FI71950C - Foerfarande foer framstaellning av ett nytt polycykliskt eterantibiotikum genom odling av stammen streptomyces halstedii atcc 31812. - Google Patents

Description

71 950

Menetelmä uuden polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi viljelemällä kantaa Streptomyces halstedii ATCC 31812.

Keksinnön kohteena on uuden happamen polysyklisen 5 eetteriantibiootin valmistus, jolle antibioottiryhmälle on biologisesti ominaista vaikutus kationien kuljetukseen mitokondri-oissa. Tähän antibioottisukuun kuuluvat monensiin! /J. Amer. Chem. Soc., 89-5737 (1967)7; nigerisiini ZBiochem. Biophys. Res. Comm. , 33: 29, 1968)_7? grisoriksiini £ J. Chem. Soc., Chem.

10 Commun., 1421 (1970)7; dianemysiini /J. Antibiotics, 22: 161 (1969)7; salinomysiini /J. Antibiotics. 27: 814 (1974)7; X-537A /7. Chem. Soc. Chem. Commun., 967 (1972)7; X-206 /J. Chem. Soc., Chem.Commun., 927, (1971)7; A204A /J. Amer. Chem. Soc., 95: 3399 (1973)7; mutalomysiini /J. Antibiotics., 30: 903, (1977)7; 15 ionomysiini /J. Amer. Chem. Chem. Soc., 101: 3344 (1979)7; K-41B /J. Antibiotics, 32: 169 (1979)7; A-130B ja A-130C fj. Antibiotics, 33:94 (1980)7; leuseramysiini /5· Antibiotics, 33: 137, (1980)7; ja A-28695B ZJ. Antibiotics, 33: 252, (1980)7. Aihetta on myös yleisesti käsitellyt Westley, "Polyether Anti-20 biotics", Adv. Appi. Microbiol., 22: 177 (1977).

Julkaisussa Chem. Abstr. voi. 87 (1977) 165946 x: Bio-technol. 1977, 27 (6) 318-325, Chem. Abstr. voi. 90 (1979) 101947 c:Jp-A- 78141202, Chem. Abstr. voi. 92 (1980) 56810 f: Jp-A-79103801 on kuvattu Streptomyces halstedii-kantojen tuot-25 tamia antibiootteja, ja US-patenttijulkaisussa 4 269 971 on kuvattu polyeetteriantibiootti TM-531, jota tuottaa Streptomyces hygroscopicus.

Edellä luetellut polysykliset eetteriantibiootit ovat aktiivisia gram-positiivisia bakteereita, sieniä ja alkueläi-30 miä vastaan. Näillä antibiooteilla on voimakas antikokkidi-aalinen aktiivisuus.

Hyvin tunnettu alkueläinsairaus, kokkidioosi, on jatkuvasti vakava ongelma ja sen torjuminen on taloudellisesti tärkeää eläinlääketieteelle, erityisesti siipikarjateollisuudelle. 35 Kokkidioosi on seuraus yhden tai useamman Eimeria- tai Isospora-lajien aiheuttamasta infektiosta (yhteenvedon ovat esittäneet Lund ja Farr julkaisussa "Diseases of Poultry", 5. painos, 2 71950

Biester ja Schwarte, toim., Iowa State University Press, Ames, la., 1965, sivut 1056-1096). On olemassa kuusi kokkidialajia, jotka aiheuttavat helposti havaittavissa olevia taudinoireita herkissä kananpojissa. Eimeria tenella, E. necatrix, E.

5 brunetti, E. acervulina, E. maxima ja E. mivati aiheuttavat vahinkoa joko suoraan tuhoamalla ruoansulatuskanavan epiteelisoluja tai epäsuorasti tuottamalla toksiineja. Kolmea muuta alkueläinlajia, jotka kuuluvat samaan sukuun, pidetään suhteellisen vaarattomina; kuitenkin E. mitis, E. hagani ja E. praecox 10 pystyvät vähentämään painon lisääntymistä, alentamaan rehun hyväksikäyttöä ja vaikuttamaan vahingollisesti munien tuotantoon .

Ottaen huomioon kokkidioosista aiheutuvat suuret taloudelliset menetykset ja joidenkin tunnettujen antikokkidiaalis-15 ten aineiden etsintä.

Enteritis (suolitulehdus) on toinen sairaus, joka voi aiheuttaa vakavia taloudellisia menetyksiä kotieläintuottajille. Enteritistä esiintyy kanoilla, sialla, nautakarjalla ja lampailla ja se aiheutuu pääasiallisesti anaerobisista bakteereista, 20 erityisesti Clostridium perfringens'istä sekä viruksista.

Enterotoksemia (suolisyntyinen myrkytys) märehtijöillä, josta "ylensyöntitauti" lampaalla on esimerkki, on C. perfringens-infektion aiheuttama tila.

Sian punatauti on eräs Yhdysvalloissa esiintyvistä 25 tavallisimmista sikasairauksista. Lisäksi tämä tauti on vallitseva monissa muissa maissa ja aiheuttaa vuosittain monien tuhansien dollareiden menetykset karjassa siankasvattajille kautta maailman. Äskettäin on havaittu, että suuri spirokeetta on tämän taudin aiheuttava organismi. Tämä organismi. Treponema 30 hyodysenteriae, on nyt eristetty ja sen on osoitettu pystyvän aiheuttamaan tätä tautia /Harris, D.E. et ai.: "Swine Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriae (New Species) and Reproduction of the Disease", Vet. Med/SAC, 67: 61-64: 1972/. Tämän jälkeen luetellut testiarvot koskevat testejä, 35 jotka on suoritettu tällä organismilla. On huomattava, että ei ole tunnettua, onko T. hyodysenteriae ainoa sian punatautia aiheuttava organismi. Käytettävissä olevista tiedoista voidaan kuitenkin päätellä, että se on infektion ensisijainen lähde.

3 71950

Hyötysuhteen parantaminen (lisääntynyt kasvunopeus ja/tai rehun hyödyntämisen lisääntynyt tehokkuus) märehtijöillä, kuten nautakarjalla, on toinen eläinlääketieteen taloudellisesti toivottava tavoite. Erityisen kiinnostavaa 5 on kasvun edistyminen, joka on saavutettu lisäämällä rehun hyödyntämistehokkuutta. Mekanismi märehtijöiden rehun ravitsevan pääosan (hiilihydraattien) hyväksikäyttämiseksi on hyvin tunnettu. Mikro-organismit eläimen pötsissä hajottavat hiilihydraattimolekyylejä monosakkaridien tuottamiseksi 10 ja muuttavat sitten nämä monosakkaridit pyruvaattiyhdisteiksi (palorypälehapon estereiksi). Pyruvaatit metabolisoituvat sitten mikrobiologisten prosessien vaikutuksesta muodostaen asetaatteja, butyraatteja tai propionaatteja, jotka yhteisesti tunnetaan haihtuvina rasvahappoina (VFA). Yksityiskoh-15 taisempaa kuvausta varten, ks. Leng julkaisussa "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et el., toim., Oriel Press, Newcastle-Upon-Tyne, Englanti, 1970, sivut 408-410.

VFA:n hyödyntämisen suhteellista tehokkuutta ovat 20 kuvanneet McCullough julkaisussa "Feedstuffs", kesäkuu 19, 1971, sivu 19; Eskeland et ai. julkaisussa J. An. Sei.

