Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia windezyny, z uzyciem nowego zwiazku posred¬ niego, 4-dezacetylowinkaleukoblastyno-3-N-(trój- weglowodorofosforanylo)karboksyimidu. Azydek 4- -dezacetylowinkaleukoblastyno-3-karbonylu podda¬ je sie reakcji z trójweglowodorofosfina z wytwo¬ rzeniem 4-dezacetylowinkaleukoblastyno-3-N-(trój- weglowodorofosforanylo)karboksyimidu, który z ko¬ lei poddaje sie reakcji z kwasem, otrzymajac win- dezyne.Windezyna, 4^dezacetylo-VLB-3-karboksyamid (VLB odpowiada winkaleukoblastynie) ma budowe przedstawiona wzorem 1.Windezyne po raz pierwszy opisali Cullinan i Gerzon w belgijskim opisie patentowym nr 813 168, jako jedna z rzeregu pochodnych nowej grupy alkaloidów Vinca, a mianowicie 3-karboksyamidów.Dotychczasowe sposoby wytwarzania windezyny obejmowaly: reakcje VLB z amoniakiem w zato¬ pionej rurze (w trakcie reakcji i/lub dalszej obrób¬ ki zachodzi czesciowa hydroliza grupy 4-acetylo- wej); reakcje VLB z wodzianem hydrazyny z otrzy¬ maniem hydrazydu 4-dezacetylo-VLB-3-karbonylu (w przypadku hyrazyny hydroliza 4-acetylu zacho¬ dzi w istocie calkowicie), po czym nastepuje reak¬ cja z kwasem azotawym z wytworzeniem azydku 3-karbonylu, który z kolei poddaje sie reakcji z amoniakiem, otrzymujac 3-karboksyamid: oraz hydrogenolize hydrazydu 4-dezacetylo-VLB-3-kar- bonylu wytworzonego w sposób jak wyzej opisa¬ lo 15 25 no przy uzyciu niklu Raney'a wedlug metody Ain- swertha, podanej w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 2 756 235, z wytworzeniem bez¬ posrednio windezyny. Kazda z tych metod obarczo¬ na jest jedna lub kilkoma wadami. Np. rzecza bardzo trudna jest powiekszenie skali w procesie wytwarzania niklu Raney'a i wydajnosci zadanych produktów róznia sie od szarzy do szarzy niklu Raney'a. Zachodzi wyrazna potrzeba niezawodnego procesu nadajacego sie do wytwarzania windezyny w skali przemyslowej. Bezposrednia reakcja VLB z amoniakiem prowadzi do mieszaniny produktów itd.Windezyna poddawana jest obecnie w Stanach Zjednoczonych i innych krajach ekstensywnym badaniom klinicznym jako czynnik onkolityczny, w szczególnosci przy leczeniu bialaczki. Aktywnosc zwiazku w leczeniu bialaczki jest bliska aktyw¬ nosci winkrystyny, jednakze posiada on nieco róz¬ ne widmo dzialan ubocznych. Poza tym stwierdzo¬ no, ze niektóre postacie bialaczki oporne na winkrystyne, podatne sa na leczenie windezyna.Wreszcie, jest wskazane wykorzystanie aktywnosci windezyny przeciw rakom pluc, jak owsiano- komórkowym jak i nieowsionokomórkowym.Celem wynalazku jest zapewnienie przemyslowo wykonalnego sposobu wytwarzania windezyny, da¬ jacego wysoka, powtarzalna wydajnosc zadanego 30 produktu, któremu towarzyszylaby tylko minional- 124 3503 na ilosc produktów ubocznych, takich które trudno chromatograficznie oddzielic od windezyny.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania winde¬ zyny polega na tym, ze poddaje sie azydek 4^deza- oetylo-VLB-3-kar'boinylu''*realfccji z tróijweglowódoro- fosfina, w której rodnikiem weglowodorowym jest alkil lub aryl z utworzeniem 4-dezacetylo- -VLB-3-N-(trójweglowodorofosforanylo)karboksy- imidu o wzorze 5, w którym X oznacza alkil lub ¦j aryl, po . czym otrzymany iminofosforan acylu roz¬ klada sie kwasem otrzymujac wdndenzyne.Wynalazek obejmuje swym zakresem takze spo¬ sób wytwarzania 4~dezacetylo-VLB-3-N-.