PL130945B1 - Process for preparing novel,acidic,polycyclic ethereal antibiotic - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego kwasowego policyklicznego antybiotyku eterowego charakteryzowanego biologicznie pojprzez oddzialywanie na transport kationów w mitochon- driach.Rodzina antybiotyków, do której nalezy anty¬ biotyk wytwarzany sposobem wedlug wynalazku obejmuje monesyne (1967)); nigerycyne (Biochem. Biiophys. Res. Comm., 33:29. (1968)); grizoriksyne (J. Chem. Soc. Chem.Commun., 1421, (1970)); dianemycyne (J. Antibio- tics 22:161, (1969)); salinomycyne (J. AniibioiLcs, 27:814 (1974)); X^537A (J. Chem. Soc. Chem. Com- mun., 967, (1972)); X-206 (J. Chem. Soc. Chem.Comiunn., 927, (1971)); A204A (J. Amer. Chem. Soc., 95:3399, (1973)); mutalomycyne (J. Antibiotics, 30:903 1977)); ionomycyne (1979)); K-41B (J. Antibiotics, 32:169, (1979)); A-130B i A-130C cyne (J. Antibiotics, 33:137, (1960)); oraz A-28696 B (J. Antisbioiics, 33:1262 (1930)). Przedmiot ten byl omawiany równiez przez Westley'a, „Polyether An¬ tibiotics", Adv. Appl. Microbiol. 22:177 (1797).Wyzej zestawione policykliczne antybiotyki ete¬ rowe sa aktywne wobec bakterii Gram-dodatnich grzybów i pierwotniaków. Antybiotyki te wykazu¬ ja wysoka czynnosc antykokcydialna.Dobrze znana choroba pderwofaiaakowa, kokcy- dioza, pozostaje powaznym proWleimem, a jej zwal¬ czanie ma znaczenie ekonomiczne w Trikach we- 10 15 terynaryjnych, zwlaszcza w przemysle drobiarskim.Kokcydioza nastepuje w wyniku zakazenia jednym lub kilkoma gatunkami Eimcria lub Isospora (dla podsumowania patrz Dund i Farr w „Diseases of Poultry", wydanie piate, Biester and Schwarte, wyd., Iowa State University Press, Anies, la., 1965, strony 1066—1096). Istnieje szesc gatunków kokcy- dia, które powoduja latwo zauwazalna zachorowal-, nosc u wrazliwych kurczat. Eimeri* tenella, E. necatrix, E. bnmetti, E. acervulina, E. maxima i E. mivati powoduja szkody, badz to bezposrednio, przez zniszczenie komórek nablonkowych przewo¬ du pokarmowego lub posrednio, przez produkcje toksyn. Trzy inne gatunki nalezace do tego same¬ go rodzaju uwaza sie za stosunkowo nieszkodliwe; jednakze E. mitte, E. hageni i E. praecox moga zmniejszac przyrost wagi, obnizac wydajnosc zy¬ wienia i ujemnie wplywac na produkcje jaj. W swietle duzych strat ekonomicznych i wad pewnych znanych czynników przeciwkokcydilalnych, prowa¬ dzi sie badania zmierzajace do znalezienia lepszych czynników przeciwkokcydialnych.Zapalenie jelit jest inna choroba, która moze po¬ wodowac powazne straty ekonomiczne producentów inwentarza zywego. Zapalenie jelit wystepuje u kurczat, swin, bydla i owiec i jest powodowane glównie przez bakterie beztlenowe, zwlaszcza Clo- gtridijum perfrigeas i wirusy, finterotoksemla u zwierzat przezuwajacych, której przejawem jest np. „choroba przejedzania" u owiec, jest stanem po- 130 945130 945 wodowanym przez zakazenie C. perfringens.Dyizenteria swin jest Jedna z najczesciej spoty¬ kanych chorób swin difignozowanych w Stanach Zjednoczonych. Choroba ta wystepuje w wielu in¬ nych krajach i rocznie powoduje straty wielu ty¬ siecy dolarów u hodowców swin na calym swie¬ cie. Ostatnio odkryto, ze organizmem wywoluja¬ cym chorobe jest duzy kretek. Organizm ten, Tre- poniema hyodysenteriae, zostal obecnie wyizolowa¬ ny i wykazano, ze moze on powodowac t^ choro¬ be (Harris DJ^ i inni: Swine Dysentery-1 Inocu- lation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproduction ott the Disease", ^fet- ltifed/£A€» Sf:ei-64: 1972). Dalej podane dane doty- Cza jróib prowadzonych a tym organizmem. Nalezy aaurwazyfc, ze nie wiadomo, czy T. hyodysenteriae jest jedynym organizmem powodujacym dyzenterie swin. Jednaltóze z dostepnych danych mozna wnios¬ kowac, ze jest on glównjim zródlem zakazenia.Zwiekszenie wydajnosci- (zwiekszenie szybkosci wzrostu i/lub zwiekszenie wydajnosci utylizacji po¬ zywienia) u zwierzat przetzuwajacych, takich jak bydlo, jest innym ekonomicznie pozadanym przed¬ miotem wiedzy weterynaryjnej. Szczególnie intere¬ sujaca jest promocja wzrostu uzyskiwana przez zwiekszenie wydajnosci utylizacji pozywienia. Me¬ chanizm utylizacji zasadniczej odzywczej porcji (weglowodanów) pozywienia zwierzat przezuwaja¬ cych jest dobrze znany. Mikroorganizmy w pierw¬ szym zoladku zwierzecia rozkladaja weglowodany z wytworzeniem monosachairydów, a nastepnie prze¬ twarzaja te monosacharydy na zwiajzki plrogronia- nowe. Pirogroniany sa metabolizowane w proce¬ sach mikrobiologicznych z wytworzeniem octanów, maslanów lub propionianów, znanych lacznie jako lotne kwasy tluszczowe (VFA). Dla bardziej szcze¬ gólowego omówienia patrz Leng w „Physiology of Ddgestion and Metabolism m the Rumdinant", Phil- lipson i inni, wyd*, Oriel Press, Newcastle-aipon- -Tyne, England, 1979, strony 408-^410..Wzgledna sprawnosc utylizacja VFA omawia McOufllough w „Feedstuffs", czerwiec 19, 1971, stro¬ na 19; Eskeland i inni w J. An. Sei. 33, 232 (1971); oraz Chfurch i inni w „Digestiitfe Physiology and Nutniiton of Ruminants", Vol. 2, 1971, strony 622 i 6&5. Choc octany i maslany sa utylizowane, pro- pioniany sa utyMaowane z wieksza sprawnoscia.Ponadto, gdy dostepnych jest za malo propionia¬ nów, u zwierzat moze rozwinac sie ketoza. Tak wiec korzystny zwiazek stymuluje zwierzeta do produk¬ cji z weglowodanów wyzszego u&zialu propionia¬ nów, przez co zwieksza sie utylizacja weglowoda¬ nów a zmniejsza wystepowanie ketozy. inna choroba