KR900004798B1

KR900004798B1 - 재조합 폐포 계면활성 단백질

Info

Publication number: KR900004798B1
Application number: KR1019860700554A
Authority: KR
Inventors: 따블류. 쉴링 제이알. 제임스; 티. 화이트 로버트; 콘델 바바라; 제이. 벤슨 브래들리
Original assignee: 캘리포니아 바이오테크날러지 인코퍼레이티드; 원본미기재
Priority date: 1984-12-11
Filing date: 1985-12-10
Publication date: 1990-07-06
Also published as: NO863197D0; KR870700019A; ATE115147T1; DE3590648T1; US4659805A; IE67067B1; WO1986003408A1; AU5308986A; JP2500197B2; NO863197L; HK1005883A1; ES549817A0; NO177678C; EP0210189B1; IE853133L; JPH07108917B2; EP0210189A4; DK172227B1; DE3587958T2; GB2181138A

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

재조합 폐포 계면활성 단백질

[도면의 간단한 설명]

제1도는 개의 32K ASP를 암호화하는 DNA 서열 및 추출되는 아미노산 서열.

제2도는 개의 10K ASP를 암호화하는 cDNA에 대해 결정된 DNA 서열 및 추론되는 아미노산 서열.

제3도는 사람의 32K ASP유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 추론되는 아미노산 서열.

제4도는 λ : gHS-15로 형질감염시킨 CHO 세포로부터 분비되는 S-Met-표지된 단백질의 자동 방사선 사진.

제5도는 pH-6에 함유된 사람 ASP cDNA의 3' 말단 부위의 서열.

제6도는 사람의 10K ASP를 암호화하는 cDNA에 대해 결정된 DNA 서열 및 추론되는 아미노산 서열.

제7도는 발현 벡터 pASPc-SV(10)의 암호 서열 및 관련 접합물.

제8도는 발현 벡터 pASPcg-SV(10)의 암호 서열 및 관련 접합물.

제9도는 발현 벡터 pMT-Apo : gHS(Hinf I/Eco R I)의 암호 서열 및 관련 접합물.

제10도는 pMT-Apo : gHS(Hinf I/EcoRI)로 형질전이된 CHO 세포에 의해 분비된 엔도 F로 처리되거나 처리되지 않은,³⁵S-표지 상등액 단백질상에서 수행된 SDS PAGE의 결과.

제11도는 pMT-Apo : gHS(HinC I/EcoR I)로 형질전이된 CHO세포에 의해 분비된 엔도 F로 처리되거나 처리되지 않은, 상등액 단백질 상에서 수행된 표지된 사람의 항 ASP로 면역반점된 SDS PAGE의 결과.

제12도는 인지질에 의해 저하되는 표면장력을 증가시키는 ASP의 능력에 대한 시험관내 측정결과.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 호흡기 질환의 치료에 유용한 재조합 폐포 계면활성 단백질(ASP)의 제조방법에 관한 것이다.

사람의 폐는 다수의 작은 주머니 또는 폐포로 이루어져 있고, 여기에서 가스가 폐의 혈액과 공간 사이에 교환된다. 건강한 사람에서, 이러한 교환은 II형 폐포세포의 미립체막에서 합성되는 계면활성 복합제를 함유하는 단백질의 존재에 의해 중재된다. 적절한 상기 복합체가 없을 경우에, 폐는 적절히 기능할 수 없고(즉, 호기중 폐포허탈), 따라서 흡기에 의해 재팽창될 수도 없다. 즉, 상기한 복합체를 합성할 수 없는 능력은 사망 또는 심한 육체적 손상을 초래시킬 수 있다.

가장 많이 알려진 부적당한 계면활성 복합체의 예는 조산아 및 임신합병증 후에 태어난 유아에서 나타내며, 호흡기 질환 증후코(RDS)으로 널리 알려져 있다. 이러한 증후군의 공공연한 형태는 초자막질병 또는 자연발생성 RDS로 명명된다. RDS는 현재 미합중국 및 기타 선진국에서 유아사망 및 질환의 주원인이고, 이의 진단 및 치료에 실제적 노력이 경주되어 왔다. 현재 치료는 기껏해야 침입 정지-갭(stop-gap)측정인 기계적(압력) 환기법에 집중되어 있고, 이는 종종 폐에 손상 및 예를 들어 폐기관 형성장해, 간질성 기종 및 기흉을 포함하는 기타의 유해한 부작용을 야기시킨다. 상기 처리법을 사용한 경우에 정신적 둔화도 경우에 따라 야기될 수 있다[참조 : Hallman, Mo, et al, Pediatric Clinics of North America(1982) 29 : 1057-1075].

계면활성제를 바꿈으로써 증후군을 치료하는 제한된 시도가 이루어져 왔다. 이는 선택의 방법이므로, 일반적으로 한번의 투여만이 요구되고, 손상잠재력이 감소된다. 예를 들어 하기 문헌에서는 소의 폐로부터 유도한 단백질-결핍된 계면활성제 제제를 사용하며, 이 제제는 유효하나 면역원성이다[참조 : Fujwara, et al, Lancet(1980) 1 : 55]. 또한 하기 문헌에서는 사람 양수로부터의 계면활성제 분리물을 사용하여 몇몇 유아로 치료하는데 어느 정도의 성공을 거두었다[참조 : Hallman et al., Pediatrics(1983) 71 : 473-482]. 클레멘트(clements)에 의한 미합중국 특허 제4,312,860호에는 단백질을 함유하지 않는 인공 계면활성제가 기술되어 있고, 이는 비록 데이타가 없지만 이 분야에 유용할 것으로 알려져 있다. 요약컨대, 계면활성제 대치는 임상적으로 널리 사용되지 않았다.

바람직한 계면활성제 치환물은 폐 계면활성 복합체 자체이다. 이 복합체는 아포단백질(apoprotein), 다량으로 존재하는 2종의 인지질(디팔미토일 포스포콜린(DPPC) 및 포스파티딜-글리세롤(PG)), 매우 소량으로 존재하는 여러 지질성분, 및 칼슘이온으로 이루어져 있다. 아포단백질은 32,000달톤의 분자량을 갖는 단백질 및 약 10,000달톤의 강한 소수성 단백질을 함유한다[참조 : King, R. J. et al, Am J Physiol(1973) 224 : 788-795]. 32,000달톤의 단백질을 글리코실화하고 이는 하이드록시프롤린을 함유한다.

계면활성제 대치요법에 있어서 발전이 저해된 주원인은 복합체의 단백질 부위의 이용가능성을 결여하고 있는데 있다. 대치요법은 지질성분 단독으로 사용하는데 시도가 이루어졌고, 이러한 치료의 수행은 아포단백질을 부가함으로써 현저히 개선될 수 있다[참조 : Hallman, M., et al, Pediatric Clinics of North America(1982) (상기 참조)]. 그러나 현재로서 이러한 단백질은 단지 정상적 성인의 폐 및 양수로부터만 구입할 수 있고, 충분한 공급을 위한 효율적인 분리공정도 제공되지 않았다. 따라서 아포단백질의 단독사용 또는 복합체의 포화 인지질 부위와 함께 사용하기 위한 아포단백질의 실제사용량을 생성시키는 방법을 개발하는 것이 바람직하다.

본 발명은 그 특질의 최적화를 허용하는 양 및 조건하에서 폐의 계면활성 복합체의 아포단백질 부위를 수득하는 방법을 제공한다. 복합체의 나머지 성분인, 디팔미토일 포스포콜린 및 포스파티딜-글리세롤과 칼슘이온은 쉽게 구입할 수 있다. 소정량의 조작가능한 아포단백질의 이용가능성은 치료에 사용가능한 복합체의 형태를 최적화하는 연구를 실현시킬 수 있고, 또한 호흡기 질환 증후군의 일상적 대치요법의 가능성을 열어준다.

즉, 한 관점에서 본 발명은 재조합에 의해 생성된, 포유동물의 폐포 계면활성 단백질(ASP)에 관한 것이다. 이러한 단백질은 약 32Kd(32K ASP)의 비교적 고분자량이며 비교적 수용성인 단백질과 약 10 내지 20Kd(10K ASP)의 저분자량이며 소수성인 단백질의 혼합물이다.

상기한 2종의 단백질은 칼슘이온의 존재하에서 인지질과 결합한 경우에 표면 장력-저하 필름을 형성시킨다. 본 발명은 또한 사람 및 개의 32K 및 10K ASP를 포함하는 포유동물의 ASP를 코드화하는 DNA 서열, 이들 단백질의 제조에 적절한 발현 벡터, 이들 벡터로 형질전환시킨 재조합 숙주세포, 및 재조합 ASP 및 이의 전구물질의 제조방법에 관한 것이다. 다른 관점에서, 본 발명은 사람의 ASP를 함유하는 약제학적 조성물 및 이를 사용하여 RDS를 치료하는 방법에 관한 것이다.

[본 발명의 수행형태]

[A. 정의]

명세서에서 사용된 "폐포 계면활성 단백질(ASP)"이란, 이하에서 정의할 바와 같은 ASP활성을 가지며 폐 계면활성 복합물과 연관된 아포단백질을 지칭한다. 조사한 모든 종류의 ASP는 하나 이상의 비교적 고분자량의 성분(이하에서는 "32K ASP"로 표시)과 하나이상의 비교적 저분자량의 완전 소수성 성분(이하에서는 "10K ASP"로 표시)으로 이루어진 것으로 나타났다[참조 : King, R. J. 등의 J. Appl Physiol(1977) 42 : 483-491 ; Phizackerley, P.J.R., Biochem J(1979) 183 : 731-736]. 이들 용어는 순수(천연) 서열 및 이의 등가변형 서열 모두에 적용된다. 예를 들어, 사람의 32K ASP는 제3도에 나타난 아미노산 서열을 갖는다. 다른 종류(예를 들어, 개, 원숭이 또는 기타 포유동물)로부터 유도된 32K ASP 단백질은 이들 서열과 거의 상동한 서열을 갖는다(참조 : 개의 ASP에 관한 제1도). 다른 특징 32K ASP(개) 및 10K ASP(사람 및 개)의 다른 서열에 대해서는 후술한다.

본 발명의 재조합 ASP 단백질은 순수 단백질의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, 활성이 파괴되지 않는 한도내에서 제한된 변형이 가능하여 전체주구조의 요구될 수 있다는 것을 인지하여야 한다. 예를 들어, 본 발명의 사람의 ASP 32K 재조합 단백질은 제3도에 나타난 것과 거의 유사한 아미노산 서열을 가지나, 활성을 파괴하지 않는 범위내의, 이러한 서열의 일부 변형도 32K 사람 ASP의 정의내 및 청구한 단백질의 정의내에 포함되며, 이는 후술할 것이다. 또한, 활성을 보유한, 제3도의 전체 서열의 분획도 정의내에 포함된다.

모두 단백질의 경우와 마찬가지로, ASP 단백질은, 그의 제조방법에 따라, 또는 용액형태일 경우 그의 환경에 따라, 중성형태 또는 염기 또는 산부가염 형태로 존재할 수 있다. 따라서, 일반적인 단백질 및 특히 모든 ASP는 유리아미노그룹을 함유한 산부가염형태 또는 유리카복실그룹으로부터 형성된 염기부가염으로 존재할 수 있다. 사실, 약학적으로 무독한 염은 단백질의 작용성을 증강시킬 수 있다. 적합한 약학적으로 무독한 산부가염에는 무기산(예를 들어, 염산 또는 황산) 또는 유기산(예를 들어, 아세트산 또는 글리콜산)으로부터 형성된 염이 포함된다. 약학적으로 무독한 염기에는 알칼리 수산화물(예를 들어, 수산화칼륨 또는 수산화나트륨) 또는 유기 염기(예를 들어, 피페리딘, 글루코사민, 트리메틸아민, 콜린 또는 카페인이 포함된다. 덧붙여, 단백질은 다른 생리학적 물질(예를 들어, 당류 및 치질)과 혼합하거나, 측쇄를 변형(예를 들어, 아미노그룹의 아세틸화, 하이드록실측쇄의 인산화 또는 설프하이드릴그룹의 산화)시키거나, 암호화된 주(primary)서열을 달리 변형시킴으로서 변형시킬 수 있다. 사실, 그의 순수형태인 경우, 32K ASP는 글리코실화 단백질이며 특정 암호화 프롤린 잔기는 하이드록시-프롤린으로 전환된다. 또는 이것은 인지질 DPPC 및 PG와 연관하여 발견되기도 한다. 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 형태, 하드드록실화되거나 하이드록실화되지 않은 형태, 아포단백질 단독 또는 지질과 혼합된 형태의 아포단백질 및 요컨대, 혈액과 폐공기 사이의 가스교환을 용이하게 하고 폐포의 재팽창을 가능케하는 능력을 보유한 순수 서열의 것과 거의 유사한 아미노산 서열을 갖는 모든 조성이 모든 ASP의 정의에 포함된다.

또한 주 아미노산 서열의 일부 변형으로 인해, 순수 서열과 비교하여 거의 동등하거나 증가된 활성을 갖는 단백질이 생성된 다른것을 인지하여야 한다. 이들 변형은 부위-유도변이유발을 통한 경우와 같이 심각한 것일 수도 있고, ASP-생성 유기체인 숙주의 돌연변이를 통할 경우와 같이 우연적일 수도 있다. 이들 변형 모두는, ASA활성이 보유되는한, 포함된다.

단백질에 대한 "ASP활성"은 단독으로 또는 다른 단백질과 혼합한 형태로 지질과 혼합시 하기 문헌에 기술된 생체내 시험에서 활성을 나타내는 능력으로 정의된다[참조 : Robertson, B. lung(1980) 158 : 57-68]. 이 시험에서는, 시험할 샘플을, 제왕절개술에 의해 미성숙단계에서 분만시킨 토끼 또는 양의 태아에 기관내 튜브를 통해 투여한다. (이들 미숙자는 자체의 ASP가 없으며, 이들 미숙자를 환풍기상에 놓는다). 폐활량, 혈액중 가스량 및 환풍기압력을 측정하여 활성의 지표로 삼는다. 활성의 예비평가는 하기 문헌에 기술된 시험관내 시험으로도 행할 수 있다[참조 : King, R.J., 등의 Am J. PhysiaL(1972) 223 : 715-726 : 또는 단백질을 인지질 소포제제와 함께 혼합시 공기-물 계면으로의 표면장력을 간단히 측정하는데 이용하는 후술할 Hawgood 등의 문헌] "작용적으로 연결된(operably linked)"이란, 성분들이 그들의 통상기능을 수행할 수 있도록 배열된 병렬(juxtaposition)을 의미한다. 따라서, 암호화 서열에 작용적으로 연결된 대조 서열은 암호 서열의 발현을 수행할 수 있다.

"대조 서열(control sequence)"이란, 목적한 암호 서열에 적절히 연결시킬 경우, 이 서열이 허용되는 숙주내에서 그의 발현을 수행할 수 있는 DNA 서열(들)을 의미한다. 이런 대조 서열에는 진핵 및 원핵 숙주에서 프로모터가 포함되며, 또한 진핵유기체에서 리보솜 결합부위 서열 및 원핵 유기체에서 말단 신호가 포함된다. 이어서 발현을 수행하는데 필수적이거나 도움을 주는 다른 요소를 동정할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바대로, "조절 서열(control sequences)"은 간단히, 사용되는 특정 숙주에서 발현을 수행하는데 필요한 모든 DNA 서열에 관한 것이다.

"세포" 또는 "재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 때때로 내용에서 명백해지는 바대로 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 직접적인 대상 세포 및, 물론, 그들의 자손도 포함한다. 돌연변이 또는 환경차이의 가능성 때문에, 모든 자손이 모(parent)세포와 정확하게 동일하지는 않다고 이해된다. 그러나, 상기 용어가 사용되는 경우, 그러한 변화된 자손도 포함된다.

[B. 일반적인 설명]

ASP를 암호화는 DNA 서열을 수득하는 하기 설명된 방법은 단지 설명하기 위한 것이며, 사용될 수 있는 그러한 방법중의 대표적인 것이다. 그러나, 본 분야에서 이해되는 바대로, 다른 방법도 사용될 수 있다.

[B. 1. 계면활성 복합체의 속성]

폐의 기포 표면은 다수의 기술 및 다수의 그룹에 의해 광범위하게 연구되어 오고 있다. 기포의 기저막은 I형 및 II형 기포 세포(이중에서 II형 세포는 표면 약 3%를 함유한다)로 이루어짐이 명백하다. II형 세포는 기저막을 덮고 있는 유체내층(lining fluid layer)내로 물질을 외분비하는 역할을 하는데, 여기에서 물질은 내층의 액체와 함유되어 있는 용적의 가스상의 표면장력을 감소시킨다. 다음, 유체층은 기포 모세관의 혈장으로부터 유도된 물, 및 II형 세포의 표면 분비물로 이루어진다.

II형 세포 자체는 세포당 단백질 60-100pg 및 인지질 약 1pg를 함유하며, 여기에서 II형 세포 DPPC와 PG인 사이의 비는 약 8 : 1이다. 아포단백질성분의 연구는 여러 종으로부터의 폐 세정을 기본으로 하고 있으며, 하기 논의하는 바대로, 분자량 약 10-20kd 및 32kd의 2개의 주 단백질로 이루어진 것으로 알려져 있다[참조 : kikkawa, Y., et al, Labor atory Investig ation(1983) 49 : 122-139]. 아포단백질이 인지질 성분에 결합되어 있는지[참조 : King, R,J., et al, Am Rev Respir Dis(1974) 110 : 273] 또는 결합되어 있지 않는지[참조 : Shelly, S.A., et al, J Lipid Res(1975) 16 : 224]는 명확하지 않다.

개의 폐 세정으로 수득하여 겔 전기 영동으로 분리시킨 고분자량 단백질이 분자량 29,000, 32,000, 및 36,000달톤의 3개의 주 성분으로 이루어져 있다는 것을 알았다.[참조 : 1984년 10월 26일자로 출원된 미합중국 특허원 제665,018호(동일 양도인에게 양도), 본 명세서에 참조문헌으로 인용] 32,000달톤 단백질을 사용하여 하기 기술하는 바의 서열 자료를 수득한다 : 그러나, 이들 단백질 3개 모두는 동일한 N-말단 서열을 가지며, 그들이 단지 글리코실화 정도만 다르다는 것이 명백하다. 36kd 및 32kd 밴드를 엔도글리코시다제 F로 분해시켜, 탄수화물 측쇄를 제거하면, 29kd 성분과 함께 이동하는 (co-migrate)생성물이 수득된다. 29kd 성분의 이동성은 이 처리에 영향받지 않는다. 32kd 분획이 다이머(dimers) 및 트리머(trimers)로 집성하는 것도 알 수 있다.

저 분자량 단백질은 더욱 어렵게 추출하지만, 이들도 혼합물형태로 나타난다[참조 : Phizackerley, et al(상기 참조) : 하기 설명].

[B. 2. 개 및 사람 ASP 단백질에 대한 코드화 서열의 클로닝]

완전한 개 및 인체 ASP 32K 단백질 암호화 서열은 클로닝되며, 하기 11c에서 볼 수 있는 바대로 다양한 숙주 세포에서 발현가능하다. 또한, 사람 및 개 공급원 둘다로부터의 몇개의 저분자량 단백질을 암호화하는 DNA 서열도 수득된다.

개의 32K 서열은 성년 개의 폐로부터 분리시킨 mRNA로부터, 2세트의 합성 올리고뉴클레오타이드(이것은 N-말단 서열의 아미노산 1-5 및 그러한 서열의 다른 아미노산 7-11 뿐만아니라 포유동물 코돈 우선을 기본으로 하여 선택된, 아미노산 1-5를 코드화하는 단일 15-머를 코드화하는 모든 가능한 서열을 수용하여 제조한 것이다)로 탐침시켜 제조한 cDNA 도서관으로부터 수득한다. 이 콜라이내에 제조되어 있는 도서관으로부터의 고정화 cDNA는 이들 올리고뉴클레오타이드 세트를 사용하여 탐침한다. 가짜 양성은 하나 이상의 세트에 하이브리드화시켜 최소화한다. 성공적인 하이브리드화 클론을 서열화시키면, 정확한 N-말단 서열을 함유함을 알 수 있다.

성공적인 클론으로부터의 cDNA 삽입물을 Pst I으로 절단한 다음, 원래의 개 cDNA 도서관의 탐침으로 사용하여, 이 탐침과 함께 개의 32K ASP의 완전한 코드화 서열을 함유하는 844 뉴클레오타이드를 연결하는 ASP의 다른 부위를 코드화하는 삽입물을 함유하는 2개의 추가의 클론을 수득한다. 3개의 적절한 삽입물의 완전한 뉴클레오타이드 서열, 및 추론되는 256 아미노산 서열을 제1도에 나타내었다.

상기 사용된 이 동일한 원래 회수된 N-말단 암호화 단편도 탐침으로 사용하여 λ 파지 캐론(Charon)28에서 인체 게놈 도서관으로부터의 단편을 수득한다. 인체 ASP 32K 단백질에 대한 완전한 암호화 서열은 단일 파지 플라그내에 함유되어 있고 : 2개의 인접 BamHI 단편, 5' 1.2kb 및 3' 3.5kb 단편내에 함유되어 있다고 밝혀졌다. 인에 ASP를 암호화하고 3인트론을 함유하는 이들 단편의 적절한 부위는 제3도에 나타내었고 ; 추론되는 인체 ASP의 아미노산 서열은 228 아미노산을 함유하고 적어도 25 아미노산의 신호서열에 의해 진행된다. 완전 길이 단백질에 상응하는 인체 32K ASP cDNA는 사람 태아 및 성인의 폐 mRNA로부터 유도된 사람 cDNA 도서관을 탐침시켜 수득한다.

개와 사람의 32 아미노산 서열 사이에는 광범위한 상동관계가 존재한다.

사람 및 개의 10K ASP를 암호화하는 cDNA를 수득하는데는 유사한 방법을 사용한다. 상기 기술된 개의 폐 cDNA 도서관을 16.5kd(환원되지 않은 겔 상에서) 개의 단백질의 N-말단 아미노산 서열에 상응하도록 고안된 2개의 합성 올리고머 혼합물로 탐침하고, 양 탐침으로 하이브리드화되는 클론을 회수하여 서열화한다. 개의 ASP 코드화 서열을 함유하는 이들 클론중 하나를 사용하여, 성인 사람 폐로부터 분리시킨 mRNA로부터 박테리오파지 gt10에서 제조된 cDNA 도서관을 탐침하여 사람 10K ASP 코드화클론을 수득한다.

[B. 3. ASP의 발현]

다양한 사람 및 개의 ASP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 현재 이용할 수 있는 바, 이들은 11C에서 볼 수 있는 바대로 다양한 시스템에서 발현될 수 있다. 원시핵 시스템을 사용하는 경우, 인트론이 없는 암호화 서열을 적절한 조절 서열과 함께 사용한다. 상기 ASP 단백질 중 어느 하나에 대한 cDNA 클론을 적절한 제한 효소로 절단하여, 그러한 발현을 위해 원핵 벡터내에서 연결시킬 수 있다. ASP 게놈 DNA의 원핵 발현을 위해, DNA를 부위-지시된 돌연변이 생성에 의하거나, cDNA의 상응하는 부분을 정정하고 인트론-함유 게놈 서열에 대해 그것들을 치환시킴으로써 변형시켜 인트론을 제거해야 한다. 그 다음, 인트론이 없는 암호화 DNA를 원핵 발현을 위한 발현 벡터에로 결합시킨다.

하기에 예를 든 바와 같이, ASP 암호화 서열은 인트론을 가공할 수 있는 발현시스템, 보통 포유류 숙주 세포 배지 내에서 직접 사용할 수 있다. 이러한 발현을 이루기 위해서는, 게놈 서열은 CHO 세포중의 이들 서열의 발현을 조절하는 조절 가능한 포유류 프로모터의 하부에 결합시킬 수 있다.

[B. 4. 단백질 회수]

ASP 단백질은 완전 단백질 또는 융합 단백질로서 생성시키거나, 분비를 위한 이 서열을 프로세싱(processing) 할 수 있는 세포내의 신호 서열과 함께 생성시킬 수 있다. 단백질의 분비물을 수득하는 것은 바람직하며, 이로써 정제에 있어서의 어려움이 최소화된다. 따라서 적당히 프로세싱할 수 있는 세포내의 음성 신호 서열을 위한 코돈을 함유하는 사람 ASP 유전자를 발현시키는 것이 바람직하다. 배양된 포유류 세포는 신호 서열을 함유하는 이종 포유류 단백질을 분열 및 프로세싱 할 수 있다(McCormick, F., et al, Mol cell Biol(1984) 4 : 166).

배지 중으로 분비되는 경우, ASP 단백질은 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 회수한다. 정제 방법은, 비교적 소수의 단백질이 배지 중으로 분비되며 그러므로 분비된 단백질은 이미 ASP일 것이기 때문에 간단하게 된다. 하지만, 그 절차가 좀더 힘든 한편, 융합 또는 완전 형태로 세포내적으로 생성되는 세포의 초음파 처리물 또는 용균물로부터 이 단백질을 정제하는 것은 본 분야에 공지된 방법이다.

[B. 5. ASP 활성에 대한 분석]

시험관내 방법은 수성/공기 접촉면 상에 필름을 생성시키도록 표면 장력을 감소시킴으로써(표면 압력을 증가시키는 것과 같음)작용에 대한 ASP 단백질의 능력을 평가하는 것으로 고안되었다. 이들 방법을 사용하는 연구는 분리된 고유의 10K 개 ASP 상에서 수행되었다(Benson, B.J., et al Prog Resp Res(1984) 18 : 83-92 : Hagwood, S., et al, Biochemistry(1985) 24 : 184-190).

생체내에서의 계면활성제 복합물의 작용이 표면 장력을 감소시키기 위하여 공기/수성 접촉면에 필름을 생성시키는 것이기 때문에, 실험관 내 모델에서의 이러한 표면에 지질 또는 지질 단백질의 살포에 의해 생성된 필름의 형성을 증가시키는 ASP 단백질의 능력을 확실히 그것의 이용성에 관련된다.

[B. 6. 투여 및 사용]

정제된 단백질은, 유아 또는 성인의 호흡기 질환 증후군의 치료를 위한 투여에 적정하게 단독으로 및 약학적 조성물 중에 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물 및 단백질 생성물은 폐렴 및 기관지염과 같은 관련된 호흡기 질환을 치료하는데 유용하다. 이러한 치료에 사용하기 위해서, 성분 둘다, 바람직하게는 32K 성분을, 단독으로 또는 바람직하게는 사람 ASP의 10K 성분과 혼합하여, 계면활성제 복합물을 재구성하도록 천연 또는 합성 지질과 혼합한다. 복합물은 지질 약 50% 내지 거의 100%(wt/wt) 및 ASP 50% 내지 1% 미만, 바람직하게는 5% 내지 20%를 함유한다. 지질 부분을 바람직하게는 나머지가 포화된 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 트리아실글리세롤, 팔미트산 또는 이들의 혼합물인 DPPC 80% 내지 90%(wt/wt)이다. 복합물은 ASP의 용액을 지질 리포솜의 현탁액과 혼합하거나 세재 또는 유기용매의 존재하에 직접 지질 단백질 용액을 혼합함으로써 재조합된다. 그 다음, 세재 또는 용매는 투석에 의해 제거할 수 있다.

복합물을 재구성함에 있어서 폐 세척으로부터 천연 지질 성분을 이용하고 ASP 단백질의 적당량으로 그것을 보충하는 것이 가능한 한편, 합성 지질의 사용이 확실히 바람직하다. 첫째, 적당한 공급의 문제가 있는 것은 자명한 것이다. 둘째, 천연 지질이 분리되는 폐에 존재할 수 있는 감염성 단백질을 포함하는 이종의 단백질에 의한 제제의 정제 및 오염으로부터의 탈피는 단지 합성 제제내에서만 확보된다. 물론, 유효한 복합물의 재구성은 합성 성분을 사용하는 경우 더 어렵게 된다.

32K 사람 ASP는 조성물의 단백질 성분으로서 단독으로 사용될 수 있는 한편, 32K와 10K 단백질의 배합이 바람직하다. 단백질 비율은 통상적으로 32K : 10K 그룹에 대해서 80 : 20의 방법이다. 32K 단백질은 수용액 중의 인지질 소포(vesicle)의 수성 현탁액에 직접 첨가될 수 있다 : 그것이 매우 소수성이기 때문에, 10K 단백질을 클로로포름과 같은 유기용매 중의 지질에 첨가되고, 용매는 증발되며 소포는 수화에 의해 재-형성된다.

복합물을 함유하는 조성물은 바람직하게는 기관내 투여(즉, 일반적으로 액체 현탁제, 무수 분말제 "진애" 또는 에어러솔러서)에 적합한 것들이다. 직접 기관내 투여를 위해서, 복합물은 예를 들어 물, 염수, 덱스트로스, 또는 글리세롤과 같은 적합한 부형제와 함께 액체중에 현탁시킨다. 또한, 조성물은 pH 완충제(예를 들면, 아세트산 나트륨 또는 인산염)와 같은 비-독성 보조물질을 소량 함유할 수 있다. "진애"를 제조하기 위해서는, 임의로 상기와 같이 혼합된 복합물을 동결건조시키고, 무수 분말로서 회수한다.

에어러솔 투여로 사용되는 경우, 복합물은 추가의 계면활성제 및 포사약과 함께 미세하게 분쇄된 형태로 공급된다. 투여할 수 있는 대표적인 계면활성제는 지방산 및 에스테르이지만, 본 발명의 경우에는, 계면활성제 복합물의 다른 성분들, DPPC 및 PG를 사용하는 것이 바람직하다. 유용한 포사약은 통상적으로 주변 조건에서 기체이며, 압력하에서 농축된다. 저급알칸 및 플루오르화 알칸(예를 들면, 프레온)이 사용될 수 있다. 에어러솔은, 성분들이 방출될 때까지 압력하에서 유지될 수 있도록 적합한 밸브가 장치된 용기내에 포장한다.

계면활성 봉합체는 기관내 튜브에 의해, 연무투여에 의해, 또는 현탁액 또는 흡입가스내로 진애의 분무화에 의해, 적절한 투여형태로 투여한다. 복합체 약 0.1mg 내지 10mg을 1회에 투여한다. 신생유아에 사용할 경우는 1회 투여도 일반적으로 충분하다. 성인의 경우는 충분한 재구성된 복합체를 일정수준의 결핍을 대체하기 위해 투여한다[참조 : Hallman, M., et al, J Clinical Investigation(1982) 70 : 673-682)].

[C. 표준방법]

세포를 형질전환하고, 벡터를 구성하고, 전령 RNA를 추출하고, cDNA 도서관을 준비하는 등에 사용되는 대부분의 기술은 당분야에 널리 실시되고 있으며 많은 관련 업자들은 특수한 조건 및 절차를 기술하는 표준자원 물질을 잘 알고 있다. 그러나 편의상 다음 설명을 참고로 소개한다.

[C. 1. 숙주 및 대조 서열]

원핵계 및 친핵계는 APS 암호화 서열을 나타내기 위해 사용할 수 있으며, 친핵숙주는 클로닝 순서에 가장 편리하다. 원핵생물은 흔히 이.콜라이의 여러자기 균주로 표현되지만, 다른 미생물 균주도 사용될 수 있다. 숙주에 적합한 종으로부터 유도된 복제 부위 및 대조 서열을 포함하는 플라스미드 벡터도 사용되며, 예를 들면 이.콜라이는 pBR 322유도체를 사용하며 형질전환되며, 플라스미드는 볼리바 등의 문헌(Bolivar, et al, Gene(1977) 2 : 95)에 의한 이.콜라이 종으로부터 유도된다. pBR 322는 암피실린 밑 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하며, 따라서 목적한 벡터를 구성하는데 보유 또는 파괴될 수 있는 부수적인 마커(markers) 유전자를 제공한다.

리보솜 결합부위 서열과 함께, 경우에 따라 오퍼레이터와, 전사개시용 프로모터를 포함하는 것으로 여기에 정의된 통상 사용되는 원핵 대조 서열은 베타-락타마제(페니실리나제) 및 락토스(lac) 프로모터계(Chang, et al, Nature(1977) 198 : 1056) 및 트립토판(trp) 프로모터계(Goeddel, et al, Nucleic Acid Res(1980) 8 : 4057) 및 람다 유도된 Pc 프로모터 및 N-유전자 리보솜 결합부위(Shimatake, et al, Nature(1981) 292:128)로서 통상 사용되는 프로모터를 사용한다.

세균 외에도, 효모와 같은 진핵 미생물도 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 사카로마이세스 새리비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 실험균주 베이커의 효모는 다수의 다른 균주도 통상 구할 수 있지만 가장 널리 사용된다. 예를 들면 복제의 2μ기원(Broach, J.R., Meth Enz(1983) 101 : 307), 또는 다른 효모의 적절한 복제기원(참조 : 예를 들면, Stinchcomb, et al, Nature(1979) 282 : 39, Tschempe, et al, Gene(1980) 10 : 157 and Clarke, et al, Meth Enz(1983) 101:300)을 사용하는 벡터도 사용할 수 있다. 효모 벡터의 조절 서열은 당 분해효소의 합성용 프로모터를 포함한다(Hees, et al, J Adv Enzyme Req(1968) 7 : 149 : Holland, et al. Biochemistry(1978) 17 : 4900). 당 분야에 공지된 추가의 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제용 프로모터(Hitzeman, et al, J Biol 초드(1980) 255 : 2073) 및 기타 당 분해효소용 프로모터를 포함한다. 성장 조건으로 조절된 복제의 부수적인 잇점을 갖는 다른 프로모터는 알콜 디하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산포스파타제, 질소대사와 관련된 분해효소 및 말토스 및 갈락토스 사용과 관련된 효소에 대한 프로모터 부류이다. 종결 서열은 암호화 서열의 3 말단에서 바람직한 것으로 믿어진다. 이러한 종결은 효모-유도된 유전자 내에서 암호화 서열 다음의 3' 비해독 부위에서 발견되었다.

또한, 다세포 유도체로부터 유도된 진핵 숙주 세포 배양물에서 폴리펩타이드 암호화 유전자를 발현할 수 있음도 물론이다.[참조 : 예를 들면, Tissue Cultures, Academic Press, Cruz and Patterson, editors(1973)]. 이들 시스템은 인트론을 결실시키는 능력을 가진 추가의 잇점이 있으므로 게놈 단편을 표현하기 위해 직접 사용할 수 있다. 유용한 숙주 세포주는 VERO 및 HeLa 세포 및 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다. 이러한 세포에 대해 벡터란 표현은 원래 프로모터 및 포유류 세포에 적합한 조절 서열, 예를 들면 통상 사용되는 시미안 비루스 40(SV 40)으로부터의 프로모터(Fiers, et al, Nature(1978) 273 : 13), 또는 기타 바이러스 프로모터(예, 폴리오마로부터 유도된 것), 아데노 바이러스 2, 소의 파필로마 바이러스, 또는 조류의 육종 바이러스를 포함한다. 조절 가능한 프로모터, hMTII(Karin, M., et al, Nature(1982) 299 : 797-802)도 또한 사용될 수 있다. 유두염 세포 숙주계 변형의 일반적 설명은 악셀(Axel)의 미합중국 특허 제4,399,216호(1983.8.16)에 기술되어 있다. 또한, "인헨서(enhancer)" 부위는 최적 표현으로 중요한 것으로 보인다. 이들은 일반적으로 비-암호화 DNA 부위에서 프로모터 부위의 상부 또는 하부에서 발견되는 서열이다. 복제의 기원은 필요에 따라 바이러스원으로부터 얻을 수 있다. 그러나 염색체로의 통합은 진핵 생물에서 DNA 복제시 통상의 기작이다.

[C. 2. 형질전환]

사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이 세포에 적절한 표준기술을 사용하여 행한다. 참고문헌(Cohen, So No, Proc Natl Acad Sci(USA)(1972) 69 : 2110)에 기술된 바와 같은 염화칼슘을 사용하는 칼슘처리, 또는 참고문헌(Maniatis, et al, Molecular Cloning : A Laboratry Manual(1982) Cold Spring Harbor Press, P.354)에 기술된 RbCl₂방법은 원핵 생물, 또는 실제적인 장애를 함유하는 다른 세포에 사용할 수 있다. 이러한 세포벽이 없는 유두염 세포의 경우, 경우에 따라 위글러 엠, 등의 문헌(Wigler, M., et al, Cell(1979) 16 : 777-785)에 의해 개선된 바와 같이, 참고문헌(Graham and Van der Eb, Virology(1978) 52 : 546)의 인산칼슘 침전법이 사용될 수 있다. 효모로의 형질전환은 반 솔리겐 피. 등의 문헌(Van Solingen, P., et al, J Bact91977) 130 : 946) 또는 히시아오 씨.엘.등의 문헌(Hsiao, C.L., et al, Proc Natl Acad Sci(USA)(1979) 76 : 3829)의 방법에 따라 수행할 수 있다.

[C. 3. 탐침용 cDNA 또는 게놈 도서관]

cDNA 또는 게놈 도서관을 콜로니 하이브리드화 방법에 의해 선별한다 각각의 마이크로티어 플레이트를 이중 니트로셀룰로오스 필터 페이퍼(S&S 형태 BA-85)상에 복제시키고, 콜로니를 15㎍/ml 테트라사이클린 함유 L 한천 상에서 14 내지 16시간 동안 37℃에서 생장시킨다. 콜로니를 10% SD로 용균시키고, DNA를 5분간에 걸쳐서 500mM NaOH/1.5M NaCl 0.5M 트리스 HCl(pH8.0)/1.5M NaCl 및 2×표준염수 시트레이트(SSC)로 차례로 처리하여 필터에 고정시킨다. 필터를 공기 건조시키고, 80℃에서 2시간동안 열건조시킨다.

닉크-해독된 탐침을 위하여, 상기 이중필터를 42℃에서 16 내지 18시간 동안 필터당 10ml의 DNA 하이브리드화 완충액[50% 포름아마이드(감소된 엄격성의 경우 40% 포름아마이드), 5×SSC, pH 7.0, 5×덴하르트 용액(Denhardt's Solution : 폴리비닐 피롤리딘과, Ficoll 및 소혈청 알부민 : 1×=각각 0.02%), 50mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 7.0 0.2% SDS, 50㎍/ml 효모 tRNA, 및 50㎍/ml 변성 및 변형 연어정자 DNA]로 예비하이브리드화시킨다.

샘플을, 5ml의 동일한 DNA 하이브리드화 완충액 중에 함유된 이종의 경우 37℃에서 그리고 동종의 경우 42℃에서 12 내지 36시간 동안 닉크-해독된 DNA 탐침으로 하이브리드화시킨다. 필터를, 동종 하이브리드화의 경우 50℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS 그리고 이종 하이브리드화의 경우 50℃에서 3×SSC, 0.1% SDS 중에서 30분간에 걸쳐 2회 세척한다. 필터를 공기건조시키고, -70℃에서 1 내지 3일간 자동 방사선 사진 처리한다.

합성(15 내지 30mer) 올리고뉴클레오타이드 탐침을 위하여, 언급된 이중 필터를 42℃에서 2내지 8시간 동안 필터당 10ml의 올리고-하이브리드화 완충액(6×SSC, 0.1% SDS, 1mM EDTA, 5×Denhar, 0.05 나트륨 피로포스페이트 및 50㎍/ml 변성 및 변형 연어 정자 DNA)로 예비하이브리드화 시킨다.

샘플을, 올리고뉴클레오타이드의 조성에 따르는 조건하에 15 내지 30 뉴클레오타이드의 키나제 처리 올리고뉴클레오타이드 탐침으로 하이브리드화 시킨다. 통상의 조건은, 24 내지 36시간 동안 30°내지 42℃의 온도와 동일한 올리고-하이브리드화 완충액 함유 탐침을 사용하는 것이다. 필터를, 6×SSC, 0.1% SDS 및 50mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH7)으로 15분간에 걸쳐서 23℃에서 2회 세척하고, 계산된 하이브리드화 온도에서 6×SSC 및 0.1% SDS로 2분간 걸쳐서 1회세척하고, 공기 건조시킨 다음, -70℃에서 2 내지 3일간 자동 방사선 사진 처리한다.

[C. 4. cDNA 도서관 제조]

송아지 흉선 터미날 트랜스퍼라제(Sutcliffe, J.G., Nuclerc Acid Res(1978) 5 : 2721-2732)에 의한 호모폴리머릭 테일링을 사용하여 플라스미드 벡터 pBR 322내로 삽입되도록 2 본쇄 cDNA를 합성하고 제조한다. 5㎍ mRNA상에 올리고(dT) 12-18을 프라이머로 하여 조류의 골수 아구중 바이러스로부터 RNA-의존 DNA 폴리머라제에 의하여 첫번째 cDNA를 합성한다. 이어서, 100℃에서 5분간에 걸친 변성에 의해 초기의 DNA 본쇄로부터 RNA 주형을 분리시키고 빙냉시킨다. 두번재 본쇄 DNA는, 첫번째 본쇄 분자의 3'-말단에서의 자체 프라이밍(Priming)에 의존하는 이.콜라이의 DNA 폴리머라제 I의 큰 단편을 사용하여 합성한다. 이에 의하여 2본쇄 헤어핀 DNA를 수득한다. 이들 분자는 개구-종결 말단에 평활-말단을 가지며, 헤어핀 루프는 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae)로부터의 S₁뉴클레아제로 개구 분해된다. 2본쇄 cDNA의 S₁뉴클레아제 분해는 600단위 효소와 함께 37℃에서 30분간 300mM NaCl, 30mM NaOAC, pH 4.5, 3mM ZnCl₂중에서 수행한다. cDNA는 페놀 : 클로로포름으로 추출하고, 작은 올리고뉴클레오타이드는 암모늄 아세테이트의 존재하에 3회의 에탄올 침전 처리로 제거한다.

이러한 처리는 다음과 같이 수행한다 : 0.5 용적의 7.5M 암모늄 아세테이트와 2용적의 에탄올을 cDNA 용액에 가하고, -70℃에서 침전시킨다. 이어서, 평활 말단의 2본쇄 cDNA를, 컬럼(0.3×14cm) 세파로스 4B(Pharmacia Fine Chemicals, Piscatawa, NJ)를 통한 겔 여과를 사용하여 분리하거나, 5 내지 20% 글리세롤 구배중에서의 초원심분리 그리고 후속되는 구배의 분리에 의하여 분리한다. 바람직한 길이 예를 들어 300염기쌍보다 더 큰 cDNA는 보유시키고 70% 에탄올로 침전시켜 회수한다. 데옥시사이톡신의 짧은 (10 내지 30 뉴클레오타이드) 폴리머릭 테일은 0.2M 칼륨 카코딜레이트, 25mM 트리스, pH 6.9, 2mM 디티오트레이톨, 0.5mM CoCl₂, 200mM cDTP, 400㎍/ml BSA, 및 40단위 송아지 흉선 터미날 데옥시튜클레오타이드 트랜스퍼라제를 사용하는 5분간에 걸친 22℃에서의 반응에 의하여 cDNA의 3'-말단에 첨가한다. 반응물을 페놀 : 클로로포름으로 추출하고, 작은 올리고뉴클레오타이드를 암모늄 아세테이트의 존재하에 3회의 에탄올 침전처리에 의해 제거한다.

dC-테일 cDNA를, Pst I으로 분리처리하고 올리고 dG로 테일링한 pBR 322로 결합시킨다. 2.5㎍ pBR 322-dG DNA를 벡터 농도 5㎍/ml에서 cDNA로 어닐링하고, 하이브리드를 하기 참조문헌에 기술된 CaCl₂처리에 의하여 이.콜라이 MC 1061내로 전이시킨다.

