KR920006903B1 - 디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6,6'-디메틸렌-디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트를 유효성분으로 하는 인체 및 표유동물의 종양형성 억제제 및 종양형성 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6,6'-디메틸렌-디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트를 유효성분으로 하는 인체 및 포유동물의 종양형성 억제제 및 종양형성 억제용 약학적 조성물

제1도는, DDB를 처리했을때와 처리하지 않았을때의 이식된 쥐의 복수중 간암 세포를 갖고있는 쥐들의 생존기간을 나타내는 도면.

제2도는, 여러 DDB 농도에서 시험관속의 쥐의 복수증간암 세포에 대한 세포 생장도.

제3도는, DDB의 여러농도에서 배양된 쥐의 복수증간암 세포안의 3중수소 표지된 티디민 결합을 보여주는 그래프.

제4도는, 여러가지 DDB 농도하에서 배양된 쥐의 복수증간암 세포의 RNA안의 3중수소 표지된 유리딘 결합의 그래프.

제5도는, 여러가지 DDB 농도에서 배양된 쥐의 복수증간암 세포의 단백질 안에서 3중수소 표지된 루신의 결합을 나타내는 그래프.

제6도는, 여러농도의 DDB로 치료한 배양되어진 쥐의 복수증간암 세포의 유사분열 정도를 도시한 도면.

제7도는, 여러가지 DDB 농도하에서 배양된 BEL-7402 인간 간암세포의 세포생장을 보여주는 그래프.

제8도는, DDB의 여러농도에서 배양된 BEL-7402 인간 간암세포의 DNA 안의 3중수소 표지된 티미딘 흡수를 나타내는 그래프.

제9도는, DDB 여러농도에서 배양된 재생되어진 토끼의 간세포의 DNA안의 3중수소 표지된 티디민 결합을 나타내는 그래프.

제10도는, DDB 여러농도에서 배양된 재생되어진 토끼의 간세포의 RNA안의 3중수소 표지된 유리딘 결합을 나타내는 그래프.

제11도는, 여러가지 DDB 농도에서의 배양된 재생된 토끼의 간세포의 단백질내로의 3중수소 표지된 루신의 결합을 나타내는 그래프.

제12도는, 6-메르캅토퓨린과, DDB 및 6-메르캅토퓨린의 동시 존재하에서의 쥐의 복수증간암 세포가 이식된 쥐의 생존 시간을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 디메틸-4,4'-디알콕시-5,6,5',6'-디메틸렌디옥실비페닐-2,2'-디카르복실레이트와, 특히 디메톡시 동족체(DDB)의 신형성(新形成)에 대한 치료제로서의 용도, 특히 악성 신형성에 대한 치료제로서의 용도 및 신형성계 질병의 조절에 있어서 다른 화학요법제와 관련한 이들 화합물 용도에 관한 것이다. DDB는 전통적인 약초인 오미자로부터 분리되어질수 있는, 생리학적으로 활성을 갖는 화합물인 스키잔드린C의 합성 유도체이다. 이 식물의 추출물은 전통적인 중국의 강장제로 사용 되어져 왔고, 만성적인 바이러스에의한 간염의 치료와 또한 사염화탄소, D-갈락토사민과 티오아세트아미드와 같은 화학적인 독성물질에 노출됨으로써 입게되는 간 손상의 치료에 유용하다고 알려져왔다. 만성적인 바이러스에 의한 B형간염 환자에 대한 DDB정제의 치료는, 혈청 글루타민 피루베이트 트랜스아미나제(SGPT)와 빌리루빈 그리고 비정상적 간기능의 전통적 징후인 α-태아 단백질의 증가를 조절하는 것으로 보여지며, 또한 식욕결핍, 고통, 고창(鼓脹)과 같은 간염의 징후의 조절에 효과적임이 입증되었다. 1981년 이래로 중화인민공화국에서는 DDB가 만성간염, 특히 바이러스에의한 B형 간염뿐 아니라 약물에의해 유발된 간손상에 대한 선택된 치료제였다. DDB와 그것의 동족체는 생체내와 시험관내 모두에서, 악성 신형성을 포함하는, 신형성의 성장을 조절할 수 있는 화학요법 치료제로서 유용함이 발견 되었다. DDB는 이식된 복수증(腹水症)의 간암세포를 갖고 있는 쥐의 생존기간을 연장시키고, 쥐에 이식된 고형의 폐암종양의 무게증가를 감소시킨다고 보여진다. 시험관내에서, 배양된 쥐의 복수증의 간암 세포를 사용한 연구는 DDB가, 신형성 세포에 있어서 DNA, RNA, 및 단백질의 합성을 억제함을 보여준다.

특기할만한 점은, 배양된 세포내의 DNA와 단백질 합성의 억제는 신형성 조직에 제한적으로 나타나고, 근본적으로 이들 과정의 억제는 부분적으로 간세척되어진 설치동물류로부터 얻어진 간세포에서는 발견되지 않는다는 사실이다. 신형성 조직의 성장을 예방하는 주요 효과에 부가하여, DDB는 약학상의 투약에 있어서 종종 경변증의 부작용 또는 사용에 있어 기타 투약에 연관된 제한이 있는 메토트랙세이트(methothrexate)와 6-메르캅토퓨린과 같은, 다른 종류의 그 효과가 입증되어진 화학요법 치료제와 함께 사용할 때 유용성을 가짐을 또한 나타낸다. 디메틸-4,4'-디알콕시-5,6,5',6'-디메틸렌디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트는 다음의 구조식을 갖는다.

여기서 R은 저급알킬기이다. 4,4'-디메톡시 동족체는 흐시(Xie)등에 의하여 최초로 합성 되었으며, Acta Pharm.Sinica, 16,306(1981) 및 Yaoxue Xuebao 17,23(1982)등에 소개되어 있다. 라세미 혼합물은 잔(Zhan)등에 의해 보고된 바와같이 분석되어질수 있으며 그 내용은 Kexue Tonqbao 32(1), 72(1987)에 소개되어 있다.

상기 화합물은 리유(Liu)등에 의하여, Chem-Biol.Interaction, 41,39(1982)에 보고된것과 같이 쥐에있어 간질환에 효과적인 처방임이 보여줬고, 중화인민공화국에서는 사람에게 걸리는 바이러스에 의한 B형간염과 다른 약물에 의해 유발되는 간질환에 대한 처방으로 사용되어져 왔다. 디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6'-디메틸렌디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트(DDB)는 스키잔드린 C유사체의 합성에 사용되어지는 중요한 중간체이다.

DDB의 합성을 위한 바람직한 방법은 다음과 같다 : DDB는, 에스테르화 반응, 모노메틸화반응, 메틸렌디옥시 유도체의 형성, 브롬화반응, 그리고 울만(Ullmann)반응에 의해 연속적으로 몰식자산으로부터 합성되어 진다. 울만 반응을 위한 출발 물질로서 모액으로부터 분리된, 혼합된 브롬 화합물을 사용함으로써, 이성질체 디메틸-6,6'-디메톡시-4,5,4',5'-디메틸렌디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트(DDB)가 얻어지고, 그것은 실리카겔을 사용한 관 크로마토그라피에 의해 분리 되어진다. DDB는 녹는점 158℃ 내지 160℃와 녹는점 179℃ 내지 181℃를 갖는 2개의 결정형태로 존재하며, 양쪽 모두 높은 SGPT 수준을 낮게하는데 효과적이다. DDB가 간질환의 치료를 위해 투여될때는 환약의 형태, 또는 덜 효과적이기는 하나 정제의 형태로 투여될 수 있다. DDB가 생체내와 시험관내에서 유해한 세포의 성장을 조절하는데 유용하다는 것이 밝혀져 있다.

이러한, 항종양 능력은 쥐의 복수증의 간암 세포와 쥐에 이식된 루이스 폐암 세포의 성장; DNA, RNA 및 단백질의 합성; 배양된 쥐의 복수증의 간암 세포의 세포생장; 배양된 BEL-7402 인간의 간암 세포를 이용한 세포생장과 DNA 합성; 에 있어서의 억제 효과에 의해 입증되며, 또한 DDB 및 다른종류의 증명된 항암 화학요법 치료제와 함께 투여 할 때 쥐의 복수증의 간암 세포의 세포 생장과 DNA 합성의 억제에 있어서의 증가된 효과에 의해서 입증되어 질수있다. 신형성 조직, 특히 악성 신형성 조직은 빠르고, 또한 본질적으로 분화되지 않은 세포생장을 특징으로 한다. 전이세포는 또한 체계적 이송 및 재침착(再沈着)이 가능하며 쉽게 이식되어진다. 게다가 종양 세포 라인은 무한한 기간동안 시험관안에서 배양되어질 수 있다.

화학요법 치료제의 효능을 시험하기 위한 한가지 방법은 숙주동물, 전형적으로는 포유동물에 배양된 암세포를 주입시키고, 그리고 추정하고 있는 치료제를 숙주동물에 투여하는 것이다. 러시아 과학자에의해 유발될수 있는 간암으로부터 최초로 얻어져서, H22 쥐에서 이식된 쥐의 복수증 간암 세포는 건강한 쥐에 이식될수 있고 그안에서 성장할수 있다. 쥐의 복수증 간암 세포가 대략 20g 정도 무게가 나가는 쿠민(Kumin)쥐에 주입되었을 때, 숙주의 생존기간은 전형적으로 60일 이내이다.

이러한, 쥐들에게 삽관법(揷管法)에 의해 0.2% 나트륨카르복시메틸 셀룰로오즈(CMC-Na)에 현탁된 DDB를 600㎎/㎏/일(日) 처방 했을 때 생존율은 60일 기간의 거의 80% 정도가 증가 했다.

이러한 결과는 DDB 또는 그의 대사산물이 체계적인 분포를 달성하며 생체내에서 항암 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 루이스 쥐의 폐암은 C57-BL/6 쥐로부터 얻어지는 고형의 종양이다. 암세포를 20g의 쿠민균주 쥐들에게 피하로 주입 시켰을 때 암세포는 쥐들속에서 계속 성장한다. 부형제로서 0.2% CMC-Na를 사용하여 삽관법에 의해 DDB로 치료하는 것은 쥐의 몸무게 증가에 있어 큰 변화없이 암세포 무게의 증가를 억제하는 결과를 가져온다. ED₅₀은 약 640㎎/㎏/일(日)로 계산된다. 전체 몸무게의 증가를 억제하지 않는 암세포 성장의 억제는 암세포에 대한 DDB의 높은 선택성과 치료제의 낮은 독성을 나타낸다. 악성 신형성의 결정적 특징은 생체내와 시험관내에서의 빠른 세포생장이다. 시험관내에 추정되고 있는 항암 치료제의 존재하에서의 세포생장의 저해는 생체내에서 화학요법 치료제의 효율과 능력을 강하게 예시한다.

예를들면, 순얀과 한룰에 의한, Recent Advances in Canaer Chemotherapy, PP44-55, Shandong Acad. Press., Hunan, PRC, 1987을 참조한다. DDB가, 쥐의 복수의 간암 세포가 통상적으로 성장되어 있는 세포 배양매체에 투여됐을 때, 세포생식은 투여량에 의존되는 방식으로 억제된다. 세포생식은 유사분열을 하는동안 딸세포에게 편입될 수 있는 새로운 DNA합성을 필요로한다. 유사분열을 직접 억제하는 화학요법 치료제는, 유사분열의 억제가 신형성계질병(순얀 등의 상기 문헌 참조)의 치료에 있어서의 유용성을 더 크게하는 것이기 때문에 특히 가치가 있다. DNA 합성을 억제하는 화학요법 치료제의 행동 양식의 지표는 배양된 세포에 의한 3중수소로 표지된 뉴클레오시드의 흡수량이다. 티미딘같은 3중수소로 표지된 뉴클레오시드의 첨가후에 배양 매체에 DDB를 첨가하면, 쥐의 복수의 간암 세포와 BEL-7402 인간의 간암세포에 있어, 핵 DNA 내로의 3중수소로 표지된 티미딘의 흡수는 투여량에 의존하는 방식으로 억제 되어진다고 보여진다. 각 암세포의 성장률은 세포안에서 최소한 부분적으로는 RNA의 생산에 의존한다. RNA의 생산은 배양 세포안에서 3중수소 표지된 유리딘의 흡수에 의해 결정된다. 쥐의 복수의 간암 세포가 DDB의 여러농도에서 미리 배양되고, 3중수소 표지된 유리딘을 그다음에 배양매체에 첨가하면 유리딘의 흡수는 억제되어진다. 직선적인 투약 반응 곡선이 형성되지 않으며 억제의 정도가 핵 DNA 내로의 3중수소 표지된 티미딘의 흡수시 관찰되는 억제도 보다 현저하게 작다는 의미에서 볼 때, 억제가 전형적으로 투여량 의존적은 아니다. 성장하는 세포속에서의 단백질 합성은 3중수소 표지된 아미노산의 흡수에 의해 측정된다. 쥐의 복수의 간암 세포가 여러 가지 농도의 DDB에 미리 배양되어 있고, 다음에 배양매체에 3중수소 표지된 루신을 첨가했을 때, 단백질 합성율에 상응하는 3중수소 표지된 루신의 흡수는 투여량에 의존하는 방식으로 억제된다.

조직의 성장 속도의 선택적 측정법은 세포-순환 주기의 측정이다. 신형성 세포에서 세포 분할 속도 측정에서의 특히 중요한 것은 세포분열을 시작하고 세포질 분열을 끝맺는 M기(期)의 측정이다. M기의 초기부분 동안, 복제된 염색체는 농축되어 있고, 광학 현미경에 의해 쉽게 확인 되어진다.