33, 282 (1971); ja Church et ai. julkaisussa "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", nide 2, 1971, sivut 622 ja 625. Vaikka asetaatteja ja butyraatteja käytetään 25 hyväksi, käytetään propionaatteja hyväksi suuremmalla tehokkuudella. Lisäksi, kun propionaattia on käytettävissä liian vähän, voi eläimissä kehittyä ketonimyrkytys. Siten edullinen yhdiste kiihottaa eläimiä tuottamaan suuremman osan propionaatteja hiilihydraateista lisäten siten hii-30 lihydraatin hyväksikäytön tehokkuutta ja pienentäen myös ketonimyrkytyksen esiintymismahdollisuutta.

Vielä eräs tauti, joka aiheuttaa taloudellisia menetyksiä kotieläintuottajille, aiheutuu Theileria-suvun al-kueläinloisen vaikutuksesta. Tämä tauti, teilerioosi, tun-35 netaan myös "itärannikon kuumeena", "rannikkokuumeena" tai "Rhodesian punkkikuumeena". Theileria-loinen elää punaisissa verisoluissa, mutta ei tuhoa niitä, mikä aiheuttaa akuutteja tai 4 71950 kroonisia kuumeisia infektioita. Nautakarjassa taudille on ominaista korkea kuume, imusolmukkeiden turpoaminen, laihtuminen ja suuri kuolleisuus. Tämä tauti on hyvin vakava ongelma Itä- ja Keski-Afrikassa. Yksityiskohtaisempaa kuvausta varten 5 teilerioosista, ks. "The Merck Veterinary Manual", Siegmund et ai., toim. Merck & Co., Rahway, N.J., 5. painos, sivut 431-433 (1979).

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi, jolla on kaava 10 0H H CH~ v ^ CH^ f *“^3 CH^ H A Vch3 15 X H Ck3 'H ° H Oj.^

0 OH CH2OH

Menetelmässä viljellään mikro-organismia Streptomyces halstedii ATCC 31812 vesipitoisissa viljelyvälineaineissa, jotka sisältä-^ vät assimiloituvan hiililähteen, typpeä ja epäorgaanisia suolo ja, upotetuissa aerobisissa fermentointiolosuhteissa, kunnes saadaan olennainen määrä tätä antibioottia. Streptomyces halstedii ATCC 31812 on eristetty Japanista saadusta maaperänäyt-teestä.

^ Piirroksissa on esitetty seuraavat infrapuna-absorptio- kirjot kaliumbromidissa:

Kuvio 1 - antibiootti 53.607 natriumsuolan muodossa; kuvio 2 - antibiootti 53.607 vapaassa happomuodossa.

Tämän keksinnön antibioottia tuottava mikro-organismi ^ eristettiin maaperänäytteestä, joka oli kerätty Hiroshimassa,

Japanissa. Mikro-organismilla havaittiin tutkittaessa olevan Streptomyces1 in morfologisia ominaispiirteitä. Sillä havaittiin olevan Actinomycetales'in hyyfit ja ilmahuovasto, jossa on itiöketjuja, jotka ovat luonteenomaisia Streptomyces-suvul-^ le. Suvun identtisyys vahvistettiin lisäksi soluseinäanalyy- sillä.

Tämän mikroorganismin viljelmä ympättiin vinopinnasta nestemäiseen ATCC ΦΦ 172 -väliaineeseen ja kasvatettiin neljä päivää 28°C:ssa täristimellä. Se poistettiin sitten täristi- 71950 meitä, lingottiin, pestiin kolme kertaa steriilillä tislatulla vedellä ja ympättiin väliaineisiin, joita tavallisesti käytetään Actinomycetales'in jäsenten tunnistamiseen.

Inkubointi tapahtui 28°C:ssa, paitsi missä toisin on 5 esitetty ja tulokset merkittiin muistiin sopivina ajankohtina; tässä annetut tulokset ovat kaksi viikkoa inkuboinnin jälkeen paitsi missä toisin on esitetty.

Tunnistamisväliaineet, joita käytettiin viljelmän karakterisointiin, sekä viitteet niiden koostumukseen olivat seuraa-10 vat: 1. Tryptoni-hiivauuteliemi - (ISP φφ 1 väliaine, Difco).

2. Hiivauute-mallasuute-agar - (ISP ΦΦ 2 väliaine,Difco).

3. Kaurajauho-agar - (ISP ΦΦ 3 väliaine, Difco).

4. Epäorgaanisia suoloja-tärkkelys-agar - (ISP φφ 4 15 väliaine, Difco).

5. Glyseroli-asparagiini-agar - (ISP ΦΦ 5 väliaine,Difco).

6. Peptoni-hiivauute-rauta-agar - (ISP ΦΦ 6 väliaine,

Difco).

7. Czapek-sakkaroosi-agar - (S.A. Waksman, "The Actino-20 mycetes", nide 2, väliaine nro 1, s. 328, 1961.

8. Glukoosi-asparagiini-agar - sama, väliaine nro 2, s.

328.

9. Bennett'in agar - sama, väliaine nro 30, s. 331.

10. Enerson'in agar - sama, väliaine nro 28, s. 331.

25 11. Ravintoaine-agar - sama, väliaine nro 14, s. 330.

12. Gordon'in ja Smith*in tyrosiini-agar - R.E. Gordon ja M.M. Smith, Jr. Bact. 69: 147-150, 1955.

13. Kaseiini-agar - sama.

14. Kalsium-malaatti-agar - S.A. Waksman, Bact. Rev.

30 21: 1-29, 1957.

15. Gelatiini - R.E. Gordon ja J.M. Mihm, Jr. Bact. 73: 15-27, 1957.

16. Tärkkelys - sama.

17. Orgaaninen nitraatti-liemi - sama.

35 18. Dekstroosi-nitraatti-liemi - S.A. Waksman, "The

Actinomycetes", nide 2, väliaine nro 1, s. 328, 1961, jolloin 30 g sakkaroosia on korvattu 3 g:11a dekstroosia ja agar jätetty pois.

6 71950 19. Peruna-porkkana-agar - M.P. Lechevalier, Jr. Lab. and Clin. Med. 71: 934-944, 1968, mutta käyttäen ainoastaan 30 g perunoita, 2,5 g porkkanoita ja 20 g agaria.

20. 2 %:n vesijohtovesi-agar.

5 21. Kuorittu maito - Difco.

22. Selluloosan hyväksikäyttö - a) H.L. Jensen, Proc. Lin. Soc. N.S.W. 55: 231-248, 1930.

b) M. Levine ja H.W. Schoenlein, "A Compilation 10 of Culture Media", väliaine nro 2511, 1930.

23. Hiilihydraatit - ISP # 9 väliaine, Difco; Nonomura'n ja Ohara'n C-2 väliaine julkaisussa Nonamura, H. ja Y. Ohara, J. Ferment. Technol. 49: 887-894, 1971.