[C. 5. 벡터 구성]

목적하는 암호화 서열 및 조절 서열을 함유하는 적절한 벡터의 구성에는 본 분야에서 공지된 표준 연결 및 제한 기술이 이용된다. 분리된 플라스미드, DNA 서열, 또는 합성 올리고뉴클레오타이드를 절단하고, 말단 부가하여 원하는 형태로 재연결한다.

일반적으로 본 분야에서 공지된 조건하에서 적절한 제한 효소(들)로 처리하여 특정 DNA 부위를 절단하는데, 그러한 조건의 상세한 설명은 시판되고 있는 이들 제한 효소들의 제조업자에 의해 기술되어 있다[참조 : New England Biolabs, Product Catalog]. 일반적으로, 플라스미드 또는 DNA 서열 약 1㎍을 완충액 약 20㎍중에서 효소 1단위로 절단하며, 본 명세서의 실시예에서는, 대표적으로 과량의 제한 효소를 사용하여 DNA 기질을 완전히 분해시킬 수 있다. 배양시간은 약 37℃에서 약 1시간 내지 2시간이면 가능하지만, 변화시킬 수 있다. 배양후에는 매번 페놀/클로로프롬으로 추출하여 단백질을 제거하고, 계속해서 에테르로 추출할 수 있으며, 에탄올로 침전시켜 수성획분으로부터 헥산을 회수한다. 경우에 따라, 절단된 단편은 표준 기술을 사용하여 폴리아실아마이드 겔 또는 아가로스겔 전기영동에 의해 선별분리할 수 있다. 선별분리 방법의 일반적인 설명은 문헌[Methods in Enzymology(1980) 65 : 499-560]에 기술되어 있다.

제한 절단된 단편은 4개의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재하에, 50mM 트리스(pH 7.6), 50mM NaCl, 6mM MgCl₂, 6mM DTT 및 5내지 10μM dNTP중, 20 내지 25℃에서 약 158 내지 25분간에 배양시간을 사용하여 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I(Klenow)의 거대 단편으로 처리함으로써 평활 말단화할 수 있다. 클레나우 단편은, 4개의 dNTP가 존재할지라도, 5'접착 말단을 채우지만 돌출되어 있는 3' 1본쇄는 역으로 절단한다. 경우에 따라, 접착 말단의 성질에 따르는 한도내에서 dNTP 또는 선택된 dNTP중의 단하나를 공급함으로써 선택적으로 수복할 수 있다. 클레나우로 처리한 후 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 적절한 조건하에서 S1 뉴콜레아제 또는 Ba1-31로 처리하면 어떠한 1본쇄, 부분이라도 가수분해된다.

합성 올리고뉴클레오타이드는 에피모브 브이. 에이. 등(Efimov.V.A.et al.,)의 방법[Nuclelc Acids Res(1982)6875-6895)에 의해 제조되며, 시판의 자동 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 제조할 수 있다. 어닐링전 또는 표지화하는 동안 1본쇄의 키나제 처리는] 50mM 트리스(pH 7.6), 10mM MgCl₂, 5mM 디티오트레이톨, 1 내지 2mM ATP, 1.7p몰 r³²p-ATP(2.9mCi/밀리몰), 01mM 스페르미딘, 0.1mM EDTA의 존재하에 기질 1n몰에 대해 폴리뉴클레오타이드 과량, 예를 들면 대략 10단위를 사용하여 수행한다.

연결방법은 다음의 표준 조건 및 온도하에 15 내지 50μ1 용적에서 수행된다 : 20mM 트리스-Cl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 33㎍/ml BSA, 10mM Nall 내지 50mM Nall과, 40μM ATP, 0℃의 0.01 내지 0.02(Weiss) 단위 T₄DNA리가제("접착 말단"연결용) 또는 1mM ATP, 14℃의 0.3 내지 0.6(Weiss) 단위 T₄DNA리가제("평활 말단"연결용). 분자간 "점성 말단"연결은 일반적으로 총 DNA 농축물 33 내지 100㎍/ml(총 말단 농도 5 내지 100mM)에서 수행한다. 분자간 평활 말단 연결(일반적으로는 10 내지 30배 몰과량의 링커 사용)은 총 말단 농도 1μM)에서 이루어진다.

"벡터 단편"을 사용하는 벡터 구성법에 있어서, 벡터 단편은 통상적으로 5'-포스페이트를 제거하고 벡터의 재연결을 방지하기 위해서 세균 알칼리성 포스파타제(BAP) 또는 장내 알칼리성 포스타파제(CIP)로 처리한다. 분해반응은 Na⁺및 Mg⁺²의 존재하에, 대략 150mM의 트리스중, pH 8 및 60℃에서 벡터 ㎍당 약 1단위의 BAP 또는 CIP를 사용하여 약 1시간동안 수행한다. 헥산 단편을 회수하고자, 제제물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 또한, 원치않는 단편을 제한 효소를 더 분해시켜 2분 분해시킨 벡터에서 재연결을 방지할 수 있다.

서열 변형이 필요한 cDNA 또는 게놈성 DNA로부터 유도된 벡터부분의 경우에는, 돌연변이 생성을 지시하는 부위 특이적 프라이머를 사용한다. 이러한 것은 제한된 잘못 짝지워짐을 제외하고 목적하는 돌연변이를 나타내도록 돌연변이시킬 1본쇄 파지 DNA에 대해 상보적인 프라이머 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행한다. 간략히 말해서, 합성 올리고뉴클레오타이드는 파지에 대해 상보적인 1본쇄의 합성을 지시하는 프라아머로서 사용되며, 생성된 2본쇄 DNA는 파지-지시 숙주세균으로 형질 전환시킨다. 형질전환된 세균의 배양물을 한천 상부에 평판도 말하면, 파지가 함유되어 있는 단세포에서 플라그가 생성된다.

이론상, 새로운 플라그의 50%는 1본쇄로서 돌연변이된 형태를 갖는 파지를 함유하며,50%는 원래의 서열을 갖는다. 생성된 플라그를, 정확한 쌍은 하이브리드화시키지만 원래의 나선을 갖는 잘못 짝지워진 쌍이 하이브리드화되는 것을 막기에 충분한 온도에서 키나제로 처리된 합성 프라이머로 하이브리드화한다. 다음에는, 탐침으로 하이브리드화한 플라그를 선별하여 배양하고 DNA를 회수한다. 부위 특이적 돌연변이 과정의 상세한 설명은 이하에서 특정 실시예에 기술하였다.

C. 6 구성의 확인 방법

후술하는 구성에 있어서, 플라스미드 구성을 위한 적당한 연결물은, 우선 이.콜라의 균주 MC 1061[Dr.M.Casadaban(Casadaban, M., et al., J Mol Biol(1980) 138 : 179-207)로부터 입수] 또는 다른 적절한 숙주를 연결 혼합물로 형질전환시킴으로써 확인한다. 성공적인 형질전환체는 본 분야에서 인지된 바와같이, 플라스미드 구성 양태에 따라 암피실린, 테트라사이클린 또는 다른 항생물질 내성에 의해 선택하거나 다른 마커를 사용하여 선택한다.

다음에는 형질전환체로부터 클리웰 등의 방법[Clewell, D.B., et al., Proc Natl Acad Sci(USA)(1962) 62 : 1159]에 따라, 임의로는 클로람페니콜 증폭(Clewell, D.B., J.Bacteriol(1972) 110 : 667)에 따라 플라스미드를 제조한다. 분리된 DNA를 제한 분석하고/하거나 상거 등의 디데옥시 방법[Sanger, F., et al, Proc Natl Acad Sci(USA)(1977) 74 : 5463, Messing, et al,에 의해 또한 기술됨(Nucleic Acids Res(1981) 9 : 309)] 또는 막삼 등의 방법[Maxam, et al, Methods in Enzymology(1980) 65 : 499]에 의해 서열화한다.

[C. 7. 예시된 숙주]

본 명세서에서 클로닝 및 발현헤 사용된 숙주 균주는 다음과 같다 : 클로닝과 서열화를 위해 및 대부분의 미생물 프로모터의 조절하에 제조의 발현을 위해, 이.콜라이 균주 MC 1061을 사용한다.

M13파지 재조합체를 위해, 파지 감염에 민감한 이.콜라이 균주, 예를 들어 이.콜라이 균주 JM 101을 사용한다.

발현에 사용된 세포는 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포이다.

[D. ASP의 클로닝 및 발현]

개 및 사람 ASP 단백질은 정제된 형태로 수득된다. 개의 cDNA를 사용하여 사람 ASP 게놈 및 cDNA도 서관을 위한 탐침을 제공한다.

[D. 1. 개 ASP의 정제]

[D. 1. a 계면활성 복합체의 분리]

폐의 계면활성 복합체는 빈혈이 있는 개로부터 수득된 페로부터 제조된다. 세정을 포함한 모든 방법은 4℃에서 수행되며 분리된 물질은 -15℃에서 저장한다.

폐에서 가스를 빼고 5mM 트리스-HCl, 100mM NaCl, pH 7.4완충액 1리터로 3회 세정한다. 이 완충액의 Ca⁺²농도는 5×10^-6M 미만이다(Radiometer F2112cA ; Radiometer A/S, Copenhagen, Denmark), 합체된 폐 세척물을 15분(Sorval RC2-B)동안 150×gav로 회전시켜 세포물질을 제거한다. 상등액을 타이프 15로터(Beckman Instruments)를 사용하여 15시간 동안(Backman L3-40) 20,000×gav로 회전시키고 생성된 펠릿을 1.64M브롬화나트륨을 함유하는 완충액 중에 분산시킨다. 1시간동안 평형시킨후, 현탁액을 SW 28로터(Beckman Instruments)에서 4시간 동안(Beckman L5-50B) 100,000×gav로 회전시킨다. 얇은 막을 완충액 중에 재현탁시키고 1시간(Beckman L5-50B)동안 100,000×gav로 회전시킨다. 이러한 펠릿을 함유하는 혼합물을 이중 증류된 물로 재현탁시킨다.

[D. 1. b. 지질 및 10kd 단백질의 추출]

10 내지 15mg 인지질/ml의 농도로 물중에 재현탁시킨 펠릿을 50배 용적 과량의 n-부탄올 중에 주입하고(Sigrist, H., et al, Biochem Biophys Res Commun(1977) 74 : 178-184) 실온에서 1시간동안 교반시킨다. 20분(Sorval RC2-B)동안 10,000×gav에서 원심분리시킨후 32K ASP를 함유하는 펠릿을 후술할 추가 정제를 위해 회수한다. 단일상인 상등액은 지질 및 저분자량 단백질을 함유한다. 지질을 수득하기 위해서, 상등액을 40℃에서 진공하에 건조시키고 지질을 추출한다(Folch, J., et al, J Biol Chem(1957) 226 : 497-509).

소수성 단백질을 수득하기 위해, 상등액을 로토백(rotovap)에 의해 부탄올을 제거하며 에탄올의 첨가에 의해 추가로 로토백에 의해 건조시킨다. 건조된 잔유물을 0.1N HCl을 함유하는 재증류된 클로로포름중에 현탁시키고 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거한다.

생성용액을 LH-20컬럼(Pharmacia)상에서 크로마토그래피시키고 클로로포름 중에서 전개시킨다(LH-20은 세파덱스 G-50(Sephadex G-50)의 하이드록시프로필 유도체이며 유기용매에 불활성인 소수성 겔이다) 단백질은 제외하고 ; 기질/인지질은 함유된 용적으로부터 용출시킨다.

단백질을 질소하에 클로로포름의 증발에 의해 공급용적 분획으로부터 회수한 다음 폴리아크릴아마이드겔 상에서 크기 분류한다. 비환원 조건하에 시행하면, 16.5kd, 12kd 및 10kd의 세개의 밴드를 수득하고 환원 조건하에서는 10 내지 12kd의 단일의 넓은 밴드를 수득한다.

비환원된 겔로부터 16.5kd 및 12kd 밴드를 에드만 분해에 의해 N-말단 분석을 수행하여 하기 서열을 수득한다 :

16.5kd에 대해 : ?-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr-Cys-Trp-Leu-Cys-Arg-Thr-Leu-Ile-Lys-Arg-Ile-Gle-Ala-Met-Ile-Pro-Lys-Gly-Val-Thr-?-Gly-Gln-

12kd에 대해 : Ile-Pro-Cys-Phe-Pro-Ser-Ser-Leu-Lys-Arg-Leu-Leu-Ile-Ile-Val-Trp

[D. 1. c. 단백질 분획화 및 ASP 32K 단백질로서의 확인]

상기 n-부탄올 추출물로부터 침전물을 질소하에 건조시키고 20mM 옥틸-β-D-글루코피라노사이드를 함유하는 완충액 20ml 중에서 2회 세척한다. 1시간 동안 100,000×gav로 원심분리시킨후(Beckman L5-50B), 펠릿을 얼음상에서 0.3M리튬 디요도 살리실레이트, 0.05m 피리딘(Ph 8.4)중에 분산시키고 수성상과 동등한 n-부탄올과 혼합시킨다. 9n-부탄올-물 분획을 사용하여 수성상에서 청정 농도를 낮춘다. 최종의 낮은 수성상을 함유하는 단백질을 15시간동안 동결 건조시키고 완충액 2ml중에 용해시키며 100,000×gav(Beckman L5-50B)로 회전시켜 잔존하는 불용성 물질을 제거한다. 323nm에서 흡관계수 4×10³으로부터계산한 최종 샘플에서 리튬 디요도살리실레이트 농도(Marchesi, V.T. and Andrews, E.P., Science(1971) 174 : 1247-1248)는 10μM 미만이다.

이렇게 정제된 개의 ASP 32K 아포단백질(apopro-tein)을 상기와 같이 정제한 계면 활성지질로 재조제한다. 재조제한 물질은 표면 균형(surface balance)에 의해 측정한 표면 활성을 가지며 이의 생체내 생물활성은 통풍기상에서 유지시킨 태아 토끼로 흡입시켜 측정한다.

[D. 1. d. 계속적인 단백질 정제 방법]

상기에서 수득한 단백질 분획을 pH 7.5 37℃에서 1시간 동안 1% SDS 중 50mM DTT, 50mM 트리스-HCl 1mM EDTA로 배양시키고, 0℃에서 30분동안 100mM 요오도 아세트 아마이드(시그마)로 알킬화 시키고, Laemmli[u.k., Mature(1970) 227 : 680-685]의 방법으로 폴리아크릴 아마이드 겔을 전기 영동시켜 환원시킨다. 겔을 4M 아세트산 나트륨 용액중에 침지시켜 단백질을 가시화하고, 32K 밴드를 안전 면도날로 얇게 썰고, SBS 과학(Del Mar, 캘리포니아) 전기 용출 장치를 사용하여 Hunkapiller, M.W. 등의 프로토콜[참조 : Methods In Enzymodogy(1983), 91 : 227-235, New York, Academic Press]로 전기 용출시킨다.

용출된 단백질을 동결 건조시키고, 제조자의 지시에 따라 어플라이드 바이오시스템 470A 가스상 서열기 참조 : Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)를 사용하여 단백질 1 나노몰로부터 그의 N-말단 아미노산 서열을 측정한다. PTH 아미노산은 0.46×25cm IBM CN-컬럼을 사용하여 벡크만 334T HPLC로 확인한다. 사용하는 구배는 Hunkapiller, N.W., 및 Hood, L.E.[참조 : Methods in Enzymolo효(1983) 91 : 486-492, New York, Academic Press가 지시한 바와 같되, 단, 구배 프로그램을 적절하게 변화시키면서, 분리 펌프로 아세토니트릴과 메탄올을 펌프하고, 두개의 비를 구배동안 시간에 따라 변화시켜, 2차 구배계 대신 3차 구배계를 사용하며, Permaphase ETH^r가드 컬럼 대신 "5×0.46cm IBM CN" 분석 "미니 컬럼"을 사용하고, 컬럼을 32℃ 대신 28℃로 가열한다.

N-말단 아미노산 서열은 다음과 같다 :

"Hyp"는 변형된 아미노산 하이드록시 프롤린을 나타낸다.

개의 32K 단백질에 대한 아미노산 조성 자료는 콜라겐과 비슷한 형식 Gly-X-Hyp로 나타나는 추론된 서열(하기 참조)중 프롤린 잔기의 하이드록실화와 일치하는 하이드록시 프롤린 함유량을 나타낸다. 이 유형은 또한 사람의 N-말단 서열에도 나타나기 때문에, 개의 자료와 유사하게 사람의 서열 중 비슷하게 배열된 프롤린이 하이드록실화될 수 있다.

콜라게나아제 처리된 개의 ASP의 정제 및 서열에 의해 정보 관계 처리를 한다.

정제된 개의 ASP를 37℃ pH 7.4-5mM CaCl₂5mM 트리스 중 1:1 효소/기질비로 박테리아성 콜라게나아제(Worthington, Freehold NJ)에 의해 분해한다. SDS 겔로 분석된 바와 같은 22kd 제한 분해 생성물이 생성된다. 이 2kd 밴드를 겔로부터 전기 용출시미고, 상술된 바와 같이 아미노산 서열 분석을 수행한다. 두개의 아미노산이 각각의 사이클에서 확인되는데, 이것은 콜라게나아제 처리시 이황화 결합에 의해 연결된 채로 남은 두개의 펩타이드가 생성되는 것을 나타낸다. cDNA 클론 서열로부터, 두개의 서열이 온전한 분자의 아미노산 78-110 및 203-231에 상응함을 알 수 있다. 수득된 서열은 다음과 같으며, 해독이 완전하고, 단백질의 c-말단이 온전한 것을 나타낸다 :

[D. 1. e. 사람 ASP의 분리방법]

사람의 32K 및 저분자량 ASP를 폐포단백증(alveolar proteinosis 폐의 과도한 계면활성제 존재로 인한 증상) 환자로부터 상기 개의 단백질에 대해 상술한 방법으로 제조한다.

32K ASP는 다음 N-말단 서열을 갖는다 :

사람의 아미노산 3-7서열은 위치 P의 세린을 제외한 개의 32K 단백질의 아미노산 6-20과 정확하게 일치한다.

분리된 저분자량 소수성 단백질은, 비-환원 조건하에서 폴리아크릴아마이드 겔을 전기 영동시킬 경우, 16.5kd, 14kd 및 10kd에 상응하는 밴드를 나타낸다. 환원 조건하에서는 10-11kd에 상응하는 폭넓은 단일 밴드가 얻어진다.

[D. 2. 개의 폐 mRNA의 분리방법]

모든 RNA를 Chirgwin, J.M. 등[참조 : Biochemistry(1979) 18 : 5294-5299]의 방법으로 다 자란 개의 폐로부터 분리시킨다. 폐 조직을 액체 N₂중 모르타르 및 공이(pestle)로 갈아서 분쇄시키고, 6M 구아니딘 티오시아네이트, 0.05M 트리스-HCl, pH 7.0, 0.1M B-머캅토에탄올, 0.5% 사르크로실의 용액중에 균질화시킨다. 이 균질물을 CsCl로 2.0M로 만들고, pH 9.0 0.01M 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 0.05M 트리스-HCl 중 5.7M CsCl 쿠션에 적층시킨다. 16시간 동안 115,000×g로 원심 분리시켜, 이 쿠션을 통해 RNA를 펠릿화 시킨 후, 더 고밀도 CsCl 용액에 침전하지 않는 세포상 DNA 및 단백질로부터 분리시킨다. 그후 RNA를 pH 7.4, 0.01M 트리스-HCl 0.005M EDTA, 0.1% 나트륨 도데실설페이트(SDS)에 용해시키고, 1:1 클로로포름 : 페놀의 혼합물로 추출하고, 70% 에탄올로 침전시킨다. Aviv, H 및 Leder, P.[참조 : Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)(1972) 69 : 1840-1412]에 의해 기술된 바와 같이 올리고(dT) 셀룰로스를 통해 친화성 크로마토그라피에 의해 폴리아데닐화 RNA(폴리 A+ RNA)분획을 수득한다.

[D. 3. 개의 폐 c-RNA 도서관의 구성 및 선별방법]

D. 2에서 제조된 다 자란 개의 폐 폴리 A⁺RNA를 사용하여 C. 4에 기술된 cDNA 도서관을 구성하여, 약 25mg cDNA, 300 염기쌍 이상으로 크리-선택된 5mg mRNA를 수득한다. 이 도서관은 약 200,000개의 독립 재조합체를 함유한다. 이 중에서 40,000 재조합체를 니트로셀룰로스 여과기에 늘어놓는다. 이러한 여과기들은 후속 리플리카(creplica)의 주체로서[Hanahan, D 및 Meselson, M.(참조 : Gene(1980) 10 : 63-75)] 작용한다.

[32K 단백질을 암호화하는 cDNA]

세가지 탐침을 구성한다 : 연속물

을 가진 아미노산 1 내지 5에 상보적인 24×14머의 혼합물(탐림 a) ; 연속물

을 가진 아미노산 7 내지 11에 상보적인 64×14머(탐림 b) ; 및 포유류 코돈 우선 기저상에서 선택한 하나의 15머 5' ATCGAGAACAACACC 3'(탐림 c). 각각의 올리고뉴클레오타이드 혼합물 및 하나의 유일한 올리고뉴클레오타이드를 Nucleic Acids Res 10(1982)(by Efimov, V.A., et al, 6875-6894)에 기재된 축합 시약과 같은 N-메틸이미다졸의 존재하에 메시틸렌설포닐 클로라이드를 사용하는 표준 포스포트리에스테르의 변형 방법으로 Biosearch SAMI 올리고뉴클레오타이드 합성제(Biosearch, Inc., San Rafael, CA)상에서 합성한 다음, 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동으로 정제한다.

하이브리드화를 위하여, 각각의 마스터(master) 필터로부터 xix 리플리카 필터를 제조하고, 각 콜로니를 각각 3개의 올리고뉴클레오타이드 탐림을 가진 복제물 중에서 선별할 수 있다. 마스터 필터를 복제한 후에 회수한 콜로니를 170㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 한천 평판상에 18시간 동안 놓아둔다. 다음에, Grunstein, M. 및 Hogness, D.의 방법[참조 : Proc Natl Acad Sci(1975) 72 : 3961-3972]에 따라 콜로니를 하이브리드화한다.

필터를 진공하 80℃에서 2시간 동안 가열한 다음, 많은 양의 3×SSC(여기서 1×SSC는 0.15M NaCl, 0.015M 나트륨 시트레이트, pH 7.5이다) 및 0.1% SDS 중에서 진탕하면서 68℃로 4시간 동안 세척한다. 필터를 6×SSC 0.1% SDS, 1mM EDTA, 5×덴하르트(Denhardt)용액 0.1% Ficoll, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 소의 혈청알부민), 0.05% 나트륨 피로포스페이트 및 50㎍/ml의 변성 연어 정자 DNA 중에서 42℃로 최소 2시간 동안 하이브리드화한다.

복제 필터를 예비 하이브리드화 용액과 동일한 성분을 함유하는 10ml의 하이브리드화 용액 중에서 필터 당 각각 P-표지된 올리고뉴클레오타이드 탐침[｛Maniatis, T., et al, Molecular Colning, (1982) Cold Spring Harbor Laboratories, pp. 122-123｝에 따라 인산화한]중 하나의 5×10⁶cpm으로 하이브리드화한다.

올리고뉴클레오타이드 탐침 a, b 및 c를 가진 필터는 각각 37℃, 45℃ 및 41℃에서 하이브리드화한다. 1시간 후에, 욕조를 평형시킨 다음, 온도 조절기를 탐침 a에 대하여 28℃까지 탐침 b에 대하여 37℃까지 낮춘다. 탐침 c를 가진 필터는 낮은 온도에서는 하이브리드화하지 않는다. 필터를 실온에서 15분 동안 6×SSC 및 0.1% SDS로 두번 세척한 다음, 탐침 a, b, 및 c에 대하여 각각 37℃, 45℃ 및 41℃에서 2분 동안 6×SSC 및 0.1% SDS로 세척한다.

최종 세척 온도는 문헌[Suggs, S.V., et al, Developmental Biology using Purified Genes(ed. D. D. Brown and C. F. Fox), Academic Press, NY, pp. 683-693]의 경험적 공식 ; 즉 Td=4(G+C)+2(A+T)에 의해 수득한다. 하이브리드화한 필터를 건조한 다음, 듀퐁 크로넥스(Duponta Cronex) 증감스크린이 있는 코닥 XAR 필름에 완전 노출이 수득될 때까지 자동 방사성 사진을 찍는다.

만일 그것이 세개의 모든 올리고뉴클레오타이드 탐침 또는 탐침 a와 b를 가진 복제물 속에서 하이브리드화 한다면 군체는 상당히 양성적인 것을 판단된다. 몇몇의 가능한 양성 클론 중에서, 하나는 다른 것과 비교할 때 탐침 a 및 b로 더욱 강렬하게 하이브리드화한다. 이러한 클론의 서열은 군체가 개의 32K ASP의 서열 일부를 암호화한다는 것을 입증한다. 그것을 DS-1이라 하며 완전한 개의 32K ASP를 얻는데 사용한다.

Pst I로 제한하여 375 염기쌍을 삽입한 정제된 DNA를 pDS-1으로부터 절단해 내고 작은 미세 제조법(miniprep method)(Maniatis, et al, Supra at p. 366)을 사용하여 제조하며 아가로서 겔 상에서 이탈시킨다. 박테리오파지 M13[Messing, J., and Vieira, J., Gene(1982) 19 : 259-268]속에 완전한 DNA 삽입물을 아클론 한 다음 Sanger, F.의 디데옥시 방법[et al, Proc Natl Acad Sci(USA)(1977) 74 : 5463-5469]을 사용하여 서열화한다. 약 300개의 아미노산 단백질의 N-종결 부분을 암호화한 서열, 즉, 32개의 잔기 N-종결 아미노산 서열은 11D.1의 정제된 개의 ASP 및 101개의 부가적인 하부 아미노산으로부터 측정한다. 또한 그것은 비번역된 영역 5'의 50개의 염기쌍을 함유한다.

mRNA푸울(pool)에 대해 너어뜬 블랏(Nor-thern blot)으로 개의 전 Asp서열을 암호화하는 충분한 길이의 서열이 존재하는지 확인한다. 11.2의 폴리 A⁺RNA는 Bailey, J. M. 및 Davidson, N. 방법[Anal Biochem(1976) 70 : 75-85]에 의하여 메틸머큐릭 수산화물을 함유하는 1.4% 아가로서 겔상에서 전기 영동시켜 분별한 후에 니크 번역된 DS-1 삽입 DNA를 사용하여 너어뜬 블랏을 행한다. 탐침에 하이브리드화하는 mRNA는 길이가 1800 내지 2000개의 뉴클레오타이드이며, 암호화 서열에 필요한 약 700 뉴클레오타이드보다 명백히 크다.

그러므로, DS-1 삽입 탐침을 사용하며, 이미 100℃에서 10분 동안 처리하여 잔여 올리고뉴클레오타이드 탐침을 제거한 본래 필터의 복제 세트 하나를 재스크린한다. 필터는 0.75M NaCl, 0.075M 나트륨 시트레이트, 50% 포름아마이드, 0.5SDS, 0.02%소의 혈청 알부민, 0.02% Ficall-400,000, 0.02% 폴리비닐 피롤리돈, 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 50㎍/ml의 효모 tRNA 및 50㎍/ml의 변성된 전단 연어 정자 DNA) 중에서 42℃로 18시간 동안 예비 하이브리드화한다. 0.03M 염화나트륨, 0.003M 나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS로 50℃에서 매 30분 마다 2회 세척한 다음, 밤새 방사선 사진에 노출시킨다. 두개의 클론, 즉, DS-4와 DS-31은 약 1700개의 염기쌍을 함유하는 DS-1과 동일하다(제1도)

DS-4 및 DS-31은 또한 Pst I을 사용하여 절단해 내고 M 13mp 9의 Pst I 부위에 아클론하며, 상거 에프.(상기 인용)법에 따라 디데옥시 서열화한다. 완전한 서열은 두개의 내부의 Pst I 위치를 함유한다. 정확한 서열화의 확정은, 제1도에서 볼 수 있는 바와 같이, 추론되는 내부의 제한 부위로부터 수득한 단편의 디데옥시 서열화에 의해 수득한다. 256 코오돈 개구 판독 프레임으로부터 추론된 ASP의 아미노산 서열을 함유하는 완전한 뉴클레오타이드는 제1도에 나타나 있다.

[개 10K ASP를 함유하는 cDNA]

2개의 올리고머 탐침을 코돈 선택을 위한 포유동물 코동 우선표를 사용하여 16.5kd 단백질의 N-말단 서열에 상응하여 합성한다. 탐침 1198은 서열의 5'-GGTCACAGCCAGGCCCTTGGGGATCATGGCCTGGAT-3'의 36-머이고 ; 탐침 1199는 서열 5-CTTGATCAGGGTTCTGCACAGCCAGCAGTAGGGCAGGGGGATGGG-3'의 45-머이다. 이둘 모두를 키나제 처리에 의해 32P로 표지한다.

하이브리드화를 위해 필터를 80℃에서 진공하에 2시간 동안 굳힌후, 68℃에서 0.1% SDS를 함유하는 3×SSC의 거대 용적 중에서 진탄시키면서 4시간 동안, 필터를 42℃에서 6×SSC, 5×Penhardt's, 20% 포름아마이드, 0.1% SDS 및 전단, 변성된 연어정자 DNA 10㎍/ml 중에서 수시간 동안 예비 하이브리드화한다. 복제필터를 68℃의 초기온도에서 그리고 밤새도록 42℃에서, 탐침 1198 13mg/ml 또는 탐침 1199 16mg/ml를 함유하는 상기 완충액 중에서 하이브리드화한다. 필터를 실온에서, 6×SSC, 0.1% SDS, 0.05% 피로인산나트륨 중에서 15분 동안, 그리고 65℃에서 동일 용매중에서 5분 동안 2회 세척한 후 건조시키고 자동 방사선 사진 촬영한다. 40,000클론을 선별하여 두개의 탐침과 하이브리드한 8클론을 제한 분석한다. 전체 1520 뉴클레오타이드를 부착하는 2개의 중첩클론을 서열시키고, 이 결과는 제2도에 나타냈다. 화살표는 16.5kd 완전 단백질의 지점을 나타낸다.

[D. 4. 사람 32K ASP 유전자의 분리]

박테리오파지 캐톤 28(Rimm, D. L. et al, Gene(1980) 12 : 301-310)에 클론된 사람의 게놈 도서관을 하버드 대학교의 Dr. T. Maniatis로부터 수득한다. 약 1.5×106 파지가 이.콜라이에서 자라고, 플라그용균을 Benton, W. D. 등의 Science(1977) 196 : 180-182에 기술된 바와 같이 니트로셀룰로즈 필터에 이동시킨다. 필터를 Ridgy, P. W. J등의 J Mol Boil(1977) 113 : 237-251의 니크 해독방법에 의해 키나제 처리한 DS-1 cDNA로 탐침한다. 필터를 42℃에서 하이브리드화 완충액(0.75M 염화나트륨, 0.75M 질산나트륨, 40% 포름아마이드, 0.05% SDS, 0.02% 소혈정 알부민, 0.02% 피콜-400,000, 0.02% 폴리비닐 피롤리돈, 0.1% 피로인산나트륨, 50㎍/ml 효모 tRNA, 50㎍/ml 변성, 전단된 연어정자 DNA)에서 1시간 동안 전세척한다. 신선한 하이브리드화 완충액 ml당 5×10⁵cpm 탐침을 가하고, 필터를 37℃에서 이 완충액 중에서 16시간 동안 배양시킨다. 이를 0.45M 염화나트륨 및 0.045M 나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS 중에서 2회 세척하고, 밤새도록 자동 방사선 사진에 노출시킨다. DS-1 cDNA에 하이브리드화하는 서열을 함유하는 6개의 강력한 클론을 정제한다. 가장 강한 하이브리드화 클론인 gHS-15를 특성화한다.

gHS-15로부터 700bp EcoRI 단편을 DS-1 탐침으로 하이브리드화하고 서열 분석을 위해 선택한다. 이 EoRI 단편을 정제하고 M 13mp 9에 삽입하고, 서열시켜 상응하는 개의 서열과 광범위하게 유사함을 발견하였다.

사람의 완전 암호화 영역은 인접하는 2개의 Bam HI 단편 : 5' 1.2kb 및 3' 3.5kb 단편 내에 포함된다. Bam HI 단편 둘다를 개별적으로 M 13MP 8의 Bam HI 위치에 아클론시키고 서열시킨다. 추가의 단편을 도표 3에서 나타낸 방법에 따라 유사하게 서열시킨다. 서열 분석을, 제작자의 지시에 따른 여러가지 Intelligenetics(Palo Alto, CA) 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석한다. 신호 펩타이드, 전구물질 서열 및 완전 아포단백질을 함유하는 영역은 개의 ASP cDNA에 비교에 의해 확인된다. 서열 분석으로부터, 유전자의 5' 말단은 1.2kb Bam HI 단편내에 암호되고 3' 말단은 3.5kb Bam HI의 단편내의 암호된다. 유전자는 1위치가 1.2kb Bam HI의 제1bp를 갖는 1218bp/1651bp 및 2482bp 위치에서 3개의 인트론에 의해 방해받는다. 추론되는 사람의 ASP 단백질의 서열을 포함하여 완전 서열은 제3도에 나타냈다.

[D. 5. 사람의 32K ASP의 실현]

사람의 완전 ASP 유전자를 함유하는 약 16kb의 삽입물을 갖는 것으로 71D.5.에서 확인된 파지 용균물 gHS-15를 CHO 세포로 형질전환시키고 이.CHO 세포는 pSV 2 : NEO(Sourthern, P., et al, J Mol Appl Genet(1982) 1 : 327-341)와 공동 형질전환에 의해 10% 태아소혈청을 함유한 McCoy's 5A 배지에서 자라고 네오마이신 유사물 G148에 대해 내성을 갖는 작용 유전자를 함유하는 플라스미드는 포유동물 세포에 대해 독성이 있다. 형질전환에서 λ : gHS-15 15㎍ 및 psv 2 : NEO 2㎍을 DNA에 노출한지 4시간 후 15% 글리세롤로 2분 "쇼크"를 포함하여, Wigler, M등의 Cell(1979) 16 : 771-785의 방법에 따라 인산칼슘/DNA 중의 CHO 세포의 100mm 디쉬에 적용시킨다. 세포를 G 418 1㎍/ml를 함유하는 배지에서 형질전환시키고 100mm 디쉬당 안정한 형질전환체 약 50을 수득한다.

안정한 형질전환체를 표지하기 전에 0.25mM 아스코르브산으로 보유된 배지에서 배양시킨다. 안정한 형질전환체 2개푸울 및 미처리 CHO 세포 1개푸울을 정상 메티오닌 농축물

을 함유하는 배지에서 1시간 동안 증식시킨후 8 내지 16시간 동안³⁵S-메티오닌으로 표지하고,³⁵S-메티오닌으로 표지된 총 분비단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기 영동으로 분리한다. 이 결과는 제4도에 나타내었다. 레인(Lane) 1은 정상 CHO 분비된 단백질을 나타내고 레인 2 및 3은 λ : gHS-15 분비 단백질을 나타내고 이들 둘 모두는 발현된 ASP 단백질에 상응하는 추가의 30 내지 36kd 단백질을 함유한다. 30 내지 36kd 단백질의 동일성의 증명으로 개의 ASP 항체를 함유한 총 분비된 단백질 시료를 면역시킬 수 있다. 벡터 λ : gHS-15를 1984년 12월 7일 Americas Type Culture Cellection에 기탁하여 부여번호 ATCC 40146를 받았다.

[D. 6. 32K 및 10K 단백질을 위한 사람 cDNA 클론의 제조]

[사람 32K ASP]

하나는 22주, 다른 하나는 24주된 두 태아로부터 사람의 폐를 취한다. 7g의 폐조직을 먼저 액체 N2 중의 모르타르 및 페스텔로서 분쇄하여 미분화하고, 11D. 2(상기)에 기술된 방법으로 총 폴리 A⁺RNA를 제조한다.

cDNA 도서관을 11D. 4에 기술된 방법으로 mRNA로부터 제조한다. 5㎍의 폐 폴리 A⁺RNA로서 약 20ng의 cDNA를 수득하며, 염기쌍 500이상의 크기를 선별하고, 300,000 독립 재결합체의 도서관을 수득한다.

사람 cDNA 도서관의 60,000멤버를, 게놈 도서관 설별을 위한 상술된 방법으로 개 DS-1 cDNA와 함께 선별한다. 개결합된 콜로니를 니트로셀룰로스 필터상에 도포하여 2조의 리플리카를 위한 마스터로 사용한다. 여과된 콜로니를 그후, M. Grunstein 및 D. Hogness(상기 인용)의 방법에 따라 하이브리드화시킨다. 필터를 진공하의 80℃에서 2시간 가온한후, 68℃의 대량의 3×SSC 및 SDS 0.1% 중에서 2시간 진탕한다.

그후, 필터를 37℃의 0.75M NaCl, 0.075M 질산나트륨, 40% 포름아마이드, 0.5% SDS, 0.02%소의 혈청 알부민, 0.02% 피콜-400,000 0.02% 폴리비닐 피롤리돈, 50㎍/ml 효모 tRNA, 50㎍/ml 변성된 전단 연어정자 DNA 중에서 18시간 예비 하이브리드화한다. 1×10⁶cpm의³²P-표지된 DS-1 탐침을 1ml의 새 하이브리드화 완충액에 가한후, 37℃에서 16시간 배양한다. 필터를 그후 50℃에서 0.45M NaCl, 0.045M 시트르산 나트륨 및 0.01% SDS로서 각각 30분간씩 2회 세척한 후, 자동 방사성 사진에 밤새 노출시킨다.

확실하게 하이브리드화된 클론 HS-6 하나는 서열 측정으로 분석한다 : Pst I 분해를 사용하여 벡터로부터 분리 가능하고, 내부 Eco R I 부위를 함유하도록 HS-6를 1.2kd에 삽입 잠복시킨다. 삽입물로부터 두개의 Pst I-Eco R I 단편을 M 13mP 8 및 mP 9의 Pst I-Eco R I 부위내로 아클론 하고, 부분 서열을 수득한다. 200bp 이상의 서열화된 부분은 gHS-15의 3' 말단에 완전하게 상응한다. HS-6의 뉴클레오타이드 서열을 제5도에 표시하였다.

HS-6 cDNA 삽입은 ASP mRNA의 3'-말단지역만을 함유하지만, 잔여 클론은 탐침로서 HS-6를 사용하여 인근의 계면활성 서열을 위해 선별한다. 잔여 도서관 중에는 클론이 발견되지 못했다.

사람 32K ASP를 암호화하는 완전한 cDNA를 수득하기 위해, 무작위로 cDNA를 성인 폐로부터 제조하고 T. Huynh 등의 cDNA 클론닝기법 : A Practical Approacl(Glorer D., ed) IRL, Oxford에 의해 Eco R I 링커를 사용하여 박테리오파지 벡터 gt 10 중에 클론한다. 성인의 폐는 태아의 폐조직(우리의 관측)에 비해 ASP 전사물 중에 대단히 풍성해지고 따라서 완전한 ASP cDNA 수득의 빈도가 증가된다.

파지 플라그를 42℃에서 50% 포름아마이드 중의 5×10^-5cpm/ml, 5×ssc, 0.05% SDS, 5×덴하르트, tRNA 및 연어정자 DNA를 사용하여 PHS-6로부터³²P 표지된 삽입물과 함께 선별한다. 필터를 50℃에서 30분간 0.2×ssc 및 0.1% SDS로 두번 세척하고, 건조 및 자동 방사선 사진 측정한다. PHS-2 및 pHS-5로 지정된 확실하게 하이브리드화된 클론을 분리하였다. 각각은 순수한 32K ASP 암호화 서열 및 5' 미해독된 지역의 대부분을 함유한다. 각각은 3' 미해독된 지역의 대부분을 함유하는 HS-6와 중복된다 : 각 클론의 3' 말단은 규정된 지역내의 부위내에 상응한다.

[사람 10K ASP]

동일한 람다 gt 10중의 cDNA 도선관을 상기와 같이 개의 클론 D 10K-1-의 1×10⁶cpm를 사용하여, 상술한 바왁 KX이 370℃의 40% 포름아마이드, 5×ssc, 0.05% SDS, 5×덴하르트, 50㎍/ml 효모 tRNA 및 50㎍/ml 연어정자 DNA 중에서, 16시간 니트로셀룰로스 필터상에서 선별한다. 필터를 50℃에서 30분간 2×ssc, 0.1% SDS로 두번 세척하고, 건조 및 자동 방사선 측정한다.

40,000 플라그의 두개는 양성이고, 1.5kb 삽입물을 함유하는 한개의 람다 H 10K-1을 서열화를 위해 선택한다. 기초적인 부분 서열화 결과를 제6도에 표시하였다. 밑줄친 아미노산 잔기는 개의 단백질과 서로 동일하다.

[D. 7. 발현 벡터의 구성]

인트론-함유 DNA를 제조할 수 있는 포유동물 세포중의 제놈성 사람 32K ASP 암호화 서열의 발현에 적합한 벡터를 구성하였다. 발현은 M.Karin 등의 Nature(1982) 299 : 797-802에 기술된 메탈로티오네인 II(h MTII)조절 서열에 의해 조절된다.

숙주 벡터 pMT를 다음과 같이 PUC 8중으로 프로모터를 연결시켜 수득한다.

h MTII 유전자를 갖는 플라스미드 84H(M.Karin 등 (Supra)를 Bam HI와 함께 완전 분해하고, 엑소뉴클리아제 Bal-31로 처리하여 말단 뉴클레오타이드를 제거후, Hind III으로 분해시켜 h MTII 유전자(뉴클레오타이드+1이 전사된 제1의 뉴클레오타이드이다)의 뉴클레오타이드-765 내지 +70를 함유하는 840bp 단편을 분리시킨다.