유사분열의 지표는 어느 순간에 농축된 염색체를 포함하는 세포의 비율(오래된 세포에 대한 새로운 세포의 비율에 기초한 약간의 정정인자를 가한후)이다. 쥐의 복수 간암 세포가 여러농도의 DDB를 포함하는 배지안에서 24시간동안 배양되었을 때, 유사분열의 지표가 투여량에 의존한 방식으로 감소함은, 암세포의 성장 속도가 DDB에 의해 억제됨을 표시한다. 악성 종양의 치료에 있어서 화학요법치료제의 유용성은 분화 되었거나 또는 "정상"조직에 대한 독성에 의해 제안되어진다. 보편적으로 세포에 대한 독성이 있는 약물은 목표조직안에서만 농축되어야만하며, 또는 목표조직과 다른조직에 대한 독성의 부작용은 받아들여질수 없다. 종양의 성장을 막기 위하여 세포의 분열을 방해하는 DDB의 기능은 상기 문헌에 기록된 결과에 강하게 제기되어 있다. 인체에 기여하는 화학요법 치료제로서 DDB의 안정성과 궁극적인 효용성은 DDB가 비 신형성조직의 정상적인 생장을 방해하지 않는다는 것을 필요로 한다. 부분적으로 간의 병소를 절제한 토끼로부터 분리된 간세포가 간암세포에서 투여량 의존적인 효과를 갖는다고 보여지는 농도에 상응하는 여러 가지 수준의 DDB의 존재하에서 배양 되어질 때, 재생된 간세포에서의 3중수소 표지된 티미딘의 흡수와 3중수소 표지된 유리딘의 흡수 및 3중수소 표지된 루신의 흡수량은 처리되지 않거나 또는 조절된 세포와 근본적으로 구별되지 않는다. 메르캅토퓨린(6-MP)는 푸린고리의 C-6위치에 케토산소가 황원자에 의해 치환되어진 하이포산틴의 유사체이다.

이 화합물은 백혈병에 대한 인정된 임상치료제이다. 6-MP는 효소적으로 6-티오 GMP로 변환되어지며, 이것은 퓨린고리의 생합성과 핵산 상호 전환을 억제한다. 6-MP의 치료적 투약을 받는 성인은 치료받은 환자의 거의 1/3이 황달로 발전한다. 쥐의 복수중 간암 세포가 주입되고 6-MP가 회음내로 투여된 쥐는, 처리된 쥐의 모두가 42일내에 죽게된다. 6-MP의 동일한 투여량과 DDB(300㎎/㎏/일, P.O.)로 치료한 동일한 쥐들은 같은 기간에대해 60%의 생존율을 보였다. 쥐의 배양된 복수중 간암 세포가 3중수소 표지된 티미딘안에서 배양된 후 오직 DDB에 의해 처리될 때, DNA에 있어 티미딘 흡수의 거의 70%가 억제됨이 관찰된다. 동일 농도의 6-MP가 DDB로 치환될 경우 3중수소 표지된 티미딘의 흡수에 있어 거의 56%가 억제됨을 관찰할 수 있다.

상기에서 기술된 양에 상응하는 각 양의 6-MP와 DDB의 동량을 취했을 경우는 억제 정도가 거의 84%이다. 6-MP와 DDB를 병행해서 치료시 각각의 치료제를 따로 사용했을 때 보다 더 큰 효력을 나타내며, DDB의 간장보호 효과가 종종 6-MP만을 독점적으로 투약했을 때 생기는 경변증의 발병을 최소화 시켜줄수 있으리라 기대된다. 메토트렉세이트는 디하이드로폴레이트 환원 효소에 대해 높은 친화력을 갖는 엽산 유사체이다. 메토트렉세이트의 투여는 DNA와 RNA 모두의 합성을 방해한다. 메토트렉세이트 치료로부터 파생되는 중요한 부작용은 백혈구 감소증을 포함하고, 치료적 투여량이 투여될때는 로이코보린이 "구급약"으로서 항상 필요로 한다.

다른 부작용은 혈소판 수혈을 필요로하는 혈소판 감소증을 포함한다. DDB와 메토트랙세이트의 동시 투여는 배양된 세포속에서 DDB 또는 메토트랙세이트 하나만을 치료했을 때와 비교해서 쥐의 복수증 간암 세포의 DNA 내로의 3중수소 표지된 티미딘의 결합을 크게 감소 시키는 것으로 나타났다.

본 발명은 또한 DDB를 포함하는 제약학상의 제법과도 관련되어 있다.

본 발명의 약학적으로 효과적인 화합물은 사람을 포함한 포유동물에게 경구 또는 비경구식 투약을 위한 제약적 제조방법을 포함하는 전통적인 조제방법에 의해서 만들어진다. 적합한 부형제는 활성인 화합물과 유해한 반응을 일으키지 않는 비경구 및 내복용에 적합한 제약적으로 허용될 수 있는 유기 및 무기담체이다.

