-12 is co-regulated with alkaline phosphatase. J. Bacteriol 143:151-157.

Tommassen. J., van Tol, H.. and Lugtenberg, B. (1983) The ultimate localization of an outer membranę protein of Escherichia coli K-12 is not determined by the signal sequence. EMBO J. 2:1275-1279.

van Berkel, Ρ. H. C.. Geerts. Μ, E. J„ van Veen, H. A., Kooiman, Ρ. M., Pieper, F. R., de Boer, H. A., and Nuijens. J. H. (3995) Glycosylated and unglycosylated human lactoferrins both bind iron and show identical affinities towards human lysozyme and bacterial polysaccharide. but differ in their susceptibilities towards tryptic proteolysis. Biochem 7312: 107-114.

van der Ley, P., Heckels, J. E„ Virji, M„ Hoogerhout, P., and Poolman, J. T. (1991)

Topoiogy of outer membranę porins in pathogenic Neisseria spp. Infect Immun 59: 2963-2971.

van der Ley, P., and Poolman, J. T. (1992) Construction of a multivalent meningococcal strain based on the cłass 1 outer membranę protein. Infect Immun 60: 3156-3161.

von Heijne, G. (1989) The structure of signal peptides from bacterial lipoproteins. Prot Eng 2: 533-534.

Young, R. A., and Davis, R. W. (1983) Yeast RNA polymerase II genes: isolation and antibody probes. Science 222: 778-782.

PL 194 800 B1

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: University of Utrecht, Technology Foundation (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Białko Neisseria wiążące laktoferrynę (iii) LICZBA SEKWENCJI: 10 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: SmithKline Beecham, Corporate IP Department (B) ULICA: Two, New Horizons Court (C) MIASTO: Brentford (D) STAN: Middlesex (E) KRAJ: Zjednoczone Królestwo (F) KOD: TW8 9EP (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS (D) OPROGRAMOWANIE: FastSeq for Windows ver. 2.0 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(xii) INFORMACJA O RZECZNIKU:

(A) NAZWA: DALTON, Marcus, Jonathan William (B) NUMER REJESTRACYJNY: XXXXXX (C) NUMER SPRAWY: B45106 (xiii) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFONE: (0181) 975 6348 (B) TELEFAX: (0181) 975 6177 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2277 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(B) SZCZEP: Neisseria meningitidis szczep BNCV (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 100...2274 (C) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:1:

PL 194 800 B1

TCCTGATTTT TGTTAATTCA CTATAAAAAC GGGTTGATAT TATCTGTACA TATTAATATA 60 ATGATAATTA TTATTAATCA AATAGGAGGA AAAGTAGGG ATG TGT AAA CCG AAT 114

Met Cys Lys Pro Asn 1 5

T2 ' T , , V-

Gly

rr r- Gly

ATT Ile

GTC Va1 10

TTC Leu

TTG Leu

GGG Pro

TTA Leu

CTT Leu 15

TTG Leu

GCA Ala

r r^T Ser

TGT Cys

ATC Ile 20

GGC Gly

162

AAT

TT -

GGC

GTG

rrr

GGT

GTT

GTC

GAA

TCA

ACG

CCG

ACC

GCG

TAC

210

Gly

Asn

Phe

Gly

Val

Gln

Pro

Val

Val

Glu

Ser

Thr

Pro

Thr

Ala

Tyr

25

30

35

CCC

GTC

ACT

TTC

AAG

TCC

ΑΑα

GAC

GTT

CCC

ACT

CCG

CCC

CCT

GCC

AAA

258

Pro

Val

Thr

Phe

Lys

Ser

Lys

Asp

Val

Pro

Thr

Pro

Pro

Pro

Ala

Lys

40

45

50

W--.- 1

TGT

ATA

GAA

ATC

ACG

CCG

GTC

AAC

CGG

CCC

GCC

GTC

GGT

GCG

GCA

306

Pro

Ser

Ile

Glu

Ile

Thr

Pro

Val

Asn

Arg

Pro

Ala

Val

Gly

Ala

Ala

55

60

65

PL 194 800 B1

ATG

CGG

CTG

CCA

AGG

CGG

AAT

AuV

GCT

ψΠ”Ρ

CAT CGT

GAA

GAT

GGC

ACG

354

Mer

Arg

Leu

Pro

Arg

Arg

Asn

Thr

Ala

Phe

His Arg

Glu

Asp

Gly

Thr

70

75

80

85

GAA

ATT

CCA

AAT

AGC

AAA

CAA

GCA

GAA

GAA

AAG CTG

TCG

ttt

CAA

GAA

402

Glu

11.e

Pro

Asn

Ser

Lys

Gin

Ala

Glu

Glu

Lys Leu

Ser

Phe

Gin

Glu

90

95

100

GGT

GAT

GTT

CTG

TTT

TTA

TAC

GGT

TCA

AAA

GGA AAT

AAA

CTT

CAA

CAA

450

Gly

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

Ser

Lys

Gly Asn

Lys

Leu

Gin

Gin

105

110

115

CG?

AAA

AGC

GAA

ATT

CAT

AAA

CGT

GAT

TCC

GAT GTA

GAA

ATT

AGG

AGA

4 98

Leu

Lys

Ser

Glu

I

his

Lys

Arg

Asp

Ser

Asp Val

Glu

Ile

Arg

Thr

120

125

130

TCA

GAA.

AAG

GAA

AAT

AAA

AAA

VA V

GAT

TAT

AAA TTT

GTA

GAT

GCA

GGT

54 6

Ser

Giu

Lys

Glu

Asn

Lys

Lys

Tyr

Asp

Tyr

Lys Phe

Val

Asp

Ala

ul y

135

140

145

TLT

GTA

TAT

GTA

AAG

GGA

AAA

U,·-. 1

GAA.

ATT

AAG TGG

ACT

TCA

GAT

TAC

594

Tvr

Val

Tyr

Val

Lys

Gly

Lys

Asp

Glu

Ile

Lys Trp

Thr

Ser

Asp

Tyr

150

155

160

165

AAG

CAG

TT v

TCT

AAC

CGG

TTA

GGT

TAT

GAC

GGT TTT

GTA

TAT

TAT

TCr

64 2

Lys

Gin

Phe

Ser

Asn

Arg

Leu

Gly

Tyr

Asp

Gly Phe

Val

Tyr

Tyr

Ser

170

175

180

GG«

GAA

CGT

GGV

TGG

CAA

Τ p

VTA.

CCG

AGT

GCG GGA

ACG

GTG

GAA

TAT

€90

Gly

Glu

Arg

Pro

Ser

Gin

Ser

Lsu

Pro

Ser

Ala Gly

Thr

Val

Glu

Tyr

185

190

195

TCT

GGT

AAC

TGG

CAA

TAT

ATG

ACC

GAT

GCC

AAA CGT

CAT

CGA

GCA

GGT

738

Ser

Gly

Asn

Trp

Gin

Tyr

Met

Thr

Asp

Ala

Lys Arg

His

Arg

Ala

Gly

200

205

210

AAG

asG

GTT

GGC

ATT

GAC

AAT

TTG

GGT

TAT

TAC ACA

TTT

TAT

GGT

AAC

786

Lys

Ala

Val

Gly

Ile

Asp

Asn

Leu

Gly

Tyr

Tyr Thr

Phe

Tyr

Gly

Asn

215

220

225

GAG

GTT

GGT

GCA

ACT

TCT

TAT

GCG

GCT

AAG

GAT GTC

GAC

GAA

AGG

GAA

834

Asp

Val

Gly

Ala

Vhr

Ser

Tyr

Ala

Ala

Lys

Asp Val

Asp

Glu

Arg

Glu

230

235

240

245

PL 194 800 B1

AAA

CAT

CCT

GCT

AAA

TAT

ACG

GTA

GAT TTC

GGT

AAC

AAA

ACC

CTG

ACG

882

Lys

His

Pro

Ala

Lys

Tyr

Thr

Val

Asp Phe

Gly

Asn

Lys

Thr

Leu

Thr

250

255

26C

GGC

GAG

CTG

ATT

AAA

AAC

CAA

TAT

GTC AAA

CCC

AGT

GAG

AAG

CAA

AAA

930

Gly

Glu

Leu

Ile

Lys

Asn

Gln

Tyr

Val Lys

Pro

Ser

Glu

Lys

Gir.

Lys

265

270

275

CCG

GTC-

ACC

ATT

TAC

AAC

ATC

ACT

GCC GA?

TTA

AAC

GGC

AAC

CGC

TTT

978

Prc

Leu

Thr

11·-

Tyr

Asn

Ile

Thr

Ala Asp

Leu

Asn

Gly

Asn

Arg

Phe

280

235

290

ACC

GGu

AGT

GCC

AAG

GTC

AAT

CCT

GAT TTA

GCG

AAA

AGC

CAT

GCC

AAT

1026

Thr

Gly

Ser

Ala

Lys

Val

Asn

Pro

Asp Leu

Ala

Lys

Ser

His

Ala

Asn

295

300

305

GAG

CAT

TTG

TTT

TTC

CAT

ucC

□Mi CC~

GAT

CAG

CGG

CTT

GAG

GGC

1074

Lys

Glu

His

Leu

Phe

Phe

His

Ala

Asp Ala

Asp

Gln

Arg

Leu

Glu

Gly

310

315

320

325

• 1

ttj

TTC

Gkji

GAT

AAG

GGu

GAA

GAu GTT

GCC

GGA

CGG

TTT

ATC

AGC

1122

Gly

P n o

Phe

Gly

Asp

Lys

Gly

Glu

Glu Leu

Ala

Gly

Arg

Phe

Ile

Ser

330

335

340

AAC

GAu

AAC

AGc

GTA

7ΤΡ

GGT

GtA

TTC GCA

GGC

AAA

CAA

AAT

AGC

CCC

1170

As n

Asp

Asn

Ser

Val

Phe

Gly

Val

Phe Ala

Gly

Lys

Gln

Asn

Ser

Pro

345

350

355

.-TG

CGG

TCT

GgA

AAA

CAC

ACC

T * Tl γλγ.

ATC TTG

GAT

rp V-

CTG

AAA

ATT

TCC

1218

Val

Pro

Ser

Gly

Lys

His

Thr

Lys

He Leu

Asp

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

360

365

370

GTT

GAT

GAG

GCA

AGT

GGT

GAA

AAT

CCC CGA

CCG

TTT

GCC

ATT

TCT

CCT

1266

Val

Asp

Glu

Ala

Ser

Gly

Glu

Asn

Pro Arg

Pro

Phe

Ala

Ile

Ser

Pro

375

380

385

ATG

CCC

GAT

TTT

GGT

CAT

CCC

GAC

AAA CTT

CTT

GTC

GAA

GGG

CAT

GAA

1314

Met

Pro

Asp

Phe

Gly

His

Pro

Asp

Lys Leu

Leu

Val

Glu

Gly

His

Glu

390

395

400

405

PL 194 800 Β1

ATT

CCT

TTG

GTT

AGC

CAA

GAG

AAA

ACC ATC

GAG

CTT GCC

GAC

GGC

AGG

1362

Ile

Pro

Leu

Val

Ser

Gin

Glu

Lys

Thr Ile

Glu

Leu Ala

Asp

Gly

Arg

410

415

420

AAA

ATG

ACC

GTC

AGT

GCT

TGT

TGC

GAC TTT

TTG

ACC TAT

GTG

AAA

CTC

1410

Lys

Met

Thr

Val

Ser

Ala

Cvs

Cys

Asp Phe

Leu

Thr Tyr

Vsl

Lys

Leu

425

430

435

CGG

ATA

AAA

ACC

GAA

CGC

CCC

GCC GCC

AAA

CCG AAG

GCG

CAG

GAC

1458

G.y

Arg

Ile

Lys

Thr

Glu

Arg

Pro

A.I a A.I a

Lys

Pro Lys

Ala

Gin

Asp

440

445

450

GAA

GAG

GAT

TCG

GAC

ATT

GAT

AAT

GGC GAA*

GAA

AGC GAA

GAC

GAA

ATC

1506

Glu

Glu

Asp

Ser

Asp

Ile

Asp

Asn

Gly Glu

Glu

Ser Glu

Asp

Giu

I le

4 55

4 60

465

GGC

GAT

C-AA

GAA

GAA

GGC

ACC

C-AA

GAT GCA

GCC

GeA GGA

GAT

GAA

GGC

1554

Gly

Asp

Glu

Glu

Glu

Gly

Thr

Glu

Asp A.I a

Ala

Ala Gly

Asp

Glu

C-ly

470

475

480

485

AGC

GAA

GAA

GAC

GAA

CCC

ACA

G.AA

AAC GAA

GAC

GGC GAA

G.AA

GAC

GAA

1602

Ser

Glu

Glu

Asp

Glu

Ala

Thr

Glu

Asn Glu

Asp

Gly Glu

Glu

Asp

Glu

490

495

500

GCT

GAA

GAA

CCT

GAA

GAA

GhA

T CG

TCG GCA

GAA

kjuC AAC

GGC

AGT

TCA

1650

Ala

Glu

Giu

Pro

Glu

Glu

Glu

Ser

Ser Ala

Glu

Gly Asn

Gly

Ser

Ser

505

510

515

AAC

GCC

ATC

/-•Τ' I*' U i 'J

CCT

GTC

CCG

GAA.

GCC TCT

AAA

UuC AGu

GAT

ATC

GAC

1693

As r.