24. Lämpötila-alue - ATCC väliaine 172 julkaisussa 15 "ATCC Culture Collection Catalogue", 14. painos, s. 518, 1980 .

Uutta viljelmää (Pfizer N393-39) kuvattiin seuraavasti eri väliaineilla värein, joita on selostettu yleisessä terminologiassa, mutta tarkat värit määritettiin ver-20 taamalla väriliuskoihin käsikirjasta Color Harmony Manual, 4. painos :

Hiivauute-mallasuute-agar - kasvu hyvä, kermanväri-sestä vaaleankellertävään (lähellä 2 ca), kohtuullisesti noussut, sileä, karheni ryppyiseksi, ei ilmahuovastoa; kään-25 töpuoli sama kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä.

Kaurajauho-agar - kasvu kohtuullinen, harmaasta ruskehtavan harmaaseen (2 ge, 2 lg-2 ni), ohuesta lievästi nousseeseen, sileä, pieniä valkoisia pisteitä; ilmahuovas-to hajanainen, valkoisesta vaaleanharmahtavaan; kääntöpuoli 30 sama kuin pinta; liukoinen pigmentti vaaleankellertävä.

Epäorgaanisia suoloja-tärkkelys-agar - kasvu kohtalainen, kellertävän ruskeasta ruskeaan (2 ie, 3 ne:stä 3 le:hen), ohut, sileä, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli sama kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä.

35 Glyseroli-asparagiini-agar - kasvu huonosta kohta laiseen, himmeän valkoinen, ohut, sileä, muutamia pieniä 71950 valkoisia pisteitä; ilmahuovasto hajanainen, valkoinen; kääntöpuoli sama kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä.

Gordon'in ja Smith'in tyrosiini-agar - kasvu heikosta kohtuulliseen, värittömästä kermanväriseen (2 ca), ohut, 5 sileä, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli sama kuin pinta; ei il-mahuovastoa; kääntöpuoli sama kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä .

Czapek-sakkaroosi-agar - kasvu heikko, värittömästä himmeän valkoiseen, ohut, sileä, ilmahuovastossa joitakin 10 pieniä valkoisia pisteitä; kääntöpuoli sama kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä.

Glukoosi-asparagiini-agar - kasvu kohtalainen, kellertävän harmaasta laventelin harmaaseen (2 ig, 3 ge:stä 3 ig:hen), ohut, sileä, mutta lievästi rypistynyt lähellä 15 reunaa; ilmahuovasto vaaleanharmahtava (2 ge); kääntöpuoli sama kuin pinta; liukoinen pigmentti vaalean kellertävä.

Kalsium-malaatti-agar - kasvu heikko, väritön, himmeän valkoinen reunus, upoksissa, sileä, harmahtavassa (lähellä harmaata sarjaa 2 dc:stä 2 fe:hen) ilmahuovastossa pie-20 niä pisteitä; kääntöpuoli sama kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä.

Kaseiini-agar - kasvu kohtalainen, vaalean ruskehtava (2 ne:stä 3 ne:hen), ohut, sileästä lievästi karhenevaan, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli sama kuin pinta; ei liukoista 25 pigmenttiä.

Bennett'in agar - kasvu hyvä, ruskea (3 ng:stä 3 niihin), noussut, rypistynyt, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli sama kuin pinta; liukoinen pigmentti vaalean kellertävä (2 ca) .

30 Emerson'in agar - kasvu kohtalaisesta hyvään, vaa lean kellertävän ruskeasta (2 carsta 3 carhan) vihertävän harmaaseen (23 ge:stä 23 ig:hen), ohuesta nousseeseen, sileästä lievästi karhenevaan tai esiintyy membraanikuppei-na, jotka ovat epäsäännöllisesti rypistyneet, ei ilmahuo-35 vastoa; kääntöpuoli sama kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä .

71950

Ravintoaine-agar - kasvu heikosta kohtuulliseen; vaalean kellertävä (2 ca), ohut, sileä, ei ilmahuovastoa, kääntöpuoli sama kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä.

Gelatiini-agar - kasvu kohtalainen, vaalean keller-5 tävä (2 ca), ohut, sileä, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli sama kuin pinta, ei liukoista pigmenttiä.

Tärkkelys-agar - kasvu hyvä, kermanvärinen, vaalean kellertävästä ruskeaan (2 carsta lähelle 3 gc), ohuesta lievästi nousseeseen, sileä, mutta rypistynyt reunaa kohti, 10 ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli sama kuin pinta; ei liukoista pigmenttiä.

Peruna-porkkana-agar - kasvu kohtalainen, kermanvärinen (2 ca), reunus harmahtavasta tumman harmahtavaan (lähellä harmaata sarjaa 2 fe, 2 ih:sta 2 ml:ään), ohut, sileä, 15 ilmahuovasto harmaasta tumman harmaaseen; kääntöpuoli sama kuin pinta, ei liukoista pigmenttiä.

Vesijohtovesi-agar - kasvu heikko, värittömästä himmeän valkoiseen, ohut, sileä, joitakin pieniä valkoisia pisteitä ilmahuovastossa; kääntöpuoli sama kuin pinta. Ei liukoista 20 pigmenttiä.

Huomautukset biokemiallisista ominaisuuksista on koottu yhteenvedoksi seuraavasti: 1. Melaniinia ei syntynyt.

2. Rikkivetyä ei syntynyt.

25 3. Gelatiini nesteytyi.

4. Tärkkelys hydrolysoitui.

5. Nitraatti pelkistyi nitriitiksi.

6. Heikko kasvu Jensen'in selluloosalla.

7. Ei kasvua Levine'n ja Schoenlein'in selluloosalla.

30 8. Ei hajoamista kummallakaan selluloosa-väliaineella.

9. Ei koaguloitumista maidolla.

10. Ei peptonisoitumista maidolla.

11. Ei kaseiinin, kalsiummalaatin eikä tyrosiinin digeroitumista.

35 12. Hiilihydraatin hyväksikäyttö; 9 71950 I. Nonomura'n väliaineella käytettiin hyväksi glukoosia, arabinoosia ja ksyloosia: raffinoosia epävarmasti; sakkaroosia, inositolia, mannitolia, fruktoosia ja raffinoosia ei käytetty hyväksi.

II. ISP ΦΦ 9 väliaineella käytettiin hyväksi glukoosia, arabinoosia, ksyloosia ja sakkaroosia; fruktoosia, inositoosia, mannitolia, raffinoosia ja ramnoosia ei käytetty hyväksi.

Peruna-porkka-agarilla tehtiin seuraavat morfologiset havainnot 15 päivää inkuboinnin jälkeen: 10 Itiömassa harmaassa värisarjassa; itiöketjut suoria, käyristyneitä, epäsäännöllisesti mutkitteleviä tai aaltoilevia, harvoin koukistuneita, 10-30 itiötä itiöketjua kohti, harvemmin vähemmän kuin 10 itiötä itiöketjua kohti; itiöt soikeita, ellipsin muotoisista sauvan muotoisiin, 15 1 - 1,8 x 0,8 -0,9 ^um, sileitä, kuten pyyhkäisyelektroni- mikroskoopilla paljastettiin.