적합한 담체는, 반드시 제한되어져야할 필요는 없지만, 물, 식염수, 알콜, 아라비아 고무, 식물성 기름, 폴리에틸렌글리콜, 젤리틴, 당류, 마그네슘스테아레이트, 활석, 규산, 파리핀류, 모노글리세라이드 및 디글리세라이드 지방산, 펜타에리트리톨, 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로이즈 및 이들의 염, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다. 약학적 제조물을 살균되어지고, 필요하다면, 윤활제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 완충제, 그리고 활성적인 화합물과 유해한 반응을 일으키지 않는 색소 및/또는 향미제와 같은 보조제와 혼합될 수 있다. 내복용을 위해서는 정제, 환약, 오블라아트 및 캡슐 의 형태가 특히 적합하다. 곡분, 고령토, 쌀가루와 같은 적합하고 독성이 없는 희석제가 사용될 수 있다. 아라비아 고무, 트라가칸트, 정제당, 젤라틴, 녹말, 및 카르복시메틸셀룰로오즈 같은 저착제가 고형 조제물용으로 적합하다. 글루코오즈, 글리세린, 아카시아 정액과 시럽같은 부형제가 첨가될 수 있다.

정제의 형태의 특정한 셀룰로오즈, 이스트, 및 다시마줄기 가루 같은 팽화제도 포함한다. 밀랍기제를 갖는 좌약 역시 적합하다. 한 개 또는 그 이상의 분해할수 있는 코팅을 가지는 지속적인 분해 처방 및 미소 캡슐화 역시 기대된다. 미합중국 약전, 국가 약학처방서 및 영국 약학 사본과같은 표준 약학 처방서가 적절한 조제 처방에 있어서 안내 책자로서 사용될수 있다. 제조방법은, "Remington's Practice of Pharmacy"와 같은 표준 참고 서적에 서술된 방법에 의해 행해진다. 투약을 위해 가장 좋은 형태는, 일본국 특공소 60-209582호에 있는 환약의 형태이다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체내에서 활성 성분의 30 내지 150㎎, 바람직하게는 45 내지 60㎎을 포함하는 단위 투약 형태로 조제된다. 사람에게 적절한 일일 투여량은, 투약하는 의사의 임상 경험과 치료 양생법에 따르며, 부가적인 화학요법 치료제, 방사선 치료 등의 사용을 포함할수 있으나, 1.25 내지 6.50㎎/㎏/일 이다.

상술한 본 발명의 유용성은 다음 실시예의 참고에 의해 더욱 잘 설명되어 질 수 있다.

이러한 실시예는 개시된 발명을 대표하는 것이고 제한하는 것은 아니다.

이 발명의 내용 범위내에서 약간의 수정은 당업자에게 가능한 일이다.

[참고예 1]

[디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6'-디메틸렌디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트(DDB)의 합성:]

1. 메틸 몰식자산염

농축황산 20㎖를 6 내지 8시간동안 교반하면서 실온에서 메탄올 600㎖안에 200g의 몰식자산이 녹아있는 용액에 적하하여 첨가한다. 메탄올의 대략 2/3가 제거된후에 잔여물은 10℃까지 냉각되고 1.2㎏의 물을 부은 뒤 하룻밤 방치된다. 형성된 백색 침전을 걸러내고 물로 세척하면, 녹는점 200℃ 내지 204℃(수득율 82%)의 메틸몰식자산염 178g을 얻을 수 있다.

2. 메틸-3-메톡시-4,5-디하이드록시벤조에이트

붕사수용액(1.5ℓ의 물에 70g의 붕사가 녹아있는)에 25g의 메틸몰식자산염을 용해시켜 준비한 혼합물에 실온에서 6시간동안 적하 깔대기를 통해 60㎖의 디메틸설페이트와 수산화나트륨 수용액(100㎖의 물에 26g의 수산화나트륨을 용해)을 교반하면서 각각 첨가한다. 첨가하는 동안에 반응혼합물의 pH는 8 내지 9를 유지한다. 첨가후에, 혼합물을 하룻밤 동안 방치하고, 농축황산으로 pH 3으로 산성화시키고 에틸아세테이트로 추출한다. 용매는 증발시키고, 잔여물은 녹는점 111℃ 내지 113℃(수득율 79%)의 모노-메톡시에테르 21.3g을 얻기위하여 톨루엔과 물로 세척된다.

3. 메틸-3,4-디히드록시-메톡시벤조에이트

150㎖의 아세테이트내의 14.0㎏의 모노-메톡시에테르, 5.7g의 디요오드메탄 및 25g의 칼륨카보네이트 무수물을 섞은 혼합물이 40시간동안 환류되었다. 반응 혼합물을 냉각한후에 여과하고, 용매를 증발 시킨후 잔여물은 하룻밤 동안 방치되었다.

그후, 잔여물은 물과 10% 알콜로 3 내지 4회 세척하여 백색 고체의 형태로 녹는점 89℃ 내지 90℃의 위제목의 화합물, 4.2g을 얻을 수 있다(에탄올로부터 재결정화시, 수득율 69%).

