KR100569086B1

KR100569086B1 - 간세포 보호활성을 갖는 고로쇠 잎 추출물 및 이로부터분리된 페놀성 화합물

Info

Publication number: KR100569086B1
Application number: KR1020030060351A
Authority: KR
Inventors: 양혜경; 성상현
Original assignee: 주식회사 엘컴사이언스
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2006-04-10
Anticipated expiration: 2023-08-29
Also published as: KR20050022711A

Abstract

본 발명은 고로쇠나무 잎의 추출물을 포함하는 간질환 예방 및 치료용 조성물 및 상기 추출물에서 분리된 하기 일반식 (1) 및/또는 (2)의 화합물을 포함하는 간질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다:

(1),

(2)

상기 식에서, R₁은 수소 또는 치환되거나 비치환된 아릴기이고, R₂는 수소 또는 OR₁₁(여기서, R₁₁은 수소 또는 람노우즈임)이고, R₃은 수소, 글루코스이고, R₄는 수소 또는 에이피오즈이고, R₅ 및 R₆은 각각 수소 또는 하이드록시기이다.

간질환, 고로쇠나무

Description

간세포 보호활성을 갖는 고로쇠 잎 추출물 및 이로부터 분리된 페놀성 화합물{Acer mono leaf extracts and Phenolic compounds isolated thereof having hepatoprotective activity}

도 1은 본 발명의 고로쇠 잎(Acer mono)에서 분리된 화합물들의 구조를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 화합물 6의 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 나타낸 것이며,

도 3은 본 발명의 화합물 6의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 화합물 7의 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 나타낸 것이며,

도 5는 본 발명의 화합물 7의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 6은 본 발명의 화합물 6 및 7의 FAB MS 스펙트럼을 나타낸 것이며,

도 7은 본 발명의 화합물 1 내지 7의 CCl₄-손상된 1차 배양된 간세포에 대한 간세포 보호 활성을 나타낸 것이다.

본 발명은 고로쇠나무 잎의 추출물을 포함하는 간질환 예방 및 치료용 조성 물 및 상기 추출물에서 분리된 하기 일반식 (1) 및/또는 (2)의 화합물을 포함하는 간질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다:

(1),

(2)

간장질환은 바이러스에 의한 급성간염이나 지속적인 다량의 알코올 섭취로 인한 지방간의 형태로 발병하여 만성간염으로 이행된 후 간경변과 간암으로 발전하는 진행 경로를 밟는 경우가 대부분이다. 우리나라 간장질환 환자의 수는 70년대 후반부터 급격히 증가하는 추세를 보이고 있으며, 1996년에는 사인 분류가 가능한 사망자 중 약 9% 가량이 간장질환에 의하여 사망한다고 한다. 그러나 아직까지도 인터페론이나 최근 개발된 간염치료제인 라미부딘을 제외하고는 간장질환 치료제의 개발에 별다른 진전이 없는 실정이며, 만성 간염의 치료보조제로 마리아 엉겅퀴 (Sylibum marianum)에서 분리된 실리마린이나 오미자 (Schizandra chinensis)에서 분리된 리그난 성분의 합성 유도체인 DDB등이 이용되고 있을 뿐이다.

이에 본 발명자들은 천연물로부터 새로운 간장질환 치료제로 개발될 후보물질을 도출하기 위해 흰쥐의 일차배양한 간세포에 인위적으로 독성을 유도시키고 이를 검색계로 하여 천연물을 대상으로 독성을 차단하거나 회복시키는 등의 보호활성을 검색하였다. 본 발명에서는 탄소 테트라클로라이드(CCl₄)를 사용하여 간세포에 독성을 유발시키고 천연물 추출물을 작용시켜 간세포로부터 배양액 중으로 유리되는 글루타민 피루빅 트랜스아미네이즈를 측정하여 그 활성을 판단하였다. 이러한 방법을 통해 천연물의 간세포 보호 활성 유무를 일차적으로 검색하던 중 고로쇠나무 (Acer mono Maximowicz) 잎의 총 메탄올 추출물이 유의성 있는 간세포 보호 활성을 나타냄을 알게 되었다.

배양한 간세포에 독성을 유발시키는 물질로는 CCl₄를 사용하였다. CCl₄는 매사 활성에 의하여 독성을 나타내므로 대사능이 있는 간에 선택적으로 작용하여 사이토크롬 P-450을 파괴하고, 지방간을 유발시키며, 간괴사 및 간경변을 초래한다. CCl₄의 독성기전은 형질내세망의 NADPH-사이토크롬 P-450 시스템에 의하여 활성화되어 트리클로로메틸 라디칼 (CCl₃) 및 산소 존재하에, 보다 반응성이 좋은 트리클로로메틸 퍼옥시 라디칼 (CCl₃O₂)을 생성한다. CCl₃O₂는 폴리비포화 지방산과 반응하여 지질과산화를 유발한다. 반면 CCl₃는 막의 지질 및 단백질과 공유결합을 하여 막의 지질과산화를 초래한다. 이러한 세포지질의 과산화는 형질내세망의 형태적 변화, 약물대사 효소의 활성 감소, 단백질 합성의 감소 및 글루코스-6-포스파테이즈의 활성 감소를 일으키고 간에서 합성된 트리글리세라이드의 방출을 억제하여 지방간을 유발시킴으로써 궁극적으로는 세포괴사를 초래한다 (Gravela et al., 1979; Groot et al., 1986; Slater, 1984).

