PL170846B1

PL170846B1 - Method of obtaining novel acyl derivatives of nucleosides and their analogues

Info

Publication number: PL170846B1
Application number: PL92303098A
Authority: PL
Inventors: Are Dalen; Finn Myhren; Bernt Borretzen; Kjell T Stokke
Original assignee: Norsk Hydro As
Priority date: 1991-10-07
Filing date: 1992-09-30
Publication date: 1997-01-31
Also published as: SK39794A3; JP2873313B2; GR3024149T3; CZ288153B6; EP0642525B1; JPH06511249A; IL103351A; UA41296C2; HU219400B; FI990270A0; HK1007430A1; CA2120725C; NO941269L; GB2260319A; CH0642525H1; FI990270A7; US6548486B1; WO1993007163A1; FI941574L; RU2126417C1

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowych acylowych pochodnych nukleozydów i analogów nukleozydów o ogólnym wzorze I: Nu-O-Fa w którym O oznacza tlen, Nu oznacza nukleozyd lub analog nukleozydu a Fa oznacza grupe acylowa ?- 9 mononienasyconego kwasu tluszczowego C18 lub C20, który to kwas tluszczowy jest zestryfikowany grupa hydroksylowa w pozycji 5'-ugrupowania cukrowego nukleozydu lub grupa hydroksylowa niecyklicznego lancucha analogu nu- kleozydu z wylaczeniem 5'-0-oleilo-aracytydyny i 2,2'-anhydro-5'-0-oleilo-ara-cytydyny, znamienny tym, ze nukleozyd lub analog nukleozydu o wzorze: NuOH gdzie Nu ma wyzej podane znaczenie acyluje sie reaktywna pochodna ?-9 mono- nienasyconego kwasu tluszczowego C18 lub C20. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych acylowych pochodnych nukleozydów i analogów nukleozydów.

Znaczna liczba poważnych chorób, takich jak AIDS, zapalenie wątroby B, opryszczka i rak ginekologiczny jako późny rezultat brodawczaków, jest wywoływana przez infekcje wirusowe.

Wirusy są małymi czynnikami infekcyjnymi niezdolnymi do niezależnych replikacji i stąd ich replikacja jest zależna od komórki gospodarza. Materiałem genetycznym wirusa są RNA lub DNA.

Infekując organizm, wirus przyłącza się do specyficznej komórki gospodarza. Po przyłączeniu się wirus przenika przez błonę cytoplazmatyczną i z jego cząstki jest uwalniany genom. Genom wirusowy zostaje zwykle przeniesiony do jądra cząsteczki, gdzie są replikowane nowe genomy. W pobliżu błony cytoplazmatycznej lub jądrowej w cytoplazmie jest syntetyzowane nowe białko wirusowe i tworzą się nowe cząstki.

Materiał genomowy pewnych wirusów jest bezpośrednio (wirus DNA) lub pośrednio (odwrotna transkrypcja RNA, retrowirus) włączany do genomów komórki gospodarza.

Wirusy pozakomórkowe są neutralizowane przez cyrkulujące przeciwciała i komórkowy aparat odpornościowy może atakować i usuwać zakażone komórki. Jeśli antygeny wirusowe nie są eksponowane na powierzchni komórek, wirusy znajdujące się wewnątrz zakażonych komórek unikają kontroli immunologicznej.

Immunizowany atak na zakażone organy wpływa na chorobę przez mechanizm określany zwykle jako indukowana wirusowo immunopatologia.

Mechanizmy decydujące o niektórych ważniejszych chorobach wirusowych są inne.

W przypadku infekcji HIV, zostają zaatakowane i zniszczone komórki pomocnicze T pacjenta. Prowadzi to do stanu niedoboru odpornościowego, który powoduje, że pacjent staje się bardzo podatny nawet na infekcje zwykle zwalczane przez układ odpornościowy bez jakichkolwiek groźnych skutków dla pacjenta.

Wirus zapalenia wątroby B atakuje komórki wątroby i pacjent może poważnie zachorować przy podjęciu przez układ odpornościowy próby uwolnienia organizmu od tych zainfekowanych komórek. Jeśli infekcja nie zostanie zwalczona przez układ odpornościowy we wczesnym stadium, wynikiem będzie przewlekłe zapalenie wątroby. Pacjent będzie w związku z tym zakażony przez całe życie. U szeregu pacjentów przewlekłe zapalenie wątroby rozwinie się w marskość lub raka wątroby.

Przy infekcjach opryszczką zwykłą, wirus początkowo wnika do komórek podskórnych. Wirus opryszczki zwykłej (HSV) wędruje do ośrodka nerwowego, gdzie pozostaje utajony do okresowych wybuchów. Nie stanowiąc w większości przypadków zagrożenia dla życia, zakażenie opryszczką jest bolesne, a pacjent będzie źródłem infekcji przy każdym wybuchu.

W przypadku wirusa brodawczaka, szczególnie w drogach płciowych kobiet, genom wirusowy zostaje umiejscowiony w jądrach komórek nabłonka, lecz nie zostaje włączony do chromosomów komórki. Jest to stan trwały i w przypadku pewnych szczepów wywołujących nowotwór w końcu następuje włączenie, prowadzące do zezłośliwienia. Genom wirusowy ma w tym wypadku decydujący, inicjujący wpływ na proces prowadzący do raka.

Jeśli układ odpornościowy zdoła uwolnić organizm od wirusa we wczesnym stadium, prowadzi to do uodpornienia do końca życia. Z drugiej strony, jeśli wirus jest zbyt agresywny i uniknie aparatu immunologicznego, nie uzyskuje się odporności i rezultatem jest stały stan zakaźny.

Ostatecznym celem przy leczeniu HIV/AIDS powinno być uwolnienie pacjenta od zakażającego wirusa. Cel ten wydaje się obecnie odległy, można jednak wiele osiągnąć przez poprawienie ogólnego stanu pacjenta. Zmniejszenie obciążenia wirusem powinno przedłużyć okres bezobjawowy i zmniejszyć zakaźność, co jest sprawą największej wagi ze względów epidemiologicznych. Wszystkie stosowane obecnie środki przeciwwirusowe

170 846 mają toksyczne działanie uboczne, co obecnie uniemożliwia wystarczająco agresywne leczenie. Ocenia się, że na świecie jest między 250 a 300 milionów nosicieli zapalenia wątroby B. Wiadomo, że u znacznej ich liczby rozwiną się raki wątroby lub niewydolności wątroby spowodowane infekcjami. W ostatnich latach osiągnięto obiecujące wyniki w leczeniu nosicielstwa przez wywoływanie odpowiedzi immunologicznej za pomocą interferonu. Przy tym sposobie postępowania istotne jest ograniczenie obciążenia wirusem, ponieważ skuteczne leczenie ostrego zapalenia wątroby B zmniejszyłoby liczbę przypadków przechodzenia w stan nosicielstwa. Zidentyfikowany ostatnio wirus zapalenia wątroby C powoduje bardzo dużą liczbę przypadków zapalenia wątroby, z których wiele przechodzi w nosicielstwo. Wstępne badania wydają się wskazywać, że stan nosicielstwa może zostać przełamany przez postępowanie terapeutyczne podobne do stosowanego przy zapaleniu wątroby B.

Opryszczki zwykłe 1 i 2, wirusy (HSVI i HSV2) często infekują ludzi, wywołując stan nosicielstwa z nawrotami infekcji miejscowych. Uogólnione infekcje prowadzące do zapalenia mózgu są rzadkie, lecz katastrofalne dla pacjenta. Istnieje duże zróżnicowanie indywidualne częstotliwości infekcji miejscowych. Dla tych pacjentów, u których zostają zaatakowane obszar genitalny lub twarz, stwarza to poważny zdrowotny problem fizyczny, psychiczny i społeczny. Żaden z dotąd opracowanych terapeutycznych sposobów postępowania nie leczy utajonych infekcji komórek w centralnym układzie nerwowym. Celem terapii jest minimalizowanie klinicznych objawów nawrotów, zarówno ich objawów jak i czasu trwania.