840bp 단편을 Hind III/Hinc II 분해한 puc 8(J. Vieira 등 Gene(1982) 19 : 259-268)로서 분리 및 연결하고, 연결된 혼합물은 E. Coli MC 1016로 형질전환한다. pMT의 정확한 구성을 디데옥시 뉴클레오타이드 서열화로 확인하였다.

또한, c-말단 조정하는 신호를 함유하는 pMT, pMT-Apo의 유도체를 제조한다. pMT-Apo는 3'-말단 조정하는 신호를 함유하는 사람의 간 단백질 Apo A, 유전자(C.C.Shoulders 등, Nucleic Acid Res(1983) 11 : 2827-2837)의 부분을 잠복시킨다.

ApoA₁, 유전자(평활 말단)의 Pst I/Pst II 2.2Kb 단편은 pMT 폴리링커지역의 Sma I 부위내로 클론화하고, Apo A₁유전자의 대부분은 Bam HI로 분해 클레나우로 평활 말단화, Stu I로 분해 및 재결합하여 제거한다. 결과 벡터는 3' 말단으로부터 대개 500bp의 Apo A₁, 유전인자를 함유함을 디데옥시-서열 분석에 의해 확인하였다.

사람 ASP 유전자의 5개의 구성물과 pMT 및 pMT-Apo 발현 벡터를 gHS-15의 1.2Kb 및 3.5kb Bam H I 단편을 사용하여 제조하였다. 모든 구성물은 제한 분석 및 디데옥시 방법 서열화로 분리 및 확인하였다. 이들 구성물은 다음과 같이 제조되었다.

1. 1.2kb 및 3.5kb Bam H I 단편을 pMT의 Bam H I 부위중의 클론시켜 pMT : gHS를 수득한다 ;

2. 1.2 kb Bam H I 단편을, Hinf I(위치 950)으로 소화시켜 5' 말단에서 절단하고, 클레나우로 채운다. 절단한 단편을 3.5kb 단편과 함께 pMT의 Bam H I 부위로 클론시켜 pMT : gHS(Hinf I)을 수득하고 ;

3. 2항의 단편들을, 그대신 pMT-Apo의 Bam H I 부위로 클론시켜 pMT-Apo : gHS(Hinf L)을 수득하며 ;

4. 3.5kb Bam H I 단편을, Eco R I(위치 3434)으로 분해하여 3'말단에서 절단하고 클레나우로 채운다. 이 절단한 단편을, 상기의 Hinf I으로 절단시킨, 절단된 1.2kb 단편과 함께 pMT-Apo의 Bam H I 부위로 클론시켜 pMT-Apo : gHS(Hinf I/Eco RI)을 수득하고 :

5. 1.2kb 단편을 위치 356의 BstE II 부위에서 절단하고 3.5kb 단편을 위치 4024의 Bam H II 부위에서 절단한다. 이 단편들은 pMT-Apo의 Bam H I 부위로 클론시켜 pMT-Apo : gHS(Hinf I/Eco R I)을 수득한다.

생성된 pMT : gHS 구조물을, 메탈로티오네인 프로모터를 유발시키고 생성된 단백질을 표지하기 위해 10^-4M의 ZnCl를³⁵S-메티오닌과 함께, 가하는 것을 제외하고는 D.6에서 설명한 바와 같이, CHO 세포로 형질전환시킨다.

8 내지 16시간 후에, 배지를, 개의 ASP에 대한 항체와 함께 면역 침전된³⁵S-메트 표지된 전체의 분비된 단백질에 대해 분석한다. 비-면역을 대조용으로 사용한다.

[D. 8 발현의 최적화]

발현 조건을 최적화하고 SV 40바이러스 인헨서를 함유하는 추가의 발현 벡터를, CHO 세포에서, 발현 정도를 높이기 위해 사용한다. 다음의 새 벡터를 사용한다 : 상기 기술한, 다음에서 더 특징화될 pMT-Apo : gHS(Hinf I/Eco R I) 및 하기에서 설명될 pASPc-SV(10) 및 pASPcg-SV(10)

[벡터 함유-인헨서]

MT-II 프로모터에 대한 실시 가능한 결합에서 SV 40 인헨서 함유 숙주 발현 벡터를 얻기 위해 1100 bp SV 40 DNA 단편을, pMT에서 MT-II 프로모터 순서를 앞서는 Hind III 부위로 삽입한다. SV 40 DNA 단편은 SV 40 복제원에 걸쳐 있고, 뉴클레오타이드 107 내지 250으로부터 복제된 72bp 복사물인 뉴클레오타이드 5171(복제원에서)부터 뉴클레오타이드 5243을, 포함하고, 후기 비루스 mRNA의 5'말단을 함유한 복제원의 측면의 뉴클레오타이드 1046까지 이어진다. 이 Hind III 1100 bp 단편은 SV 40 DNA의 Hind III 분해로부터 수득[참조 : Buchman, A.R., 등의 DNA Tumor Viruses, 2d ed(J. Tooze, ed.), Cold Spring Harbor Laborstory, New York(1981), PP. 799-841]하고, 확대하기 위해 pBR 322로 클론시킨다. 클로닝 벡터를 Hind III로 잘라내고 1100bp SV 40 DNA 단편을 겔 전기 영동으로 분리하여 Hind III로 분해시키고 CIP로 처리한 pMT에 연결한다. 생성된 벡터 pMT-SV(9) 및 pMT-SV(10)는 MT-II 프로모터 앞의 배향과 반대로 단편을 함유한다. pMT-SV(9)에서, 인헨서는 5' mRNA 출발점으로부터 약 1600 bp에 있다 ; 반대방향에서는 5' mRNA 출발점으로부터 약 980bp에 있다. 두 배향 모두 실시가능하나 인헨서의 순서가 출발점에 가까운 배향이 더 높은 발현정도를 제공한다.

pASPc-SV(10) :

ASP에 대한 암호순서를 상술한, 숙주 벡터 pMT-SV(10)의 변형시킨 형태에 삽입한다. 먼저, (상술한) pMT-Apo의 분해로 수득한 500bp apo A I 단편을 분리하고 Eco R I/Bam H I로 분해시킨 pMT-SV(10)에 연결시켜, pMT-SV(10)에 이 단편을 삽입한다. 변형된 벡터를 Bam H I로 분해시키고, 평활하게 하여, 평활하게 된 Eco R I 분해물로, PHS-5로부터 수득된 cDNA 서열에 연결시킨다[참조 : White, R.T., 등의 Nature(1985) 317 : 316-363]. cDNA 단편은 5' 미전사 영역에 결합된 Eco R I 접합부로부터 3" 미전사 영역(900bp)의 자연발생된 Eco R I 부위까지 확장된다. 관련된 뉴클레오타이드 서열이 제7도에서 보여지며, 그중 별표한 아미노산은, pMT-Apo : gHS(Hinf I/Eco R I)로 부터 수득된 단백질과 1차 아미노산 순서상의 차이점을 나타낸다.(이 차이점은 사람 cDNA와 게놈 서열 사이의 기본적인 변화로부터 생긴다. 전사는, 본래의 서열에서 처럼, 뉴클레오타이드 56에서 개시된다.

pASPcg-SV(10) :

pASPc-SV(10) 및 pMT-Apc : gHS(Hinf I/Eco R I)서열을 통합하여 추가로 변형시킨다. 플라스미드 pASPc-SV(10)을 Bam H I 및 Eco R IFH 분해시키고, 분리시킨 더 큰 단편을, pMT-Apo : gHS(Hinf I/Eco R I)을 Bam H I/Eco R I(부분)로 분해시켜 수득한 ASP 유전자의 3' 위치에 연결시킨다. 이것은, 상술한 Apo A I 유전자 단편에 연결된, 뉴클레오타이드 1154로부터 뉴클레오타이드 3432까지의 사람 ASP 유전자의 부분을 나타낸다. 이 구성물은, pMT-Apo : gHS(Hinf I : Eco R I)으로부터 수득된 것과 동일한 단백질의 결과가 되지만, pASPc-SV(10)으로부터 수득된 것과는 아미노산 25, 30 및 34위치에서 다르다. 관계된 삽입물의 뉴클레오타이드 서열이 제8도에 있다.

[pMT-Apo : gHS(Hinf I/Eco R I)]

게놈 DNA-함유벡터, pMT-Apo : gHS(Hinf I/Eco R I)에 대해, 암호 서열은 엑손(exon) 2, 3 및 4 및 엑손 5의 부분을 함유하는, 뉴클레오타이드 950로부터 뉴클레오타이드 3432까지의 유전자의 Hinf I/Eco R I 단편으로 수득된다[참조 : White, R. T., 등의 Nature(1985) 317 : 316-363]. 이 단편은, 상술한 폴리아데닐화 신호 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 사람 Apo A I 유전자의 3' 말단으로 부터의 500bp 단편에 연결된다[참조 : Shoulders, C.C., Nudeic Acids Res(1983) 11 : 2827-2837]. 전체 ASP-암호화 게놈의 삽입은 제9도에 MT-II 프로모터와 연결되어 보여진다. 이 벡터는, 본래의 전 단백질(pre-protein)(이것은 신호 서열을 포함한다)보다 23개의 아미노산이 더 연결된 단백질을 생성시키는 것으로 기대된다. 그 구성물은 엑손이 1부족하므로 전사는, 본래의 전단백질 mRNA(그것의 뉴클레오타이드는 보통 처음 인트론이 있다.)에 보충적인 유전성 서열의 뉴클레오타이드 987에서 시작하는, ATG에서 개시되는 듯하다. 본래의 전단백질의 생성에서, 엑손 1은, 출발코돈을 결실시키고 뉴클레오타이드 1046에서 개시되도록 하면서, 뉴클레오타이드 1022의 엑손 2에 이어진다. 그러나 추가의 잔류물이 분비물과 간섭하는 것으로 보이지는 않으며, 정상적인 완숙된 단백질이, 이러한 변형된 유전자 형태로 발현되는 세포로부터 분비된다.

[형질 전환 공정]

상기 기술된 각각의 벡터(Vector)를 다음과 같이 CHC 세포로 형질전환시킨다 : 차이니스 햄스터 난소(CHC)-K1 세포 쿤(COOn)의 F12 배지 및 DME-21 배지와 10% 태아 송아지 혈청 1:1 혼합물로 구성된 배지에 배양시킨다. 캄피턴트(competent)세포를 관련 벡터 및 PS V 2 : NEO는 네오마이신 유사체 G 418에 내성을 나타내는 유전자의 기능을 함유한다. 전형적인 형질전환에 있어서, PS V 2-NEO 0.5㎍ 및 발현 벡터 DNA 5㎍ 또는 그 이상을 세포의 100mm 디쉬에 적용시킨다. 칼슘 포스페이트-DNA를 하기 문헌의 원안에 따라 V 공동-침전시키고, 이 DNA에 4시간 노출시킨 후에 PBS 중의 15% 글리콜과 함께 2분간 "쇼크"시켜 사용한다.[참조 : Wigler, M., et al, Cell(1979) 16 : 777-785].

간단히 말해서, 세포를 1/10 합체엑에 파종하고, 밤새 배향시키며, PBS로 2회 세척하여, ca PO4 : DNA를 함유하는 염수의 0.5ml Hepes-완충기중에 넣어 15분간 공동 침전시킨 뒤에 10ml 배지를 공급한다. 이 배지를 흡출법으로 제거시키고 1.5 내지 3분 동안 PBS 중의 15% 글리콜로 대치시킨다. 쇼크를 준 세포를 세척하고 배양배지를 공급한다. MT-II-통제된 발현이 유도될 때까지 배지는 10% FBS와 함께 F 12/DMEM 21 1 : 1를 함유한다. 하루 지나서, 이 세포들에게 1mg/ml의 G 418를 제공하여 G 418-내성콜로니의 푸울을 수득한다. 목적하는 플라스미드의 안정된 유전성이 있는 성공적인 형질전환체는 클론 분리물을 정제하기 위해 낮은 밀도로 평판 배양한다.

[4. ASP의 생산수준에 대한 분석]

형질전환체는 원하는 단백질의 생산에 대해, 첫째는 푸울로서, 다음은 다중-웰 플레이트 중의 이탈된 클론으로서 분석한다. 플레이트 분석 수준은 때로는 웰 크기에 의존한다. 즉, 24웰 플레이트로부터의 결과를 96웰 플레이트로부터의 결과와 직접 비교할 수는 없다. 만족할 만한 수준에서 단백질을 생산하기 위하여 플레이트 분석에 의해 판명된 클론은 로울러 병의 생산단계에서 생육시킬 수 있다. 전형적으로, 생산수준은 규모를 크게할 때 더 높다. 그러나, 플레이트 분석과 로울러 병속에서의 실시 사이에는 절대적인 상호관계는 없다. 즉 플레이트 분석에서의 최선의 생산자인 배양체가 규모를 크게한 후에도 반드시 최선의 것은 아니다. 이러한 이유 때문에, 대표적으로 100 내지 200 이상의 개별 클론은 플레이트 상에서 각종 선별방법에 의하여 분석하며 가장 높은 생산자 5 내지 10개는 생산조건(로울러 병)하에서 분석한다.

[플레이트 분석]

플라스미드를 암호화하는 각종 ASP로 형질전환된 세포의 푸울은 다중 웰 속에서 성장한 다음 아연 이온 농도를 5×10^-5내지 1×10^-4까지 노출하여 ASP의 생산을 유도한다.

ASP 분석은¹²⁵I 단백질 A 및 방사선 사진에 따르는 토끼 항-사람 폴리클로날 항혈청을 가진 면역침전을 사용하는 웨스턴 블랏을 사용하여 실시한다.

더욱 상세하게는, 10% FBS를 가진 맥코이의 5A

배지속에서 성장하는 개별 세포주의 반유동성 단일층을 인산염-완충 염수(PBS)로 세척하고 10% FBS, 1×10^-4염화아연 및 0.25mM 나트륨 아스코르베이트를 함유하는 맥코이 배지로 재공급한다(아스코르베니트는 프롤린 잔기의 수소화를 돕는다).

24시간 후에 유도한 세포를 PBS로 세척한 다음 염화아연 및 아스코르베이트를 함유하는 무혈청 맥코이 매질로 재공급한다. 12시간 후에, 조절된 배지를 수득하여, 트리스, pH 8 중에서 20mM로 만들어 BRL 도트-블랏 장치속의 니트로셀룰로오스를 통하여 여과한다. 니트로셀룰로오스 필터는 5%의 탈지분유를 함유하는 50mM 트리스, pH 7.5, 150mM NaCl(트리스/염)속에서 차단한 다음, 차단 용액중의 토끼 항-사람 ASP 폴리클로날 항혈청의 1 : 5000 희석액으로 배양하여, 상기의 트리스/염으로 수회 세척한 다음, 차단 용액중의¹²⁵I 단백질 A 25μci로 배양하여 세척한 다음 방사선 사진술을 행한다.

