PL197449B1 - Wyizolowane polipeptydy, immunogenne fragmenty tych polipeptydów, wyizolowane polinukleotydy, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza zawierająca taki wektor, sposób wytwarzania polipeptydu, sposób ekspresji polinukleotydu, kompozycja szczepionki, przeciwciało immunospecyficzne w stosunku do polipeptydu lub jego immunogennego fragmentu, sposób diagnozowania zakażenia Neisseria meningitidis, zastosowania kompozycji zawierającej polipeptyd lub jego immunogenny fragment, lub polinukleotyd i kompozycja terapeutyczna do leczenia choroby wywołanej przez Neisseria meningitidis - Google Patents

Abstract

1. Wyizolowany polipeptyd zawieraj acy sekwencj e aminokwasow a, która ma przynajmniej 85% identyczno sci z sekwencj a aminokwasow a wybran a z grupy z lo zonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4 na ca lej d lugo sci tych sekwencji, odpowiednio. 16. Sposób wytwarzania polipeptydu zawieraj acego sekwencj e aminokwasow a, która ma przy- najmniej 85% identyczno sci z sekwencj a aminokwasow a wybran a z grupy z lo zonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4, znamienny tym, ze obejmuje hodowanie komórki gospodarza okre slonej w zastrz. 15 w warunkach wystarczaj acych do wytwarzania polipeptydu i odzyskanie polipeptydu z pod lo za hodow- lanego. 17. Sposób ekspresji polinukleotydu okre slonego w zastrz. 7-14, znamienny tym, ze obejmuje transformacj e komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym zawieraj acym przynajmniej jeden z wy- mienionych polinukleotydów i hodowl e tej komórki gospodarza w warunkach wystarczaj acych dla eks- presji wymienionych polinukleotydów. 18. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, ze zawiera skuteczna ilosc polipeptydu okre slo- nego w zastrz. 1-4 lub jego immunogenny fragment okre slony w zastrz. 5-6 i farmaceutycznie do- puszczalny no snik. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są wyizolowane polipeptydy, immunogenne fragmenty tych polipeptydów, wyizolowane polinukleotydy, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza zawierająca taki wektor, sposób wytwarzania polipeptydu, sposób ekspresji polinukleotydu, kompozycja szczepionki, przeciwciało immunospecyficzne w stosunku do polipeptydu lub jego immunogennego fragmentu, sposób diagnozowania zakażenia Neisseria meningitidis, zastosowania kompozycji zawierającej polipeptyd lub jego immunogenny fragment, lub polinukleotyd i kompozycja terapeutyczna do leczenia choroby wywołanej przez Neisseria meningitidis.

Niniejszy wynalazek dotyczy polinukleotydów (określanych tu jako „polinukleotyd(y) BASB029), kodowanych przez nie polipeptydów (określanych tu jako „BASB029 lub „polipeptyd(y) BASB029), szczepionek przeciw zakażeniom bakteriami oraz oznaczenia diagnostycznego do wykrywania infekcji przez pewne patogeny.

Neisseria meningitidis (meningokok) jest Gram-ujemną bakterią często izolowaną z górnych dróg oddechowych człowieka. Czasem powoduje inwazyjne choroby bakteryjne, takie jak bakteriemia i zapalenie opon mózgowych. Cz ę stość wystę powania zapalenia opon mózgowych jest róż na w róż nych obszarach geograficznych, porach roku i latach (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2. (Suplement), S18-S24, 1989). Większość chorób w krajach o klimacie umiarkowanym powodowana jest przez szczepy serogrupy B i zmienia się pod względem częstości występowania od 1-10/100000/rok na całą populację, czasem osiągając wyższe wartości (Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. i wsp. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E. i wsp. Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990).

Epidemie zdominowane przez meningokoki serogrupy A napotyka się głównie w Afryce środkowej, czasem osiągają one poziomy do 1000/100000/rok (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V. Clin. Microbiol. Rev 2 (Suplement), S18-S24, 1989). Prawie wszystkie przypadki chorób meningokokowych jako całości wywołane są przez meningokoki serogrup A, B, C, W-135 i Yi dostępna jest tetrawalentna szczepionka polisacharydowa A,C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10:335-339, 1982).

Obecnie ulepsza się szczepionki polisacharydowe poprzez ich chemiczne sprzęganie z białkami nośnikowymi (Lieberman, J.M., Chiu, S.S., Wong, V.K., i wsp. JAMA 275: 1499-1503, 1996).

Szczepionka dla serogrupy B nie jest dostępna, ponieważ polisacharyd otoczki B okazał się nieimmunogenny, najprawdopodobniej z powodu podobieństwa strukturalnego do składników gospodarza (Wyle, F.A., Artenstein, M.S., Brandt, M.L. i wsp. J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972: Finne, J.M., Leinonen, M., Makela, P.M. Lancet ii: 355-357, 1983).

Wiele lat temu rozpoczęto i prowadzono próby opracowania szczepionek opartych na błonie zewnętrznej meningokoków (de Moraes, J.C., Perkins, B., Camargo, M.C. i wsp. Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E.A., Gronnesby, J.K. i wsp. 338: 1093-1096, 1991). Takie szczepionki wykazały skuteczność od 57% do 85% u dzieci starszych (> 4 lat) i nastolatków.

W tych szczepionkach obecne są liczne składniki błony zewnętrznej bakterii, takie jak PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB, a wkład tych składników do obserwowanej ochrony nadal wymaga określenia. Stosując przeciwciała zwierzęce lub ludzkie określono inne składniki bakteryjnej błony zewnętrznej jako potencjalnie istotne dla indukcji ochronnej odporności, takie jak TbpB i NspA (Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B.R., J. Exp. Med. 185: 1173-1183, 1997; Lissolo, L., MaitreWilmotte, C., Dumas, P. i wsp., Inf. Immun. 63: 884-890, 1995). Mechanizmy odporności ochronnej będą obejmowały aktywność bakteriobójczą za pośrednictwem przeciwciał i opsonofagocytozę.

W celu połączenia wszystkich mechanizmów z udziałem przeciwciał stosowano zwierzęcy model bakteriemii (Saukkonen, K., Leinonen, M., Abdilahi, H., Poolman, J.T., Vaccine 7: 325-328, 1989). Ogólnie przyjmuje się, że późny mechanizm bakteriobójczy z udziałem dopełniacza jest krytyczny dla odporności na chorobę meningokokową (Ross, S.C., Rosenthal P.J., Berberic, H.M., Densen, P.J. Infect. Dis. 155: 1266-1275, 1987).

Częstość zakażeń Neisseria meningitidis wzrosła dramatycznie w ciągu kilku ostatnich dziesięcioleci. Przypisywano to pojawieniu się szczepów opornych na wiele antybiotyków i zwiększającej się populacji ludzi z osłabionym układem odpornościowym. Nie jest już nietypowe izolowanie szczepów

Neisseria meningitidis, które są oporne na część lub wszystkie standardowe antybiotyki. To zjawisko powoduje istnienie niezaspokojonej potrzeby medycznej i zapotrzebowania na nowe środki przeciw

PL 197 449 B1 mikroorganizmom, szczepionki, metody badań przesiewowych leków i testy diagnostyczne dla tego organizmu.

Niniejszy wynalazek dotyczy BASB029, w szczególności polipeptydów BASB029 i polinukleotydów BASB029, jak opisano bardziej szczegółowo poniżej. W szczególności wynalazek dotyczy polipeptydów i polinukleotydów BASB029 Neisseria meningitidis, które pod względem sekwencji aminokwasowej mają homologię z białkiem powierzchniowym fibryl Haemophilus influenzae (HSF). Wynalazek dotyczy BASB029 mającego sekwencję nukleotydową i aminokwasową podaną w Sek. Id. Nr: 1 lub 3 i Sek. Id. Nr: 2 lub 4, odpowiednio. Należy rozumieć, że sekwencje podane w liście sekwencji poniżej jako „DNA przedstawiają przykład jednego wykonania wynalazku, a dla przeciętnego specjalisty jest oczywiste, że takie sekwencje mogą być przydatne do stosowania ogólnie w polinukleotydach, w tym rybopolinukleotydach.

Polipeptydy

Wyizolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową, która ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4 na całej długości tych sekwencji odpowiednio.

Korzystnie sekwencja aminokwasowa ma przynajmniej 95% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4 na całej długości tych sekwencji odpowiednio.

Korzystnie polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4.

W zakres wynalazku wchodzi ponadto wyizolowany polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. Nr: 4.

Polipeptydy BASB029 o Sek.Id. Nr: 2 lub 4 są polipeptydami BASB029 ze szczepów Neisseria meningitidis ATCC13090 i H44/76.

Wynalazek dotyczy także immunogennego fragmentu polipeptydu według wynalazku, zdolnego do wzbudzenia immunogennej odpowiedzi, która rozpoznaje polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. Nr: 4.

Korzystnie immunogenny fragment jest związany z nośnikiem.

Taki fragment (jeśli trzeba połączony z nośnikiem) jest zdolny do wywołania odpowiedzi odpornościowej, która rozpoznaje polipeptyd BASB029. Taki immunogenny fragment może na przykład obejmować polipeptyd BASB029 pozbawiony N-końcowej sekwencji liderowej i/lub domeny transbłonowej i/lub C-końcowej domeny kotwiczącej. W korzystnym wykonaniu immunogenny fragment BASB029 według wynalazku zawiera zasadniczo całą domenę zewnątrzkomórkową polipeptydu, który ma przynajmniej 85% identyczności, bardziej korzystnie 90% identyczności, jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej 95% identyczności, jeszcze korzystniej 97-99% lub całkowitą identyczność do sekwencji Sek. Id. Nr: 2 lub 4 na całej długości Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. Nr 4.

Fragment jest polipeptydem mającym sekwencję aminokwasową, która jest całkowicie taka sama jak część, ale nie cała, dowolna sekwencja aminokwasowa dowolnego polipeptydu według wynalazku. Jak w przypadku polipeptydów BASB029, fragmenty mogą być „wolne lub zawarte w większym polipeptydzie, którego tworzą część lub region, najbardziej korzystnie jako pojedynczy ciągły region w pojedynczym większym polipeptydzie.

Korzystne fragmenty obejmują na przykład odcięte polipeptydy mające część sekwencji aminokwasowej z Sek. Id. Nr: 2 lub 4 lub jego wariantów, takich jak ciągła seria reszt, która zawiera sekwencję aminokwasowa N- lub C- końcową. Formy degradacji polipeptydów według wynalazku wytwarzane przez lub w komórce gospodarza są też korzystne. Dalej korzystne są fragmenty scharakteryzowane strukturalnymi lub funkcjonalnymi cechami, takimi jak fragmenty, które zawierają alfa helisy i regiony tworzące alfa helisy, harmonijki beta i regiony tworzące harmonijki beta, zwroty i regiony tworzące zwroty, kłębki i regiony i tworzące kłębki, regiony hydrofilowe, regiony hydrofobowe, regiony alfa amfipatyczne, regiony beta amfipatyczne, regiony elastyczne, regiony tworzące powierzchnię, regiony wiążące substrat oraz wysoce antygenowe regiony wskaźnikowe.

Dalsze korzystne fragmenty obejmują izolowany polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 15, 20, 30, 40, 50 lub 100 przylegających aminokwasów z sekwencji aminokwasowej z Sek. Id. Nr: 2 lub 4 lub wyizolowany polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 15, 20, 30, 40, 50 lub 100 przylegających aminokwasów odciętych lub usuniętych z sekwencji aminokwasowej z Sek. Id. Nr: 2 lub 4.

PL 197 449 B1

Fragmenty polipeptydów według wynalazku mogą być stosowane do wytwarzania odpowiednich polipeptydów pełnej długości za pomocą syntezy peptydów, zatem fragmenty te mogą być stosowane jako produkty wyjściowe do wytwarzania peptydów pełnej długości według wynalazku.

Szczególnie korzystne są warianty, w których kilka, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 lub 1 aminokwas są podstawione, usunięte lub dodane w dowolnej kombinacji.

Polipeptydy lub fragmenty immunogenne według wynalazku mogą być w postaci „dojrzałego białka lub mogą być częścią większego białka, takiego jak białko prekursorowe lub białko fuzyjne. Często korzystne jest włączenie dodatkowej sekwencji aminokwasowej, która zawiera sekwencje wydzielnicze lub liderowe, prosekwencje, sekwencje, które pomagają w oczyszczaniu, takie jak wielokrotne reszty histydynowe, lub dodatkową sekwencję dla stabilności w czasie produkcji rekombinanta. Ponadto w celu zwiększenia potencjału immunogennego ostatecznej cząsteczki rozważa się dodatek egzogennego polipeptydu lub ogona lipidowego lub sekwencji polinukleotydowej.

Polipeptyd według niniejszego wynalazku, lub jego fragment, może tworzyć rozpuszczalne białka fuzyjne uzyskane technikami inżynierii genetycznej, które ponadto zawierają różne części stałych regionów ciężkich lub lekkich łańcuchów immunoglobulin różnych podklas (IgG, IgM, IgA, IgE). Korzystna jako część immunoglobulinowa jest stała część ludzkiego łańcucha ciężkiego IgG, konkretnie IgG1, gdzie fuzja odbywa się w regionie zawiasowym. W konkretnym wykonaniu, część Fc może być po prostu usunięta przez przyłączenie sekwencji cięcia, która może być przecięta przez czynnik krzepliwości krwi Xa.

Ponadto opisano procesy przygotowania tych białek fuzyjnych za pomocą inżynierii genetycznej i ich zastosowanie do badań przesiewowych, poszukiwania leków, diagnozy i terapii. Przykłady technologii białek fuzyjnych można znaleźć w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO 94/29458 i WO 94/22914.

Białka mogą być chemicznie koniugowane lub wyrażane jako zrekombinowane białka fuzyjne pozwalając na wytwarzanie na zwiększonych poziomach w układzie ekspresyjnym w porównaniu z biał kami nie bę d ą cymi fuzjami. Partner w fuzji moż e pomóc w dostarczeniu epitopów dla limfocytów pomocniczych T (partner fuzji immunologicznej), korzystnie epitopów dla limfocytów pomocniczych T rozpoznawanych przez ludzi, lub partner w fuzji może pomagać w ekspresji białka (wzmacniacz ekspresji) przy wyższych wydajnościach niż natywne białko zrekombinowane. Korzystnie partner w fuzji będzie zarówno partnerem fuzji immunologicznej jak i partnerem wzmagającym ekspresję.

Partnerzy fuzji obejmują białko D z Haemophilus influenzae i niestrukturalne białko wirusa grypy, NS1 (hemaglutynina). Innym partnerem fuzji jest białko znane jako LytA. Korzystnie stosowana jest C-końcowa część cząsteczki. LytA pochodzi ze Streptococcus pneumoniae, który syntetyzuje amidazę N-acetylo-L-alaninową, amidazę LytA (kodowaną przez gen lytA (Gene, 43 (1986) strony 265-272)), autolizynę, która specyficznie degraduje pewne wiązania w szkielecie peptydo-glikanu. C-końcowa domena białka LytA jest odpowiedzialna za powinowactwo do choliny lub pewnych analogów choliny, takich jak DEAE. Ta właściwość była wykorzystana do opracowania plazmidów E. coli wyrażających C-LytA przydatnych do ekspresji białek fuzyjnych. Opisano oczyszczenie białek hybrydowych zawierających fragment C-LytA na N-końcu (Biotechnology: 10 (1992) strony 795-798). Jest możliwe stosowanie powtórzonej części cząsteczki LytA spotykanej na C-końcu rozpoczynając od reszty 178, na przykład reszty 188-305.

W wymienionych uprzednio polipeptydach, można wymienić aminokwasy tworząc warianty tych polipeptydów, to znaczy polipeptydy, które różnią się od polipeptydów referencyjnych konserwatywnymi podstawieniami aminokwasów, w wyniku czego aminokwas jest podstawiony przez inny o podobnych cechach. Typowe takie podstawienia obejmują podstawienia w obrębie grup Ala, Val, Leu i Ile; Ser i Thr; kwaś ne reszty Asp i Glu; Asn i Gln; i zasadowe reszty Lys i Arg; lub aromatyczne reszty Phe i Tyr.

Opisane polipeptydy mogą być przygotowane w dowolny odpowiedni sposób. Takie polipeptydy obejmują naturalnie występujące polipeptydy, polipeptydy wytwarzane przez rekombinację, syntetycznie wytwarzane polipeptydy lub polipeptydy wytwarzane przez połączenie tych sposobów. Sposoby przygotowania takich polipeptydów są dobrze znane w dziedzinie.

Najbardziej korzystnie polipeptyd według wynalazku pochodzi z Neisseria meningitidis, jednak może być korzystnie otrzymany z innych organizmów tego samego rodzaju taksonomicznego. Polipeptyd według wynalazku może też być uzyskany na przykład z organizmów tej samej rodziny taksonomicznej lub tego samego rzędu.

PL 197 449 B1

Polinukleotydy

Wyizolowany polinukleotyd według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową o Sek. Id. Nr: 2 lub 4 na całej długości tych sekwencji odpowiednio lub sekwencję nukleotydową komplementarną do tego wyizolowanego polinukleotydu.

Ponadto wynalazek obejmuje wyizolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową, która ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2 lub 4 w całym regionie kodującym lub sekwencję nukleotydową komplementarną do tego wyizolowanego polinukleotydu.

Korzystnie identyczność z Sek. Id. Nr: 1 lub 3 wynosi przynajmniej 95%.

Wynalazek dotyczy również wyizolowanego polinukleotydu zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2 lub 4.

Ponadto wynalazek dotyczy wyizolowanego polinukleotydu zawierającego polinukleotyd o Sek. Id. Nr: 1 lub Sek. Id. Nr: 3.

W zakres wynalazku wchodzi również wyizolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2 lub 4, który można uzyskać przez przeszukiwanie odpowiedniej biblioteki w ostrych warunkach hybrydyzacji ze znakowaną sondą mającą sekwencję z Sek. Id. Nr: 1 lub Sek. Id. Nr: 3 lub ich fragmentem.

Polinukleotydy BASB029 o sekwencji przedstawionej w Sek. Id. Nr: 1 lub 3 są polinukleotydami BASB029 ze szczepów ATCC13090 i H4476 Neisseria meningitidis.

W dalszym wykonaniu wynalazku opisane są wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące i/lub wyrażające polipeptydy i polinukleotydy BASB029, szczególnie polipeptydy i polinukleotydy BASB029 Neisseria meningitidis obejmując na przykład nieobrobione RNA, RNA rybozymu, mRNA, cDNA, genomowy DNA, B- i Z- DNA. Dalsze wykonania wynalazku obejmują polinukleotydy i polipeptydy przydatne biologicznie, diagnostycznie, klinicznie, lub terapeutycznie, i ich warianty oraz kompozycje je zawierające.

Inne wykonanie wynalazku dotyczy wyizolowanych polinukleotydów, zawierających przynajmniej jeden gen pełnej długości, który koduje polipeptyd BASB029 mający wydedukowaną sekwencję aminokwasową z Sek. Id. Nr: 2 lub 4 i polinukleotydy blisko z nią związane i ich warianty.

W innym szczególnie korzystnym wykonaniem wynalazku jest peptyd BASB029 z Neisseria meningitidis zawierający lub złożony z sekwencji aminokwasowej z Sek. Id. Nr: 2 lub 4 albo jej wariantu.

Wykorzystując dostarczoną tu informację, taką jak sekwencja polinukleotydu przedstawiona w Sek. Id. Nr: 1 lub 3 można uzyskać, przy użyciu standardowych sposobów klonowania i przeszukiwania, takich jak dla klonowania i sekwencjonowania chromosomalnych fragmentów DNA z bakterii stosując jako materiał wyjściowy komórki Neisseria meningitidis, polinukleotyd według wynalazku kodujący polipeptyd BASB029, a następnie uzyskać klon pełnej długości. Na przykład, aby uzyskać sekwencję polinukleotydu według wynalazku, taką jak sekwencja polinukleotydowa podana w Sek. Id. Nr: 1 lub 3 typowo bibliotekę klonów chromosomalnego DNA Neisseria meningitidis w E. coli lub jakimś innym odpowiednim gospodarzu przeszukuje się znakowanym radioaktywnie oligonukleotydem, korzystnie 17-merowym lub dłuższym, pochodzącym z częściowej sekwencji. Klony niosące DNA identyczny z sondą można wówczas wyróżnić stosując ostre warunki hybrydyzacji. Przez sekwencjonowanie poszczególnych tak zidentyfikowanych klonów przez hybrydyzację ze starterami do sekwencjonowania zaprojektowanymi na podstawie sekwencji oryginalnego polipeptydu lub polinukleotydu jest wówczas możliwe rozszerzenie sekwencji polinukleotydu w obu kierunkach aby ustalić sekwencję całego genu. Takie sekwencjowanie można dogodnie przeprowadzić stosując na przykład zdenaturowany dwuniciowy DNA przygotowany z klonu plazmidowego. Odpowiednie techniki są opisane przez Maniatis, T., Fritsch. E.F. i Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) (zobacz szczególnie Screening By Hybridization 1.90 i Sequencing Denatured Double Stranded DNA Templates 13.70). Można też przeprowadzić bezpośrednie sekwencjonowania genomowe aby uzyskać sekwencję genu pełnej długości. Ilustracyjnie podajemy, że każdy polinukleotyd przedstawiony w Sek. Id. Nr: 1 lub 3 był znaleziony w bibliotece DNA pochodzą cej z Neisseria meningitidis.

Co więcej, każda sekwencja DNA przedstawiona w Sek. Id. Nr: 1 lub 3 zawiera otwartą ramkę odczytu kodującą białko mające w przybliżeniu liczbę reszt aminokwasowych przestawioną w Sek. Id. Nr: 2 lub 4 z wydedukowaną masą cząsteczkową, którą można wyliczyć przy użyciu wartości mas cząsteczkowych reszt aminokwasów dobrze znanych specjalistom.

PL 197 449 B1

Polinukleotyd o Sek. Id. Nr: 1, między kodonem start przy nukleotydzie 1 i kodonem stop, który rozpoczyna się przy nukleotydzie numer 1783 w Sek. Id. Nr: 1, koduje polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2.

Polinukleotyd o Sek. Id. Nr: 3, między kodonem start przy nukleotydzie 1 i kodonem stop, który rozpoczyna się przy nukleotydzie numer 1774 w Sek. Id. Nr: 3, koduje polipeptyd o Sek. Id. Nr: 4.

Polinukleotyd kodujący polipeptyd według niniejszego wynalazku, w tym homologi i ortologi z gatunków innych niż Neisseria meningitidis, może być uzyskany sposobem, który obejmuje etapy przeszukiwania odpowiedniej biblioteki w ostrych warunkach hybrydyzacji (na przykład stosując temperaturę w zakresie 45-65°C i stężenie SDS od 0,1 - 1%) ze znakowaną lub wykrywalną sondą złożoną z lub zawierającą sekwencję Sek. Id. Nr: 1 lub 3 lub jej fragment, i izolacji genu pełnej długości i/lub klonów genomowych zawierających tę sekwencję polinukleotydu.

Wynalazek dotyczy sekwencji polinukleotydowej identycznej na całej swojej długości z sekwencją kodującą (otwarta ramka odczytu) przedstawioną w Sek. Id. Nr: 1 lub 3. Wynalazek dotyczy też sekwencji kodującej dojrzały polipeptyd lub jego fragment jako taki, jak również sekwencji kodującej dojrzały polipeptyd lub fragment w ramce odczytu z inną sekwencją kodującą, taką jak sekwencja kodująca sekwencję liderową lub sekrecyjną, sekwencję białka pre-, lub pro- lub prepro-. Polinukleotyd według wynalazku może też zawierać przynajmniej jedną sekwencję niekodującą, obejmując na przykład, ale nie wyłącznie, przynajmniej jedną niekodującą sekwencję 5' i 3', taką jak transkrybowane, ale nieulegające translacji sekwencje, sygnały terminacji (takie jak rho-zależne i rho-niezależne sygnały terminacji), miejsca wiązania rybosomu, sekwencje Kozak'a, sekwencje, które stabilizują mRNA, introny i sygnały poliadenylacji. Sekwencja polinukleotydowa może też zawierać dodatkowe sekwencje kodujące, które kodują dodatkowe aminokwasy. Na przykład może być zakodowana sekwencja markerowa, która ułatwia oczyszczanie fuzji polipeptydowej. W niektórych wykonaniach wynalazku, sekwencja markerowa jest peptydem heksa-histydynowym, jak dostarczony w wektorze pQE (Quiagen, Inc.) i opisany w Gentz i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989) lub znacznikiem peptydu HA (Wilson et al., Xcell 37:767 (1984), z których oba mogą być przydatne do oczyszczania połączonych z nimi sekwencji polipeptydów. Polinukleotydy według wynalazku także obejmują, ale nie wyłącznie, polinukleotydy zawierające strukturalny gen i jego naturalnie zasocjowane sekwencje kontrolujące ekspresję genu.

Sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd BASB029 o Sek. Id. Nr: 2 lub 4 może być identyczna z sekwencją kodującą polipeptyd objętą przez nukleotydy 1 do 1782 Sek. Id. Nr: 1 lub sekwencją kodującą polipeptyd objętą przez nukleotydy 1 do 1773 Sek. Id. Nr. 3, odpowiednio. Alternatywnie może być to sekwencja, która w wyniku nadmiarowości (degeneracji) kodu genetycznego także koduje polipeptyd Sek. Id. Nr: 2 lub 4.

Stosowane tu określenie „polinukleotyd kodujący polipeptyd obejmuje polinukleotydy, w tym sekwencję kodującą polipeptyd według wynalazku, konkretnie polipeptyd bakteryjny, a bardziej konkretnie polipeptyd Neisseria meningitidis BASB029 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sek. Id. Nr: 2 lub 4. Okreś lenie obejmuje takż e polinukleotydy, które zawierają jeden cią g ł y region lub nieciągłe regiony kodujące polipeptyd (na przykład polinukleotydy przerywane przez włączonego faga, włączoną sekwencję insercyjną, włączoną sekwencję wektora, włączoną sekwencję transpozonu lub ze względu na redagowanie RNA lub reorganizację genomowego DNA) wraz z dodatkowymi regionami, które mogą też zawierać sekwencje kodujące i/lub niekodujące.

Wynalazek dalej dotyczy wariantów polinukleotydów tu opisanych, które kodują warianty polipeptydu mającego wydedukowaną sekwencję aminokwasową z Sek. Id. Nr: 2, 4. Mogą być stosowane fragmenty polinukleotydów według wynalazku, na przykład do syntezy pełnej długości polinukleotydów według wynalazku.

Dalszym szczególnie korzystnym wykonaniem są polinukleotydy kodujące warianty BASB029, które mają sekwencję aminokwasową polipeptydu BASB029 z Sek. Id. Nr: 2, Iub 4, w której podstawiono, zmodyfikowano, usunięto i/lub dodano, w dowolnej kombinacji kilka, 5 do 10, 1 do 5, 1 do 3, 2, 1 lub żadnej reszty aminokwasu. Szczególnie korzystne są ciche podstawienia, addycje i delecje, które nie zmieniają właściwości i aktywności polipeptydu BASB029.

Dalsze korzystne wykonania wynalazku to polinukleotydy, które mają przynajmniej 85% identyczności na całej swej długości z polinukleotydem kodującym polipeptyd BASB029 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sekw. Id. Nr: 2 lub 4 i polinukleotydy, które są komplementarne do takich polinukleotydów. Pod tym względem szczególnie korzystne są polinukleotydy identyczne na przynajmniej 90% całej swej długości z polinukleotydem kodującym polipeptyd BASB029 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Sekw. Id. Nr: 2 lub 4, a wśród nich szczególnie korzystnymi polinuPL 197 449 B1 kleotydami są te z przynajmniej 95% identyczności. Dalej, wśród polinukleotydów mających przynajmniej 95% identyczności, wysoce korzystne są polinukleotydy mające przynajmniej 97% identyczności, a w wś ród mają cych przynajmniej 98% identycznoś ci szczególnie korzystne są te mają ce przynajmniej 99% identyczności, przy czym bardziej korzystne są polinukleotydy z przynajmniej 99% identyczności.

Korzystnymi wykonaniami są polinukleotydy kodujące polipeptydy, które zachowują zasadniczo tę samą funkcję biologiczną lub aktywność jak dojrzały polipeptyd kodowany przez DNA z Sek. Id. Nr: 1 lub 3.

Zgodnie z pewnymi korzystnymi wykonaniami tego wynalazku dostarczone są polinukleotydy, które hybrydyzują, szczególnie w warunkach ostrych, z sekwencją polinukleotydu BASB029, takie jak polinukleotydy o Sek. Id. Nr: 1 lub 3.

Wynalazek dalej dotyczy polinukleotydów, które hybrydyzują z sekwencją polinukleotydów tu dostarczonych, szczególnie polinukleotydów, które hybrydyzują z opisanymi tu polinukleotydami w warunkach ostrych. Stosowane tu określenie „warunki ostre i „ostre warunki hybrydyzacji oznacza hybrydyzację zachodzącą tylko, gdy jest przynajmniej 95%, a korzystnie przynajmniej 97% identyczności między sekwencjami. Konkretnym przykładem ostrych warunków hybrydyzacji jest całonocna inkubacja w 42°C w roztworze zawierającym 50% formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trisodu), 50 mM fosforan sodu (pH 7,6), 5 x roztwór Denhardta, 10% siarczan dekstranu i 20 mikrogramów/ml zdenaturowanego, pofragmentowanego DNA spermy łososia, a następnie płukanie nośnika hybrydyzacji w 0,1 x SSC w około 65°C. Warunki hybrydyzacji i płukania są dobrze znane, a przykłady podano w Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2. Cold Spring Habror, N.Y. (1989) w szczególności Rozdział 11 tamże. Sekwencje polinukleotydów według wynalazku mogą hybrydyzować w roztworze.

Wynalazek dotyczy też polinukleotydu złożonego z lub zawierającego sekwencję polinukleotydową uzyskaną przez przeszukanie odpowiedniej biblioteki zawierającej cały gen pod kątem sekwencji polinukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO:1, 3 w ostrych warunkach hybrydyzacji z sondą mającą sekwencję tej sekwencji polinukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO:1, 3 lub jej fragmentu; i izolację tych sekwencji polinukleotydowych. Fragmenty użyteczne do uzyskania takiego polinukleotydu obejmują na przykład sondy i startery tu opisane w pełni w innym miejscu.

Polinukleotydy według wynalazku mogą być stosowane jako sonda do hybrydyzacji dla RNA, cDNA i genomowego DNA w celu wyizolowania cDNA pełnej długości i klonów genomowych kodujących BASB029 i wyizolowania cDNA i genomowych klonów innych genów, które mają wysoki stopień identyczności, szczególnie wysoką identyczność sekwencji do genu BASB029. Takie sondy na ogół będą obejmowały przynajmniej 15 reszt nukleotydowych lub par zasad. Korzystnie takie sondy będą miały przynajmniej 30 reszt nukleotydowych lub par zasad i mogą mieć przynajmniej 50 reszt nukleotydowych lub par zasad. Szczególnie korzystne sondy będą miały przynajmniej 20 reszt nukleotydowych lub par zasad i będą miały mniej niż 30 reszt nukleotydowych lub par zasad.

Region kodujący genu BASB029 do syntezy sondy oligo-nukleotydowej może być wyizolowany przez przeszukiwanie z użyciem sekwencji DNA przedstawionej w Sek. Id. Nr: 1 lub 3. Wyznakowany oligonukleotyd mający sekwencję komplementarną do sekwencji genu według wynalazku jest następnie stosowany do przeszukiwania biblioteki cDNA, genomowego DNA lub mRNA w celu określenia z którymi czł onkami biblioteki hybrydyzuje sonda.

Istnieje kilka metod uzyskania DNA pełnej długości lub przedłużania krótkich DNA, dostępnych i dobrze znanych specjalistom do, na przykł ad opartych na metodzie szybkiej amplifikacji koń ców cDNA (Rapid Amplification of cDNA ends - RACE) (zobacz na przykład, Frohman i wsp., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Niedawne modyfikacje tej techniki, których przykładem jest technologia Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.), na przykład, znacznie uprościły poszukiwania dłuższych cDNA. W technologii Marathon™ cDNA przygotowano z mRNA wyekstrahowanego z wybranej tkanki i z każ dym końcem zligowano sekwencję „adaptora. Następnie przeprowadzono amplifikację kwasów nukleinowych (PCR), aby powielić „brakujący koniec 5' DNA, stosując kombinację starterów oligonukleotydów specyficznych w stosunku do genów i adaptorów. Następnie powtarzano reakcję PCR stosując „zagnieżdżone startery, to znaczy startery, zaprojektowane do przyłączania się w obrębie zamplifikowanego produktu (typowo starter specyficzny dla adaptora, który przyłącza się dalej w stronę 3' do sekwencji adaptora i starter specyficzny dla genu, który przyłącza się dalej w stronę 5' do wybranej sekwencji genu). Produkty tej reakcji można wówczas analizować przez sekwencjonowanie DNA i DNA pełnej długości skonstruowanego albo przez połączenie produktu bezpośrednio z istniejącym DNA,

PL 197 449 B1 aby uzyskać pełną sekwencję, albo przez przeprowadzenie oddzielnej PCR pełnej długości stosując nową informację o sekwencji do zaprojektowania startera 5'.

Polinukleotydy i polipeptydy według wynalazku mogą być stosowane na przykład jako odczynniki do badań i materiały do poszukiwania środków do leczenia i diagnostyki chorób, w szczególności chorób ludzkich, jak to dalej omówiono w odniesieniu do testów polinukleotydowych.

Polinukleotydy według wynalazku, które są oligonukleotydami pochodzącymi z sekwencji Sek. Id. Nr: 1-4 mogą być stosowane w procesach tu opisanych, ale korzystnie w PCR, które prowadzi się, aby określić czy zidentyfikowane tu polinukleotydy w całości lub częściowo są transkrybowane w bakteriach w zakażonej tkance. Uważa się, że takie sekwencje będą też użyteczne w diagnostyce stadium zakażenia i typu zakażenia, jakie osiągnął patogen.

Wynalazek obejmuje również polinukleotydy, które kodują polipeptyd, który jest dojrzałym białkiem plus dodatkowe N-lub C- końcowe aminokwasy albo aminokwasy wewnątrz dojrzałego polipeptydu (gdy dojrzała postać ma więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy, na przykład). Takie sekwencje mogą odgrywać rolę w obróbce białka z prekursora do postaci dojrzałej, mogą umożliwiać transport białek, mogą wydłużać lub skracać okres półtrwania białka lub mogą ułatwiać manipulację białkiem w testach lub produkcji, między innymi. Jak na ogół w przypadku in vivo, dodatkowe aminokwasy mogą być usuwane z dojrzałego białka przez enzymy komórkowe.

Dla każdego polinukleotydu według wynalazku dostarczony jest komplementarny do niego polinukleotyd. Korzystnie te komplementarne polinukleotydy są w pełni komplementarne do każdego polinukleotydu, z którym są komplementarne.

Białko prekursorowe, mające dojrzałą postać polipeptydu w postaci fuzji z jedną lub więcej prosekwencjami może być nieaktywną postacią polipeptydu. Gdy usuwa się prosekwencje, takie nieaktywne prekursory na ogół ulegają aktywacji. Część lub wszystkie prosekwencje mogą być usunięte przed aktywacją. Na ogół takie prekursory nazywa się probiałkami.

Oprócz standardowego oznaczania nukleotydów przez A, G, C T/U, do opisu pewnych polinukleotydów według wynalazku może też być stosowane oznaczenie „N. „N oznacza, że dowolny z czterech nukleotydów DNA lub RNA może pojawić się w takiej określonej pozycji w sekwencji DNA lub RNA, przy czym korzystnie N nie jest kwasem nukleinowym, który, w połączeniu z przyległymi pozycjami nukleotydowymi, gdy jest odczytywany we właściwej ramce odczytu, będzie w takiej ramce odczytu generował przedwczesny kodon terminacyjny.

Podsumowując, polinukleotyd według wynalazku może kodować dojrzałe białko, dojrzałe białko plus sekwencję liderową, (która może być określana jako prebiałko), prekursor dojrzałego białka zawierający jedną lub więcej prosekwencji, które nie są sekwencjami liderowymi prebiałka, lub preprobiałko, które jest prekursorem probiałka, zawierającego sekwencję liderową i jedną lub więcej prosekwencji, które są na ogół usuwane w czasie etapów obróbki, które prowadzą do produkcji aktywnych i dojrzałych postaci polipeptydu.

Polinukleotyd według wynalazku stosuje się do celów terapeutycznych lub profilaktycznych, w szczególności immunizacji genetycznej.

Zastosowanie polinukleotydu według wynalazku do immunizacji genetycznej korzystnie będzie wiązało się z użyciem odpowiedniego sposobu dostarczenia, takiego jak bezpośrednia iniekcja DNA plazmidowego do mięśni (Wolff i wsp., Hum. Mol. Genet.(1992)1:363, Manthorpe i wsp., Hum. Gene Ther. (1983)4:419), dostarczenie DNA skompleksowanego ze specyficznymi nośnikami białkowymi (Wu i wsp., J Biol Chem. (1989) 264:16985), koprecypitacji DNA z fosforanem wapnia (Benvenisty i Reshef, PNAS USA, (1986) 83:9551), enkapsulacja DNA w różnych postaciach liposomów (Kaneda i wsp., Science (1989) 243:375), bombardowanie cząstkami (Tang i wsp., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun i wsp., DNA Cell Biol (1993) 12:791) i zakażenie in vivo z użyciem sklonowanych wektorów retrowirusowych (Seeger i wsp., PNAS USA (1984) 81:5849).

Wektory, komórki gospodarza, systemy ekspresji

Wynalazek dotyczy także wektora ekspresyjnego lub wyizolowanego żywego mikroorganizmu, który zawiera izolowany polinukleotyd według wynalazku.

W zakres wynalazku wchodzi również komórka gospodarza, która zawiera wektor ekspresyjny według wynalazku lub subkomórkowa frakcja lub błona tej komórki gospodarza wyrażające wyizolowany polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową, która ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową, która ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy

PL 197 449 B1 złożonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4, i który obejmuje hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w warunkach wystarczających do wytwarzania polipeptydu i odzyskanie polipeptydu z podłoża hodowlanego.

Wynalazek obejmuje również sposób ekspresji polinukleotydu według wynalazku, który obejmuje transformację komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierającym przynajmniej jeden z tych polinukleotydów według wynalazku i hodowlę tej komórki gospodarza w warunkach wystarczających dla ekspresji wymienionych polinukleotydów. Do produkcji takich białek mogą być także stosowane bezkomórkowe układy translacji z zastosowaniem RNA pochodzących z konstruktów DNA.

Wprowadzenie polinukleotydu do komórki gospodarza można przeprowadzić sposobami opisanymi w wielu standardowych podręcznikach laboratoryjnych, takich jak Davis i wsp., Basic Methods in Molecular Biology, (1986) i Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habror, N.Y. (1989), takimi jak transfekcja z fosforanem wapnia, transfekcja za pośrednictwem DEAE-dekstranu, transfekcja, mikroiniekcja, transfekcja za pośrednictwem kationowych lipidów, elektroporacja, transdukcja, wprowadzenie przez skrobanie (ang. scrape loading), wprowadzanie balistyczne i zakażenie.

Reprezentatywne przykłady odpowiednich komórek gospodarzy obejmują komórki bakterii, takie jak komórki gronkowców, paciorkowców, enterokoków, E. coli, Streptomyces, sinic, Bacillus subtilis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae i Neisseria meningitidis; komórki grzybów, takie jak komórki drożdży, Kluveromyces, Saccharomyces, podstawczaka, Candida albicans i Aspergillus; komórki owadów, takie jak komórki Drosophila S2 i Spodoptera Sf9, komórki zwierząt, takie jak CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 i komórki czerniaka Bowes, oraz komórki roślinne, takie jak komórki rośliny nagonasiennej lub okrytonasiennej.

Do wyrażania polipeptydów według wynalazku można zastosować wiele różnych systemów ekspresyjnych. Takie wektory obejmują między innymi wektory pochodzące od chromosomów, episomów i wirusów, na przykład wektory pochodzące z plazmidów bakteryjnych, z bakteriofaga, z transpozonów, z episomów drożdży, z elementów insercyjnych, z elementów chromosomów drożdży, z wirusów takich jak bakulowirusy, papowawirusy, takie jak SV40, wirusy krowianki, adenowirusy, wirusy ospy ptasiej, wirusy pseudowścieklizny, pikornawirusy, retrowirusy, i alfawirusy i wektory pochodzące z ich kombinacji, takie jak pochodzą ce z elementów genetycznych plazmidów i bakteriofagów, takie jak kosmidy i fagemidy. Konstrukty systemu ekspresji mogą zawierać regiony kontrolne, które zarówno regulują, jak i wywołują ekspresję. Na ogół w tym celu może być stosowany do ekspresji dowolny system lub wektor odpowiedni do utrzymania, namnażania lub ekspresji polinukleotydów i/lub ekspresji polipeptydu w gospodarzu. Odpowiednia sekwencja DNA może być wstawiona do systemu ekspresji za pomocą różnych dobrze znanych i rutynowych technik, jak na przykład przedstawione w Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, powyż ej.

W zrekombinowanych ukł adach ekspresyjnych u eukariontów, do wyraż anego polipeptydu mogą być włączone odpowiednie sygnały sekrecyjne w celu sekrecji ulegającego translacji białka do światła retikulum endoplazmatycznego, do przestrzeni peryplazmatycznej lub do środowiska zewnątrzkomórkowego. Te sygnały mogą być endogenne dla polipeptydu albo mogą być sygnałami heterologicznymi.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być odzyskane i oczyszczone z hodowli zrekombinowanych komórek za pomocą dobrze znanych metod, obejmujących strącanie siarczanem amonu lub etanolem, ekstrakcję kwasem, chromatografię jonowymienną anionową lub kationową, chromatografię na fosfocelulozie, chromatografię interakcji hydrofobowych, chromatografię powinowactwa, chromatografię na hydroksyloapatycie i chromatografię na lektynie. Najbardziej korzystnie do oczyszczania stosuje się chromatografię powinowactwa do jonów metalu (IMAC). Można stosować dobrze znane techniki ponownego zwijania białek do regenerowania konformacji aktywnej, gdy polipeptyd ulega denaturacji w czasie wewnątrzkomórkowej syntezy, izolacji lub oczyszczania.

Układem ekspresyjnym może być także zrekombinowany żywy mikroorganizm, taki jak wirus lub bakteria. Gen będący przedmiotem zainteresowania może być wstawiony do genomu żywego zrekombinowanego wirusa lub bakterii. Inokulacja i zakażenie in vivo tym żywym wektorem doprowadzi do ekspresji in vivo antygenu i indukcji odpowiedzi immunologicznych. Wirusy i bakterie stosowane w tym celu są to, na przykł ad, wirusy ospy (np. krowianka, ospa ptasia, ospa kanarków), alfawirusy (wirus Sindbis, wirus gorączki Semliki Forest, wirus wenezuelskiego zapalenia opon mózgowych koni), adneowirusy, wirusy związane z adenowirusami, pikornawirusy (wirus polio, wirus nieżytu nosa), wirusy opryszczki (wirus osy wietrznej i półpaśćca itd), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG.

PL 197 449 B1

Wirusy te i bakterie mogą być wirulentne, lub atenuowane na różne sposoby w celu uzyskania żywych szczepionek.

Oznaczenia diagnostyczne, prognostyczne, serotypu i mutacji

Wykrycie polinukleotydów i/lub polipeptydów BASB029 u eukarionta, szczególnie u ssaka, a zwłaszcza u człowieka umożliwi wykorzystanie ich w sposobie diagnostycznym do diagnozowania choroby, określenia etapu choroby lub odpowiedzi organizmu zakaźnego na leki. Eukarionty, szczególnie ssaki, a zwłaszcza ludzie, w szczególności zakażeni lub podejrzewani o zakażenie organizmem zawierającym gen lub białko BASB029, mogą być zidentyfikowani na poziomie kwasu nukleinowego lub białka za pomocą różnych dobrze znanych technik jak i sposobów tu dostarczonych.

Polipeptydy i polinukleotydy do prognozy, diagnozy lub innej analizy można uzyskać z próbek biologicznych z ustroju przypuszczalnie zakażonego i/lub zakażonego osobnika. Polinukleotydy z dowolnego z tych ź ródeł , w szczególnoś ci DNA lub RNA, mogą być stosowane bezpoś rednio do wykrywania lub mogą być amplifikowane enzymatycznie przez zastosowanie PCR lub dowolnej innej techniki amplifikacji przed analizą. W ten sam sposób mogą być również stosowane RNA, szczególnie mRNA, cDNA i genomowy DNA. Stosując amplifikację, przez analizę genotypu wybranego polinukleotydu organizmu można uzyskać charakterystykę gatunku i szczepu zakaźnego lub rezydującego organizmu obecnego u osobnika. Zmiana wielkości amplifikowanego produktu w porównaniu z genotypem sekwencji odnośnikowej wybranej z pokrewnego organizmu, korzystnie innego gatunku tego samego rodzaju lub innego szczepu tego samego gatunku umożliwia wykrycie delecji i insercji. Mutacje punktowe można zidentyfikować przez hybrydyzację amplifikowanego DNA ze znakowanymi sekwencjami polinukleotydowymi BASB029. Idealnie lub znacząco sparowane sekwencje można odróżnić od niedoskonale lub bardziej znacząco niesparowanych sekwencji przez trawienie DNazą lub RNazą, odpowiednio dla DNA lub RNA, lub przez wykrycie różnic w temperaturach topnienia lub kinetyce renaturacji. Różnice w sekwencji polinukleotydów mogą być też wykryte przez zmiany w ruchliwości elektroforetycznej fragmentów polinukleotydowych w żelach w porównaniu z sekwencją odnośnikową. Można to przeprowadzić z lub bez czynników denaturujących. Różnice w polinukleotydach można też wykryć przez bezpośrednie sekwencjonowanie DNA lub RNA. Zobacz na przykład Myers i wsp., Science 230: 1242 (1985) Zmiany sekwencji w specyficznych miejscach mogą być też ujawnione przez testy ochrony przed nukleazą, takie jak test ochrony przed RNazą, VI i S1 lub metoda cięcia chemicznego. Zobacz na przykład Cotton i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397-4401 (1985).

W innym wykonaniu moż na skonstruować ukł ad oligonukleotydowych sond zawierają cy sekwencję nukleotydową BASB029 lub jej fragmenty do przeprowadzenia wydajnego poszukiwania, na przykład, mutacji genetycznej, serotypu, klasyfikacji taksonomicznej lub identyfikacji. Metody technologii matryc są dobrze znane i mają powszechne zastosowanie i mogą być wykorzystane do stawiania różnych pytań w genetyce molekularnej obejmujących ekspresję genów, powiązania genetyczne oraz zmienność genetyczną (zobacz na przykład Chee i wsp., Science 274:610 (1996)).

Polinukleotydy według niniejszego wynalazku mogą być stosowane jako odczynniki diagnostyczne. Wykrycie zmutowanej postaci polinukleotydu według wynalazku, korzystnie o Sek. Id. Nr: 1 lub 3, która jest związana z chorobą lub patogennością, zapewni narzędzie diagnostyczne, które może wspomóc lub zdefiniować diagnozowanie choroby, prognozowanie przebiegu choroby, określenie stadium choroby lub podatności na chorobę, co wynika ze słabej ekspresji, nadmiernej ekspresji lub zmienionej ekspresji polinukleotydu. Organizmy, szczególnie organizmy zakaźne, niosące mutacje w takim polinukleotydzie mogą być wykryte na poziomie polinukleotydu za pomocą róż nych technik, takich jak tu opisane.

Komórki z organizmu niosącego mutacje lub polimorfizmy (warianty alleliczne) w polinukleotydzie i/lub polipeptydzie według wynalazku mogą być też wykryte na poziomie polinukleotydu lub polipeptydu za pomocą różnych technik, co umożliwi na przykład serotypowanie. Na przykład RT-PCR może być stosowana do detekcji mutacji w RNA. Szczególnie korzystne jest stosowanie RT-PCR w połączeniu ze zautomatyzowanymi systemami detekcji, takimi jak na przykład GeneScan. RNA, cDNA lub genomowy DNA może być też stosowany w tym samym celu, PCR. Przykładowo, startery PCR komplementarne do polinukleotydu kodującego polipeptyd BASB029 mogą być stosowane do identyfikacji i analizy mutacji.

Startery z 1, 2, 3 lub 4 nukleotydami usuniętymi z 5' i/lub 3' końca mogą być stosowane, między innymi, do amplifikacji DNA i/lub RNA BASB029 izolowanego z próbki pochodzącej od osobnika, takiej jak próbka biologiczna z ustroju. Startery mogą być stosowane do amplifikacji polinukleotydu wyizoloPL 197 449 B1 wanego od zakażonego osobnika, tak że, polinukleotyd może być następnie poddany różnym technikom do wyjaśnienia sekwencji polinukleotydowej. W ten sposób mogą być wykryte mutacje w sekwencji polinukleotydowej i wykorzystane do diagnostyki i/lub prognozowania zakażenia lub jego stadium lub przebiegu, lub do serotypowania i/lub klasyfikacji czynnika zakaźnego.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób diagnozowania zakażenia Neisseria meningitidis, który obejmuje identyfikację polipeptydu według wynalazku lub jego immunogennego fragmentu według wynalazku, lub przeciwciała, które jest immunospecyficzne dla danego polipeptydu, obecnego w próbce biologicznej od zwierzę cia podejrzanego o takie zakaż enie.

Zwiększoną lub zmniejszoną ekspresję polinukleotydu BASB029 można zmierzyć stosując dowolny ze sposobów dobrze znanych w dziedzinie oznaczania ilościowego polinukleotydów, taki jak na przykład amplifikacja, PCR, RT-PCR, ochrona przed RNazą, technika Northern, spektrometria i inne metody hybrydyzacji.

Ponadto, do wykrycia zakażenia mogą być na przykład stosowane testy diagnostyczne do wykrywania nadekspresji polipeptydu BASB029 w porównaniu z normalnymi próbkami kontrolnymi z tkanki. Techniki testowe, które mogą być stosowane do okreś lenia poziomów polipeptydu BASB029 w próbce pochodzącej od gospodarza, takiej jak próbka biologiczna z ustroju, są dobrze znane specjalistom. Takie sposoby testowania obejmują testy radioimmunologiczne, testy współzawodnictwa o wiązanie, analizę typu Western, oznaczenia kanapkowe przeciwciał, wykrywanie przeciwciała i testy ELISA.

Polinukleotydy według wynalazku mogą być stosowane jako składniki układów polinukleotydowych, korzystnie o wysokiej gęstości matryc lub siatek. Te matryce o wysokiej gęstości są szczególnie przydatne dla celów diagnostycznych i prognostycznych. Na przykład, zestaw plamek, z których każda zawiera inny gen, a ponadto zawiera polinukleotyd lub polinukleotydy według wynalazku, może być zastosowany do sondowania, takiego jak przez hybrydyzację lub amplifikację kwasu nukleinowego, z uż yciem sondy uzyskanej lub pochodzącej z próbki biologicznej z ustroju, aby okreś lić obecność konkretnej sekwencji polinukleotydowej lub pokrewnej sekwencji u osobnika. Taka obecność może oznaczać obecność patogenu, w szczególności Neisseria meningitidis i może być przydatna w diagnozowaniu i/lub prognozowaniu choroby lub przebiegu choroby. Także korzystna jest siatka zawierająca szereg wariantów sekwencji polinukleotydowej z Sek. Id. Nr: 1 lub 3. Korzystna jest też siatka zawierająca szereg wariantów sekwencji polinukleotydowej kodującej sekwencję polipeptydową o Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. Nr: 4.

Przeciwciała

W zakres wynalazku wchodzi również przeciwciał o immunospecyficzne w stosunku do polipeptydu lub jego immunogennego fragmentu według wynalazku.

Ponadto wynalazek dotyczy też kompozycji terapeutycznej przydatnej do leczenia ludzi z chorobą powodowaną przez Neisseria meningitidis, która zawiera przynajmniej jedno przeciwciało skierowane przeciw polipeptydowi według wynalazku i odpowiedni nośnik farmaceutyczny.

Polipeptydy i polinukleotydy według wynalazku lub ich warianty albo wyrażające je komórki można zastosować jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał immunospecyficznych wobec takich polipeptydów lub polinukleotydów, odpowiednio.

Przeciwciała wytworzone przeciw polipeptydom lub polinukleotydom według wynalazku można otrzymać przez podawanie polipeptydów lub polinukleotydów według wynalazku lub fragmentów niosących epitop jednego z nich lub obydwu, analogów jednego z nich lub obydwu, albo komórek wyrażających jeden z nich lub obydwa, zwierzętom, korzystnie niebędącym ludźmi, stosując rutynowe procedury. Do wytarzania monoklonalnych przeciwciał można zastosować dowolną technikę znaną w tej dziedzinie, która dostarcza przeciwciał wytwarzanych przez ciągłe hodowle linii komórkowych. Przykłady obejmują różne techniki, takie jak opisane w Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor i wsp., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole i wsp., str. 77-96 w MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Techniki do wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych (Patent USA Nr 4,946,778) można zaadaptować do wytwarzania przeciwciał jednołancuchowych wobec polipeptydów lub polinukleotydów według wynalazku. Ponadto transgeniczne myszy i inne organizmy lub zwierzęta, takie jak inne ssaki można zastosować do wyrażania humanizowanych przeciwciał immunospecyficznych wobec polipeptydów lub polinukleotydów według wynalazku.

Alternatywnie, można stosować technologie prezentacji na fagach do selekcji genów dla przeciwciał z aktywnościami wiązania wobec polipeptydów według wynalazku albo ze zbioru powielonych

PL 197 449 B1 w reakcji PCR v-genów z limfocytów od ludzi przetestowanych pod kątem posiadania anty-BASB029 lub z bibliotek od osób, które nie miały kontaktu z antygenem (McCafferty, i wsp., (1990). Nature 348, 552-554; Marks, i wsp., (1992) Biotechnology 10. 779-783). Powinowactwo tych przeciwciał można również zwiększyć przez np. tasowanie łańcuchów (Clackson i wsp., (1991) Nature 352: 628).

Opisane powyżej przeciwciała można wykorzystać do izolowania lub do identyfikowania klonów wyrażających polipeptydy lub polinukleotydy według wynalazku w celu oczyszczenia polipeptydów lub polinukleotydów, na przykład, przez chromatografię powinowactwa.

A zatem, przeciwciała przeciw polipeptydowi BASB029 lub przeciw polinukleotydowi BASB029 mogą być wykorzystane, między innymi, do leczenia infekcji, szczególnie infekcji bakteryjnych.

Warianty polipeptydów obejmujące antygenowe, epitopowo lub immunologicznie równoważne warianty, stanowią szczególne wykonanie tego wynalazku.

Korzystnie przeciwciało lub jego wariant jest zmodyfikowany w celu zmniejszenia jego immunogenności wobec danego osobnika. Przykładowo, jeżeli tym osobnikiem jest człowiek, najkorzystniej przeciwciało jest „humanizowane, gdzie region lub regiony określające swoistość przeciwciała pochodzącego z hybrydoma zostają przeniesione do monoklonalnego przeciwciała ludzkiego, na przykład tak, jak opisano w Jones i wsp. (1986), Nature 321, 522-525 lub Tempest i wsp., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagoniści i agoniści - testy i cząsteczki

Polipeptydy i polinukleotydy według wynalazku można również zastosować do testowania wiązania małych cząsteczek będących substratami i ligandami np. w komórkach, preparatach wolnych od komórek, bibliotekach chemicznych i mieszaninach produktów naturalnych. Substraty te i ligandy mogą być naturalnymi substratami i ligandami lub mogą być ich strukturalnymi lub funkcjonalnymi imitacjami. Patrz. Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology 1 (2): Chapter 5 (1991).

Metodami skriningowymi można po prostu mierzyć wiązanie związku-kandydata z polipeptydem albo polinukleotydem, albo z komórkami albo błonami zawierającymi polipeptyd lub polinukleotyd, albo białko fuzyjne polipeptydu, przy użyciu znacznika bezpośrednio albo pośrednio połączonego ze związkiem-kandydatem. Alternatywnie, metoda skriningowa może obejmować współzawodnictwo z wyznakowanym czynnikiem współzawodniczącym. Ponadto, tymi metodami skriningowymi można testować, czy związek-kandydat daje sygnał wytworzony przez aktywację lub hamowanie polipeptydu lub polinukleotydu przy użyciu systemu wykrywania właściwego dla komórek zawierających polipeptyd lub polinukleotyd. Inhibitory aktywacji testuje się na ogół w obecności znanych agonistów i obserwuje się efekt aktywacji przez agonistę w obecności związku-kandydata. Konstytutywnie aktywne polipeptydy i/lub konstytutywnie wyrażane polipeptydy lub polinukleotydy można zastosować w metodach skriningowych dla odwrotnych agonistów lub inhibitorów, w nieobecności agonisty lub inhibitora, przez testowanie, czy związek-kandydat hamuje aktywację polipeptydu lub polinukleotydu, co może się zdarzyć. Ponadto, metody skriningowe mogą po prostu obejmować etapy mieszania związku-kandydata z roztworem zawierającym polipeptyd lub polinukleotyd według niniejszego wynalazku w celu utworzenia mieszaniny, mierzenia aktywności polipeptydu lub polinukleotydu BASB029 w mieszaninie i porównywania aktywności polipeptydu lub polinukleotydu BASB029 w mieszaninie z wzorcem. Białka fuzyjne, takie jak utworzone z części Fc i polipeptydu BASB029, jak opisano tu wcześniej, można również zastosować do wysokowydajnych testów przesiewowych w celu zidentyfikowania antagonistów polipeptydu według niniejszego wynalazku, jak również polipeptydów spokrewnionych filogenetycznie i/lub funkcjonalnie (patrz D. Bennett i wsp., J Mol Recognition. 8:52-58 (1995); i K. Johanson i wsp., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995).

Polinukleotydy, polipeptydy i przeciwciała, które wiążą się lub oddziałują z polipeptydem według niniejszego wynalazku, mogą być również przydatne do opracowania skriningowych metod do wykrywania wpływu dodawanych związków na wytwarzanie mRNA i/lub polipeptydu w komórkach. Na przykład, można opracować test ELISA do pomiaru poziomów wydzielanego lub związanego z komórkami polipeptydu przy użyciu monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciał stosując metody znane w tej dziedzinie. Test ten może być użyty do wykrycia czynników, które mogą hamować lub wzmacniać wytwarzanie polipeptydu (zwanych również antagonistą lub agonistą, odpowiednio), w poddanych odpowiednim manipulacjom komórkach lub tkankach.

Dostarczono również metod przeszukiwania związków w celu zidentyfikowania tych, które wzmacniają (agonista) lub blokują (antagonista) działanie polipeptydów lub polinukleotydów BASB029, szczególnie tych związków, które są bakteriostatyczne i/lub bakteriobójcze. Metoda skriningowa może obejmować wysokowydajne techniki. Przykładowo, w celu poszukiwania agonistów

PL 197 449 B1 i antagonistów syntetyczną mieszaninę reakcyjną , kompartment komórkowy, taki jak bł ona, otoczka komórkowa lub ściana komórkowa lub preparat dowolnej z nich, zawierający polipeptyd BASB029 i wyznakowany substrat lub ligand takiego polipeptydu inkubuje się w obecnoś ci albo przy braku obecności cząsteczki-kandydata, który może być agonistą lub antagonistą BASB029. Zdolność cząsteczki-kandydata do działania agonistycznego lub antagonistycznego wobec polipeptydu BASB029 przejawia się w zmniejszeniu wiązania wyznakowanego ligandu lub zmniejszeniu wytwarzania produktu z takiego substratu. Cząsteczki, które wiążą się bezinteresownie, tj. bez indukowania działania polipeptydu będą najprawdopodobniej dobrymi antagonistami. Agonistami są cząsteczki, które wiążą się dobrze, zwiększają szybkość wytwarzania produktu z substratu, zwiększają przekazywanie sygnału lub aktywność kanałów chemicznych. Wykrywanie szybkości lub poziomu, co może mieć miejsce, w przypadku wytwarzania produktu z substratu, przekazywania sygnał u lub aktywności kanał ów chemicznych, można zwiększyć przez zastosowanie systemu reporterowego. Systemy reporterowe, które mogą być z tego względu przydatne, obejmują ale nie wyłącznie, kolorymetryczny, wyznakowany substrat przekształcany w produkt, gen reporterowy, który odpowiada na zmiany aktywności polinukleotydu lub polipeptydu BASB029, oraz testy wiązania znane w tej dziedzinie.

Innym przykładem testu na agonistów BASB029 jest test współzawodnictwa, w którym łączy się BASB029 i potencjalnych agonistów z cząsteczkami wiążącymi BASB029, zrekombinowanymi cząsteczkami wiążącymi BASB029, naturalnymi substratami lub ligandami, naturalnymi substratami lub ligandami albo imitacjami substratów lub ligandów w odpowiednich warunkach dla testu kompetycyjnej inhibicji. W celu oceny skuteczności potencjalnych agonistów BASB029 można wyznakować np. przy użyciu związków radioaktywnych lub kolorymetrycznych tak, że liczba cząsteczek BASB029 związanych z cząsteczką wiążącą się lub przekształconych do produktu może być precyzyjnie oznaczona.

Potencjalni agoniści obejmują, miedzy innymi, małe cząsteczki organiczne, peptydy, polipeptdy i przeciwciała, które wiążą się z polinukleotydem i/lub z polipeptydem według wynalazku i hamują w ten sposób lub eliminują jego aktywność lub ekspresję . Potencjalnymi agonistami mogą być również małe cząsteczki organiczne, peptyd, polipeptyd, taki jak blisko spokrewnione białko lub przeciwciało, które wiążą się z tymi samymi miejscami na cząsteczce wiążącej, bez indukowania aktywności indukowanych przez BASB029, zapobiegając w ten sposób działaniu lub ekspresji polipeptydów i/lub polinukleotydów BASB029 przez wykluczenie polipeptydów i/lub polinukleotydów BASB029 z wiązania.

Potencjalni agoniści obejmują małe cząsteczki, które wiążą się i zajmują miejsce wiązania polipeptydu, zapobiegając w ten sposób wiązaniu z komórkowymi cząsteczkami wiążącymi, tak że przeciwdziała się ich normalnej aktywności biologicznej. Przykłady małych cząsteczek obejmują, ale nie wyłącznie, małe cząsteczki organiczne, peptydy i cząsteczki podobne do peptydów. Inni potencjalni antagoniści obejmują cząsteczki antysensowne (patrz Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press. Boca Raton. FL (1988), dla opisu tych cząsteczek). Korzystni potencjalni antagoniści obejmują związki pokrewne i warianty BASB029.

Na drodze inżynierii genetycznej można uzyskać rozpuszczalne fuzje białkowe zawierające polipeptyd według niniejszego wynalazku lub jego fragment i różne części regionów stałych ciężkich i lekkich ł a ń cuchów immunoglobulin róż nych podklas (IgG, IgM, IgA, IgE). Jako immunoglobulina korzystna jest stała część ciężkiego łańcucha IgG, szczególnie IgG1, gdzie fuzja ma miejsce w regionie zawiasowym. W jednym z wykonań część Fc może być usunięta po prostu przez wstawienie przecinanej sekwencji, która może być cięta czynnikiem Xa krzepnięcia krwi. Ponadto, uzyskane na drodze inżynierii genetycznej fuzje białkowe można zastosować do testowania leków, diagnozy i leczenia. Przykłady technologii fuzji białkowych można znaleźć w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr W094/29458 i W094/22914.

Każda z opisanych tu sekwencji polipeptydowych może być zastosowana do wykrycia i opracowania związków antybakteryjnych. Zakodowane białko, po ekspresji, może być użyte jako cel do przeszukiwania leków antybakteryjnych. Ponadto, sekwencje polinukleotydowe kodujące aminokońcowe regiony zakodowanego białka lub sekwencje Shine-Delgarno lub inne sekwencje ułatwiające translację odpowiedniego mRNA można zastosować do konstrukcji sekwencji antysensownych do kontrolowania ekspresji sekwencji kodującej, będącej przedmiotem zainteresowania.

Polipeptyd, polinukleotyd według wynalazku, agonista lub antagonista może być stosowany do zakłócania początkowych fizycznych oddziaływań pomiędzy patogenem lub patogenami a eukariotycznym, korzystnie ssaczym gospodarzem, odpowiedzialnych za następstwa infekcji. W szczególności, cząsteczki te mogą być stosowane: do zapobiegania adhezji bakterii, w szczególności bakterii

PL 197 449 B1 gram dodatnich i/lub gram ujemnych, do eukariotycznych, korzystnie ssaczych, białek substancji pozakomórkowej na założonych na stałe urządzeniach lub do białek substancji pozakomórkowej w ranach; do blokowania adhezji bakteryjnej między eukariotycznymi, korzystnie ssaczymi białkami substancji pozakomórkowej i bakteryjnymi białkami BASB029, które pośredniczą w uszkodzeniu tkanki i/lub blokują normalny rozwój patogenezy w infekcjach zapoczątkowanych w inny sposób niż przez wszczepienie zakładanych na stałe urządzeń lub przez inne techniki chirurgiczne.

Antagonistów i agonistów można użyć, na przykład, do zapobiegania, hamowania lub leczenia chorób.

Ponadto opisano mimotopy polipepytydów według wynalazku. Mimotop jest sekwencją peptydową, wystarczająco podobną do natywnego peptydu (pod względem sekwencji lub struktury), która może być rozpoznawana przez przeciwciała, które rozpoznają natywny peptyd; lub jest zdolna do indukowania przeciwciał, które rozpoznają natywny peptyd po połączeniu z odpowiednim nośnikiem.

Mimotopy peptydowe można zaprojektować do konkretnych celów poprzez dodanie, usunięcie lub podstawienie wybranych aminokwasów. A zatem peptydy można modyfikować dla celów łatwego łączenia się z białkiem nośnikowym. Przykładowo, może być pożądane w niektórych metodach sprzęgania chemicznego dołączenie końcowej cysteiny. Ponadto, może być pożądane dla peptydów połączonych z białkiem nośnikowym dołączenie hydrofobowego końca oddalonego od połączonego końca peptydu, tak, że wolny nie uczestniczący w połączeniu koniec peptydu pozostaje związany z powierzchnią białka nośnikowego. Peptyd jest wtedy prezentowany w konformacji, która najbardziej przypomina peptyd znajdowany w kontekście całej natywnej cząsteczki. Przykładowo, peptydy mogą być zmienione tak, aby mieć N-końcową cysteinę i C-końcowy hydrofobowy amidowany ogon. Alternatywnie, można dodać lub podstawić formą stereoizomeru-D jeden lub więcej aminokwasów w celu utworzenia korzystnej pochodnej, na przykład do zwiększenia stabilności peptydu.

Alternatywnie, mimotopy peptydowe można identyfikować przy użyciu przeciwciał, które same mają zdolność do wiązania polipeptydów według niniejszego wynalazku przy użyciu technik, takich jak technologia prezentowania na fagach (EP 0552 267 B1). W technice tej wytworzona zostaje duża liczba sekwencji peptydowych, które imitują strukturę natywnych peptydów i są zatem zdolne do wiązania przeciwciał przeciw natywnym peptydom, ale same nie muszą koniecznie wykazywać homologii sekwencji z natywnym polipeptydem.

Szczepionki

W zakres wynalazku wchodzi również kompozycja szczepionki zawierająca skuteczną ilość polipeptydu według wynalazku lub jego immunogennego fragmentu i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Ponadto wynalazek obejmuje kompozycję szczepionki, zawierającą skuteczną ilość polinukleotydu według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Wynalazek dotyczy również zastosowania kompozycji zawierającej immunologicznie skuteczną ilość polipeptydu według wynalazku lub jego immunogennego fragmentu do wytwarzania leku stosowanego do wywołania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia.

Ponadto wynalazek obejmuje zastosowanie kompozycji zawierającej immunologicznie skuteczną ilość polinukleotydu według wynalazku do wytwarzania leku stosowanego do wywołania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia.

Takie kompozycje po wprowadzeniu do osobnika, korzystnie człowieka, u którego można zaindukować odpowiedź immunologiczną, indukują odpowiedź immunologiczną wobec polinukleotydu BASB029 i/lub zakodowanego w nim polipeptydu, przy czym kompozycja zawiera zrekombinowany polinukleotyd BASB029 i/lub zakodowany w nim polipeptyd i/lub zawiera DNA i/lub RNA, który koduje i wyraż a antygen takiego polinukleotydu BASB029, zakodowanego w nim polipeptydu lub innego polipeptydu według wynalazku. Odpowiedź immunologiczną można wykorzystać leczniczo lub profilaktycznie i może ona mieć postać odporności humoralnej i/lub odporności komórkowej, takiej jak odpowiedź komórkowa pochodząca od limfocytów T CTL lub CD4.

Polipeptyd BASB029 lub jego fragment można połączyć z ko-białkiem lub częścią cząsteczki chemicznej, która może albo nie może sama wytwarzać przeciwciała, ale ma zdolność do stabilizowania pierwszego białka i wytwarzania białka fuzyjnego albo białka zmodyfikowanego, które będzie miało właściwości antygenowe i/lub immunogenne, a korzystnie właściwości ochronne. A zatem korzystnie zrekombinowane białko fuzyjne zawiera ponadto antygenowe ko-białko, takie jak lipoproteina D z Haemophilus influenzae, S-transferaza glutationowa (GST) lub beta-galaktozydaza lub dowolne inne stosunkowe duże ko-białko, które solubilizuje białko i ułatwia jego wytwarzanie i oczyszczanie. PonadPL 197 449 B1 to, ko-białko może działać jako adiuwant w znaczeniu dostarczania ogólnej stymulacji układu immunologicznego organizmu otrzymującego białko. Ko-białko może być przyłączone zarówno do końca aminowego jak i karboksylowego pierwszego białka.

Opisano również sposoby, w których stosuje się polinukleotyd według wynalazku lub jego poszczególne fragmenty, które kodują niezmienne regiony powierzchniowych białek bakteryjnych, można też stosować w konstruktach polinukleotydowych użytych w genetycznych doświadczeniach immunizacyjnych w modelach zwierzęcych infekcji Neisseria meningitidis. Takie doświadczenia będą szczególnie przydatne do identyfikacji epitopów białkowych zdolnych do prowokowania profilaktycznej albo leczniczej odpowiedzi immunologicznej. Uważa się, że to podejście umożliwi wytworzenie monoklonalnych przeciwciał o szczególnej wartości, pochodzących z odpowiedniego narządu zwierzęcia, które jest odporne albo z powodzeniem likwiduje infekcję, do wytworzenia czynników profilaktycznych lub postępowania profilaktycznego wobec infekcji bakteryjnej, w szczególności infekcji Neisseria meningitidis u saków, szczególnie ludzi.

Immunogenny zrekombinowany polipeptyd i/lub polipeptyd według wynalazku łącznie z odpowiednim nośnikiem, takim jak farmaceutycznie dopuszczalny nośnik mogą być sformułowane w postać preparatu szczepionki. Ponieważ polipeptydy i polinukleotydy mogą być rozkładane w żołądku, korzystnie podaje się każdy z nich pozajelitowo, włączając w to na przykład podawanie podskórne, domięśniowe, dożylne lub doskórne. Preparaty odpowiednie do podawania pozajelitowego obejmują wodne i niewodne sterylne roztwory do iniekcji, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, związki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczone, które sprawiają, że preparat jest izotoniczny wobec płynów ustrojowych, korzystnie krwi osobnika; oraz wodne i niewodne sterylne zawiesiny, które mogą zawierać zawieszony czynnik lub czynniki zagęszczające. Preparaty można przygotować w dawkach jednostkowych lub pojemnikach wielodawkowych, na przykład szczelnych ampułkach i fiolkach i można przechowywać w postaci zliofilizowanej, wymagającej jedynie dodatku sterylnego płynnego nośnika bezpośrednio przed użyciem.

Preparat szczepionki może również zawierać system adiuwantowy do wzmocnienia immunogenności. Korzystnie system adiuwantowy wzbudza preferencyjnie odpowiedź typu TH1.

Odpowiedź immunologiczną można ogólnie podzielić na dwie odrębne kategorie, czyli odpowiedź humoralną i komórkową (tradycyjnie charakteryzowane jako mechanizmy obrony przez przeciwciała i efektory komórkowe, odpowiednio). Te kategorie odpowiedzi zostały nazwane odpowiedziami typu TH1 (odpowiedź komórkowa) i odpowiedziami immunologicznymi typu TH2 (odpowiedź humoralna).

Skrajne odpowiedzi immunologiczne typu TH1 można scharakteryzować przez wytwarzanie specyficznych dla antygenu, cytotoksycznych limfocytów T o ograniczonym haplotypie i naturalnej odpowiedzi komórek zabójców. U myszy odpowiedzi typu TH1 często charakteryzują się wytwarzaniem przeciwciał podtypu IgG2a, podczas gdy u ludzi odpowiada to przeciwciałom typu IgGl. Odpowiedzi immunologiczne typu TH2 charakteryzują się wytwarzaniem szerokiego zakresu izotypów immunoglobulin, włączając w to IgGl, IgA i IgM u myszy.

Można przyjąć, że siłą sprawczą tych dwóch typów odpowiedzi immunologicznych są cytokiny. Wysokie poziomy cytokin typu TH1 prowadzą do faworyzowania indukcji odpowiedzi immunologicznych za pośrednictwem komórek, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typy TH2 faworyzują indukcję humoralnych odpowiedzi immunologicznych na antygen. Rozróżnienie między odpowiedziami immunologicznymi typu TH1 i TH2 nie jest bezwzględne. W rzeczywistości u osobnika może wytworzyć się odpowiedź immunologiczna, która jest opisana jako odpowiedź głównie TH1 lub głównie TH2. Jednakże często dogodne jest traktowanie rodzin cytokin w kategoriach opisanych dla mysich klonów CD4+ limfocytów T przez Mosmanna i Coffmana (Mosmann T.R. and Coffman. R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual

Review of Immunology; 7, str. 145-173). Tradycyjnie, odpowiedziom typu TH1 towarzyszy wytwarzanie cytokin INF-γ i IL-2 przez limfocyty T. Inne cytokiny, takie jak IL-12, często bezpośrednio związane z indukcją odpowiedzi immunologicznej typu TH1, nie są wytwarzane przez limfocyty T. Przeciwnie, odpowiedziom typu TH2 towarzyszy wydzielanie IL-4, IL-5, IL-6 i IL-13.

Wiadomo, że niektóre adiuwanty szczepionkowe są szczególnie przydatne do stymulowania odpowiedzi cytokin zarówno typu TH1 jak i TH2. Tradycyjnie najlepsze wskaźniki równowagi TH1:TH2 w odpowiedzi immunologicznej po zaszczepieniu lub infekcji obejmują bezpośredni pomiar wytwarzania cytokin TH1 lub TH2 przez limfocyty T in vitro po powtórnej stymulacji antygenem i/lub pomiar stosunku IgGl:IgG2 w odpowiedzi przeciwciał specyficznej wobec antygenu.

PL 197 449 B1

A zatem adiuwant typu TH1 preferencyjnie stymuluje populacje izolowanych komórek TH1 do wytwarzania wysokich poziomów cytokin typu TH1, gdy są powtórnie stymulowane antygenem in vitro i promuje rozwój zarówno cytotoksycznych limfocytów T, jak i specyficznych wobec antygenu odpowiedzi immunoglobulinowych związanych z izotypem typu TH1.

Adiuwanty, które są zdolne do preferencyjnej stymulacji odpowiedzi komórkowej TH1, są opisane w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO 94/00153 i WO 95/17209.

Jednym z takich adiutantów jest 3 de-O-acylowany monofosforylowy lipid A (3D-MPL). Jest on znany z GB 2220211 (Ribi). Chemicznie jest to mieszanina 3 de-O-acylowanego monofosforylowego lipidu A z 4, 5 lub 6 acylowanymi łańcuchami i jest wytwarzany przez Ribi Immunochem, Montana. Korzystna postać 3 de-O-acylowanego monofosforylowego lipidu A jest ujawniona w patencie europejskim O 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Korzystnie 3D-MPL są dostatecznie małe, aby mogły być filtrowane przez filtr 0,22 mikrony (Patent Europejski numer O 689454).

3D-MPL będzie obecny w zakresie 10 μg - 100 μg, korzystnie, 25-50 μg na dawkę, podczas gdy antygen będzie zazwyczaj obecny w zakresie 2-50 μg na dawkę.

Inny korzystny adiuwant obejmuje QS21, oczyszczoną przez HPLC nietoksyczną frakcję pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina. Ewentualnie może być zmieszana z 3 de-O-acylowanym monofosforylowym lipidem A (3D-MPL), ewentualnie łącznie z nośnikiem. Sposób wytwarzania QS21 jest ujawniony w Patencie USA Nr 5,057,540.

Wcześniej zostały opisane (WO 96/33739) niedające reakcji preparaty adiuwantowe zawierające QS21. Wykazano, że takie preparaty zawierające QS21 i cholesterol, są adiuwantami skutecznie stymulującymi TH1 po sformułowaniu razem z antygenem.

Inne adiuwanty, które są korzystnymi stymulatorami odpowiedzi komórkowej TH1, obejmują immunomodulatorowe oligonukleotydy, na przykład niezmetylowane sekwencje CpG, jak ujawniono w WO 96/02555.

Kombinacje różnych adiutantów stymulujących TH1, takich jak wspomniane powyżej, są również rozważane jako adiuwant, który jest korzystnym stymulatorem odpowiedzi komórkowej TH1. Przykładowo, QS21 można sformułować razem z 3D-MPL. Stosunek QS21 : 3D-MPL będzie zazwyczaj w zakresie od 1 : 10 do 10 : 1; korzystnie 1 : 5 do 5 : 1, a często zasadniczo 1:1. Korzystny zakres odpowiedniego współdziałania wynosi od 2,5 : 1 do 1 : 1 3D-MPL: QS21.

Korzystnie kompozycja szczepionki według wynalazku zawiera także nośnik. Nośnik może być emulsją olejową albo wodną lub solą glinu, taką jak fosforan glinu albo wodorotlenek glinu.

Korzystne emulsje typu olej w wodzie zawierają metabolizowany olej, taki jak skwalen, alfa tokoferol i Tween 80. W szczególnie korzystnym wykonaniu antygeny w kompozycji szczepionki według wynalazku łączy się z QS21 i 3D-MPL w takiej emulsji. Dodatkowo emulsja olej w wodzie może zawierać span 85 i/lub lecytynę i/lub trikaprylinę.

Typowo, do podawania ludziom QS21 i 3D-MPL są obecne w szczepionce w zakresie 1 μg - 200 μg, jak 10 μg - 100 μg, korzystnie, 10 μg - 50 μg na dawkę. Typowo olej w wodzie zawiera od 2 do 10% skwalenu, od 2 do 10% alfa tokoferolu i od 0,3 do 10% Tweenu 80. Korzystnie, stosunek skwalen:alfa tokoferol jest równy lub mniejszy od 1 i to daje bardziej stabilną emulsję. Span 85 może być również obecny na poziomie 1%. W niektórych przypadkach korzystnie kompozycje szczepionki według wynalazku zawierają ponadto stabilizator.

Nietoksyczne emulsje olej w wodzie zawierają nietoksyczny olej, taki jak np. skwalan, lub skwalen i emulgator np. Tween 80 w wodnym nośniku. Wodnym nośnikiem może być na przykład roztwór soli buforowany fosforanem.

Szczególnie silny preparat adiuwanta zawierający QS21 i 3D-MPL oraz emulsję tokoferolu w wodzie jest opisany w WO 95/17210.

Jakkolwiek wynalazek został tu opisany w odniesieniu do pewnych polipeptydów i polinukleotydów BASB029, należy rozumieć, że obejmuje też fragmenty występujących naturalnie polipeptydów i polinukleotydów oraz podobnych polipeptydów i polinukleotydów z insercjami, delacjami, podstawieniami, które nie wpływają zasadniczo na właściwości immunogenne zrekombinowanych polipeptydów i polinukleotydów.

Antygen można również dostarczyć w postaci całych bakterii (martwych lub żywych) albo jako frakcje subkomórkowe; możliwości te obejmują samą N. meningitidis.

PL 197 449 B1

Kompozycje, zestawy i podawanie

Omawiane tu kompozycje zawierają polipeptydy i/lub polinukleotydy lub ich agonistów albo antagonistów. Polipeptydy i polinukleotydy według wynalazku można zastosować w kombinacji z niesterylnym albo sterylnym nośnikiem lub nośnikami, takimi jak farmaceutycznie dopuszczalny nośnik odpowiedni do podawania osobnikowi, do zastosowania z komórkami, tkankami lub organizmami. Takie kompozycje zawierają na przykład dodatek podłoża lub skutecznej ilości polipeptydów i polinukleotydów według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. Takie nośniki mogą obejmować między innymi sól fizjologiczną, buforowaną sól fizjologiczną, dekstrozę, wodę, glicerol, etanol lub ich kombinację. Preparat powinien odpowiadać sposobowi podawania. Polipeptydy, polinukleotydy według wynalazku można zastosować pojedynczo lub w połączeniu z innymi związkami, takimi jak związki lecznicze.

Kompozycje farmaceutyczne można podawać w skuteczny, dogodny sposób, włączając w to na przykład podawanie drogą miejscową, doustną, doodbytniczą, dopochwową, dożylną, dootrzewnową, domięśniową, podskórną, donosową, lub między innymi przezskórną.

W leczeniu lub profilaktycznie, aktywny czynnik może być podawany osobnikowi jako kompozycja do wstrzyknięcia, na przykład jako sterylna zawiesina wodna, korzystnie izotoniczna.

Kompozycję dostosowuje się do drogi podawania, na przykład drogi ogólnoustrojowej lub doustnej. Korzystne formy podawania ogólnoustrojowego obejmują iniekcję, typowo iniekcję dożylną. Można stosować inne drogi iniekcji, takie jak podskórne, domięśniowe i dootrzewnowe. Alternatywne sposoby podawania ogólnoustrojowego obejmują podawanie przezśluzówkowe i przezskórne przy zastosowaniu czynników przenikających, takich jak sole żółciowe lub kwasy fusydowe lub innych detergentów. Ponadto jeżeli polipeptyd lub inne związki według niniejszego wynalazku mogą być formułowane w kompozycje dojelitowe lub w kapsułki, możliwe jest również podawanie doustne. Podawanie tych związków może być również miejscowe i/lub zlokalizowane, w postaci maści, past, żeli, roztworów, pudrów i temu podobnych.

Przy podawaniu ssakom, a szczególnie ludziom dzienna dawka czynnika aktywnego będzie w zakresie od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, typowo około 1 mg/kg. Lekarz w każdym przypadku określi aktualną dawkę, która będzie najbardziej odpowiednia dla osobnika i będzie się różniła w zależności od wieku, wagi i odpowiedzi konkretnego osobnika. Powyższe dawki są przykładowymi dla przeciętnego przypadku. Mogą istnieć oczywiście indywidualne przypadki, gdzie wyższe lub niższe zakresy dawkowania są niezbędne i mieszczą się one w zakresie wynalazku.

Wymagany zakres dawki zależy od wybranego peptydu, drogi podawania, natury preparatu, stanu chorobowego i oceny biegłego w tej dziedzinie. Odpowiednie dawkowanie pozostaje jednakże w zakresie 0,1 - 100 μg/kg osobnika.

Dogodnie kompozycja szczepionki jest w postaci wstrzykiwalnej. Konwencjonalne adiuwanty można zastosować do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Odpowiednia dawka jednostkowa do szczepienia wynosi 0,5-5 mikrogramów/kg antygenu i taką dawkę korzystnie podaje się 1-3 razy w odstępach 1-3 tygodni. We wskazanym zakresie dawki nie będzie się obserwować żadnych szkodliwych efektów toksykologicznych w przypadku polipeptydów i polinukleotydów według wynalazku, które wykluczałyby ich zastosowanie odpowiednim osobnikom.

Można się jednakże spodziewać szerokiego zróżnicowania niezbędnej dawki w świetle różnorodności dostępnych związków i różnej skuteczności różnorodnych dróg podawania. Przykładowo, można oczekiwać, że podawanie doustne będzie wymagało wyższych dawek niż podawanie przez iniekcję dożylną. Zróżnicowanie w tych poziomach dawek można regulować stosując standardowe empiryczne sposoby optymalizacji, co jest dobrze znane w tej dziedzinie.

Bazy danych sekwencji, sekwencje w nośniku trwałym i algorytmy

Sekwencje polinukleotydowe i polipeptydowe tworzą wartościowe źródło informacji dla określania ich 2- i 3-wymiarowych struktur, jak również identyfikowania dalszych sekwencji o podobnej homologii. Te podejścia ułatwia najbardziej przechowywanie sekwencji w odczytywalnym przez komputer nośniku, a następnie użycie przechowywanych danych w znanym programie dotyczącym struktur makromolekularnych lub w celu przeszukiwania baz danych sekwencji przy zastosowaniu dobrze znanych narzędzi do poszukiwań, takich jak pakiet programów GCG.

Poniżej przedstawiono również sposoby analizowania określonych sekwencji lub ciągów, szczególnie sekwencji genetycznych lub zakodowanych sekwencji białkowych. Korzystne sposoby analizy sekwencji obejmują, na przykład, sposoby analizy homologii sekwencji, takie jak analiza identyczności i podobieństwa DNA, analiza struktury RNA i białka, składanie sekwencji, analiza klady18

PL 197 449 B1 styczna, analiza motywu sekwencji, określanie otwartych ramek odczytu, wywoływanie zasad kwasu nukleinowego, analiza stosowania kodonów, przycinanie zasad kwasu nukleinowego, analiza pików w chromatogramach przy sekwencjonowaniu.

Komputerowy sposób przeprowadzania identyfikacji homologii, obejmuje etapy: dostarczania pierwszej sekwencji polinukleotydowej zawierającej sekwencję polinukleotydu według wynalazku w nośniku odczytywalnym przez komputer i porównywanie takiej pierwszej sekwencji polinukleotydowej z co najmniej jedną drugą sekwencją polinukleotydową lub sekwencją polipeptydową w celu zidentyfikowania homologii.

Komputerowy sposób przeprowadzania identyfikacji homologii obejmuje etapy: dostarczania pierwszej sekwencji polipeptydowej zawierającej sekwencję polipeptydu według wynalazku w nośniku odczytywalnym przez komputer i porównywanie takiej pierwszej sekwencji polipeptydowej z co najmniej jedną drugą sekwencją polinukleotydową lub sekwencją polipeptydową w celu zidentyfikowania homologii.

Definicje „Identyczność, jak wiadomo w tej dziedzinie, jest pokrewieństwem pomiędzy dwiema lub większą liczbą sekwencji polipepytydowych, lub dwiema lub większą liczbą sekwencji polinukleotydowych, co może mieć miejsce, określonym przez porównywanie sekwencji. W tej dziedzinie „identyczność oznacza również stopień pokrewieństwa sekwencji między sekwencjami polipeptydowymi lub polinukleotydowymi, co może mieć miejsce, określony poprzez dopasowanie ciągów takich sekwencji. „Identyczność może być łatwo policzona znanymi metodami, włączając w to, ale nie wyłącznie, te opisane w (Computational Molecular Biology; Lesk, A.M., wyd., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Część I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., wyd. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G. Academic Press, 1987; oraz Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux. J. wyd. M Stockton Press, New York, 1991; oraz Carillo, H., and Lipman. D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988). Sposoby określania identyczności są tak zaprojektowane, żeby dawać największe dopasowanie między testowanymi sekwencjami. Ponadto, sposoby określania identyczności są skodyfikowane w publicznie dostępnych programach komputerowych. Sposoby zastosowania programów komputerowych do określania identyczności między dwiema sekwencjami obejmują między innymi program GAP w pakiecie programów GCG (Devereux, J. i wsp., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984), BLASTP, BLASTN (Altschul,

S.F. i wsp., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) oraz FASTA (Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). Rodzina programów BLAST jest dostępna publicznie z NCBI i innych źródeł (BLAST Manual, Altschul. S. i wsp., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul. S., i wsp., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Do określenia identyczności można również zastosować dobrze znany algorytm Smith Waterman.

Parametry do porównywania sekwencji polipeptydowych obejmują:

Algorytm: Needleman and Wunsch. J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Tablice podstawień: BLOSSUM62 z Henikoff and Henikoff.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)

Kara za przerwę: 8

Kara za długość przerwy: 2

Przydatnym programem z tymi parametrami jest publicznie dostępny program gap z Genetics Computer Group, Madison WI. Wymienione powyżej parametry są standardowymi parametrami przy porównywaniu peptydów (łącznie z brakiem kary za przerwy końcowe).

Parametry do porównywania sekwencji polinukleotydowych obejmują:

Algorytm: Needleman and Wunsch. J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Tablice podstawień: zgodność = +10, niezgodność = 0

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)

Kara za przerwę: 50

Kara za długość przerwy: 3

Dostępny jako: Program gap z Genetics Computer Group, Madison WI. Są to standardowe parametry przy porównywaniu kwasów nukleinowych.

Korzystne znaczenia terminu „identyczność dla polinukleotydów i polipeptydów, co może mieć miejsce, są dostarczone poniżej w punktach (1) i (2).

PL 197 449 B1 (1) Wykonania dotyczące polinukleotydu obejmują ponadto wyizolowany polinukleotyd zawierający sekwencję polinukleotydową o co najmniej 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 lub 100% identyczności w odniesieniu do Sek Id Nr: 1, gdzie taka sekwencja polinukleotydowa moż e być identyczna z odnośnikową Sek. Id. Nr: 1 lub może obejmować do pewnej liczby całkowitej zmian nukleotydowych w porównaniu z sekwencją stanowią c ą odniesienie, gdzie takie zmiany są wybrane z grupy skł adają cej się z co najmniej jednej delecji nukleotydowej, podstawienia, włączając w to tranzycję i transwersję, albo insercji, i gdzie takie zmiany mogą wystąpić w pozycjach 5'- lub 3'-końcowych sekwencji nukleotydowej stanowiącej odniesienie, lub gdziekolwiek między tymi końcowymi pozycjami, rozmieszczonych albo pojedynczo wśród nukleotydów w sekwencji stanowiącej odniesienie, albo w jednej lub więcej ciągłych grupach w obrębie sekwencji stanowiącej odniesienie i gdzie taka liczba zmian nukleotydowych jest określona przez pomnożenie całkowitej liczby nukleotydów w Sek. Id. Nr: 1 przez liczbę całkowitą określającą procent identyczności podzieloną przez 100, a następnie odjęcie tego wyniku od całkowitej liczby nukleotydów w Sek. Id. Nr: 1, albo nn < Xn - (Xn · y) gdzie nn jest liczbą zmian nukleotydowych, xn jest całkowitą liczbą nukleotydów w Sek. Id. Nr: 1, y wynosi 0,50 dla 50%, 0,60 dla 60%, 0,70 dla 70%, 0,80 dla 80%, 0,85 dla 85%, 0,90 dla 90%, 0,95 dla 95%, 0,97 dla 97% lub 1,00 dla 100%, a • jest symbolem mnożenia, i gdzie nie będąca liczbą całkowitą wartość xn i y jest zaokrąglana w dół do najbliższej liczby całkowitej przed odjęciem jej od xn. Zmiany sekwencji polinukleotydowej kodującej polipeptyd z Sek. Id. Nr: 2 mogą prowadzić do powstania mutacji nonsens, missens lub mutacji zmiany ramki odczytu w tej sekwencji kodującej, zmieniając tym samym polipeptyd kodowany przez polinukleotyd po takich zmianach.

Jako przykład, sekwencja polinukleotydowa według niniejszego wynalazku może być identyczna z sekwencją Sek. Id. Nr. 1 stanowiącą odniesienie, to znaczy może być w 100% identyczna, albo może zawierać do pewnej liczby całkowitej zmian nukleotydowych w porównaniu do sekwencji stanowiącej odniesienie, tak, że procent identyczności wynosi mniej niż 100% identyczności. Takie zmiany są wybrane z grupy składającej się z co najmniej jednej delecji nukleotydowej, podstawienia, włączając w to tranzycję i transwersję, albo insercji, i gdzie takie zmiany mogą wystąpić w pozycjach 5'- lub 3'-końcowych sekwencji polinukleotydowej stanowiącej odniesienie, lub gdziekolwiek między pozycjami końcowymi, rozmieszczonych albo pojedynczo wśród nukleotydów w sekwencji stanowiącej odniesienie albo w ciągłych grupach w obrębie sekwencji stanowiącej odniesienie. Liczba zmian w kwasie nukleinowym dla danego procentu identyczności jest określona przez pomnożenie całkowitej liczby nukleotydów w Sek. Id. Nr: 1 przez liczbę całkowitą określającą procent identyczności podzielon ą przez 100, a następnie odjęcie tego wyniku od całkowitej liczby nukleotydów w Sek. Id. Nr: 1, albo nn < xn - (xn • y), gdzie nn jest liczbą zmian nukleotydowych, xn jest całkowitą liczbą nukleotydów w kwasie nukleinowym w Sek. Id. Nr: 1, y wynosi na przykład 0,70 dla 70%, 0,80 dla 80%, 0,85 dla 85% itd., • jest symbolem mnożenia i gdzie nie będącą liczbą całkowitą wartość xn i y jest zaokrąglana w dół do najbliższej liczby całkowitej przed odjęciem jej od xn.

(2) Wykonania dotyczące polipeptydu obejmują ponadto wyizolowany polipeptyd obejmujący polipeptyd o co najmniej 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 lub 100% identyczności w odniesieniu do Sek. Id. Nr: 2, gdzie taka sekwencja polipeptydowa może być identyczna z odnośnikową Sek. Id. Nr: 2 lub może obejmować do pewnej liczby całkowitej zmiany aminokwasowe w porównaniu z sekwencją stanowiącą odniesienie, gdzie takie zmiany są wybrane z grupy składającej się z co najmniej jednej delecji aminokwasowej, podstawienia, włączając w to podstawienia konserwatywne i niekonserwatywne, albo insercji, i gdzie takie zmiany mogą wystąpić w pozycjach amino- lub karboksykońcowych sekwencji polipeptydowej stanowiącej odniesienie, lub gdziekolwiek między tymi końcowymi pozycjami, rozmieszczonych albo pojedynczo wśród aminokwasów w sekwencji stanowiącej odniesienie albo w jednej lub wielu ciągłych grupach w obrębie sekwencji stanowiącej odniesienie i gdzie taka liczba zmian aminokwasowych jest określona przez pomnożenie całkowitej liczby aminokwasów w Sek. Id. Nr: 2 przez liczbę całkowitą określającą procent identyczności podzieloną przez 100, a następnie odjęcie tego wyniku od całkowitej liczby aminokwasów w Sek. Id. Nr: 2, albo na < xa - (xa • y),

PL 197 449 B1 gdzie na jest liczbą zmian aminokwasowych, xa jest całkowitą liczbą aminokwasów w Sek. Id. Nr: 2, y wynosi 0,50 dla 50%, 0,60 dla 60%, 0,70 dla 70%, 0,80 dla 80%, 0,85 dla 85%, 0,90 dla 90%, 0,95 dla 95%, 0,97 dla 97% lub 1,00 dla 100%, a • jest symbolem mnożenia i gdzie nie będąca liczbą całkowitą wartość xa i y jest zaokrąglana w dół do najbliższej liczby całkowitej przed odjęciem jej od xa.

Jako przykład, sekwencja polipeptydowa według niniejszego wynalazku może być identyczna z odnośnikową Sek. Id. Nr: 2, to znaczy może być identyczna w 100%, albo może zawierać do pewnej liczby całkowitej zmian aminokwasowych w porównaniu z sekwencją stanowiącą odniesienie, tak, że procent identyczności wynosi mniej niż 100% identyczności. Takie zmiany są wybrane z grupy składającej się z co najmniej jednej delecji aminokwasowej, podstawienia, włączając w to podstawienia konserwatywne i niekonserwatywne, albo insercji, i gdzie takie zmiany mogą wystąpić w pozycjach amino- lub karboksy-końcowych sekwencji polipeptydowej stanowiącej odniesienie, lub gdziekolwiek między tymi pozycjami końcowymi, rozmieszczonych albo pojedynczo wśród aminokwasów w sekwencji stanowiącej odniesienie albo w jednej lub więcej ciągłych grupach w obrębie sekwencji stanowiącej odniesienie. Liczba zmian aminokwasowych dla danego % identyczności jest określona przez pomnożenie całkowitej liczby aminokwasów w Sek. Id Nr: 2 przez liczbę całkowitą określającą procent identyczności podzieloną przez 100, a następnie odjęcie tego wyniku od całkowitej liczby aminokwasów w Sek. Id. Nr: 2, albo n_a < Xa - (Xa • y), gdzie na jest liczbą zmian aminokwasowych, xa jest całkowitą liczbą aminokwasów w Sek. Id. Nr: 2, y wynosi na przykład 0,70 dla 70%, 0,80 dla 80%, 0,85 dla 85% itd., • jest symbolem mnożenia i gdzie nie będąca liczbą całkowitą wartość xa i y jest zaokrąglana w dół do najbliższej liczby całkowitej przed odjęciem jej od xa.

„Osobnik(i) jak jest tu stosowane w odniesieniu do organizmu, oznacza wielokomórkowego eukarionta, obejmując, ale nie wyłącznie, ssaka, bydlęcie, małpę, naczelnego i człowieka.

„Wyizolowany oznacza zmieniony „ręką ludzką ze stanu naturalnego, t.j. jeśli występuje w naturze, został zmieniony lub usunięty ze swojego oryginalnego środowiska, lub i to i to. Na przykład, polinukleotyd lub polipeptyd naturalnie obecny w żywym organizmie nie jest „izolowany, ale ten sam polinukleotyd lub polipeptyd oddzielony od współistniejących materiałów swego naturalnego stanu jest „izolowany, w znaczeniu tu stosowanym. Co więcej, polinukleotyd lub polipeptyd, który jest wprowadzony do organizmu za pomocą transformacji, manipulacji genetycznej lub za pomocą dowolnej innej metody rekombinacji jest „izolowany, nawet jeśli jest nadal obecny w tym organizmie, który może być żywy lub nieżywy.

„Polinukleotyd(y) ogólnie dotyczy dowolnego polirybonukleotydu lub polideoksyrybonukleotydu, który może być niezmodyfikowanym RNA lub DNA lub zmodyfikowanym RNA lub DNA obejmującym regiony jedno- i dwuniciowe.

„Wariant dotyczy polinukleotydu lub polipeptydu, który różni się od odnośnikowego polinukleotydu lub polipeptydu, ale zachowuje zasadnicze właściwości. Typowy wariant polinukleotydu różni się sekwencją nukleotydową od innego polinukleotydu odnośnikowego. Zmiany w sekwencji nukleotydowej wariantu mogą zmieniać lub nie sekwencję aminokwasów polipeptydu kodowanego przez odnośnikowy polinukleotyd. Zmiany nukleotydów mogą dawać podstawienia aminokwasów, addycje, delecje, fuzje i obcięcia w polipeptydzie kodowanym przez sekwencję odnośnikową, jak omówiono to poniżej. Typowy wariant polipeptydu różni się sekwencją aminokwasów od innego polipeptydu odnośnikowego. Na ogół różnice są ograniczone tak, że sekwencje odnośnikowego polipeptydu i wariantu są ogólnie bardzo podobne, a w wielu regionach są identyczne. Wariant i polipeptyd odnośnikowy mogą różnić się w sekwencji aminokwasów pod względem jednej lub więcej substytucji, addycji, delecji w dowolnej kombinacji. Podstawiona lub wstawiona reszta aminokwasu może być lub nie być taką, która jest kodowana przez kod genetyczny. Wariant polinukleotydu lub polipeptydu może być naturalnie występującym, takim jak wariant alleliczny, lub może być wariantem, który nie występuje naturalnie. Niewystępujące naturalnie warianty polinukleotydów i polipeptydów mogą być przygotowane za pomocą technik mutagenezy lub za pomocą syntezy bezpośredniej.

„Choroba (choroby) oznacza dowolną chorobę spowodowaną przez lub związaną z zakażeniem przez bakterie i obejmuje na przykład zakażenie górnych dróg oddechowych, inwazyjne choroby bakteryjne, takie jak bakteriemia i zapalenie opon mózgowych.

PL 197 449 B1

P r z y k ł a d y

Przykłady poniżej przeprowadzone są standardowymi technikami, które są dobrze znane i rutynowe dla specjalistów, o ile nie jest inaczej szczegółowo podane. Przykłady są ilustracjami, ale nie ograniczają wynalazku.

P r z y k ł a d 1: Ujawnienie i sekwencjonowanie DNA genu BASB029 z dwóch szczepów N. meningitidis w celu potwierdzenia

A. BASB029 w szczepie N. meningitidis ATCC13090 serogrupy B

Gen BASB029 Sek. Id. Nr: 1 najpierw wykryto w bazie danych Incyte PathoSeq zawierającej niewykończone sekwencje genomowego DNA N. meningitidis szczep ATCC13090. Translacja sekwencji polinukleotydu BASB029 przedstawionej na Sek. Id. Nr: 2 wykazała znaczące podobieństwo (52% identyczności w zachodzącej sekwencji 582 aminokwasów) do białka włókienka powierzchniowego Haemophilus influenzae (HSF).

Sekwencję genu BASB029 dalej potwierdzono eksperymentalnie. W tym celu genomowy DNA wyekstrahowano z 10⁹ komórek szczepu N. meningitidis (szczep ATCC 13090) stosując zestaw do ekstrakcji genomowego DNA QIAGEN (Qiagen Gmbh) i 1 μg tego materiału poddano amplifikacji reakcją łańcuchową polimerazy stosując startery Hsf1 (5' - GGG GCCA TAT GAA CAA AAT ATA CCG CAT CAT TTG GAA-3') (Sek. Id. Nr: 5) zawierający wewnętrzne miejsce Ndel (podkreślone) i Hsf2 (5' - GGG GCT CGA GCC ACT GAT AAC CGA CAG ATG CGG A-3') (Sek. Id. Nr: 6) zawierający wewnętrzne miejsce Xhol (podkreślone). Ten produkt PCR oczyszczono w żelu i poddano sekwencjonowaniu DNA stosując zestaw Big Dye Cycle Sequencing (Perkin-Elmer) i sekwenator DNA ABI 373A/PRISM. Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono na obu niciach z nadmiarem 2 i sekwencję pełnej długości zmontowano stosując program SeqMan z pakietu oprogramowania DNASTAR Lasergene. Powstała sekwencja DNA okazała się w 100% identyczna z Sek. Id. Nr: 1.

B. BASB029 w szczepie N. meningitidis H44/76 serogrupy B

Sekwencję genu BASB029 określono również w innym szczepie N. menigitidis serogrupy B, szczepie H44/76. W tym celu wyekstrahowano genomowy DNA ze szczepu H44/76 N. meningitidis stosując warunki eksperymentalne podane w przykładzie 1. Ten materiał (1 μg) poddano amplifikacji DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy stosując startery Hsf1 i Hsf2 specyficzne dla genu BASB029. Uzyskano fragment DNA 4389 bp, strawiono endonukleazami restrykcyjnymi NdeI/XhoI i wstawiono do odpowiednich miejsc wektora do klonowania/ekspresyjnego pET-24b (Novagen) stosując standardowe techniki biologii molekularnej (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wydanie 2, red: Sambrook, Fritsch i Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989). Zrekombinowany pET-24b/BASB029 następnie poddano sekwencjonowaniu DNA stosując zestaw Big Dyes (Applied Biosystems) i Analizowano na sekwenatorze DNA ABI 373/A w warunkach opisanych przez dostawcę. W wyniku uzyskano sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję polipeptydu, które określano jako Sek Id Nr: 3 i Sek. Id. Nr: 4, odpowiednio. Stosując program PILEUP z pakietu oprogramowania GCG przyrównano sekwencje polinukleotydów Sek. Id. Nr: 1 i Sek. Id. Nr: 3 i jest ona przedstawiona na figurze 1, ich poziom identyczności wynosi 96,8% jak określono według programu GAP. Stosując ten sam program PILEUP przeprowadzono przyrównanie sekwencji polipeptydowych z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4 i przedstawiono na figurze 2, ich poziom identyczności wynosi 94,2% według programu GAP. Razem dane te wskazują na silną konserwację sekwencji BASB029 wśród dwóch szczepów N. meningitidis serogrupy B.

P r z y k ł a d 2. Ekspresja i oczyszczenie zrekombinowanego białka BASB029 w Escherichia coli

Konstrukcję wektora do klonowania/ekspresji pET-24b/BASB029 opisano w przykładzie 1B. Wektor ten niesie gen BASB029 wyizolowany ze szczepu H44/76 w postaci fuzji z sekwencją 6 reszt histydyny, umieszczonych pod kontrolą silnego promotora genu 10 bakteriofaga T7. Dla badania ekspresji wektor wprowadzono do szczepu Escherichia coli Novablue (DE3) (Novagen), w którym gen na polimerazę T7 jest umieszczony pod kontrolą promotora lac regulowanego przez izopropylo-beta-D-tiogalaktozyd (IPTG). Płynne hodowle (100 ml) zrekombinowanego szczepu E. coli Novablue (DE3) (pET-24b/BASB029) hodowano w 37°C z mieszaniem aż do gęstości optycznej 0,6 przy 600 nm (OD600). W tym momencie dodano IPTG do końcowego stężenia 1 mM i hodowlę prowadzono jeszcze 4 godziny. Hodowlę następnie odwirowano przy 10000 obr./min i osad zamrożono w -20°C na przynajmniej 10 godzin. Po rozmrożeniu osad zawieszono w ciągu 30 min w 25°C w buforze A (6M chlorowodorek guanidyny, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris, pH 8,0), przepuszczono trzy razy przez igłę i klarowano za pomocą wirowania (20000 obr./min, 15 min). Próbkę następnie naniesiono przy tempie

PL 197 449 B1 przepływu 1 ml/min, na kolumnę Hitrap naładowaną Ni2+ (Pharmapia Biotech). Po przepuszczeniu przepływu, kolumnę płukano kolejno 40 ml buforu B (8 M mocznik, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris pH 8,0), 40 ml buforu C (8 M mocznik, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris pH 6,3). Zrekombinowane białko BASB029/His6 następnie eluowano z kolumny 30 ml buforu D (8 M mocznik, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris pH 8,0) zawierającego 500 mM imidazol i zbierano frakcje po 3 ml. Jak pokazano na fig. 3 (ścieżka 3) z kolumny wyeluowano wysoce oczyszczone białko BASB029/His6 (czystość szacowana na ponad 90% przy barwieniu Coomassie) migrujące przy 66 kDa (szacowana względna masa cząsteczkowa). Ten polipeptyd reagował z mysim monoklonalnym przeciwciałem powstałym przeciw motywowi 5 histydyn (zobacz figura 3, ś cież ka 2). Dane te w sumie wskazują , ż e gen BASB029 moż e być wyrażany i oczyszczany w postaci zrekombinowanej (BASB029/His6) z E. coli.

P r z y k ł a d 3. Immunizacja myszy zrekombinowanym BASB029

Częściowo oczyszczone zrekombinowane białko BASB029 wyrażone w E. coli wstrzyknięto trzy razy myszom Balb/C w dniach 0, 14 i 29 (8 zwierząt/grupę). Zwierzęta poddawano iniekcji drogą podskórną około 5 μg antygenu w dwóch różnych preparatach: albo zaadsorbowane na 100 μg AlPO₄ albo formułowane w emulsji SBAS2 (emulsja SBAS2 zawierająca 5 μg MPL i 5 μg QS21 na dawkę). Do eksperymentu dodano również negatywną grupę kontrolną złożoną z myszy immunizowanych tylko emulsją SBAS2. Myszy skrwawiano w dniu 29 (15 dni Post II) i 35 (6 dni po III) w celu wykrycia specyficznych przeciwciał anty-BASB029. Specyficzne przeciwciała anty-BASB029 mierzono w łącznych surowicach (z 10 myszy/grupę) za pomocą techniki Western dla sześciu różnych szczepów NmB (fig. 4 i 5).

Rozpoznawanie epitopów BASB029 na różnych szczepach NmB za pomocą techniki typu Western

W tym teście surowice immunizowanych myszy (połączone) badano techniką typu Western pod kątem rozpoznawania epitopów BAB029 na sześciu różnych szczepach B Neisseria meningitidis: H44/76 (B:15:P1.7, 16, linia ET-5), M 97 250987 (B:4:P1.15), BZ10 (B:2b:P1.2, linia A4), BZ198 (B:NT*:-, linia 3), EG328 (B:NT*:-, linia ST-18) i ATCC 13090 Men B, jak i częściowo oczyszczonym zrekombinowanym białku BAB029 (*: NT: nie poddawany typowaniu).

Pokrótce 10 μl (>10⁶ komórek/ścieżkę) każdej próbki traktowanej buforem do próbek (10 min w 95°C) umieszczono na żelu gradientowym SDS-PAGE (Tris-glicyna 4-20%, Novex, nr kodu EC60252). Migracja elektroforetyczna zachodziła przy 125 woltach przez 90 min. Następnie białka przenoszono na arkusz nitrocelulozy (0,45 μm, Bio-Rad, nr kodu 162-0114) przy 100 woltach przez 90 minut stosując system Trans-blot Bio-Rad (nr kodu 170-3930). Filtr blokowano PBS - 0,05% Tween 20 przez noc w temperaturze pokojowej przed inkubacją z surowicami mysimi zawierającymi przeciwciała przeciw BASB029 pochodzącego zarówno z kombinacji z AlPO4 i SBAS2. Surowice te rozcieńczano 100 razy w PBS - 0,05% Tween 20, i inkubowano na arkuszu nitrocelulozy przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z łagodnym wytrząsaniem stosując zestaw miniblotter (Miniprotean, Bio rad nr kodu 170-4017). Po trzech powtórzonych płukaniach w PBS - 0,05% Tween 20 przez 5 min arkusz nitrocelulozy inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godz. z łagodnym wytrząsaniem z odpowiednim koniugatem (biotynylowane przeciwciało Ig z owcy przeciw myszy, Amersham nr kodu RPN1001) rozcieńczone 1/500 w tym samym buforze do płukania. Membranę płukano trzy razy jak poprzednio i inkubowano 30 min z mieszaniem stosując kompleks streptawidyna - peroksydaza (Amersham nr kodu 1051) rozcieńczony 1/1000 w Buforze do płukania. Po trzech ostatnich powtórzonych etapach płukania, wywołanie zachodziło w czasie inkubacji przez 20 min w 50 ml roztworu zawierającego 30 mg 4-chloro-1-naftolu (Sigma), 10 ml metanolu, 40 ml PBS i 30 μl H₂O₂. Barwienie stopowano podczas płukania membrany kilkakrotnie w wodzie destylowanej.

Wyniki zilustrowane na fig. 4 i 5 pokazują, że wszystkie badane szczepy wykazywały oczekiwany prążek około 65-70 kDa i dwa inne główne prążki około 55 i 90 kD, które są blisko spokrewnione z białkiem BASB029 (polimery, produkty degradacji). Oznacza to, że białko BASB029 jest wyrażane w większości, jeżeli nie we wszystkich, szczepach NmB. Na fig. 4 zrekombinowane białko BASB029 widoczne jest jako cztery różne białka, dwa o oczekiwanych masach cząsteczkowych 65-70 kDa i dwa inne o bardzo (wysokich) masach cząsteczkowych (> 200 kDa), które są prawdopodobnie agregatami zrekombinowanego białka BASB029.

P r z y k ł a d 4. Obecność przeciwciał anty-BASB029 w surowicach rekonwalescentów

W tym teście badanoj surowice rekonwalescentów techniką typu western pod kątem rozpoznawania oczyszczonego zrekombinowanego białka BASB029.

PL 197 449 B1

Pokrótce, częściowo 5 μg częściowo oczyszczonego białka BASB029 NmB umieszczono w gradiencie żelu SDS-PAGE (4-20%, Novex, nr kodu EC60252) w celu migracji elektroforetycznej. Białka przenosi się na arkusz nitrocelulozy (0,45 μm, Bio-Rad, nr kodu 162-0114) przy 100 woltach przez 1 godzinę stosując system Trans-blot Bio-Rad (nr kodu 170-3930). Następnie filtr blokowano PBS - 0,05% Tween 20 przez noc w temperaturze pokojowej przed inkubacją z ludzkimi surowicami. Surowice te rozcieńczano 100 razy w PBS - 0,05% Tween 20, i inkubowano na arkuszu nitrocelulozy przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z łagodnym wytrząsaniem stosując zestaw miniblotter (Miniprotean, Bio rad nr kodu 170-4017). Po trzech powtórzonych płukaniach w PBS - 0,05% Tween 20 przez 5 min arkusz nitrocelulozy inkubowano w temperaturze pokojowej z łagodnym wytrząsaniem z odpowiednim koniugatem (biotynylowane przeciwciało Ig z owcy anty-ludzkie, Amersham nr kodu RPN1003) rozcieńczone 1/500 w tym samym buforze do płukania. Po ostatnich trzech płukaniach membranę inkubowano 30 min z mieszaniem stosując kompleks streptawidyna-peroksydaza (Amersham nr kodu 1051) rozcieńczony 1/1000 w buforze do płukania. Po ostatnich trzech powtórzonych etapach płukania, wywołanie zachodziło w czasie inkubacji przez 20 min w 50 ml roztworu zawierającego 30 mg 4-chloro-1-naftolu (Sigma), 10 ml metanolu, 40 ml PBS i 30 μl H₂O₂. Barwienie stopowano podczas płukania membrany kilkakrotnie w wodzie destylowanej.

Wyniki zilustrowano na fig. 6 i 7 i pokazują, że u wszystkich 7 rekonwalescentów występuje reakcja przeciw zrekombinowanemu białku BASB029 około 65-70 kDa, podczas gdy dwa górne prążki (>200 kDa) są też rozpoznawane przez większość z nich, podczas gdy niektóre reagują słabo. Reaktywności przeciw białkom o wysokiej masie cząsteczkowej potwierdzają, że te dwa prążki są ściśle spokrewnione z białkiem BASB029, które prawdopodobnie występuje w postaci zagregowanej. W części A fig. 6 i 7 te same reakcje przeciwko tym czterem prążkom widać z surowicami immunizowanych myszy. To jasno potwierdza, że wszystkie te cztery prążki są spokrewnione ze zrekombinowanym białkiem BASB029. Negatywne surowice myszy nie reagują ze zrekombinowanym białkiem jak pokazano na fig. 7.

Zdeponowane materiały

Depozyt zawierający szczep serogrupy B Neisseria meningitidis został zdeponowany w American Type Culture Collection (tutaj „ATCC) 22 czerwca 1997 i przypisano mu numer depozytu 13090. Depozyt opisano jako Neisseria meningitidis (Albrecht i Gbon) i jest on zliofilizowaną biblioteką o wstawkach 1,5-2,9 kb skonstruowaną z izolatu N. meningitidis. Depozyt jest opisany w Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon 8:1-15 (1958).

Szczep Neisseria meningitidis jest tu określany jako „zdeponowany szczep lub jako „DNA zdeponowanego szczepu.

Zdeponowany szczep zawiera gen BASB029 pełnej długości. Sekwencja polinukleotydów w zawarta w zdeponowanym szczepie jak i sekwencje aminokwasów dowolnego kodowanego przezeń polipeptydu są decydujące w razie dowolnego konfliktu z dowolnym tu podanym opisem sekwencji.

Depozyt zdeponowanego szczepu zrobiono w ramach Traktatu Budapeszteńskiego na Międzynarodowym Uznaniem Depozytów Mikroorganizmów dla Celów Procedury Patentowej. Szczep będzie bez ograniczenia i warunków udostępniany po wydaniu patentu. Zdeponowany szczep jest dostarczony wyłącznie dla wygody specjalistów i nie jest przyznaniem, że depozyt jest wymagany dla takiego umożliwienia, jakie jest wymagane pod 35 U.S.C. § 112.

PL 197 449 B1

LISTA SEKWENCJI <110? SmithKline Beecham Biologicals S.A. ' <i2o? Polinukleotydy BASB029 i polipeptydy z Neisseria raeningitidis <130? BM45321 <16 0 > 6 <170? FastSEO fi?r Windowa Version 3.0 <210? 1 <211? 1795 <212? DNA <213? Bacteria <400? 1

dtga.ace.aas	tataccgcac	catttggaat	agtgcectea	acgcctgggt	cgccgcaccc	GO
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tggcgacegc	cgcattggcg	120
acactgttgt	ctgcaacggt	tcaggcgagt	actaccgatg	acgacgattt	acatttagaa	160
cccgtacaac	gcactgctgt	cgtgttgagc	tcccgtcccg	ataaagaagg	cacgggagaa	240
aaagaagtxa	cagaagattc	aaattgggga	gtaCatttcg	acaagaaagg	agcaccaaca	300
gccggaacaa	tcacccicaa	agccggcgac	aacctgaaaa	teaaaeaaaa	caecaatgaa	360
aacaccaatg	ccagcagctt	cacctaetcg	ctgaaaaaag	aectcaeaga	tacgaccagt	420
gc tggaactg	aaaaactacc	gcttagcgca	aacagcaata	aagtcaaeat	caeaagcgac	480
accaaaggct	tgaacttcgc	gaaaaaaacg	gctgagacca	acggdgacac	eacggctcac	540
ctgaacggca	ccggttcgac	tttgaccgat	acgctgdtga	ataccggage	gaceacaaac	600
gtaaccaacg	acaacgctac	cgatgacgag	aaaaaacgtg	cggdaagcgt	taaagacgta	660
tcaa&cgcag	gccggaacat	taaaggcgtt	aaacccggta	caacagcttc	cgataaćgtc	720
gat Ltcgtce	gcacttacga	cacagtogag	ttcttgagcg	cagatacgaa	aacaacgact	730
gttaatgtgg	aaagcaaa^a	eaacggeaag	agaaccgaag	ttaaaatcgg	tgcgaagact	B40
tctgttatca	aagaaaaaga	cggtaagttg	gttaccggta	aagacaaagg	cgagaacgat	300
tcttctacag	acaaaggoga	aggettagtg	actgcaaaag	aagtgattga	tgcagtaaac	350
aaggctggtt	ggagaatgaa	aa-aacaacc	gctaacggtc	aaacaggtca	agctgacaag	1020
iLtgaaaccg	ttacatcagg	cacaaatgta	accc t tgcca	gtggtaaagg	tacaactgcg	1000
actgtaagta	aagacgarca	aggcaacacc	actgttatgt	atgatgcaaa	tgtcggcgat	1140

PL 197 449 B1

gecctaaacg	tcaatcagct	gcaaaacagc	ggttggaatt	tggattccaa	agcggttgca	1200
ggttctUcgg	geaaagtcat	cagcggcaet	gcttcgccga	gcaagggaaa	gacggatgaa	1260
acegtcaaca	ttaacgccgg	caacaacatc	gagattaccc	gaaacggcaa	aaatatcgac	1320
atcgccacct	cgatgacccc	gcaattttcc	agegtctcgc	tcggagcggg	ggcggatgcg	1380
cccactttaa	gcgtggatga	cgagggcgcg	ttgaatgecg	gcagcaagga	cgc-aacaaa	1440
cccgCeegca	ttscęaatgt	cgccccgggc	gttaasgagg	gggatgttac	aaacgtcgca	1500
caacttsaag	gcgtggcgca	aaacttgaac	aaccacatcg	acaatgcgga	cggcaacgcg	1560
cgtgcgggca	tcgcccaagc	gattgcaacc	gcaggtctgg	ttcaggcgta	tctgcccggc	1620
aagagtatga	cggcgatcgg	cggcggcact	tatcgcggcg	sagccggtta	tgccatcggc	1SHC
cactca&gca	tttccgacgg	cggaaattgg	attatcaaag	gcaCggcttc	cggcaattcg	1740
cgcggucatt	tcggtgcttc	cgcatctgtc	ggttaccagt	ggtaa		1705
<210>	2
<211>	S94
<212>	PRT
<2133	Eacteria

<400ϊ> 2

MeŁ Asn Lys 1

Ile

Tyr 5

Arg

Ile

Ile

Trp

Asn Ser 10

Ala

Leu

Asn

Ala 15

Trp

val

Ala

val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

-

25

30

Thr

vBl

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

Ala

Ser

Thr

Thr

Asp

Asp

Asp

Asp

Leu

Tyr

Leu

Glu

Pro

Val

Gin

Arg

50

55

60

Thr

Ala

val

Val

Leu

Ser

Phe

Arg

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

65

70

75

60

Lys

Glu

Val

Thr

Glu

Asp

Ser

Asn

Trp

Gly

val

Tyr

Phe

Asp

Lys

Lys

85

90

35

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Gly

Thr

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

A3p

Asn

Leu

100

105

110

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Glu

Agn

Thr

Asn

Ala

Ser

Ser

Phe

Thr

115

120

125

Tyr

Ser

Leu

Lys

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Glu

13 D

135

140

Lys

Lau

Ser

Phe

Sar

Ala

Asn

Ser

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

145

150

155

160

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ale

Lys

Lys

Thr

Ala

Glu

Thr

Asn

Gly

Asp

PL 197 449 B1

PL 197 449 B1

Pro

Val

Arg

Ile

Thr 4as

Asn. Val

Ala Pro

Gly 490

Val

Lys

Gin

Gly

Asp 4 95

Val

Thr

Asn

vai

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Asn

His

soo

505

510

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

515

520

525

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Sar

Mec

Met

S3C

535

£40

Ala

Ile

Gly

Gly

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Gly

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

545

550

S55

sęo

Tyr

Ser

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Gly

Asn

Trp

Ile

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

565

570

575

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Sar

Val

Gly

Tyr

SBC 5ΒΞ 5go

Gin Trp <21C> 3 «211:. 1776 <212? DNA <213? Bacterli <400? 3 acgaacaaaa tataccgcac cacctggaat agEgccccca atgcctgggt cgocgCaccc 60 gagctcacac goaaceacac caaacgcgcc tcagcaaccg tgaagaccgc cgcaetggcg 120 acactgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aagagcaaga agaagatcca 160 tacttagacc ccgtacaacg cactgctgcc gtgEcgatag Ccaattccga taaagaaggc 240 acgggagaaa aagaaaaagt agaagaaaat tcagattggg cagcacattt caacgagaaa 300 ggagtactaa cagccajaga aaccaccctc aaagccggcg aeaacctgaa aatcaaaeaa 360 aaeggcacaa acttcaccta ctcgctgaaa aaagacctca cagatetgac cagtgttgga 420 actgaaaaat tatcgtttag cgcaaaeggc aataaagtca acatcacaag cgacaccaaa 460 ggcttgaatt ttgcgaaaga aacggctggg acgaacggcg acaccaeggt tcacetga&c 540 ggtattggtt cgactttgac cgatacgctg ctgaataccg gagcgaecac aaacgtaacc 600 aacgacaacg ttaccgatga cgagaaaaaa cgtgcggcaa gegrtaaaga egtactaaac 660 geaggctgga acitcaaagg cgttaaaccc ggtacaacag cttccgataa cgttgatttc 720 gtccgcactt acgacacagt cgagttcttg agcgcagata cgaaaacaac gactgttaat 700 gtggaaagca aagacaacgg caagaaaacc gaagttaaaa Ecggcgcgaa gacttctgtt 940 attaaagaaa aagacggtna gttggctacc ggtaaagaca aaggcgagaa tggctcttct 900 acagacgaag gcgaaggCCE agrgactgca aaagaagega ttgatgcagt aaacaaggct 960

PL 197 449 B1

ggtcggagaa tgaaaacaac aaccgccaat ggtcaaacag gccaagctga caagttcgaa	1020
accgccacat; caggcacaaa ogtaaccctc gctagtggta aaggtacaac tgcgactgta	1030
agraaagatg atcaaggcaa catcactgct atgtatgatg taaatgtcgg cgatgcccta	1140
aacgtcaatc agctgcaaaa cagcggttgg aatttggact ccaaagcggt tgcaggttct	1200
tcgggcaaag tcatcagegg caatgtttcg ccgagcaagg gaaagatgga tgaaaccgtc	1260
aacattaatg ccggcaacaa catcgagatt acćagcaacg gtaaaaacat cgacatcgcc	1320
acttcgatga ccccgcagct rtccagcgct tęgctcggcg cgggggcgga tgcgcccact	1300
ttgagcgtgg atggggacgc attgaatgtc ggcagcaaga aggacaacaa acccgtccgc	1440
attaccaatg tcgccccggg cgctaaagag ggggatgtta eaaacgtcgc acaacttaaa	1500
ggcgtggcgc aaaacttgaa caaccgcatc gacaatgtgg acggcaacgc gcgrgcgggc	1560
atcgcccaag cgattgcaac cgęag-gtctg gttcaggcgt atttgcccgg caagagcatg	1620
atggcgatcg gcggcggcac ttatcgcggc gaagccggtt acgocatcgg ctactccagt	1600
atttccgacg geggaaattg gattatoaaa ggcacggctt ccggeaattc gcgcggccat	1740
ttcggtgctt ccgcatctgt cggttatcag tggtaa	1776
cUOi 4
c211s. 531
<212 > PHT
<213> Bactcria
<;4 00 > 4
MeC Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Aan Ser Ala Leu Aan Ala Trp
15 10 ie
val Ala Val Ser Glu Lsu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Sar Al*
20 25 30
Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin
35 40 ¢5
Ala Ser Ala Asn Asn Glu. Glu Gin Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro
50 55 60
Val Gin Arg Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly
<55 70 75 BO
Thr Gly Glu Lys Glu Lys val Glu Glu Asn Ser Aap Trp Ala val Tyr
65 30 35
Phe Asn Glu Lys Gly val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala
100 105 110
Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr ser
115 120 12S
Leu Lys Lys Aap Leu Thr Asp Leu Thr Ser val Gly Thr Glu Lys Leu
130 135 140

PL 197 449 B1

ser

Phe

ser

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

vai

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

14 5

ISO

155

160

Gly

Leu

ńsn

Phe

Ala

Lyi

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

Thr

165

170

175

Val

His

Leu,

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Leu

Asn

180

185

190

Thr

Gly

Ala

Thr

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

Asp

Glu

195

200

205

Lys

Lya

Arg

Ala

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

210

215

220

Ile

Lya

Gly

Val

Lya

Pro

Gly

Thr

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

val

Asp

Phe

225

230

235

240

Vg.l

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

245

250

2SS

Thr

Thr

Val

Asn

Val

Glu

ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Lys

Thr

Glu

Val

260

265

270

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

275

260

265

Val

Thr

Gly

Lys

Asp

Lya

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

ser

Thr

Asp

Glu

Gly

290

235

300

Glu

Gly

Leu

val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Aap

Ala

Val

Aaa

Lys

Ala

205

310

315

320

Gly

Trp

Arg

Met

Lya

Thr

Thr

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

325

330

335

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

340

345

350

Gly

Lys

Gly

Thr

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

LyS

Asp

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

355

360

365

Thr

Val

Met

Tyr

Asp

Val

Aan

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

val

Asn

Gin

370

375

3Θ0

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

5er

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

385

390

395

400

Ser

Gly

Lys

val

rie

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

405

410

415

Aap

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Aa π

Ala

Gly

Asn

Asn

Ile

Glu

ile

Thr

Arg

420

425

430

Αξγ.

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

435

440

445

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

PL 197 449 B1

	450	455	460
Gly	Asp Ala Liii Asn Val	Gly Ser Lya Lys Asp	Asn Lys Pro Val Arg
46S	470	475	4S0
Ile	Thr Asn val Ala Pro	Gly Val Lys alu. Gly	Asp Val Thr Asn Val
	485	490	495
Ala	Gin Leu Lys Gly ual	Ala Gin Asn Leu Asn	Asn Arg Ile Asp Asn
	500	505	Sio
vai	Asp Gly Asn Ala Arg	Ala Gly Ile Ala Gin	Ala Ile Ala Thr Ala
	515	520	525
Gly	Leu Val Gin Ala Tyr	Leu Pro Gly Lys Ser	Met Met Ala Ile Gly
	530	535	540
Gly	Gly Thr Tyr Arg Gly	Glu Ala Gly Tyr Ala	Ile Gly Tyr Ser Ser
545	550	555	550
Ile	Ser Asp Gly Gly Asn	Trp Ile Ile Lys Gly	Thr Ala Ser Gly Ann
	5S5	570	575
Ser	Arg Gly His Phe Gly	Ala Ser Ala Ser Val	Gly Tyr Gin Trp
	580	5Θ5	590
	<210s 5
	<211= 36
	<212? DNA
	<213= Sekwencja sztuczna
	<220>
	<223’ Oligonukleotyd
	<40D> S

ggggcatatg aaćaaaatac accgcatcat ttggaa 3E <210> 6 <211:» 34 <212 = DRA <213= Sekwencja sztuczna <220 = <223= Oligonukleotyd <400 = 6 ggggctcgag ccaetgataa ccgacagatg cgga

PL 197 449 B1

Polinukleotydy i polipeptydy z BASB029

Id. Sekw. nr 1 sekwencja polinukleotydowa BASB029 Neisseria meningitidis

ATGAACAAAATATACCGCATCATTTGGAATAGTGCCCTCAATGCCTGGGTCGCCGrATCC gagctcacacgcaaccacaccaaacgcgcctccgcaaccgtggcgaccgccgtattggcg acactgttgtttgcaacgc-ttcaggcgagtactagcgatgacgacgatttatatttagaa cccgtacaacgcactgctgtcgtgttgagcttccgttccgataaagaaggcacgggagaa aaagaagttacagaagattcaaattggggagtatatttcgacaagaaaggagtactaaca gccggaacaatcaccctcaaagccggcgacaacctgaaaatcaaacaaaacaccaatgaa

AACACCAA.TGCCAGTAGCTTCACCTACTCGCTGAAAAAAGACCTCACAGATCTGACCAGT gttggaactgaaaaattatcgtttagcgcaaacagcaataaagtcaacatcacaagcgac accaaaggcttgaatttcgcgaaaaaaacggctgagaccaacggcgacaccacggttcat ctgaacggtatcggttcgactttgaccgatacgctgctgaataccggagcgaccacaaac gtaaccaacgacaacgttaccgatgacgagaaaaaacgtgcggcaagcgttaaagacgta

TTAAACGCAGGCTGGaACATTAAAGGCGTTAAACCCGGTACAACAGCTTCCGATAACGTT

GATTTCGTCCGCACTrACGACACAGTCGAGTTCTTGAGCGCAGATACGAAAACAACGACT gttaatgtggaaagcaaagacaacggcaasagaaccgaagttaaaatcggtgcgaagact

TCTGTTATCAAAGAAAAAGACGGTAAGTTGGTTACTGGTAAAGACAAAGGCGAGAATGAT tcttctacagacaaaggcgaaggcttagtgactgcaaaagaagtgattgatgcagtaaac aaggctggttggagaatgaaaacaacaaccgctaatggtcaaacaggtcaagctgacaag

TTTGAAACCGTTACATCAGGCACAAATGTAACCTTTGCTAGTGGTAAAGGTACAACTGCG

ACTGTAAGTAAAGATGATCAAGGCAACATCACTGTTATGTATGATGTAAATGTCGGCGAT

GCCCTAAACGTCAATCAGCTGCAAAACAGCGGTTGGAATTTGGATTCCAAAGCGGTTGCA

GGTTCTTCGGGCAAAGTCATCAGCGGCAATGTTTCGCCGAGCAAGGGAAAGATGGATGAA accgtcaacattaatgccggcaacaacatcgagattacccgcaacggcaaaaatatcgac atcgccacttcgatgaccccgcaattttccagcgtttcgctcggogcgggggcggatgcg cccactttaagcgtggatgacgagggcgcgttgaatgtcggcagcaaggatgccaacaaa cccgtccgcattaccaatgtcgccccgggcgttaaagagggggatgttacaaacgtcgca caacttaaaggcgtggcgcaaaacttgaacaaccacatcgacaatgtggacggcaacgcg cgtgcgggcatcgcccaagcgattgcaacćgcaggtctggttcaggcgtatctgcccggc aagagtatgatggcgatcggcggcggcacttatcgcggcgaagccggttatgccatcggc tactcaagcatttccgacggcggaaattggatiatcaaaggcacggcttccggcaattcg cgcggccatttcggtgcttccgcatctgtcggttatcagtggtaa

Id. Sekw. nr 2 sekwencja polipeptydowa BASB029 Neisseria meningitidis wywnioskowana z Id. Sekw. nr 1

MNKIYRIIWNSAI®AWVAVSELTRKHTKXASATVATAVLATLI,FATVQASTrDDDDI,YLE ρν0ΕΤΑννΤ2ΓΗ.5ΏΚΕαΤΕΕΚ£νΤΕ05ΝΜσνΥΕθΚΚΕνΕΤΑΟΤΙΤΏΚΑαΏΝΙ.1<ΪΚ(2ΝΤΜΕ

PL 197 449 B1

NTNAS S FT YS LKXD LTDLTSVGT E KLS FSANSNKVNITSDTKGLNFAKKTAE TNGDTTW lngigstltdtllntgattwvtndnvtddekkeaasvkdvlnagwnikgvkpgttasdnv □FVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKRTSVXIGAKTSVIKEKrX3KE.VTGKDKGEND

S3TDKGEGLVTAK£VIDAVNKAGWE:MKTTTANG0TGQADKFETVTSGTNVTFASGKGTTA

TVSKDDQGNITVMYDVNVGDALNVNQLQNSGWNLDSKAWAGSSGKVISGNVSPSKGKMDE

TVNINAGNMlElTElfGKNlDIATSMTPQFSSVSLGAGAnAPTLSVDDEGALiJVGSia3AIiK

PVA1TNVAPGVkEGDVTNVaqlXGVAQKLIIWHIDNVBGHARAGIAQAIATaGLVQAYLPG ksmmaigggtyrgeagyaigyssisdggnwiixgtasgnsrghfgasasvgyqw

Id. Sekw. nr 3 sekwencja polinukleotydowa BASB029 szczepu H44/76 Neisseria meningitidis

ATGAACAAAATATACCGCATCATTTGGAATAGTGCCCTCAATGCCTGGGTCGCCGTATCC

GAGCTCACACGCAACCACACCAAACGCGCCTCCGCAACCGTGAAGACCGCCGTATTGGCG

ACACTGTTGTTTGCAACGGTTCAGGCAAGTGCTAACAATGAAGAGCAAGAAGAAGATTTA

TATTTAGACCCCGTACAACGCACTGTTGCCGTGTTGATAGTCAATTCCGATAAAGAAGGC acgggagaaaaagaaaaagtagaagaaaattcagattgggcagtatatttcaacgagaaa ggagtactaacagccagagaaatcaccctcaaagccggcgacaacctgaaaatcaaacaa aacggcacaaacttcacctactcgctgaaaaaagacctcacagatctgaccagtgttgga actgaaaaattatcgtttagcgcaaacggcaataaagtcaacatcacaagcgacaccaaa ggcttgaattttgcgaaagaaacggctgggacgaacggcgacaccacggttcacctgaac ggtattggttcgactttgaccgatacgctgctgaataccggagcgaccacaaacgtaacc aacgacaacgttaccgatgacgagaaaaaacgtgcggCaagcgttaaagacgtattaaac gcaggctggaacattaaaggcgttaaacccggtacaacagcttccgataacgttgatttc gtccgcacttacgacacagtcgagttcttgagcgcagatacgaaaacaacgactgttaat

GTGGAAAGCAAAGACAACGGCAAGAAAACCGAAGTTAAAATCGGTGCGAAGACTTCTGTT attaaagaaaaagacggtaagttggttactggtaaagacaaaggcgagaatggttcttct acagacgaaggcgaaggcttagtgactgcaaaagaagtgattgatgcagtaaacaaggct ggttggagaatgaaaacaacaaccgctaatggtcaaacaggtcaagctgacaagtttgaa accgttacatcaggcacaaatgtaacctttgctagtggtaaAggtacaactgcgactgta agtaaagatgatcaaggcaacatcactgttatgtatgatgtaaatgtcggcgatgcccta aacgtcaatcagctgcaaaacagcggttggaatttggattccaaagcggttgcaggttct tcgggcaaagtcatcagcggcaatgtttcgccgagcaagggaaagatggatgaaaccgtc aacattaatgccggcaacaacatcgagattacccgcaacggtaaaaatatcgacatcgcc acttcgatgaccccgcagttttccagcgtttcgctcggcgcgggggcggatgcgcccact ttgagcgtggatggggacgcattgaatgtcggcagcaagaaggacaacaaacccgtccgc attaccaatgtcgccccgggcgttaaagagggggatgttacaaacgtcgcacaacttaaa ggcgtggcgcaaaacttgaacaaccgcatcgacaatgtggacggcaacgcgcgtgcgggc atcgcccaagcgattgcaaccgcaggtctggttcaggcgtatttgcccgggaagagtatg atggcgatcggcggcggcacttatcgcggcgaagccggttacgccatcggctactccagt atttccgacggcggaaattggattatcaaaggcacggcttccggcaattcgcgcggccat ttcggtgcttccgcatctgtcggttatcagtggtaa

PL 197 449 B1

Id. Sekw. nr 4 sekwencja polipeptydowa BASB029 szczepu H44/76 Neisseria meningitidis wywnioskowana z Id. Sekw. nr 3

MNKIYRIIWNSALNAWVAVSELTRNHTKRASATVKTAVLATI,LFATVQASANNEEQEEDL YLDPVQRTVAVXIVNSDKEGTGEKEKVEENSDWAVYFNEKGVLTAREITLKAGDNIjKIKQ NGTNFTYSIjKKDLiTDLTSVGTEKLSFSANGNKVNITSDTKGIiNFAKETAGTNGDTTVHIiN GIGSTLTDTLLNTGATTl!rVTlWNVTODEKKRAASVKDVŁNAGWIKGVKPGTTASDNVDF vrtydtveflsadtktttvnveskdmgkktevkigaktsvikekdgklvtgkdkgeitgss TDEGEGLVTAKEVIDAWKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGTNVTFASGKGTTATV S KDDQGNITVMYD vnvgd alnvnqlqns GWNLDS KAVAGS s gkvi s gnvs p s kgkmdetv NINAGNNIEITRNGraTIDIATSMTPQFSSVSLGAGADAPTljSVDGDALNVGSKKDNrKPVR ITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAXATAGLVQAYLPGKSM MAIGGGTYRGEAGYAIGYS SIS DGGNWIIKGTAS GNS RGHFGAS AS VGYQ W

SEQ ID NO:5

GGG GCA TAT GAA CAA AAT ATA CCG CAT CAT TTG GAA

SEQ ID NO:6

GGG GCT CGA GCC ACT GAT AAC CGA CAG ATG CGG A

Claims (24)

1. Wyizolowany polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową, która ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4 na całej długości tych sekwencji, odpowiednio.

2. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa ma przynajmniej 95% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4 na całej dł ugoś ci tych sekwencji, odpowiednio.

3. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4.

4. Wyizolowany polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. Nr: 4.

5. Immunogenny fragment polipeptydu określonego w zastrz. 1-4, znamienny tym, że jest zdolny do wzbudzenia immunogennej odpowiedzi, która rozpoznaje polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. i Nr: 4.

6. Immunogenny fragment polipeptydu według zastrz. 5, znamienny tym, że jest i związany z noś nikiem.

7. Wyizolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową o Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. Nr: 4 na całej długości tych sekwencji odpowiednio, lub sekwencję nukleotydową komplementarną do tego wyizolowanego polinukleotydu.

8. Wyizolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową, która ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. Nr: 4 w cał ym regionie kodują cym lub sekwencję nukleotydową komplementarną do tego wyizolowanego polinukleotydu.

PL 197 449 B1

9. Wyizolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową, która ma przynajmniej 85% identyczności z Sek. Id. Nr: 1 lub 3 na całej długości tych sekwencji odpowiednio lub sekwencję nukleotydową komplementarn ą do tego wyizolowanego polinukleotydu.

10. Wyizolowany polinukleotyd określony w zastrz. 9, znamienny tym, że identyczność z Sek. Id. Nr: 1 lub Sek. Id. Nr: 3 wynosi przynajmniej 95%.

11. Wyizolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. Nr: 4.

12. Wyizolowany polinukleotyd zawierający polinukleotyd o Sek. Id. Nr: 1 lub Sek. Id. Nr: 3.

13. Wyizolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd o Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. Nr: 4, które można uzyskać przez przeszukiwanie odpowiedniej biblioteki w ostrych warunkach hybrydyzacji ze znakowan ą sondą mając ą sekwencję o Sek. Id. Nr: 1 lub Sek. Id. Nr: 3 lub ich fragmentem.

14. Wektor ekspresyjny lub wyizolowany żywy mikroorganizm, znamienny tym, że zawiera wyizolowany polinukleotyd określony w zastrz. 7-13.

15. Komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny określony w zastrz. 14 lub subkomórkowa frakcja, lub błona tej komórki gospodarza wyrażająca wyizolowany polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową, która ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy złożonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4.

16. Sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową, która ma przynajmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową wybran ą z grupy złożonej z Sek. Id. Nr: 2 i Sek. Id. Nr: 4, znamienny tym, ż e obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 15 w warunkach wystarczających do wytwarzania polipeptydu i odzyskanie polipeptydu z podłoża hodowlanego.

17. Sposób ekspresji polinukleotydu określonego w zastrz. 7-14, znamienny tym, że obejmuje transformację komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierającym przynajmniej jeden z wymienionych polinukleotydów i hodowlę tej komórki gospodarza w warunkach wystarczających dla ekspresji wymienionych polinukleotydów.

18. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość polipeptydu określonego w zastrz. 1-4 lub jego immunogenny fragment określony w zastrz. 5-6 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

19. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość polinukleotydu określonego w zastrz. 7-13 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

20. Przeciwciało immunospecyficzne w stosunku do polipeptydu określonego w zastrz. 1-4 lub jego immunogennego fragmentu określonego w zastrz. 5-6.

21. Sposób diagnozowania zakażenia Neisseria meningitidis, znamienny tym, że obejmuje identyfikację polipeptydu określonego w zastrz. 1-4, lub jego immunogennego fragmentu określonego w zastrz. 5-6, lub przeciwciała, które jest immunospecyficzne dla danego polipeptydu, obecnego w próbce biologicznej od zwierzę cia podejrzanego o takie zakaż enie.

22. Zastosowanie kompozycji zawierającej immunologicznie skuteczną ilość polipeptydu określonego w zastrz. 1-4 lub jego immunogennego fragmentu określonego w zastrz. 5-6 do wytwarzania leku stosowanego do wywołania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia.

23. Zastosowanie kompozycji zawierającej immunologicznie skuteczną ilość polinukleotydu określonego w zastrz. 7-13 do wytwarzania leku stosowanego do wywołania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia.

24. Kompozycja terapeutyczna przydatna do leczenia ludzi z chorobą wywołaną przez Neisseria meningitidis, znamienna tym, że zawiera przynajmniej jedno przeciwciało skierowane przeciw polipeptydowi określonemu w zastrz. 1-4 lub jego immunogennemu fragmentowi określonemu w zastrz. 5-6 i odpowiedni nośnik farmaceutyczny.