powodujaca straty ekonomiczne u producentów zywca jest powodowana przez paso¬ zyty pierwotndafcowe rodzaju Theileria. Choroba ta, theileriosis, jest równiez znana jako rEast Coast Fever", „Coastal fever" loifb Rbodesian tick fever".Pasozyt Theileria atakuje czerwone cialka krwi lecz ich nie niszczy, co powoduje ostre lub chroniczne za¬ kazenia goraczkowe. U bydla choroba ta charakte¬ ryzuje sie wysoka goraczka, obrzekiem wejzlów chlonnych, wycienczeniem i wysoka smiertelnoscia.Choroba ta jest bardzo powaznym problemem we Wschodniej i Centralnej Afryce. Dla bardziej szcze¬ gólowego omówienia thelleriosis patrz ^he Merck Veterinary Manual", Siegjmfdrtd l:ikng,i^&s:;'-'MeTck Co., Rahway, NJ., 5th Ld., stron^ 431^4J3 Wynalazek dotyczy sposobu wJWaFzMa** nowe- 5 go, kwasowego, poficyWfoznego antybiotyku etero¬ wego o wzorze podanym na zalaczonym rysunku, polegajacego na tym, ze w poapówierzchniowej hodowli aerobowej w wodnej JWftywce prowadzi sie hodowle Streptomyces halsiedti ATCC . 31812, 10 izolowanego z próbki gleby w Japonii.Antybiotyk wytwarzany sposobem wedliig wyna¬ lazku, o wzorze podanym na zalaczonym rysunku i jego kationowe sole sa aktywne wobec róznych mikroorganizmów i sa efektywne w zwalczaniu 15 kokcydiicizy, zapalenia jelit, dyzenterid Swin i thei- Leriosis jak równiez W promowatndu wzrostu drobiu i zwierzat przezuwajacych. Na ryJfaftkaeh fljgdra 1 i figura 2 przedstawiono nastepujace1 widma ab¬ sorpcji w .podczerwieni: M fig. 1 — Antybiotyk 53 607 w postaci soli sodowej; fig. 2 — Antybiotyk 53 607 w postaci wolnego kwa¬ su.Mikroorganizm wytwarzajacy antybiotyk wedlug niniejszego wynalazku zostal wyizolowany z prób- 25 ki gleby pobranej w Hiroszimie, Japonia. Badania wykaszaly, ze mikroorganizm mia morfologiczne wlas¬ ciwosci Streptomyces. Stwierdzono równiez, ze ma on waskie strzepki Actinomycetales i grzybnie po¬ wietrzna z lancuchami zarodników charaktery- 30 styczna dla rodzaju Streptomyces. Identyfikacja rodzajowa zostala dalej potwierdzona analiza scia¬ ny komórkowej.Hodowle mikroorganizmu inokulowano ze skosu do cieklej pozywki ATCC#172 i prowadzono ho- 35 dowle w ciagu 4 dni w temperaturze 28°C, na wstrzasarce. Nastepnie usunieto ja ze wsfcrzasarki, odwirowano, przemyto trzykrotnie sterylna woda destylowana i posiano na pozywkach zwykle sto¬ sowanych do identyfikacji czlonów Actinomycetales. 40 Inkubacje prowadzono w temperaturze 28°C, jezeli nie zaznaczono inaczej, a wyniki rejestrowa¬ no w odpowiednim czasie; podane tu wyniki otrzy¬ mano po 2 tygodniach, jezeli nie zaznaczono ina¬ czej. Pozywki identyfikacyjne stosowane do cha- 45 rakteryzowania hodowli i odnosniki do ich skladu sa nastepujace: 1." Bulion z tryptonem i ekstraktem z drozdzy (ISP#1, Difco) 2. Agar z ekstraktem z drozdzy i z ekstraktem slo- 53 dowym (ISiP#2, Difco) 3. Agar z maka owisiana — (ISP#3, Difco) 4. Agar z nieorganicznymi solami i skrobia — (ISP#4, Difco) 5. Agar z gliceryna i asparagina (ISP#5, Difco) 55 6. Agar z peptonem, ekstraktem z drozdzy i zela¬ zem (ISP#6, Ddjfco). 7. Agar Czapeka z sacharoza — S.A. Wafcaman,.„The Actiinomycetes", Vol. 2, pozywka no. 1, stro¬ na 328, 1961 to 8. Agar z glukoza i asparagina — tamze, pozyw¬ ka no. 2, strona 3128 9. Agar Bennetta — tamze, pozywka no. 30, stro¬ na 331 10. Pozywka Emersona, tamze, pozywka no. 28, M strona 331130 945 5 11. Agar odzywczy — tamze, pozywka no. 14, stro¬ na 330 12. Agar tyrozynowy Gordona i Smitha — RE.Gordon i MJM. Smith, Jr. Baet. 69. 147—150, 1955 13. Agar kazeinowy — tamze 11 Agar z jablczanem wapnia — S.A. Waksman, Bari. Rev. 21: 1—29, 1967 15. Zelatyna — R. E. Gordon i JjM. Mihm, Jr.Baot. 73: 15—27, 1957 16. Skrobia — tamze 17. Bulion z organicznymi azotanami — tamze 18. Bulion z defcstroza i azotanami — S.A. Waks¬ man, The Actinomycetes, Vol. 2, pozywka no. 1, strona 326, 1961; 30 g sacharozy zastajpiono 3 g dekstrozy, pominieto agar 19. Agar z ziemniakiem! i marchewka — MJP. Le- chevalier, Jr. Lab. and Clto. Med. 71: 934^-944, 1968 lecz z uzyciem jedynie 30 g ziemniaka, 2,5 g marchwi i 20 g agaru 20 2% agar na wodzie wodociagowej 21. Odtluszczone mleko — Ditfco 22. Utylizacja celulozy — a) H.L. Jensen, Proc. Limu. Soc. N.S.W. 55: 231^248, 1930 b) M. Levine i H.W. Schoenlein, „A Compilationof Culture Media", pozywka no. 2511, 1930 23. Weglowodany — IiSO#9, Difco; Nonomura i Ohara, pozywka C-2; Nonomura, H. i Y. Ohara, Z.Ferment. Technol. 49: 887^894, 1971. 24. Zakres temperatury — pozywka ATCC 172 w „ATCC Culture Coliection Catalogue", wydanie 14, strona 518, 1980.Nowa kulture (iPfizer N 393-39) opisano jak na¬ stepuje na roznych pozywkach z barwami opisany¬ mi w zwyklej terminologii, lecz dokladne barwy (numery podano w nawiasie) oznaczono przez po^ równanie z Wzorcami barwnymi z Color Harmony Manual, wydanie czwarte: Agar z ekstraktem z drozdzy i z ekstraktem slo¬ dowym — wzrost dobry, kremowy do jasnozólta- wego (bliski 2 ca), umiarkowanie wzniesiony, glad¬ ki, szorstki do zmarszczonego, brak grzybni po¬ wietrznej; spod taki sam jak powierzchnia; brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar z maka owsiana — wzrost umiarkowany, szary do brazowawoszarego (2 ge, 1 Ig do 2 ni), cienki do lekko wzniesionego, gladki z malymi bia¬ lymi kropkami; rzadka grzybnia powietrzna, biala do jasnosizarawej; spod taki sam jak powierzchnia; rozpuszczalny pigment jasnozóltawy.Agar z nieorganicznymi solami i skrobia — wzrost umiarkowany, zóltawobrazowy