(trójweglo- wodorofosforanylo)karbcksyimidu o wzorze 5, po- polegajacy na tym, ze poddaje sie azydek 4-deza- cetylo-VLB-3-karbonylu reakcji z trójweglowodo- rofosfina, w której rodnikiem weglowodorowym jest alkil lub aryl.W wykonaniu powyzszego, oraz innych sposobów hydrazyd 4-dezacetylo-VLB-3-karbonylu, wytwo¬ rzony metoda Cullinana i Gerzona, podana w bel¬ gijskim opisie patentowym nr 813 168 poddaje sie reakcji z kwasem azotawym lub organicznym azo¬ tynem w roztworze kwasnym z otrzymaniem odpo¬ wiedniego azydku. Nastepnie azydek ten poddaje sie reakcji z trójweglowodorofosfina w celu wy¬ tworzenia iminofosforanu acylu, który poddaje sie hydrolizie w obecnosci kwasu, otrzymujac bezpo¬ srednio windezyne. Powyzsza metode pelniej przed¬ stawia zalaczony schemat, w którym azydek pod¬ daje sie reakcji z trójfenylofosiina, w którym to schemacie zamieszczono windolinowa (nizsza) czesc alkaloidu, podczas gdy welbanaminowa (górna) czesc zaznaczona jest linia kreskowana i skrótem „VELB".Stwierdzono, ze w powyzszym procesie dla prze¬ ksztalcenia hydrazydu w azydek odczynnikiem z wyboru moze byc albo azotyn n-butylu albo azotyn izoamylu, oraz ze korzystnym rozpuszczal¬ nikiem organicznym jest czterowodorofuran (THF).Do innych mozliwych do uzycia rozpuszczalników nalezy dwumetoksyetan, octan etylu i alkohol. pH powinno wynosic 4,5 lub mniej. Nalezy utrzymy¬ wac wartosc pH na poziomie 4,5 lub nizszym za pomoca kwasu protonowego. Dla zapewnienia cal¬ kowitej przemiany hydrazydu w azydek w poza¬ danym krótkim okresie czasu, np. w ciagu 5 minut, konieczne jest uzycie szesciu równowazników 1 N kwasu solnego i 2 równowazników azotynu n-bu¬ tylu. Dluzszy czas reakcji prowadzi do wzrostu ilosci niepozadanych produktów ubocznych. Poza tym, temperature wodnej, kwasnej mieszaniny reakcyjnej nalezy utrzymywac w zakresie miedzy 10°C a temperatura zamarzania, korzystnie ponizej 0°C, a to dla unikniecia tworzenia sie produktów ubocznych. Nizsza temperatura powoduje zamarza¬ nie wody obecnej w mieszaninie.Przemiane wyodrebnionego azydku w iminofos¬ foran acylu przeprowadza sie w warunkach apro- tonowych za pomoca wkroplenia trójweglowodoro- fosfiny, korzystnie trójfenylofosfiny, w rozpuszczal¬ niku organicznym, do mieszaniny reakcyjnej za¬ wierajacej azydek 4-dezacetylo-VLB-3-karbonylu, korzystnie w tym samym rozpuszczalniku organicz¬ nym. Temperatura reakcji nie jest istotna, a reak- 350 4 cja zaczyna sie w wyniku mieszania. Mieszanine reakcyjna korzystnie miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu 1 godziny. Nastepnie skladniki lotne usuwa sie za pomoca odparowania pod zmniejszo- 5 nym cisnieniem; otrzymujac jako pozostalosc imi¬ nofosforan acylu o wzorze 4 wraz z nadmiarem trójweglowodorofosfiny. Pozostalosc ta jest sta¬ bilna i mozna ja przechowywac. Nastepnie pozo¬ stalosc te zadaje sie wodnym roztworem kwasu, 10 powodujac w ten sposób hydrolize iminofosforanu acylu do windezyny. Nalezy zapewnic ilosc kwasu i wody dostateczna do utrzymywania windezyny w stanie rozpuszczonym jako kwasnej soli addy¬ cyjnej. Nierozpuszczalna fosfine i tlenek fosfiny 15 usuwa sie za pomoca ekstrakcji odpowiednim nie- mieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem orga¬ nicznym, takim jak chlorek metylenu, chloro¬ form, czterochlorek wegla, toluen i octan etylu.Nastepnie windezyne wyodrebnia sie i oczyszcza 2a przy uzyciu zwyklych metod, takich jak chroma¬ tografia i krystalizacja. Wydajnosc windezyny wy¬ tworzonej z azydku 4-dezacetylo-VLB-3-karbonylu wynosi od 60 do 80%.Jednakze, korzystnie prowadzi sie powyzsze reakcje z pominieciem wyodrebniania któregokol¬ wiek zwiazku posredniego. Hydrazyd 4-dezacetylo- -VLB-3-karbonylu przeksztalca sie w azydek stosu- sujac azotyn organiczny w wodnym kwasnym srodo¬ wisku, przy uzyciu rozpuszczalnika organicznego, takiego jak THF. Dodaje sie trójfenylofosfine w postaci roztworu w tym samym rozpuszczalniku, jakiego uzyto przy wytwarzaniu azydku i otrzy¬ muje sie jako krótkotrwaly