Rozpowszechnienie infekcji wirusem brodawczaka narządów płciowych wzrosło gwałtownie po 1980 roku. Obecnie ustalono, że niektóre genotypy są onkogenne, to znaczy, że zapoczątkowują w komórce zmiany, które po okresie utajenia rozwijają się w raka. Wirus brodawczaka dróg płciowych wywołuje długotrwałe infekcje. Czynniki powodujące zezłośliwienie zmian nie są dobrze poznane, lecz ważną rolę przypisuje się układowi odpornościowemu. Uważa się, że te zmiany które wykazują rozwój w ciągu miesięcy i lat rozwijają się do raka. Brodawczaki narządów płciowych nazywane kłykcinami są obecnie leczone metodami fizycznymi, takimi jak usunięcie chirurgiczne, powodowanie martwicy, działanie ciekłym azotem lub tym podobnymi. Brodawki narządów płciowych są początkowo guzami łagodnymi o zmienionych strukturach enzymatycznych, wpływających między innymi na metabolizm analogów nukleozydów. Proleki nukleozydowe wpływają na rozrost episomalny wirusa brodawczaka, zapoczątkowując przez to ustępowanie brodawek.

Zapobiegawcze szczepienie okazało się bardzo skuteczne w ostrych infekcjach takich jak polio, odra, świnka i inne, lecz nie znaleziono skutecznych szczepionek dla wielu innych poważnych infekcji wirusowych.

Pomimo intensywnych usiłowań wyprodukowania podczas ostatniej dekady skutecznych chemoterapeutyków antywirusowych, nie można dziś zaproponować skutecznego sposobu leczenia większości chorób wirusowych. Usiłowania te stały się szczególnie intensywne od pojawienia się HIV i pokrewnych infekcji wirusowych, rozprzestrzeniających się w świecie w alarmującym tempie; wyniki uzyskane za pomocą takich środków jak azydotymidyna (AZT) i acyklowir (aCv) przy AIDS i opryszczce można dotąd określić jako częściowo udane. Te najbardziej obiecujące środki przeciwwirusowe są pochodnymi naturalnie występujących nukleozydów, które zmodyfikowano w grupie zasadowej lub cukrowej, to znaczy są analogami nukleozydów. Nie wykazały one jednak oczekiwanego działania terapeutycznego, ponieważ stosowaniu ich towarzyszą poważne efekty uboczne u niektórych pacjentów, bądź też wykazują małą skuteczność lub jej brak u innych. Ponadto, leczenie tymi środkami jest wyjątkowo kosztowne. Z tych powodów otrzymują je jedynie pacjenci cierpiący z powodu bardzo poważnych infekcji wirusowych, takich jak AIDS. Pacjenci z mniej poważnymi, lecz także bardzo bolesnymi infekcjami wirusowymi są często pozostawiani bez jakiegokolwiek leczenia z pozostawieniem infekcji jej biegowi.

170 846

Nie leczony pacjent przenosi duże obciążenie infekcyjne i stanowi ryzyko dla otaczających go ludzi. Jeśli jest on leczony środkiem przeciwwirusowym, celem jest zmniejszenie obciążenia infekcyjnego, jak też umożliwienie układowi odpornościowemu organizmu zwalczania infekcji. Dalszym celem jest zmniejszenie zaraźliwości i przez to liczby nowych pacjentów i nosicieli.

Tak więc zapotrzebowanie na związki o lepszym wskaźniku terapeutycznym jest oczywiste.

Zapotrzebowanie to jest szczególnie duże w przypadku przewlekłych lub nawracających infekcji wirusowych z niebezpieczną ostrą fazą lub długoterminowymi niekorzystnymi skutkami dla zdrowia lub samopoczucia, takich jak AIDS, zapalenie wątroby B i C, infekcje z grupy opryszczek i brodawczaki wywołane infekcjami wirusowymi. Istnieje podobne zapotrzebowanie na środki przeciwwirusowe do stosowania w leczeniu zwierząt cierpiących na choroby wirusowe.

W celu poprawienia terapeutycznej skuteczności, opracowano pochodne nukleozydów i analogów nukleozydów, które są zmodyfikowane bądź w grupie zasadowej, bądź w cukrowej. W szczególności, w celu poprawienia lipofilowości i zdolności do przechodzenia przez membrany, opracowano estry kwasów tłuszczowych nukleozydów lub analogów nukleozydów.

Z opisu patentowego EP 56 265 (Lobering i in.) znane są estry arabinofuranozylotyminy (Ara T) z nasyconymi kwasami tłuszczowymi o 1-17 atomach C.

Z PCT/W090/00555 (Hostetler i in.) znane są pochodne lipidowe przyłączone, zwłaszcza przez grupę fosforanową, do pozycji 5' grupy pentozowej nukleozydu. Celem otrzymania tej pochodnej było spowodowanie, by nukleozyd stał się bardziej lipofilowy i przez to mógł był włączony do liposomów, które są wybiórczo wchłaniane przez makrofagi i monocyty, komórki które okazały się siedliskiem wirusa HIV. Stwierdzono, że dzięki temu osiąga się efekt celowy.

Z opisu patentowego EP 393 920 znane są estry lub amidy nukleozydów lub analogów nukleozydów i nienasyconych, korzystnie polinienasyconych kwasów tłuszczowych C16 lub wyższych. Ustalono, że część kwasową tych cząsteczek korzystnie jest otrzymywać z polinienasyconych kwasów tłuszczowych, takich jak kwas y-linolenowy lub linolowy.

Z opisu patentowego US-A-3 920 630 wiadomo, że 2,2'-anhydro-aracytydyna i jej 5'-0-acylany mają generalnie taką samą aktywność biologiczną i terapeutyczną jak same antywirusowe czynniki ara-cytydyny. Wymieniona jest zwłaszcza 2,2'-anhydro-5'-0-oleilo-ara-cytydyna.

Związek 5'-0-oleilo-Ara C (znany także jako 5'-0-oleilo-ara-cytydyna ujawniony jest w Int. J. Cancer. 37. 149-154 (1986), ale z publikacji tej nie wynika, że ma on własności antywirusowe.

Obecnie stwierdzono nieoczekiwanie, że wybrana grupa mono-estrów kwasów tłuszczowych przeciwwirusowych nukleozydów i analogów nukleozydów, w których kwasem tłuszczowym jest ω-9 mononienasycony kwas C18 lub C20, daje znacznie lepsze wyniki. Związki wytwarzane sposobem według wynalazku są ponadto stosunkowo nietoksyczne, jak wynika z doświadczeń z młodymi myszami, a według obserwacji poczynionych w trakcie prób hodowli tkankowej wykazują ponadto niską cytotoksyczność.

Chociaż jest wiadomo, że zarówno same nukleozydy i analogi nukleozydów jak i same niektóre nienasycone kwasy tłuszczowe wykazują działania przeciwwirusowe, wielkość efektów uzyskanych przy zastosowaniu związków wytwarzanych sposobem według wynalazku wskazuje, że chodzi tu o aktywność nie addytywną, lecz raczej synergiczną.

Mechanizm odpowiedzialny za te efekty nie jest obecnie znany, lecz są one o rząd wielkości lepsze niż dla najściślej pokrewnych związków według dotychczasowego stanu wiedzy. Stąd nie uważa się za prawdopodobne, żeby powstały one jedynie w wyniku efektu membranowego lub efektu celowego.

170 846

Ponadto jest również jasne, co wyniknie z przytoczonych niżej przykładów biologicznych, że ze związkami tymi uzyskano efekty w układach, w których z macierzystymi związkami nukleozydowymi nie można uzyskać żadnych efektów.

Sposobem według wynalazku wytwarza się nowe monoestry o ogólnym wzorze I: Nu-O-Fa w którym O jest tlenem, Nu jest nukleozydem lub analogiem nukleozydu a Fa jest grupą acylową ω-9 mononienasyconego kwasu tłuszczowego C18 lub C20, przy czym kwas tłuszczowy jest zestryfikowany grupą hydroksylową w pozycji 5' części cukrowej nukleozydu lub analogu nukleozydu lub grupę hydroksylową na niecyklicznym łańcuchu analogu nukleozydu. Nukleozydy są cząsteczkami zawierającymi zasadę hetero cykliczną, taką jak cytozyna, uracyl, adenina lub guanina, związana z jednostką rybozy. W analogach nukleozydów bądź zasada, bądź jednostka rybozy została zmodyfikowana. Jednostka rybozy może zostać na przykład zastąpiona inną jednostką cukrową lub łańcuchem niepierścieniowym.

Kwas tłuszczowy jest zestryfikowany grupą hydroksylową w pozycji 5- grupy cukrowej nukleozydu lub grupą hydroksylową niepierścieniowego ugrupowania analogu nukleozydu.

Nukleozyd lub analogi nukleozydu, które mogą być wybrane jako Nu w związku o wzorze I mogą korzystnie odpowiadać wzorowi II:

S-B (II) w którym S jest bądź pochodną monosacharydową wybraną spośród 1-β-D-arabinofuranozy lub 2,3-dideoksy-3-azydo-1-e-D-rybofuranozy, lub wybraną spośród grup

2-hydroksy-etoksymetylowej, 4-hydroksy-3-(hydrok.symetylo)butylowej, 2-hydroksy-l-(hydroksymetylo)etoksymetylowej i 2,3-dihydroksypropoksylowej; B jest zasadą azotową wybraną spośród adeniny, guaniny, cytozyny, uracylu, tyminy i pochodnej tyminy o następującym wzorze:

o

w którym X jest deuterem lub fluorem.

Przykładami tych nukleozydów lub analogów nukleozydów są:

Arabinofuranozylotymina (Ara T)

Arabinofuranozyloadenina (Ara A)

Acyklowir (ACV)

170 846

Azydotymidyna

AZT

Arabinozyd puryny

R=NH₂, NHCH3,

N(CH 3)2 lub OCH,

O

R analog nukleozydu, gdzie R jest grupa niecykliczną

Acyklowir jest przykładem analogu nukleozydu o wzorze przedstawionym wyżej. Inne przykłady grup R w różnych analogach nukleozydów pokazano poniżej:

Istnieje kilka sposobów określania pozycji podwójnych wiązań w kwasach tłuszczowych. W niniejszym zgłoszeniu zastosowano system ω, w którym pozycja podwójnego wiązania w nienasyconych kwasach tłuszczowych jest liczona od końcowej grupy metylowej. Kwas eikozenowy na przykład (C20:1, ω-9) ma w łańcuchu 20 atomów węgla, a wiązanie podwójne znajduje się między 9 i 10 atomami węgla licząc od końca łańcucha.

Okazało się, że wybraną grupę kwasów tłuszczowych które mogą być poddane reakcji z nukleozydami lub analogami nukleozydów z utworzeniem estrów o wyraźnie zaznaczonej aktywności, stanowią tylko ω-9 mononienasycone kwasy tłuszczowe C18 lub C20.

ω-9 kwasami tłuszczowymi C18 lub C20, które związane z nukleozydami lub analogami nukleozydów dają efekt nieoczekiwanie podwyższonej aktywności, są: kwas oleinowy (08:1, (o-9, cis), kwas elaidynowy (08:1, ω-9, trans), kwas eikozenowy (C20:1, (0-9, cis) i (C20:1, ω-9, trans).

Korzystnymi przedstawicielami związków wytwarzanych sposobem według wynalazku są: Ara A-kwas oleinowy, Ara A-kwas elaidynowy, Ara A-kwas eikozenowy, cis, Ara A-kwas eikozenowy, trans, Ara T-kwas oleinowy, Ara T-kwas elaidynowy, Ara T-kwas eikozenowy cis, Ara T-kwas eikozenowy, trans, ACV-kwas oleinowy, ACV-kwas elaidynowy, ACV-kwas eikozenowy, cis, ACV-kwas eikozenowy, trans, AZT-kwas oleinowy, AZT-kwas elaidynowy, AZT-kwas eikozenowy, cis, AZT-kwas eikozenowy, trans. Wzory ich są przedstawione na fig. 4.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku wykazują działanie przeciwwirusowe i mogą wchodzić w skład kompozycji farmaceutycznych lub weterynaryjnych. Kompozycje takie zawierają co najmniej jeden związek o wzorze I, sam lub w połączeniu z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub zaróbką.

Okazuje się również, że niektóre z połączeń mononienasyconych kwasów tłuszczowych z nukleozydami lub analogami nukleozydów są szczególnie odpowiednie dla leczenia pewnych infekcji wirusowych. Tak więc okazuje się, że pochodna AZT z kwasem tłuszczowym jest szczególnie przydatna dla leczenia AIDS.

Podobnie okazuje się, że pochodne Ara T i Ara A z kwasami tłuszczowymi są szczególnie odpowiednie dla leczenia zapalenia wątroby B. Okazuje się też, że estry Ara T będą skuteczne w środkach odpowiednich do leczenia infekcji wywołanej wirusem

1710846 brodawczaka. Dalej okazuje się, że estry kwasów tłuszczowych ACV są szczególnie odpowiednie do leczenia infekcji wywołanej opreszczką.

Jak wspomniano, spowodowanie koniecznej odpowiedzi immunologicznej w celu zwalczenia infekcji wirusowej, takiej jak zapalenie wątroby, może być w pewnych wypadkach zapoczątkowane przez jednoczesne podanie interferonu.

W zależności od tego, jaka infekcja wirusowa ma być leczona i w jakim ta infekcja jest stadium, a także od tego, czy pacjent jest człowiekiem czy zwierzęciem, może mieć miejsce układowe lub miejscowe podawanie związków. Dla podawania miejscowego, ze związków mogą być sporządzane w znany sposób formy użytkowe w każdej postaci dogodnej do podawania na skórę lub błony śluzowe. Przy podawaniu miejscowym, związkom o wzorze I może być nadawana postać maści, kremu, żelu, nalewki, aerozolu, mleczka lub podobna, zawierająca związek o wzorze I w mieszaninie z obojętnymi, stałymi lub ciekłymi nośnikami używanymi zwykle w preparatach do stosowania miejscowego. Szczególnie wskazane jest zastosowanie formy chroniącej składnik aktywny przed utlenieniem lub degradacją.

Preparaty farmaceutyczne zawierające związki o wzorze I mogą również być podawane układowo, jelitowo lub pozajelitowo.

Przy podawaniu jelitowym, ze związków o wzorze I mogą być sporządzane formy na przykład miękkich lub twardych kapsułek żelatynowych, tabletek, granulek, ziaren lub proszków, drażetek, syropów, zawiesin lub roztworów. Przy podawaniu pozajelitowym odpowiednie są preparaty związków o wzorze I jako roztwory, zawiesiny lub emulsje do iniekcji lub infuzji.

Preparaty mogą zawierać obojętne lub farmakodenamicenie aktywne dodatki. Tabletki lub granulaty mogą na przykład zawierać szereg środków wiążących, materiałów wypełniających, nośników lub rozcieńczalników. Preparaty ciekłe mogą występować na przykład w postaci sterylnych roztworów. Kapsułki mogą jako dodatek do substancji aktywnej zawierać materiał wypełniający lub środek zagęszczający. Ponadto mogą być obecne dodatki poprawiające smak a także substancje stosowane zwykle jako środki konserwujące, stabilizujące, zatrzymujące wilgoć oraz emulgujące, sole dla zmiany ciśnienia remotycznugr, bufory i inne dodatki.

Dawkowania według którego są podawane preparaty będą zmieniać się zależnie od sposobu użycia, a także wymagań pacjenta. Ogólnie dzienną dawką dla terapii układowej przeciętnego dorosłego pacjenta będzie około 0,1 - 100 mg/kg ciężaru ciała/dobę, korzystnie 1-20 mg/kg/dobę. Dla podawania miejscowego, odpowiednia maść może zawierać od 0,1 - 10% wagowych czynnika farmaceutycznego, zwłaszcza 0,5 - 5% wagowych.

Jeśli to pożądane, preparat farmaceutyczny może oprócz związku o wzorze I zawierać anteutleniacz, na przykład tokofuroi, N-metylotokoferaminę, butylowany hydrokseanieri, kwas askorbinowy lub butylowa^ hydroksy^um.

Wynalazek eiiustrowanr badaniami i przykładami pruparaeknymi załączono także rysunki na których:

Fig. la przedstawia efekt inhibitujący estrów kwasów tłuszczowych ACV; związki wytwarzane sposobem według wynalazku są porównane ze związkiem ze stanu techniki (iinrienian ACV, zob. EP-A-393920) i estrem C22 mononienasyconym (ω-9) (erukian ACV).

Fig. 1b przedstawia porównanie dwóch związków według wynalazku z macierzystym nuklertedum przy dwóch różnych stężeniach.

Fig. 2 przedstawia działanie inhibitujące osiągnięte przy zastosowaniu estrów Ara T; związek badany porównany jest z nasyconym estrem ze stanu techniki (palmitynian Ara T, EP-56265), maciurzeetem nukiuozydum oraz mononienasyconym C11 estrem Ara T (undecenian Ara T).

Fig. 3 przedstawia porównanie stopnia przeżycia młodych myszy zakażonych HSV 2 po podaniu ACV i elaidynianu ACV.

170 846

Fig. 4 przedstawia pełne struktury najkorzystniejszych związków wytwarzanych sposobem według wynalazku.