do brazo¬ wego (2 ic, 3 ne do 3 le), cienki, gladki, brak grzybni powietrznej, spód taki sam jak powierzch¬ nia, brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar z gliceryna i asparagina — wzrost slaby do umiarkowanego, metnobialy, gladki z kilkoma malymi bialymi punktami, rzadka grzybnia po¬ wietrzna, biala; spod taki sam jak powierzchnia; brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar tyrozynowy Gordona i Smitha — wzrost slaby do umiarkowanego, bezbarwny do kremowe¬ go (2 ca), cienki, gladki, brak grzybni powietrznej; spód taki sam jak powierzchnia; brak rozpuszczal¬ nego pigmentu.Agar Czapefca i sacharaa — wzrost slaby, bez* barwny do metnobdalego, cienki, gladki z kilkoma malymi bialymi punktami grzybni powietrzne]; spód taki sam jak powierzchnia; brak rozpuszczal- f nego pigmentu.Agar i glukoza i asparagikia — wzrost umiarko¬ wany, zóltawoszary do lawendowoszarego (2 ig, 3 ge do 3 ig), cienki, gladki lecz slabo zmarszczo¬ ny w pobditziu krawedzi; grzybnia powietrzna jasno- 10 szarawa (2 ge); spod taki sam jak powierzchnia; rozpuszczalny pigment jasnozóltawy.Agar glukozowo-asparaginowy — wzrost umiar¬ kowany, zóltawoszary do lawendowoszarego (2 ig, 3 ge do 3 ig), cienki, gladki lecz lekko zmarszczo- 19 ny w poblizu krawedzi; grzybnia powietrzna szara- wa (2 ge); spód taki sam jak powierzchnia; roz¬ puszczalny pdgment jasnozóltawy.Agar z jablczanem wapnia — wzrost slaby, bez¬ barwny z metnobialym marginesem, podpowierz- 10 chniowy, gladki z malymi punktami szarawej (se¬ ria bliskiej szarosci 2 dc do 2 fe) grzybni powietrz¬ nej; spód taki sam jak powierzchnia; brak rozpusz¬ czalnego pigmentu.Agar kazeinowy — wzrost umiarkowany, jasno- u brazowawy (2 ne do 3 ne), cienki, gladki do lekko szorstkiego, brak grzybni powietrznej; spód taki sam jak powierzchnia; brak rozpuszczalnego pig¬ mentu.Agar Bennetta — wzrost dobry, brazowy (3 ng ,0 do 3 ni), wzniesiony, zmarszczony, brak grzybni po¬ wietrznej; spód taki sam jak powierzchnia; roz¬ puszczalny pigment jasnozóltawy (2 ca).Agar Emersona — wzrost umiarkowany do do¬ brego; jasnozóltawobrazowy (2 ca do 3 ca) do zie- 35 lonawoszarego (23 ge do 23 ig), cienki do wzniesio¬ nego, gladki do lekko szorstkiego lub wystepujacy w postaci przeponowych kubków, które sa niere¬ gularnie zmarszczone, brak grzybni powietrznej; spód taki sam jak powierzchnia; brak rozpuszczai- 40 nego pigmentu.Agar odzywczy — wzrost slaby do umiarkowa¬ nego, jasnozóltawy (2 ca), cienki, gladki, brak grzybni powietrznej; spód taki sam jak powierzch¬ nia; brak rozpuszczalnego pigmentu. 45 Agar zelatynowy — wzrost umiarkowany, jasno¬ zóltawy (2 ca), cienki, gladki, brak grzybni po- wietrznej; spód taki sam jak powierzchnia; brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar skrobiowy — wzrost dobry, kremowy, jas- 50 nozóltawy do jasnozóltawobrazowego (2 ca do blis¬ ko 3 gc), cienki do lekko wzniesionego, gladki lecz zmarszczony ku krawedzi, brak grzybni powietrz^ nej; spód taki sam jak powierzchnia; brak roz¬ puszczalnego pigmentu. 5f Agar z ziemniakiem i marchwia — wzrost u- miarkowany, kremowy (2 ca) z szarawym do ciemnoszarego marginesem (seria bliskiej szarosci 2 fe, 2 ih do 2 ml), cienki, gladka grzybnia po¬ wietrzna szara do ciemnoszarej; spód taki sam jak •• powierzchnia; brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar na wodzie wodociagowej — wzrost slaby, bezbarwny do metnobialego, cienki, gladki, z kil¬ koma malymi bialymi punktami grzybni powietrz¬ nej; spód taki sam jak powierzchnia, brak rozpusz- €5 czalnego pigmentu.13ft 945 Uwagi ó biocnetóicznych wkscjfwasciach sa zsu- thctwam jak nastepuje: i. Melahina nie wytwarzana & Siaricofwod6r nie wytwarzany 3. Zelatyna uplynniana 4. Starobia h^tkoliziOwaTLa 0. Azotany redrukowane do azotynów 6. Slaby /wzrost na celulozie Jensena i. Szafie wzrostu na celulc*ale Levlne,a i Schoe- leina 8. Brak rozkladu na o/bu pozywkach celulozowych 8. Brak koagulacji na mletou ió. Brak peptonizacji na mleku li. Brak rozkladu kazeiny, jablezanu wapnia i tyrozyny 12. Utyitzacja weglowodanów: 1. Na pozywce Nonomury glukoza, arabinoza i ksyloza utylizowane; rafinoza watpliwie uityiizowana; sacharoza, dnozyt, mannit, fruktoza i ramnoza nie utylizowane.Ii. fta pozywce ISiP#9 glukoza, arabinoza, ksyloza i sacharoza utylizowane; fruktoza, inozyt, mannit, rafinoza i ramnoza nie "Utylizowane.Na agarze z zieimniakamti i marchwia po 15 dniach inkubacji poczyniono nastepujace obserwa¬ cje morfologiczne: Masa zarodników w serii barwy szarej; lancu¬ chy zarodników proste, skrecone, nieregularnie kre¬ te lub faliste, rzadko haczykowane, 10 do 30 za¬ rodników w lancuchu, rzadko mniej niz 10 za¬ rodników w lancuchu; zarodniki owalne, eliptycz¬ ne do paleczkowatych, 1.