zwiazek posredni, iminofosforan acylu, poniewaz ciagla obecnosc wodnego roztworu kwasu powoduje szybka hydro¬ lize tego zwiazku posredniego do windezyny.Wszystkie 4-deacetylo-VLiB-pochodne, hydrazyd 3- -karbonylu, azydek karbonylu i karboksyamid obecne sa w trakcie procesu w postaci kwasnych 40 soli addycyjnych. W celu solubilizacji tych kwas¬ nych soli addycyjnych przez caly czas musi byc zapewniona dostateczna ilosc wody.Po zakonczeniu dodawania trójfenylofosfiny, do¬ daje sie dodatkowa ilosc wodnego roztworu kwasu w celu utrzymania windezyny w fazie wodnej w trakcie dalszej reakcji. Dodaje sie chlorek me¬ tylenu i oddziela faze organiczna jak wyzej. Win¬ dezyne wyodrebnia sie jako taka za pomoca zal- 50 kalizowania kwasnej fazy wodnej i ekstrakcji nie¬ rozpuszczalnej w tych warunkach windezyny w po¬ staci wolnej zasady rozpuszczlnikiem organicznym.Po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymuje sie windezyne, która mozna dalej oczyszczac za po¬ moca cieczowej chromatografii cisnieniowej lub innej dogodnej metody.Doniosle przemyslowe znaczenie ma mozliwosc prowadzenia powyzszego procesu w jednym reak¬ torze jako procesu „jednogarnkowego". 60 W powyzszym sposobie mozna wykorzystywac zródla azotynu inne niz azotyn izoamylu lub azo¬ tyn n-butylu, np. azotyn sodowy ale jak to po¬ przednio zaznaczono, korzystne pod wzgledem uzyskiwania maksymalnej wydajnosci jest uzycie m azotynu n-butylu lub azotynu izoamylu.124350 Przyklad I. 77 mg azydku 4-dezacetylo-VLB- -3-karbonylu rozpuszcza sie w 2 ml IN kwasu sol¬ nego i otrzymany roztwór oziebia sie do tempera¬ tury okolo 0°C. Nastepnie dodaje sie 8,4 mg azo¬ tynu sodowego i mieszanine reakcyjna miesza w temperaturze okolo 0°C przez 5 minut, po czym dodaje sie zimny nasycony wodny roztwór wodoro¬ weglanu sodowego i otrzymana wodna mieszanine poddaje sie ekstrakcji zimnym chlorkiem metyle¬ nu. Ekstrakt w chlorku metylenu oddziela sie i su¬ szy nad siarczanem sodowym, po czym chlorek metylenu usuwa sie za pomoca odparowania. Pozo¬ stalosc, zawierajaca azydek 4-dezacetylo-VLB-3- -karbonylu, utworzony w trakcie powyzszej reak¬ cji, rozpuszcza sie w 7 ml THF i wkrapla w nad¬ miarze trójfenylofosfine w THF. Po zakonczeniu dodawania trójfenylofosfiny mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 1 godziny. Do roztworu w THF dodaje sie w nadmiarze 1 N roztwór kwasu solnego i mieszanine rekacyjna miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu okolo 30 minut. Metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej wykazuje sie, ze glównym produktem reakcji jest windezyna, przy obecnosci bardzo nieznacznej ilosci produktów ubocznych.Przyklad II. 76,8 mg hydrazydu 4-dezacetylo- -VLB-3-karbonylu rozpuszcza sie w 1 ml THF i 1 ml kwasu octowego lodowatego. Mieszanine reakcyjna oziebia sie do temperatury okolo 0°C, po czym wkrapla sie 0,2 ml 10%. obj./obj. roztworu azotynu n-butylu w THF. Tak otrzymana miesza¬ nine reakcyjna miesza sie w temperaturze okolo 0°C w ciagu okolo 5 minut. Nastepnie wkrapla sie 262 mg trójfenylofosfiny w 2 ml THF i po zakon¬ czeniu dodawania trójfenylofosfiny utworzona tak mieszanine rekacyjna miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu okolo 30 minut. Metoda chromato¬ grafii cienkowarstwowej z zastosowaniem ukladu octan etylu — chlorek metylenu — metanol wy¬ kazuje sie, ze przy wytwarzaniu windezyny, wy¬ dajnosc przemiany wynosi jedynie okolo 20°/o i ze mieszanina reakcyjna zawiera oba zwiazki wyjscio¬ we oraz jedna lub dwie nieznane substancje.Przyklad III. 1 g hydrazydu 4-dezacetylo- -VLB-3-karbonylu rozpuszcza sie w 25 ml THF i otrzymany roztwór oziebia sie do okolo 0°C. Do¬ daje sie 