4. 메틸-2-브로모-3,4-디메틸렌디옥시-5-메톡시벤조에이트

60㎖의 빙초산에 16.8g의 브롬이 용해된 용액을 130㎖ 빙초산에 위에서 얻은 메틸렌디옥시 유도체 22g이 녹아있는 용액에 적하하면서 첨가하여 3시간동안 12℃ 내지 14℃에서 교반 하였다. 브롬의 첨가후에 혼합물이 2시간 동안 추가 교반 되었다. 그 다음에 반응혼합물을 냉각수내에 쏟아붓고 침전이된 고체를 여과한후, 22g의 조제(粗製)생성물을 얻기위해 세척 용액이 중화될때까지 세척하였다. 에탄올로부터 재결정화로 녹는점 102℃ 내지 104℃(수득율 64%)의 브롬화합물 19g을 얻었다.

5. 디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6'-디메틸렌디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트(DDB)

상기에서 얻은 브롬화합물(4) 50g과 160㎖의 DMF속에 있는 34g의 구리가루의 혼합물이 환류되고 2시간동안 교반 되었다. DMF의 제거후에 잔여물은 벤젠과 메틸렌 클로라이드(1 : 1)으로 추출되고, 수득율 87%의 녹는점 158℃ 내지 160℃ 또는 178℃ 내지 180℃(상이한 결정 형태에 기인함)의 DDB 31.4g을 얻기위하여 메탄올 : 클로로포름(1 : 3)으로부터 재결정화되는 백색 결정의 고체를 얻기위해 증발시킨다.

[실시예 1]

몸무게가 18에서 22g사이인 20마리의 수컷인 큐민균주 쥐들을 큐민쥐들로부터 얻은 현탁된 쥐의 복수증 간암 세포의 동일한 부분 표본으로 회음내로 접종하였다. 쥐들에게는 실험용 동물의학회에서 제조한 실험용 음식물과 물로 음식물을 제한시켰다. 병균을 접종한후 하루후 쥐들은 2종류의 그룹으로 나누어졌다. 그룹 1에게는 0.2% CMC-Na(10㎖/㎏)내에 현탁된 DDB 300㎎/㎏을 하루에 두 번씩 삽관법에 의해 투여했다. 대조그룹에는 동일한 부피의 부형제를 투여했다. 치료는 38일만에 종결되었다. 접종후 58일후에 대조그룹의 보든 쥐들은 사망했고, 반면, DDB로 치료된 10마리의 쥐중 8마리가 생존했다. 제1도는 58일이 지난후에 각 그룹에서 생존해 있는 쥐의 수를 보여주는 그래프이다.

[실시예 2]

실시예 1에서 사용된 수컷 큐민균주 쥐들에게 C57-BL/6쥐로 부터 얻어진 루이스폐암세포의 균등질의 부분표본 0.1㎖를 피하고 주입하고 4개의 그룹으로 나누었다. 물과 실험용 음식으로 쥐들의 먹이가 제한되었다. 그룹들중에 3그룹에 0.2% CMC-Na내의 DDB가 삽관법에 의해 투여되었다. 투여량은 동일한 부피로 75, 150 및 300㎎/㎏일 이였다. 대조그룹 쥐들은 동량의 부형제를 투여했다. DDB는 9일동안 투약되었고 10일째에는 각 쥐들의 무게를 재었고, 그후 도살되었다. 종양이 제거되었고 그리고 각각의 무게를 재었다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

[쥐의 루이스폐암에 대한 DDB의 효과]

*P〈0.001

[실시예 3]

1×10⁵세포/㎖의 농도인 쥐의 복수중간암세포 현탁액이 DDB1, 5, 10 및 20㎍이 포함된 DMSO 10㎕를 첨가한 배양매체, RPMI-1640에서 배양되었다. 대조그룹에는 오직 10㎕의 DMSO만을 첨가 하였다. 배양군 3은 CO₂배양기에서 배양되었고, 24, 48 및 72시간에 각 배양군으로 부터 6개의 부분표본이 회수되었으며 40배율 확대로 현미경을 통해 그 수를 세었다. 그 결과는 제2도에 나타내었다. 대조그룹과 DDB 그룹의 차이점은 통계적으로 주목할만하다.(P〈0.01)

[실시예 4]

쥐의 복수의 간암세포가 5×10⁵세포/㎖의 밀도로 RPMI-1640에서 현탁된후, 그 세포현탁액 1㎖를 페트리(petri)접시에 넣고 10㎖ DMSO내의 0, 1, 5, 10, 20㎍의 DDB로써 24시간 동안 배양하였다. 3중수소 표지된 티미딘(0.5μci)를 각 접시에 첨가하고 4시간 더 배양하였다. 0.1㎖의 1% 트리톤 X-100이 세포를 용해시키기 위해 첨가 되었다. 2㎖의 10% 트리클로로아세트산(TCA)가 첨가되었다. 원심분리 시킨후에 핵산을 분리해내기위해 5% TCA 1㎖가 첨가되었다. 액체 0.2㎖가 브레이(Bray)의 액체 형광 칵테일에 첨가되고, 벡크만 LS-9800 형광 분석기에 의해 방사선이 계수되었다. 결과는 제3도에 나타내었다.