Efekty biologiczne

A. Doświadczenia in vitro

Metoda płytek: hodowla tkankowa wirusa.

Wirusowy preparat HSV 2 (3 pasaż izolatu klinicznego) rozcieńcza się do 3 · 10³pfu/wgłębienie a następnie inokuluje na komórkach i inkubuje w ciągu 1 godziny w hodowli tkankowej komórek. Po tym czasie wirus zostaje włączony do komórek.

Komórki te hoduje się następnie w ciągu 24 godzin wobec środka przeciwwirusowego. Potem umieszcza się je w warunkach zamrażania, co prowadzi do rozerwania komórek i w następującym po tym procesie topnienia pojawia się wolny wirus. Przygotowuje się roztwory 1/100 lub 1/10000 i dodaje do świeżych hodowli tkankowych. Inkubacje w ciągu 1 godziny prowadzą do włączenia wirusów do komórek. Dla zapobieżenia międzykomórkowej migracji wirusa przez środowisko, dodaje się karboksymetylocelulozę (CMC). Rozprzestrzenianie się wirusa przez kontakt komórkowy jest w dalszym ciągu efektywne, powodując powstawanie płytek.

Jedna płytka reprezentuje jednego infekującego wirusa, stąd zliczenie plamek daje dokładne określenie liczby usuniętych infekujących wirusów.

1.1. Estry Acyklowiru

Do hodowli tkankowej rozpuszczonej w dimetylosulfotenku (DMSO) dodano różne środki przeciwwirusowe wytwarzane sposobem według niniejszego wynalazku i według znanego stanu wiedzy zastrzeżone w EP-A-393 920, a także porównywalny ester długołańcuchowego mononienasyconego kwasu tłuszczowego, w stężeniu 0,94 μ mola/1. Stężenie to jest niższe od efektywnego stężenia inkubatorowego acyklowiru w użytym szczepie Herpes Simplex 2. Wyniki przedstawiono na fig. 1a. Jak wynika z fig. 1a, estry nukleozydów z kwasami tłuszczowymi według wynalazku mają nawet przy tych stężeniach działanie inhibitujące wobec wirusa o rzędy wielkości lepsze niż macierzysty związek acyklowir.

Figura la ukazuje również zwiększone działanie inhibitujące w porównaniu ze związkami według dotychczasowego stanu wiedzy reprezentowanymi przez y-linolenian (C18:3 w-3) ACV, a także w porównaniu z estrem nukleozydu z mononienasyconym kwasem tłuszczowym o dłuższym łańcuchu, erukianem (C22:1 w-9), z wiązaniem nienasyconym w tym samym miejscu łańcucha. Działania inhibitujące uzyskane przy zastosowaniu trzech przedstawicieli obecnych związków są bliskie 100%.

Wpływ wzrastających stężeń jest przedstawiony na fig. 1b. W próbie ze szczepem HSV 2, stosunkowo odpornym na ACV, badane związki, ACV, oleinian ACV i elaidynian ACV dodano przy 0,9 μ mola/1 lub 2,2 μ mola/1. Jak widać, działanie inhibitujące związków według niniejszego wynalazku silnie wzmaga się przy wyższych stężeniach, podczas gdy działanie macierzystego nukleozydu, ACV, pozostaje na tym samym poziomie.

1.2. Estry Ara T

Odpowiednie doświadczenia zostały przeprowadzone z Ara T, oleinianem Ara T, jednym estrem nasyconego kwasu tłuszczowego reprezentującym dotychczasowy stan wiedzy, palmitynianem (C16:0) Ara T oraz z undecenianem (C11:1, w-1), reprezentującym ester mononienasyconego kwasu tłuszczowego o krótszym łańcuchu. Środki przeciwwirusowe zostały dodane przy stężeniu 3,9 μ mola/1. Wyniki podano na fig. 2.

Jak wcześniej zauważono dla estrów ACV, ester Ara T według niniejszego wynalazku, oleinian Ara T, wykazuje uderzająco poprawioną aktywność inhibitującą. Osiągnięta w tej próbie inhibicja wynosi 100%.

170 846

B. Wyniki uzyskane in vivo - zmniejszona śmiertelność

Wirus opryszczki zwykłej 2

Doświadczenia in vivo przeprowadzono stosując 3-4 tygodniowe samice myszy NMRI. Myszy tego szczepu są wrażliwe na wirusa ludzkiej opryszczki do wieku około 6 tygodni, po czym myszy są stosunkowo odporne. Użyto myszy poniżej tego krytycznego wieku, o ciężarze 13-17 g. Wirusy opryszczki 2 będące izolatami po trzecim pasażu zaszczepiono na lewym płatku usznym stosując standardową procedurę. Po trzech dniach stwierdzono lokalną infekcję. W tych warunkach HSV 2 był wysoce neutropowy i u 95% zwierząt rozwinęło się śmiertelne zapalenie mózgu, zwykle po 7-9 tygodniach. Tak więc HSV 2 jest szczególnie odpowiedni jako układ do oceny skuteczności terapeutycznej przez zliczanie przypadków zapalenia mózgu.

Badane związki były podawane przy bardzo niskich stężeniach w celu lepszej obserwacji różnic skuteczności. Zwierzęta otrzymywały około 12 mg badanego związku na kg ciężaru ciała/dobę wraz z wodą pitną. Związki dodawano do wody pitnej w postaci micelli z dezoksycholanem. Końcowe stężenie wynosiło 0,22 mole/l.

Zarówno grupa kontrolna jak i grupy otrzymujące badane związki obejmowały 10 zwierząt w każdej grupie. Badanymi związkami były elaidynian ACV i ACV w porównaniu z kontrolą. Leczenie rozpoczęto na trzeci dzień od zaszczepienia. Po tym okresie infekcja w centralnym układzie nerwowym była w pełni ustalona. Sporządzono wykres śmiertelności zwierząt i wyniki przedstawiono na fig. 3.

Przedstawiony układ badawczy odpowiada skrajnie ciężkim warunkom. Jak wynika z fig. 3, wszystkie zwierzęta z grupy kontrolnej zmarły w wyniku infekcji. Macierzysty nukleozyd acyklowir nie wykazał przy tym stężeniu żadnego działania terapeutycznego gdy leczenie rozpoczęto po ustaleniu się infekcji, trzeciego dnia po zainfekowaniu. Jak widać, stopień przeżycia ulega poprawie od 0 do 40% u zwierząt otrzymujących elaidynian ACV. Po 21 dniach zwi<^^:^^ta w tej grupie były nastroszone, lecz nie wykazywały oznak zapalenia mózgu.

Preparatyka

Związki o wzorze I mogą ogólnie być otrzymane zgodnie z następującym równaniem reakcji:

zasada

Nu-OH + FaX

----------> Nu-O-Fa

-HX w którym Nu, O i Fa są takie jak podano wyżej a X oznacza Cl, Br, O-CO-R', gdzie R' oznacza Fa, CH3, CH2CH3 lub CF3. Tak więc reakcja polega na acylowaniu nukleozydu lub analogu nukleozydu. Przeprowadza się to przez użycie odpowiednich reaktywnych pochodnych kwasów tłuszczowych, zwłaszcza halogenków kwasowych lub bezwodników kwasowych. Przy stosowaniu halogenku kwasowego, takiego jak chlorek kwasowy, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się jako katalizator trzeciorzędową aminę, taką jak trietyloamina, N,N-dimetyloanilina, pirydyna lub N,N-dimetyloaminopirydyna w celu wiązania uwalnianego kwasu chlorowocowodorowego. Reakcje korzystnie prowadzi się w niereaktywnym rozpuszczalniku, takim jak N,N-dimetyloformamid lub

170 846 chlorowcowany węglowodór, taki jak dichlorometan. Jeśli to pożądane, jako rozpuszczalnik można zastosować każdy z wymienionych wyżej katalizatorów - amin trzeciorzędowych zwracając uwagę, by obecny był jego odpowiedni nadmiar. Temperatura reakcji może zmieniać się między 0°C i 40°C, lecz korzystnie powinna być utrzymywana między 5°C i 25°C. Po okresie 24 do 60 godzin, reakcja będzie zasadniczo zakończona. Postęp reakcji można śledzić stosując chromatografię cienkowarstwową (TLC) i odpowiedni układ rozpuszczalników. Gdy według oznaczenia TLC reakcja jest zakończona, produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym i oczyszcza chromatograficznie i/lub przez krystalizację z odpowiedniego układu rozpuszczalników. Jeśli w nukleozydzie lub analogu nukleozydu są obecne więcej niż jedna grupa hydroksylowa oraz grupy aminowe, może być otrzymana mieszanina związków acylowanych. Poszczególne mono- lub poliacylowane związki mogą zostać rozdzielone, na przykład chromatograficznie.