7,8 ml 1N kwasu solnego, a nastepnie 2,6 ml 10°/o obj./obj. roztworu azotynu n-butylu w THF (2 równowazniki azotynu n-butylu). Mie¬ szanine reakcyjna miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu 5 minut, po czym do roztworu wkrapla sie 3,4 g trójfenylofosfiny w 25 ml THF (10 równo¬ wazników) i mieszanine reakcyjna miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu okolo 1 godziny.Nastepnie mieszanine reakcyjna ogrzewa sie do temperatury pokojowej i rozciencza 1N kwasem solnym, po czym poddaje 3 razy ekstrakcji równo¬ waznymi objetosciami chlorku metylenu. Nastep¬ nie roztwór alkalizuje sie za pomoca dodania 5 N 10 15 20 25 40 50 Sf wodnego roztworu wodorotlenku sodowego i zasa¬ dowy roztwór poddaje 4 razy ekstrakcji takimi samymi objetosciami chlorku metylenu. Ekstrakty organiczne laczy sie i polaczone ekstrakty suszy Po odparowaniu rozpuszczalnika organicznego otrzymuje sie 946 mg pozostalosci zawierajacej windezyne. Metoda cieczowej chromatografii cisnie¬ niowej wykazuje sie, ze wydajnosc windezyny wy¬ nosi co najmniej 63,7%; w stosunku do ogólnej ilosci cial stalych, co jest równowazne 61,6% wy¬ dajnosci windezyny w stosunku do ilosci zwiazku wyjsciowego, hydrazydu 4-dezacetylo-VLB-3-karbo- nylu.Przyklad IV. 1,973 g hydrazydu 4-dezacetylo- -VLB-3-karbonylu rozpuszcza sie w 50 ml THF i otrzymany roztwór oziebia do temperatury okolo 0°C przy mieszaniu w atmosferze azotu. Dodaje sie 15,6 ml 1 N kwasu solnego, a nastepnie w jed¬ nej porcji 5,2 ml 10% obj./obj. azotynu n-butylu w THF. Mieszanine rekacyjna miesza sie w tem¬ peraturze 0°C w ciagu 5 minut, po czym wkrapla sie roztwór 6,8 g trójfenylofosfiny w 50 ml THF.Po zakonczeniu dodawania trójfenylofosfiny mie¬ szanine reakcyjna miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu okolo 1 godziny, a nastepnie rozciencza 25 ml wody.THF odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostala wodna zawiesine rozciencza sie 1 N kwasem solnym i kwasny roztwór poddaje 2 razy ekstrakcji chlorkiem metylenu. pH kwas¬ nego roztworu doprowadza sie do wartosci okolo 10 za pomoca 14 N wodnego roztworu wodorotlenku amonowego i otrzymany zasadowy roztwór poddaje 3 razy ekstrakcji chlorkiem metylenu. Ekstrakty organiczne laczy sie i polaczone ekstrakty suszy.Po odparowaniu rozpuszczalników otrzymuje sie 1,95 g surowej windezyny. Po oczyszczeniu metoda cieczowej chromatografii cisnieniowej i krystaliza¬ cji otrzymuje sie 1,44 g wolnej zasady, co stanowi 74,6% wydajnosci czystej windezyny.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania windezyny znamienny tym, ze azydek 4-dezacetylo VLB C-3 karbonylu poddaje sie reakcji z trójweglowodorofosfina, w której rodnikiem weglowodorowym jest alkil lub aryl, za wyjatkiem fenylu, z utworzeniem 4-dezacetylo VLB C-3 N-(trójweglowodorofosfora- nylo)karbonimidu o wzorze 5, w którym X oznacza grupe alkilowa lub arylowa inna niz grupa feny- lowa, po czym otrzymany iminofosforan acylu roz¬ klada sie kwasem otrzymujac windezyne. 2. Sposób wytwarzania windezyny znamienny tym, ze azydek 4-dezacetylo VLB C-3 karbonylu poddaje sie reakcji z trójfenylofosforanylo/karbo- nimidu o wzorze 5, w którym X oznacza fenyl, po czym otrzymany iminofosforan rozklada sie kwasem otrzymujac windezyne.124 350 7 K^l Cfl, J*Kz ,2'rrii* 141 - C-0-CH3 H Vtl8 *K ; 10|—Nt T|? CH^oVfjf^oH ca Wofr-*? CH2CH3 \ C-NH-NH, v N0'3 /£Zfi o S CH^CHj /Vz0A / 17 nun Wz r-CH9-CH, wCndezyna 'knas ch3-o-1^^^oh CH3 C-N-P(C6H5,'3 wto O ft' ^ <0H •r- N [--C,H5 w1 ^" r^C-O-CH, H 9 " 101—isr^i? J31,l\'2, 17 HC C-N-P(X), Wzór 5 LZGraf. Z-d Nr 2 — 1380/86 80 egz. A-4 Ctiu 100 il PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL