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KR900008442B1 - 가용성의 포스포릴화한 글루칸(glucan) - Google Patents

가용성의 포스포릴화한 글루칸(glucan) Download PDF

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KR900008442B1
KR900008442B1 KR1019870700332A KR870700332A KR900008442B1 KR 900008442 B1 KR900008442 B1 KR 900008442B1 KR 1019870700332 A KR1019870700332 A KR 1019870700332A KR 870700332 A KR870700332 A KR 870700332A KR 900008442 B1 KR900008442 B1 KR 900008442B1
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KR
South Korea
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glucan
soluble
soluble phosphorylated
particle
mixture
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KR1019870700332A
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Inventor
알. 다루지오 니콜라스
Original Assignee
더 어드미니스트레이터즈 오브 더 튜래인 에듀 케이셔널 훤드
죤 제이. 월쉬
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Publication date
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Publication of KR870700355A publication Critical patent/KR870700355A/ko
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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
가용성의 포스포릴화한 글루칸(glucan)
[도면의 간단한 설명]
제1도는 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 27㎎/㎖에서의 핵자기공명 스펙트럼.
제2도는 렌티난(lentinan)(Ajinomoto co.Inc., Tokyo,Japan)의 시판제품의 NMR 스펙트럼.
제2a도는 40㎎/㎖의 농도로 수득된 스펙트럼.
제2b도는 3㎎/㎖의 농도로 수득된 렌티난의 스펙트럼 설명.
제3도는 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 주 2회 주사하여 받는 코르티코스테로이드-면역억제된 쥐의 생존 효과를 설명하는 그래프.
제3도는 또한 정상 쥐의 생존에 대한 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 만성적 투여의 효과를 설명한다.
제4도는 정상쥐와 코르티모스테로이드-면역억제된 쥐의 대장균 감염에 대한 내성에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸의 전 생체내 투여의 효과를 설명하는 그래프.
제5도는 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 전처리의 효과와 그 다음의 실험적으로 유발된 황색포도상구균감염의 치사효과를 나타내는 그래프.
제6도는 쥐의 생존성에 대한 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 전처리하고 그 다음의 실험적으로 유발된 비투스성 헤파티티스의 효과를 나타내는 그래프.
제7도는 실험적으로 유발된 아구창 칸디딘 감염된 쥐의 생존에 대한 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 전경구투여의 효과를 설명하는 그래프.
제8도는 인터루이킨(Interleukin) Ⅰ생성에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸의 영향을 나타내는 그래프.
제9도는 38,500과 84,000달톤의 분자량을 가진 두개의 주요부분으로 구성된 가용성의 포스포릴화한 글루칸-활성화된 대식세포 배양물로부터 수득된 종양세포 세포독성/세포증식억제성의 인자를 나타내는 차트.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 새로운 류의 가용성 글루칸(glucan), 보다 특별히는 폴리-[β-(1-3)글루코피라노스]체인이 여러 정도로 포스포릴화된 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 물론 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)와 코리오루스 베르시칼라(Coriolus versicolor)와 같은 각종 미생물로부터 이러한 새로운 가용성의 포스포릴화된 글루칸을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 새로운 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 비-독성, 비-면역성의, 실제의 비-발열성이며, 또한 동물과 인체의 생체에 투여되면 현저한 면역생물학적 응답을 나타내며, 그의 가장 괄목할 활성도는 대식세포 활성도의 면역자극이 되어서 다른 면역성 세포의 활성화를 유발한다. 또한, 이러한 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 생체내에서 선암과 욕종은 물론 인공조건에서 임파구 백혈병 세포에 대항하여 세포증식 억제성의 효과를 나타낸다.
용어 "글루칸"은 셀룰로오스, 아밀로오스, 글리코겐, 라미나리안, 전분 등과 같은 고분자를 포함하는 각종 천연발생의 단일 다당류나 다포도당류를 의미한다. 글루칸은 알파나 베타형의 1-3, 1-4 및 1-6 글루코시드 결합으로 결합되고 측쇄되거나 측쇄되지 않은 글루코오스 단위체(units)를 포함한다.
여기서 정의된 것같이, "입자 글루칸(particulate glucan)"은 맥주효모균 효모의 세포벽에서 유발되는 것 같은 수-불용성의 입자(particulate)(약 1-3μ)의 다포도당류를 지칭한다. 입자 글루칸은 고분자-(macromolecular-)이미 일련의 β-1-3 글루코시드 결합으로 결합된 폐쇄(閉鎖)(closed linked)의 글루코피라노오스 단위체를 포함한다(Hassid et al., 1941, J.Amer.Chem.Soc.63 : 295-298; Di Luzio et al., 1971, Int'l J.Cancer 24 : 773-779). X-선 회절연구에 의해서 입자 글루칸이 3중-사의 헬리즈(helice)의 형태로 존재하는 것으로 나타났다(Sarko et al., 1983, Biochem.Soc.Trans.11:139-142).
[2.1 입자 글루칸의 면역생물학적 활성도]
입자 글루칸은 대식세포/단핵세포 계열, 보체는 물론 B 세포 임파구의 유력한 활성제이다. 이와 같이, 입자 글루칸은 세망내피(reticuloendothelial)와 면역계의 양자에 충분한 효과를 가진다.
상기한 연구에서 나타나는 것은 입자 글루칸을 여러가지의 시험동물에 생체내 투여하면 충분한 면역생물학적 응답을 유발한다는 것을 나타내는데, 이 응답에는 다음이 포함된다. (1) 단핵세포와 대식세포의 증식의 증대(Deimann and Fahimi,1979,J.Exper.Med.149:883-897; Ashworth et al., 1963,Exper.Molec.Pathol.,Supp.1:83-103); (2) 대식세포의 식세포 기능증대(Riggi and Di Luzio,1961,Am,J.Physiol.200:297-300); (3) 대식세포의 분비기능증대(Barlin et al.,1981,in Heterogeneity of Mononuclear Phagocytes,Forster and Landy,ods.,Academic Press,New York,pp.243-252); (4)대식세포의 크기의 증가(Patchen and Lotzova,1980,Exper.Hematol.8:409-422); (5) 대식세포의 접착력과 케모텍틱(chemotactic)활성의 증대(Niskanen et al.,1978,Cancer Res.38:1406-1409); 그리고 (6) 보체활성의 증대(Glovsky et al.,1983,J.Reticuloendothel.Soc.33:401-413). 종양세포에 대한 세포용해도의 증가가 생체내(Mansell and Di Luzio,1976,in "The Macrophage in Neoplasia" Fink, ed.,Academic Press,New York,pp.227-243)와 인공조건하(Chirigos et a.,1978,Cancer Res.38:1085-1091).에서 연구에서 입자 글루칸으로 처리한 동물과 인체로부터 취한 대식세포내에서 나타났다.
입자 글루칸을 생체내 투여하여 세망네피계를 자극하면 치사의 방산된 동물에서 동종이나 이종의 골수이식의 수용을 억제케한다. (예는 Weoles and Di Luzio,1964,Proc.Soc.Exper,Biol.Med.115:76-759)참조. 이 발견으로 글루칸이 정상세포가 숙주와 유전상 상이한 경우에도 심지어 정상세포에 대해서도 숙주방에 메카니즘을 유발할 것이라는 것을 의미한다.
세망내피와 면역응답에 효과이외에도, 입자 글루칸의 생체내 투여로 과립세포형성, 단일세포형성 및 적색세포형성을 포함하는 조혈기능을 증대시켜 전체 몸체방산이 치사투여량으로부터 크게 회수시키는 것으로 나타났다(Patchem,1983,Surv.Immunol.Res.2:237-242).
많은 연구에 의해서 나타난 것은 입자 글루칸을 생체내 투여하면 박테리아, 진균의, 비루스의 그리고 기생충의 유기체에 의해서 유발된 각종 감염성 질병에 대한 숙주내성을 현저히 변화시킨다는 것이다. 특별히, 감염에 대한 숙주내성의 증가는 동물이 대장균, 황색포도상구균, 야토병균(野兎病菌), 나균, 연쇄구균폐염, 아구창 칸디나, 스포로트리코시스의 병원균은 물론 베네수엘라 마뇌척수의 뇌척수염 비루스, 립트 계곡열 비루스, 쥐의 간염비루스, 개구리 비루스 Ⅲ, 단순 헤르페스 Ⅰ 및 Ⅱ, 그리고 도노반 레이슈마니아와 같은 기생충과 같은 미생물에 의해 공격을 받았을때 나타났었다(Review by Di Luzio,1983,Trends in Pharmacol.Sci,4:344-347 and references cited therein).
광범위한 연구에 의해서 입자 글루칸이 유력한 항-종양 활성을 가지는 것을 나타낸다. 예를 들면, 입자 글루칸은 선암 BW 10232, 미분화암 15091A, 흑색종 B16 및 자연성 임파구 백혈병 BW 5147을 포함하는 네개의 선천성의 쥐의 종양 모형에서 종양 생장을 억제하고 생존을 연장시키는 것으로 나타났다(Di Luzio et al, 1979, in Advances in Experimental Medicine and Biology,Vol.121A:269-290).
입자 글루칸의 항-종양 활성도의 세포기준을 평가하기 위하여, 기준쥐와 입자 글루칸으로 처리한 쥐에서 유도된 복막대식세포의 항-종양 세포독성도를 연구하였다(Mansell and Di Luzio, 1976, in The Machrophage in Neoplasia, Fink, ed. Academic Press,New York,pp.227-243). 이러한 연구에서 글루칸 처리한 쥐의 복막 대식세포가 정상 대식세포에 비하여 중대한 세포독성응답을 나타낸 것으로 되어 있다. 이 관찰은 확인되었다(예로서 Barlin et al.1981, in Heterogenity of Mononuclear Phagocytes, forster and Landy, eds., Academic Press, New York, pp.243-252)and Chirigos et al., 1978, Cancer Res.38:1085-1091).
또한 입자 글루칸으로 배양시킨 정상세포와 종양세포의 시험과 연구에서는 글루칸이 육종세포와 흑색종세포에 대해서는 직접적인 세포증식억제효과를 그리고 정상적인 비장세포와 골수세포에 대해서는 증식효과를 내는 것으로 나타났다(Williams et al., 1985, Hepatology, 5 : 198-206). 이러한 연구에서 글루칸은 치료학적으로 투여되면 (1)간의 전이를 현저하게 억제하고; (2) 원발종양의 생장을 억제하고; (3) 성세포(星細胞)루모르시딘 활성도의 증가는 물론 육종세포에 대한 이러한 글루칸의 직접적인 세포증식억제효과에 의해서 가능하면 생존을 연장시키는 것을 나타낸다.
이러한 생물학적 성질에도 불구하고, 입자 글루칸의 유해부작용으로 이러한 모든 화합물을 일상의학이외에는 소용이 없게 만든다.
[2.2. 입자 글루칸의 유해부작용]
입자 글루칸을 동물에 생체내투여할 때, 많은 심각한 부작용이 명백해지며, 그중 가장 주목할 것은:
(1) 육아종(사르코이도시스)의 형성
(2) 간비종의 발육
(3) 그램음성감염과 내독소의 이환성 증가
(4) 보체(아나필라톡신)의 활성화
(5) 폐성의 육아종맥관염의 발육
(6) 정맥투여후의 저혈압증의 증상
(7) 고농도로 투여했을 때의 미소색전증증상
또한, 입자 글루칸을 생체내에 투여했을 때에 관찰되는 급성독성이 비교적 높은 정도로 나타난다. 이를테면, 입자 글루칸의 수현탁액을 일회 정맥주사한 후에 몸무게 ㎏당 250 및 500㎎의 글루칸을 맞은 쥐는 각각 20%와 100%의 모라리티(morality)가 관찰되었다.
더우기 글루칸 제품(1-3μ)의 입자성질 때문에 정맥을 통한 투여는 곤란하다. 설명하기 위한 방법으로, 입자 글루칸을 투여받는 환자에게는 정맥(Ⅳ)투여하는 동안 계속적인 감시가 필요하며, 적주병을 연속적으로 흔들어서 입자 글루칸을 현탁액으로 유지시키는 것이 환자의 포배(胞胚)의 형성을 방지하기 위하여 필수적이 된다.
약간 녹는 중성 글루칸이 시판되기는 하지만, 이 제품을 정맥투여하기에는 부적합한데 그 이유는 이 수용액의 점성도가 높고, 더욱 중요한 것은 시험동물에 투여했을 때 이의 사용으로 상당한 독성이 따르는 것이 불가피하기 때문이다.
렌티누스 에도데스(Lentinus edodes)에서 수득되는 고분자량이며 수용성이 낮은 β-1,3 및 β-1,6 글루탄인 렌티난(Lentinan)을 개에 정맥투여한 후 연구하였다. 렌티난(Ajinomoto Co. Inc., Tokyo, Japan)을 2.0,8.0 및 30㎎/㎏ 일의 투여량으로 5일간 투여한 후에 여러가지 유해한 임상효과가 관찰되었다. 유해효과중에는 강막(sclera)의 구토, 홍반, 퇴색 및 안면의 팽윤이 포함되었다. 또한 순환계의 허탈, 비정상적 보행, 변화된 습관형태, 수액분비의 과다가 각 사냥개에서 보였다. 부검에서, 위장 점막의 출혈이 2.0 또는 8.0㎎/㎏/일로 처리한 동물에서 발견되었다. 간의 형태학적 변화가 간세포에 축적된 렌티난인, 세포질내 봉입체를 나타내었다. 한 동물에서는 8.0㎎/㎏로 처음 주사했을 때 순환계 허탈을 나타내었다. 그가 회복되었을 때, 이 동물은 피가 있는 구토증세를 반복하여 위장관의 출혈을 나타내었다. 다른 동물은 안면의 홍반과 피하 알레르기 반응을 나타내어서 뚜렷한 알레르기반응을 나타내었다. 부검결과 피하조직의 심한 부종과 출혈된 위장과의 응혈을 나타내었다. 대식세포는 아마도 렌티난인, 물질의 축적을 나타내었다(Chesterman et al., 1981, Toxicol. Lett. 9 : 87-90).
또한 독성연구를 실시한 바, 여기서는 0.1 내지 1.0㎎/㎏/일로 렌티난의 투여량을 변화시키면서 쥐에 9주일간 정맥투여하였다. 피부병변증상과 혈전증으로 추정되는 쥐의 변색으로 보아 독성이 명백하였다(Cozens et al., 1981, Toxicol. Lett, 9 : 55-64).