ASP 암호화 벡터로 형질전환된 대부분의 푸울은 이러한 분석법으로 감지할 수 있는 ASP를 생산하지 않는다. 그러나, A-38로 표시된 양성의 ASP-분비 세포주는 pMT-Apo : gHS(Hinf I/Eco R I)전환체로부터 선택한다. 또한, ASP-I으로 표시되는 pSAPc-SV(10) 또는 SAP-F 및 ASP-G로 표시되는 pASPcg-SV(10)으로 변형된 세포중의 어떤 푸울은 아래에 기재된 D-4로 표시되는 세포 주(∼2 내지 5㎍/ml)에 의해 제조된 것들과 비교할 수 있는 수준의 ASP를 생산한다.

[ASP 단백질의 특징화]

A-38 세포는 10% FBS를 함유하는 맥코이의 5A 배지중에서 25% 유동적일 때까지 성장시킨 다음, 10% FS 및 0.25mM 나트륨 아스코르베이트를 함유하는 맥코이 배지속에서 10^-4M 염화아연으로 유도한다(세포의 반은 또한 10^-6M 텍사메타손으로 처리한다). 24시간 후에, 세포를 PBS로 세척하고 10%의 투석된 FBS, 1×10^-4M 염화아연, 0.25mM 나트륨 아스코르베이트 및 0.5mCi/ml δ-메티오닌을 함유하는 RPMI 배지를 제공급한다.

18시간후에, 세포 상층액을 1mM 페닐메틸설포닐-플루오라이드로 만든 다음 담체로서 단백질 A를 사용하는 토끼 항 사람 ASP항 혈청으로 면역 침전시킨다. 침전된 단백질의 반을 SDS-PAGE 샘플 완충제 중에서 비등시키고, 나머지 반은 0.75% Triton×-100, 0.075% sds, 0.75% 2-머캅토에탄올, 3Mm EDTA, 75mM 인산나트륨, pH 1속에서 용출시켜 0.5 단위의 엔도글리코시다제-F(두애-F)로 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 처리된 엔도-F 및 처리하지 않은 단백질 분획에 대해 SDS-PAGE한 결과가 표 10에 있다. 처리된 엔도-F 분획은 처리되지 않은 것의 38kd 단백질(lane E)과 비교하여 30kd 단백질(lane F)을 나타낸다. [페인 M은 싸이즈 마커를 함유하며, 레인 A 및 B는 변형안된 CHO 세포로부터의 부유물을 함유하고, 레인 C 및 D는 덱사메타손으로 각각 처리안된 것과 처리된 A-38세포로부터의 부유물을 함유한다.

[D-4를 형성한은 중복 형질 감염]

D-4로 지정된 추가의 세포주는 PMP-Apo : gHS(Hinf I/Eco R I) 및 pSV2 : GPT(1㎍)의 혼합물로 A-38을 중복 감염시켜 수득한다.

F 12/DMEM 21 중에서 10% FBS로 증식하는 A-38의 반유동성 단일층은 상기 기술한 바와 같이 공동 형질 감염된다.

48시간후 세포들은 10% FBS를 함유하는 F 12/DMEM 21 및 HAT 선택약제로 1 : 5의 비율로 분리된다. 17일의 HAT 선택후 생존 내성클론의 푸울을 면역여과방법(참조 : McCracken, A. A. et al. Biotechniques March/April 1984 82-87)에 의해 고수준의 ASP를 생산하는 개개의 클론에 대하여 선별된다. 간략히 말하자면 세포들은 F 12/DMEM 21, 10% FBS 중에서 100mm 디쉬당 100의 세포수로 플레이트에 접종한다. 5일후(각각의 클론이 50 내지 200의 세포를 함유한때) 세포들을 PBS로 세척하고 무혈청 F 12/DMEM 21FH 재공급하여 살균테플론 메쉬(teflon mesh)로 겉을 씌운다. 메쉬의 상부에는 8시간 동안 적합하게 방치한 니트로셀룰로오즈 필터를 둔다. 니트로셀룰로오즈를 제거하고 면역 블랏으로서, 첫번째 토끼 항-개의 ASP 폴리클로날 항 혈청, 이어서¹²⁵I 단백질 A로 처리하고 후속적으로 방서선 사진을 찍는다. 대략 2000개의 선별된 콜로니 중 2개가 감지할 수 있는 신호를 나타내고 또한 1개를 A-38의 수준에 비해 10 내지 20배로 또는 약 2 내지 5㎍/ml ASPDP 상응하는 양으로 ASP 유전인자를 발현하는 것으로 나타났다.

[특성표시]

D-4 세포주에서 분비된 ASP는 친화 크로마토그래피에 의해 무혈청 배지로부터 분리하고 가스-상 마이크로서열기상의 N-말단에서 서열화한다. 16개의 아미노산 서열의 결정은 전체의 70%로 N-말단기의 Glu 잔기를 포함하고 잔여의 30%는 N-말단기의 Val을 함유하도록 잘려 있는 폐세척액으로부터 분리한 단백질의 N-말단 부위와 완전히 일치함이 나타났다. 이것은 분리된 폐 단백질과 조직이 동일한다. 해독후 과정을 나타내는 세포의 능력을 표시하는 하이드록시 프롤린은 위치 10, 13 및 16에 존재한다. 추가로, 푸울 ASP-I(상기) 및 푸울 ASP-G(상기)로부터 분비된 단백질 단편에 따라 D-4에 의해 분비된 단백질은 웨스턴 랏을 사용하여 사람 단백질 폐세척 단백질과 비교한다. 유발된 세포로부터 무혈청 배지를 침전시키고 엔도-F로 처리하여(또는 미처리하여) 12.5% 겔 중의 SDS-PAGE 분석한다. 겔을 토끼 한 사람 ASP 폴리클로날 항 혈청으로, 이어서¹²⁵I 단백질 A에 의해 전기블랏(electroblot) 및 도트-배양(dot-incubate)시킨다. 이 결과를 제11도에 나타내었다.

레인 A 및 F는 엔도-F 분해 전후에 1㎍의 소포 단백증 단백질을 함유하고 ; 레인 B, C 및 D는 엔도-F에 의해 처리되지 않은 D-4, ASP-1 푸울 및 ASP-G 푸울 각각으로부터 배지를 나타내고 ; 레인 G, H 및 I는 엔도-F로 처리된 이들의 부유물로부터 단백질을 나타낸다. 엔도-F 처리는 모든 단백질의 외견상 분자량을 감소시키고 더욱 불연속적인 피를 나타내는 것은 명백한 사실이다.

[제조작업]

PMT-Apo : gHS(Hinf I/EcoR I)(세포주 D-4)의 복식 복제물을 함유하는 중복 형질 감염 세포주는 로울러병 중에서 제조수준 작업략으로 사용한다. 10% FCS, 15mM Hepes, 펜(pen)/스트랩(strep) 및 글루타민 중의 세포 2×10⁶개를 함유하는 10cm 디쉬로 850-㎠ 로울러병에 접종한다. 셀이 군집된(2 내지 3일)후, 이들을 PBS로 2회 세척하고 FCS 없이 F 12/DMEM 21 250ml, 10mM Hepes로 대체한다. 다음날, 세포에 F 12/DMEM 21 250ml, Hepes 10mM, 5×10^-9염화아연, 10^-6M 덱사메타손 및 0.25mM 아스코르베이트를 재공급한다. 세포를 2일마다 채취하고 10분 동안 1000rpm으로 회전시키고 -20℃에서 동결시킨다. 산출은 1 내지 5㎍/ml/1일 이고 상기 기술한 바와 같이 1 : 5000 희석한 폴리클로날 항-개의 ASP 항 혈청을 사용하여 도트-블랏 웨스턴에 의해 분석한다. 산출은 약 14 내지 17일 후 급격히 저하된다.

[D. 9. ASP 성분의 활성]

공기/물의 접촉면에서 지방 막의 생성을 증진시키는, 분리된 ASP 성분의 능력은 문헌(참조 : S. et al, Biochemistry(1985) 24 : 184-190)에 기술된 방법으로 시험관내에서 추정한다. 시험 단백질을 적절한 비율로 갖는 인지질 소포의 제조물을 수성완충제, 자석 교반기 및 완충제의 표면에 매달려 있고 스트레인 게이지(strain gauge)에 부착된 백금 양극판을 갖는 테플론 접시의 바닥에 소량으로 주의하여 가한다. 스트레인 게이지에 지시되는 표면장력의 변화는 교반 개시된 시간의 함수로 기록된다.

10k 단백질은 이것을 함유하는 클로로포름 용액과 지방의 클로로포름 : 메탄올(2 : 1/v/v)용액을 혼합하므로써 인지질에 첨가된다. 용매를 증발시키고 고체를 완충액중에 수화시켜 소포를 수득한다. 32K 단백질은 수용액 중에서 소포의 현탁액에 직접 가할 수 있고 소포의 공생체 및 집합체는 혼탁정도를 측정하여 감지할 수 있다.

Hawgood 및 그 동료(supra)에 의해 보고된 바와 같이 32K 개의 ASP는 인지질 소포를 집합체화 할 수 있고 인지질 소포내에 함유되고 그 인지질의 개의 폐 표면 활성제 복합체로부터 수득된 경우에 막의 형성을 감화시킬 수 있다. 본 발명이 단백질의 활성은 Hawgood가 설명한 집합체 및 막형성 강화도의 측정방법과 동일한 방법을 이용하여 평가한다.

개의 폐로부터 상기 기술한 만큼(300㎍)제조된 인지질 제조된 및 인지질들의 합성 혼합물, 양쪽을 모두 사용한다. 합성 인지질은 시판용 DPPC 240㎍ 및 달걀 PG 60㎍ 함유하고 천연 지질에 비해 막을 형성하기가 훨씬 어렵다. 그러나 시험 인지질은 단백질의 활성을 가장 효과적으로 극적으로 표현할 수 있도록 선택하였다.

32K 단백질 및 10k ASP의 혼합물은 상기 기술한 바와 같이 개의 폐로부터 분리한다. 32K 단백질 60㎍을 가하여 폐로부터 수득한 "천연" 인지질에 의해 복합체 그자체에 의해 나타나는 수준 정도로 막 형성을 강화시킬 수 있는 반면 합성지질을 사용하는 경우에는 막 형성을 적당히 증가시킬 뿐이다. 10k 단백질을 13㎍ 단독으로 첨가하여도 유사한 결과를 얻는다. 그러나 32K 단백질 60㎍을 첨가하기 전에 합성 인지질 소포로 13㎍의 10K 제조물을 배양시킨 경우에는 천연 복합체 그자체의 경우와 비교될 정도의 속도로, 비교될 정도의 수준까지 막 형성이 일어난다. 이들 결과가 제12도에 나타나 있다.

Claims

완전한 폐포 계면활성 단백질(ASP) 아미노산 서열을 암호화하는 엑손 II 내지 IV DNA 및 엑손 I DNA 부분으로서 제3도에 도시된 DNA 또는 이의 천연 대립형질 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖고, 적어도 하나의 프롤린 잔기가 하이드록시프롤린 잔기에 의해 치환된 상기의 직접 암호화된 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 글리코실화 형태 또는 비글리코실화 형태로 존재할 수 있는 실질적으로 순수한 형태의 사람 32K 폐포 계면활성 단백질.
제1항의 사람 폐포 계면활성 단백질을 암호화하는 재조합 DNA를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양시킴을 특징으로 하여, 사람의 32K 폐포 계면활성 단백질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, N-말단 아미노산 서열이 Glu-Val-Lys-Asp-Val-Gly-Ser-Hyp-Gly-Ile-Hyp-Gly-Thr-Hyp-Gly인 사람 32K 폐포 계면활성 단백질.
제1항의 ASP를 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 함유함을 특징으로 하는, 포유동물의 호흡기질환 증후군을 치료하는 데에 효과적인 약제학적 조성물.
제1항의 ASP를 천연 또는 합성 지질과의 복합체 형태로 함유함을 특징으로 하는, 포유동물의 호흡기 질환 증후군을 치료하는 데에 효과적인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 적어도 세개의 프롤린 잔기가 하이드록시 프롤린 잔기에 의해 치환되는 사람 32K 폐포 계면활성 단백질.
제6항에 있어서, 모든 프롤린 잔기가 하이드록시 프롤린 잔기에 의해 치환되는 사람 32K 폐포 계면활성 단백질.
제5항에 있어서, 복합체가 약 50중량% 내지 거의 100중량%의 지질을 함유하는 조성물.
제8항에 있어서, 복합체가 약 80 내지 95%의 지질을 함유하는 조성물.
제5항에 있어서, 복합체의 지질 부분이 약 80 내지 90%의 디팔미토일 포스파티딜 클로린(DPPC)인 조성물.
제10항에 있어서, 복합체의 지질 부분이 불포화 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 트리아실 글리세롤, 팔미트산, 또는 이의 혼합물을 추가로 함유하는 조성물.
제5항에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 함유하는 조성물.
완전한 폐포 계면활성제 단백질(ASP)의 암호화 서열로서 제1도에 도시된 DNA 서열 또는 이의 천연 대립형질 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖고, 적어도 하나의 프롤린 잔기가 하이드록시 프롤린에 의해 치환된 상기의 직접 암호화된 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 글리코실화 형태 또는 비글리코실화 형태로 존재할 수 있는 실질적으로 순수한 형태의 개의 32K 폐포 계면활성 단백질.
제13항에 있어서, N-말단 아미노산 서열이 Ile-Glu-Asn-Asn-Thr-Lys-Asp-Val-Cys-Val-Gly-Asn-Hyp-Gly-Ile-Hyp-Gly-Thr-Hyp-Gly-Ser-His-Gly-Leu-Hyp-Gly-인 개의 32k 폐포 계면활성 단백질.
제13항에 있어서, 적어도 네개의 프롤린 잔기가 하이드록시 프롤린 잔기에 의해 치환되는 개의 32K 폐포 계면활성 단백질.
제13항에 있어서, 모든 프롤린 잔기가 하이드록시 프롤린 잔기에 의해 치환되는 개의 32K 폐포 계면활성 단백질.