Lämpötilan suhde kasvunopeuteen havaittiin seuraa- vaksi : Lämpötila Kasvu 20 21°C hyvästä erinomaiseen 28°C hyvä 37°C kohtuullinen 45°C heikko

Kuten edellä mainittiin, vahvisti soluseinän analyysi viljelmän kuuluvan Streptomyces-lajiin. Koko solun analyysi osoitti LL-diaminopimeliinihapon ja glysiinin läsnäolon, mutta diagnostisten sokereiden poissaolon. Menetelmät, joita käytettiin kokosolun aminohappo- ja sokeriana-lyysejä varten, ovat kuvanneet Becker, B. et ai. julkaisus-30 sa Appi. Microbiol., 12: 421-423, 1964; ja Lechevalier, M.P. julkaisussa J. Lab. Clin. Med., 71: 934-944, 1968.

Viljelmälle N393-39 on ominaista massassa olevien itiöiden väri vaaleanharmaasta harmaaseen, itiöketjut suorista mutkitteleviin, sileät itiöt ja kyvyttömyys tuottaa 35 melaniinia. LL-diaminopimeliinihapon läsnäolo ja diagnostisten sokereiden poissaolo kokosolu-hydrolysaateissa vahvistaa sen kuulumisen Streptomyces-sukuun. Viljelmä muistuttaa 10 71 950 läheisesti Streptomyces halstedii1 ta, jonka ovat kuvanneet Schirling, E.B. ja Gottlieb, D., 1968, Int. J. Syst. Bacteriol., 18:69-189 ja siten käytettiin vertailuun tyyppikantaa S. halstedii ATCC 10897. Molemmat viljelmät ovat yhdenmukaisia tois-5 tensa kanssa seuraavissa ominaisuuksissa: itiöketjujen morfo logia, itiöpinnan morfologia, negatiivinen melaniinin tuotanto ja useimmat biokemialliset ominaisuudet. Viljelmä N393-39 poikkeaa S. halstedii'sta siinä, että ilmahuovasto puuttuu monilla väliaineilla, pesäkkeen kääntöpuoli on ruskea mieluummin kuin 10 harmahtavasta mustaan ISP ΦΦ 2-, ISP ΦΦ 3- ja ISP ΦΦ 4-väliai-neilla; I^S-tuotanto on negatiivinen eikä viljelmä käytä hyväksi fruktoosia. Koska nämä erot ovat pelkästään pieniä muunnoksia Streptomyces-lajien kantojen joukossa, pidetään viljelmää N393-39 Streptomyces halstedii’n uutena kantana (Waksman ja 15 Curtis) Waksman ja Henrici.

Tämä uusi viljelmä (Pfizer N393-39) talletettiin 23. helmikuuta 1981 kokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland tunnusnumerolla Streptomyces halstedii ATCC 31813. Tämän viljelmän tallennuksen pysyvyys kokoelmassa The 20 American Type Culture Collection Rockville'ssä Maryland'issa ja sen yleinen saatavuus mahdollistetaan kautta patentin koko voimassaoloajan siinä tapauksessa, että patentti myönnetään. Viljelmän saatavuus on mahdollista patenttihakemuksen vireillä-oloaikana tietyin rajoituksin (37 CFR 1.14 ja 35 USC 112).

25 Kaikki rajoitukset tallennetun viljelmän saatavuudelle poistetaan peruuttamattomasti patentin myöntämisen jälkeen.

Viljelmän Streptomyces halstedii ATCC 31812 viljely voidaan suorittaa samanlaisissa olosuhteissa kuin tähän asti käytetyissä polyeetteriantibioottien fermentoinneissa. Ks.

30 esimerkiksi US-patentti 4 195 079. Viljely tapahtuu edullisesti vesipitoisissa ravintoväliaineissa upotetuissa aerobisissa olosuhteissa sekoittaen lämpötilassa väliltä 24-36°C. Viljelyyn käyttökelpoiset ravintovälineet sisältävät assimiloituvan hiilen lähteen, kuten sokereita, tärkkelyksiä ja 35 glyserolia; 11 71950 orgaanisen typpilähteen, kuten kaseiinia, kaseiinin entsymaattista uutetta, soijapapujauhoa, puuvillansiemenjauhoa, maapähkinäjauhoa, vehnän gluteenia, soijajauhoa, lihajauhoa ja kalajauhoa. Kasvuaineiden lähdettä, kuten jyvien liu-5 koisia aineita ja hiivauutetta sekä myös suoloja, kuten natriumkloridia ja kalsiumkarbonaattia sekä hivenalkuainei-ta, kuten rautaa, magnesiumia, sinkkiä, kobolttia ja mangaania käytetään myös hyväksi edullisin tuloksin. Jos fer-mentoinnin aikana tapahtuu liiallista kuohuntaa, voidaan 10 lisätä vaahtoamisen estoaineita, kuten kasviöljyjä tai si-likoneja käymisväliaineiseen. Väliaineen ilmastus säiliössä upotettua kasvua varten ylläpidetään edullisesti määrässä 1/2 - 2 tilavuusosaa steriiliä vapaata ilmaa tilavuusosaa kohti käymislientä/minuutti, joka johdetaan käymisliemeen 15 spargetin läpi.Sekoitus voidaan ylläpitää sekoittimien avulla, jotka ovat yleensä fermentointialaan perehtyneiden yleisesti tuntemia. Sekoittamisnopeus riippuu käytetystä sekoitintyypistä. Ravistuspulloa käytetään yleensä taajuudella 150-200 sykliä/minuutti, kun taas käymisastiaa taval-20 lisesti pyöritetään nopeudella 300-600 r/min. Aseptiset olosuhteet täytyy tietenkin ylläpitää organismin siirrostuk-sen ja koko sen viljelyn ajan.

Ymppi tämän keksinnön mukaisen antibiootin valmistusta varten saadaan käyttäen vinopintaviljelmästä otettua 25 näytettä. Näytteellä ympätään joko ravistuspulloja tai ymppäys-säiliöitä tai ymppäyssäiliöt voidaan ympätä ravistuspullois-ta. Ravistuspulloissa kasvu yleensä saavuttaa maksiminsa 2-4 päivässä, kun taas ymppi upotetuissa ymppäyssäiliöissä tavallisesti on edullisimmassa vaiheessa 1,5 - 3 päivässä.

30 Antibioottituotannon edistymistä fermentoinnin ai kana ja fermentointiliemen bioaktiivisuutta voidaan tarkkailla liemen biologisella määrityksellä käyttäen Staphylococcus aureuksen tai Bacillus subtiliksen herkkää kantaa.

S. aureus ATCC 6538 ja B. subtilis ATCC 6633 ovat sopivia 35 kantoja tähän tarkoitukseen. Käytetään standardilevymääri- tysmenetelmää, jossa inhibitiovyöhykettä, joka ympäröi suodatin paperikiekkoa, joka on kyllästetty käymisliemellä, käytetään 71950 antibioottisen tehon mittana. Myös ohutlevykromatografia piihappogeeliä käyttäen on käyttökelpoinen tapa käymis-väliaineessa tuotetun antibiootin ja käymisliemistä uutettujen raakojen ja puhdistettujen aineiden koostumuksen ana-5 lysointia varten. Analtech-piihappogeeli GF-kromatogrammit kehitetään etyyliasetaatti/metanolilla (9:1) tai kloro-formi/metanolilla (9:1). Antibioottiyhdiste tehdään näkyväksi suihkuttamalla vanilliinilla etanolipitoisessa rikkihapossa (3 g vanilliinia 97 ml:ssa etanolia ja 3 ml:ssa 10 väkevää rikkihappoa) ja kuumentamalla TLC-levyä 80°C:ssa. Antibiootti näkyy vaaleanpunertavana täplänä. Levy voidaan myös päällystää agarilla, joka on ympätty joko S. aureuk-sella tai B. subtiliksella ja inkuboida 37aC:ssa 16 tuntia antibiootin tekemiseksi näkyväksi.