[2.3. 입자 글루칸의 용해하는 시도의 실패]
생체내 투여를 위한 입자 β-1,3 글루칸의 이러한 결함의 견지에서, 독성이 없으며, 중요한 병변을 유발하지 않으면서도 한편으로 중요한 면역생리학적 활성도를 유지하는, 가용성의 β-1,3 폴리글루칸을 개발하려는 광범위한 연구를 수행하였다.
입자 글루칸의 개미산 가수분해에 의해서 제조된 저분자량의 비-포스포릴화한 가용성 글루칸 제품은 항-종양 및 항-포도상구균성 활성도를 가지는 것으로 나타났다(Di Luzio et al., 1979, Internat'l J.Cancer 24:773-779). 불행히도, 이 방법으로 수득되는 부분의 저수율과 다양성 때문에 이 제품을 예방용도와 치료용도에 부적합하게 하였다(Di Luzio,1983,Trands in Pharmacological Sciences 4 : 344-347).
유사하게, "분자 이완제"인 디메틸설폭시드(DMSO)를 첨가하여 입자 글루칸을 가용화 하려는 시도도 또한 실패하였다. 이것은 DMSO가 글루칸 분자의 트리폴 헬릭스구조를 이완시키는 것으로 생각되었다. 실제로, 입자 글루칸은 DMSO의 존재하에 용해한다. 그러나 DMSO 용액으로부터 가용성 글루칸을 단리하려는 모든 시도는 실패로 돌아갔다. DMSO-글루칸 용액을 포도당이나 식염수와 같은 여러가지 수용성 매체로서 희석시키면, 입자 글루칸이 제형성된다. DMSO-가용성 글루칸용액을 식염수로 희석시키면, 이러한 용액을 주사한 모든 동물은 주사즉시 DMSO의 고농도나 입자 글루칸의 재형성에 의해서 죽었다. 에탄올(100%)을 첨가하여 DMSO 용액에 글루칸을 침전시킨 즉시, 침전을 수거하여 동결건조하였다. 이렇게 동결건조한 글루칸을 물에 첨가하면, 입자 글루칸이 재형성되었다.
입자 글루칸의 중성의 글루칸 제품에 인산염이나 황산염 그룹을 첨가함은 물론 아세틸화하여 극성으로 하전된 제품으로 전환시키고저 하는 시도도 또한 실패하였다. 이러한 각 과정은 DMSO로 입자 글루칸을 가용화하여 실시하였으며 각 예에서 입자 글루칸이 재형성되었다.
[3. 본 발명의 요약]
각 사슬(chain)이 반응할 수 있을 정도로 글루칸의 트리폴-사상체 헬릭스를 충분히 이완시키는 방법의 철저한 연구에서 발견된 것은 입자 글루칸이 강력한 혼란추성제(混亂趨性劑)(chaotropic agent)(요소와 같은)의 존재하에 강한 극성용매(DMSO와 같은)에 용해되었으며, 글루칸의 구조가 각 단일사슬(사상체)가 포스포릴화가 가능할 정도로 충분히 파괴되어 수득되는 포스포릴화한 글루칸이 입자 글루칸의 특징적인 트리폴 헬릭스구조가 실질적으로 완전히 없어진 것을 나타내었다는 것이다. 생성된 포스포릴화한 글루칸을 제거하면 이것은 물에 녹으며, 독성이 없고, 비-임뮤노겐이고, 실질적으로 비-발열성이고, 동물과 인체의 생체내에 투여했을 때 강한 면역 생물학적 응답을 낼 수 있음이 발견되었다.
이 발견을 근거로 하여, 본 발명은 (a) 폴리-[β-(1-3) 글루코피라오스]사슬이 여러정도로 포스포릴화하며; (b) 비-독성의, 비-임뮤노겐의, 실질적으로 비-발열성의, 그리고 (c) 동물과 인체의 생체내에 투여했을 때 강한 면역생물학적 응답을 나타낼 수 있는, 새로운 류의 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 제공한다. 이러한 새로운 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 입자 글루칸의 트리플 헬릭스 구조가 실질적으로 없는 것으로 특징이 되고, 대식세포의 활성도를 면역자극시켜서 세망내피와 면역계속에 있는 다른 면역성 세포를 활성화 시킨다. 또한 이러한 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 백혈구 형성을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 조혈기능을 증대한다. 이러한 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 생체내의 선암과 육종에 대해서 그리고 시험관내에서 임파종 백혈병세포에 대해서 세포증식 억제효과를 나타낸다. 이러한 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 생체내의 대식세포를 자극할 뿐만 아니라 시험관에서 배양된 대식세포에 대해서도 강한 자극효과를 나타낸다. 대식세포의 이러한 면역자극은 불가피하게 대식세포 세포독성/세포증식억제인자(MCT)인, 암세포, 특히 선암세포에 대해 선택적으로 독성이 있는 미지구조의 단백질이나 단백질들의 생성이 수반된다.
또한, 본 발명은 강한 혼란추성제를 포함하는 강한 극성용매에 입자 글루칸(다른 미세생물을 사용할 수 있지만 바람직하게는 맥주 효모균에서 제조한)을 용해시키고, 수득된 글루칸을 인산과 반응시켜 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 생성시키고 다음에 이 반응 혼합물로 부터 생성된 포스포릴화한 글루칸을 회수함으로서, 이러한 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 제조하는 방법을 제공한다.
더우기, 본 발명은 가용성의 포스포릴화한 글루칸이나 동물이나 인체에 병리학적으로 허용되는 담체와 결합된 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 포함하는 제약조성물을 투여하여 박테리아, 진균, 비루스 및 기생충으로 유발된 감염을 치료학적 및 예방학적으로 치료하는 방법을 제공한다. 더우기, 하나의 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 전술한 감염에 대해 생체활성제의 효과가 있게 결합된 것의 유효량으로 이러한 제제에 의해 유발된 감염을 치료학적으로 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 가용성의 포스포릴화한 글루칸 단독이나 항-암제와 결합된 상태로 치료학적으로 유효한 양을 동물이나 인체에 투여하여 동물과 인체의 악성 종양성 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 동물이나 인체에 가용성 포스포릴화한 글루칸과 항-암제의 결합물의 유효량을 투여하여, 항-암제의 투여로 유발된 로이코페니아(leukopenia)를 방지하는 방법을 제공한다.
더우기, 본 발명은 동물과 인체의 대식세포(생체내에서나 시험관에서)를 자극하여 가용성 세포독성/세포증식억제인자(MCT)를 생성시키고 이렇게 생성된 생성물을 분비시키는 방법을 제공한다. 특별히, MCT는 동물이나 인체에 가용성 포스포릴화한 글루칸을 투여하거나 시험관에서 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 포함하는 배양배지에서 동물이나 인체의 대식세포를 배양하여 생성시킨다.
본 발명의 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 면역생물학적 성질은 (1) 압도적인 그램음성의 박테리아 감염에 기인하는 사망율의 방지능력; (2) 그램양성의 박테리아 감염에 기인하는 사망율의 방지능력; (3) 강하게 면역-억제된 동물과 인체에서의 자연감염으로부터 사망율을 변경시키는 능력; (4) 그램음성의 박테리아 감염에 대한 면역억제된 동물과 인체의 증가된 이환율을 변경시키는 능력; (5) 비루스성 감염을 현저하게 변경시키는 능력; (6) 진균 및 기타 기생충 미생물로 유발된 자연감염을 변경시키는 능력; (7) 단독사용시의 원발종양 생장을 현저히 억제하고 항-암제와 동시 사용시의 원발종양생장에 대한 공력(共力)효과를 나타내는 능력; (8) 동물과 사람의 원발악성 병변은 물론 전이성 병변의 퇴행에서 항암제와 공력작용을 하는 능력이 포함된다.
이러한 독특한 성질 때문에, 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 박테리아, 비루스, 진균 및 기생충으로 유발된 각종 질병은 물론 많은 종양성 조건에 대해 예방적 및 치료학적으로 특별히 유용하다. 이 가용성의 포스포릴화한 글루칸 조성물은 단독으로나 또는 생체활성이나 약리학 제제 및 치료학적 사용법(modalities)와 공동으로 병리학적으로 적합한 제약담체와 함께 유익하게 사용할 수 있다.
[5. 발명의 상세한 설명]
[5.1. 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 제조방법]
수용성의 포스포릴화한 글루칸은 앞에서 기술한 어떤 다른 글루칸과는 상이한 독특한 류의 제품을 얻는 방법으로 제조한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따라서, 아래와 같이 수용성의 포스포릴화한 글루칸을 제조한다 : 맥주효모균으로부터 유도된 중성의 다포도당류인 입자 글루칸을 디메틸설폭시드(DMSO)와 같은 중성용매에 강한 혼란추성제를 용액에 계속 저으면서 현탁시킨다. 강한 혼란추성제는 다포도당류의 수소결합을 "이완"시켜서, 분자를 펼쳐준다. 수소결합의 재형성을 방지하기 위하여 요소와 같은 강한 혼란추성제를 약 4-12M의 매우 높은 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 그리고 이 혼합물을 가열하고 약 50-150℃로 유지한 후 계속 저으면서 인산을 서서히 첨가한다. 수용성 포스포릴화한 글루칸 생성물을 포함하는 침전물이 약 1시간 후에 나타난다. 생체활성의 생성물의 수율을 증가시키기 위하여 이 반응 혼합물을 약 100℃에서 약 3-12시간 유지하는 것이 바람직하다. 실제로는, 약 100℃에서 약 6시간 동안 반응시킨 후에 수율은 대략 70-90%가 된다. 수용성 생성물의 포스포릴화 정도는 반응시간에 따라 약간 변한다(예로, 3시간에서는 1.48%, 6시간에서는 2.23%).
생체활성의 수용성 포스포릴화한 글루칸 생성물은 아래와 같이 반응혼합물로부터 단리한다 : 포스포릴화 반응을 정지시키기 위해 이 혼합물을 냉각하고 침전물을 재현탁하기에 충분한 양의 증류수로 희석시킨다. 수득되는 용액을 굵게, 중간의, 미세하게 탕화된 깔대기를 통해 여과하여 어떤 잔유 침전물을 제거한다. 그리고, 이 용액을 분자체로 걸러서 분자량(MW)이 약 10,000달톤이하의 모든 성분을 제거한다. 이와 같이 DMSO, 요소, 포도당 및 어떤 미반응 인산이 용액에서 제거된다. 분자체의 걸름은 이러한 저분자량(예로 10,000달톤이하)의 성분을 제거하는 어떤 방법으로도 실시할 수 있다. 하나의 설명예에서, 이 용액을 스펙트랩포(Spectrapor)막 분리 튜브를 사용하고 통과하는 증류수에 대해 약 5일간 투석시켜 분리한다. 또다른 설명예에서는, 용액을 10,000달톤의 MW 막여과기와 다량의 투석용액이 든 밀리포어(Millipore)투석기/농축기를 사용하여 분리한다. 분자체질 후에는, 수득되는 용액을 농축하고 동결건조하여 솜털같은(fluffy)분말조성물 형태의 최종적인 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 수득한다. 결정체 구조는 관찰되지 않았다.
본 발명에 따라서 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 제조하는 방법에 사용되는 입자 글루칸은 공지방법으로 맥주효모균의 세포벽으로부터 단리할 수도 있다(예는 여기에 참고로 제시한 Di Luzio et al., 1979, Internat'l J.Cancer 24 : 773-779; Hassid et al., 1941, J.Amer. Chem. Soc. 63 : 295-298) 실제시 간단히는 입자 글루칸은 아래와 같이 제조한다 : 건조 효모를 수산화나트륨의 수용액에 흡수시키고 약 100℃는 약 4시간동안 가열하고 다음에 밤새껏 방치한다. 상청액을 경사하고 이 과정을 세번 반복한다. 잔사는 염삼으로 산성화하고 100℃로 가열하여 약 4시간동안 유지하고 하룻밤 냉각시킨다. 상청액을 경사하고 산의 흡수를 두번 반복한다. 그리고 잔사를 증류수로 반복하여 세척하고 에탄올로 최소한 24시간동안 추출한다. 그리고 적갈색의 상청액을 흡입하여 버린다. 에탄올 추출은 상청액이 완전히 무색이 될 때까지 반복한다. 이 에탄올은 증류수로 반복 세척하여 제거한다. 입자 글루칸은 원심분리나 여과로 수거한다.
"분자 이완제"로서의 기능이 있는 것으로 알려진 것중에서 요소가 아닌 다른 여러가지 화합물도 또한 입자 글루칸의 트리플 헬릭스구조를 "이완"시키려고 DMSO를 사용한 후에 수소결합의 재형성을 방지하는 것으로 평가되었다. 이러한 것에는 (1) 에틸렌 디아멘 테트라아세트산; (2) 황산히드라진; (3) 모노에탄올아민; (4) 구아나딘(guanandine); (5) 구아닌(guanine) 그리고 (6) 티오요소가 포함된다. 또한 Tween-20과 같은 계면활성제와 유탁제 그리고 Alcolec 및 Centrolexf(레시틴)과 같은 인지질 유탁제도 입자 글루칸을 용해시키고 포스포릴화하는 목적으로 사용하였다. 어떤 경우에도 가용성의 면역생물학적 활성제품은 수득되지 않았다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 각종 다른 미세생체원으로부터 유도된 중성의 다포도당류나 다포도당-단백질 생성물로부터 제조할 수 있다. 전부는 아니지만 이러한 공급원을 표 1에 제시한다.
[표 1]
Figure kpo00001
[5.2. 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 특징]
본 발명에 따라 제조한 맥주효모균에 수득한 가용성 포스포릴화한 글루칸의 용해도는 물에 대해 약 50㎎/㎖보다 크다. 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 수용액은 비-점성이며 단맛을 내지 않는다.
[5.2.1. 원소조성]
가용성 글루칸의 원소조성은 Gailbraith 시험실(Knoxville, TN)으로 측정하며 표 2에 설명되어 있다. 표 2에 제시된 데이터로서 아래와 같은 본 제품의 평균 실험식을 제시한다:
C40H87PO37.
이와 같이, 가용성의 포스포릴화한 글루칸에는 매 6.6 포도당 잔사당 평균적으로 하나의 인산염 그룹이 있다.
[표 2]
[가용성의 포스포릴화한 글루칸a의 원소조성]
Figure kpo00002
a는 6시간의 포스포릴화한 후에 측정한 것임.
[5.2.2. 구조모양]
가용성의 포스포릴화한 글루칸의 분자량(MW)과 구조모양의 각종 형태를 측정하는데 많은 방법을 사용하였다.
[5.2.2.1. 분자체]
세파로오스 CL-6B-200(Pharmacia Fine Chemicals,Piscataway,NJ)을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로서 80%의 가용성 글루칸이 10,000 내지 100,000달톤 범위의 MW를 가지는 반면에 20%는 약 100,000 내지 약 500,000달톤 범위의 MW를 가지는 것으로 나타낸다.
[5.2.2.2. 핵자 핵자기공명 스펙트로스코피]
Brucker WP-200분광기(Brucker Instruments, Billerica,MA)를 사용하는 탄소-13 핵자기공명(13C-NMR) 스펙트로 스코피를 본 발명에 따라 제조된 맥주효모균에 수득한 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 여러가지 구조적 성질을 측정하는데 사용하였다.
NMR 연구용 시료는 물에 산화 듀우테륨(D2O)를 10%는 녹인 것을 사용하여 제조한다. 시료는 처음에 기준물질이 없이 실시하고 다음에 1, 4-디옥산의 적은 분취량을 첨가한 후에 실시한다. 모든 시료는 10㎜ 직경의 튜브에 넣는다.
가용성의 포스포릴화한 글루칸의13C-NMR 스펙트럼 연구에서 β-1-3 글루칸 구조는 C-6 탄소에서 측쇄가 없는 것으로 나타났다(제1도 참조). 이 NMR 스펙트럼은 입자 글루칸의 트리플 헬릭스구조가 실질적으로 없는 것을 나타낸다. 포스포릴화의 정도는 3.6%로 추정되며 이 수치는 분석치와 필수적으로 일치한다.
본 발명에 따라 제조된 맥주효모균에서 수득된 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 스펙트럼과는 달리, 하나의 렌티난 제품(Ajinomoto Co. Inc., Tokyo Japan)인, 측쇄의 β-1-3 및 1-6 글루칸은 40㎎/㎖(제2a도)나 3㎎/㎖(제2b도)에서 NMR 스펙트럼이 가늘어지는 것을 나타낸다. 이것은 이런 분자에, 특히 40㎎/㎖ 농도에서 겔상태가 있는데 기인한 것으로 추정된다. 3㎎/㎖ 농도의 겔이 없는 10% D2O 용액에서는 신호가 없었다.
제1도와 제2도의 비교에서 렌티난과 가용성의 포스포릴화한 글루칸간에 구조와 형태가 완전히 틀리는 것을 나타낸다. 렌티난의 β-1-6 결합에는 무질서한 형태(Saito et al., 1977 Carbohydrate Research, 58 : 293-305)가 있는 반면에 본 발명에 따른 가용성의 포스포릴화한 글루칸에는 질서있는 형태가 있음이 분명하다.
[5.3. 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 비-독성, 비-발열성, 비-임뮤노게니시티]
가용성의 포스포릴화한 글루칸이 주사가능한 생리학적 응답 조절제로서 입자 글루칸보다 중요한 잇점을 제공하기 때문에, 가용성 글루칸의 특징적인 독성, 발열성 및 임뮤노겐시티를 입자 글루칸의 이러한 성질과 비교하여 특별한 기준으로 아래에 기술한다.
[5.3.1. 비-독성]
급성 독성을 정상동물에 각종 투여량으로 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 일회 정맥 주사한 후 평가하였다. 처리된 동물을 주사후 30일간 관찰하였다.
일련의 실험에서, 49ICR/HsD 쥐를 각각 15마리씩의 3그룹과 각 2마리씩의 2그룹으로 분류하였다. 그룹1-3에는 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 각각 40,200 및 1000㎎/㎏을 포함하는 식염수 용액을 0.5㎖ 취하였다. 어떤 그룹에서도 사망율은 관찰되지 않았다. 더우기, 생리학적이나 습관적인 변화도 분명히 없었다. 반대로 유사하게 입자 글루칸을 처리한 쥐에서는 250㎎/㎏에서 20%의 치사율, 500㎎/㎏에서는 100%의 치사율울 나타내었다.
또다른 일련의 시험에서, 스프라쿠 도울러(Sprague Dawley) 쥐를 각각 다섯마리씩 두 그룹을 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 각각 250과 500㎎/㎏씩 정맥주사하였다. 치사율이나 생리학 또는 습관기능의 변화가 어떤 그룹에서도 없었다. 반대로 입자 글루칸을 각각 75와 150㎎/㎏로 정맥주사한 뒤에는 30%와 100%의 치사율을 나타내었다. 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 0,40,200 및 1000㎎/㎏의 투여량을 포함하는 식염수용액을 정맥주사한 2주일 후에 만성독성을 측정하였다. 몸체와 기관의 중량, 현미경으로 보는 병리학, 혈청 전해물, 용질 및 혈청효소가 신(腎)과 간의 기능에서 나타나는 것이 감지되었다.
일련의 한 시험에서 쥐를 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 처리후 각각 0.8,11,15,22 및 30일에 중량을 측정하였다. 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 어떤 투여량에서도 몸무게에 현저한 차이가 없었다. 만성처리 30일 후, 동물을 죽여서, 간, 폐와 신장의 무게가 변화가 없음이 나타났다. 취장의 무게에서는 가용성 글루칸을 40과 100㎎/㎏(0.01＜p＜0.001)으로 처리한 쥐에서는 통계적으로 주요한 증가가 나타났지만 200㎎/㎏으로 처리한 쥐에서는 없었다.
또다른 일련의 시험에서, 쥐를 가용성의 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 후(일주일에 2번씩) 0, 15, 30, 49 및 60일에 각각 몸무게를 측정하였다. 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 투여한 어떤 투여량에서도 몸무게의 차이는 없었다. 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 만성처리한 60일 후 동물을 죽였다. 간, 신장이나 폐의 무게에서 현저한 차이는 없었다. 취장의 무게는 가용성의 포스포릴화한 글루칸(p＜0.001)으로 처리한 쥐에서 통계적으로 주요한 증가가 분명히 보였다.
만성처리 30, 60일 후, 다음의 혈청 성분에서 주요한 변화는 없었다 : 포도당, 혈청 요소의 질소(BUN), 요산(尿酸), 콜레스테롤, 삼글리세리드, 전체단백질, 알부민, 글로불린, 크레아티닌, 칼슘, 인, 나트륨, 칼륨, 염화물, 중탄산염 및 음이온의 차이, 더우기, 다음의 효소에서 중요한 변화가 없었다 : 알칼리 포스파타아제, 유산 탈수소효소, 혈청 글루타민 옥살아세트 트란스아미나제, 혈청 글루타민 피루빈 트란스아미나제 및 크레아티닌 포스포키나아제, 혈청 빌리루빈에는 변화가 검출되지 않았다.
만성처리 30일 후에 쥐에서 취한 조직에 대한 조직학적 연구에서 주사당 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 40 및 200㎎/㎏ 맞는 쥐에서 필수적으로 정상간의 조직을 나타내었다. 1000㎎/㎏의 가용성 포스포릴화한 글루칸을 취한 동물에서는 간에서 단핵세포 침윤이 분명하였다. 폐와 신장조직은 모든 쥐에서 정상이었다.
만성처리 60일 후에 쥐에서 취한 조직에 대한 조직학적 연구에서 40과 200㎎/㎏의 투여량으로 주사한 동물에서 단리된 성질의 간의 육아종이 몇개 보였다. 1000㎎/㎏으로 주사한 쥐에서는 더 많은 단핵세포의 침윤이 관찰되었다. 부검한 모든 동물에서 폐조직이 본질적으로 정상이었다.
더우기 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 포함하는 식염수용액을 250㎎/㎏로 7일간(FDA의 필수시험)의 복강내주사로 5㎖를 취한 기니아(guinea) 돼지(Harlan Sprague Dawley, Houston, TX)를 사용하여 만성독성을 측정하였다. 표 3에 제시된 결과는 0.9% 식염수의 동일량을 취한 기준치와 비교하여 가용성 글루칸을 취한 기니아 돼지에는 성장의 장해가 있음을 나타낸다. 그러나 만성처리 7일 후, 처리한 동물의 체중이 처음체중과 비교하여 9% 증가되었다.
[표 3]
[가용성의 포스포릴화한 글루칸의 만성투여의 체중에 대한 영향]
Figure kpo00003
a 값은 평균체중(gm)±표준편차를 나타낸다.
N=5 동물.
b SPG는 가용성의 포스포릴화한 글루칸
* (p＜0.001)을 지칭한다.
가용성의 포스포릴화한 글루칸을 주 2회씩 정맥투여(5㎎/㎏)를 120일간 취한 2살짜리 암개에 대해 만성독성을 검사하였다. 이 개에 퓨리나 초우(Purina Chow)와 1깡통의 시판 개먹이(Alpo
Figure kpo00004
)를 보충한 물 에드 리비툼(ad libitum)을 주 2회씩 먹였다. 체중, 혈청용질, 전해질, 효소들 0, 17, 24, 38, 80 및 120일에 조사하였다. 만성처리 120일 후에, 체중은 2.8㎏ 또는 약 22% 증가했음이 관찰되었다.
다음에 혈청용질에서 중요한 차이는 없었다 : 포도당, BUN, 요산, 콜레스테롤, 크레아티닌, 다음의 혈청 전해질에서 중요한 차이는 없었다 : 칼슘, 인 나트륨, 칼륨, 염화물, 중탄산염, 및 음이온 갭(gap), 다음의 혈청효소에서 중요한 차이는 없었다 : 알칼리 포스파타아제, 유산 탈수소효소, 혈청 글루타민 옥살아세트 트란스아미나아제, 혈청 글루타민 피루빈 트란스아미나아제 및 크레아티닌 포스포키나아제.
또한, 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 50㎎/㎖로서 주 3회씩 3개월간 치료한 후 환자의 혈청 생화학에서 중요한 차이는 관찰되지 않았다.
[5.3.2. 비-발열성]
의식이 있는 개에 7.5㎎/㎏와 30㎎/㎏의 투여량으로 단일 정맥주사한 후 가용성 포스포릴화한 글루칸의 발열성을 측정하였다. 체온은 주사후 14일간 측정하였다.
표 4에 제시된 결과로서 이 만성적 동물 모형에서는 발열성 반응이 나타나지 않았다.
[표 4]
[개에서 급성이나 만성의 발열성 반응이 없음]
Figure kpo00005
a N=3마리의 개/그룹
또한 3시간 동안 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 1, 5, 10, 15, 25 및 50㎎/㎏로 투여량을 증가시키면서 중복 주사하고 넴부탈(Nembutal)(30㎎/㎏)로 마취시킨 3마리의 개를 사용하여 발열성을 측정하였다. 체온은 큰알약 투여 후 15분에 측정하였다. 어느 투여량에서 발열성 영향은 관찰되지 않았다.
또한 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 발열성을 토끼에서도 측정하였다. 7마리의 토끼를 각각 2마리, 5마리씩 2그룹으로 나눈다. 그룹 1에는 동일한 용량의 식염수를; 그룹 2에는 식염수에 가용성의 포스포릴화한 글루탄 5㎎/㎏을 용해한 것을 정맥주사하였다. 몸체중심온도를 단일의 큰알약 주사후 100분 동안 15분 간격으로 측정하였다. 기준 쥐는 체온이 0.2℃로 약간 떨어지는 것으로 나타났다. 가용성의 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 쥐는 평균 0.44℃ 상승되는 것으로 나타났다. 이와 같이 토끼에서는 약간의 발열성이 있었다.
[5.3.3. 비-면역원성]
IgG 항체의 존재를 측정하기 위해 계면 고리시험(interfacial ring test)으로 개에 120일간 만성적으로 투여했을 때의 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 면역원성을 측정하였다.
혈청시료는 발열성이 없는 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 5㎎/㎏로 주 2회씩 120일간 정맥주사한 큰 암개에서 수득하였다. 계면고리 침전소시험은 다음과 같이 실시하였다 : 0.1㎖의 희석암은 항혈청을 시험관에 피펫으로 옮긴다. 항원이나 포스포릴화한 가용성 글루칸을 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 및 1:32의 희석비율로 하여 항혈청에 넣어서 직선의 계면을 형성한다. 계면에서의 백색 침전소 고리의 형성으로 글루칸 특정의 항체나 존재함을 나타낸다. 어떤 항원 희석물에서도 침전소 고리가 검출되지 않았다.
[5.4. 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 용도]
[5.4.1. 감염성 질병의 예방과 치료]
가용성의 포스포릴화한 글루칸의 면역응답과 세망네피계에 대한 자극의 강한 활성도 때문에, 이것을 각종 미생물로 유발된 질병에 대한 예방적 및 치료적 사용에서 유입하게 쓸 수 있다. 가용성의 포스포릴화한 글루칸이 숙주수를 조절하는 인체의 기본적 숙주방어계, 대식세포의 기능적 활성도 및 상호작용, T 및 B임파구, 백혈구 및 자연적 억제제세포(killer cells)는 물론 이들의 체액과 분비물의 성분에 영향을 주기 때문에, 이 글루칸은 감염성 질병의 광범위한 배열을 비-특정적으로 변화시키는 잠재력을 보유한다.
가용성의 포스포릴화한 글루칸은 황색 포도상구균, 연쇄구균속의 폐염, 마이코박테륨 폐결핵, 헤모필루스 인플루엔자, 쌍구균 폐열과 같은 것을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 그램양성 박테리아; 대장균, 박테리아장염, 야토병균을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 그램음성 박테리아; 마이코박테륨 나병을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 항상균; 간염, 단순 헤르페스 비루스 Ⅰ 및 Ⅱ 등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 비루스; 칸디나 알비칸스, 스포로트리쿰을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 진균; 리슈마니아 도노반, 만손 빌하르쯔 주혈흡층등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 원생동물 기생충등에 의해서 유발되는 질병을 방지하고 치료하는 것으로 알려진 항균제와 이 글루칸을 조합하여 사용하거나 이 글루칸 단독으로 사용할 수 있다.
또한, 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 선천성이나 후천성의 면역결핍 또는 화학적치료의 부작용으로서 면역억제된 동물이나 사람을 불시의 감염의 방지와 치료를 위해 사용할 수 있다.
가용성의 포스포릴화한 글루칸은 아래의 잇점을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 감염치료에 특별히 유익되게 하는 많은 특성을 나타낸다 : (1) 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 광범위한 활성도를 가진다. 이 글루칸은 박테리아, 진균, 비루스 및 기생충으로 유발된 감염에 대한 효과가 있다. (2) 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 아미노글루코시드 항체등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 감염치료에 통상적으로 사용되는 생체활성제와 공동으로 추가적 또는 공력효과를 가진다. (3) 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 그 효과가 숙주에 의해서 전달되기 때문에 원인성 미생물의 발육을 유발하지 않는다. (4) 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 독성이 매우 낮다. (5) 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 백혈구감소등의 증상을 방지하거나 교정한다. (6) 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 숙주의 세포 및 체액 면역응답의 여러가지 다양한 특징을 증대시킨다; 그리고 (7) 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 숙주속에서의 면역억제의 증상을 방지하거나 역장용시킨다.
[5.4.2. 신생물(neoplasms)의 치료]
가용성의 포스포릴화한 글루칸에 의한 대식세포의 식세포성 및 분비성 활성도의 자극과 대식세포의 증식의 증가때문에, 이 조성물을 선암, 망상 세포육종등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 악성 신생물의 질병을 치료하기 위하여, 외과 및 화학요법과 같은 다른 치료법 공동으로 하거나 단독으로 유리하게 사용할 수 있다.
또한, 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 임파종의 백혈병 세포를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 종양세포의 증식에 직접적인 억제효과를 나타내기 때문에, 이 조성물을 종양생장과 진이를 억제하는데 유리하게 사용할 수 있다.
끝으로, 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 대식세포에서의 가용성의 세포독성/세포증식억제인자(뒤에서는 macrophage cytotoxic factor "MCT"라 한다)의 생성과 분비를 자극하는 것으로 나타나 있다(제7항 참조). MCT는 선암등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 암세포에 독성이 있는 대식세포의 배양배지의 상청액으로부터 단리한 미지구조의 가용성 단백질부분이다. 이와 같이 가용성 포스포릴화한 글루칸은 생체내에서의 MCT 생성을 자극하는데 유리하게 사용할 수도 있다. 또한 가용성 포스포릴화한 글루칸은 시험관에서 대식세포에 의한 MCT의 생성을 자극하는데 사용할 수 있다.
[5.5. 투여경로]
본 발명의 가용성 포스포릴화한 글루칸은 경구식으로 정맥, 복강내, 피하, 근육내, 등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 주사로, 코와 비인두의 내장에의 국소투여로, 호흡기관 내장등에 에어러졸 및 투여를 통한 흡입에 의한 많은 경로로서 예방 및 치료용으로 투여할 수 있다.
동물이나 인체에 투여할 때는, 가용성의 포스포릴화한 글루칸은 물, 수용액 또는 생리학적으로 적합한 제약운반체나 담체와 조합할 수가 있다.
아래의 일련의 실시예는 설명의 목적으로만 제시하고 본 발명의 범위로 제한코저 하는 것은 아니다.
[6. 가용성 포스포릴화한 글루칸의 제조]
입자 글루칸은 Di Luzio et al.의 방법에 따라서 세망내피로부터 제조하였다(1979,Int'l J.Cancer 24 : 773-779). 간략히 설명하면, 61 플라스를 사용하여 540gm의 건조효모(Universal Foods Corp., Milwaukee, WI)를 31의 3% 수산화나트륨수용액에 현탁하였다. 이 현탁액을 끓는 중탕에 4시간 넣고 밤새껏 냉각시키고 상청액을 경사하였다. 이 과정을 세번 반복하였다. 그리고 잔사를 800㎖의 농축염산과 21의 3% 염산으로 산성화하고 끓는 중탕에 4시간 동안 넣는다. 상청액을 밤새껏 방치하고 상청액을 경사한다. 잔사를 다시 31의 3% 염산으로 100℃에서 4시간 동안 흡수시키고 밤새껏 냉각하고 경사한다. 3% 염산흡수를 두번 반복한다. 그리고 잔사를 증류수(20℃)로 세번 세척하고 100℃의 증류수로 두번 세척한다. 11의 에틸알코올을 잔사에 첨가하고 완전히 혼합시키고 최대로 추출하기 위해 최소한 24시간 동안 방치한다. 검은 적-갈색의 알코올 상청액을 잔사로부터 흡입하여 버린다. 알코올 추출과정을 알코올 상청액이 필수적으로 무색이 될때까지 되풀이 한다. 끓는 물로 이 잔사를 네번 세척하여 알코올을 제거하고; 그러면 입자 글루칸을 원심분리, 냉동 및 동결건조하여 수거한다.
가용성 포스포릴화한 글루칸은 본 발명에 따라서 입자 글루칸을 아래와 같이 용해시키고 포스포릴화하여 제조하였다 : 18gm의 요소(8m)을 50㎖의 디메틸 설폭시(DMSO)로 포함하는 플라스크에 계속 저으면서 용해시킨다. 1g의 입자 글루칸을 첨가하여 미세하게 분산된 현탁액을 형성시킨다. 이 플라스크를 100℃로 가열하고 10㎖의 인산(85%)을 서서히 방울로 첨가한다. 이 혼합물을 끓는 물중탕에 넣어 100℃에서 3-12시간 동안 유지시킨다. 약 6시간 동안 반응을 진행시키는 것이 바람직하다.
가열과정중에는, 침전물이 형성되어서 약 1시간 후에는 보이게 되고 그후에 양이 증가한다. 약 6시간 후에, 이 혼합물은 냉각시키고 200㎖의 증류수로 희석시켜 침전물을 재현탁시킨다. 이 혼합물을 거친, 중간, 미세의 시터된(sintered) 깔대기로 여과하여 침전물을 제거한다.
포도당, DMSO 및 요소를 포함하는 저분자량 부분을 제거하기 위하여 수득되는 용액을 분자채로 걸른다.
한 일련의 실험에서, 스펙트래포 막 튜브(Fisher Scientific Co; Pittsburgh, PA)를 사용하여 증류수를 통과시키면서 5일간 투석하여 분자 채질을 한다. 이 튜브의 공동의 MW의 크기 범위는 약 12,000달톤이 된다. 다른 일련의 실험에서, 10,000 막 여과기가 있는 밀리포어 분리기/농축기(Millipore Corp., Bedford, MA)를 사용하여 분자채질을 수행한다. 약 70ℓ의 투석용액을 저분자량 화합물을 제거하는데 사용하였다. 두 경우에서, 최종 제품중의 포도당의 존재확인 시험은 음성이었다. 더우기, 고성능의 가스-액체크로마토그래피로 사용하여 DMSO가 최종 제품에서 검출되지 않았다.
분자채질 후에는, 포스포릴화한 가용성의 글루칸을 포함하는 이 용액을 농축시키고 동결건조하였다. 이 동결건조한 글루칸은 동결건조된 상태에서 최소한 2년간은 안정되고 -20℃로 유지되는 용액속에서는 최소한 15개월은 안정하다.
[7. 가용성 포스포릴화한 글루칸의 면역생물학적 성질]
아래에 기술하는 모든 실험에서, 동물은 12시간씩 명암이 교차되며 에어콘이 설치된 Purina Laboratory Chow ad Libitum에서 보관하였다.
[7.1. 면역억제된 동물에서 임의 감염에 대한 이환율증가의 변경]
화학요법, 선천성 또는 후천성 면역결핍(예로, 후천성 면역결핍증 또는 AIDS와 같은) 때문에 면역억제된 동물은 각종 임의성 기관에 의한 감염에 이환성이 있다. 예를 들면, AIDS로 고통을 받는 환자에서 사망의 주 원인은 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii)가 된다(예로 Jaffee et al., 1983, J.Infect. Dis. 148 : 339-345; Gottlieb et al., 1981, New Eng. J.Med. 305 : 1425-1431).
Walzer et al. (1983, J.Reticuloendothel. Soc. 33 : 1-9; Infec. Immunol. 24 : 939-947)에 의한 상기 연구에서 나타낸 것은 코르티코스테로이드의 만성투여로 면역억제되면 P. carinii에 의해서 유발된 폐염에 대해 쥐의 C3H/HeJ 균주가 더욱 이환성이 있다는 것이다. 이러한 사람과 같이, 뉴모시스티스 폐염의 진화가 면역억제의 진화에 따른 잠복성 감염의 활성화를 나타낸다.
아래의 실험에서 만성적으로 면역억제된 C3H/HeJ 쥐에 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 투여하면 임의성 감염에 대한 이러한 동물의 이환율을 현저히 감소시키고 생존율을 현저히 증가시킨다는 것을 나타낸다.
[7.1.1. 생존의 증대]
일련의 실험에서, 100마리의 C3H/HeJ 쥐(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)를 각각 25마리씩 네그룹으로 분류하였다. 그룹 1에는 0.5㎖의 5% 포도당 용액을 정맥투여하고; 그룹 2에는 5㎎의 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 정맥투여하고; 그룹 3에서는 1.5㎎의 아세트산 코르티손(cortisone)(Upjohn, Kalamazoo, MI)을 피하투여하고; 그룹 4에는 5㎎의 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 정맥투여하고, 1.5㎎의 아세트산 코르티손을 피하투여하였다. 모든 쥐를 주 2회씩 5주간 처리하고 생존을 60일간 추적하였다. 주지할 것은 아세트산 코르티손으로 처리한 동물은 투여될 스테로이드의 투여량이 Walzer(Supra)에 의해서 나타낸 소요량보다 상당히 초과했기 때문에 심하게 면역억제되었다.
이 결과는 제3도에 설명하였다. 제3도에서 나타낸 것같이, 포도당(그룹 1)이나 가용성의 포스포릴화한 글루칸(그룹 2)의 단독으로 처리된 쥐에서는 치사가 없었다. 24일까지, 코르리코스테로이드만으로 처리된 쥐의 생존은 12%이었다(그룹 3). 조직병리학적 연구에서 나타난 것은 죽음의 주원인은 뇌를 포함하는 곳으로의 박테리아나 진균의 감염이었다. 반대로 24일까지, 코르리코스테로이드와 가용성의 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 쥐의 생존은 약 68%이었다(그룹 4). 이러한 쥐의 장기적 생존은 66%로서 코르티코스테로이드-처리된 쥐(p＜0.001)에 비교할 때 통계적으로 매우 중요하다.
[7.1.2. 대장균 감염에 대한 면역-억제된 쥐의 내성증가]
아래의 실험은 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 투여로 정상 및 만성면역억제된 쥐의 대장균감염에 대한 내성을 증가시키는 것을 나타낸다.
60마리의 C3H/HeJ 쥐를 각각 15마리씩의 네그룹으로 분류하였다. 그룹 1에는 5% 포도당(0.5㎖)을 세번 정맥주사하고, 그룹 2에는 마리당 4㎎의 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 3번 정맥주사하고; 그룹 3에는 마리당 1.5㎎의 아세트산 코르티손을 3번 피하주사하고; 그룹 4에는 마리당 4㎎의 가용성 포스포릴화한 글루칸과 마리당 1.5㎎의 아미토산 코르티손을 피하로 3일간격으로 3번 주사하였다. 마지막 주사 3일후, 쥐에 2.5×107의 대장균 박테리아를 복강내 투여하였다. 대장균으로 주사후 15일간 생존을 추적하였다.
제4도에 표시된 결과는 대장균으로 감염되고 정상의 포도당-처리된 쥐(그룹 1)에서 65%가 생존함을 나타낸다. 대장균으로 감염된 7일 후 이 그룹에서는 치사가 나타나지 않았다. 반대로, 가용성의 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 정상쥐(그룹 2)에서 치사율이 0%로 관찰되었다. 이와 같이, 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 사전처리하면 정상동물의 대장균 감염에 대한 내성을 현저히 증가시켰다.
또한 제4도에 제시된 결과는 코르티코스테로이드의 투여로 만성적으로 면역이 억제된 쥐의 두드러진 치사율을 나타낸다. 포도당으로 처리되어 면역억제된 쥐(그룹 3)에서, 40시간에 50%의 치사율, 그리고 5일에서는 75%의 치사율을 기록하였다. 현저한 반대현상으로서, 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 처리하여 면역억제된 쥐(그룹 4)에서는 0%의 치사율이 관찰되었다. 이와 같이 기준과 코르티손-처리된 두가지 쥐에서, 가용성의 글루칸은 숙주내성을 증대시켜 정상 및 코르티손-면역억제된 쥐의 두가지 모두에서 그램-음성감염에 대해 완전한 보호를 하게 된다.
이러한 연구에 의해서 코르티손의 면역억제성 투여를 받은 쥐에 가용성의 글루칸을 투여하면 감염에 대한 코르티손-유발된 이환율에 변경을 가져온다는 것을 나타낸다. 그러므로, 글루칸은 코르티손의 만성투여의 면역억제성 효과를 변태시켜 자생감염으로부터의 치사율을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 또한 코르티손의 비교적 급성의 면역억제효과도 유도할 수가 있다.
[7.2. 가용성 포스포릴화한 글루칸의 생체내 투여에 의한 동물의 박테리아 질병의 변태]
[7.2.1. 황색 포도상구균으로 유발된 폐혈증의 변태]
아래의 실험은 가용성 포스포릴화한 글루칸의 생체내투여로 황색 포도상구균과 관련되는 폐혈증의 치사효과를 변위시키는 유효성을 나타낸다.
20마리의 ICR/TEX 쥐를 두 그룹으로 분류하여 아래와 같이 처리하였다. 폐혈증의 3, 2 및 1일전에, 그룹 1에는 가용성 포스포릴화한 글루칸을 200㎎/㎏로 정맥주사하고; 기준 그룹으로 지칭하는 그룹 2에는 같은 용량의 등장성 글루칸을 정맥투여하였다. 다당류의 세번째 투여의 하루뒤에, 두 그룹에 1.0×109세포의 황색 포도상구균을 정맥주사하였다. 실험용 및 기준용 쥐의 생존을 130일간 추적하였다.
결과는 제5도에 표시되어 있다. 여기서 나타내는 바와 같이, 황색 포도상구균의 주사 2일후에, 포도당처리한 쥐(그룹 2)에서 60%의 치사율이 관찰되었다. 그러나 표시에 주사전에 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 쥐에서는 0%의 치사율이 관찰되었다. 주사 8일후, 27%의 기준그룹이 생존하였다. 반대로, 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 동물의 생존율은 동시에 100%이었다. 어떤 그룹에서도 130일간 더 이상의 죽음은 없다. 이와 같이 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 사전 처리하면 후속적인 황색 포도상구균 감염의 치사율을 현저히 감소시켰다.