고로쇠나무(고로쇠)는 단풍나무과 (Aceraceae)에 속하는 낙엽교목으로 산색수, 고로실나무 등으로 불리운다. 단풍나무과는 북반구의 온대에 2속 100종 가량이 분포하며, 우리나라에는 1속 13종이 분포한다. 고로쇠나무의 식물학적 특징은, 높이 20m 안팎이고 수피는 회색이며 갈라지고 소지(小枝)에 털이 없다. 잎은 대생하고 둥글며 5~7개로 얕게 갈라지고 열편은 끝이 날카롭고, 엽병이 길고 뒷면 맥 위에 약간의 털이 있다. 꽃은 황색으로 4~5월에 잎보다 먼저 피며, 자웅동주이고 산방화서이다. 꽃잎은 5개이며, 8개의 수술과 1개의 암술이 있다. 10월에 열매가 성숙되며 시과(翅果)는 길이 2~3cm이고 예각으로 벌어진다. 민간에서는 고로쇠나무의 수액을 이른 봄에 채취하여 이뇨, 변비, 위장병, 통풍 및 신경통의 치료에 사용하며, 잎을 지혈제로, 뿌리 및 근피를 관절통, 골절의 치료에 사용하였다. 동속식물로는 울릉도에서만 자생하는 우산고로쇠 (A. okamotoanum Nakai)를 비롯하여 긴고로쇠 (A. mono for. dissectum Rehder), 털고로쇠 (A. mono var. ambiquum Rehder), 왕고로쇠 (A. mono var. savatieri Nakai ), 산고로쇠 (A. mono var . horizontale Nakai ) 등이 분포하고 있다.

고로쇠나무의 성분과 생리활성에 대하여는 아직까지 보고된 바 없다. 이에 본 발명에서는 간세포 보호 활성을 나타낸 고로쇠나무 잎의 총 메탄올 추출물로부터 활성 지향적 분리기법을 이용하여 활성물질을 분리하고 그 작용기전을 밝힘으로써 새로운 간장질환 치료제로 개발될 수 있는 화합물을 찾아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 고로쇠나무 잎 추출물을 포함하는 간질환 예방 및 치료용 조성물 및 상기 추출물에서 분리된 상기 일반식 (1) 또는 (2)의 화합물을 포함하는 간질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 고로쇠나무 잎의 C_1-4 알콜 추출물 또는 상기 추출물의 분획물을 포함하는 간질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 고로쇠 잎의 추출과정의 일예를 들어 하기에 상세하게 설명한다.

고로쇠 잎을 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 부탄올 등과 같은 C_1-4알콜, 바람직하게는 메탄올을 용매로 하여 초음파 추출 등의 통상의 추출방법으로 추출하고, 감압농축하여 알콜 총 추출물을 얻는다. 얻어진 고로쇠 잎 추출물, 예컨대 메탄올 추출물을 최소한의 증류수에 현탁시킨 다음, n-헥산으로 분획하여 물 분획과 n-헥산 분획을 얻는다. 얻어진 물 분획을 다시 클로로포름으로 분획하여 클로로포름 분획과 물 분획을 얻고, 물 분획을 또 다시 EtOAc로 분획하여 EtOAc 분획과 물 분획을 얻고, EtOAc 분획을 n-BuOH로 분획하여 고로쇠 잎의 n-BuOH 분획물 및 물 분획을 얻는다.

상기 고로쇠 잎의 C_1-4알콜 총 추출물 및 이로부터 분획된 분획물들은 하기 실시예와 같이 우수한 간질환 예방 및 치료 효과를 나타내었다.

본 발명은 또한 상기 고로쇠 나무 잎의 추출물에서 분리된 하기 일반식 (1)의 화합물을 포함하는 간질환 예방 및 치료용 조성물에 제공한다:

(1)

상기 식에서, R₁은 수소 또는 치환되거나 비치환된 아릴기이고, R₂는 수소 또는 OR₁₁(여기서, R₁₁은 수소 또는 람노우즈임)이고, R₃은 수소, 글루코스이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "아릴"은 페닐, 나프틸, 또는 C_1-4알킬 또는 하이드록시기로 치환된 페닐(예, 페놀, 레조시놀 등)일 수 있으며, 특히 페놀 또는 레조시놀이 바람직하다.

상기 일반식 (1)의 화합물이 에리오딕티올-7-O-β-D-글루코피라노사이드, 5,7-디히드록시크로몬 7-O-β-D-글루코피라노사이드, 나링게닌 7-O-β-D- 글루코피라노사이드, 에리오딕티올 또는 쿼시트린이 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 추출물에서 분리된 하기 일반식 (2)의 화합물을 포함하는 간질환 예방 및 치료용 조성물에 제공한다:

(2)

상기 식에서, R₄는 수소 또는 에이피오즈이고, R₅ 및 R₆은 각각 수소 또는 하이드록시기이다.

상기 일반식 (2)의 화합물은 5-메톡시-(E)-레스베라트롤 3-O-β-D-에이피오푸라노실-(1→6)-D-글루코피라노사이드 또는 5-메톡시-(E)-레스베라트롤 3-O-β-D-글루코피라노사이드가 바람직하다.

상기 페놀성 화합물은 고로쇠 잎 분획물에서 분리할 수 있다. 고로쇠 잎 분획물중 EtOAc 분획물의 경우, 간세포 보호 활성이 가장 우수하였고, 이 EtOAc 분획물을 하기 실시예의 방법에 따라 컬럼크로마토그래피하여 상기 일반식 (1) 또는 (2)의 화합물을 얻었다.

본 발명의 상기 일반식 (1) 또는 (2)의 화합물은 우수한 간질환 예방 및 치료 효과를 나타내었다.

본 발명의 상기 일반식 (1)과 (2)의 화합물은 약제학적 분야에서 공지의 방법의 의해 제제화될 수 있고, 그 자체 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 약제학적으로 통상으로 허용되는 약학적 제제, 예를 들면 액제, 시럽제, 캡슐제 등으로 제제화될 수 있으며, 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 제제는 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일 0.01∼500mg/kg, 바람직하게는 0.1∼200mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 실시예에서 사용한 분석용 시약 및 추출용매 등은 하기와 같다.

컬럼크로마토그래피용 실리카겔

Kiesgel 60 (40-60μm, 230-400 mesh, Art. 9385, Merck, Germany)

Lichroprep ODS RP-18(40-63μm Art. 11447, EM Science, U.S.A)

컬럼크로마토그래피용 Sephadex LH-20

Sephadex LH-20 (bead size 25-100 μm, Pharmacia, Sweden)

박층 크로마토그래피용 precoated plates

Kiesgel 60 F₂₅₄(Art. 5715, Merck, Germany)

RP-18 F₂₅₄(Art. 15389, Merck, Germany)

발색시약

아니스알데히드 - H₂SO₄

추출용매 및 기타 시약

식물재료의 추출과 컬럼크로마토그래피용 용매는 시약용 용매 (Koryo Pure Chemical Eng. Co. Ltd., Korea)를 1차 증류하여 사용하였고, HPLC용 용매는 HPLC grade 용매 (Fisher Scientific Korea Ltd., Korea), 그 외에는 분석용 1급 시약 (Duksan Pure Chemical Co. Ltd., Korea ; Junsei Chemical Co., Japan)을 사용하였다.

간세포 보호 활성 측정용 시약

콜라게네이즈 (Type IV), 덱사메타손, 겐타마이신 설페이트, HBSS, 인슐린, 페니실린-스트렙토마이신, 트립신 블루, Waymouth MB 752/1, 실리마린 등은 Sigma-Aldrich Co. (USA) 제품을 사용하였고, L-알라닌, L-세린, 소 혈청 알부민 (fraction V)은 Amnesco (USA) 제품을, 소태아 혈청은 Hyclone Co. (USA) 제품을, 우레탄(urethane)은 Junsei Chemical Co., Ltd. (Japan) 제품을 사용하였다. GPT kit은 영동제약 (Korea)에서 구입하였다.

기기

Autoclave : Sanyo MLS 3000, Japan

Analytical Balance : Mettler AE 50, Switzerland

Centrifuge : Eppendorf, Centrifuge 5810-R, Germany

Cold Chamber : LG Electronics, GC-123EHF, Korea

Clean Bench : Sookong, Korea

Drying Oven : Wooju Sci. Co., CO-2D-1S, Korea

ELISA microplate reader : Speatra Max 340PC, USA

Evaporator : EYELA NE, Japan

HPLC : Pump ; Dionex P580, USA

Autosampler ; Dionex ASI-100, USA

Detector ; Dionex UVD170S, USA

HPLC 컬럼 : LUNA 10u Phenyl-hexyl, Phenomnex, USA

Watchers 120 ODS-BP (10um), DAISO Co. Ltd., Japan

IR : Perkin Elmer 1710 spectrophotometer, USA

Microspin: Sorvall Instruments Dupont. USA

Millipore Filter : Millipore Co., USA

MS : JEOL JMS AX 505 WA Spectrometer, Japan

NMR : JEOL GSX 400 Spectrometer (400 MHz), Japan

JEOL LA 300 Spectrometer (300 MHz), Japan

Bruker AMX 500 Spectrometer (500 MHz), Germany

Phase Contrast Inverted Microscope : Olympus CK-2, Japan

Sonicator : Branson 5200, UK

Speed Vac Concentrator : Savant SVC-100H, USA

UV Spectrophotometer: Shimadzu UV-2101 Spectrophotometer, Japan

UV Lamp : UVP UVGL-58, USA

Water-jacked CO₂ Incubator : Forma Scientific Co., USA

실시예. 고로쇠 잎의 추출물의 제조 및 간세포 보호 성분의 분리

1. 고로쇠 잎의 추출물의 제조 및 간세포 보호 성분의 분리

(1) 식물재료

본 실시예에 사용한 고로쇠나무 잎 (5.2 kg)은 2001년 6월 전라남도 광양시 백운산에서 채집하여 건조한 것을 서울대학교 약학대학 한대석 명예 교수님으로부터 식물학적 감정을 거친 후 사용하였다.

(2) 고로쇠 잎의 추출 및 분획

건조된 고로쇠나무의 잎 (5.2kg)을 80% MeOH로 4회, 3시간 동안 초음파 추출하였고, 그 추출액을 감압 농축하여 총 추출물 783g을 얻었다. 또한 이를 최소한의 증류수에 현탁한 다음 n-헥산으로부터 EtOAc, n-BuOH로 극성을 높여가며 분획하고 감압 농축하여 n-헥산 분획 (195g), CHCl₃분획 (39g), EtOAc 분획 (98g), n-BuOH 분획 (121g) 및 H₂O 분획 (100g)을 얻었다(도식 1).

도식 1

(3) EtOAc 분획물로부터 화합물 1∼7의 분리

상기 분획 중 가장 높은 간세포 보호 활성을 보이는 EtOAc 분획을 H₂O와 MeOH의 혼합용매를 사용하여 농도 구배(step gradient) ODS RP c.c.를 실시하여 6개의 소분획 (Fr. 1 ~ Fr. 6)으로 나누었다. 각 소분획들의 간세포 보호 활성을 측정한 결과 소분획 Fr. 1, 4 및 5가 다른 분획에 비해 유의성 있게 높은 간세포 보호 활성을 나타내었고(표 1), 이들 소분획으로부터 활성 성분의 분리를 시도하여 화합물 1∼7을 분리하였다(도식 2).

도식 2

각종 이화학 및 분광학적 (MS, UV, IR, ¹H- 및 ¹³C-NMR) 데이타를 이용하여 분리한 화합물들의 구조를 하기와 같이 규명하였다.

2. 화합물의 구조규명(도 1 참조)

(1) 화합물 1

소분획 Fr. 2로부터 생성된 조결정을 여과한 후 이를 다시 MeOH로 재결정하여 미황색의 화합물 1 (794 mg)을 얻었다.

연노란색 분말

C₂₁H₂₂O₁₁

R_f : 0.42 (MeOH : H₂O = 1 : 1)

IR (KBr) _max (cm^-1): 3430 (OH), 1635와 1357 (방향족 환), 1188과1074 (C-O)

양성 FAB MS m/z : 451 [M+H]⁺, 450 [M]⁺, 289 [M+H-162]⁺

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : δ 12.05 (1H, s, 5-OH), 9.07 (2H, brs , H-3, 4), 6.88 (1H, s, H-2), 6.75 (2H, s, H-5, 6), 6.14 (1H, s, H-8), 6.13 (1H, s, H-6) 5.44 (1H, dd, J = 3.0, 12.2 Hz, H-2), 4.96 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-1), 3.68-3.20 (5H, m, H-2, 3, 4, 5, 3_ax), 2.73 (1H, d, J = 3.0, 17.2 Hz, H-3_eq) ppm

¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) : δ 197.2 (C-4), 165.3 (C-7), 162.9 (C-9), 162.7 (C-5), 145.8 (C-4), 145.2 (C-3), 129.2 (C-1), 118.1 (C-6), 115.4 (C-5), 114.4 (C-2), 103.3 (C-10), 99.6 (C-1), 96.4 (C-8), 95.4 (C-6), 78.7 (C-2), 77.1 (C-3), 76.3 (C-5), 73.0 (C-2), 69.5 (C-4), 60.6 (C-6), 42.2 (C-3) ppm

(2) 화합물 2

소분획 Fr. 2로부터 생성된 조결정을 여과한 후 남은 여액을 MeOH : H₂O = 1 : 1혼합용매로 Sephadex LH-20 c.c.를 시행하여 정제한 다음 이를 MeOH로 재결정하여 백색의 화합물 2 (70 mg)를 얻었다.

흰색 무정형 결정

C₁₅H₁₆O₉

R_f : 0.57 (MeOH : H₂O = 1 : 1)

IR (KBr) _max (cm^-1): 3434 (OH), 1663 (C=O), 1620와 1444 (방향족 환), 1181과 1087 (C-O)

양성 FAB MS m/z : 341 [M+H]⁺, 179 [M+H-162]⁺

¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD) : δ 8.04 (1H, d, J = 5.9 Hz, H-2), 6.69 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-6), 6.50 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.25 (1H, d , J = 5.9 Hz, H-3), 5.03 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1), 3.90 (1H, dd, J = 2.2, 12.2 Hz, H-6 _a), 3.69 (1H, dd, J = 5.6, 12.2 Hz, H-6_b), 3.51-3.31 (4H, m, H-2, 3, 4, 5) ppm

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) : δ 181.6 (C-4), 163.1 (C-7), 161.2 (C-5), 158.1 (C-9), 157.5 (C-2), 110.8 (C-3), 106.5 (C-10), 99.8 (C-1), 99.6 (C-6), 94.8 (C-8), 77.2 (C-5), 76.4 (C-3), 73.0 (C-2), 69.5 (C-4), 60.6 (C-6) ppm

(3) 화합물 3

소분획 Fr. 3을 MeOH로 Sephadex LH-20 c.c.를 시행하여 얻은 조결정을 MeOH로 재결정하여 화합물 3 (10 mg)을 얻었다.

연노란색 분말

C₂₁H₂₂O₁₀

R_f : 0.52 (MeOH : H₂O = 1 : 1)

IR (KBr) _max (cm^-1): 3427 (OH), 1637 (C=O), 1452 (방향족 환), 1173과 1082 (C-O)

양성 FAB MS m/z : 457 [M+Na]⁺, 435 [M+H]⁺, 273 [M+H-162]⁺

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : δ 12.05 (1H, s, 5-OH), 9.59 (1H, s , H-4), 7.32 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2, 6), 6.78 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3, 5), 6.14 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.12 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-6), 5.49 (1H, dd , J = 2.9, 12.8 Hz, H-2), 4.95 (1H, d, J = 7.1 Hz, H-1), 3.68-3.20 (5H, m, H-2, 3, 4, 5, 3_ax), 2.69 (1H, dd, J = 2.9, 17.0 Hz, H-3_eq) ppm

¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) : δ 197.2 (C-4), 165.3 (C-7), 162.9 (C-9), 162.7 (C-5), 157.8 (C-4), 128.6 (C-1), 128.4 (C-2,6), 115.1 (C-3, 5), 103.2 (C-10), 99.6 (C-1), 96.4 (C-8), 95.4 (C-6), 78.7 (C-2), 77.1 (C-3), 76.3 (C-5), 73.0 (C-2), 69.5 (C-4), 60.6 (C-6), 45.2 (C-3) ppm

(4) 화합물 4

소분획 Fr. 4를 H₂O와 MeOH의 혼합용매를 사용하여ODS RP c.c.를 실시하여 다시 6개의 소분획 (Fr. 4-1 ~ Fr. 4-6)으로 나누었다. 이 중 Fr. 4-2를 MeOH로 Sephadex LH-20 c.c.를 시행하여 6개의 소분획 (Fr. 4-2-1 ~ Fr. 4-2-6)을 얻었으며, 이 중 5번 소분획 (Fr. 4-2-5)을 MeOH로 재결정하여 미황색의 화합물 4 (100 mg)를 얻었다.

연노란색 분말

C₁₅H₁₂O₆

R_f : 0.54 (MeOH : H₂O = 1 : 1)

IR (KBr) _max (cm^-1): 3377 (OH), 1606와 1454 (방향족 환), 1162와 1083 (C-O)

EIMS m/z (rel. int.) : 288 [M]⁺ (81), 287 (32), 241 (8), 166 (31), 153 (80), 121 (100), 71 (27), 57 (37)

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : δ 12.13 (1H, s, 5-OH), 10.76 (1H, s, 7-OH), 9.06 (1H, s, H-4), 9.00 (1H, s, H-3), 6.86 (1H, s, H-2), 6.73 (2H, s, H-5, 6), 5.86 (2H, s, H-6, 8), 5.37 (1H, dd, J = 3.0, 12.5 Hz, H-2), 3.18 (1H, dd, J = 12.5, 17.2 Hz, H-3_ax), 2.66 (1H, dd, J = 3.0, 17.2 Hz, H-3_eq) ppm

¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) : δ 196.4 (C-4), 166.6 (C-7), 163.5 (C-5), 162.9 (C-9), 145.7 (C-4), 145.2 (C-3), 129.4 (C-1), 117.9 (C-6), 115.4 (C-5), 114.3 (C-2), 101.8 (C-10), 95.7 (C-8), 94.9 (C-6), 78.5 (C-2), 42.0 (C-3) ppm

(5) 화합물 5의 분리

화합물 4의 분리과정 중 소분획 Fr. 4-2-4을 MeOH로 재결정하여 황색의 화합물 5 (278 mg)를 얻었다.