15 S. halstedii ATCC 31812:n fermentoinnihla tuotettu antibiootti erotetaan ja otetaan talteen uuttamalla koko suodattamatonta käymislientä orgaanisella liuottimena, kuten kloroformilla, etyyliasetaatilla, metyyli-isobutyy-liketonilla tai butanolilla luonnostaan vallitsevassa pH:ssa. 20 Liuotinuute voidaan sitten väkevöidä tyhjössä ohueksi siirapiksi .

Tyypillinen menetelmä tämän keksinnön antibiootin (tämän jälkeen "antibioottinen yhdiste 53 607") erottamiseksi ja talteenottamiseksi on seuraava: 25 Koko liemi S. halstedii ATCC 31812:n fermentoinnis- ta uutettiin metyyli-isobutyyliketonilla. Liuotinuute antoi tumman öljyn liuottimen haihduttamisen jälkeen tyhjössä.

Öljy liuotettiin kloroformiin ja kaadettiin piihappogeelikerrokseen. Piihappogeelikerros pestiin sitten peräkkäin klo-30 roformilla, etyyliasetaatilla ja asetonilla. Pesujakeet tutkittiin ohutlevykromatografiällä ja antibioottiyhdiste 53 607 löytyi miltei yksinomaan etyyliasetaattijakeesta. Etyyliasetaattijae haihdutettiin kuiviin ja muut jakeet hylättiin. Kuivaa etyyliasetaattijaetta puhdistettiin edel-35 leen pylväskromatografisesti kokoamalla se etyyliasetaattiin ja pantiin pylvääseen, joka oli täytetty piihappogeelillä, joka oli lietetty etyyliasetaattiinpa eluoitiin etyyli- 13 71 950 asetaatilla. Pylväsjakeet, jotka sisälsivät antibiootti-yhdistettä 53 607 (määritetty ohutlevykromatografiällä) yhdistettiin ja konsentroitiin haihduttamalla. Tämä aine kromatografoitiin sitten pylväässä, joka oli täy-5 tetty Sephadex LH-20:llä metanolissa ja jakeet, jotka sisälsivät antibioottiyhdistettä 53 607, yhdistettiin, haihdutettiin pienempään tilavuuteen ja koottiin sitten kloroformiin. Kloroformiliuosta pestiin 5-%:isella mononatrium-fosfaattipuskurilla, jonka pH oli säädetty 4,5:een fosfori-10 hapolla. Liuotinfaasi pestiin sitten 5-%:isella, paino/ tilavuus, dinatriumfosfaattipuskurilla, jonka pH säädettiin 9,0:aan natriumhydroksidiliuoksella. Liuotinfaasi kuivattiin sitten vedettömällä natriumsulfaatilla ja haihdutetaan. Jäännös koottiin asetoniin ja pantiin jääkaappiin, 15 minkä jälkeen antibioottiyhdiste 53 607 kiteytyi natrium-suolana. Vapaa happo voidaan saada pesemällä natriumsuolan etyyliasetaattiliuosta vedellä, jonka pH on säädetty 4,5:een. Liuottimen haihduttaminen antoi antibioottiyhdisteen 53 607 vapaan hapon kiteitä.

20 Antibioottiyhdisteen 53 607 analyysi ilmaisee seu- raavan rakenteen: OH H CH.

co^c, ch3, Λ. c«3 25 CI*3 H j?··—\ c,·a\-4ch3

ch, ch,h 0 H

33 J OH CH20H

30 Antibioottiyhdisteellä 53 607 on estävä vaikutus joukon gram-positiivisia mikro-organismeja kasvua vastaan. Seuraavaan taulukkoon I on koottu in vitro MIC-testien tulokset. Tätä testiä varten jokainen organismi ympätään sarjaan koeputkia, jotka sisältävät ravintoväliainetta ja 35 yhdisteen 53 607 vaihtelevia pitoisuuksia,antibiootin minimi väkevyyden (yug/ml) määrittämiseksi, joka estää organismin kasvun 24 tunnin jakson ajan (MIC).

14 71 950

Taulukko I

MIC, !ug/ml yhdistettä

Organismi 53 507 (natriumsuola) 5 Staphylococcus aureus 01A005 0,78 01A052 0,78 01A110 1,56 01A400 1,56

Streptococcus faecal is 02A006 1,56 10 Streptococcus pyogenes 020203 <0,01

Corynebacterium pyogenes 11D001 25

Bacillus subtilis 06Ά001 0,39

Bacteroides fragilis 78C004 12,5 78C009 6,25 15 78C010 6,25

Bacteroides vulgatis 78E032 3,12

Haemophilus influenza 54A036 6,25 54A037 3,12 54A059 12,5 20 Pasteurella multocida 59A001 >200

Clostridium perfringens 10A002 0,98 10A003 0,98

Neisseria sicca 66C000 25

Staphylococcus epidermidls 01B087R 0,78 25 01B111RR 0,78 01B126 1,56

Fusobacterium necrophorum 84C004 3,12

Treponema hyödysenteriae 94A001 0,39 94A002 0,098 30

Gram-negatiivisia bakteereita, kuten Escherichia colia, Pseudomonas aeruginosaa, Klebsiella pneumoniaeta, Serratia marcescens’ia ja Enterobacteriaceae aerogenes’tä, 35 vastaan MIC-arvot olivat kaikissa tapauksissa >50.

15 71 950

Antibioottiyhdisteellä 53 607 ja sen kationisuoloil-la on erinomainen aktiivisuus kokkidioosi-infektioita vastaan siipikarjassa. Kun sitä lisätään kanojen ravintoon määrissä 50-200 ppm, nämä yhdisteet ovat tehokkaita torjumaan 5 Eimeria tenella'sta, E. acervulina1sta, E. maxima'sta, E. brunetti'sta ja E. necatrix'istä aiheutuvat infektiot.

Antibioottiyhdisteen 53 607 ja sen suolojen tehokkuus kokkidioosi-infektioita vastaan kananpojissa määritettiin seuraavalla tavalla. 3-5:n kymmenen päivän ikäisen SPF valio koisen Leghorn kukonpojan ryhmille syötettiin ravintoseos-ta, joka sisälsi antibioottiyhdistettä 53 607 tai sen natrium- ja/tai kaliumsuolaa siihen tasaisesti dispergoituna. Oltuaan tällä ravinnolla 24 tuntia, jokainen kukonpoika ympättiin per os (suun kautta) testattavan nimenomaisen 15 Eimeria-lajin itiörakkulalla. Muita 3-5:n kymmenen päivän ikäisen kukonpojan ryhmiä syötettiin samanlaisella seka-ravinnolla, jossa ei ollut antibioottiyhdistettä 53 607 tai sen suoloja. Ne infektoitiin myös 24 tunnin kuluttua ja toimivat infektoituina kontrolleina. Vielä yksi 3-5:n 10 20 päivän ikäisen kukonpojan ryhmä syötettiin ravintoseoksel-la, jossa ei ollut antibioottiyhdistettä 53 607 ja joita ei infektoitu kokkidialla.Nämä toimivat normaalikontrolleina. Käsittelyn tulokset arvosteltiin viiden päivän kuluttua E. acervulina'n tapauksessa ja kuuden päivän jälkeen kai-25 kille muille tapauksille. Saadut tulokset on koottu taulukkoon II.