A.I a

Ile

Leu

Pro

Vai

Pro

Glu

Ala Ser

Lys

Gly Arg

Asp

Ile

Asp

520

525

530

CTT

TTC

< χ G

AAA

GGT

ATC

CGC

ACG

GCA GAA

ACG

AAT ATT

CCG

C.AA

ACT

1746

Leu

Phe

Leu

Lys

Gly

Ile

Arg

Thr

A.I a Glu

Thr

Asn Ile

Pro

Gin

Thr

535

54 0

545

GGA

GAA

GCA

CGC

TAT

ACC

GGC

ACT

TGG GAA

GCG

CGT ATC

GGC

AAA

CCC

1794

Gly

Glu

Ala

Arg

Tyr

Thr

Gly

Thr

Trp Glu

Ala

Arg Ile

Gly

Lys

Pro

550

555

560

565

ATT

CAA

TGG

GAC

AAT

CAT

GCu

GAT

AAA GAA

GCG

GCA AAA

GCA

GTA

TTT

1842

Ile

Gin

Trp

Asp

Asn

His

Ala

Asp

Lys Glu

Ala

Ala Lys

Ala

Val

Phe

570

575

580

PL 194 800 Β1

ACC GTT GAT

TTC Phe 585

GGC AAG AAA TCG

ATT Ile 590

TCC GGA ACG CTG ACG GAG AAA

1890

Thr

Val

Asp

Gly Lys

Lys

Ser

Ser

Gly

Thr Leu

Thr 595

Glu

Lys

AAC

GGT

GTA

GAA

CCT

GCT

TTC

CGT

ATT

GAA

AAC

GGC

GTG

ATT

GAG

GGC

1938

Asn

Gly

Val

Glu

Pro

Ala

Phe

Arg

Ile

Glu

Asn

Gly

Val

Ile

Glu

Gly

600

605

610

AAC

GGT

TTC

CAT

GCG

ACA

GCG

CGC

ACT

CGG

GAT

GAC

GGC

ATC

GAC

CTT

1986

Asn

Gly

Phe

His

Ala

Thr

Ala

Arg

Thr

Arg

Asp

Asp

Gly

Ile

Asp

Leu

615

620

625

TCC

GGG

CAG

GGT

TCG

ACC

AAA

CCG

CAG

ATC

TTC

AAA

GCT

AAT

GAT

CTT

2034

Ser

Gly

Gln

Gly

Ser

Thr

Lys

Pro

Gln

Ile

Phe

Lys

Ala

Asn

Asp

Leu

630

635

640

645

CGT

GTA

GAA

GGA

GGA

TTT

TAC

GGC

CCG

AAG

GCG

GAG

GAA

TTG

GGC

GGT

2082

Arg

Val

Glu

Gly

Gly

Phe

Tyr

Gly

Pro

Lys

Ala

Glu

Glu

Leu

Gly

Gly

650

655

660

ATT

ATT

TTC

AAT

AAT

GAT

GGG

AAA

TCT

CTT

GGT

ATA

ACT

GAA

GGT

ACT

2130

Ile

Ile

Phe

Asn

Asn

Asp

Gly

Lys

Ser

Leu

Gly

Ile

Thr

Glu

Gly

Thr

665

670

675

GAA

AAT

AAA

GTT

GAA

GCT

GAT

GTT

GAT

GTT

GAT

GTT

GAT

GTT

GAT

GTT

2178

Glu

Asn

Lys

Val

Glu

Ala

Asp

Val

Asp

Val

Asp

Val

Asp

Val

Asp

Val

680

685

690

GAT

GCT

GAT

GCT

GAT

GTT

GAA

CAG

TTA

AAA

CCT

GAA

GTT

AAA

CCC

CAA

2226

Asp

Ala

Asp

Ala

Asp

Val

Glu

Gln

Leu

Lys

Pro

Glu

Val

Lys

Pro

Gln

695

700

705

TTC

GGC

GTG

GTA

TTC

GGT

GCG

AAG

AAA

GAT

AAT

AAA

GAG

GTG

GAA

AAA T

2275

Phe

Gly

Val

Val

Phe

Gly

Ala

Lys

Lys

Asp

Asn

Lys

GlU

Val

Glu

Lys

710

715

720

725

GA

2277

PL 194 800 B1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 725 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Neisseria meningitidis szczep BNCV (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:2:

Met Ί

Cys

Lys

Pro

Asn 5

Tvr

Gly

Gly

Ile

Val 10

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu 15

Leu

τ, ί _ Cl

Ser

Cys

Ile

Gly

Gly

Asn

Phe

Gly

Val

Gin

Pro

Val

Val

Glu

Ser

20

25

30

Thr

Pro

Thr

Ala

Tyr

Pro

Val

Thr

Phe

Lys

Ser

Lys

Asp

Val

Pro

Thr

35

40

45

Pro

Pro

Pro

Ala

Lys

Pro

S°r

Ile

Glu

Ile

Thr

Pro

Val

Asn

Arg

Pro

50

c c U -ś

60

Ala

Val

Gly

Ala

Ala

Met

Arg

Leu

Pro

Arg

Arg

Asn

Thr

Ala

Phe

His

C 0

70

75

80

n m

' ± U

Asp

Gly

Thr

Glu

-le

Pro

Asn

Ser

Lys

Gin

Ala

Glu

Glu

Lys

85

90

95

Leu

Ser

Phe

Gin

Glu

Gly

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

Ser

Lys

Gly

100

105

110

Asn

Lys

Leu

Gin

Gin

Leu

Lys

Ser

Glu

Ile

His

Lys

Arg

Asp

Ser

Asp

115

120

125

Val

Glu

Ile

Arg

Thr

Ser

Glu

Lys

Glu

Asn

Lys

Lys

Tyr

Asp

Tyr

Lys

130

135

140

Phe

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Val

Tyr

Val

Lys

Gly

Lys

Asp

Glu

Ile

Lys

145

150

155

160

Trp

Thr

Ser

Asp

Tyr

Lys

Gin

Phe

Ser

Asn

Arg

Leu

Gly

Tyr

Asp

Gly

165

170

175

PL 194 800 Β1

Phe

Val

Tyr

Tyr 180

Ser

Gly

Glu

Arg

Pro 185

Ser

Gin Ser

Leu

Pro 190

Ser

Ala

Gly

Thr

Val

Glu

Tyr

Ser

Gly

Asn

Trp

Gin

Tyr Met

Thr

Asp

Ala

Lys

195

200

205

Arg

His

Arg

Ala

Gly

Lys

Ala

Val

Gly

Ile

Asp Asn

Leu

Gly

Tyr

Tyr

210

215

220

Thr

Phe

Tyr

Gly

Asn

Asp

Val

Gly

Ala

Thr

Ser Tyr

Ala

Ala

Lys

Asp

22 5

230

235

240

Vai

Asp

Glu

Arg

Glu

Lys

His

Pro

Ala

Lys

Tyr Thr

Val

Asp

Phe

Gly

245

250

255

Asn

Lys

Thr

Leu

Thr

Gly

Glu

Leu

Ile

Lys

Asn Gin

Tyr

Val

Lys

Pro

260

2 65

270

Ser

Glu

Lys

Gir.

Lys

Pro

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asn Ile

Thr

Ala

Asp

Leu

275

290

285

Asn

Gly

Asn

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Al a

Lys

Val Asn

Pro

Asp

Leu

Ala

2 90

295

300

Lys

Ser

His

Ala

ASh

Lys

Glu

His

Leu

Phe

Phe His

Ala

Asp

Ala

Asp

305

310

315

320

G 1 n

Arg

Leu

Glu

Gly

Gly

Pne

Phe

Gly

Asp

Lys Gly

Glu

Glu

Leu

Ala

325

330

335

G1 y

Arg

Phe

i 1 θ

Ser

Asn

Asp

Asn

Ser

Val

Phe Gly

Val

Phe

Ala

Gly

340

345

350

Lys

Gin

A.sn

Ser

Pro

Val

Pro

Ser

ul y

Lys

His Thr

Lys

Ile

Leu

Asp

- = c

360

365

S £27

Leu

Lys

Ile

Ser

y a 1

Asp

Giu

Ala

Ser

Gly Giu

Asn

Pro

Arg

Pro

330

37 5

380

A.1 a

Ile

Ser

Pro

Met

Pro

Asp

Phe

Gly

His Pro

Asp

Lys

Leu

Leu

365

390

395

400

Val

Glu

j-y

His

Glu

Ile

Pro

Leu

Val

Ser

Gin Glu

Lys

Thr

Ile

Glu

405

410

415

Leu

Ala

Asp

Gly

Arg

Lys

Met

Thr

Val

Ser

Ala Cys

Cys

Asp

Phe

Leu

4 20

425

430

Thr

Tyr

Val

Lys

Leu

Gly

Arg

Ile

Lys

Thr

Glu Arg

Pro

Ala

Ala

Lys

435

440

445

Pro

Lys

Ala

Gir.

Asp

Glu

Gru

Asp

Ser

Asp

Ile Asp

Asn

Gly

Glu

Glu

450 455 460

PL 194 800 B1

Ser

Glu

Asp

Glu

Ile

Gly

A.sp

Glu

Glu

Glu

Gly

Thr

Glu

Asp

Ala

Ala

465

470

475

480

Al a

Gly

Asp

Glu

Gly

Ser

Glu

Glu

Asp

Glu

Ala

Thr

Glu

Asn

Glu

Asp

485

490

495

Gly

Glu

Glu

Asp

Glu

Ala

Glu

Glu

Pro

Glu

Glu

Glu

Ser

Ser

Ala

Glu

500

505

510

Gly

Asn

Gly

Ser

Ser

Asn

Ala

Ile

Leu

Pro

Val

Pro

Glu

Ala

Ser

Lys

515

52C

525

Gly

Arg

Asp

Ile

Asp

Leu

Phe

Leu

Lys

Gly

Ile

Arg

Thr

Ala

Glu

Thr

530

535

540

Asn

Ile

Pro

Gln

Thr

Gly

Giu

Ala

Arg

Tyr

Thr

Gly

Thr

Trp

Glu

Ala

545

550

555

560

Arg

Ile

Gly

Lys

Pro

Ile

Gln

Trp

Asp

Asn

His

Ala

Asp

Lys

Glu

Ala

565

570

575

Ala

Lys

Ala

Val

Phe

Thr

Val

Asp

Phe

Gly

Lys

Lys

Ser

Ile

Ser

Gly

580

585

590

Thr

Leu

Thr

01 u

Lys

Asn

Gly

Val

Glu

Pro

Ala

Phe

Arg

Ile

Glu

Asn

595

600

605

Gly

Val

Ile

Glu

Gly

Asn

Gly

Phe

His

Ala

Thr

Ala

Arg

Thr

Arg

Asp

610

615

620

Asp

Gly

Ile

Asp

Leu

Ser

Gly

Gin

Gly

Ser

Thr

Lys

Pro

Gin

Ile

Phe

62 5

630

635

640

Lys

Ala

Asn

Asp

Leu

Arg

Val

Glu

Gly

Gly

Phe

Tvr

Gly

Pro

Lys

Ala

645

650

655

Glu

Glu

Leu

Gly

Gly

T s

Ile

Pne

Asn

Asn

Asp

Gly

Lys

Ser

Leu

Gly

660

665

670

Ile

Thr

Glu

Gly

Thr

Glu

Asn

Lys

Val

Glu

Ala

Asp

Val

Asp

Val

Asp

675

680

685

Val

Asp

Val

Asp

Val

A.sp

Ala

Asp

Ala

Asp

Val

Glu

Gin

Leu

Lys

Pro

690

695

700

Glu

Val

Lys

Pro

Gin

Phe

Gly

Val

Val

Phe

Gly

Ala

Lys

Lys

Asp

Asn

705

710

715

720

Lys

Glu

Val

Glu

Lys

725

PL 194 800 B1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2169 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(B) SZCZEP: Neisseria meningitidis szczep M981 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 1... 2166 (C) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:3:

ATG Met 1

TGT Cys

AAA Lys

CCG Pro

AAT Asn 5

TAT Tyr

GGC Gly

GGC Gly

ATT Ile

GTC Val 10

TTG Leu

TTG Leu

CCC Pro

TTA Leu

CTT Leu 15

TTG Leu

48

GCA

TCT

TGC

ATC

GGC

GGC

AAT

TTC

GGC

GTG

CAG

CCT

GTT

GTC

GAA

TCA

96

Ala

Ser

Cys

Ile

Gly

Gly

Asn

Phe

Gly

Val

Gin

Pro

Val

Val

Glu

Ser

20

25

30

ACG

CCG

ACC

GCG

TAC

CCC

GTC

ACT

TTC

AAG

TCT

AAG

GAC

GTT

CCC

ACT

144

Thr

Pro

Thr

Ala

Tyr

Pro

Val

Thr

Phe

Lys

Ser

Lys

Asp

Val

Pro

Thr

35

40

45

TCG

CCC

CCT

GCC

GGG

•pęn·

TCG

GTA

GAA

ACC

ACG

CCG

GTC

AAC

CAG

CCC

192

Ser

Pro

Pro

Ala

Gly

Ser

Ser

Val

Glu

Thr

Thr

Pro

Val

Asn

Gin

Pro

50

55

60

GCC

GTC

GGT

GCG

GCA

ATG

CGG

CTG

TTG

AGA

CGG

AAT

ACT

GCT

TTT

CAT

240

Ala

Val

Gly

Ala

Ala

Met

Arg

Leu

Leu

Arg

Arg

Asn

Thr

Ala

Phe

His

65

70

75

80

CGT

GAA

GAT

GGC

ACG

GCA

ATT

CCC

GAT

AGC

AAA

CAA

GCA

GAA

GAA

AAG

288

Arg

Glu

Asp

Gly

Thr

Ala

Ile

Pro

Asp

Ser

Lys

Gin

Ala

Glu

Glu

Lys

PL 194 800 B1

CTG Leu

TCG Ser

TTT Phe

AAA Lys 100

GAA GGT

GAT GTT

CTG Leu 105

TTT Phe

TTA Leu

TAC GGT

TCA Ser 110

AAA Lys

GAA du

336

du

dy

Asp

Val

Tyr

dy

AAT

AAA

CTT

CAA

CAA

CTT

AAA

AGC

GAA

ATT

CAT

AAA

CGT

AAT

CCT

GAG

384

Asn

Lys

Leu.