Dodatkowo zilustrują to następujące przykłady:

Przykład I. 5'-O-Heksafekanoilo-1-e -D-arabinofuranozylotymina.

Do roztworu 1-/3-D-arabinofuranozylotyminy (Ara T) (0,5 g, 1,94xl0'³ mola) w 20 ml bezwodnej pirydyny dodano 3 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku palmitoilu (0,58 g, 2,13x10'³ mola) w 5,5 ml dichlorometanu. Mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej w ciągu 12 godzin, gdy chromatografia cienkowarstwowa wykazała częściowe przereagowanie. Dodano pozostały roztwór chlorku palmitoilu i powstałą mieszaninę mieszano w ciągu 24 godzin. Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha i pozostałość podzielono między 50 ml chloroformu i 50 ml wody. Odwirowanie powstałej emulsji dało w wyniku ciało półstałe, które po przekrystalizowaniu z mieszaniny etanol/heptan 1:1 dało 0,7 g (72%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

1H NMR (DMSO-d₆, 300Mhz) δ: 11,25 (1H, s, N-H), 7, 32 (1H, s, H-6), 6,05 (1H, d, H-1'), 5,65 (1H, d, OH-2'), 5,58 (1H, d, OH-3'), 4,50 (1H, m, H-5'1), 4,15 (1H, m, H-5'₂), 4,02 (1H, m, H-2'), 3,92 (1H, m, H-3'), 3,88 (1H, m, H-4'), 2,31 (2H, t, CH2-COO), 1,75 (3H, s, CH3-5), 1,55 (2H, m, CH2-C-COO), 1,20 (24H, m, CH2), 0,85 (3H, t CH3-CH2).

1³CNMR (DMSO-d₆, 75 Mhz) δ: 172, 81 (COO), 163,78 (CO-4), 150,37 (CO-2),

137,88 (C-6), 107,21 (C-5), 85,29 (C-1') , 81,74 76,06 (C-3'), 74,65 (C-2'),

63,23 (C-5'), 31,26, 28,97, 28,33, 24,44, 22,05 (OH), 13,89 (CH3-CH2), 12,15 (CH3-5).

Przykład II. 5'-O-(cis-9-Heksadecenoiło)-1-e-D-arabinofuranozylotymina.

Do roztworu kwasu cis-9-heksadecenowego (4,0 g, 15,72x10’3 mola) w 40 ml bezwodnego benzenu dodano chlorek oksalilu (1,5 ml, 17,71x10'3 mmola) i mieszaninę mieszano pod azotem w temperaturze 35°C w ciągu 3 godzin. Rozpuszczalnik i nadmiar reagenta usunięto pod głęboką próżnią i pozostałość rozcieńczono 10 ml dichlorometanu, otrzymując zapas roztworu chlorku cis-heksadecenoilu. Do roztworu Ara-T (1,0 g, 3,87x10'³ mola) w 20 ml bezwodnej pirydyny i 10 ml N,N-dimetyloformamidu dodano 2 ml roztworu chlorku i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. W około ośmiogodzinnych odstępach dodano w 1 ml porcjach kolejne 4 ml przygotowanego roztworu. Po trwającym łącznie 60 godzin czasie reakcji usunięto pod głęboką próżnią rozpuszczalniki i pozostałość rozcieńczono 50 ml wody i 50 ml chloroformu. Odwirowanie powstałej emulsji dało w wyniku półstałą masę, którą przekrystalizowano z mieszaniny etanol/heptan, co dało 1,15 g (60%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

Ή NMR (DMSO-d6, 300 Mhz) δ: 11,25 (1H, s, N-H), 7,32 (1H, s, H-6), 6,05 (1H, d, H-1'), 5,65 (1H, d, OH-2'), 5,55 (1H, d, OH-3'), 5,3 (2H, m, -CH=CH-), 4,45 (1H, m, H-5'1), 4,15 (1H, m, H-5'2), 3,98 (1H, m, H-2'), 3,95 (1H, m, H-3'), 3,90 (1H, m, H-4'), 2,35 (2H, t, CH-COO), 1,98 (4H, m, =CH-CH2-), 1,75 (3H, t, CH3-5),

1,52 (2H, m, CH2-C-COO), 1,20 (16H, m, CH2), 0,85 (3H, t, CH3-CH2),

170 846 ⁿCNMR (DMSO-dó, 75 Mhz) δ: 172,31 (CO-4), 149,90 (CO-2), 137,89 (C-6),

129,13 i 129,03 (-CH=CH-), 106,74 (C-5), 84,83 (C-1'), 81,26 (C-4'), 75,59 (C-3'),

74.16 (C-2'), 62,76 (C-5'), 32,98, 30,62, 28,57, 28,50, 28,02, 27,91, 27,84, 27,76, 26,07, 26,03, 23,95, 21,56 (CH₂), 13,39 (CH3-CH2-), 11,68 (CH3-5).

Przykład III. 5'-O-(cis-9''-Oktadecenoilo)-1-e-D-arabinofuranozylotymina.

Do roztworu Ara-T (1,0 g, 3,87 x 10' mola) w 20 ml bezwodnej pirydyny i 10 ml N,N-dimetyloformamidu dodano 2 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku cis-9-oktadecenoilu (2,1 g, 6,98 x 10^ mola) w 6 od dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. Pozostały roztwór chlorku dodano w 2 ml porcjach w około dwunastogodzinnych odstępach. Po łącznie 60 godzinach reakcji odparowano rozpuszczalniki pod głęboką próżnią i pozostałość rozcieńczono 65 ml wody i 65 ml chloroformu. Powstałą emulsję odwirowano i fazę organiczną przemyto solanką, zatężono i pozostałość przekrystalizowano, co dało 1,2 g (60%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

1HNMR (DMSO-d₆, 300 Mhz) δ: 11,28 (1H, s, N-H), 7,35 (1H, s, H-6), 6,05 (1H, d, H-1'), 5,65 (1H, d, OH-2'), 5,55 (1H, d, OH-3'), 5,28 (2H, m, CH=CH), 4,45 (1H, m, H-5't), 4,15 (1H, m, H-5'₂), 3,98 (1H, m, H-2'), 3,95 (1H, m, H-3'), 3,90 (1H, m, H-4'), 2,35 (2H, t, CH2-COO), 1,97 (4H, m, CH₂-CH=), 1,75 (3H, s, CH3-5),

1,52 (2H, m, CH2-C-COO), 1,25 (20H, m, CH2), 0,85 (3H, t, CH3-CH2),

13CNMR (DMSO-d₆, 75mhz) δ: 172,75 (COO), 163,80 (CO-4), 150,39 (CO-2),

137,88 (C-6), 129,58 i 129,49 (CH=CH), 107,21 (C-5), 85,36 (C-1'), 81,79 (C-4'), 76,11 (C-3'), 74,67 (C-2'), 63,26 (C-5'), 33,42, 31,27, 29,08, 29,02, 28,84, 28,68, 28,43, 28,37, 26,54, 24,44, 22,07 (CH₂), 13,86 (CH3-CH2), 12,15 (CH3-5).

Przykład IV. 5'-O-(trans-9''-Oktadecenoilo)-1-e-D-arabinofuranozylotymina.

Do roztworu Ara-T (1,0 g, 3,87 x 10'3 mola) w 20 ml bezwodnej pirydyny i 10 ml N,N-dimetyloformamidu dodano 2 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku trans9-oktadecenoilu (2,1 g, 6,98 x 10'3 mola) w 6 ml dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. Pozostały roztwór chlorku dodano w 2 ml porcjach w około dwunastogodzinnych odstępach. Po łącznie 60 godzinach reakcji odparowano rozpuszczalniki pod głęboką próżnią i pozostałość rozcieńczono 65 ml wody i 65 ml chloroformu. Zwykła obróbka i krystalizacja dała 1,30 g (60%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

¹HNMR (DMSO-dg, 300 Mhz) δ: 11,25 (1H, s, N-H), 7,35 (1H, s, H-6), 6,05 (1H, d, H-1'), 5,65 (1H, d, OH-2'), 5,55 (1H, d, OH-3'), 5,35 (2H, m, CH=CH),

4,45 (1H, m, H-5'r=), 4,15 (1H, m, H-5'2=), 4,0 (1H, m, H-2'), 3,95 (1H, m, H-3'), 3,90 (1H, m, H-4'), 2,35 (2H, t, CH2-COO), 1,93 (4H, m, CH2-CH=), 1,75 (3H, s, CH3-5), 1,51 (2H, m, CH2-C-COO), 1,25 (20H, m, CH2), 0,85 (3H, t, CH3-CH2),

13CNMR (DMSO-d6, 75 MHZ) δ: 172,77 (COO), 163,88 (CO-4), 150,45 (CO-2), 137,98 (C-6), 130,03 i 129,97 (CH=CH), 107,24 (C-5), 85,44 (C-1'), 81,89 (C-4'),

76.17 (C-3'), 74,69 (C-2'), 63,34 (C-5'), 33,48, 31,99, 31,35, 29,06, 20,00, 28,91, 28,78, 28,61, 28,56, 28,44, 28,40, 24,50 i 22,15 (CH₂), 13,90 (CH3-CH2), 12,20 (CH3-5).

Przykład V. 5'-Ó-(cis-1r'-Eikozenoilo)-1-e-D-arabinofuranozylotymina.

Do roztworu Ara-T (1,0 g, 3,87 x 10^ mola) w 20 ml bezwodnej pirydyny i 10 ml N,N-dimetyloformamidu dodano 2 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku ciseikozenoilu (2,1 g, 6,38 x 10’3 mola) w 6 ml dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. Reakcję doprowadzono do końca w zwykły sposób i surowy produkt oczyszczono na kolumnie z silikażelem z 10% metanolu w chloroformie jako układem eluującym. Homogeniczne frakcje odparowano, co dało

1,25 g (58%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

^HNMR (DMSO-d6, 300MHZ) δ: 11,25 (1H, s, N-H), 7,35 (1H, s, H-6), 6,05 (1H, d, H-1'), 5,65 (1H, d, OH-2'), 5,55 (1H, d, OH-3'), 5,32 (2H, m, CH=CH),

4,45 (1H, m, H-5'1), 4,15 (1H, m, H-5'₂), 3,98 (1H, m, H-2'), 3,90 (1H, m, H-3'),

170 846

3,88 (1H, m, H-4'), 2,33 (2H, t, CH2COO), 1,95 (4H, m, CH2-CI H=), 1,75 (3H, s, CHs-5), 1,52 (2H, m, CH2-C-COO), 1,25 (20H, m, CH), 0,95 (3H, t, CH3-CH2) ¹³CNMR (DMSO-d6, 75 Mhz) δ: 172,25 (COO), 163,30 (CO-4), 149,89 (CO-2),

137,38 (C-6), 129,05 (CH=CH), 106,71 (C-5), 84,85 (C-1'), 81,28 (C-4'), 75,60 (C-3'), 74,16 ((^-2'), 62^,7^ (C-5'), 32,99, 30,77, 22,58, 28,34, 28,19, 22,00, 22,88, 26,00, 22,95, 21,58, (CH2), (CH₃=CH2=), 11,65 (CH-5).

Przykład VI. 9'-(2'-(cis-9-OktadecenoHoksy)etoks>ymetylo)guanina.

Do roztworu ACV (2,0 g, 8,89 x 10'³ mola) w 40 ml bezwodnej pirydyny i 10 ml N,N-dimetyloformamidu dodano 4 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku cis5-oktadecenoiiu (4,25 g, 14,12 x 10(3 mola) w 8 ml dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. Pozostały roztwór chlorku dodawano w porcjach 4 ml co 8 godzin. Po 40 godzinach łącznego czasu reakcji usunięto rozpuszczalniki pod głęboką próżnią. Pozostałość zawieszono w 50 ml wody i 100 ml chloroformu. Odwirowanie emulsji dało półstałą masę, którą przekrystalizowano z etanolu, co dało 3,7 g (85%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

¹HNMR (DMSO-d₆, 300MHZ) δ: 10,65 (1H, s, N-H), 7,82 (1H, s, H-8), 6,52 (2H, s, NH), 5,25-5,4 (4H, m, CH-1') i (CH=CH), 4,07 (2H, t, CH2-4'), 3,65 (2H, t, CH-3'),

2,25 (2H, t, CH2-COO), 1,95 (4H, m, CH-CH=), 1,48 (2H, m, CH-C-COO), 1,20 (20¾ m, CH2), 0,85 (3H, t, CH3-CH2=).

13CNMR (DMSO-dó, 75 Mhz) δ: 172,72 (COO), 156,70 (CO-6), 153,85 (C-2), 151,37 (C-4), 137,58 (CH-8), 129,58 (CH=CH), 116,46 (C-5), 71,76 (CH-1'), 66,52 (W), 62,50 (CH2-4'), 32,25, 31,63, 25,02, 28,78, 28,62, 28,54, 28,48, 28,42, 28,35, 26,54, 24,32, 22,03 (CH), 13,97 (CH3-CH2).

Przykład VII. 9'-(2'-(trans-5-Oktadecenυiloksy)etoksyrnetyio)guanma.

Do roztworu ACV (2,0 g, 8,89 x 10'3 mola) w 40 ml bezwodnej pirydyny i 20 ml N,N-dimetyloformamidu dodano 4 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku trans9-oktade-enoiiu (4,25 g, 14,12 x 10'3 mola) w 8 ml dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. Pozostały roztwór chlorku dodawano w porcjach 4 ml co 8 godzin. Po 50 godzinach łącznego czasu reakcji usunięto rozpuszczalniki pod głęboką próżnią. Pozostałość zawieszono w 50 ml wody i 100 ml chloroformu i odwirowanie emulsji dało półstałą masę, którą przekrystalizowano z etanolu, co dało 3,75 g (86%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

1HNMR (DMSO-dó, 300MHZ) δ: 10,65 (1H, s, NH), 7,82 (1H, s, CH-8),

6,75 (2H, s, NH2), 5,25-5,4 (4H, m, CH2-1' i CH=CH), 4,07 (2H, t, CH-4'), 3,65 (2H, t, CHO'), (2H, t, CH-COO), 1,98 (4H, m, CH2-CH=), 1,45 (2H, m,

CH2-C-COO), 1,25 (20H, m, CH), 0,85 (3H, t, CH-CH).

^CNMR (DMSO-dó, 75 Mhz) δ: 172, 77 (COO), 156,72 (CO-6), 154,17 (C-2), (C-4), 137,52 (CH-8), 130,03 (CH=CH)( 116,44 (C-5), 71,77 (CHb-l'), 66,54 (CH2-3'), 62)55 (CH-4'), 23)88, 39)92, 21,26) 88)58, 28,95, 28,82, 28)69, 28,49, 28)28) 28,33) 24,25) 22,08 (CH2), 13,91 (CH-CH).

Przykład VIII. 9'-(2'-(cis-11-EikozeIloiloksy)etoksymetyio)guanma.

Do roztworu ACV (1,0 g, 4,43 x 10- mola) w 20 ml bezwodnej pirydyny i 10 ml N,N-dimetyloformamidu dodano 4 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku cis11-eikozenoilu (1,59 g, 4,83x10'3mola) w 4 ml dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. Pozostały roztwór chlorku dodawano w porcjach 1 ml co 8 godzin. Po 60 godzinach łącznego czasu reakcji usunięto rozpuszczalniki pod głęboką próżnią. Pozostałość potraktowano chloroformem i wodą i na koniec oczyszczono na kolumnie z silikażelem (90%MeOH/CHC13), co dało 0)92 g (40%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

HNMR (DMSO-dó, 300MHZ) δ: 10,65 (1H, s, NH), 7,81 (1H, s, CH-8), 6,50 (2H, s, NH2), 5,85-5)4 (4H, m, CH-1' i CH=CH), 4,08 (2H, t, CH-4'), 2,65 (2H, t, CH-3'), (2H, t, CH-COO), 2,0 (4H, m, Cik-CHĄ, 1,45 (211, m, CH2-C-COO), (24H m, CH), 0,85 (3H, t, CH3-CH2).

¹³CNMR (DMSO-dó), 75 Mhz) δ: 172, 73 (COO), 156,70 (CO-6), 153,90 (C-2), 151,37 (C-4), 137,59 (CH-8), 129,58 (CH=CH), 116,35 (C-5), 71,81 (CH₂-1') , 66,54 (CH2-3'), 62,52 (CH2-4'), 33,28, 31,26, 29,09, 28,82, 28,67, 28,58, 28,40, 25,56, 24,35 i 22,07 (CH2), 13,88 (CH3-CH2).

Przykład IX. 5'-0-(cis-9''-Oktadecenoilo)-3'-deoksy-3'-azydotymidyna.

Do roztworu 3'-deoksy-3'-azydotymidyny (1,0 g, 3,75x10'³mola) w 20 ml bezwodnej pirydyny dodano 2 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku cis-9-oktadecenoilu (70%, 1,7 g, 3,9xł(0³mola) w 6 ml dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. Pozostały roztwór chlorku dodano w porcjach 2 ml w około ośmiogodzinnych odstępach. Po łącznie 60 godzinach reakcji odparowano rozpuszczalniki pod głęboką próżnią i pozostałość rozcieńczono 100 ml chloroformu i 50 ml wody. Fazę organiczną potraktowano solanką, suszono (MgSO.4) i zatężono otrzymując lepki olej. Produkt oczyszczono na kolumnie z silikażelem z 3% metanolu w chloroformie jako układem eluującym. Homogeniczne frakcje odparowano, co dało 1,65 g (82%) tytułowego związku jako bezbarwnego lepkiego oleju.

CłNMR (DMSO-d₆, 300MHZ) δ: 11,25 (1H, s, NH), 7,45 (1H, s, H-6), 6,12 (2H, s, H-1), 5,25-5,4 (2H, m, CH=CH), 4,45 (1H, m, H-3'), 4,25 (2H, m, H-5'), 3,95 (1H, m, H-4'), 2,25-2,45 (2H, m, CH'-''), 2,35 (2H, t, CH2-COO), 1,97 (4H, m, CH2-CH=), 1,77 (3H, s, CHs-5), 1,53 (2H, m, CH2-C-COO), 1,25 (20H, m, CH2), 0,85 (3H, t, CH3-CH2).

^l3CNMR (DMSO-dć), 75 Mhz) δ: 172, 31 (COO), 163,31 (CO-4), 149,90 (CO-2), 137,89 (C-6), 129,13 i 129,03 (-CH=CH-), 106,74 (C-5), 8,83 (C-1'), 81,26 (C-4'), 75,59 (C-3'), 74,16 (C-2'), 62,76 (C-5'), 32,98, 30,62, 28,57, 28,50, 28,02, 27,91, 27,84, 27,76, 26,07, 26,03, 23,95, 21,56 (CH2), 13,39 (CH3-CH2), 11,68 (CHs-5).

Przykład X. 5'-O-(cis-9-Oktadecenoilo)-9-e-D-arabinofuranozyloadenina.

Do roztworu 9-β-D-arabinofuranozyloadeniny (Ara-A) (1,0 g, 3,74x10'³ mola) w 10 ml bezwodnej pirydyny i 20 ml N,N-dimetyloformamidu dodano 2 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku cis-9-oktadecenoilu (2,1 g, 6,98x10'³mola) w 6 ml dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. Pozostały roztwór chlorku dodano w 2 ml porcjach w około ośmiogodzinnych odstępach. Po łącznie 50 godzinach reakcji odparowano rozpuszczalniki pod głęboką próżnią i pozostałość rozpuszczono w 10% metanolu w chloroformie i przesączono przez małą kolumnę z silikażelem. Zatężone frakcje produktu oczyszczono na kolumnie z silikażelem, co dało 0,6 g (30%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

¹HNMR (DMSO-dć, 300 Mhz) β: 8,18 (1H, s, ArH), 7,25 (2H, s, NH2), 6,30 (1H, d, H-1'), 5,78 (1H, d, OH-''), 5,68 (1H, d, OH-3'), 5,2-5,4 (2H, m, CH=CH),

4,38 (1H, m, H-5'1), 4,25 (1H, m, H-5'2), 4,15 (1H, m, H-2', H-3'), 3,95 (1H, m, H-4'), 2,30 (2H, t, CH2-COO), 1,95 (4H, m, CH₂-CH=), 1,50 (2H, m, CH2-C-COO),

1,25 (20H, m, CH2), 0,85 (3H, t, CH3-CH2).

*³CNMR (DMSO-d6, 75mhz) β: 172,73 (COO), 155,43 (CO-6), 151,85 (C-2), 149,28 (C-4), 140,60 (C-8), 129,66 i 129,54 (CH=CH), 118,22 (C-5), 83,82 (C-1'), 81,23 (C-''), 77,88 (C-2')) 755,1 (C-3')) 63,88 (C-''), 33,37, 33^1,^^, 22,09, 22,05, 28,88, 28,70, 28,59, 28,48, 24,41, 22,08 (CH'), 13,87 (CHa-CH').

Przykład XI. 5'-Ó-(trans-9''-Oktadecenoilo)-1-e3D3arabinofuranozylo-(N6-metylo) adenina.

Do roztworu 9-β-D-arabinofuranozylo-N36-metyloadeniny g, 3,55χ10'³ mola) w 10 ml bezwodnej pirydyny i 15 ml N,N-dimetyłoformamidu dodano 2 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku trans-9-oktadecenoilu (2,0 g, 6,64x10 '³mola) w 6 ml dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. Pozostały roztwór chlorku dodano w 2 ml porcjach w około ośniogodzinnych odstępach. Po łącznie 60 godzinach reakcji odparowano rozpuszczalniki pod głęboką próżnią, a pozostałość rozpuszczono w 5% metanolu w chloroformie i kilkakrotnie chromatografowano

170 846 w kolumnie z silikażelem, uzyskując 0,7 g (36%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

*HNM.R (DMSO-dć, 300 Mhz) δ: 8,25 (1H, s, ArH), 7,75 (1H, s, NH), 6,29 (1H, d, H-1'), 5,78 (1H, d, OH-2'), 5,70 (1H, d, OH-3'), 5,25-5,35 (2H, m, CH=CH), 4,40 (1H, m, H-5'1), 4,27 (1H, m, H-5'z), 4,15 (1H, m, H-2', H-3'), 3,95 (1H, m, H-4'), 2,95 (3H, br. s, N-CH3), 2,30 (2H, t, CH2-COO), 1,90 (4H, m, CH2-CH=),

1,50 (2H, m, CH2CCOO), 1,25 (20H, m, CH2), 0,85 (3H, t, CH3-CH2).

ⁱ³CNMR (DMSO-de, 75mhz) δ: 172,75 (COO), 154,89 (CO-6), 152,43 (C-2), 149,33 (C-4), 140,02 (C-8), 129,99 (CH=CH), 118,20 (C-5), 83,61 (C-1'), 81,06 (C-4'), 75,77 (C-2'), 75,06 (C-3'), 63,76 (C-5'), 33,36, 31,90, 31,25, 28,97, 28,90, 28,81, 28,68, 28,47, 28,36, 28,30 (CH2), 27,20 (N-CH3), 24,41, 22,07 (CH2), 13,89 (CH3-CH2).

Przykład XII. 9-(4'-(trans-9''-Oktadecenoiloksy)-3'-hydroksymetylobutylo)guanina.

Do roztworu 9-(4-hydroksy-3-hydroksymetylobutylo)guaniny (pencyklowir) (1,0 g, 3,98x10'³ mola) w 10 ml bezwodnej pirydyny i 40 ml N,N-dimetyloformamidu dodano 2 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku trans-9-oktadecenoilu (2,1 g, 6,98x10'3mola) w 6 ml dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze pokojowej. Pozostały roztwór chlorku dodano w 2 ml porcjach w około ośmiogodzinnych odstępach. Po łącznie 65 godzinach reakcji odparowano rozpuszczalniki pod głęboką próżnią, a pozostałość rozpuszczono w 15% metanolu w chloroformie i eluowano przez kolumnę z silikażelem. Homogeniczne frakcje przekrystalizowano z etanolu, co dało 0,45 g (22%) związku tytułowego jako białego ciała stałego.

1HNMR (DMSO-de, 300MHZ) δ: 10,50 (1H, s, NH), 7,65 (1H, s, CH-8), 6,43 (2H, s, NH2), 5,33 (2H, m, CH=CH), 4,62 (1H, t, OH), 4,00 (4H, m, CH2-N i RCOOCH2), 3,38 (2H, m, CH2-OH), 2,25 (2H, t, CH2-COO), 1,90 (4H, m, CH2-C=), 1,60 - 1,80 (CH i CH2-CH2N), 1,45 (2H, m, CH2C-COO), 1,20 (20H, m, CH2), 0,85 (3H, t CH3).

13CNMR (DMSO-d₆), 75 Mhz) δ: 172,90 (COO), 156,75 (C-6), 153,40 (C-2), 151,07 (C-4), 137,22 (C-8), 130,02 (CH=CH), 116,57 (C-5), 63,80 (RCOOCH2), 60,50 (CH2OH), 40,67 (CH2N), 37,54 (CH), 33,44, 31,88, 31,22, 28,95, 28,90, 28,77, 28,64, 28,43, 28,27, 24,38, 22,04 (CH2), 13,90 (CH2).

Przykład XIII. 9-(2'-(trans-9-OktadecenoiIoksy)-r-hydroksymetyloetoksymetylo)guanma.

Do roztworu 9{[2-Hydroksy-1-(hydroksymetylo)etoksy]metyio)guanmy (Gancyklowir) (0,655 g, 2,56x10'3 mola) w 10 ml bezwodnej pirydyny i 40 ml NjN-dimet^yloformamidu dodano 2 ml przygotowanego wcześniej roztworu chlorku trans-9-oktadecenoilu (1,3 g, 4,32x103mola) w 6 ml dichlorometanu i mieszaninę reakcyjną mieszano pod azotem w temperaturze 40°C. Pozostały roztwór chlorku dodawano w porcjach 2 ml co około 8 godzin. Po 60 godzinach łącznego czasu reakcji usunięto rozpuszczalniki pod głęboką próżnią. Pozostałość zawieszono w 100 ml wody i 100 ml chloroformu a odwirowanie emulsji dało półstałą masę, którą przekrystalizowano z etanolu, co dało 0,8 g (60%) tytułowego związku jako białego ciała stałego.

¹HNMR (DMSO-d6, 300MHZ) δ: 10,60 (1H, s, NH), 7,81 (1H, s, CH-8), 6,58 (2H, s, NH2), 5,45 (2H, s, OCH2N), 5,35 (2H, m, CH=CH), 4,85 (1H, t, OH), 4,08 (1H, m), 3,90 (1H, m) i 3,75 (1H, m) (RCOOCH2 i CH-O), 3,35 (2H, m, CH2OH), 2,08 (2H, t, CH2-COO), 1,93 (4H, m, CH2-C=), 1,10-1,45 (22H, m, CH2), 0,85 (3H, t, CH2CH2).

1³CNMR (DMSO-dó), 75 Mhz) δ: 172, 64 (COO), 156,85 (C-6), 153,84 (C-2), 151,34 (C-4), 137,62 (C-8), 130,02 (CH=CH), 116,48 (C-5), 76,88 (CH-O), 71,29 (OCH2N),

63,13 (RCOOCH22, 60,39 (OHOH), 33,19 31,29, 28,1^2, 28,53, 28,41,

27,07, 27,02, 22,10 (CH20, 13,90 (CH₃).

170 846

Figura 1b

Działanie estrów ACV na HSV 2

Kontrola

0.9 2.2

Stężenie [mikromole/htr]

170 846

Figura 2

Estry kwasów tłuszczowych Ara-T Działanie na HSV 2

Płytki/ml |

Kontrola, 2.Ara-T, 3:Palmitynian Ara-T, 4:Undecenian Ara-T, 5 Oleinian Ara-T

170 846

Figura 3

Stopień przeżycia myszy zainfekowanych HSV 2 % przeżycia

dni — Kontrola + ACV ^Elaidynian ACV

Leczenie rozpoczęto 3 dnia

170 846

FIGURA 4

ΗΝ

Elaidynian ACV

170 846

FIGURA 4

X

°Λ >

O <

c tę 'c (U

N

O

LU

Eikozeman Ara-T

170 846

FIGURA 4 c-> X

O

Elaidynian Ara-T

170 846

X

O

FIGURA 4

ł—

N <

c 'c ja>

O

Oleinian Ara-T

FIGURA 4

X •O

Eikozeman Ara-A, cis

170 846

X

O

OH

170 846

FIGURA 4

cn

X

O

170 846

FIGURA 4

170 846

FIGURA 4

NHCH

170 846

FIGURA 4

CS

>

O

O c

(U c

>.

Ό

TS

LU

Figura 1a

Estry kwasów tłuszczowych Acyklowiru Działanie na HSV 2

1,000,000

Płytki/ml

Kontrola, 2 ACV, 3 Linolenian ACV

4:Erukian ACV, 5:Oleinian ACV, 6.Elaidynian ACV, 7 'Eikozenian ACV

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowych acylowych pochodnych nukleozydów i analogów nukleozydów o ogólnym wzorze I:

Nu-O-Fa w którym O oznacza tlen, Nu oznacza nukleozyd lub analog nukleozydu a Fa oznacza grupę acylową ω-9 mononienasyconego kwasu tłuszczowego C18 lub C20, który to kwas tłuszczowy jest zestryfikowany grupą hydroksylową w pozycji 5'-ugrupowania cukrowego nukleozydu lub grupą hydroksylową niecyklicznego łańcucha analogu nukleozydu z wyłączeniem 5'-0-oleilo-aracytydyny i 2,2'-anhydro-5'-0-oleilo-ara-cytydyny, znamienny tym, że nukleozyd lub analog nukleozydu o wzorze:

NuOH gdzie Nu ma wyżej podane znaczenie acyluje się reaktywną pochodną ω-9 mono-nienasyconego kwasu tłuszczowego C18 lub C20.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek NuOH, w którym Nu oznacza związek o wzorze II:

S-B w którym S oznacza albo pochodną monosacharydową wybraną spośród l-jS-Darabinofuranozy lub 2,3-dideoksy-3-azydo-1-e-D-rybofuranozy, lub wybraną spośród grupy 2-hydroksyetoksymetylowej, 4-hydroksy-2-(hydroksymetylo)butylowej,

2-hydroksy-1-(hydroksymetylo)etoks^yme^^lowej lub 2,3-di^^i^iroksypropoksylowej, a B oznacza zasadę azotową wybraną spośród adeniny, guaniny, cytozyny, uracylu, tyminy lub pochodnej tyminy o wzorze:

w którym X oznacza deuter lub fluor.
3. SposóS według zastrz.2, znamienny eym, że stosuje się związek o wzorze NuO, w którym Nu oznacza arabinrfuranoeeirteminę (Ara T), arabino-puranozeioadeninę (Ara A), acyklokir (ACV), azedotymidenę (AZT), arabinozyd puryny o ogólnym wzorze:

170 846 w którym R' oznacza grupę -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2 lub -OCH3 lub analog nukleozydu o ogólnym wzorze w którym R oznacza grupę noncykliczną.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się związek w którym R oznacza grupę [2-hydroksy-1-(hydroksymetylo)etoksy]metylową.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że stosuje się związek w którym Fa oznacza kwas oleinowy, elaidynowy lub cis- albo trans-eikozenowy.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki, w którym Nu oznacza acyklowir a Fa oznacza kwas oleinowy.
7. Sposób według zastrz, 1, znamienny tym, że stosuje się związki w których Nu oznacza acyklowir a Fa oznacza kwas elaidynowy.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki w których Nu oznacza acyklowir a Fa oznacza kwas cis- lub trans-eikozenowy.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki w których Nu oznacza Ara T a Fa oznacza kwas elaidynowy.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki w których Nu oznacza Ara T a Fa oznacza kwas oleinowy.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki w których Nu oznacza Ara T a Fa oznacza kwas cis lub trans eikozenowy.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki, w których Nu oznacza Ara A a Fa oznacza kwas cis lub trans eikozenowy.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki, w których Nu oznacza Ara A a Fa oznacza kwas oleinowy.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki, w których Nu oznacza Ara A a Fa oznacza kwas elaidynowy.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki, w których Nu oznacza gancyklowir a Fa oznacza kwas elaidynowy.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki, w których Nu oznacza AZT a Fa oznacza kwas elaidynowy.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki, w których Nu oznacza AZT a Fa oznacza kwas oleinowy.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związki, w których Nu oznacza AZT a Fa oznacza kwas cis- lub trans- eikozenowy.
19. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 6, albo 7, albo, 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, znamienny tym, że jako reaktywną pochodną kwasu tłuszczowego stosuje się związek o wzorze:

FaX w którym Fa ma znaczenie podane w zastrz. 1, a X wybrane jest spośród Cl, Br i O-CO-R'- gdzie R' oznacza Fa, CH3, CH2CH3 lub CF3.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w niereaktywnym rozpuszczalniku.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się N,N-dimetyloformamid lub chlorowcowany węglowodór.

170 846