16 71 9 5 0

Taulukko II

Infektion

Infektointiin Annos keskin.. Painon käytetty laji (ppm) aste1 Suhde1 lisäys (%) 5 Eimeria tenella 200 1,.3 0T41 37 100 1,0 (1,3) 0,32 (0,37) 57 (60) 50 2,7 (0,3) 0,86 (0,09) 22 (97) 25 3,0 (1,7) 0,95 (0,49) 47 (102)

Eimeria acervulina 200 1,5 0,75 2 10 100 1,2 0,60 22 50 2,0 1,00 18 25 2,0 1,00 7

Eimeria necatrix 200 — 100 0,0 0,00 69 15 50 0,2 0,11 99 25 0,6 0,33 111

Eimeria maxima 200 1,5 0,94 10 100 0,8 0,50 37 50 1,0 0,63 70 20 25 1,4 0,88 51

Eimeria brunetti 200 100 0,4 0,22 47 50 1,0 0,55 49 25 2,6 1,44 47 25 "^Arvosteluperusteet, joita käytettiin antikokkidiaalisen aktiivisuuden mittaamiseen, käsittivät sairaustumisarvioinnit nollasta neljään E. tenella'lle J.E. Lynch'in, "A New Method 30 for the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", Am.

J. Vet. Res. 22: 324-326 (1969) mukaan; ja nollasta kolmeen muille lajeille, mikä perustuu arviointijärjestelmän muunnokseen, jonka ovat suunnitelleet J. Johnson ja W.H. Reid, "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery 35 and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit. 28: 30-36 (1970). Vakiosuhde määritettiin jakamalla jokaisen käsittellyn ryhmän sairastumisarvio infektoidun kontrollin sairastumisarviolla.

17 71 950

Eläinrehujen arvo on yleensä määritetty suoraan eläimiä syöttämällä. GB-patentissa 1 197 826 esitetään yksityiskohtaisesti in vitro pötsimenetelmä, jolla rehuissa tapahtuvat mikro-organismien aikaansaamat muutokset mitataan 5 helpommin suuremmalla tarkkuudella arvioitaessa eläinrehuja. Tämä menetelmä käsittää laitteen käytön, jossa eläinten ruoansulatusprosessit saatetaan tapahtumaan ja tutkitaan in vitro. Eläinrehut, pötsiymppi ja erilaiset kasvua edistävät aineet viedään laboratorioyksikköön ja poistetaan siilo 1 tä huolellisesti valvotuissa olosuhteissa ja tapahtuneita muutoksia tutkitaan kriittisesti ja progressiivisesti sinä aikana, jona mikro-organismit kuluttavat rehua. Lisäys pöt-sinesteen propionihappopitoisuudessa osoittaa, että haluttu vaste märehtijän kokonaissuorituksessa on saatu aikaan kas-15 vua edistävällä aineella rehuyhdistelmässä. Muutos propionihappopitoisuudessa ilmaistaan prosenttina propionihappo-pitoisuudesta, joka havaittiin vertailupötsinesteissä. Pitkäaikaisia in vivo syöttötutkimuksia käytetään osoittamaan luotettava vastaavuussuhde pätsinesteen propionihappolisäyk-20 sen ja eläimen parantuneen suoritustehon välillä.

Pötsinestettä kerätään lehmästä, jolle on tehty avanne ja jota syötetään kaupallisella lihottavalla ravinnolla plus heinillä. Pötsineste suodatetaan välittömästi juusto-kankaan läpi ja 10 ml pannaan 50 ml:n kartiomaiseen pulloon, 25 joka sisältää 400 mg standardisubstraattia (68 % maissitärk-kelystä plus 17 % selluloosaa plus 15 % uutettua soijapapu-jauhoa) , 10 ml pH 6,8 puskuria ja testiyhdistettä. Pulloja kaasutetaan happivapaalla typellä n. kaksi minuuttia ja in-kuboidaan täryvesihauteella 39°C:ssa n. 16 tuntia. Kaikki 30 testit suoritetaan kolminkertaisina.

Inkuboinnin jälkeen sekoitetaan 5 ml:n näyte 1 ml:n kanssa 25-%:ista metafosforihappoa. 10 minuutin kuluttua lisätään 0,25 ml muurahaishappoa ja seosta lingotaan kier-rosnopeudella 1 500 r/min 10 minuuttia. Näytteitä analysoi-35 daan sitten kaasu-neste-kromatografiällä D.W. Kellog'in menetelmällä, J. Dairy Science, 52, 1690 (1969) . Huippujen 18 71 950 korkeudet etikka-, propioni- ja voihapoille määritetään käsittelemättömistä ja käsitellyistä inkubointipulloista otetuille näytteille.

Testattaessa tällä in vitro -menetelmällä antoi an-5 tibioottiyhdiste 53 607 pitoisuudessa pg/ml n. 57 %:n lisäyksen propionihapon tuotantoon verrattuna tähän tuotteeseen vertailuliuoksessa ilman lisättyä antibioottiyhdistettä 53 607. Vertailun vuoksi mainittakoon, että kaupallisesti saatava monensiini (eräs toinen polysyklinen eetterianti-10 biootti) antoi määrässä 10 /ag/ml propionihapon n. 20 %:n lisäyksen kontrolliin nähden (J. Amer. Chem. Soc., 89,5737 (1967)/.

Verrattuna salinomysiiniin /CT. Antibiotics, 27: 814, (1974)^, aikaansai antibioottiyhdiste 53 607 n. 43 %:n li-15 säyksen propionihapossa väkevyydellä 20 ^ug/ml ja n. 40 %:n lisäyksen väkevyydellä 5 ^ug/ml, vastaavasti salinomys ini aiheutti n. 52%:n lisäykseen väkevyydellä 5 ^,ug/ml.

Näiden lukuarvojen perusteella voidaan päätellä että antibioottiyhdiste 53 607 parantaa märehtijöiden, ku-20 ten nautakarjan ja lampaiden sekä yksimahaisten eläinten, kuten sikojen ja kaniinien rehun hyväksikäyttöä. Antibioottiyhdistettä 53 607 voidaan yhdistää rehuyhdistelmiin vapaana happona, natriumsuolana, kaliumsuolana tai niiden seoksina. Antibioottiyhdisteen 53 607 raakoja muotoja tai 25 kuivattua käymislientä, joka sisältää antibioottia, voidaan yhdistää rehuyhdistelmiin halutuissa voimakkuuspitoisuuk-sissa.

Seuraavat esimerkit valaisevat lähemmin tämän keksinnön toimintaa, 30 Esimerkki 1

Ymppi

Valmistettiin steriili vesipitoinen väliaine, jolla oli seuraava koostumus: 19 71 950

Aineosa grammaa/litra sereloosi 10 tärkkelys 20 hiivauute 5 5 NZ Amine YTTX 5 dikalium-vetyfosfaatti 0,5 lihajauho 5 kobolttikloridi 0,002 kalsiumkarbonaatti 4 10 pH 7,1 - 7,2

Soluja Streptomyces halstedii ATCC 31812:n vinopintavil^el-mästä siirrettiin sarjaan 300 ml:n pulloja, joista jokainen sisälsi 40 ml tätä steriiliä väliainetta ja ravisteltiin pyörötäryttimellä 28-36°C:ssa 3-4 päivää.

15 Fermentointi

Erä kasvatetusta viljelmästä, riittävä aikaansaamaan 2 %:n, tilavuus/tilavuus, ympin, siirrettiin neljän litran käymisastioihin, joista jokainen sisälsi kaksi litraa seuraavaa steriiliä väliainetta: 20 Aineosa grammaa/litra sereloosi 10 NZ Amine Ax 5 tärkkelys 20 hiivauute 5,0 25 kalsiumkarbonaatti 1,0 kobolttikloridi 0,002 vettä täydentämään 1 000 ml:ksi (xRekisteröity tavaramerkki kaseiinin entsymaattiselle hajo-tustuotteelle, Humko Sheffield Chemical Co., Inc.) 30 Fermentointi tapahtui 30°C:ssa sekoittaen kierros-

nopeudella 1 700 kierrosta minuutissa (r/min) ja ilmastamalla yhdellä tilavuusosalla ilmaa yhtä tilavuusosaa kohti lientä minuutissa, kunnes havaittiin olennainen aktiivisuus (antibiootti-levy-määrityksen perusteella B. subtilis ATCC

20 71 950 6633'ea vastaanx), tavallisesti 3-5 päivää. Koko liemi suodatettiin neutraalissa pHrssa käyttäen suodatusapuainetta "Super-Cel" tai "Celite"ja suodosta uutettiin joko metyyli-iso-butyyliketonilla tai n-butanolilla. Orgaaninen faasi ero-5 tettiin vesipitoisesta faasista imemällä ja suodatettiin suspendoidun aineksen poistamiseksi. Suodatuskakku luetettiin metanolilla, suodatettiin, metanoli haihdutettiin ja jäännöstä uutettiin samalla liuottimena, jota käytettiin suodatetun liemen uuttamiseen. Uutteet yhdistettiin ja haih-10 dutettiin tyhjössä , jolloin saatiin viskoosi öljy. öljy suspen-doitiin heptaaniin, sekoitettiin piihappogeelin kanssa ja suodatettiin. Suodatuskakkua pestiin toistuvasti heptaanilla ja tuotetta eluoitiin vaiheittain kloroformilla pelkästään, kloroformin ja etyyliasetaatin seoksilla ja lopuksi pelkäs-15 tään etyyliasetaatilla. Jakeiden ohutlevykromatografisen (TtiC) ja biomäärityksen jälkeen aktiiviset jakeet yhdistettiin, haihdutettiin tyhjössä ja jäännös kromatogra-foitiin uudelleen antibioottiyhdisteen 53 607 saamiseksi kiinteänä aineena. Infrapunakirjo (KBr-levy) ^um: 2,95 20 3,42, 6,00, 6,37, 6,85, 7,14, 7,30, 7,65, 7,90, 8,10, 9,05, xLiemen ja myöhemmin talteenotettujen jakeiden bioaktiivisuut- ta seurattiin käyttäen Bacillus subtilis ATCC 6633:n tai

Staphylococcus aureus ATCC 6538:n herkkää kantaa. Liemessä 25 ja talteenotetuissa jakeissa olevat aineosat tehtiin silminnähtäviksi käyttäen piihappogeelilevyjä seuraavassa systeemissä: etyyliasetaatti/metanoli 9:1 tai kloroformi/raetanoli 9:1 ja levyä suihkutettiin vanilliinilla (3 g vanilliinia 97,0 ml:ssa etanolia ja 3,0 ml:ssa väkevää rikkihappoa) ja 30 kuumennettiin sitten 80°C:ssa. Yhdiste 53 607 ilmestyy näkyviin vaaleanpunertavana täplänä. Vaihtoehtoisesti levy päällystettiin agarilla, ympättiin joko S. aureuksella tai B. subtiliksella, johon oli lisätty 1,0 ml l-%:ista tetratso- liumliuosta ja inkuboitiin 37°C:ssa 16 tuntia antibiootin 35 tekemiseksi näkyväksi. (Kirkkaat alueet vaaleanpunaista taustaa vastaan.) 71950 9,15, 9,67, 10,00, 10,18, 10,53, 11,15, 11,40, 11,75, 13,25.

Sen havaittiin olevan liukoinen kloroformiin, etyyliasetaattiin, metanoliin ja metyyli-isobutyyliketoniin; ja liukenematon veteen.

5 Esimerkki 2

Valmistettiin ymppi, kuten edellisessä esimerkissä selostettiin, paitsi että käytettiin 700 ml väliainetta pulloa kohti, ravistuspulloymppiä fermentoitiin 3-4 päivää 28°C:ssa, yhdistettynä kahteen sivuhaarapulloon.

1700 gallonan (6400 1) käymislaite, joka sisälsi 1200 gallonaa (4200 1) steriiliä seuraavassa esitettyä väliainetta, ympättiin kuudella litralla (0,1%) edellä esitettyä ymppiä: Käymisväliaine

Aineosa Grammaa/litra 15 sereloosi 1,0 kaseiini 5,0 tärkkelys 5,0 maissin liuotusneste 5,0 ml kalsiumkarbonaatti 3,0 20 kobolttikloridi 0,002 vettä täydentämään 1 litraksi pH 6,9 - 7,0 Käymisastia pidettiin 28°C:ssa ja ilmastettiin ja sekoitettiin kierrosluvulla 1 700 r/min. 120 tunnin kulut-25 tua käymisastiasta koottiin tuote. Koko liemi (1200 gallonaa) uutettiin 250 gallonalla (950 1) metyyli-isobutyyliketonia, kerrokset erotettiin uuttolaitteessa (Podbielniak) ja orgaaninen faasi haihdutettiin tyhjössä/ jolloin saatiin 8 gallonaa (301)öljyä.öljyä väkevöitiin edelleen tyhjössä pyöröhaih-30 duttimella. Jäljelle jäänyt siirappi suspendoitiin heptaa-niin, sekoitettiin piihappogeelin kanssa ja suodatettiin ja pestiin useita kertoja heptaanilla. Pesty suodatuskakku käsiteltiin valmiiksi, kuten esimerkissä 1 selostettiin, jolloin saatiin3oo g öljyä, öljy liuotettiin pieneen määrään kloro-35 formia, liuos kaadettiin suodattimelle (Lapp), joka sisälsi 3,5 kg piihappogeeliä (Merck, aste 60),ja piihappogeeliä pestiin peräkkäin kloroformilla, etyyliasetaatilla ja aseto- 22 71 950 nilla, viidellä gallonalla (20 1) kukin. Jakeet tutkittiin ohut-levykromatografiällä. Tuotteen havaittiin olevan, miltei yksinomaan, etyyliasetaattijakeessa. Muut jakeet hylättiin, etyyliasetaattijae haihdutettiin kuiviin tyhjössä» jolloin saatiin 5 150 g väkevöitettä. Väkevöitettä puhdistettiin edelleen kromatografisesti 8,0 x 1 000 cm:n pylväässä, joka oli täytetty piihappogeelillä (Merck, aste 60) liettämällä etyyliasetaatilla. Pylväs eluoitiin etyyliasetaatilla ottaen yhden litran jakeita 60 ml minuutissa. Tuotteen sisältävät jakeet 10 yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä» jolloin saatiin 85 g tuotetta.

Tuote johdettiin pylvään läpi, joka sisälsi 1 kg Sephadex LH-20, ja eluoitiin metanolilla virtausnopeudella 25 ml/min. Otettiin 300 ml:n jakeita. Yhdistämällä tuotetta 15 sisältävät jakeet ja haihduttamalla liuotin, saatiin 30 g kiinteää ainetta. Tämä liuotettiin 500 ml:aan kloroformia ja liuos pestiin yhtä suurella tilavuusmäärällä 5-%:ista Nal^PO^-puskuria, jonka pH oli säädetty 4,5:een 85%:isella fosforihapolla. Orgaaninen faasi erotettiin, pestiin 20 500 ml :11a 5-%:ista Na2HPO^-puskuria, jonka pH oli säädet ty 9,0:aan IN natriumhydroksidilla. Uute kuivattiin sitten vedettömällä natriumsulfaatilla ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin. Jäännös koottiin asetoniin ja sen annettiin kiteytyä jääkaapissa. Kiteet kerättiin suodattamalla ja kuivat-25 tiin suurtyhjössä huoneen lämpötilassa, jolloin saatiin 14 g antibioottiyhdisteen 53 607 natriumsuolaa, sp. 199-204°C.

Optinen rotaatio: /ajQ + 44° (c = 1, kloroformi) + 37° (c = 1, metanoli).

Ultraviolettikirjo: lambda , 233 nm (metanoli) ^ q ma x 30 E, = 212.

1 cm

Infrapunakirjo (KBr-levy) mikronia: 2,95, 3,42, 6,00, 6,37, 6,85, 7,14, 7,30, 7,65, 7,90, 8,10, 9,05, 9,15, 9,67, 10,00, 10,18, 10,53, 11,15, 11,40, 11,75 ja 13,25.

Infrapunakirjo on esitetty kuviossa 1.

35 Alkuaineanalyysi: C 57,54 H 7,74 N 0,0.

Käyttämällä edellä esitetyssä menetelmässä ΚΗ2ΡΟ^-(pH 4,5) ja K2HPO^-puskuria, jonka pH on säädetty 9,0:aan IN

23 719 5 0 kaiiumhydroksidillä, saadaan antibioottiyhdisteen 53 607 kaliumsuola samalla tavalla.

Samoin saadaan ammoniumsuola käyttämällä edellä esitetyssä menetelmässä (NH^)H2PO^:ää ja (NH^)2HPO^:ää.

5 Esimerkki 3

Erä edellä saatua antibioottiyhdisteen 53 607 nat-riumsuolaa liuotettiin etyyliasetaattiin, lisättiin vettä ja vesipitoisen faasin pH säädettiin 5,4:een 85%:isella fosforihapolla. Orgaaninen kerros erotettiin, kuivattiin 10 (Na2SO^) ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin yhdisteen 53 607 vapaa happo, sp. 84-94°C. Alkuaineanalyysi tehtiin näytteellä, joka oli kuivattu yli yön suurtyhjössä huoneen lämpötilassa ja se oli: C 64,69 H 8,91 N 0,0.

15 Hapon havaittiin olevan veteen liukenematon; liukoi nen kloroformiin, etyyliasetaattiin, metanoliin ja metyyli-isobutyyliketoniin.

/ck/d + 74,5° (c = 1, kloroformi) ^&c7d + 4 9,7° (c = 1, metanoli) 20 Ultraviolettikirjo: lambdamo 233 nm (metanoli)

m o lUClX

E 1 nm ~ 189· 1 cm

Infrapunakirjo (KBr-levy) mikronia: 2,95, 3,45, 6,00, 6,85, 7,28, 8,13, 9,05, 9,67, 10,20, 10,55, 11,12 ja 11,48. Kirjo on esitetty kuviossa 2.

25 Bariumsuola valmistetaan ravistelemalla 2,0 g vapaa ta happoa, joka on liuotettu 80 ml:aan etyyliasetaattia, yhtä suuren tilavuusmäärän kanssa vettä, joka sisältää 2,4 g bariumhydroksidioktahydraattia. Kerrokset erotetaan, orgaaninen faasi pestään Ba(OH)·8H20:n tuoreella liuoksel-30 la, kuivataan (Na2SO^) ja haihdutetaan tyhjössä antamaan antibioottiyhdisteen 53,607 haluttu suola.

Kalsiumsuola valmistetaan edellä esitetyllä menetelmällä, mutta käyttäen kalsiumhydroksidia bariumhydroksidi-oktahydraatin asemasta.

35 Esimerkki 4

Toteutetaan esimerkin 1 menettely, mutta käytetään 4 %, tilavuus/tilavuus,ymppiä 4 litran käymisastioissa, 24 71 950 joista jokainen sisältää kaksi litraa seuraavaa steriiliä väliainetta:

Aineosa Grammaa/litra sereloosi 10 5 maissitärkkelys 10 soijapapujauho 10 kalsiumkarbonaatti 1 maissin fermentoituvat kiintoaineet 5 natriumkloridi 5 10 pH = 7,0

Fermentointi suoritettiin kahden päivän aikana 36°C:ssa sekoittaen kierrosluvulla 1 700 r/min ja johtamalla ilmaa spargerilla määrässä kaksi tilavuusosaa yhtä tilavuusosaa kohti lientä minuutissa. Koko liemi uutettiin kloroformil-15 la ja käsiteltiin valmiiksi, kuten esimerkissä 1 selostettiin, jolloin saatiin antibioottiyhdiste 53 607 natrium-, kalium- ja kalsiumsuolojensa seoksena.

Kun edellä esitetty menettely toistetaan, mutta käyttäen käymisväliainetta, joka sisältää glyserolia sereloo-20 sin asemesta, kalajauhoa tai puuvillansiemenjauhoa maissin fermentoituvien kiintoaineiden asemesta ja saattamalla fermentointi tapahtumaan pH 8,0:ssa, 28°C:ssa kuuden päivän aikana, ovat tulokset pääasiallisesti muuttumattomat.

Claims (3)

25 7 1 9 5 0

1. Menetelmä polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi, jolla on kaava 5 OH H CH CO H ^ CH CH3 I il tCH3 CHt 2 f 3 \ 3 CH3 H -L CJC A \*CH.

3. Y Y^o Λϊ'ΊίΝτ^οτ A 7 3

10 CH CH H fcH-fc H °7\ CH3 CH3 3 OH CH20H tunnettu siitä, että viljellään mikro-organismia Streptomyces halstedii ATCC 31812 vesipitoisissa viljely-15 väliaineissa, jotka sisältävät assimiloituvan hiililähteen, typpeä ja epäorgaanisia suoloja, upotetuissa aerobisissa fermentointiolosuhteissa, kunnes saadaan olennainen määrä tätä antibioottia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että antibiootti erotetaan käymisväliai- neesta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käymisväliaine haihdutetaan kuiviin.