[실시예 5]

쥐의 복수중간암 세포(5×10⁵세포/㎖)가 실시예 4에서 기술된 바와같이 DMSO내의 0, 1, 10 및 100㎍/㎖의 DDB와 함께 5% CO₂배양기에서 RPMI-1640 배양매체 1㎖의 내에 24시간 동안 미리 배양되었다.

3중수소 표지된 유리딘, 0.5μci을 배양매체에 첨가시킨후 4시간 더 배양을 계속한다. 세포는 실시예 4와 같은 방식으로 처리되고, 결합된 3중수소 표지된 유리딘은 기술된 바와같이 측정되었다. 결과는 제4도에서 나타내었다.

[실시예 6]

쥐의 복수증간암세포(5×10⁵세포/㎖)가 실시예 4에서 기술된 바와같이 DMSO내의 0, 1, 10 및 100㎍/㎖의 DDB가 존재하는 5% CO₂배양기안의 RPMI-1640 배양매체 1㎖에서 24시간동안 배양되었다. 3중수소 표지된 루딘, 0.5μci가 각 샘플에 첨가되었고 4시간 동안 더 배양되었다. 샘플은 실시예 4에 기술된 바와같이 처리되었다. 단백질 침전은 0.4N 수산화나트륨 0.5㎖에 용해되었고, 단백질 용액0.4㎖가 형광 칵테일과 방사능결정에 첨가 되었다. 결과는 제5도에 나타내었다.

[실시예 7]

5×10⁵세포/㎖의 초기농도를 갖는 쥐의 복수증간암 세포가 DMSO내의 0, 1, 10, 100㎍/㎖의 DDB가 존재하는 5% CO₂배양기속에 있는 RPMI-1640 배양매체 1㎖에서 24시간 동안 배양되었다. 배양이 끝난다음 500×G에서 5분동안 현탁액을 원심분리 시킨다. 세포현탁액 방울이 세포층으로부터 회수되고, 라이츠-글렘사(wrightsglemsa)염료로 염색되었다. 500개 세포의 무작위 그룹이 400배의 현미경하에서 관찰되고 각 그룹에서의 M기의 세포수가 측정되었다. 그 결과는 제6도에 나타내었다.

[실시예 8]

모든 배양 라인으로부터 얻어진 BEL-7402 인간 간암종양 세포가, DDB 0, 1, 10 및 100㎍을 포함하는 DMSO 10㎕가 첨가되는 초기농도 5×10⁵세포/㎖의 페트리 접시안에 있는 RPMI-1640 배양매체에서 배양되었다. 세포배양군으로부터의 방울을 회수해서 현미경으로 분석했다. 결과는 제7도에 나타내었다. 최소 효과를 보이는 투여량은 1㎍ DDB/㎖ 배양매체로 계산되었다.

[실시예 9]

BEL-7402 인간간암세포가 실시예 7에 기술된 바와같이 배양되었다. 24시간후에 10㎕의 3중수소 표지된 티미딘, 0.5μci가 각 배양군에 첨가되고, 실시예 4에 기술된 것과 마찬가지로 티미딘의 흡수가 측정되었다. 결과는 제8도에 나타내었다.

[실시예 10]

몸무게가 150g 정도의 수컷 위스터 토끼가 간의 거의 70%가 손상된 부분적인 간암에 걸려 있었다. 복부가 봉합되었고 그 토끼들은 5일동안 물과 실험실용 음식물로 식이를 유지했다. 그 동물을 도살하여 간을 절개하고 콜라겐 분해효소용액에 담그고, 세글렌(Seglen)의 방법(Methods Cell Biol.13, 29(1976))에 의해 간세포를 분리하였다. 간세포는 RPMI-1640 배양매체에서 5×10⁵세포/㎖까지 희석되고, DMSO 10㎕속에 녹아있는 DDB 0, 1, 10 및 100㎍속에서 배양되었다. 24시간후에 보통식염수 10㎕에 녹아있는 3중수소 표지된 티미딘 0.5μci가 배양균매체에 첨가되고, 현탁액은 4시간 더 배양되었으며, 세포는 실시예 4와 같이 처리되었다. 결과는 제9도에 나타내었다.