dn

dn

Leu

Lys

Ser

Glu

Ile

His

Lys

Arg

Asn

Pro

du

115

120

125

GCA

AGC

ATT

ACC

ACA

TCG

GAA

AAT

GAA

AAT

AAA

AAA

TAT

AAT

TAT

CGG

432

Ala

Ser

Ile

Thr

Thr

Ser

du

Asn

du

Asn

Lys

Lys

Tyr

Asn

Tyr

Arg

130

135

140

TTT

GTG

AGT

GCC

GGT

TAT

GTG

TTT

ACT

AAA

AAC

GGA

AAA

GAT

GAA

ATT

480

Phe

Va 1

Ser

Ala

dy

Tyr

Val

Phe

Thr

Lys

Asn

dy

Lys

Asp

du

Ile

145

150

155

160

GAG

AAA

ACA

TCG

GAT

GAA

AAG

CAG

TTT

TCT

AAT

CGT

TTA

GGC

TAT

GAC

528

Glu

Lys

Thr

Ser

Asp

Glu

Lys

dn

Phe

Ser

Asn

Arg

Leu

dy

Tyr

Asp

165

170

175

GGT

TTT

GTA

TAT

TAT

CTC

GGA

GAA

CAT

CCT

TCC

CAA

TCT

TTA

CCG

AGC

576

Glv

Phe

Val

Tyr

Tyr

Leu

dy

du

His

Pro

Ser

dn

Ser

Leu

Pro

Ser

180

185

190

GCG

ACG

ulu

AAA

TAT

TCC

GGG

AAC

TGG

CAA

TAT

ATG

ACC

GAT

GCC

624

Ala

Gly

Thr

val

Lys

Tyr

Ser

dy

Asn

Trp

dn

Tyr

Met

Thr

Asp

Ala

195

200

205

ATA

CGT

CAT

CGG

AGA

n /-mpr u c 1

AAG

GGG

GTT

TCC

AGT

GTG

GAT

TTG

GGT

TAT

672

He

Arg

His

Arg

Arg

Gly

Lys

dy

Val

Ser

Ser

Val

Asp

Leu

dy

Tyr

210

215

220

ACC

ACA

TAT

TAT

GGT

AAT

GAA

ATT

GGG

GCA

GCT

TGT

TAT

GAG

GCT

AGG

72 0

Thr

Thr

yr

Tyr

dy

Asn

du

He

dy

Ala

Ala

Ser

Tyr

du

Ala

Arg

225

230

235

240

GAT

GCG

GAT

GGC

CGG

GAA

AAA

CAT

CCT

GCC

GAA

TAT

ACG

GTT

AAT

TTC

768

Asp

Ala

Asp

dy

Arg

Glu

Lys

His

Pro

Ala

du

Tyr

Thr

Val

Asn

Phe

245

250

255

GAC

AAA

AAA

AAC

CTG

GAA

GGT

AAG

TTG

ATT

AAA

AAT

CAG

TAT

GTG

CAA

816

Asp

Lys

Lys

Asn

Leu

du

dy

Lys

Leu

Ile

Lys

Asn

Gin

Tyr

Val

dn

260 265 270

PL 194 800 B1

AAG Lys

AGA GAT

GAT ASp

CCT Pro

AAA Lys

AAT Asn

CCA CTG

ACC Thr

ATT He

TAC Tyr

AAC Asn 265

ATT ACC GCA

B64

Arg

ASp 275

Pro 280

Leu

Ile

Thr

Ala

ACA

TTG

GAC

GGC

AAC

CGC

TTT

ACC

GGC

AGT

GCC

AAA

GTT

AGC

ACC

GAG

912

Thr

Leu

Asp

Gly

Asn

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Ala

Lys

Val

Ser

Thr

Glu

290

295

300

GTG

AAG

ACG

CAA

CAC

GCT

GAT

AAA

GAA

TAT

TTG

TTT

TTC

CAT

ACC

GAT

960

Val

Lys

Thr

Gin

His

Ala

Asp

Lys

Glu

Tyr

Leu

Phe

Phe

His

Thr

Asp

305

310

315

320

GCC

GAT

CAG

CGG

CTT

GAG

GGC

GGT

TTT

TTC

GGC

GAT

AAC

GGA

GAA

GAG

100Θ

Ala

Asp

Gin

Arg

Leu

Glu

Gly

Gly

Phe

Phe

Gly

Asp

Asn

Gly

Glu

Glu

325

330

335

CTT

GCC

GGG

CGG

TTT

ATC

AGT

AAC

GAC

AAC

AGC

GTA

TTC

GGC

GTG

TTC

1056

Leu

Ala

Gly

Arg

Phe

Ile

Ser

Asn

Asp

Asn

Ser

Val

Phe

Gly

Val

Phe

340

345

350

GCA

GGC

AAA

CAA

AAA

ACA

GAG

ACA

GCA

AAC

GCA

TCA

GAT

ACA

AAT

CCT

1104

Ala

Gly

Lys

Gin

Lys

Thr

Glu

Thr

Ala

Asn

Ala

Ser

Asp

Thr

Asn

Pro

355

360

365

GCC

CTG

CCG

TCT

GGA

AAA

CAC

ACC

AAA

ATC

TTG

GAT

TCT

CTA

AAA

ATT

1152

Ala

Leu

Pro

Ser

Gly

Lys

His

Thr

Lys

Ile

Leu

^p

Ser

Leu

Lys

Ile

370

375

380

TCC

GTT

GAC

GAG

GCG

ACT

GAT

GAC

CAT

GCC

CGT

AAG

TTT

GCC

ATT

TCC

1200

Ser

Val

Asp

Glu

Ala

Thr

Asp

Asp

His

Ala

Arg

Lys

Phe

Ala

Ile

Ser

3S5

390

395

400

ACT

ATG

CCC

GAT

TTT

GGT

CAT

CCC

GAC AAA

CTT

CTT

GTC

GAA

GGG

CGT

1248

Thr

Met

Pro

Asp

Phe

Gly

His

Pro

^p Lys

Leu

Leu

Val

Glu

Gly

Arg

405

410

415

GAA

ATT

CCT

TTG

GTT

AGC

CAA

GAG

AAA

ACC

ATC

GAG

CTT

GCC

GAC

GGC

1296

Glu

Ile

Pro

Leu

Val

Ser

Gin

Glu

Lys

Thr

Ile

Glu

Leu

Ala

Asp

Gly

420

42S

430

PL 194 800 B1

PL 194 800 Β1

TAT Tyr

GCG AAT

CAA GCG Gln Ala

GCA Ala

AAA Lys 615

GCA Ala

GAA Glu

TTT Phe

GAC Asp

GTT Val 620

GAT Asp

TTT Phe

GGT Gly

GCG Ala

1872

Ala 610

Asn

AAG

TCG

CTT

TCA

GGT

AAG

TTG

ACA

GAA

AAA

AAT

GAT

ACA

CAC

CCC

GCT

1320

Lys

Ser

Leu

Ser

Gly

Lys

Leu

Thr

Glu

Lys

Asn

Asp

Thr

His

Pro

Ala

625

630

635

640

TTT

TAT

ATT

GAA

AAA

GGT

GTG

ATT

GAT

GGC

AAC

GGT

TTC

CAC

GCT

TTG

1968

Phe

Tyr

Ile

Glu

Lys

Gly

Val

Ile

Asp

Gly

Asn

Gly

Phe

His

Ala

Leu

645

650

655

GCG

CGT

ACT

CGT

GAA

AAT

GGT

GTT

GAT

TTG

TCT

GGG

CAA

GGT

TCG

ACT

2016

Ala

Arg

Thr

Arg

Glu

Asn

Gly

Val

Asp

Leu

Ser

Gly

Gln

Gly

Ser

Thr

660

665

670

AAT

CGC

CAA

AGT

TTT

AAA

GCC

AGT

AAT

CTT

CTC

GTA

GAA

GGA

GGA

TTT

2064

Asn

Pro

Gln

Ser

Phe

Lys

Ala

Ser

Asn

Leu

Leu

Val

Glu

Gly

Gly

Phe

675

680

685

TAT

GGT

CCG

CAG

GCG

GCA

GAG

TTG

GGT

GGT

AAT

ATT

ATC

GAC

AGT

GAC

2112

Tyr

Gly

Pro

Gln

Ala

Ala

Glu

Leu

Gly

Gly

Asn

Ile

Ile

Asp

Ser

Asp

690

695

700

CGG

AAA

ATC

GGC

GTG

GTA

i

GCG

AAG

AAA

GAT

ATG

CAG

GAG

GTG

2160

Arg

Lys

Ile

Gly

Val

Val

Phe

Gly

Ala

Lys

Lys

Asp

Met

Gln

Glu

Val

705

710

715

720

GAA AAA TGA Glu Lys

2169

PL 194 800 Β1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 722 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Neisseria meningitidis szczep M981 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:4:

Met Cys 1

Ala Ser

Thr Pro

Ser Pro

A.1 a Val 55

Arg Glu

Leu Ser

Asn Lys

Ala Ser

130 Phe Val 145

Glu Lys

Gly Phe

Ala Gly

Ile Arg

210

Lys Pro

Cys Ile 20

Thr Ala 35

Pro Ala

Gly Ala

Asp Gly

Phe Lys 100

Leu Gln 115

Ile Thr

Ser Ala

Thr Ser

Val Tyr 180

Thr Val 195

His Arg

Asn 5	Tyr
Gly	Gly
Tyr	Pro
Gly	Ser
Ala	Met 70
Thr 85	Ala
Glu	Gly
Gln	Leu
Thr	Ser
Gly	Tyr 150
Asp 165	Glu
Tyr	Leu
Lys	Tyr
Arg	Gly

Gly Gly

Asn Phe

Val Thr 40

Ser Val 55

Arg Leu

Ile Pro

Asp Val

Lys Ser 120

Glu Asn

135

Val Phe

Lys Gln

Gly Glu

Ser Gly 200

Lys Gly 215

Ile Val 10

Gly Val 25

Phe Lys

Glu Thr

Leu Arg

Asp Ser 90

Leu Phe 105

Glu Ile

Glu Asn

Thr Lys

Phe Ser

170

His Pro

185

Asn Trp

Val Ser

Leu Leu

Gln Pro

Ser Lys

Thr Pro 60

Arg Asn 75

Lys Gln

Leu Tyr

His Lys

Lys Lys 140

Asn Gly 155

Asn Arg

Ser Gln

Gln Tyr

Ser Val

Pro Leu

Val Val

Asp Val 45

Val Asn

Thr Ala

Ala Glu

Gly Ser

110 Arg Asn 125

Tyr Asn

Lys Asp

Leu Gly

Ser Leu

190 Met Thr 205

Asp Leu

Leu Leu

Glu Ser

Pro Thr Gln Pro
Phe	His 80
Glu 95	Lys
Lys	Glu
Pro	Glu
Tyr	Arg
Glu	Ile 160
Tyr 175	Asp
Pro	Ser
Asp	Ala

Gly Tyr

220

PL 194 800 B1

Thr

Thr

Tyr

Tyr

Gly Asn Glu

Ile

Gly

Ala

Ala

Ser

Tyr

Glu

ALa

Arg

225

230

235

240

Asp

Ala

Asp

Gly

Arg Glu Lys

His

Pro

Ala

Glu

Tyr

Thr

Val

Asn

Phe

245

250

255

Asp

Lvs

Lys

Asn

Leu Glu Gly

Lys

Leu

Ile

Lys

Asn

Gin

Tyr

Val

Gin

260

265

270

Lys

Arg

Asp

Asp

Pro Lys Asn

Pro

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asn

He

Thr

Ala

275

280

285

Thr

Leu

Asp

Gly

Asn Arg Phe

Thr

Gly

Ser

Ala

Lys

Val

Ser

Thr

GLu

290

295

300

Val

Lys

Thr

Gin

His Ala Asp

Lys

Glu

Tyr

Leu

Phe

Phe

His

Thr

Asp

305

310

315

320

Ala

Asp

Gin

Arg

Leu Glu Gly

Gly

Phe

Phe

Gly

Asp

Asn

Gly

GLu

Glu

325

330

335

Leu

Al a

Gly

Arg

Phe Ile Ser

Asn

Asp

Asn

Ser

Val

Phe

Gly

Val

Phe

340

345

350

Ala

Gly

Lys

Gin

Lys Thr Glu

Thr

Ala

Asn

Ala

Ser

Asp

Thr

Asn

Pro

355

360

365

Ala

Leu

Pro

Ser

Gly Lys His

Thr

Lys

He

Leu

Asp

Ser

Leu

Lys

Ile

370

375

380

Ser

Val

Asp

Glu

Ala Thr Asp

Asp

His

Ala

Arg

Lys

Phe

Ala

Ile

Ser

385

390

395

400

Thr

Met

Pro

Asp

Phe Gly His

Pro

Asp

Lys

Leu

Leu

Val

Glu

Gly

Arg

405

410

415

Glu

He

Pro

Leu

Val Ser Gin

GLu

Lys

Thr

Ile

Glu

Leu

Ala

Asp

Gly

420

425

430

Arg

Lvs

Met

Thr

He Arg Ala

Cys

Cys

Asp

Phe

Leu

Thr

Tyr

Val

Lys

435

440

445

Leu

Gly

Arg

Ile

Lys Thr Asp

Arg

Pro

Ala

Val

Lys

Pro

Lys

Ala

Gin

450

455

460

Asp

Glu

Glu

Asp

Ser Asp He

Asp

Asn

Gly

Glu

Glu

Ser

Glu

Asp

Glu

465

470

475

480

Ile

Ser

Glu

Asp

Asp Asn Gly

Glu

Asp

Glu

Val

Thr

Glu

GLu

Glu

Glu

485

490

495

Ala

Glu

Glu

Thr

Glu Glu Glu

Thr

ASp

Glu

Asp

Glu

Glu

Glu

Glu

Pro

500

505

510

Glu

Glu

Thr

Glu

Glu Thr Glu

Glu

Thr

Glu

Glu

Thr

Glu

GLu

Thr

Glu

515

520

525

Glu

Thr

Glu

Glu

Lys Ser Pro

Thr

Glu

Glu

Gly

Asn

Gly

Gly

Ser

Gly

530

535

540

Ser

Ile

Leu

Pro

Thr Pro Glu

Ala

Ser

Lys

Gly

Arg

Asp

Ile

Asp

Leu

545

550

555

560

PL 194 800 B1

Phe

Leu

Lys

Gly

Ile 565

Arg

Thr Ala Glu

Ala Asp 570

Ile

Pro

Gin

Ile 575

Gly

Lys

Ala

Arg

Tyr

Thr

Gly

Thr

Trp

Glu

Ala

Arg

Ile

Gly

Val

Pro

Asp

580

585

590

Lys

Lys

Gly

Glu

Gin

Leu

Asp

Gly

Thr

Thr

Ser

Ile

Gin

Lys

Asp

Ser

595

600

605

Tyr

Ala

Asn

Gin

Ala

Ala

Lys

Ala

Glu

Phe

Asp

Val

Asp

Phe

Gly

Ala

610

615

620

Lys

Ser

Leu

Ser

Gly

Lys

Leu

Thr

Glu

Lys

Asn

Asp

Thr

His

Pro

AL a

625

630

635

640

Phe

Tyr

Ile

Glu

Lys

Gly

Val

Ile

Asp

Gly

Asn

Gly

Phe

His

Ala

Leu

645

650

655

Ala

Arg

Thr

Arg

Glu

Asn

Gly

Val

Asp

Leu

Ser

Gly

Gin

Gly

Ser

Thr

660

665

670

Asn

Pro

Gin

Ser

Phe

Lys

Ala

Ser

Asn

Leu

Leu

Val

Glu

Gly

Gly

Phe

675

680

685

Tyr

Gly

Pro

Gin

Ala

Ala

Glu

Leu

Gly

Gly

Asn

Ile

Ile

Asp

Ser

Asp

690

695

700

Arg

Lys

Ile

Gly

Val

Val

Phe

Gly

Ala

Lys

Lys

Asp

Met

Gin

Glu

Val

705

710

715

720

Glu Lys

PL 194 800 B1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2226 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(B) SZCZEP: Neisseria meningitidis szczep H44/76 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 1...2223 (C) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:5:

ATG Met 1

TGT Cvs

AAA Lys

CCG Pro

AAT Asn 5

TAT Tvr

GGC Gly

GGC Gly

ATT Ile

GTC Val 10

TTG Leu

TTG Leu

CCC Pro

TTA Leu

CTT Leu 15

TTG Leu

48

GCA

TGT

TGT

ATT

GGC

GGC

AAT

TTC

GGC

GTG

CAG

CCT

GTT

GTC

GAA

TCA

96

Ala

Ser

Cys

Ile

Gly

Gly

Asn

Phe

Gly

Val

Gin

Pro

Val

Val

Glu

Ser

20

25

30

ACG

CCG

ACC

GCG

TAC

CCC

GTC

ACT

TTC

AAG

TCT

AAG

GAC

GTT

CCC

ACT

144

Thr

Pro

Thr

Ala

Tyr

Pro

Val

Thr

Phe

Lys

Ser

Lys

Asp

Val

Pro

Thr

35

40

45

CCG

CCC

CCT

GCC

AAA

CCT

TCT

ATA

GAA

ACC

ACG

CCG

GTG

CCG

TCA

ACC

192

Pro

Pro

Pro

Ala

Lys

Pro

Ser

Ile

Glu

Thr

Thr

Pro

Val

Pro

Ser

Thr

50

55

60

GGG

CCT

GCC

GTC

GGT

GCG

GCA

ATG

CGG

CTG

TTG

AGG

CGG

ATT

TTC

GCA

240

Gly

Pro

Ala

Val

Gly

Ala

Ala

Met

Arg

Leu

Leu

Arg

Arg

Ile

Phe

Ala

65

70

75

80

ACT

TCT

GAT

AAG

GTT

GGC

AAT

GAT

TTT

CCA

AAT

AGC

AAA

CAA

GCA

GAA

288

Thr

Ser

Asp

Lys

Val

Gly

Asn

Asp

Phe

Pro

Asn

Ser

Lys

Gin

ALa

Glu

PL 194 800 B1

GAA du

AAG Lys

CTG Leu

TCG Ser 100

TTT Phe

AAA Lys

GAA GGT

GAT Asp 105

GTT CTG TTT TTA TAC

GGT dy

TCA Ser

336

Glu

dy

Val

Leu

Phe

Leu

Tyr 110

AAA

AAA

GAT

AAA

CTT

CAG

TGG

CTT

AAG

GAT

AAA

ATT

CAT

CAA

CGC

AAT

394

Lys

Lys

Asp

Lys

Leu

Gin

Trp

Leu

Lys

Asp

Lys

Ile

His

dn

Arg

Asn

115

120

125

CCT

AAT

GTA

GAA

ATT

AGG

ACA

TCA

GAA

AAT

GAA

AAT

AAA

AAA

TAT

GGT

432

Pro

Asn

Val

Glu

Ile

Arg

Thr

Ser

GLu

Asn

du

Asn

Lys

Lys

Tyr

dy

130

135

140

TAT

GAA

TTT

GTG

GAT

GCC

GGT

TAT

GTA

TAT

ACT

AAA

AAC

GGA

AGA

GAT

480

Tyr

Glu

Phe

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Val

Tyr

Thr

Lys

Asn

dy

Thr

Asp

145

150

155

160

GAA

ATT

GAG

TGG

ACT

TCA

AAT

CCC

AAG

CAG

TTT

TCT

AAT

CGT

TTT

GGC

528

Glu

ile

Glu

Trp

Thr

Ser

Asn

Arg

Lys

Gin

Phe

Ser

Asn

Arg

Phe

dy

165

170

175

TAC

GAC

GGT

TTT

GTA

TAT

TAT

TCC

GGA

GAA

CAT

CCT

TCC

CAA

TCT

TTA

576

Tyr

Asp

Gly

Phe

Val

Tyr

Tyr

Ser

dy

du

His

Pro

Ser

dn

Ser

Leu

1B0

IBS

190

CCG

AGC

GCG

GGA

ACG

GTG

CAA

TAT

TCC

GGT

AAC

TGG

CAA

TAT

ATG

ACC

624

Pro

Ser

Ala

dy

Thr

val

Gin

Tvr

Ser

Gly

Asn

Trp

dn

Tyr

Mer

Thr

195

200

205

GAT

GCC

ATA

CGT

CAT

CGA

ACA

GGA

AAA

GCA

GGA

GAT

CCT

AGC

GAA

GAT

672

ASp

Ala

Ile

Arg

His

Arg

Thr

GLy

Lys

Ala

dy

Asp

Pro

Ser

Glu

Asp

210

215

220

TTG

GGT

TAT

CTG

GTT

TAT

TAC

GGT

CAA

AAT

GTC

GGA

GCA

ACT

TCT

TAT

720

Leu

Gly

Tyr

Leu

Val

Tyr

Tyr

Gly

dn

Asn

Val

dy

ALa

Thr

Ser

Tyr

225

230

235

240

GCT

GCG

ACT

GCC

GAC

GAC

CGG

GAG

GGA

AAA

CAT

CCT

GCC

GAA

TAT

ACG

768

Ala

Ala

Thr

Ala

Asp

Asp

Arg

Glu

dy

Lys

His

Pro

ALa

du

Tyr

Thr

245

250

255

GTT

GAT

TTC

GAT

AAG

AAA

ACT

TTG

ACG

GGT

CAA

TTA

ATT

AAA

AAT

CAG

816

Val

Asp

Phe

Asp

Lys

Lys

Thr

Leu

Thr

dy

dn

Leu

Ile

Lys

Asn

dn

260 265 270

PL 194 800 B1

ΤΑΤ Tyr

GTG Val

CAA AAG

AAA Lys

ACC Thr

GAT Asp

GAA Glu 280

AAG Lys

AAA Lys

CCA Pro

CTG Leu

ACC Thr 285

ATT Ile

TAC Tyr

GAC Asp

864

Gln 275

Lys

ATT

ACC

GCA

ACA

TTG

GAC

GGC

AAC

CGC

TTT

ACC

GGC

AGT

GCC

AAA

GTT

912

Ile

Thr

ALa

Thr

Leu

Asp

Gly

Asn

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Ala

Lys

Val

290

295

300

AAC

ACC

GAG

TTG

AAG

ACG

AGC

CAC

GCT

GAT

AAA

GAG

CAT

TTG

TTT

TTC

950

Asn

Thr

Glu

Leu

Lys

Thr

Ser

His

Ala

Asp

Lys

Glu

His

Leu

Phe

Phe

305

310

315

320

CAT

ACC

GAT

GCC

GAT

CAG

CGG

CTT

GAG

GGC

GGT

TTT

TTC

GGC

GAT

AAG

1008

His

Thr

Asp

Ala

Asp

Gln

Arg

Leu

Glu

Gly

Gly

Phe

Phe

Gly

Asp

Lys

325

330

335

GGG

GAA

GAG

CTT

GCC

GGA

CGG

TTT

ATC

AGC

AAC

GAC

AAC

AGC

GTA

TTC

1055

Gly

Glu

Glu

Leu

Ala

Gly

Arg

Phe

He

Ser

Asn.

Asp

Asn

Ser

Val

Phe

340

345

350

GGC

GTA

TTC

GCA

GGC

AAA

AAA

ACA

AAC

GCA

TCA

AAC

GCA

GCA

GAT

ACA

1104

Gly

Val

Phe

Ala

Gly

Lys

Lys

Thr

Asn

Ala

Ser

Asr.

Ala

Ala

Asp

Thr

355

350

355

AAT

CCT

GCT

ATG

CCG

TCT

GAA

AAA

CAC

ACC

AAA

ATC

TTG

GAT

TCT

CTG

1152

Asn

Pro

Ala

Met

Pro

Ser

Glu

Lys

His

Thr

Lys

Ile

Leu

Asp

Ser

Leu

370

375

380

AAA

ATT

TCC

GTT

GAC

GAG

GCG

ACG

GAT

AAA

AAT

GCC

CGC

CCG

TTT

GCC

1200

Lys

Ile

Ser

Val

Asp

Glu

Ala

Thr

Asp

Lys

Asn

Ala

Arg

Pro

Phe

ALa

385

3 90

395

400

ATT

TCZC

CCT

CTG

CCC

GAT

TTT

GGC

CAT

CCC

GAC

AAA

CTC

CTT

GTC

GAA

1248

Ile

Ser

Pro

Leu

Pro

Asp

Phe

Gly

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Leu

Val

Glu

405

410

415

GGG

CGT

GAA

ATT

CCT

TTG

GTT

AGC

CAA.

GAG

AAA

ACC

ATC

GAG

CTT

GCC

1296

Gly

Arg

Glu

Ile

Pro

Leu

Val

Ser

Gln

Glu

Lys

Thr

Ile

Glu

Leu

Ala

420

425

430

PL 194 800 Β1

GAC GGC AGG AAA Asp Gly Arg Lys

ATG Met

ACC Thr

GTC CGT GCT

TGT Cys

TGC Cys

GAT TTT CTG ACC TAT

1344

Val

Arg 440

Ala

Asp

Phe 445

Leu

Thr

Tyr

435

GTG

AAA

CTC

GGA

CGG

ATA

AAA

ACT

GAC

CGC

CCA

GCA

AGT

AAA

CCA

AAG

1392

Val

Lys

Leu

Gly

Arg

Ile

Lys

Thr

Asp

Arg

Pro

Ala

Ser

Lys

Pro

Lys

450

455

460

GCG

GAA

GAT

AAA

GGG

AAG

GAT

GAA

GAG

GAT

ACA

GGC

GTT

GGT

AAC

GAC

1440

Ala

Glu

Asp

Lys

Gly

Lys

Asp

Glu

Glu

Asp

Thr

Gly

Val

Gly

Asn

Asp

465

470

475

480

GAA

GAA

GGC

ACG

GAA

GAT

GAA

GCC

GCA

GAA

GGC

AGC

GAA

GGA

GGC

GAA

1488

Glu

Glu

Gly

Thr

Glu

Asp

Glu

Ala

Ala

Glu

Gly

Ser

Glu

Gly

Gly

Glu

485

490

495

GAC

GAA

ATC

GGC

GAT

GAA

GGA

GGA

GGT

GCG

GAA

GAC

GAA

GCC

GCA

GAA

1536

Asp

Glu

Ile

Gly

Asp

Glu

Gly

Gly

Gly

Ala

Glu

Asp

Glu

Ala

Ala

Glu

500

505

510

AAC

GAA

GGC

GGC

GAA

GAA

GAC

GAA

GCT

GAA

GAA

CCT

GAA

GAA

CCC

GAA

1584

Asn

Glu

Gly

Gly

Glu

Glu

Asp

Glu

Ala

Glu

Glu

Pro

Glu

Glu

Pro

Glu

515

520

525

GAA

GAA

TCG

CCG

GCA

GAA

GGC

GGC

GGT

GGT

GGT

TCA

GAC

GGC

ATC

CTG

1632

Glu

Glu

Ser

Pro

Ala

Glu

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Asp

Gly

Ile

Leu

530

535

540

CCC

GCT

CCG

GAA

GCT

CCT

AAA

GGC

AGG

GAT

ATC

GAC

CTT

TTC

CTG

AAA

1680

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Pro

Lys

Gly

Arg

Asp

Ile

Asp

Leu

Phe

Leu

Lys

545

550

555

560

GGT

ATC

CGC

ACG

GCG

GAA

GCC

GAC

ATT

CCG

CAA

ACT

GGA

AAA

GCA

CGC

1728

Gly

Ile

Arg

Thr

Ala

Glu

Ala

Asp

Ile

Pro

Gin

Thr

Gly

Lys

Ala

Arg

565

570

575

TAT

ACC

GGC

ACT

TGG

GAA

GCG

CGT

ATC

AGC

AAA

CCC

ATT

CAA

TGG

GAC

1776

Tyr

Thr

Gly

Thr

Trp

Glu

Ala

Arg

Ile

Ser

Lys

Pro

Ile

Gin

Trp

Asp

580

585

590

AAT

CAT

GCG

GAT

AAA

AAA

GCG

GCA

AAA

GCA

GAA

TTT

GAC

GTT

GAT

TTC

1824

Asn

His

Ala

Asp

Lys

Lys

Ala

Ala

Lys

Ala

Glu

Phe

Asp

Val

Asp

Phe

595

600

605

PL 194 800 B1

GGC Gly

GAG Glu 610

AAA Lys

TCG Ser

ATT He

TCC Ser

GGA Gly 615

ACG Thr

CTG Leu

ACG Thr

GAG Glu

AAA Lys 620

AAC Asn

GGT Gly

GTA Val

CAA Gln

1872

CCT

GCT

ttc

CAT

ATT

GAA

AAC

GGC

GTG

ATT

GAG

GGC

AAT

GGT

TTC

CAC

1920

Pro

Ala

Phe

His

Ile

Glu

Asn

Gly

Val

Ile

Glu

Gly

Asn

Gly

Phe

His

625

630

635

640

GCG

ACA

GCG

CGC

ACT

CGG

GAT

AAC

GGC

ATC

AAT

CTT

TCG

GGA

AAT

GAT

1968

A-i a

Thr

Ala

Arg

Thr

Arg

Asp

Asn

Gly

Ile

Asn

Leu

Ser

Gly

Asn

Asp

645

650

655

TCG

ACT

AAT

CCT

CCA

AGT

TTC

AAA

GCC

AAT

AAT

CTT

CTT

GTA

ACA

GGC

2016

Ser

Thr

Asn

Pro

Pro

Ser

Phe

Lys

Ala

Asn

Asn

Leu

Leu

Val

Thr

Gly

660

665

670

GGC

TTT

TAC

GGC

CCG

CAG

GCG

GAG

GAA

TTG

GGC

GGT

ACT

ATT

TTC

AAT

2064

Gly

Phe

Tyr

Gly

Pro

Gln

Ala

Glu

Glu

Leu

Gly

Gly

Thr

Ile

Phe

Asn

675

680

6B5

AAT

GAT

GGG

AAA

TCT

CTT

GGT

ATA

ACT

GAA

GAT

ACT

GAA

AAT

GAA

GCT

2112

Asn

Asp

Gly

Lys

Ser

Leu

Gly

Ile

Thr

Glu

Asp

Thr

Glu

Asn

Glu

Ala

690

695

700

GAA

GCT

GAA

GTT

GAA

AAT

GAA

GCT

GGT

GTT

GGC

GAA

CAG

TTA

AAA

CCT

2160

Glu

Ala

Glu

Val

Glu

Asn

Glu

Ala

Gly

Val

Gly

Glu

Gln

Leu

Lys

Pro

705

710

715

720

GAA

GCT

AAA

CCC

CAA

TTC

GGC

GTG

GTA

TTC

GGT

GCG

AAG

AAA

GAT

AAT

2208

Glu

Ala

Lys

Pro

Gln

Phe

Gly

Val

Val

Phe

Gly

Ala

Lys

Lys

Asp

Asn

725

730

735

AAA

GAG

GTG

GAA

AAA

TGA

2226

Lys

Glu

Val

Glu

Lys

740

PL 194 800 Β1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 741 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Neisseria meningitidis szczep H44/76 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:6:

Met

Cys

Lys

Pro

Asn

Tyr

Gly

Gly

Ile

Val

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Leu

1

5

10

15

Ala

Ser

Cys

Ile

Gly

Gly

Asn

Phe

Gly

Val

Gln

Pro

Val

Val

Glu

Ser

20

25

30

Thr

Pro

Thr

Ala

Tyr

Pro

Val

Thr

Phe

Lys

Ser

Lys

Asp

Val

Pro

Thr

35

40

45

Pro

Pro

Pro

Ala

Lys

Pro

Ser

Ile

Glu

Thr

Thr

Pro

Val

Pro

Ser

Thr

50

55

60

Gly

Pro

Ala

Val

Gly

Ala

Ala

Met

Arg

Leu

Leu

Arg

Arg

Ile

Phe

Ala

55

70

75

80

Thr

Ser

Asp

Lys

Val

Gly

Asn

Asp

Phe

Pro

Asn

Ser

Lys

Gln

Ala

Glu

85

90

95

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

Ser

100

105

110

Lys

Lys

Asp

Lys

Leu

Gln

Trp

Leu

Lys

Asp

Lys

Ile

His

Gln

Arg

Asn

115

120

125

Pro

Asn

Val

Glu

Ile

Arg

Thr

Ser

Glu

Asn

Glu

Asn

Lys

Lys

Tyr

Gly

130

135

140

Tyr

Glu

Phe

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Val

Tyr

Thr

Lys

Asn

Gly

Thr

Asp

145

150

155

160

Glu

Ile

Glu

Trp

Thr

Ser

Asn

Arg

Lys

Gln

Phe

Ser

Asn

Arg

Phe

Gly

165

170

175

Tyr

Asp

Gly

Phe

Val

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Glu

His

Pro

Ser

Gln

Ser

Leu

180

185

190

Pro

Ser

Ala

Gly

Thr

Val

Gln

Tyr

Ser

Gly

Asn

Trp

Gln

Tyr

Met

Thr

195

200

205

Asp

Ala

Ile

Arg

His

Arg

Thr

Gly

Lys

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Glu

Asp

210

215

220

PL 194 800 B1

Leu

Gly Tyr Leu Val

Tyr

Tyr Gly

Gln

Asn

Val

GLy

AL a

Thr

Ser

Tyr

225

230

235

240

Ala

Ala

Thr

Ala

ASp

Asp

Arg

Glu

GLy

Lys

His

Pro

Ala

Glu

Tyr

Thr

245

250

255

Val

Asp

Phe

Asp

Lys

Lys

Thr

Leu

Thr

Gly

Gln

Leu

Ile

Lys

Asn

Gln

260

265

270

Tyr

Val

GLn

Lys

Lys

Thr

Asp

Glu

Lys

Lys

Pro

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asp

275

280

235

Ile

Thr

Ala

Thr

Leu

Asp

Gly

Asn

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Ala

Lys

Val

290

295

300

Asn

Thr

Glu

Leu

Lys

Thr

Ser

His

Ala

Asp

Lys

Glu

His

Leu

Phe

Phe

305

310

315

320

His

Thr

Asp

Ala

Asp

Gin

Arg

Leu

Glu

Gly

Gly

Phe

Phe

Gly

Asp

Lys

325

330

335

Gly

Glu

Glu

Leu

Ala

GLy

Arg

Phe

Ile

Ser

Asn

Asp

Asn

Ser

Val

Phe

340

345

350

Gly

Val

Phe

Ala

Gly

Lys

Lys

Thr

Asn

Ala

Ser

Asn

Ala

Ala

Asp

Thr

355

360

365

Asn

Pro

Ala

Met

Pro

Ser

Glu

Lys

His

Thr

Lys

Ile

Leu

Asp

Ser

Leu

370

375

380

Lys

Ile

Ser

Val

Asp

Glu

Ala

Thr

Asp

Lvs

Asn

Ala

Arg

Pro

Phe

Ala

305

390

395

400

Ile

Ser

Pro

Leu

Pro

Asp

Phe

GLy

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Leu

Val

Glu

405

410

415

Gly

Arg

Glu

He

Pro

Leu

Val

Ser

Gln

Glu

Lys

Thr

Ile

Glu

Leu

Ala

420

425

430

Asp

Gly

Arg

Lys

Met

Thr

Val

Arg

Ala

Cys

Cys

Asp

Phe

Leu

Thr

Tyr

435

44 0

445

Val

Lys

Leu

Gly

Arg

Ile

Lys

Thr

Asp

Arg

Pro

Ala

Ser

Lys

Pro

Lys

450

455

460

Ala

Glu

Asp

Lys

Gly

Lys

Asp

Glu

GLu

Asp

Thr

Gly

Val

Gly

Asn

Asp

465

470

475

480

Glu

Glu

Gly

Thr

Glu

Asp

GLu

Ala

Ala

Glu

Gly

Ser

Glu

Gly

Gly

Glu

405

490

495

Asp

Glu

Ile

Gly

Asp

Glu

GLy

GLy

Gly

Ala

Glu

Asp

Glu

Ala

Ala

Glu

500

505

510

Asn

Glu

Gly

Gly

GLu

Glu

Asp

Glu

Ala

Glu

Glu

Pro

Glu

Glu

Pro

Glu

515

520

525

Glu

Glu

Ser

Pro

Ala

Glu

Gly

Gly

GLy

Gly

Gly

Ser

Asp

Gly

Ile

Leu

530

535

540

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Pro

Lys

GLy

Arg

Asp

Ile

Asp

Leu

Phe

Leu

Lys

545

550

555

560

PL 194 800 B1

Gly

Ile

Arg Thr

Ala 565

Glu

Ala Asp

Ile

Pro Gin Thr Gly Lys Ala Arg

570

575

Tyr

Thr

Gly

Thr

Trp

Glu

Ala

Arg

Ile

Ser

Lys

Pro

Ile

Gin

Trp

Asp

580

585

590

Asn

His

Ala

Asp

Lys

Lys

Ala

Ala

Lys

Ala

Glu

Phe

Asp

Val

Asp

Phe

595

600

605

Gly

Glu

Lys

Ser

Ile

Ser

Gly

Thr

Leu

Thr

Glu

Lys

Asn

Gly

Val

Gin

610

615

620

Pro

Ala

Phe

His

Ile

Glu

Asn

Gly

Val

Ile

Glu

Gly

Asn

Gly

Phe

His

625

630

635

640

Ala

Thr

Ala

Arg

Thr

Arg

Asp

Asn

Gly

Ile

Asn

Leu

Ser

Gly

Asn

Asp

645

650

655

Ser

Thr

Asn

Pro

Pro

Ser

Phe

Lys

Ala

Asn

Asn

Leu

Leu

Val

Thr

Gly

660

665

670

Gly

Phe

Tyr

Gly

Pro

Gin

Ala

GLu

Glu

Leu

Gly

Gly

Thr

Ile

Phe

Asn

675

680

685

Asn

Asp

Gly

Lys

Ser

Leu

Gly

Ile

Thr

Glu

Asp

Thr

Glu

Asn

Glu

Ala

690

695

700

Glu

Ala

Glu

Val

Glu

Asn

Glu

Ala

Gly

Val

Gly

Glu

Gin

Leu

Lys

Pro

705

710

715

720

Glu

Ala

Lys

Pro

Gin

Phe

Gly

Val

Val

Phe

Gly

Ala

Lys

Lys

Asp

Asn

725

730

735

Lys

Glu

Val

Glu

Lys

740

(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2262 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(B) SZCZEP: Neisseria meningitidis szczep M990 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 1...2259 (C) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:7:

PL 194 800 B1

ATG	TGT	AAA	CCG	AAT	TAT	GGC	GGC	ATT
Met 1	Cys	Lys	Pro	Asn 5	Tyr	Gly	Gly	Ile
GCA	TCT	TGT	ATC	GGC	GGC	AAT	TTC	GGC
Ala	Ser	Cys	Ile 20	Gly	Gly	Asn	Phe	Gly 25
ACG	CCG	ACC	GCG	CCA	ACT	CTG	TCA	GAT
Thr	Pro	Thr 35	Ala	Pro	Thr	Leu	Ser 40	Asp
GAT	AAG	CCT	GCT	CCA	GCT	CCT	GCC	GAG
Asp	Lys 5C	Pro	Ala	Pro	Ala	Pro 55	Ala	Glu
GTC	AAG	CGG	CCC	GCC	GTC	GGT	GCG	GCA
Val 6 5	Lys	Arg	Pro	Ala	Val 70	Gly	Ala	Ala
ATC	GCA	ACT	TTT	GAT	AAA	AAT	GGT	AAT
Ile	Ala	Thr	Phe	Asp 85	Lys	Asn	Gly	Asn
gca	GAG	GAG	TAT	CTG	CCG	CTC	AAA	GAG
Ala	Glu	Glu	Tyr 100	Leu	Pro	Leu	Lys	Glu 105
GGT	ACG	CCG	AAA	GAA	CAG	GCT	GAC	AAA
G-y	Thr	Pro 115	Lys	Glu	Gin	Ala	Asp 120	Lys
CGG	CAT	CCT	AAT	GCA	CCA	ATC	TAC	ACG
Arg	His 130	Pro	Asn	Ala	Pro	Ile 135	Tyr	Thr
TAT	CAA	TAT	AAA	TAT	GTC	CGG	GCC	GGA
Tyr 145	Gin	Tyr	Lys	Tyr	Val 150	Arg	Ala	Gly

GTC	TTG TTG CCC TTA CTT TTA	48
Val	Leu Leu Pro Leu Leu Leu
10	15

GTA Val	CAG Gin	CCT Pro	GTT Val	GTC Val 30	GAA Glu	TCA Ser	96
TCC	AAA	TCT	TCC	AAT	CCT	GCG	144
Ser	Lys	Ser	Ser 45	Asn	Pro	Ala
CCT	TCG	GTA	GAA	ATC	ACG	CCG	192
Pro	Ser	Val 60	Glu	Ile	Thr	Pro
ATG	CGG	CTG	CCA	AGG	CGG	AAT	240
Met	Arg 75	Leu	Pro	Arg	Arg	Asn 80
GAA	ATT	CCC	AAT	AGT	AAG	CAG	288
Glu 90	Ile	Pro	Asn	Ser	Lys 95	Gin
AAG	GAT	ATC	CTG	TTT	TTA	GAC	336
Lys	Asp	Ile	Leu	Phe 110	Leu	Asp
CTT	AAA	AAG	GAA	ATC	AAC	GGA	384
Leu	Lys	Lys	Glu 125	Ile	Asn	Gly
TCC	GAT	TTA	AAA	GAT	GAT	GCG	432
Ser	Asp	Leu 140	Lys	Asp	Asp	Ala
TAT	GTT	TAT	ACT	AGA	TAT	GGA	480
Tyr	Val 155	Tyr	Thr	Arg	Tyr	Gly 160

PL 194 800 Β1

ACA Thr

GAT Asp

GAA ATC

GAA Glu 165

CAG Gin

AAC Asn

TCA Ser

GGC Gly

GGT Gly 170

AAG Lys

CGG Arg

GTT Val

ACC Thr

CAC His 175

CGC Arg

528

Glu

Ile

TTA

GGT

TAT

GAC

GGT

TTT

GTA

TAT

TAT

TCC

GGA

GAA

CGT

CCT

TCC

CAA

576

Leu

Gly

Tyr

Asp

Gly

Phe

Val

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Glu

Arg

Pro

Ser

Gin

180

185

190

TCT

TTA

CCG

AGT

GCG

GGA

ACG

GTG

GAA

TAT

TCT

GGT

AAC

TGG

CAA

TAT

624

Ser

Leu

Pro

Ser

Ala

Gly

Thr

Val

Glu

Tyr

Ser

Gly

Asn

Trp

Gin

Tyr

195

200

205

ATG

ACC

GAT

GCC

AAA

CGT

CAT

CGA

GCA

GGT

CAG

GCG

GTT

GGC

ATT

GAC

672

Met.

Thr

Asp

Ala

Lys

Aro

His

Arg

Ala

Gly

Gin

Ala

Val

Gly

Ile

Asp

210

215

220

AAT

TTG

GGT

TAT

ATC

ACA

TTT

TAT

GGT

AAC

GAT

GTT

GGT

GCA

ACT

TCT

720

Asn

Leu

Gly

Tyr

Ile

Thr

Phe

Tyr

Gly

Asn

Asp

Vai

Gly

Ala

Thr

Ser

225

230

235

240

TAT

GCG

GCT

AAG

GAT

GTC

GAC

GAA

AGG

GAA

AAG

CAT

CCT

GCC

AAA

TAT

768

Tyr

Ala

Ala

Lys

Asp

Val

Asp

Glu

Arg

Glu

Lys

His

Pro

Ala

Lys

Tyr

245

250

255

ACG

GTT

GAT

TTT

GAT

AAC

AAA

ACC

ATG

AAT

GGC

AAG

CTG

ATT

AAA

AAT

816

Thr

Val

Asp

Phe

Asp

Asn

Lys

Thr

Met

Asn

Gly

Lys

Leu

ile

Lys

Asn

260

265

270

CAG

TAT

GTG

CGA

AAT

AAA

AAA

GAT

GAA

CCC

AAA

AAA

CCG

CTG

ACC

ATT

864

Gin

Tyr

Val

Arg

Asn

Lys

Lys

Asp

Glu

Pro

Lys

Lys

Pro

Leu

Thr

Ile

275

280

285

TAC

GAC

ATT

ACT

GCA

AAA

TTG

GAC

GGC

AAC

CGC

TTT

ACC

GGC

AGT

GCC

912

Tyr

Asp

Ile

Thr

Ala

Lys

Leu

Asp

Gly

Asn

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Ala

290

295

300

AAG

GTC

AAT

CCT

GAT

TTA

GCG

AAA

AAC

CTT

GCC

GGT

AAT

GAG

CGT

TTG

960

Lys

Val

Asn

Pro

Asp

Leu

Ala

Lys

Asn

Leu

Ala

Gly

Asn

Glu

Arg

Leu

305

310

315

320

TTT

TTC

CAT

GCC

GAT

GCC

GAT

CAG

CGG

CTT

GAG

GGC

GGT

TTT

TTC

GGC

1008

Phe

Phe

His

Ala

Asp

Ala

Asp

Gin

Arg

Leu

Glu

Gly

Gly

Phe

Phe

Gly

325

330

335

PL 194 800 B1

GAT AAC Asp Asn

GGA GAA

GAG Glu

CTT Leu

GCC Ala

GGA CGG

TTT Phe

ATC Ile

AGC AAC GAC AAC AGC

1056

Gly

Glu 340

Gly

Arg 345

Ser Asn

Asp 350

Asn

Ser

GTA

TTC

GGC

GTA

TTC

GCA

GGC

AAA

AAA

ACA

GAG

ACA

GCA

AAC

GCA

GCA

1104

Val

Phe

Gly

Val

Phe

Ala

Gly

Lys

Lys

Thr

Glu

Thr

Ala

Asn

Ala

Ala

355

360

365

GAT

ACA

AAA

CCT

GCC

CTG

CCG

TCT

GGA

AAA

CAC

ACC

AAA

ATC

TTG

GAT

1152

Asp

Thr

Lys

Pro

Ala

Leu

Pro

Ser

Gly

Lys

His

Thr

Lys

Ile

Leu

Asp

370

375

380

TCT

CTA

AAA

ATT

TCC

GTT

GAC

GAG

GCG

ACT

GAT

GGC

CAT

GCC

CGT

AAG

1200

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Val

Asp

GLu

Ala

Thr

Asp

GLy

His

Ala

Arg

Lys

385

390

395

400

TTT

GCC

ATT

TCC

TCT

ATG

CCC

GAT

TTT

GGT

CAT

CCC

GAC

AAA

CTT

CTT

1248

Phe

Ala

Ile

Ser

Ser

Met

Pro

Asp

Phe

Gly

Kis

Pro

Asp

Lys

Leu

Leu

405

410

415

GTC

GAA

GGG

CGT

GAA

ATT

CCT

TTG

GTA

AAC

GAA

GAA

CAA

ATC

ATC

AAG

1296

Val

Glu

GLy

Arg

GLu

Ile

Pro

Leu

Val

Asn

Glu

Glu

Gin

Ile

Ile

Lys

420

425

430

CTT

GCC

GAC

GGC

AGG

AAA

ATG

ACC

GTC

CGT

GCT

TGT

TGC

GAC

TTT

TTG

1344

Leu

Ala

Asp

Gly

Arg

Lys

Met

Thr

Val

Arg

Ala

Cys

Cys

Asp

Phe

Leu

435

440

445

ACC

TAT

GTG

AAA

CTC

GGA

CGG

ATA

AAA

ACC

GAT

CGC

CCG

GCA

AGT

AAA

1392

Thr

Tyr

Val

Lys

Leu

GLy

Arg

Ile

Lys

Thr

Asp

Arg

Pro

Ala

Ser

Lys

450

455

450

CCA

AAG

GCG

GAA

GAT

AAA

GGG

GAG

GAT

GAA

GAG

GGT

GCA

GGC

GTT

GAT

1440

Pro

Lys

Ala

Glu

Asp

Lys

Gly

GLu

Asp

Glu

Glu

GLy

Ala

Gly

Val

Asp

465

470

475

480

AAC

GAC

GAA

GAA

AGC

GAA

GAC

GAA

GCC

GTA

GAA

GAC

GAA

GGC

GGC

GAA

1488

Asn

Asp

Glu

GLu

Ser

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

Glu

Asp

Glu

GLy

Gly

Glu

485 490 495

PL 194 800 B1

GAA Glu

GAC GAA

ACT Thr 500

TCC GAA GAG GAT AAT

GGC GAA GAC

GAA GAA GCA Glu Glu ALa 510

ACC Thr

1536

Asp

Glu

Ser

Glu

Glu Asp Asn 505

Gly

Glu

Asp

GCC

GAA

GAA

GAA

ACC

GAA

GAA

GTT

GAT

GAA

GCC

GAA

GAG

GAG

GAA

GTT

1584

Ala

Glu

Glu

Glu

Thr

Glu

Glu

Val

Asp

Glu

Ala

Glu

Glu

Glu

Glu

Val

515

520

525

GAA

GAA

CCC

GAA

GAA

AAA

TCG

CCG

GCA

GAA

GGC

AAC

GGC

GGT

TCA

GGC

1632

Glu

Glu

Pro

Glu

Glu

Lys

Ser

Pro

Ala

Glu

Gly

Asn

Gly

Gly

Ser

Gly

530

535

540

AGG

ATC

CTG

CCT

GCC

CTA

GAA

GCC

TCT

AAA

GGC

AGG

GAC

ATC

GAC

CTT

1680

Ser

Ile

Leu

Pro

Ala

Leu

Glu

Ala

Ser

Lys

Gly

Arg

Asp

Ile

Asp

Leu

545

550

555

560

TTC

CTG

AAA

GGT

ATC

CGC

ACG

GCA

GAA

ACG

GAT

ATT

CCG

CAA

AGC

GGA

1728

Phe

Leu

Lys

Gly

Ile

Arg

Thr

Ala

Glu

Thr

Asp

Ile

Pro

Gln

Ser

Gly

565

570

575

ACG

GCG

CAT

TAT

AGC

GGC

ACT

TGG

GAA

GCG

CGT

ATC

GGC

AAA

CCC

ATT

1776

Thr

Ala

His

Tyr

Thr

Gly

Thr

Trp

Glu

Ala

Arg

Ile

Gly

Lys

Pro

Ile

580

5B5

590

CAA

TGG

GAC

AAT

CAG

GCG

GAT

GAA

AAA

GCG

GCA

AAA

GCA

GAA

TTT

ACC

1824

Gln

Trp

Asp

Asn

Gln

Ala

Asp

Glu

Lys

Ala

Ala

Lys

Ala

Glu

Phe

Thr

595

600

605

GTT

GAT

TTC

GAC

AAG

AAA

TCG

ATT

TCC

GGA

AAG

CTG

ACG

GAG

CAA

AAC

1872

Val

Asp

Phe

Asp

Lys

Lys

Ser

Ile

Ser

Gly

Lys

Leu

Thr

Glu

Gln

Asn

610

615

620

GGG

GTA

GAA

CCT

GCT

TTC

CAT

ATT

GAA

GAC

GGC

AAG

ATT

GAT

GGC

AAC

1920

Gly

Val

Glu

Pro

Ai a

Phe

His

Ile

Glu

Asp

Gly

Lys

Ile

Asp

Gly

Asn

625

630

635

640

GGT

TTC

CAC

GCG

ACA

GCG

CGC

ACT

CGG

GAG

AGC

GGC

ATC

AAT

CTT

TCG

1968

Gly

Phe

His

Ala

Thr

Ala

Arg

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Ile

Asn

Leu

Ser

645

650

655

GGA

AAT

GGT

TCG

ACC

GAC

CCC

AAA

ACA

TTC

CAA

GCT

AGT

AAT

CTT

CGT

2016

Gly

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Pro

Lys

Thr

Phe

Gln

ALa

Ser

Asn

Leu

Arg

660

5

670

PL 194 800 B1

GTA Val

GAA Glu

GGA Gly 675

GGA TTT

TAC Tyr

GGC Gly

CCG Pro 680

CAG Gin

GCG Ala

GCG Ala

GAA GLu

TTG Leu 685

GGC Gly

GGT Gly

ACT Thr

2064

Gly

Phe

ATT

TTC

AAT

AAT

GAT

GGG

AAA

TCT

CTT

AGT

ATA

ACT

GAA

AAT

ATT

GAA

2112

Ile

Phe

Asn

Asn

Asp

Gly

Lys

Ser

Leu

Ser

Ile

Thr

Glu

Asn

Ile

GLu

690

695

700

AAT

GAA

GCT

GAA

GCT

GAA

GTT

GAA

GTT

GAA

GCT

GAA

GCT

GAA

GTT

GAA

2160

Asn

Glu

Ala

GLu

Ala

GLu

Val

Glu

Val

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

Val

Glu

705

710

715

720

GTT

GAA

GCT

GAT

GTT

GGC

AAA

CAG

TTA

GAA

CCT

GAT

GAA

GTT

AAA

CAC

2208

Val

Glu

Ala

Asp

Val

Gly

Lys

Gin

Leu

GLu

Pro

Asp

Glu

Val

Lys

His

725

730

735

AAA

TTC

GGC

GTG

GTA

TTC

GGT

GCG

AAG

AAA

GAT

ATG

CAG

GAG

GTG

GAA

2256

Lys

Phe

GLy

Val

Val

Phe

Gly

Ala

Lys

Lys

Asp

Met

Gin

Glu

Val

Glu

740

745

750

AAA TGA 2262

Lys (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:8:

(i) CCAAAAKEEYSSYKK SSEK^EECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 753 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (c) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RADDZJ CCĄSSECCZI: b iałao (iii) RRODZA FRAAGMENE: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO OYSGINALNE:

(A) ORGANIZM: Neisseria meningitidis szczep M990 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:8:

Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu. Leu Leu 15

PL 194 800 B1

Ala

Ser

Cys

Ile 20

Gly

Gly

Asn

Phe Gly Val 25

Gln Pro Val

Val 30

Glu

Thr

Pro

Thr

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Asp

Ser

Lys

Ser

Ser

Asn

Pro

35

40

45

Asp

Lys

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Glu

Pro

Ser

Val

Glu

Ile

Thr

50

55

60

Val

Lys

Arg

Pro

Ala

Val

GLy

Ala

Ala

Met

Arg

Leu

Pro

Arg

Arg

65

70

75

He

Ala

Thr

Phe

Asp

Lys

Asn

Gly

Asn

Glu

Ile

Pro

Asn

Ser

Lys

85

90

95

Ala

Glu

Glu

Tyr

Leu

Pro

Leu

Lys

Glu

Lys

Asp

Ile

Leu

Phe

Leu

100

105

110

Gly

Thr

Pro

Lys

Glu

Gln

Ala

Asp

Lys

Leu

Lys

Lys

Glu

Ile

Asn

115

120

125

Arg

His

Pro

Asn

Ala

Pro

Ile

Tyr

Thr

Ser

Asp

Leu

Lys

Asp

Asp

130

135

140

Tyr

Gln

Tyr

Lys

Tyr

Val

Arg

Ala

Gly

Tyr

Val

Tyr

Thr

Arg

Tyr

145

150

155

Thr

Asp

Glu

Ile

GLu

Gln

Asn

Ser

Glv

GLy

Lys

Arg

Val

Thr

His

185

170

175

Leu

Gly

Tyr

ASp

Gly

Phe

Val

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Glu

Arg

Pro

Ser

ieo

185

190

Ssr

Leu

Pro

Ser

Ala

Gly

Thr

Val

Glu

Tyr

Ser

Gly

Asn

Trp

Gln

195

200

205

Mec

Thr

Asp

Ala

Lys

Arg

His

Arg

Ala

Gly

Gln

Ala

Val

Gly

Ile

210

215

220

Asn

Leu

Gly

Tyr

Ile

Thr

Phe

Tyr

Gly

Asn

Asp

Val

Gly

Ala

Thr

225

230

235

Tyr

Ala

Ala

Lys

Asp

Val

Asp

GLu

Arg

Glu

Lys

His

Pro

Ala

Lys

245

250

255

Thr

Val

Asp

Phe

Asp

Asn

Lys

Thr

Met

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Lys

260

285

270

Gln

Tyr

Val

Arg

Asn

Lys

Lys

Asp

Glu

Pro

Lys

Lys

Pro

Leu

Thr

275

280

285

Tyr

Asp

Ile

Thr

Ala

Lys

Leu

Asp

Gly

Asn

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

290

295

300

Lys

Val

Asn

Pro

Asp

Leu

Ala

Lys

Asn

Leu

Ala

Gly

Asn

Glu

Arg

305

310

315

Phe

Phe

His

Ala

Asp

Ala

Asp

Gln

Arg

Leu

Glu

Gly

Gly

Phe

Phe

325

330

335

Asp

Asn

Gly

Glu

GLu

Leu

Ala

Gly

Arg

Phe

Ile

Ser

Asn

Asp

Asn

340

345

350

Ser

Ala

Pro

Asn

Gln

Asp

Gly

Ala

Gly

160

Arg

Gln

Tyr

Asp

Ser

240

Tyr

Asn

Ile

Ala

Leu

320

Gly

Ser

PL 194 800 B1

Val

Phe

Gly 355

Val

Phe

Ala

Gly

Lys 360

Lys

Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ala 365

Asp

Thr

Lys

Pro

Ala

Leu

Pro

Ser

Gly

Lys

His

Thr

Lys

Ile

Leu

Asp

370

375

380

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Val

Asp

Glu

Ala

Thr

Asp

Gly

His

Ala

Arg

Lys

385

390

395

400

Phe

Ala

Ile

Ser

Ser

Met

Pro

Asp

Phe

Gly

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Leu

405

410

415

Val

Glu

Gly

Arg

Glu

Ile

Pro

Leu

Val·

Asn

Glu

Glu

Gln

Ue

Ue

Lys

420

425

430

Leu

Ala

Asp

Gly

Arg

Lys

Met

Thr

vaL

Arg

ALa

Cys

Cys

Asp

Phe

Leu

435

440

445

Thr

Tyr

Val

Lys

Leu

Gly

Arg

Ile

Lys

Thr

Asp

Arg

Pro

Ala

Ser

Lys

450

455

460

Pro

Lys

Ala

Glu

Asp

Lys

Gly

Glu

Asp

Glu

Glu

Gly

ALa

Gly

Val

Asp

465

470

475

480

Asn

Asp

Glu

Glu

Ser

Glu

Asp

Glu

Ala

VaL

Glu

Asp

Glu

Gly

Gly

Glu

465

490

495

Glu

Asp

Glu

Thr

Ser

Glu

Glu

Asp

Asn

Gly

Glu

Asp

Glu

Glu

Ala

Thr

500

505

510

Ala

Glu

Glu

Glu

Thr

Glu

Glu

Val

Asp

Glu

Ala

Glu

Glu

Glu

Glu

Val

515

520

525

Glu

Glu

Pro

Glu

Glu

Lys

Ser

Pro

Al a

Glu

Gly

Asn

Gly

Gly

Ser

Gly

530

535

540

Ser

Ile

Leu

Pro

Ala

Leu

Glu

Ala

Ser

Lys

Gly

Arg

Asp

Ile

Asp

Leu

545

550

555

560

Phe

Leu

Lys

Gly

Ile

Arg

Thr

Ala

Glu

Thr

Asp

Ile

Pro

Gln

Ser

Gly

565

570

575

Thr

Ala

His

Tyr

Thr

Gly

Thr

Trp

Glu

Ala

Arg

Ile

Gly

Lys

Pro

Ile

580

5B5

590

Gln

Trp

Asp

Asn

Gln

Ala

Asp

Glu

Lys

Ala

Ala

Lys

Ala

Glu

Phe

Thr

595

600

605

Val

Asp

Phe

Asp

Lys

Lys

Ser

Ile

Ser

Gly

Lys

Leu

Thr

Glu

Gln

Asn

610

615

620

Gly

Val

Glu

Pro

Ala

Phe

His

Ile

Glu

Asp

Gly

Lys

Ile

ASp

Gly

Asn

625

630

635

640

Gly

Phe

His

Ala

Thr

Ala

Arg

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Ile

Asn

Leu

Ser

645

650

655

Gly

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Pro

Lys

Thr

Phe

Gln

Ala

Ser

Asn

Leu

Arg

660

665

670

Val

Glu

Gly

Gly

Phe

Tyr

Gly

Pro

Gln

ALa

ALa

Glu

Leu

Gly

Gly

Thr

675

680

685

PL 194 800 Β1

Ile

Phe 690

Asn

Asn Asp

Gly

Lys 695

Ser

Leu

Ser

Ile

Thr 700

Glu

Asn

Ile

Glu

Asn

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

Val

Glu

Val

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

Val

Glu

705

710

715

720

Val

Glu

Ala

Asp

val

Gly

Lys

Gin

Leu

Glu

Pro

Asp

Glu

Val

Lys

His

725

730

735

Lys

Phe

Gly

Val

Val

Phe

Gly

Ala

Lys

Lys

Asp

Met

Gin

Glu

Val

Glu

740

745

750

Lys (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2124 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(B) SZCZEP: Neisseria meningitidis szczep 881607 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 1...2121 (C) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:9:

ATG Met 1

TGT Cys

AAA Lys

CCG Pro

AAT Asn 5

TAT Tyr

GGC Gly

GGC Gly

ATT Ile

GTC Val 10

TTG Leu

TTG Leu

CCC Pro

TTA CTT

TTG Leu

48

Leu

Leu 15

GCA

TCT

TGC

ATC

GGC

GGC

AAT

TTC

GGC

GTG

CAG

CCT

GTT

GTC

GAA

TCA

96

Ala

Ser

Cys

Ile

Gly

Gly

Asn

Phe

Gly

Val

Gin

Pro

Val

Val

Glu

Ser

20

25

30

ACG

CCG

ACC

GCG

TAC

CCC

GTC

ACT

TTC

AAG

TCT

AAG

GAC

GTT

CCC

ACT

144

Thr

Pro

Thr

Ala

Tyr

Pro

Val

Thr

Phe

Lys

Ser

Lys

Asp

Val

Pro

Thr

35

40

45

PL 194 800 Β1

TCG Ser

CCT Pro 50

CCT Pro

GCC Ala

GGG Gly

TCT Ser

TCG Ser 55

GTA GAA

ACC Thr

ACG Thr

CCG Pro 60

GTC val

AAC Asn

CGA Arg

CCC Pro

192

val

Glu

GCC

GTT

GGT

GCG

GCA

ATG

CGG

CTG

TTG

AGA

CGG

AAT

ATT

GCA

ACT

TCT

240

Ala

Val

Gly

Ala

Ala

Met

Arg

Leu

Leu

Arg

Arg

Asn

Ile

Ala

Thr

Ser

65

70

75

80

GAT

AAG

GAT

GGC

AAT

GAT

TTT

CCA

AAT

AGC

AAA

CAA

GCA

GAA

GAA

AAG

288

Asp

Lys

Asp

Gly

Asn

Asp

Phe

Pro

Asn

Ser

Lys

Gin

Ala

Glu

Glu

Lys

85

90

95

CTG

TCG

TTT

AAA

GAG

GAA

GAT

ATC

CTG

TTT

TTA

TAC

GGT

TCC

AAA

AAA

336

Leu

Ser

Phe

Lys

Glu

Glu

Asp

Ile

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

Ser

Lys

Lys

100

105

110

GAT

CAA

CGT

CAG

CAG

CTT

AAA

GAT

AAA

ATT

CGT

CAA

CCA

AAT

CCT

ACG

384

Asp

Gin

Arg

Gin

Gin

Leu

Lys

Asp

Lys

Ile

Arg

Gin

Pro

Asn

Pro

Thr

115

120

125

GCA

AGC

ATT

ACC

ACA

TCG

GAA

AAG

AAA

AAT

AAA

AAA

TAT

GAT

TAT

AAA

432

Ala

Ser

Ile

Thr

Thr

Ser

Glu

Lys·

Lys

Asn

Lys

Lys

Tyr

Asp

Tyr

Lys

130

135

140

rprpiFyi

GTA

GAT

GCA

GGT

TAT

GTA

TAT

ACT

AAA

GAC

GGA

AAA

GAT

GAA

ATT

480

Phe

Val

ASp

Ala

Gly

Tyr

Val

Tyr

Thr

Lvs

Asp

Gly

Lys

Asp

Glu

Ile

145

150

155

160

GAG

TGG

ACT

TCA

AAT

TAC

AAG

CAG

TCT

ACC

AAC

CGG

TTT

GGT

TAT

GAC

528

Glu

Trp

Thr

Ser

Asn

Tyr

Lys

Gin

Ser

Thr

Asn

Arg

Phe

Gly

Tyr

Asp

165

170

175

GGT

TTT

GTA

TAT

TAT

TCC

Gja

GAA

CAT

CCT

TCG

CAA

TCT

TTA

CCG

AGC

576

Gly

Phe

Val

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Glu

His

Pro

Ser

Gin

Ser

Leu

Pro

Ser

180

185

190

GCG

GGA

ACG

GTG

AAA

TAT

TCC

GGC

AAC

TGG

CAA

TAT

ATG

ACC

GAT

GCC

624

Ala

Gly

Thr

Val

Lys

Tyr

Ser

Gly

Asn

Trp

Gin

Tyr

Met

Thr

Asp

Ala

195

200

205

PL 194 800 Β1

TCT Ser 545

AAA GGC

AGG Arg

GAC ATC

GAC Asp

CTT Leu

TTC Phe

CTG AAA GGT

ATC Ile

CGC Arg

ACG Thr

GCG Ala 560

1680

Lys

Gly

Asp

Ile 550

Leu

Lys 555

Gly

GAA

GCC

GAC

ATT

CCA

AAA

AAC

GGA

ACG

GCG

CAT

TAT

ACC

GGC

ACT

TGG

1728

Glu

Ala

Asp

Ile

Pro 565

Lys

Asn

Gly

Thr

Ala 570

His

Tyr

Thr

Gly

Thr 575

Trp

GAA

GCG

CGT

ATC

GGC

GTA

TCG

GAT

AGT

GGT

ACG

TCC

ATT

CAA

AAG

GAT

1776

Glu

Ala

Arg

Ile 5B0

Gly

Val

Ser

Asp

Ser 585

Gly

Thr

Ser

Ile

Gin 590

Lys

Asp

AGC

TAT

GCG

AAT

CAA

GGG

GCA

AAA

GCA

GAA

TTT

ACC

GTT

GAT

TTC

GAA

1824

Ser

Tyr

Ala 595

Asn

Gin

Gly

Ala

Lys 600

Ala

Glu

Phe

Thr

val 605

Asp

Phe

Glu

GCG

AAG

ACG

GTG

TCC

GGA

ATG

CTG

ACA

GAA

AAA

AAT

GAT

ACA

ACC

CCC

1872

Ala

Lys 610

Thr

Val

Ser

Gly

Met 615

Leu

Thr

Glu

Lys

Asn 620

Asp

Thr

Thr

Pro

GCT

TTT

TAT

ATT

GAA

AAA

GGT

GTG

ATT

GAC

GGT

AAC

GGT

TTC

CAC

GCT

1920

Ala 625

Phe

Tyr

Ile

Glu

Lys 630

Gly

Val

Ile

Asp

Gly 635

Asn

Gly

Phe

His

Ala 640

TTG

GCG

CAT

ACT

CGG

GAG

AAC

GGT

ATT

GAC

CTT

TCT

GGG

CAG

GGT

TCG

1968

Leu

Ala

His

Thr

Arg 645

Glu

Asn

Gly

Ile

Asp 650

Leu

Ser

Gly

Gin

Gly 655

Ser

ACT

AAC

CCG

AAG

AAC

TTC

AAA

GCC

GAC

AAT

CTT

CTT

GTA

ACA

GGC

GGC

2016

Thr

Asn

Pro

Lys 660

Asn

Phe

Lys

Ala

Asp 665

Asn

Leu

Leu

Val

Thr 670

Gly

Gly

TTT

TAT

GGC

CCG

CAG

GCG

GCA

GAA

TTG

GGC

GGT

AAT

ATT

ATC

GAC

AGC

2064

Phe

Tyr

Gly 675

Pro

Gin

Ala

Ala

Glu 680

Leu

Gly

Gly

Asn

Ile 685

Ile

Asp

Ser

GAC

CGG

AAA

TTC

GGT

GCG

GTA

TTT

GGG

GCG

AAA

AAA

GAT

GAC

AAG

GAG

2112

Asp

Arg 690

Lys

Phe

Gly

Ala

Val 695

Phe

Gly

Ala

Lys

Lys 700

Asp

Asp

Lys

Glu

GCA ACA CGA TGA 2124

Ala Thr Arg

705

PL 194 800 B1

ATT Ile 385

TCC Ser

GTT Val

GAC Asp

GAG Glu

GCA AGT GGT GAA

AAT Asn

CCC Pro 395

CGA Arg

CCG Pro

TTT Phe

GAG Glu

GTT Val 400

1200

Ala 390

Ser

Gly

Glu

TCC

ACT

ATG

CCC

GAT

TTT

GGT

CAT

CCC

GAC

AAA

CTT

CTT

GTC

GAA

GGG

1248

Ser

Thr

Met

Pro

Asp 405

Phe

Gly

His

Pro

Asp 410

Lys

Leu

Leu

Val

Glu 415

Gly

CGT

GAA

ATT

CCT

TTG

GTA

AAC

AAA

GAA

CAA

ACC

ATC

GAT

CTT

GCC

GAC

1296

Arg

Glu

Ile

Pro 420

Leu

Val

Asn

Lys

Glu 425

Gin

Thr

Ile

Asp

Leu 430

Ala

Asp

GGC

AGG

AAA

ATG

ACC

GTC

CGT

GCT

TGT

TGC

GAC

TTT

TTG

ACC

TAT

GTG

1344

Gly

Arg

Lys 435

Met

Thr

Val

Arg

Ala 440

Cys

Cys

Asp

Phe

Leu 445

Thr

Tyr

Val

AAA

CTC

GGA

CGG

ATA

AAA

ACC

GAA

CGC

CCC

GCC

GTC

CAA

CCG

AAG

GCG

1392

Lys

Leu 450

Gly

Arg

Ile

Lys

Thr 455

Glu

Arg

Pro

Ala

Val 460

Gin

Pro

Lys

Ala

CAG

GAT

GAA

GAG

GGG

GAC

GAA

GAG

GGT

GTA

GGC

GTT

GAT

AAC

GGT

AAA

1440

Gin 455

Asp

Glu

Glu

Gly

Asp 470

Glu

Glu

Gly

Val

Gly 475

Val

Asp

Asn

Gly

Lys 4B0

GAA

AGC

GAA

GAC

GAA

ATC

GGC

GAT

GAA

GAA

AGC

ACC

GGA

GAC

GAA

GTC

1488

Glu

Ser

Glu

Asp

Glu 485

Ile

Gly

Asp

Glu

Glu 490

Ser

Thr

Gly

Asp

Glu 495

Val

GTA

GAA

GAT

GAA

GAC

GAA

GAT

GAA

GAC

GAA

GAA

GAA

ATC

GAA

GAA

GAA

1536

Val

Glu

Asp

Glu 500

Asp

Glu

ASp

Glu

Asp 505

Glu

Glu

Glu

Ile

Glu 510

Glu

Glu

CCT

GAA

GAA

GAA

GCT

GAA

GAG

GAA

GAA

CCC

GAA

GAA

GAA

TTG

CCG

GCA

1584

Pro

Glu

Glu 515

Glu

Ala

Glu

Glu

Glu 520

Glu

Pro

Glu

Glu

Glu 525

Leu

Pro

Ala

GAA

GAA

GGC

AAC

GGC

GGT

TCA

GGC

AGC

ATC

CTG

CCC

ACT

CCG

GAA

GCC

1632

Glu

Glu

Gly

Asn

Gly

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

Leu

Pro

Thr

Pro

Glu

Ala

530 535

540

PL 194 800 B1

ΑΤΑ Ile

CGT Arg 210

CAT His

CGA ACA

GGA Gly

AAA GCA Lys Ala 215

GGA GAT Gly Asp

CCT Pro

AGC GAA GAT TTG GGT

672

Arg

Thr

Ser 220

Glu

Asp

Leu

Gly

ΤΑΤ

ATC

GTT

TAT

TAC

GGT

CAA

AAT

GTC

GGA

GCA

ACT

TCT

TAT

GCT

GCG

720

Tyr

Ile

Val

Tyr

Tyr

Gly

Gin

Asn

Val

Gly

Ala

Thr

Ser

Tyr

Ala

Ala

225

230

235

240

ACT

GCC

GAC

GAC

CGG

GAG

GGA

AAA

CAT

CCT

GCC

GAA

TAT

ACG

GTT

AAT

768

Thr

Ala

Asp

Asp

Arg

Glu

Gly

Lys

His

Pro

Ala

Glu

Tyr

Thr

Val

Asn

245

250

255

.TC

GAC

CAA

AAA

ACT

CTG

AAT

GGC

AAG

CTG

ATT

AAA

AAT

CAG

TAT

GTG

816

Phe

Asp

Gin

Lys

Thr

Lau

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Lys

Asn

Gin

Tyr

Val

260

265

270

CAA

AAG

AGA

GAT

GAT

CCT

AAA

AAA

CCA

CTG

ACC

ATT

TAC

GAC

ATT

ACT

r 864

Gin

Lys

Arg

Asp

Asp

Pro

Lys

Lys

Pro

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asp

Ile

Thr

275

280

285

GCA

AAA

TTG

GAC

GGC

AAC

CGC

TTT

ACC

GGC

AGT

GCC

AAA

GTT

AAC

ACA

912

Ala

Lys

Leu

Asp

Gly

Asn

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Ala

Lys

val

Asn

Thr

290

295

300

GAG

GTG

AAG

ACG

AAT

CAC

GCT

GAT

AAA

GAA

TAT

TTG

TTT

TTC

CAT

ACC

960

Glu

Val

Lys

Thr

Asn

His

Ala

Asp

Lys

Glu

Tyr

Leu

Phe

Phe

His

Thr

305

310

315

320

GAT

GCC

GAT

CAG

CGG

CTT

GmG

GGC

GGT

TTT

ΓΤ~

GGC

GAT

AAG

GGG

GAA

100B

Aso

Ala

ASp

Gin

Arg

Leu

Glu

Gly

Gly

Phe

Phe

Gly

Asp

Lys

Gly

Glu

325

330

335

GAG

CTT

GCC

GGA

CGG

TTT

ATC

AGC

AAC

GAC

AAC

AGC

GTA

TTC

GGC

GTG

1056

Glu

Leu

Ala

Gly

Arg

Phe

Ile

Ser

Asn

Asp

Asn

Ser

Val

Phe

Gly

Val

340

345

350

TTC

GCA

GGC

AAA

CAA

AAA

ACA

GAG

ACA

GCA

AAC

GCA

TCA

GAT

ACA

AAT

1104

Phe

Ala

Gly

Lys

Gin

Lys

Thr

Glu

Thr

Ala

Asn

Ala

Ser

Asp

Thr

Asn

355

360

365

CCT

GCC

CTG

CCG

TCT

GGA

AAA

CAC

ACC

AAA

ATC

TTG

GAT

TCT

CTA

AAA

1152

Pro

Ala

Leu

Pro

Ser

Gly

Lys

His

Thr

Lys

Ile

Leu

Asp

Ser

Leu

Lys

370

375

380

PL 194 800 B1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 707 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko l (iii) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Neisseria meningitidis szczep 881607 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:10:

Mer 1

Cys

Lys

Prc

Asn 5

Tyr

Gly

Gly

Ile

Val 10

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu 15

Leu

Ala

Ser

Cys

Ile

Gly

Gly

Asn

Phe

Gly

Val

Gln

Pro

Val

Val

Glu

Ser

20

25

30

Thr

Pro

Thr

Ala

Tyr

Pro

Val

Thr

Phe

Lys

Ser

Lys

Asp

Val

Pro

Thr

35

40

45

Ser

Pro

Pro

Ala

Gly

Ser

Ser

Val

Glu

Thr

Thr

Pro

Val

Asn

Arg

Pro

50

55

60

Ala

Val

Gly

Ala

Ala

Met

Arg

Leu

Leu

Arg

Arg

Asn

Ile

Ala

Thr

Ser

6 5

70

75

80

Asp

Lys

Asp

Gly

Asn

Asp

Phe

Pro

Asn

Ser

Lys

Gln

Al a

Glu

Glu

Lys

85

90

95

Leu

Ser

Phe

Lys

Glu

Glu

Asp

Ile

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

Ser

Lys

Lys

100

105

110

Asp

Gln

Arg

Gln

Gln

Leu

Lys

Asp

Lys

Ile

Arg

Gln

Pro

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Ala

Ser

He

Thr

Thr

Ser

Glu

Lys

Lys

Asn

Lys

Lys

Tyr

Asp

Tyr

Lys

130

135

140

Phe

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Val

Tyr

Thr

Lys

Asp

Gly

Lys

Asp

Glu

Ile

145

150

155

160

Glu

Trp

Thr

Ser

Asn

Tyr

Lys

Gln

Ser

Thr

Asn

Arg

Phe

Gly

Tyr

Asp

165

170

175

Gly

Phe

Val

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Glu

His

Pro

Ser

Gln

Ser

Leu

Pro

Ser

180

185

190

Ala

Gly

Thr

Val

Lys

Tyr

Ser

Gly

Asn

Trp

Gln

Tyr

Met

Thr

Asp

Ala

195 200

205

PL 194 800 Β1

Ile

Arg 210

His Arg Thr

Gly

Lys Ala 215

Gly

Asp

Pro

Ser 220

Glu

Asp

Leu

Gly

Tyr

Ile

Val

Tyr

Tyr

Gly

Gin

Asn

Vai

Gly

Ala

Thr

Ser

Tyr

Ala

Ala

225

230

235

240

Thr

Ala

Asp

Asp

Arg

Glu

Gly

Lys

His

Pro

Ala

Glu

Tyr

Thr

Val

Asn

245

250

255

Phe

Asp

Gin

Lys

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Lys

Asn

Gin

Tyr

Val

250

265

270

Gin

Lys

Arg

Asp

Asp

Pro

Lys

Lys

Pro

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asp

Ile

Thr

275

2B0

285

Ala

Lys

Leu

Asp

Gly

Asn

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser

Ala

Lys

Val

Asn

Thr

290

295

300

Glu

Val

Lys

Thr

Asn

His

Ala

Asp

Lys

Glu

Tyr

Leu

Phe

Phe

His

Thr

305

310

315

320

Asp

Ala

Asp

Gin

Arg

Leu

Glu

Gly

Gly

Phe

Phe

Gly

Asp

Lys

Gly

Glu

325

330

335

Glu

Leu

Ala

Gly

Arg

Phe

Ile

Ser

Asn

Asp

Asn

Ser

Val

Phe

Gly

Val

340

345

350

Pha

Ala

Gly

Lys

Gin

Lys

Thr

Glu

Thr

Ala

Asn

Ala

Ser

Asp

Thr

Asn

355

360

365

Pro

Ala

Leu

Pro

Ser

Gly

Lys

His

Thr

Lys

Ile

Leu

Asp

Ser

Leu

Lys

370

375

380

Ile

Ser

Val

Asp

Glu

Ala

Ser

Gly

Glu

Asn

Pro

Arg

Pro

Phe

Glu

Val

385

390

395

400

Ser

Thr

Met

Pro

Asp

Phe

Gly

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Leu

Val

Glu

Gly

405

410

415

Arg

Glu

Ile

Pro

Leu

Val

Asn

Lys

Glu

Gin

Thr

Ile

Asp

Leu

Ala

Asp

420

425

430

Gly

Arg

Lys

Met

Thr

Val

Arg

Ala

Cys

Cys

Asp

Phe

Leu

Thr

Tyr

Val

435

440

445

Lys

Leu

Gly

Arg

Ile

Lys

Thr

Glu

Arg

Pro

Ala

Val

Gin

Pro

Lys

Ala

450

455

460

Gin

Asp

Glu

Glu

Gly

Asp

Glu

Glu

Gly

val

Gly

Val

Asp

Asn

Gly

Lys

465

470

475

480

Glu

Ser

Glu

ASp

Glu

Ile

Gly

Asp

Glu

Glu

Ser

Thr

Gly

Asp

Glu

Val

495

490

495

Vai

Glu

Asp

Glu

Asp

Glu

Asp

Glu

Asp

Glu

Glu

Glu

Ile

Glu

Glu

Glu

500

505

510

Pro

Glu

Glu

Glu

Ala

Glu

Glu

Glu

Glu

Pro

Glu

Glu

Glu

Leu

Pro

Ala

515

520

525

Glu

Glu

Gly

Asn

Gly

Gly

Ser

Gly

Ser

Ile

Leu

Pro

Thr

Pro

Glu

Ala

530 535 540

PL 194 800 B1

Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala

54S 550 555 560

Glu Ala Asp Ile Pro Lys Asn Gly Thr Ala His Tyr Thr Gly Thr Trp

565 570 575

Glu Ala Arg Ile Gly Val Ser Asp Ser Gly Thr Ser Ile Gin Lys Asp

580 565 590

Ser Tyr Ala Asn Gin Gly Ala Lys Ala Glu Phe Thr Val Asp ^phe Glu

595 600 605

Ala Lys Thr Val Ser Gly Met Leu Thr Glu Lys Asn Asp Thr Thr Pro

610 615 620

Ala Phe Tyr Ile Glu Lys Gly Val Ile Asp Gly Asn Gly Phe His Ala

625 630 635 640

Leu Ala His Thr Arg Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gly Gin Gly ^Ser

645 650 655

Thr Asn Pro Lys Asn Phe Lys Ala Asp Asn Leu Leu Val Thr Gly Gly

660 665 670

Phe Tyr Gly Pro Gin Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ser

675 660 685

Asp Arg Lys Phe Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asp Lys Glu

690 695 700

Claims (34)

1. Izolowany polinukleotyd kodujący białko LbpB Neisseria meningitidis, który jest polinukleotydem o Id. Sekw. yr. 1 (od yukieotydu 100 do yukieotydu 2274), Id. Sekw. yr 3, Id. Sekw. yr 5, Id. Sekw. yr 7 aibo Id. Sekw. yr 9.

2. IzolowałypolinuUleetyy, obermującyseeweegjęnuUleetyyową, która j eet przynajmnise w 65% ideytyczya z sekweycją o Id. Sekw. yr 1 od yukieotydu 100 do yukieotydu 2274 ya całej jej długości iub obejmujący sekweycję yukieotydową, która koduje ooiioeotyd orzyyajmyiej w 55% ideytyczyy z sekweycją o Id. Sekw. yr 2 ya całej jej długości.

3. Izolowang polinukleetyy weeług zast^. 2, znamienny tym, że obermuje kekwaegje nukleotydową, która koduje sekweycję amiyokwasową z Id. Sekw. yr 2 od amiyokwasu w oozycji 19 do końca C ooiioeotydu.

4. Izolowasg polinukleotyy obbrmujący kekweegje nukleetyyową, ΚΙογζ j jes p^ynajm^^ w 65% ideytyczya z sekweycją o Id. Sekw. yr 3 ya całej jej długości iub obejmujący sekweycję yukieotydową, która koduje ooiioeotyd orzyyajmyiej w 55% ideytyczyy z sekweycją o Id. Sekw. yr 4 ya całej jej długości.

5. Izolowasg polinuUleotyy zaste. 4, znamienny tym, że obermuje sekwangje nuklidtyldwą, która koduje sekweycję amiyokwasową z Id. Sekw. yr 4 od amiyokwasu w oozycji 19 do końca C ooiioeotydu.

5. Izotówasg poiinukleetyy obermującc kekwencjj nukleotydową, która j ees p^ynajm^^ w 65% ideytyczya z sekweycją o Id. Sekw. yr 5 ya całej jej długości iub obejmujący sekweycję yukieotydową, która koduje ooiioeotyd orzyyajmyiej w 55% ideytyczyy z sekweycją o Id. Sekw. yr 5 ya całej jej długości.

7. Izolowang polinukleetyy weełuuj z^^st^. 6, znamienny tym, że obermuje kekwenccj nukleotydową, która koduje sekweycję amiyokwasową z Id. Sekw. yr 5 od amiyokwasu w oozycji 19 do końca C ooiioeotydu.

PL 194 800 B1

8. Izolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 7 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 8 na całej jej długości.

9. Izolowany pollnukleotyd według zastrz. 8, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową z Id. Sekw. nr 8 od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu.

10. Izolowany poiinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową. która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 10 na całej jej długości.

11. Izolowa ny ροΗηυΜοο1:γό według zastrz. 10, znamienny tym, że obejmie sekwenecę nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową z Id. Sekw. nr 10 od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu.

12. Izolowany pollnukkeotyd obejmujący fragment izdowanego pollnukleotydu k^du^^^c^^ białko LbpB Neisseria meningitidis, będącego polinukleotydem o Id. Sekw. nr. 1 (od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274), Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 5, Id. Sekw. nr 7 albo Id. Sekw. nr 9, przy czym fragment ten koduje sekwencję aminokwasową o aktywności antygenowej LbpB N. meningitidis.

13. Izolowany ρ^Ν(^ι^Ι^Ι^(^^;^(1 według zastrz. 12, znamienny tym, że obejmie sekwenecę nukleotydową, która koduje odpowiednio sekwencję aminokwasową z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10, od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu.

14. Polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, oraz rekombinacyjny układ ekspresyjny, przy czym polinukleotyd jest zdolny do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB w zgodnej komórce gospodarza.

15. Komórka gospodarza obejmuiąca ρ<^ΙΙι^ι^Ι^Ι^<^0|^<^ sekwencjęnukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub zawierający sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, oraz rekombinacyjny układ ekspresyjny, przy czym polinukleotyd jest zdolny do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB.

16. Sposób wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB, znamienny tym, że obejmuje hodowane komórki gospodarza obejmującej polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub zawierający sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, oraz rekombinacyjny układ ekspresyjny, przy czym polinukleotyd jest zdolny do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB w warunkach odpowiednich do wytwarzania polipeptydu i odzyskiwanie polipeptydu z hodowli.

17. Sposób wytwarzania komórki wytwarzającej rekombinowany polipeptyd LbpB, znamienny tym, że obejmuje transformowanie albo transfekowanie komórki gospodarza rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, tak, że komórka gospodarza w odpowiednich warunkach hodowli jest zdolna do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB.

18. Sposób wytwarzania pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego rekombinowany polipeptyd LbpB, znamienny tym, że obejmuje transformowanie albo transfekowanie komórki gospodarza rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, tak, że komórka gospodarza w odpowiednich warunkach hodowli jest zdolna do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB.

19. Niellpidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meninghtdis obejmujący sekwencćę aminokwasową przynajmniej w 65% identyczną z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości.

20. Rekombinowany polipeptyd LbpB z Neisseria ΓΌθηίηςίίίόίε. dodatkową sekwencję aminokwasową, która ułatwia oczyszczanie polipeptydu, przy czym polipeptyd obejmuje sekwencję

PL 194 800 B1 aminokwasową przynajmniej w 65% identyczną z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości.

21. Polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis będący polipeptydem z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10.

22. Pollpeptyd LbpB z Neisseria meningitidis obejmujący sekwencję aminokwasową odpowiednio z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu oraz jego białka fuzyjne.

23. Fragmeni pollpeppydu LbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2,

4, 6, 8 lub 10 zachowujący aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu, że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, oraz jego białko fuzyjne.

24. Izo Iowa ny pollnukleotyd sekwoi^ę nukleotydową kodLuącą ffagment pollpeptydu LbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 zachowujący aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, lub jego białko fuzyjne.

25. Przeciwciatoswoiste Immunologiczniewobec pollpeptydu LbpB z N. meningitfdis o sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 65% identycznej z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości.

26. Sposób Iden-yfikacji związków, które hamiuą pollpeptyd LbpB z Ν. πί^ΓΉΓΚ^ίίίόί;; o sekwen^j aminokwasowej przynajmniej w 65% identycznej z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, znamienny tym, że obejmuje:

(a) doprowadzenie do kontaktu związku kandydującego z komórkami, które wyrażają polipeptyd LbpB; i (b) obserwowanie wiązania, albo zahamowania odpowiedzi funkcjonalnej; albo porównywanie pod kątem aktywności wobec polipeptydu LbpB zdolności komórek, które doprowadzono do kontaktu ze związkiem kandydującym z takimi samymi komórkami, które nie były kontaktowane.

27. Szczepionka, znamiennatym, że ohoen^e skuuecznąliośćpoHpeptyduLbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 65% identycznej z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4_r 6, 8 lub 10 na całej jej długości oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

28. Szczepionka według 27, znamienna tym, że kompozycCa obejmuje co najmniej jeden antygen N. meningitidis.

29. Szczepionka, znamienna tym, że obejmuje skuteczną ilość fragmentu pohpeptydu LbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10, przy czym fragment zachowuje aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, lub jego białko fuzyjne, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

30. Szczepionka według zas^z. 29, znamienna tym, że kompozycCa obejmuje co najmniej jeden antygen N. meningitidis.

31. Szczepionka, znamienna tym, że obejmie skuueczną iiość pollnukleotydu zawierającego sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1, 3,

5, 7 lub 9 na całej jej długości lub zawierającego sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

32. Zastosowanie kompozygi obejmującej skuteczną ilość niellpidowanego LbpB z Neisseria meningitidis o sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 65% identycznej z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości do wytwarzania leku do leczenia lub hamowania choroby wywoływanej u ludzi przez Neisseria.

33. Zastosowanie według zas^z. 32, tym, że lek jess przeznaczony do podawania doustnie, podskórnie, doodbytniczo, dotchawiczo, domięśniowo albo donosowo.

34. Zastosowanie kompozycji obejmującej skuteczną ilość polinukleotydu obejmującego sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub obejmującego sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości do wytwarzania leku do leczenia lub hamowania choroby wywoływanej u ludzi przez Neisseria.

35. Zastosowanie według zas^z. 34, tym, że lek jess przeznaczony do podawania podskórnie, dotchawiczo, domięśniowo albo donosowo.