[7.2.2. 대장균으로 유발된 복막염의 변태]
[7.2.2.1. 보호효과의 소요시간]
아래의 실험은 가용성 포스포릴화한 글루칸의 복강내 투여로서 쥐에오는 실험적으로 유발되는 대장균 폐혈증에 대한 유효성을 나타낸다.
79마리의 백색 큰 쥐를 각각 8-13마리로된 8개의 그룹으로 분류하였다. 기준으로 지칭하는 그룹 1에는 1㎖의 포도당(5%)을 취하고; 양성 기준으로 지칭한 그룹 2에는 3㎎의 입자 글루칸; 그룹 3에는 12.5㎎의 대장균에 노출되기 24시간전에 12.5㎎의 가용성 포스포릴화한 글루칸을 취한다. 그룹 4, 5, 6 및 7에는 각각 대장균에 노출되기 6, 2, 1, 0시간전에 12.5㎎의 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 취한다. 그룹 8에는 대장균에 노출된 2 및 4시간 후에 12.5mg의 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 취한다. 모든 처리는 복강내 주사로 투여하였다. 또한 대장균(1.0×108세포)을 복강내 경로로 주사하였다. 결과는 표 5에 설명되어 있다.
[대장균의 폐혈증에 의한 치사율에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸의 투여시간의 영향]
[표 5]
Figure kpo00006
a. 그룹번호는 본문에서 설명된 처리방법을 참조한다.
각 그룹의 동물수는 8-13이었다.
b. PG는 입자글루칸을 지칭하고; SPG는 가용성 포스포릴화한 글루칸을 지칭한다.
c. 시간 동물을 처리한 시간이다.
d. 48시간 기간후에는 어느 그룹에서도 더이상의 치사율은 없었다.
표 5에서 나타낸 것같이, 가용성 포스포릴화한 글루칸의 복강내 투여로 실험적으로 유발된 대장균 복막염이 있는 쥐(그룹 3 및 4)의 생존을 현저히 증대시켰다. 관찰된 것같이, 가용성 포스포릴화한 글루칸은 대장균에 노출되기 늦어도 6시간 전에 유효하게 투여할 수 있었다.
가용성 포스포릴화한 글루칸을 대장균의 투여와 동시 또는 그 후에 투여하여 감염의 돌발성 성질에 기인한 대장균 복막염(그룹 7 및 8)의 치사성을 역전시키는데 효과가 없었다.
[7.2.2.2. 투여량-응답]
또다른 일련의 실험을 수행하여 대장균 유발된 복막염과 치사율에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸의 각종 투여량의 투여효과를 측정하였다.
106마리의 백색 쥐를 각각 9-30마리로된 그룹으로 분류하였다. 기준으로 지칭하는 그룹 1-2에는 같은 용적의 포도당을 취하였다. 그룹 2-7에는 각 1, 1, 2, 4, 8, 10, 20, 120, 200 또는 260로 가용성 포스포릴화한 글루칸을 취하였다. 모든 주사는 대장균(1×108세포)의 복강내 투여에 의한 복막염 감염의 24시간 전에 복강내로 투여하였다. 결과는 표 6에 설명되어 있다.
[대장균a의 복강내 투여의 치사에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸(SPG)의 투여량의 영향]
[표 6]
Figure kpo00007
a는 대장균에 노출되기 24시간 전에 복강내 투여한 가용성 포스포릴화한 글루칸이나 포도당의 단일주사 생존율을 노출후 24시간에서 기록하였다.
표 6에서 나타낸 것같이, 1㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏ 범위의 가용성 포스포릴화한 글루칸의 모든 투여량은 대장균의 복강내 감염에 의해 노출된 동물에서 생존율을 증대시키는 거의 같게 유효하였다.
[7.3. 비루스로 유발된 간염에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸의 영향]
앞의 연구에 입자글루칸이 쥐의 간염비루스(MHV) 균주 A59에 노출된 쥐에서 생존을 증가시키고, 간염성 괴사를 억제하고, 식세포 활성도의 활성화 상태를 유지하는 것을 나타낸다(Williams and Di Luzio, 1980, Science 208:67-69).
아래의 실험은 가용성 포스포릴화한 글루칸의 사전 투여로서 실험적으로 유발된 비루스성 간염이 있는 쥐의 생존을 증가시킨 것을 나타낸다.
20마리의 숫놈인 C57BL/6 Tex 쥐(Timco, Houston, TX)를 두 그룹으로 분류하였다. 기준으로 지칭한 그룹 1에는 포도당(0.5㎎/쥐)을 정맥주사하고, 그룹 2에는 급성 비루스성 간염 유발의 3, 2 및 1일전에 가용성 포스포릴화한 글루칸(5㎎/쥐)을 정맥주사하였다. 간염은 MHV 균주 A59의 16보체결합단위(CFU)를 복강내 주사하여 유발시켰다.
쥐의 생존을 비루스 투여의 30일 후에 추적하였다. 결과는 제6도에서 설명한다.
제6도에 나타낸 것같이 가용성 포스포릴화한 글루칸의 정맥투여로 급성 비루스성 간염인 쥐의 생존을 현저히 증대시켰다. 간염의 유발후 6일에서, 기준 그룹중 50%의 생존이 관찰되었다. 반대로 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 사전처리한 그룹에서는 100%의 생존이 관찰되었다. 다른 그룹(7-30일)에서도 더 이상의 치사는 관찰되지 않았다.
[7.4. 아구창-유발된 폐혈증에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸의 경구투여 효과]
아래의 실험은 가용성 포스포릴화한 글루칸의 경구투여가 효모 아구창으로 유발된 폐혈증의 치사율의 변태에 유효한 것을 나타낸다.
25마리의 숫놈 ICR/Tex 쥐를 두 그룹으로 분류한다. 그룹(13마리)에는 5.0㎎/㎖의 가용성 포스포릴화한 글루칸을 포함하는 식수를 7일간 주었다. 쥐는 하루에 약 1.1-1.5㎖를 먹고서, 이렇게 처리된 쥐는 하루에 약 7㎎의 가용성 포스포릴화한 글루칸을 취하였다. 기준 그룹으로 지칭된 그룹(12마리)는 실험기간을 통하여 수도물을 먹였다. 당일에는 모든 동물에 아구창(3.0×106세포/쥐)을 정맥주사하였다. 그룹 1을 식수에 가용성 포스포릴화한 글루칸을 다시 감염후 5일간 경구 투여하고 다음에 이 동물에 수도물만 주었다. 두 그룹에서 쥐의 무게를 추적하였다. 그룹 1과 2의 양자에서 쥐는 같은 율로 무게가 증가되었다. 두 그룹에서 생존도 또한 추적하였다. 결과는 제7도에 그래프로 설명한다.
제7도에서 나타낸 것같이 아구창으로 감염되기 전이나 감염된 후 5일간 가용성 포스포릴화한 글루칸의 경구투여로 쥐의 생존을 현저하면서도 일시적인 증가를 가져왔다. 감염후 25 및 30일에서, 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 그룹에서의 생존은 기준 그룹보다 현저히 높았다.(p＜0.05 수준에서). (카이 2승 검정에서 λ＜0.5＜0.01). 기준 그룹의 중간 생존시간은 18일이었고; 반면에 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 그룹의 중간 생존시간은 그러나 30일이었다. 장기간 생존과 관련하여, 궁극적인 결과는 현저히 변하지 않았다. 이와 같이, 이 실험으로 제시하는 것은 가용성 포스포릴화한 글루칸이 경구투여할 때는, 높은 투여량이 필요하다는 것이다.
[7.5. 대식세포의 식세포 활성도의 증대]
아래의 실험에서 가용성 포스포릴화한 글루칸의 투여로 대식세포의 식세포기능을 현저히 증가시키는 것을 나타낸다.
20마리의 숫놈 ICR 쥐를 각각 10마리씩의 두 그룹으로 분류하였다. 식세포 활성도를 측정하기전 3, 2, 1일에, 기준으로 지칭된 그룹 1에는 동일용량의 식염수를 주사하고; 그룹 2에는 가용성 포스포릴화한 글루칸(200㎎/㎏)로 주사하였다. 모든 주사는 정맥으로 투여하였다.
식세포 기능은 Wooles et al.의 방법(1962, Rad. Res. 16 : 546-554)에 따라서 콜로이드 형태의 탄소(cll/143(a) Gunther Wagner, Hanover, Germany)의 맥관내의 제거율을 측정하여 실시하였다. 콜로이드 형태의 탄소는 정맥투여하고(640㎎/㎏), 일련의 혈액시료는 꼬리정맥에서 취하였다. 분취량을 4.0㎖의 0.5% 탄산나트륨에 용혈시키고 콜로이드형 탄소의 농도를 스펙트로포토메터로 측정하였다. 반감기(t/2)는 가시밀도나 농도가 제기곡선을 0시간으로 외삽시켜 측정한 0시간 값의 절반이 되는 시간으로 취하였다. 결과는 표 7에 나타낸다.
[표 7]
[대식세포의 식세포 기능에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸(SPG)의 영향]
Figure kpo00008
a N=그룹단 10
* p＜0.001
표 7에서 나타낸 것같이, 가용성 포스포릴화한 글루칸의 투여로 제거의 55% 증가로 나타낸 것같이 식세포기능을 현저히 증대시킨다(표 7). 앞에서 관찰한 것같이, 간의 무게는 증가가 없었다(표 7).
[7.6. 대식세포의 분비활성도의 증가]
대식세포의 주요분비 생성물은, 특히 활성화 상태에서, 인터로이킨 Ⅰ(Interleukin Ⅰ)라고 칭하는 매개분자이다. 인터로이킨 Ⅰ는 실험동물과 인체에서 급성단계의 단백질 응답을 유발하는 폴리펩티드이다. 이 응답은 적혈구 침강속도, 백혈구증, 급성단계 단백질의 증가, 및 내인성 발열질에 기인한 열의 발생이 포함된다. 또한, 인터로이킨 Ⅰ은 T-세포의 활성화와 증식을 크게 자극하는 능력을 가진다. 이와 같이, 인터로이킨 Ⅰ은 세포를 점증원시켜 숙주방어 활성도를 증대시킬 수 있는 임파구 활성화 인자이다.
아래의 실험은 가용성 포스포릴화한 글루칸의 투여로 인터로이킨 Ⅰ의 분비로 검사하여 대식세포의 분비물 활성도를 자극시키는 것을 나타낸다.
많은 쥐(16)에 가용성 포스포릴화한 글루칸(200㎎/㎏)를 정맥주사하였다. 8마리의 기준 쥐에는 동일용량의 포도당을 취하였다. 플라스마 시료는 주사후 1, 3, 5, 8, 24, 48, 72 및 168시간에서 취하였다.
인터로이킨 Ⅰ의 생성은 C-57 BL/6J 흉선세포를 사용하여 평가하였다. 흉선세포(1×106세포)의 배양은 배지만, 또는 기준 쥐 또는 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 쥐에 취한 0.1㎖의 플라스마를 넣은 배지에서 배양하였다. 이 세포 배양은 24시간 지속하고서, 1μ의 3H-티미딘을 첨가하였고 배양은 또다시 24시간 동안 실시하였다. 이때, 티미딘 흡수량을 측정하였고, 결과는 제8도에 제시한다.
제8도에서 설명한 것같이, 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 쥐에서 취한 혈청에는 포도당으로 처리한 쥐에서 취한 혈청과 비교하여 1, 24, 48 및 72시간에서의 흉선세포에 흡수된 티미딘의 증가로서 반영된 것같이 인터로이킨 Ⅰ 활성도의 증가를 보였다. 이와 같이 가용성 포스포릴화한 글루칸은 신속히 대식세포를 활성화하여 플라스마 인터로이킨 수준의 증가로서 반영된 것같이 분비물 활성도를 증가시킨다. 24-72시간 피크의 성질이 형성되도록 유지된다.
[7.7. 시험관내에서의 대식세포에 의한 항-종양 세포독성 생성물의 증대]
아래의 실험은 가용성 포스포릴화한 글루칸의 자극하에서 대식세포에 의해서 대식세포 세포독성/세포증식 억제인자(MCT)의 생성을 평가하기 위해 실시하였다.
C57BL/6J 쥐에서 취한 비장(Splenic)의 대식세포(5×106세포)를 7.5% 태아송아지 혈청, 50IU/㎖의 페니실린 G, 50μg/㎖의 스트렙토마이신, 50μg/㎖의 황산 겐타마이신, 10μg/㎖의 암포테리신 B 및 2㎎/㎖의 NaHCO3를 넣은 RPMI 1640 배지로 배양시켰다. 기준세포는 배지만으로 배양하였다. 실험용 세포는 가용성 포스포릴화한 글루칸(5㎎/㎖)를 포함하는 배지에서 배양하였다. 모든 세포배양은 Falcon 2013 배양 플라스에서 5% CO2, 95% 공기로, 37℃에서 20시간 동안 유지시켰다. 배양 후 배양 상청액은 원심분리하여 수거하고 모든 세포는 0.22μ 여과기를 통과시켜 제거하였다.
MCT의 존재를 확인하는 검사에서, 선암세포(BW10232)를3H-티미딘으로 라벨하고 세번 세척하여 어떤 관련안되는 방사성을 제거하였다. 그리고 라벨을 한 종양세포(0.1㎖당 2×104 세포)를 미세적정웰에 첨가하고 MCT를 시험할 상청액을 0.1㎖ 용량으로 첨가하고 이 세포를 24시간 동안 배양하였다. 배양 후에 미세적정 판을 원심분리하고 0.1㎖ 분취량을 방사성 검사를 하였다. 종양세포용해의 지수를 나타내는 방출방사선은 존재하는 MCT의 양에 따라서 직접 변한다. 또한 세포분해와 세포증식억제의 정도의 정략적 측정은 종양세포를 에탄올로 고정시키고 검사염색액으로 염색하여 실시하였다. 결과는 표 8에 제시한다.
예로 비-가용성의 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 것과 같은 기준 또는 정지하는 대식세포에서 취한 상청액은 배지단독으로 배양한 것과 비교하여 선암세포로부터의3H-티미딘의 배출을 증가시키는 세포독성인자(MCT)를 포함한다(표 8). 그러나 글루칸-자극된 대식세포에서부터의 상청액은 실제로 더많은 MCT를 생성한다. 세포독성의 현저한 증대가 명백하다(표 8).
[선암 BW 10232에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 활성화한 대식세포 상청액의 세포독성 증대]
[표 8]
%3H-티미딘 배출a
Figure kpo00009
a 값은 그룹당 6회의 복제에 대한 평균치 ±S.E.를 나타낸다.
* p＜0.01
** p＜0.001
상청액 부분의 증가된 세포분해 효과가 글루칸의 직접적인 영향이 아니라는 것을 나타내려는 목적으로 3H-티미딘 라벨을 한 종양세포를 0.5㎎의 가용성 포스포릴화한 글루칸의 존재하에 24시간 동안 배양하였다. 결과는 표 9에 제시한다.
[시험관에서의 선암 BW 10232에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸의 직접적인 세포독성 효과의 없음]
[표 9]
%3H-티미딘 배출d
Figure kpo00010
d 값은 그룹당 6회 복제에 대한 평균치 ±S.E.를 나타낸다.
표 9에서 볼 수 있는 것같이, 가용성 포스포릴화한 글루칸은 사전-라벨을 한 종양세포로부터의 티미딘의 배출에 대해서 중요한 영향을 미치지 않는다. 그러므로, 종양세포에 의한 키니딘의 배출의 증가는 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 배양한 세포에서의 상청액내에서 생성된 대식세포 생성물에 기인한 것으로 결론을 낼 수 있다.
상청액 부분의 세포독성/세포증식억제 효과의 확인은 배양물의 조직학적 평가로서 실시하였다. 배지만에서 배양된 선암세포(BW 10232)에서는 우수한 생장이 명백히 나타난다.3H-티미딘 배출과 관련하여 위에서 기술한 데이터에 따라서, 가용성 포스포릴화한 글루칸을 포함하는 배지에서 24시간 배양한 종양세포에서도 또한 정상적인 생장이 명백하게 나타난다. 이것은 종양세포 배양주에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸의 직접적인 세포독성 효과가 없음을 확인한다. 뚜렷한 반대현상으로, 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 대식세포로부터의 상청액으로 배양한 종양세포에서 중요한 세포장애와 분해가 분명히 있었다. 세포장해와 분해의 정도는 정상이나 기준 대식세포에서 취한 상청액을 배양배지에 첨가한 경우보다 이러한 종양세포 배양에서 현저히 더 크게 관찰되었다. 이와 같이 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 유발된 정지상태의 대식세포는 종양 세포독성인자의 생성을 증가시킨다.
세포독성/세포증식억제인자(MCT)가 단백질인 것으로 발견된 이래 연구는 분자량(S)과 같은 그의 성질을 규명하는데 기울여졌다. 대식세포 배양물에서 취한 상청액의 건조물 50㎎를 1㎖의 살균수에 용해시키고 이것을 세파아크릴(Sephacryl) S-300 초미세 기질(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ)로 충진된 1.5㎝×90㎝의 유리 컬럼에 첨가하였다. 이 칼럼을 용출물로서 인산염 환충의 식염수로 0.2㎖/min의 유속으로 조작하였다. 유분을 1㎖ 간격으로 수거하고 세포증식억제 활성도를 시험하였다. 결과는 제9도에서 그래프로 설명하였다.
제9도에서 나타낸 것같이, 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 활성화한 대식세포 배양물의 상청액을 컬럼 크로마토그래피로 선암세포에 대한 세포독성을 가지는 두개의 피크를 수득하였다. 이 피크는 38,500과 84,000달톤의 분자량을 나타내는 용적의 용출물이다.
[7.8. 전이성 간질환의 변태]
아래의 실험은 가용성 포스포릴화한 글루칸을 단독으로나 또는 예로서 시클로포스파아미드와 같은 항-암제와 함께 투여하면 쥐의 원발종양의 생장과 세망종세포 육종의 전이를 감소시켰다는 것을 나타낸다.
120마리의 C57BL/6J 쥐(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)를 각각 30마리씩의 네 그룹으로 분류하였다. 모든 쥐에 1.0×104세포의 세망종세포 육종세포 M5076을 피하 주사하였다. 주사한 50일 후에, 5마리를 무작위로 선택하여 죽여서 원발종양 생장을 측정하고 전이병변의 유무를 확인하였다. 원발종양의 평균무게는 1.86㎎ 또는 몸무게의 6.4%이었고, 시험한 모든 동물이 기관특징의 간 미세전이를 가졌다. 원발종양무게의 %변화를 기준으로서 20일된 종양무게를 사용하여 계산하였다.
종양이식 후 20일과 그 후에 50일까지 매 3일마다 기준으로 지칭한 그룹 1에는 포도당(0.5㎖)을 투여하고; 그룹 2에는 가용성 포스포릴화한 글루칸(200㎎/㎏ 몸무게)를 정맥주사하고; 그룹 3에는 시클로포스파아미드(Cytoxan, Mead Johnson, Evansville, IN)(45㎎/㎏ 몸무게)를 투여하고; 그룹 4에는 가용성 포스포릴화한 글루칸(200㎎/㎏ 몸무게)으로 정맥투여하고 시클로포스파아미드(45㎎/㎏ 몸무게)를 복강내 투여하였다.
원발종양의 생장에 대한 여러가지 치료의 영향을 표 10에 제시한다. 생존에 대한 영향은 표 11에 제시한다.
[가용성 포스포릴화한 글루칸과 시클로포스파아미드의 화학면역요법:원발종양에 대한 공적효과]
[표 10]
Figure kpo00011
a 모든 그룹의 C57BL/6J 쥐에 0일에 1.0×104세망종 내피세포를 피하 주사하였다. 20일에, 원발종양의 평균무게는 1.86g 또는 몸무게의 6.4%이었다. 20일과 그후 매 3일마다 쥐에 적합한 약물치료를 하였다.
다음의 상세한 내용 참조.
표 10에 제시된 것같이, 가용성 포스포릴화한 글루칸과 시클로포스파아미드는 예로서 기준 쥐(그룹 1)의 몸무게의 12.6%와 비교하여 8.3% 및 8.5%로 된 것같이 원발종양 생장의 감소에 대해서 거의 같은 효과를 가졌다. 가용성 포스포릴화한 글루칸과 시클로포스파아미드로 같이 처리한 쥐(그룹 4)에서는, 예로서 기준(그룹 1)의 12.6%와 비교하여 4.4%인 것같이 원발종양의 크기를 심지어 크게 감소시켰다.
결과는 36일에서 심지어 더욱 현저하다(표 10). 기준 그룹이 16일(20-36일)에서 평균 종양무게가 142%로 증가된 한편, 가용성 포스포릴화한 글루칸으로 처리한 그룹(그룹 2)에서의 종양무게는 단지 84%만 증가하였고, 시클로포스파아미드(그룹 3)에서는 단지 36%만 증가하였다. 본인들의 연구중 처음에는, 화학요법과 가용성 포스포릴화한 글루칸의 면역요법의 혼합으로서 원발종양의 실제 억제가 명백하였다. 혼합요법에서, -64% 성장이 관찰되어 원발종양의 억제를 나타내었다.
표 11에서 나타내는 것같이, 가용성 포스포릴화한 글루칸(그룹 2)이나 시클로포스파아미드만(그룹 3)으로 처리한 쥐에서는 모두 기준(그룹 1)과 비교하여 생존이 현저히 증가된 것이 관찰되었다(p＜0.01). 더우기, 가용성 포스포릴화한 글루칸과 시클로포스파아미드를 같이 처리한 동물(그룹 4)에서는 통계학적으로 매우 중요하게(p＜0.01) 증가된 생존시간이 관찰되었다.
이러한 연구에서 명백히 나타내는 것은 화학요법과 가용성 포스포릴화한 글루칸의 면역요법의 공용의 유효성이다. 원발종양 생장을 억제 뿐만 아니라 조직병리학적 관찰에서 반영된 것같이 전이질병의 감소도 주지되었다. 기준 그룹에서 알려진 간의 전이는 가용성 포스포릴화한 글루칸과 시클로포스파아미드로 처리한 그룹에서는 필수적으로 없었다. 또한 생존의 현저한 증가(표 11) 뿐만 아니라 이의 처리된 그룹에서 발생된 최초의 죽음 이전의 간격의 증대로 관찰되었다.
[가용성 포스포릴화한 글루칸과 시클로포스파아미드의 화학면역요법 :
세망종세포 암종 M5076으로 형성된 쥐의 생존에 대한 영향]
[표 11]
Figure kpo00012
a 방법은 표 10에서 제시된 데이터를 얻기위해 사용된 것과 동일하다. 모든 처리는 50일에서 끝내었다.
b 가용성 포스포릴화한 글루칸과 시클로포스파아미드 그룹에서의 치사율은 치료를 종결했을 때 후속적으로 유포된 잔유의 비장 종양세포 때문인 것으로 추정되었다.
* p＜0.01
** p＜0.001
[7.9. 시클로포스파아미드-유발된 백혈구 감소증을 방지하기 위한 가용성 포스포릴화한 글루칸의 능력]
거의 모든 항 신생종제의 투여와 관련된 유해성 영향중에는 골수억제, 백혈구 감소증의 유발 및 감염성 질병에 대한 이환율의 증가가 있다(일반적으로 Klastersky, ed.,
Figure kpo00013
Infection in Cancer Patients, Raven Press, NY, 1982, pp. 1-12).
7, 8항에서 상세히 기술한 것같이, 가용성 포스포릴화한 글루칸을 시클로포스파아미드 치료와 결합시킬 때 원발종양에 대한 공력효과를 유발할 수가 있다. 암환자에 시클로포스아미드의 사용과 관련된 결함의 하나는 백혈구 감소증의 발생이다. 650라드(rad)의 코발트 방사의 한시간 전이나 한시간 후에 투여할 때 쥐에서의 헤모포에틴회수를 증가시키는 분산입자와 가용성의 폴리글리칸의 나타낸 능력의 견지에서(Patchen, 1983, Surv. Immunol. Res.
Figure kpo00014
: 237-242; Patchen et al., 1984, J.Biol. Response Modifiers,
Figure kpo00015
: 627-733 참조), 시클로포스파아미드의 치료학적 및 면역억제성 투여를 받은 동물에서 말초의 백혈구수준을 유지시키는 능력을 가용성 포스포릴화한 글루칸이 가지는 지의 여부를 측정하기 위한 연구를 수행하였다.
40마리의 쥐를 네 그룹으로 분류하였다. 기준 그룹인 그룹 1에는 등장성의 포도당을 정맥 주사하였다. 그룹 2에는 가용성 포스포릴화한 글루칸(마리당 5㎎)를 투여하고; 그룹 3에는 시클로포스파아미드(시톡산)(마리당 0.6㎎)을 복강내 투여하고; 그룹 4에는 시클로포스파아미드와 가용성 포스포릴화한 글루칸을 같이 투여하였다. 모든 주사는 3일 간격으로 마리당 네번 주사하였다. 말초 혈액의 전체 백혈구의 계산을 14일에 하였다. 이 연구의 결과는 표 12에 제시한다.
[가용성 포스포릴화한 글루칸에 의한 시클로포스파아미드-유발된 백혈구 감소증의 방지]
[표 12]
Figure kpo00016
a 가용성 포스포릴화한 글루칸(SPG)(5㎎/쥐)를 매 3일마다 정맥 투여하였다.
시클로포스파아미드(0.6㎎/쥐)는 매 3일마다 복강내 투여하였다. 전체 백혈구의 수는 실험 14일에 계산하였다.
* p＜0.01-시클로포스파아미드 처리화 비교한 기준.
** p＜0.01은 시클로포스파아미드만의 경우와 SPG+시클로포스파아미드 경우와 비교.
제시된 것같이, 시클로포스파아미드의 투여로 말초 백혈구(p＜0.01)가 47% 감소하는 특성을 보였다. 가용성 포스포릴화한 글루칸과 시클로포스파아미드를 같이 투여하면 시클로포스파아미드를 처리한 그룹(p＜0.01)과 비교하여 백혈구의 전체 수가 103% 증가된다.
이 연구에서 명백히 나타내는 것은 가용성 포스포릴화한 글루칸과 시클로포스파아미드를 같이 투여하면 시클로포스파아미드의 투여로 생기는 백혈구 감소등의 특징적인 발생을 방지할 수가 있다. 이로서 7.8.항 supra에서 제시된 것같이 종양억제에 대한 공력효과를 나타내는 한편 독성의 화학치료제의 존재하에 감염성 질병에 대한 내성을 유지할 것이다.
[7.10. 시험관에서의 임파구성 백혈병 세포의 증식에 대한 세포증식억제 효과]
본 연구는 시험관에서의 쥐의 임파구성 백혈병 세포의 증식율을 억제하는 가용성 포스포릴화한 글루칸의 능력을 나타낸다.
배양물에 유지된, L-1210 임파구성 백혈병 세포를 웰당 2×105세포의 농도로 미세적정기 웰에 편다. 가용성 포스포릴화한 글루칸(500μg/웰) 또는 입자 글루칸(100μg/웰)을 첨가하고 세포를 24시간 동안 배양하였다. 같은 양의 배양배지(7.5%의 태아송아지 혈청으로 보충한 RPMI-1640)를 기준 배양물에 첨가하였다.3H-티미딘(0.5μCi/웰)을 모든 배양물에 첨가하고 배양을 다시 24시간 동안 계속하였다. 세포증식은 3H-티미딘의 삽입으로 측정하여 실시하였다. 결과는 표 13에 설명된다.
[쥐의 임파구성 백혈병 세포의 시험관내 증식에 대한 가용성 포스포릴화한 글루칸(SPG)과 입자글루칸(PG)의 비교효과]
[표 13]
Figure kpo00017
a L-1210 세포(2×105/웰)를 가용성 포스포릴화한 글루칸(0.5㎎/웰) 또는 입자글루칸(0.1㎎/웰)의 존재하에 배양하였다.3H-티미딘(0.5μCi/웰)을 첨가하여 종양세포 증식을 측정하였다. N=24웰/그룹.
표 13에 표시된 것같이, 입자글루칸은 종양세포증식을 약 36% 억제하였다. 현저한 반대로, 가용성 포스포릴화한 글루칸은 종양세포증식은 약 88.5% 억제하였다. 이와 같이 가용성 포스포릴화한 글루칸이 종양생장과 전이를 억제하는 메카니즘의 하나는 이미 미확인된 방법이지만 그 능력상 종양세포증식을 직접적으로 억제하는 것이다.
[8. 코리오루스 베르시칼라(Coriolus veriscolor)로부터의 가용성 포스포릴화한 글루칸의 제조와 그 효능]
아래의 실험은 가용성 포스포릴화한 글루칸을 담자균류 코리오루스 베르시칼라(Fr.Quel.)로부터 수득하며 또한 유용한 면역생물학적 활성도를 가지는 것을 나타낸다.
C.베르시칼라로부터 가용성 포스포릴화한 글루칸을 제조하는 출발물질로서, 일본 도꾜의 산꾜 회사에 "Krestin" 또는 "PSK"라는 명칭으로 시판되는 다당류-단백질 제품을 사용하였다. 이 시판제품은 β-1,4, β-1,3, β-1,6-글루칸-단백질 착화합물을 포함하는 비교적 조제품이다. 다포도당류의 기본적 화학구조는 β-1,3과 β-1,6 글루코시드 결합으로 결합된 포도당 단위의 측쇄나 측면쇄가 부착된, 1,4-글리코시드 결합으로 결합된 포도당 단위의 즉 사슬이다. 단백질 함량은 15-38%의 범위가 된다(Ehrke et al., 1983, Internat'l J. Immunopharm.
Figure kpo00018
: 34-42; Yamamura and Azuma, 1982, Adv. Immunopharm.
Figure kpo00019
: 501-207).
시판되는 PSK 제품은 비교적 조제품이고 비교적 높은 단백질 함량을 가지므로, 이 물질을 정맥투여하는 것은 불가능하다. 이것은 경구투여해야 한다.
[8.1. 제조]
C.베르시칼라에서 얻은 PSK-다당류-단백질 착화합물은 제5항에 기술된 본 발명에 따라서 가용성 포스포릴화한 글루칸(이후로는 "가용성의 포스포릴화한-PSK"라 한다)로서 제조한다. 이 단리된 가용성 포스포릴화한-PSK를 동결건조한다.
[8.2. 대장균 유발된 복막염에 대한 효능]
다음의 실험은 후속적으로 대장균 유발된 복막염에 대한 가용성의 포스포릴화한 PSK의 복강내 투여의 효능을 나타낸다.
48마리의 백색 큰 쥐를 각각 16마리씩 세그룹으로 분류하였다. 기준 그룹으로 지칭된 그룹 1에는 등장성의 식염수 용액 0.5㎖를 정맥투여하고; 그룹 2에는 5㎎의 시판되는 PSK(Sankyo Corporation, Tokyo, Japan)을 정맥투여하고; 그룹 3에는 5㎎의 가용성의 포스포릴화한-PSK를 정맥 투여하였다. 모든 글루칸은 대장균 노출 24시간 전에 투여하였다. 대장균(1×108박테리아)를 복강내 경로로 주사하였다. 결과는 표 14에 설명한다.
[대장균-폐혈증에 기인한 치사율에 대한 C.베르시칼라에서 취한 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 투여효과]
[표 14]
Figure kpo00020
a N=그룹당 16마리.
b 식염수나 가용성 포스포릴화한-PSK(5㎎/쥐)의 단일 주사를 대장균 노출 24시간 전에 복강내 투여하였다.
c 시판되는 PSK(Sankyo Corporation, Tokyo, Japan)을 대장균에 노출되는 24시간 전에 정맥 투여하였다(5㎎/동물).
표 14에서 설명한 것같이, 시판품 PSK와 가용성 포스포릴화한-PSK 글루칸은 둘다 감염 후 24시간에서 대장균 폐혈증에 대해 중요한 보호성 활성도를 나타내었다. 그러나, PSK 제품과는 반대로, 본 발명에 따른 제조된 가용성 포스포릴화한-PSK는 장기간에 걸쳐 감염에 대해 효능이 크게 증가된 것을 보여준다. 감염 72시간 후에, 가용성 포스포릴화한-PSK로 처리한 그룹에서는 치사율이 관찰되지 않았다(그룹 3). 동시에 PSK로 처리한 그룹(그룹 2)에서는 81%의 치사율이 관찰되었다.

Claims (19)

  1. 포스포릴화한 폴리-[β-(1-3)글루코피라노스]사슬을 포함하는 가용성 글루칸(glucan)에 있어서, (a) 물이나 수용액에 용해될 수 있으며; (b) 비-독성, 비-면역원성 및 실질적으로 비-발열성이며; (c) 동물이나 인체에 생체내 투여될 때 현저한 면역생물학적 응답을 낼 수 있는 것을 특징으로 하는 가용성 글루칸.
  2. 제1항에 있어서, 핵자기공명 스펙트로스코피로 측정하여 트리플 헬릭스 사슬이 실질적으로 완전히 없는 것을 특징으로 하는 가용성 글루칸.
  3. 제1항에 있어서, 약 1.4% 내지 약 3.4% 범위의 포스포릴화 정도로 가지는 것을 특징으로 하는 가용성 글루칸.
  4. 제1항에 있어서, 약 10,000 내지 약 100,000달톤 범위 분자량을 가지는 것을 또다른 특징으로 하는 가용성 글루칸.
  5. 제1항에 있어서, 약 100,000 내지 약 500,000달톤 범위의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 가용성 글루칸.
  6. 제1항에 있어서, 미생물의 공급원으로부터 수득하는 가용성 글루칸.
  7. 제1항에 있어서, 미생물 공급원이 매주효모균
    Figure kpo00021
    를 포함하는 가용성 글루칸.
  8. 제6항에 있어서, 미생물의 공급원이 코리오루스 베르시칼라
    Figure kpo00022
    를 포함하는 가용성 글루칸.
  9. 동물이나 인체에 생체내 투여할 때 현저한 면역생물학적 응답을 낼 수 있는 비-독성, 비-면역원성, 실제로 비-발열성의 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 제조하는 방법에 있어서, (a) 강한 혼란추성제(chaotropic agent)를 포함하는 강한 극성용매에 입자글루칸(particulate glucan)이나 글루칸 단백질 착화합물을 용해시키며; (b) 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 형성하기 위하여 수득한 용해된 글루칸을 인산과 반응시키며; (c) 반응 혼합물로부터 수득된 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 회수하는 것을 포함하는 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 강한 극성용매가 디메틸설폭시드를 포함하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 강한 혼란추성제가 요소를 포함하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, (a) 혼합물을 형성하기 위하여 강한 혼란추성제를 포함하는 강한 극성용매에 입자글루칸이나 글루칸 단백질 착화합물을 현탁시키며; (b) 이 혼합물을 약 50-150℃로 가열하여; (c) 이 혼합물에 인산을 첨가하며; 그리고 (d) 이 혼합물은 50-150℃에서 약 1-12시간 동안 방치시켜 반응시키는 것을 포함하는 순서적인 단계를 포함하는 방법으로 입자글루칸이나 글루칸 단백질 착화합물을 용해시키는 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 혼합물을 약 100℃로 가열하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 혼합물이 디메틸설폭시드에 약 4-12M의 요소를 포함하는 방법.
  15. 제9항에 있어서, 글루칸을 충분한 시간동안 인산과 반응시켜 수득된 가용성의 포스포릴화한 글루칸의 포스포릴화가 실질적으로 완결되게 하는 방법.
  16. 제9항에 있어서, 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 (a) 가용성의 포스포릴화한 글루칸이 침전이 되게하고; (b) 재침전된 가용성의 포스포릴화한 글루칸을 재현탁하기 위하여 충분한 양의 물을 첨가하며; (c) 약 10,000달톤의 분자량 보다 작은 모든 성분을 제거함에 의해서, 회수하는 글루칸의 제조방법.
  17. 제9항에 있어서, 입자글루칸을 맥주효모균에서 수득하는 방법.
  18. 제9항에 있어서, 글루칸 단백질 착화합물을 코리오루스 베르시칼라에서 수득하는 방법.
  19. 제9항에 있어서, 입자글루칸을 (a) 수산화물의 수용액에 진균세포의 분취량을 현탁시키고, 혼합물을 형성하며; (b) 이 혼합물을 약 50-150℃로 가열하며; (c) 수득되는 잔사로부터 상청액을 제거하며; (d) 이 잔사를 수산화물의 수용액에 현탁시키며; (e) 단계 b와 c를 두번이나 세번 반복하며; (f) 염산을 단계 e의 잔사에 첨가하여 산성 혼합물을 형성하며; (g) 산성 혼합물을 가열하며; (h) 상청액을 제거하며; (i) 단계 f와 g를 두번 반복하며; (j) 이 잔사를 물로 세척하며; (k) 상청액이 본질적으로 무색이 될때까지 잔사를 에탄올로 반복하여 추출하며; (l) 형성된 불용성의 다포도당류 조성물을 단리하는 단계를 포함하는 방법으로 수득하는 글루칸 제조방법.
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Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5082936A (en) * 1984-11-28 1992-01-21 Massachusetts Institute Of Technology Glucan composition and process for preparation thereof
US5028703A (en) * 1988-03-11 1991-07-02 Massachusetts Institute Of Technology Glucan composition and process for preparation thereof
US4992540A (en) * 1984-11-28 1991-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Glucan composition and process for preparation thereof
US4900722A (en) * 1985-08-19 1990-02-13 Bioglucans, L.P. Methods and compositions for prophylactic and therapeutic treatment of infections
US4739046A (en) * 1985-08-19 1988-04-19 Luzio Nicholas R Di Soluble phosphorylated glucan
US4975421A (en) * 1985-08-19 1990-12-04 Bioglucan, Lp. Soluble phosphorylated glucan: methods and compositions for wound healing
CA1334290C (en) * 1987-02-26 1995-02-07 Adrienne Elizabeth Clarke Plant gum material and use thereof in food products
EP0295956B1 (en) * 1987-06-18 1996-09-11 Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Use of a protein-bound polysaccharide for making a drug for treating AIDS.
US4904768A (en) * 1987-08-04 1990-02-27 Bristol-Myers Company Epipodophyllotoxin glucoside 4'-phosphate derivatives
US5200182A (en) * 1988-05-26 1993-04-06 Nika Health Products, Ltd. Antiviral or antibacterial composition and method of use
WO1990001938A1 (en) * 1988-08-19 1990-03-08 The Australian National University Phosphosugar-based anti-inflammatory and/or immunosuppressive drugs
US5506210A (en) * 1988-08-19 1996-04-09 The Australian National University Phosphosugar-based anti-inflammatory and/or immunosuppressive drugs
US6150503A (en) * 1988-10-28 2000-11-21 Pestka Biomedical Laboratories, Inc. Phosphorylated fusion proteins
US6747131B1 (en) 1988-10-28 2004-06-08 Pestka Biomedical Laboratories, Inc. Phosphorylated fusion proteins
IL92124A (en) 1988-10-28 1996-10-31 Sidney Pestka Recombinant proteins modified to contain post-phosphorylation that do not occur in nature
US5135920A (en) * 1988-11-16 1992-08-04 Takeda Chemical Industries, Ltd. Angiostatic agents
JP2984366B2 (ja) * 1989-04-05 1999-11-29 バイオミラ、インコーポレーテッド 免疫抑制ムチンを生成する腺がんの能動的特異免疫療法
US4946450A (en) * 1989-04-18 1990-08-07 Biosource Genetics Corporation Glucan/collagen therapeutic eye shields
US5032401A (en) * 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
FR2648350B1 (fr) * 1989-06-20 1994-07-01 Roussel Uclaf Utilisation de lipopolysaccharides extraits de bacteries gram(-) pour la fabrication d'un medicament facilitant la cicatrisation de la peau
US5622939A (en) * 1992-08-21 1997-04-22 Alpha-Beta Technology, Inc. Glucan preparation
US5811542A (en) * 1989-09-08 1998-09-22 Alpha-Beta Technology, Inc. Method for producing soluble glucans
US5488040A (en) * 1989-09-08 1996-01-30 Alpha-Beta Technology, Inc. Use of neutral soluble glucan preparations to stimulate platelet production
CA2067159A1 (en) * 1989-09-08 1991-03-09 Spiros Jamas Method for immune system activation
WO1991003495A1 (en) * 1989-09-08 1991-03-21 Alpha Beta Technology, Inc. Method for producing soluble glucans
US5223491A (en) * 1989-11-09 1993-06-29 Donzis Byron A Method for revitalizing skin by applying topically water insoluble glucan
FR2655267B1 (fr) * 1989-12-04 1992-04-03 Roussel Uclaf Nouveau derive sulfate du galactanne extrait de klebsiella, procede de preparation, application a titre de medicaments et compositions pharmaceutiques le renfermant.
US5242806A (en) * 1990-05-07 1993-09-07 Baxter Diagnostics Inc. Method for conducting the cytotoxicity assays on tumor cells
CA2040374C (en) * 1990-07-06 1998-06-16 Gunnar Rorstad Process for enhancing the resistance of aquatic animals to disease
ES2027528A6 (es) * 1990-12-17 1992-06-01 Andromaco Lab Procedimiento para la obtencion de polimeros con actividad antiviral.
DE4101910A1 (de) * 1991-01-23 1992-07-30 Laevosan Gmbh & Co Kg Verfahren zur herstellung eines pyrogenfreien gut wasserloeslichen fructans sowie ein nierendiagnostikum, das ein solches fructan enthaelt
AU1455292A (en) * 1991-02-01 1992-09-07 Bioglucans, L.P. Soluble glucans
US5466680A (en) * 1992-03-26 1995-11-14 Cytologics, Inc. Method and compositions for enhancing white blood cell functioning on a mucosal or cutaneous surface
PL173978B1 (pl) * 1992-07-13 1998-05-29 Nika Health Products Ltd Sposób oddziaływania na wydzielanie cytokin w hodowli limfocytów krwi obwodowej
SI9300415A (en) * 1992-08-05 1994-06-30 Bioglucans L P Improved method for preparing soluble glucans
EP0595209A3 (en) * 1992-10-23 1996-07-17 R I T A Corp An Illinois Corp Cosmetic composition
US5519009A (en) * 1993-10-01 1996-05-21 Donzis; Byron A. Solubilized yeast glucan
US5919466A (en) * 1993-10-01 1999-07-06 Gerbu Biotechnik Gmbh Method for improving the yield of immunoantibodies in the vaccination of animals and humans
RU2122401C1 (ru) * 1993-12-16 1998-11-27 Николаев Борис Петрович Ранозаживляющая композиция
US5622940A (en) * 1994-07-14 1997-04-22 Alpha-Beta Technology Inhibition of infection-stimulated oral tissue destruction by β(1,3)-glucan
JP3240102B2 (ja) 1994-08-11 2001-12-17 江崎グリコ株式会社 リン酸化糖とその製造方法
US5576015A (en) * 1995-03-02 1996-11-19 Donzis; Byron A. Substantially purified beta (1,3) finely ground yeast cell wall glucan composition with dermatological and nutritional uses
GB2331014C (en) * 1995-03-13 2005-06-21 Novogen Res Pty Ltd Therapeutic uses of glucan
AUPN166195A0 (en) * 1995-03-13 1995-04-06 Norvet Research Pty Limited Process for glucan extraction
US5833946A (en) * 1995-06-06 1998-11-10 Bayer Corporation Dissemination of fungal infections: animal model and method of prophylaxis
US6800747B1 (en) 1995-06-07 2004-10-05 Pestka Biomedical Laboratories, Inc. Nucleic acids encoding phosphorylated fusion proteins
US6117850A (en) * 1995-08-28 2000-09-12 The Collaborative Group, Ltd. Mobilization of peripheral blood precursor cells by β(1,3)-glucan
RU2124354C1 (ru) * 1996-03-13 1999-01-10 Истранова Елена Викторовна Ранозаживляющее средство "эмпаркол"
US6083922A (en) * 1996-04-02 2000-07-04 Pathogenesis, Corp. Method and a tobramycin aerosol formulation for treatment prevention and containment of tuberculosis
US5858378A (en) * 1996-05-02 1999-01-12 Galagen, Inc. Pharmaceutical composition comprising cryptosporidium parvum oocysts antigen and whole cell candida species antigen
NZ336381A (en) 1996-12-30 2000-11-24 Battelle Memorial Institute Formulation and method for treating neoplasms by inhalation
US5786343A (en) * 1997-03-05 1998-07-28 Immudyne, Inc. Phagocytosis activator compositions and their use
DE19710368A1 (de) * 1997-03-13 1998-09-17 Henkel Kgaa Verwendung von wasserlöslichen beta-Glucanen als Wirkstoffe zur Herstellung von therapeutischen Mitteln zur Hautbehandlung
US6046323A (en) * 1997-07-29 2000-04-04 The Collaborative Group, Ltd. Conformations of PPG-glucan
RU2141820C1 (ru) * 1997-08-07 1999-11-27 Алкацева Надежда Ильинична Ранозаживляющая мазь "эпофен"
AU9597198A (en) * 1997-10-03 1999-04-27 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Imine-forming polysaccharides, preparation thereof and the use thereof as adjuvants and immunostimulants
RU2146921C1 (ru) * 1997-11-05 2000-03-27 Рязанский областной клинический кожно-венерологический диспансер Мазевая композиция, стимулирующая регенерацию эпителия
RU2150936C1 (ru) * 1997-12-16 2000-06-20 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Композиция для лечения гнойно-некротических ран (варианты)
RU2139044C1 (ru) * 1997-12-16 1999-10-10 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Средство для лечения гнойно-некротических ран и ожогов "коллагель"
US6136794A (en) * 1998-02-02 2000-10-24 Merck & Co., Inc. Platelet aggregation inhibition using low molecular weight heparin in combination with a GP IIb/IIIa antagonist
JPH11313667A (ja) * 1998-03-24 1999-11-16 Pacific Corp β―１，６―分枝―β―１，３―グルカンを分離するためのスエヒロタケの液体培養方法及びこの方法により製造されたβ―１，６―分枝―β―１，３―グルカンを含有する外用剤組成物
AU760669B2 (en) 1998-04-28 2003-05-22 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates
TW591105B (en) * 1998-04-30 2004-06-11 Korea Inst Sci & Tech Novel immuno-stimulating polysaccharide substance from Phellinus spp. strain and use thereof
US7030101B2 (en) 1998-09-14 2006-04-18 Nabi Biopharmaceuticals Compositions of β-glucans and specific antibodies
CA2344166C (en) * 1998-09-14 2008-11-18 Nabi Compositions of .beta.-glucans and specific igiv
US6369216B1 (en) 1998-09-25 2002-04-09 Biopolymer Engineering Pharmaceutical, Inc. Very high molecular weight β-glucans
AU6261999A (en) 1998-09-25 2000-04-17 Collaborative Group, Ltd., The Very high molecular weight beta-glucans
AUPP659198A0 (en) * 1998-10-19 1998-11-12 Novogen Research Pty Ltd Mastitis treatment
US6165994A (en) * 1999-02-08 2000-12-26 Blue Ridge Pharmaceuticals, Inc. Methods for promoting the healing of cutaneous wounds and ulcers using compositions of α-D-glucans
EP1206939B1 (en) * 1999-07-21 2008-10-15 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Cholesterol-lowering agents, secondary bile acid procuction inhibitors and foods and drinks
US6541678B2 (en) * 1999-09-27 2003-04-01 Brennen Medical, Inc. Immunostimulating coating for surgical devices
EP1267795A1 (en) * 2000-03-30 2003-01-02 Brennen Medical Inc. Anti-microbial and immunostimulating composition
US6713459B1 (en) 2000-04-28 2004-03-30 East Tennessee State University Methods for the prophylactic and therapeutic treatment of cardiac tissue damage
JP2001354570A (ja) * 2000-06-15 2001-12-25 Ichimaru Pharcos Co Ltd 免疫賦活剤及びそれを利用した香粧品
RU2185157C2 (ru) * 2000-06-26 2002-07-20 Рудько Адолина Петровна Средство для лечения ожоговых ран
MXPA03003401A (es) * 2000-10-16 2004-06-30 Neopharm Inc Formulacion liposomica de mitoxantrona.
US6436411B1 (en) * 2000-10-23 2002-08-20 The Center For The Improvement Of Human Functioning, Int'l., Inc. Cancer treatment method
ES2237477T3 (es) * 2000-11-22 2005-08-01 D.M.G. Italia Srl Preparacion para reforzar la respuesta inmunitaria en el anillo de waldeyer y la mucosa buconasal mediante una administracion intranasal.
US7507724B2 (en) * 2001-01-16 2009-03-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
EP1357919B1 (en) 2001-01-16 2017-04-05 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US7906492B2 (en) * 2001-01-16 2011-03-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
WO2002081720A1 (en) * 2001-04-05 2002-10-17 Granada Bio Tech Sa De Cv Polysubstituted polycarboxylic phosphoamide biopolymers, methods for their production and uses of compositions derived therefrom
KR20040039195A (ko) * 2001-04-27 2004-05-10 아지노모토 가부시키가이샤 면역강화제
US6506413B1 (en) * 2001-04-30 2003-01-14 Joseph C. Ramaekers Compositions for treating animal diseases and syndromes
US20060073197A1 (en) * 2004-05-20 2006-04-06 Ramaekers Joseph C Encapsulated transfer factor compositions and methods of use
US20070128253A1 (en) * 2005-04-13 2007-06-07 Ramaekers Joseph C Encapsulated transfer factor compositions and methods of use
WO2002098440A1 (en) * 2001-06-01 2002-12-12 Ajinomoto Co., Inc. Drugs for diabetes
DE60222144T2 (de) * 2001-08-14 2008-05-15 Valderm Aps Behandlung von hyperproliferativen zuständen von körperoberflächen
US7786094B2 (en) * 2001-10-09 2010-08-31 Biopolymer Engineering, Inc. Use of beta-glucans against biological warfare weapons and pathogens including anthrax
US7048932B2 (en) * 2002-05-22 2006-05-23 The Chinese University Of Hong Kong Preparation and standardization of immunomodulatory peptide-linked glucans with verifiable oral absorbability from coriolus versicolor
EP1545208A4 (en) * 2002-08-13 2006-04-12 Biopolymer Engineering Inc METHODS OF USING BETA-GLUCAN AS RADIOPROTECTIVE AGENT
US20060165700A1 (en) * 2002-09-04 2006-07-27 Ostroff Gary R Cancer therapy using whole glucan particles and antibodies
EP1536820B2 (en) * 2002-09-04 2013-10-23 Biopolymer Engineering, Inc. Cancer therapy using whole glucan particles and antibodies
US7018986B2 (en) * 2002-09-20 2006-03-28 Immudyne Use of beta glucans for the treatment of osteoporosis and other diseases of bone resorption
US20050026849A1 (en) * 2003-03-28 2005-02-03 Singh Chandra U. Water soluble formulations of digitalis glycosides for treating cell-proliferative and other diseases
US7197521B2 (en) * 2003-11-21 2007-03-27 Intel Corporation Method and system performing concurrently mark-sweep garbage collection invoking garbage collection thread to track and mark live objects in heap block using bit vector
KR100485056B1 (ko) * 2004-01-19 2005-04-22 (주)네추럴에프앤피 효모의 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 항 h1n2형 조류독감 바이러스제
MX2007013725A (es) 2005-05-05 2008-04-09 Sensient Flavors Inc Produccion de beta-glucanos y mananos.
DE602006009144D1 (de) 2005-11-21 2009-10-22 Bioatlantis Ltd Zusammensetzungen für die verbesserung der darmgesundheit und der tierischen leistung enthaltend beta-glucans and alfa-fucans
US8323644B2 (en) 2006-01-17 2012-12-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US20090053221A1 (en) * 2006-01-17 2009-02-26 Cheung Nai-Kong V Immune response enhancing glucan
FR2899815B1 (fr) * 2006-04-14 2008-07-11 Goemar Lab Sa Nouveaux medicaments pour les traitements contre les retrovirus
US20090053197A1 (en) * 2006-06-14 2009-02-26 Ramaekers Joseph C Transfer Factor Compositions and Methods
US9125874B2 (en) 2007-11-30 2015-09-08 The Ramaekers Family Trust Administration of transfer factor for improving reproductive health
US20090022799A1 (en) * 2006-10-06 2009-01-22 Shikha Pramanik Barman Compositions that contain beta-glucan to be used for the prevention and treatment of disease and methods for their use
US9457047B2 (en) 2006-11-06 2016-10-04 Whitehead Institute Immunomodulating compositions and methods of use thereof
ES2397186T3 (es) * 2006-11-06 2013-03-05 Whitehead Institute Composiciones inmunomoduladoras y métodos para su uso
US20090074751A1 (en) * 2007-09-18 2009-03-19 Ramaekers Nutrition, Inc. Growth factor fraction compositions and methods
EP2278984A4 (en) * 2007-11-30 2013-02-27 Ramaekers Family Trust COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING FERTILITY
US7854936B2 (en) 2008-01-14 2010-12-21 Active Organics, Inc. Anti-inflammatory hydrolysate of C. versicolor
CN101250236B (zh) * 2008-04-11 2010-09-29 武汉大学 茯苓葡聚糖磷酸酯化衍生物及其制备方法和用途
CN102119332A (zh) 2008-04-29 2011-07-06 免疫刺激公司 免疫调节组合物及其使用方法
US20100267661A1 (en) * 2009-03-17 2010-10-21 Immudyne, Inc. Beta glucans and methods of use thereof
US20110129801A1 (en) * 2009-11-27 2011-06-02 Shikha Pramanik Barman Compositions and methods to prevent and treat dry socket post-operatively after tooth extraction surgery
CN107674129B (zh) * 2017-09-04 2020-12-15 珠海伊斯佳科技股份有限公司 裂褶多糖磷酸化衍生物及其制备方法、应用
WO2023002252A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Bioatlantis Limited Composition comprising beta-glucans and alpha-fucans for improving gut health and animal performance and methods of making the same
US11572420B1 (en) 2021-07-30 2023-02-07 Tissue repair ltd Isolated biological polysaccharide compound, methods of use and methods of manufacture thereof
US11384160B1 (en) 2021-07-30 2022-07-12 Tissue repair ltd Method of making a beta glucan compound
CN114014949B (zh) * 2021-11-15 2022-08-30 戚春建 一种水溶性酵母葡聚糖的制备方法
CN115232845A (zh) * 2022-07-08 2022-10-25 广东先强药业有限公司 一种活化的葡糖氨基葡聚糖及其制备方法和应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1258100B (de) * 1960-11-22 1968-01-04 Wacker Chemie Gmbh Verfahren zum Phosphorylieren hydroxylgruppenhaltiger polymerer Stoffe
US3081226A (en) * 1961-01-07 1963-03-12 Luzio Nicholas R Di Process for reducing exogenous cholesterol levels in animal organisms
US3396082A (en) * 1965-06-09 1968-08-06 Agriculture Usa Glucan production by fermentation of fleshy fungi
DE1518587A1 (de) * 1965-08-23 1969-08-14 Bloecker Dr Dipl Chem Erich Verfahren zur Herstellung von Phosphorsaeureestern von hydroxylgruppenhaltigen Polymeren
US3987166A (en) * 1970-05-13 1976-10-19 Kaken Kagaku Kabushiki Kaisha Treatment of tumors with glucan compositions in mice and rats
US3943247A (en) * 1972-05-22 1976-03-09 Kaken Kagaku Kabushiki Kaisha Treatment of bacterial infections with glucan compositions
DE2646879A1 (de) * 1975-10-21 1977-05-05 Takeda Chemical Industries Ltd Matrix aus einem in wasser unloeslichen beta-1,3-glucangel und verfahren zu ihrer herstellung
US4138479A (en) * 1975-11-07 1979-02-06 Bayer Aktiengesellschaft Process for the preparation of immunopotentiating agents from components of yeast cell wall material
JPS5385000A (en) * 1976-12-31 1978-07-26 Akira Misaki Glucan and its preparation
JPS5461112A (en) * 1977-10-24 1979-05-17 Ono Pharmaceut Co Ltd Oncostatic polysaccharide* its preparation* and oncostatic drugs containing it as an effective component
FR2447193A1 (fr) * 1979-01-25 1980-08-22 Unicler Utilisation de pichia ou d'extraits de pichia, comme medicament.
DE3071815D1 (en) * 1980-08-05 1986-12-11 Debat Lab Use of glycosylglucanes in the treatment of infections of the large intestines
US4340673A (en) * 1980-11-07 1982-07-20 Merck & Co., Inc. Process of producing modified glucans as anti-caries agent
US4614733A (en) * 1981-12-31 1986-09-30 Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Polysaccharides pharmaceutical compositions and the use thereof
US4739046A (en) * 1985-08-19 1988-04-19 Luzio Nicholas R Di Soluble phosphorylated glucan

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