[실시예 11]

몸무게 150g정도의 수컷 위스터 토끼가 간의 약 70%가 손상된 부분적인 간암에 걸려 있었다. 복부가 봉합되었고 그 토끼들은 5일동안 물과 실험실용 음식물로 식이를 유지시켰다. 그 동물을 도살하여 간을 절개하고 콜라겐 분해효소용액에 담근후 간세포를 세글렌의 방법에 의해 분리하였다. 간세포는 RPMI-1640 배양매체에서 5×10⁵세포/㎖까지 희석되고, 4개의 그룹으로 나누어졌다. 간세포 각 1㎖씩을 DMSO 10㎕에 녹아있는 0, 1, 10 또는 100㎍의 DDB에 첨가하였다. 24시간후에 식염수 10㎕에 녹아있는 3중수소 표지된 유리딘 0.5μci가 배양매체에 첨가되고 현탁액은 4시간 더 배양되며 실시예 4와 같이 처리되었다. 결과는 제10도에 나타내었다.

[실시예 12]

몸무게 약150g의 수컷 위스터 토끼가 간의 거의 70%가 손상된 부분적인 간암에 걸려 있었다. 복부가 봉합되었고 그 토끼들은 5일동안 물과 실험실용 음식물로 식이가 유지되었다. 그 동물을 도살시켜 간을 절개시키고 콜라겐 분해효소 용액에 담그어 간세포를 세글렌 방법에 의해 분리시켰다. 간세포는 RPMI-1640 배양매체에서 5×10⁵세포/㎖까지 희석되며 4그룹으로 나누어졌다. 간세포 1㎖가 DMSO 10㎕에 녹아있는 0, 1, 10 또는 100㎍의 DDB에 각각 첨가되었다. 24시간후에 보통 식염수 10㎕에 녹아있는 3중수소 표지된 루신 0.5μci가 배양매체에 첨가되고 현탁액은 4시간 더 배양되었다. 단백질은 분리되어지고, 3중수소 표지된 루신의 결합은 실시예 6에 기술된 바와같이 측정할수 있다. 결과는 제11도에 나타내었다.

[실시예 13]

몸무게가 18 내지 22g 정도인 10마리씩의 수컷 큐민균주 쥐들 2그룹에, 이식된 쥐들로부터 2배의 희석후에 얻어진 쥐의 복수간암 세포 0.2㎖를 회음내로 주입시켰다. 그룹 1에게는 매일 6-메르갑토퓨린 48㎎/㎏을 회음내로 투여했다. 그룹 2에게는 6-M의 동일한 양과 더불어 삽관법에 의해 DDB 300㎎/㎏을 투여했다. 42일이 끝날때쯤 6-MP만을 투여했던 모든 쥐들이 사망했고, DDB와 6-MP 모두를 투여했던 쥐들중의 6마리는 생존했다. 결과는 제12도에 나타내었다.

[실시예 14]

5×10⁵세포/㎖의 농도인 쥐의 복수증간암세포가 DDB 10㎍ 또는 메토트렉세이트 10㎍ 또는 DDB 10㎍과 메토트렉세이트 10㎍의 존재하에 5% CO2 배양기 안에 있는 RPMI-1640 배양매체에서 배양되었다. 메토트렉세이트는 증류수에 용해되었다. DMSO와 증류수 동량을 포함하는 대조그룹이 또한 사용되었다. 24시간후에 3중수소 표지된 티미딘 0.5μci가 각 샘플에 첨가되었고 배양은 4시간 더 계속되었다. 세포가 치료되었고, DNA에의 3중주소 표지된 티미딘 결합이 실시예 4에 기술되어진 방법에 의해 측정 되었다. 결과는 표2에 나타내었다.

[표 2]

[세포생장에서 MTX를 결합시키는 DDB의 효과와 시험관에서의 복수간암 DNA에로의³H-TdR의 결합정도]

DDB는 DMSO내에 용해되고, MTX는 증류수내에 용해됨

* P〈0.05

** P〈0.01

*** P〈0.001

[실시예 15]

6-MP가 메토트렉세이트로 치환된것만 제외하고 실시예 13의 방법을 사용하여 쥐의 복수증 간암세포에서의 3중수소 표지된 티미딘의 DNA 흡수를 측정하였다. 결과는 표 3에서 나타내었다.

[표 3]

[세포생장에서 6-MP를 결합시키는 DDB의 효과와 시험관에서의 복수간암 DNA에로의³H-TdR의 결합정도]

DDB는 DMSO내에 용해되고, 6-MP는 증류수내에 용해됨

** P〈0.01

*** P〈0.001

Claims (3)

1. 디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6'-디메틸렌-디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트를 유효 성분으로하는 것을 특징으로 하는 인체 및 포유동물의 종양형성 억제제.
2. 6-메르캅토퓨린 1중량부당 구성되는 디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6'-디메틸렌-디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트 약 6중량부로 인체 및 포유동물의 종양형성 억제용 약학적 조성물.
3. 메토트렉세이트 1중량부당 디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5',6'-디메틸렌-디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트 약 6중량부로 구성되는 인체 및 포유동물의 종양형성 억제용 약학적 조성물.

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