—1,8X0,8—0,9 firn, gladkie, co wynika z przemiatajacej spektroskopii elektro¬ nowej.Stosunek temperatury do szybkosci wzrostu ob¬ serwowano jak nastepuje: Temperatura Wzrost 21°C 28°C 37°C 45°C dobry do doskonalego dobry umiarkowany slaby Jak wyzej zauwazono, analiza sciany komórko¬ wej potwierdzila identyfikacje rodzajowa hodowli jako gatunku Streptomyces. Analiza calej komórki wykazala obecnosc kwasu LL-dwuaminopimelino- wego i glicyny i brak diagnostycznych cukrów. Me¬ tody stosowane do analiz aminokwasów calej ko¬ mórki i cukru sa opisane w Becker, B i inni, Appl.MlcrobkL, 12: 421—423, 1964; oraz Lechevallier, M.R, J. Lab. Clin, Med., 71: 934^£44f 1968.Kultura N 393^39 charakteryzuje sie jasnoszara do szarej barwy zarodhików w masie, prostymi do kretych lancuchami zarodników, gladkimi zarodni¬ kami i niezdolnoscia do wytwarzania melaniny.Obecnosc kwasu LL-dwuaaninopimelinowego i nie¬ obecnosc cukrów diagnostycznych w hydrolizacie ca¬ lej komórki ustalaja przypisanie jej do rodzaju Streptomyces. Hodowla blisko przypomina Strep¬ tomyces halstedii opisany w Shirling, EJ*, i Got- ilieb, D, 1968, Int. J. Syst. Bacteriol., 1«:G9—189, tak wiec do porównania uzyto typowego szczepu S. halstedii ATCC 10897. Obie kultury zgadzaja sde ze soba w nastepujacych wlasciwosciach: mor¬ fologii lancuchów zarodników, morfologii po¬ wierzchni zarodników, ujemna produkcja melani- 5 ny i wiekszoscia wlasciwosci biochemicznych. Kul¬ tura N 393-39 rózni sie od S. halstedii nieobecnos¬ cia grzyibni powietrznej w wielu pozywkach; bra¬ zowej zamiast szarawej do czarnej barwy spodu kolonii na ISP#2, LSP#3 i ISP#4; ujemna pro- 10 dukcja H2S i niezdolnoscia do utylizacji frukto* zy. Poniewaz róznice te sa jedynie malymi waria^ cjami pomiedzy szczepami Streptomyces, N 393^39 przyjmuje sie za nowy szczep Streptomyces hal¬ stedii (Waksanan i Curtis) Waksman i Henrici. 15 Nowa kulture (Pfizer iN 393-39) przekazano 23 lu¬ tego 1981 do American Type Culture Collection, RockvMle, Maryland, nadajac jej oznaczenie Strep¬ tomyces halstedii ATCC 311812. Zapewniono trwa¬ losc depozytu tej kultury w The American Type 20 Culture Collection w Rockville, Maryland i latwosc dostepu publicznego w trakcie efektywnej waz¬ nosci patentu, w przypadku gdy patent zostanie udzielony. Dostep do kultury w trakcie przebiegu zgloszenia jest zapewniony pod symbolem 37 CFR 25 1,14 i 35 USC 112. Wszystkie ograniczenia doste¬ pu do kultury zdeponowanej beda nieodwolalnie zniesione po udzieleniu patentu.Hodowle kultury Streptomyces halstedii ATCC 31312 mozna prowadzic w warunkach podobnych ^ do stosowanych w poprzednich fermentacjach daja¬ cych antybiotyki polieterowe. Patrz np. opis pa¬ tentowy Stanów Zjednoczonych nr 4195 079. Ho¬ dowla korzystnie ma miejsce w wodnych pozyw¬ kach w podpowierzchniowych, aerobowych warun- 35 kach, przy mieszaniu w temjperaturze 24 do 36°C.Pozywki uzyteczne w hodowli obejmuja zródla przyswajalnego wegla, jak oukry, skrobie i glice¬ ryna; zródlo organicznego azotu, jak kazeina, en¬ zymatyczne hydrolizaty kazeiny, maka sojowa, ma- 40 ka z nasienia bawelny, maka arachidowa, gluten pszeniczny, maczka miesna i maczka rybna. Z ko¬ rzystnymi wynikami mozna stosowac równiez sub¬ stancje wzrostowe, takie jak ekstrakt z ziarna i ekstrakt z drozdzy oraz sole, jak chlorek sodu i 45 weglan wapnia oraz pierwiastki sladowe, jak zela¬ zo, magnez, cynk, kobalt i mangan. Jezeli w trak¬ cie fermentacji zachodzi nadmierne pienienie, to do pozywki fermentacyjnej mozna dodac czynników przeciwpiennych, takich jak oleje roslinne lub sili- 50 kony. Napowietrzanie pozywki w zbiornikach dla hodowli podpowierzchniowej korzystnie utrzymuje sie na poziomie okolo 1/2 do 2 objetosci sterylne¬ go, wolnego powietrza na objetosc brzeczki fer¬ mentacyjnej na minute, wprowadzanego do brzecz- 55 ki przez belkotke. Mieszanie mozna utrzymywac za pomoca mieszadel, zwykle znanych fachowcom w dziedzinie fermentacji. Szybkosc mieszania zalezy od typu uzytego mieszadla. Wstrzasanie w kolbach prowadzi sie zwykle z szybkoscia 150 do 200 cykli go na minute, natomiast fermentor zwykle prowadzi sie przy 300 do 600 obrotach na minute. W trakcie przenoszenia organizmu i jego wzrostu musza byc oczywiscie utrzymane warunki jalowe.Inoikulum ido wytwarzania antybiotyku ó podn- 65 nym wzorze, sposobem wedlug wynalazku mozna139 945 10 •otrzymac stosujac wzrost ze skosu hodowli. Wzrost moze byc uzyty do inokulowania badz to kolb wstrzasanych badz tez zbiorników inokulum badz tez zbiorniki inokulum moga ibyc posiewane z kolb.Wzrost we wstrzasanych kolbach zwykle osiaga maksimum w ciagu 2 do 4 dni, natomiast dla ino¬ kulum w podpowierzchniowych warunkach hodow¬ li w tanku najkorzystniejszym okresem bedzie zwykle 1 1/2 do 3 dni.Postep produkcji antybiotyku w trakcie fermen¬ tacji i bdoaktywnosc brzeczki fermentacyjnej moz¬ na sledzic badaniem biologicznym brzeczki przy uzyciu wrazliwego szczepu Staphylococcus aureus lub Baciluus subtilis. S. aureus ATCC 6638 i B. subLilis ATCC 6633 sa szczepami odpowiednimi do tego celu. Stosiuje sie standardowa technike ozna¬ czania na plytkach, przyjmujac jako miare aktyw¬ nosci antybdotycznej strefe hamowania otaczajaca krazek z bibuly filtracyjnej. Uzytecznym narze¬ dziem do analizy antybiotyku produkowanego w pozywce fermentacyjnej i skladu surowych i oczy¬ szczonych materialów ektrahowanych z brzeczki fermentacyjnej jest takze chromatografia cienko¬ warstwowa na zelu krzemionkowym. Chromatogra- my na zelu krzemionkowym Analtech GF rozwi¬ ja sie w ukladzie octan etylu/metanol (9:1) lub chloroform/metanol (9:1). Antybiotyczny zwiazek uwidacznia sie przez spryskanie wanilina w etano- lowym kwasie siarkowym (3 g waniliny w 97 ml etanolu i 3 ml stezonego ikwasu siarkowego) i ogrze¬ wajac plyte TLC w 80°C. Antybiotyk ukazuje sie w postaci rózowej plamy. Mozna równiez nalozyc na plyte agar posiany S. aureus lub B. subtilis i inkubowac w 37°C w ciagu 16 godzin, dla ujaw¬ nienia antybiotyku.Antybiotyk wytwarzany przez fermentacje S. hal- stedii ATCC 31812 mozna wydzielic i odzyskac przez ekstrakcje calej, nie saczonej brzeczki fer¬ mentacyjnej za pomoca organicznego rozpuszczal¬ nika, jak chloroform, octan etylu, keton metyloizo- butylowy lub butanol, w naturalnym pH. Ekstrakt rozpuszczalnikiem mozna nastepnie odparowac w prózni do rzadkiego syropu.Typowa metoda wydzielania i odzyskiwania an¬ tybiotyku wedlug wynalazku (dalej „Antybiotycz¬ ny zwiazek 53 607") jest nastepujaca: Cala brzecz¬ ke z fermentacji S. halsiedii ATCC 31812 ekstra¬ howano ketonem metyloizobutylowym. Z ekstrak¬ tu rozpuszczalnikiem otrzymano, po odparowaniu rozpuszczalnika w prózni, ciemny olej. Olej rozpu¬ szczono w chloroformie i wylano na zloze zelu krze¬ mionkowego. Zloze zelu krzemionkowego przemyto nastepnie kolejno chloroformem, octanem etylu i acetonem. Frakcje pluczne badano chromatografia cienkowarstwowa, stwierdzajac, ze zwiazek anty- Taiotyczny 53 607 znajduje sie prawie wylacznie we frakcja octanu etylu. Frakcje octanu etylu odparo¬ wano do sucha, a pozostale frakcje odrzucono. Su- -che frakcje octanu etylu oczyszczono dalej chro¬ matografia kolumnowa, przez rozpuszczenie w oc¬ tanie etylu i podanie na kolumne upakowana ze¬ lem krzemionkowym zawieszonym w octanie ety¬ lu i elucje octanem etylu. Wycinki kolumny zawie¬ rajace zwiazek antybiotyczny 53 607 (oznaczony chromatografia cienkowarstwowa) polaczono i przez odjparowanie zmniejszono objetosc. Material ten poddano chromatografii na kolumnie upakowanej nosnikiem Sephadex LH-20 w metanolu, a frak¬ cje zawierajace zwiazek antybiotyczny 53 607 po- 5 laczono, odparowano do zmniejszonej objetosci i rozpuszczono w chloroformie. Chloroformowy roz¬ twór przemyto 5% buforem fosforanu jednosodowe- go doprowadzonym do pH 4,5 za pomoca kwasu fosforowego. 10 Nastejpn;e faze rozpuszczalnika przemyJo,bufo¬ rem fosforanu dwuscdowego 5% wagowó-bbjetos- ciowych, który za pomoca roztworu wo^o^otienku sodu doprowadzono do pH 9,0. Faze rozpuszczalni¬ ka wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i 15 odiparowano. Pozostalosc rozpuszczono w acetoinie i umieszczono w lodówce, co spowodowalo wytra¬ cenie zwiazku antybiotycznego 53 607 w postaci soli sodowej. Wolny kwas mozna otrzymac przez prze¬ mycie roztworu soli sodowej w octanie sodu woda 20 doprowadzona do pH 4,5. Odparowanie rozpusz¬ czalnika dalo krysztaly wolnego kwasu zwiazku antybiotycznego 53 607.Analiza zwiazku antybiotycznego 53 607 wykazu¬ je, ze strukture tego zwiazku okresla wzór podany na zalaczonym rysunku.Zwiazek antybiotyczny 53 607 wykazuje czynnosc inhilbitowania wobec wzrostu szeregu mikroorga¬ nizmów Gram — dodatnich. W tabeli I ponizej zsu¬ mowano wyniki prób MIC iii viiro. Dla tej próby, kazdy organizm jest inokulowany w serii probówek testowych zawierajacych pozywke i rózne stezenie zwiazku 53 607, w celu .okreslenia minimalnego ste¬ zenia antybiotyku w mcg/ml, które hamuje wzrost organizmu w czasie 24 godzin (MIC).^ W stosunku do bakterii gram-ujemnycfy takich jak Eschertehia coli, Pseudomonas aeruginosa, Kleb- siella pneumoniae, Serratia marcescens i Entero- bacteriaeese aerogenes, wartosci MIC w kazdym przypadku wyniosly 50.Zwiazek antybiotyczny 53 607 i jego kationowe sole wykazuja znakomita aktywnosc wobec zaka¬ zen kokcydialnych u drobiu. Wprowadzone do die¬ ty kurczat na poziomie 50 do 200 ppm, zwiazki te sa efektywne w zwalczaniu zakazen spowodowa- 45 nych Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunnetti i E. nacatrix.Dane dotyczace skutecznosci zwiazku antybio¬ tycznego 53 607 i jego soli wobec zakazen kokcy¬ dialnych u kurczat otrzymano w nastepujacy spo- 50 sób. Grupom 3—5 dniowych kogucików bialych leg¬ hornów SPF dawano papkowata diete zawierajaca zwiazek antybiotyczny 53607 lub jego sól sodowa i/lub potasowa, rójwnomieroie rozprowadzana. Po 24 godzinach na tej racji kazdego kogucika inoku- 55 lowano per os oocystami testowanego gatunku Eimeria. Inne grupy 3—5 dniowych kogucików kar¬ miono podobna papkowata dieta bez zwiazku anty¬ biotycznego 53 607 lub jego soli. Równiez te zaka¬ zano po 24 godzinach, a stanowily one zakazona 60 kontrole. Jeszcze inna grupe 3—5 dniowych kur¬ czat karmiono papkowata dieta wolna od zwiazku antybiotycznego 53 607 i nie zakazano jej kokcy- diami. Te stanowily kontrole normalna. Wyniki traktowania oceniano po 5 dniach w przypadku 55 E. acervulina, a po 6 dniach dla wszystkich innych 40130 045 li 12 T abela I Organizm Staphylococcus aureus 1 Streptococcus faecalis Streptocoocus pyogenes Corynebacterium pyagenes Baoillus subtilis Bacteriloides fragilis Bacteroides vulgarLs Haemophilus influenza Pasteurella multocida Clostridium perfrimgeiis Neisseria sieca Staphyloceocus epidermis Fusobacterium necroforum Treponema hyodysenteriae 01A005 01A052 01Al 10 O1A4O0 02A006 020203 lipooi 06A 001 78C004 7SC009 78C010 78E032 54A036 54A037 54A059 59A001 10A002 10A003 060000 01B087R 01B111RR 01B126 84C004 94A001 94A002 MIC, mcg/ml Zwiazek 53 607 (sól sodowa) J 0,78 0,78 1,56 1,56 1,56 <0,01 25 0,39 12,5 6,25 6,25 3,12 6,25 3,12 12,5 200 0,98 0,98 25 0,78 0,78 1,56 3.12 0,39 0,098 1 Tabela II Gatunek zakazajacy Eimeria te ella Eiineria acervulina Eimeria necatrix Eimeria maxima Eimeria brunetti Dawka (ppm) 200 100 50 25 200 100 50 25 200 100 50 25 200 100 50 25 200 100 50 25 Przecietny stopien1 infekcji 1,3 1,0(1,3) 2,7 (0,3) 3,0(1,7) 1,5 1,2 2,0 2,0 0,0 0,2 0,6 1,5 0,8 1,0 1,4 — 0,4 1,0 2,6 Stosunek1 0,41 0,32 (0,37) 0,86 (0,09) 0,95 (0,49) 0,^5 0,60 1,00 1,00 0,00 0,11 0,33 0,94 0,50 0,63 0,88 — 0,22 0,55 1,44 Uzysk wagi (%) 37 57 (60) 22 (97) 47 (102) 2 1 22 18 7 69 99 Ul 10 37 70 51 I 1 47 | 49 47 l Kryteria stosowane do mierzenia czynnosci, przeciwKokcy dialnej s^iadaiy sie. z oceny wzerów od 0 do 4 dla E. Uk * nella, wedlug J. E. Lynch „A New Method for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity". Am. J. Vet. Res. 22*324,—326 (1961); i 0; do a dla, innych gatunków, w oparciu o modyfikacje systemu oceny opracowana, puz^z J. Jofcnso- na i W. H. Reida, „Anticoccidial drugs. Lesion Scoring Techniaues in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Eilp. Farasit. 28:30—3&(1970). "Ustalono sialy stosunek dzielac ocene wzerów w kazdej traktowanej grupie przez ocena? Wzerów gru^y zakazpriej ÓfoniEol*).130 945 13 14 rzakazen. W tabeLi II zestawiono uzyskane wyniki.Wartosc karmienia .zwierzecia ogólnie okreslano tezpoj&rednio przez karmienie zwierzecia. Brytyjski •opis patentowy nr 1197 826, podaje szczególy oraz technika pierwszego zoladka in vitro, gdzie zmia¬ ny powodowane w pozywieniu przez mikroorganiz¬ my mierzy sie latwiej i z wieksza dokladnoscia w ocenie pozywienia zwierzecia. Technika ta obejmu¬ je stosowanie aparatu, w ktoryim proces trawien¬ ny zwierzat prowadzi sie i bada in vitro. Pozy¬ wienie zwierzecia, inokulum zoladka i rozne pro- motory wzrostu wprowadza sie do i pobiera z jed¬ nostki laboratoryjnej w starannie regulowanych warunkach, a zachodzace zmiany bada sie krytycz¬ nie i progresyiwnie w trakcie konsoimpcji pozywie¬ nia pnzez mikroorganizmy. Wzrost zawartosci kwa¬ su propionowego w plynie zoladkowym wskazuje na zadana odpowiedz w ogólnej czynnosci zoladka przez promotor wzrostu w skladzie pozywienia.Zmiane zawartosci kwasu propionowego wyraza sie jako procent zaiwartoóoi kwasu propionowego zna¬ lezionego w plynie zoladkowym kontroli. Dlugo¬ trwale badania zywienia in vitro stosuje sie do wykazania wiarogodnej korelacji miedzy wzrostem kwasu propionowego w plynie zoladkowym i lepsza czynnoscia zwierzat.Plyn zoladkowy pobiera sie sonda od krowy, kar¬ mionej handlowa racja tuczaca plus siano. Plyn zoladkowy natychmiast przesacza sie przez plótno do cedizenia sera i 10 ml dodaje do 50 mi stozko¬ wego naczynia zawierajacego 400 mg standardowe¬ go sjubstratu (68% skrobda kukurydziana + 17% ce¬ lulozy + 15% ekstrahowanej maki sojowej), 10 ml buforu pH 6,6 i badany zwiazek. Naczynia gazuje sie w ciagu okolo 2 minut azotem wolnym od tle¬ nu i inkubuje we wstrzasowej kapieli wodnej w ciagu okolo 16 godzin. Wszystkie próby prowadzi sie w trzech powtórzeniach.Po inkubacji, 5 ml próbki miesza sie z 1 ml 25% kwasu metalosiforowego. Po 10 minutach do¬ daje sie 0,25 ml kwasu mrówkowego i wiruje mie¬ szanine przy 1500 obrotach na minute w ciagu 10 minut. Nastepnie próbki analizuje sie chromato¬ grafia gazowa, sposobem wedlug D.W. Kellog, J.Diary Science, 52, 1690 (1969). Oznacza sie wysokosci pików dla kwasu octowego, propionowego i ma¬ slowego dla próbek z inkubowanych kolb nietrak- towanych i traktowanych.Badany powyzsza procedura in vitro, zwiazek antybdotyczny 53607 na poziomie 20 mikrogramów na milimetr dal okolo 57% wzrost produkcji kwa¬ su propionowego w stosunku do tego produktu w roztworze kontrolnym bez dodania antybiotycznego zwiazku 58607. Dla porównania, dostepna w han¬ dlu monensyna (inny poldcykliczny)antybiotyk ete¬ rowy), na poziomie 10 unr/lrni daje okolo 20% wzrost kwasu propionowego w stosunku do kon¬ troli (J. Amef. Chcm. Soc 89, 6737 (1969)). iPorównany z salinomycyna (1974) zwiazek antybiotyczny 53607 dawal okolo 43% wzrost kwasu propionowego na poziomie $0 jjjg/mi i okolo 40% wzrost przy 5 |ig/ml, w po- Tównaniu ze wzrostem o okolo 52% dla salino- jnycyny przy 5 (ig/ml.Bazujac na tych danych mozna przewidziec, ze zwiazek antybdotyczny 53 607 polepszy utylizacje paszy przez zwierzeta przezuwajace, takie jak by¬ dlo i owce i przez zwierzeta jednozoladkowe, takie jak swinia i króliki. Zwia!zek antybiotyczny 53 607 5 mozna dodawac do kompozycji paszowej w postaci wolnego kwasu, soli sodowej, soli potasowej lub ich mieszanin. Surowe postaci zwiazku antybio- tycznego 53 607 lub suszona brzeczke fermentacyjna zawierajaca antybiotyk mozna dodawac do kompo- 10 zycji paszowej na zadanym poziomie stezenia ak¬ tywnosci.Ponizsze przyklady pelniej ilustruja operacje we¬ dlug wynalazku lecz nadazy rozumiec, ze wynala¬ zek: nie jest ograniczony przykladami. 15 Przyklad I. a) Inokulum. Sporzadzono sterylna pozywke wod¬ na o nastepujacym skladzie: Skladnik gramów/litr Preparat Cerelose 10 20 skrobda 20 ekstrakt z drozdzy 5 Preparat NZ Amine YTT* 5 , wodorofostforan dwupotasowy 0,5 maczkamiesna 5 25 chlorek kobaltu 0,002 weglanwapnia 4 pH 7,1—7,2 Komórki ze skosu Streplomyces halstedil ATCC 31812 przeniesiono do serii kolb o pojemnosci 300 30 ml zawierajacych 40 ml tej sterylnej pozywki i wstrzasano na wstrzasarce obrotowej w tempera¬ turze 2&-^36°C, w ciagu 3-^4 dni. to) Fermentacja. Podwdelokrotnosc rosnacej ho- dowli^ wystarczajaca do uzyskania 2% objetosc/ob- 35 jetosc inokulum przeniesiono do czterolitrowych fermentorów zawierajacych po dwa litry naste¬ pujacej sterylnej pozywki: Skladnik gramów/litr Preparat Cerelose 10 40 Preparat NZ AmineA 5 skrobia 20 ekstrakt z drozdzy 5,0 weglan wapnia 1,0 woda — uzupelnienie do 1000 ml 45 Fermentacje prowadzono w temperaturze 30°C przy mieszaniu z szybkoscia 1700 obrotów na mi¬ nute (RPM) i napowietrzania jedna Objetosc po¬ wietrza na objetosc brzeczki na minute do zaob¬ serwowania znacznej aktywnosci (bazowanej na 50 oznaczeniu krazkowym antybiotyku wobec B. sub- tilis ATCC 6633 *), zwykle 3—5 dni. Cala brzeczke * Rejestrowany znak handlowy enzymatycznego hydro¬ lizatu kazeiny, Humko Sheffield Chemical Co., Inc.