노란색 분말

C₂₁H₂₀O₁₁

R_f : 0.58 (MeOH : H₂O = 3 : 2)

IR (KBr) _max (cm^-1): 3300 (OH), 1650 (C=O), 1600 (방향족 환)

양성 FAB MS m/z : 449 [M+H]⁺, 303 [M-146]⁺

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : δ 12.64 (1H, s, 5-OH), 10.87 (1H, s, 7-OH), 9.70 (1H, s, 4-OH), 9.34 (1H, s, 3-OH), 7.29 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2), 7.24 (1H, dd, J = 2.1, 8.3 Hz, H-6), 6.85 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-5), 6.38 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.24 (1H, d , J = 1.2, H-1), 4.93-3.95 (4H, m, H-2, 3, 4, 5), 0.80 (3H, d, J = 5.6 Hz, H-6) ppm

¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) : δ 178.2 (C-4), 164.6 (C-7), 161.7 (C-5), 157.7 (C-9), 156.9 (C-2), 148.9 (C-4), 145.6 (C-3), 134.6 (C-3), 121.5 (C-6), 121.2 (C-1), 115.9 (C-5), 104.5 (C-2), 102.3 (C-1), 99.1 (C-6), 94.0 (C-8), 71.6 (C-4), 71.0 (C-3), 70.8 (C-2), 70.5 (C-5), 18.0 (C-6) ppm

(6) 화합물 6의 분리

화합물 4의 분리 과정에서 얻은 소분획 Fr. 4-4를 MeOH로 Sephadex LH-20 c.c.를 시행하여 9개의 소분획 (Fr. 4-4-1 ~ Fr. 4-4-9)으로 나누고, 소분획 Fr. 4-4-3을 실리카겔 c.c. (CHCl₃: MeOH = 50 : 1 MeOH)를 시행하여 5개의 소분획을 얻었다. 이 중 3번 소분획(Fr. 4-4-3-3)을 ODS RP 컬럼을 이용하여 H₂O : MeOH = 50 : 50의 용매조건에서 2 ml/min의 유속으로 HPLC를 실시하여 t_R 28.27 분에서 유출되는 화합물 6 (106 mg)을 얻었다 (도 1).

연노란색 분말

C₂₁H₂₄O₈

R_f : 0.30 (MeOH : H₂O = 3 : 2)

IR (KBr) _max (cm^-1): 3429 (OH), 1600와 1455 (방향족 환), 1170과 1073 (C-O)

양성 FAB MS (m/z) : 527 [M+Na]⁺, 404 [M]⁺, 242 [M-162]⁺

¹H-NMR (CD₃OD, 500MHz) : 표 1 및 도 2 참조

¹³C-NMR (CD₃OD, 125MHz) : 표 1 및 도 2 참조

화합물 6의 HMBC 스펙트럼은 도 3에 나타내었고, FAB MS 스펙트럼은 도 6에 나타내었다.

(9) 화합물 7의 분리

화합물 6의 분리과정 중 소분획 Fr. 4-4-3-5를 페닐-헥실 RP 컬럼을 이용하여 H₂O : AcCN : MeOH = 50:5:45의 용매조건에서 2ml/min의 유속으로 HPLC를 실시하여 t_R16.04 분에서 유출되는 화합물 7 (123 mg)을 얻었다 (도 1). 하기 표 1은 화합물 6 및 7의 ¹H 및 ¹³C-NMR 케미칼 쉬프트(CD₃OD)를 나타낸다.

연노란색 분말

C₂₆H₃₂O₁₂

R_f : 0.64 (MeOH : H₂O = 3 : 2)

IR (KBr) _max (cm^-1): 3429 (OH), 1600와 1456 (방향족 환), 1168과 1060 (C-O)

양성 FAB MS (m/z) : 566 [M+K]⁺, 559 [M+Na]⁺, 536 [M]⁺, 405 [M+H-132] ⁺, 242 [M-132-162]⁺

¹H-NMR (CD₃OD, 500MHz) : 표 1 및 도 4 참조

¹³C-NMR (CD₃OD, 125MHz) : 표 1 및 도 4 참조

화합물 7의 HMBC 스펙트럼은 도 5에 나타내었고, FAB MS 스펙트럼은 도 6에 나타내었다.

상기 데이타를 근거로, 화합물 1 ~ 5를 각각 에리오딕티올-7-O-β-D-글루코피라노사이드 (1), 5,7-디히드록시크로몬 7-O-β-D-글루코피라노사이드 (2), 나링게닌 7-O-β-D- 글루코피라노사이드 (3), 에리오딕티올 (4), 쿼시트린 (5)으로 동정하였고, 화합물 6을 5-메톡시-(E)-레스베라트롤 3-O-β-D-에이피오푸라노실-(1→6)-D-글루코피라노사이드로, 화합물 7을 5-메톡시-(E)-레스베라트롤 3-O-β-D-글루코피라노사이드로 결정하였다. 이 중 화합물 6 및 7은 천연에서 처음으로 분리 보고되는 물질이다.

실험예 1. 고로쇠 잎 추출물 및 화합물 1 내지 7 화합물의 간세포 보호활성의 측정

실험동물

흰쥐 (Wistar, male, 150-200g)는 서울대학교 실험동물 사육장으로부터 공급받은 것을 온도 22 ± 1℃, 습도 60 ± 5%로 유지되며 12시간 간격으로 명암을 바꿔주는 실험동물 사육실에서 사료와 물을 마음껏 섭취하도록 하였다. 간세포는 실험 하루 전부터 굶겨 공복 상태인 흰쥐에서부터 직접 채취하였다.

흰쥐의 간세포 배양

흰쥐의 간세포는 Berry와 Friend의 방법 (1984)을 수정한 2단계 콜라게네이즈 관류법을 이용하여 분리하였다 (Kleiman and Hartin, 1979; Seglan, 1993). 간세포를 얻기 위하여 흰쥐를 우레탄(1g/kg body weight)으로 마취시키고 70% 에탄올로 복부를 소독한 후 개복하였다. 간문맥에 21 게이지 카테터를 삽관(canulation)하고 신정맥 아래에서 하대정맥을 자른 후, 0.2mM EDTA의 HBSS 용액 50 ml를 30 ml/min의 속도로 관류시켜 간 조직내의 혈액을 제거하였다. 흰쥐의 흉강을 열어 상 대정맥에 18 게이지 카테터를 삽관한 다음 하대정맥을 묶어 소화용액이 상대정맥을 통하여 공급용기로 되돌아오는 재순환이 이루어지도록 하였다. CO₂와 O₂혼합기체를 공급해주면서 0.05% 콜라게네이즈(type IV)를 함유한 HBSS로 구성된 소화용액으로 10-15 분간 재순환을 시켜 간세포를 조직으로부터 분리시킨 다음, 간을 떼어내어 HBSS 80 ml를 가한 후 간막을 가위로 열어서 간세포가 유리되게 한 다음 거어즈로 여과하였다. 여과액을 50 g에서 2분간 2회 원심분리한 후 얻은 펠렛을 배양액으로 같은 조건에서 원심분리하여 세포 현탁액을 얻었다. 이렇게 얻은 간세포 현탁액을 5×10⁵세포/ml 농도로 희석하여 콜라겐을 미리 도포시킨 배양 용기 (Falcon)에 이식하였다. 배양액으로는 Waymouth MB 752/1 배지, 5 % 소태아 혈청, 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민 (fraction V), 10^-6M 덱사메타손, 10^-8M 인슐린, 5.32×10^-2M L-세린, 4.09×10^-2M L-알라닌, 2.67×10^-2M NaHCO₃, 100 IU/ml 페니실린, 100 g/ml 스트렙토마이신 및 50 g/ml 겐타마이신 설페이트로 구성된 것을 사용하였다.

배양환경

분리한 흰쥐의 간세포는 일정한 습도와 온도가 유지되는 37℃ 배양기에서 O₂ (95 %)와 CO₂ (5 %)의 혼합기체를 계속 공급하면서 세포를 배양하였다.

통계 처리

통계적 유의성을 검토하기 위해 대조치로부터의 변동을 ANOVA 테스트에 의해 판정하였다. P 값이 5 % 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

CCl ₄ 에 의한 간세포 독성유도 및 시료의 투여

분리한 흰쥐의 간세포를 1.5시간 동안 배양한 후에 새로운 배양액으로 갈아주고 다시 24 시간 동안 계속하여 배양한 후 CCl₄ 투여 1 시간 전에 검색하고자 하는 시료를 각 농도별로 투여하고 6.6 mM CCl₄를 함유한 배양액으로 80분 동안 처리하여 독성을 유도하였다 (Kiso et. al., 1983).

시료의 제조

시료를 디메틸설폭사이드(DMSO, 최종 농도, 0.1 % 이하)로 용해시킨 후 오토클레이브한 증류수로 희석시키고 이를 밀리포어막(0.22m)을 사용하여 여과시켜 무균상태로 제조하였다.

실시예의 고로쇠 잎 추출물 및 분획물의 간세포 보호 활성 측정

세포 독성이 유도된 간세포의 배양액을 취하여 GPT 키트를 사용하여 Reitman - Frankel의 방법 (Am. J. Clin. Pathol. 28; 56-63 (1957))으로 실시예의 고로쇠 잎 추출물 및 분획물의 GPT 활성을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

표 2와 같이, 고로쇠나무 잎의 총 메탄올 추출물을 50 g/ml의 농도로 CCl₄로 독성을 유발시킨 일차배양 간세포에 투여한 결과 배양액 중으로 유리되는 GPT의 양을 유의성 있게 감소시켜 35.4 %의 간세포 보호 활성을 나타내었다. 또한 상기 총 메탄올 추출물의 n-헥산, CHCl₃, EtOAc, n-BuOH 또는 H₂O 분획물의 경우, 각 분획을 50 g/ml의 농도로 투여한 결과 모두 간세포 보호활성을 나타내었고, 특히 EtOAc 분획이 가장 높은 간세포 보호 활성을 나타내었다. 또한 고로쇠나무의 잎의 EtOAc 분획의 소분획 Fr. 1 ~ Fr. 6의 경우, 각각의 소분획을 50 g/ml씩 투여하여 소분획의 간세포 보호 활성을 검색한 결과 소분획 Fr. 4가 가장 높은 활성 (78.4 %)을 보였다.

(주) 유의성 : ^* p < 0.05, ^** p < 0.01, ^*** p < 0.001, 콘트롤군은 CCl₄를 처리하지 않은 군으로 GPT 값는 22.3 ±1.47 IU/L였고, 대조군은 CCl₄로 처리한 군으로 GPT 값은 40.1 ±4.8 IU/L였다. 보호율(%)은 100× 참조군의 값 - 샘플의 값) / (참조군의 값 - 콘트롤의 값)으로 계산하였다. 실리빈(50 g/ml)의 상대적 보호율(%)은 29.8 ±1.4^*** 였다.

실험예 2. 본 발명의 화합물 1 ~ 7의 간세포 보호 활성의 측정

CCl₄로 독성을 유발시킨 일차배양한 흰 쥐의 간세포에 대하여 활성분획인 소분획 Fr. 4으로부터 분리한 화합물 4 ~ 7 및 소분획 Fr. 2, Fr. 3으로부터 분리한 화합물 1 ~ 3을 1 M에서 50 M까지 농도를 증가시키면서 간세포 보호 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7과 같이, 본 발명의 화합물 1∼7은 CCl₄ 독성에 대한 우수한 간세포 보호 활성을 나타내었다. 특히 화합물 4는 1 M에서 정상 상태의 40.3 %까지 유지시킴으로써 우수한 간세포 보호 활성을 나타내었다.

이하, 본 발명의 제제 실시예를 설명한다.

제제 실시예 1

화합물 4 10mg

주사용 멸균증류수 적량

pH조절제 적량

화합물 4를 주사용 증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH 약 7.6로 조절한 다음 전체를 2ml로 한 후, 2ml용량의 앰플에 충진하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

제제 실시예 2

화합물 1 2mg

주사용 멸균증류수 적량

pH조절제 적량

화합물 6을 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH조절제로 pH 약 7.2로 조절하고 전체를 2ml로 한 다음, 2ml용량의 앰플에 충진하여 주사제를 제조하였다.

제제 실시예 3

고로쇠 잎 총 메탄올 추출물 10mg

유당 100mg

전분 100mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제 실시예 4

화합물 6 10mg

유당 100mg

전분 50mg

스테아린산 마그네슘 적량

제제 실시예 5

고로쇠 잎 추출물의 EtOAc 분획물 5mg

유당 50mg

전분 50mg

탈크 2mg

스테아린산마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조하였다.

제제 실시예 6

화합물 4 5mg

유당 100mg

전분 93mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

제제 실시예 7

화합물 7 50mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조하였다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 고로쇠 잎의 총추출물, 그의 분획물 및 그로부터 분리한 상기 일반식 (1) 및/또는 (2)의 화합물은 우수한 간세포 보호 활성을 나타내었다.

Claims

고로쇠 잎의 C_1-4 알콜 추출물을 포함하는 지방간, 간염 또는 간괴사의 예방 및 치료용 조성물.
제1항의 알콜 추출물의 n-헥산 분획물, CHCl₃분획물, EtOAc 분획물, n-BuOH 분획물 및 물 분획물을 포함하는 지방간, 간염 또는 간괴사의 예방 및 치료용 조성물.
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하기 일반식 (2)의 화합물:

(2)

상기 식에서, R₄는 수소 또는 에이피오즈이고, R₅는 수소이며, R₆는 하이드록시기이다.
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하기 일반식 (2)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 지방간, 간염 또는 간괴사의 예방 및 치료용 조성물:

(2)

상기 식에서, R₄는 수소 또는 에이피오즈이고, R₅는 수소이며, R₆는 하이드록시기이다.
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