• Bioaktywnosc brzeczki i nastepne strumienie odzysku 55 ^ kontrolowano stosujac wrazliwy szczep Baccilus sub- tilis ATCC 6633 lub Staphylococcus aureus ATCC 6538.Skladniki w brzeczce 1 strumieniach odzysku uwido¬ czniono stosujac plyty z zelem krzemionkowym w na¬ stepujacym ukladzie: octan etylu/metanol 9 : l lub chloroformymetanol 9:1, a plyty spryskiwano wani- 60 lina (3 g waniliny w 97,0 ml etanolu i 3,0 ml stez. kwasu siarkowego) i nastepnie ogrzewano w 80°C.Alternatywnie, plyty nakladano na agar, posiewano S. aureus lub B. subtilii do których dodawano 1,0 mi 1% roztworu tetrazoliowego i inkubowano w 37°C w ciagu 16 godzin, dla uwidocznienia antybiotyku (kla- g5 równe obszary wobec rózowego tla).130 945 15 1C saczono przy obojetnym pH, stosujac srodek ulat¬ wiajacy saczenie (Super Cel lub Celite), przesacz ekstrahowano ketonem metyioizobutylowym lub n-butanolem. Faze organiczna oddzielono od fazy wodnej przez zassanie i przesaczano dla usuniecia zawieszonego materialu. Placek filtracyjny zawie¬ szano w metanolu, saczono, odparowywano meta¬ nol, a pozostalosc ekstrahowano tym samym roz¬ puszczalnikiem, jaki stosowano do ekstrakcji brze¬ czki. Ekstrakty polaczono i odparowano w prózni, otrzymujac lepki olej. Olej zawieszono w heptanie, mieszano z zelem krzemionkowym i saczono. Pla¬ cek filtracyjny wielokrotnie przemyto heptanem, a produkt eluowano stopniowo samym chlorofor¬ mem, mieszaninami chloroformu i octanu etylu i na koncu octanem etylu. Po chromatografii cienko¬ warstwowej (TLC) i analizie biologicznej frakcji, frakcje aktywne polaczono i odparowano w prózni, a pozostalosc rechromatografowano, otrzymujac zwiazek antybdotyczny 53 607 w postaci ciala stale¬ go. Widmo w podczerwieni (pastylka KBr) mikro¬ nów: 2,95, 3,42, 6,00, 6,37, 6,95, 7,14, 7,30, 7,65, 7,00, 8,10, 9,05, 9,(15, 9,67, 10,00, 10,18, 10,53, 11,15, 11,40, 11,75, 13,25. Stwierdzono, ze jest on rozpuszczalny w chloroformie, octanie etylu, metanolu i ketonie metyloizobutylowym nierozpuszczalny w wodzie.Przyklad II. Sporzadzono inokulum jak opi¬ sano w poprzednim przykladzie, z tym, ze stoso¬ wano 700 ml pozywki na kolbe, a inokulum we wstrzasanych kolbach fermentowano w ciagu 3—4 dni w temperaturze 28°C. Stosowano butle z dwo¬ ma ramionami bocznymi.Fermentor o pojemnosci 6435 1 zawierajacy 45401 ponizszej sterylnej pozywki inokulowano szescio¬ ma litrami (0,1%) powyzszego inokulum: Pozywka fermentacyjna Skladnik gramów/litr Preparat Ce elose 1,0 kazeina 5,0 skrobia 5,0 namok kukurydziany 5,0 ml weglan wapnia 3,0 chlorek kobaltu 0,002 woda do 1 litra p±i 6,9—7.0 Fermenitor utrzymywano w temperaturze 28°C, przy napowietrzaniu i mieszaniu z szybkoscia 1700 RPM. Po 120 godzinach fermentor oprózniono. Ca¬ la brzeczke 4540 1 ekstrahowano 945 litrami ketonu metyloizdbutylowego, warstwy rozdzielono w eks- traktorze (jPodbdelniak), a faze organiczna odparo¬ wano w prózna, otrzymujac okolo 30 1 oleju. Olej dalej odparowywano w prózni w wyparce obroto¬ wej. Pozostaly syrop zawieszono w deptanie, mie¬ szano z zelem krzemionkowym i saczono, kilka¬ krotnie przemywajac heptanem. Przemyty placek filtracyjny przerobiono jak opisano w przykladzie I, otrzymujac 300 g oleju. Olej rozpuszczono w ma¬ lej ilosci chloroformu, roztwór wylano na filtr (Lapp) zawierajacy 3^5 kg zelu krzem:onkowego (Merck, gatunek 60), a zloze zelu krzemionkowego przemyto kolejno porcjami po 5 galonów chloro¬ formu, octanu etylu i acetonu. Frakcje badano chromatografia cienkowairstwowa. Stwierdzono, zer produkt znajduje sie prawie wylacznie we frakcji. octanu etylu, Pozostale frakcje odrzucono, frakcje; octanu etylu odparowano do sucha w prózni, otezy- 5 mujac 160 g koncentratu. Koncentrat dalej oczy¬ szczano chromatografia na 8,0X1000 cm kolum¬ nie wypelnionej zelem krzemionkowym (Merck, ga¬ tunek 60), przez zawieszenie w octanie etylu. Ko¬ lumne eluowano octanem etylu, pobierajac 1 litro— 10 we frakcje z szybkoscia 60 ml/minute. Frakcje za¬ wierajace produkt polaczono i odparowano w próz¬ ni, otrzymujac 85 g produktu.Produkt przepuszczono przez kolumne zawiera¬ jaca jeden kilogram Sephadex LH-20, eluujac me- 15 tanolem z szybkoscia przeplywu 0,25 ml/minute- Pobierano frakcje 300 ml. Polaczenie frakcji za¬ wierajacych produkt i odparowanie rozpuszczalni¬ ka dalo 30 g materialu stalego. Material ten roz¬ puszczono w 500 ml chloroformu, roztwór przemy- 20 to taka sama objetoscia 5% buforu NaHiP04, który doprowadizono do pH 4,5 za pomoca 85% kwasu fosforowego. Oddzielono faze organiczna, przemyto- 500 ml 5% buforu Na2HP04 doprowadzonego do pH 9,0 za pomoca LN wodorotlenku sodu. Ekstrakt wy- 25 suszono nastepnie nad bezwodnym siarczanem so¬ du i odparowano do sucha w prózni. Pozostalosc rozpuszczono w acetonie i pozostawiono do krysta¬ lizacji w lodówce. Krysztaly zebrano przez sacze¬ nie i wysuszono pod wysoka próznia w temperatu- 30 rze pokojowej, otrzymujac 14 g soli sodowej zwiaz¬ ku antybiotycznego 53 607, temperatura topnienia 199—204°C.Skrecalnosc optyczna: (alfa)D + 44° (c=l, chloro- 35 form) (alfa)D+37° (c=a, metanol).Widmo w nadfiolecie: lambdamax, 233 nm (metanol) 1% E = 212 1 cm 40 Widma w podczerwieni (pastylka KBr) mikronów: 2,95, 3,42, 6,00, 6,37, 6,85, 7,14, 7,30, 7,65, 7,90, 8,10, 9,05, 9,15, 9,67, 10,00, 10,18, 10£3, 1,1,15, 11,40, 11,75, 13,25.Widmo w podczerwieni przedstawiono na figurze 1.Analiza elementarna: C 57,54; H 7,74; N 0,0.Stosujac bufor KH^P04 (pH 4,5) i K2HP04 do¬ prowadzony do 9,0 za pomoca IN wodorotlenku po¬ tasu w powyz5izej procedurze, w podobny sposób 50 otrzymuje sie sól potasowa zwiazku antybiotycz¬ nego 53G07. Podobnie otrzymuje sie sól amonowa, stosujac w powyzszej procedurze (NH4)H2P04 i (NH4)£HP04. 55 Przyklad Iii.Czesc powyzszej soli sodowej zwiazku antybio¬ tycznego 53 607 rozpuszczono w octanie etylu, do¬ dano wody i za .pomoca 85% kwasu fosforowego doprowadzono faze wodna do pH 4,5. Oddzielono 60 warstwe organiczna, wysuszono (NajS04) i odpa¬ rowano w prózni, otrzymujac wolny kwas zwiaz¬ ku 53 607, temperatura topnienia 84-^94°C. Analize elementarna otrzymano na próbce suszonej w cia¬ gu nocy pod wysoka próznia w temperaturze poko- 65 jowej: C 64,96, H 8,91; N 0,0. 4517 130 M5 u Stwierdzono, ze kwas jest nierozpuszczalny w -wodzie; rozpuszczalny w ohioroformde, octanie ety¬ lu, metanolu i ketonie metyloizobutylowym.Widmo w nadfiolecie: lambdamdx 233 nm (metanol) 1% E =196. lem Widmo w podczerwieni (pastylka KBr) mikronów: .2,85, 3,46, 6,00, 6,66, 7,128, 843, 9,05, 9,67, 10,20, 10,55, 11,15, 1.1,48.Widmo jest przedstawione na figurze 2.Sól barowa sporzadza sie przez wstrzasanie 2,0 g wolnego kwasu rozpuszczonego w 80 ml octanu etylu z taka sama objetoscia wody zawierajacej 2,4 g osmiowodzianu wodorotlenku baru. Rozdzie¬ la sie warstwy, faze organiczna przemywa swiezym roztworem Ba(OH), • 8H*0, suszy (NaiSOi) i odpa¬ rowuje w prózni, otrzymujac zadana sól zwiazku antybiotycznego 53 607.Sól wapniowa otrzymuje sie powyzsza procedu¬ ra, lecz stosujac zamiast osmiowodzianu wodoro¬ tlenku baru wodorotlenek wapnia.Przyklad IV.(Przeprowadza sie procedure z przykladu I lecz stosujac 4% objetosciowo/objetosciowych inokulum w czterolitrowych fermentorach, zawierajacych po dwa litry nastepujacej sterylnej pozywki: Skladnik Preparat Cerelosa skrobia kukurydziana maka sojowa weglan wapnia graniow/titr 10 10 10 1 fermentujacy material staly kukurydzy 5 chloreksodu 5 pH 7,0 Fermentacje prowadzono w ciagu dwóch dni w 5 temperaturze 36°C, przy mieszaniu z szybkoscia 1700 RPM i przepuszczeniu powietrza z szybkos¬ cia 2 objetosci /1 objetosc brzeczki na minute. Ca¬ la brzeczke ekstrahowano chloroformem i przero¬ biono jak opisano w przykladzie I, otrzymujac 10 zwiazek antybiotyczny 53 607 w postaci mieszani¬ ny soli sodowej, potasowej i wapniowej.Gdy powtarza sie powyzsza procedure stosujac pozywke fermentacyjna zawierajaca zamiast ce- relozy gliceryne, zamiast fermentujacego materialu 15 stalego kukurydzy maczke rybna lulb make z na¬ sienia bawelny i prowadzac fermentacje przy pH 8,0, w temperaturze 28°C w ciagu 6 dni, wyniki sa zasadniczo nie zmienione. 20 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego, kwasowego, po- licyklicznego antybiotyku eterowego o wzorze po- 25 danym na zalaczonym rysunku, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle mikroorganizmu Strepto- myces halstedii ATCC 31812 w wodnych pozyw¬ kach hodowlanych zawierajacych asymilowane zród¬ lo wegla, azotu i nieorganicznych soli, w warun- 30 kach podpowierzchniowej fermentacji aerobowej, az do uzyskania znacznej ilosci tego antybiotyku. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze antybiotyk wydziela sie z pozywki fermentacyjnej. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze » pozywke fermentacyjna doprowadza sie do stanu suchego. jp.i. j-iff.2.SD £0. 70 tir. 50 CO 30 r\ -i -li 1 Ml 1 M i i ' ? 3 I I J~—uJ I i /ITK /ii h\ /Mi 1/ I I ii [ 1 1 i 1 Ia III 1 1 1 1 1 4 ó & 1 1 ! In 1 1 i 1 i i r- i \m A Mn "i ' iiiN Jl M \E (' 1A MII i I Al M P1 *' mJn i i 1 i I M i 1 m r II III1 1 1 MMMM 1 l ! I 1 1 ! 1 1 1 '/ 5 S K) Jl I | | ! i | ! 1 1 | 1 [ MIII ft M ' 1 U H i M fi Ul JM U n\\ 1 M MM M V }—1—T —< ! ———i —i—i—' M'1 1 1 M | i i MIM | 1 | | | 1 i ' J2 13 14L 3 A ó &7d310 11l2i3J4130 945 CHjCt^ PZGraf. Koszalin A-27 85 A-4 Cena 100 zl PL PL PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego, kwasowego, po- licyklicznego antybiotyku eterowego o wzorze po- 25 danym na zalaczonym rysunku, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle mikroorganizmu Strepto- myces halstedii ATCC 31812 w wodnych pozyw¬ kach hodowlanych zawierajacych asymilowane zród¬ lo wegla, azotu i nieorganicznych soli, w warun- 30 kach podpowierzchniowej fermentacji aerobowej, az do uzyskania znacznej ilosci tego antybiotyku. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze antybiotyk wydziela sie z pozywki fermentacyjnej. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze » pozywke fermentacyjna doprowadza sie do stanu suchego. jp.i. j-iff.

2. SD £0. 70 tir. 50 CO 30 r\ -i -li 1 Ml 1 M i i ' ? 3 I I J~—uJ I i /ITK /ii h\ /Mi 1/ I I ii [ 1 1 i 1 Ia III 1 1 1 1 1 4 ó & 1 1 ! In 1 1 i 1 i i r- i \m A Mn "i ' iiiN Jl M \E (' 1A MII i I Al M P1 *' mJn i i 1 i I M i 1 m r II III1 1 1 MMMM 1 l ! I 1 1 ! 1 1 1 '/ 5 S K) Jl I | | ! i | ! 1 1 | 1 [ MIII ft M ' 1 U H i M fi Ul JM U n\\ 1 M MM M V }—1—T —< ! ———i —i—i—' M'1 1 1 M | i i MIM | 1 | | | 1 i ' J2 13 14L 3 A ó &7d310 11l2i3J4130 945 CHjCt^ PZGraf. Koszalin A-27 85 A-4 Cena 100 zl PL PL PL PL