DE3587958T2

DE3587958T2 - Rekombinantes alveolares oberflächenaktives protein.

Info

Publication number: DE3587958T2
Application number: DE3587958T
Authority: DE
Inventors: Bradley Benson; Barbara Cordell; James Schilling; Robert White
Original assignee: Scios Nova Inc
Current assignee: Takeda GmbH
Priority date: 1984-12-11
Filing date: 1985-12-10
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2005-12-11
Also published as: NO863197D0; KR870700019A; ATE115147T1; DE3590648T1; US4659805A; IE67067B1; WO1986003408A1; AU5308986A; JP2500197B2; NO863197L; HK1005883A1; ES549817A0; NO177678C; EP0210189B1; IE853133L; JPH07108917B2; EP0210189A4; DK172227B1; GB2181138A; JPH08224091A

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung rekombinanter Proteine. Genauer gesagt, betrifft sie die Herstellung von alveolärem Surfactant-Protein (ASP), das nützlich ist bei der Behandlung bestimmter Atemwegserkrankungen.

Technischer Hintergrund

Die menschliche Lunge ist aufgebaut aus einer großen Anzahl kleiner Bläschen oder Alveolen, in denen Gase zwischen dem Blut und den Lufträumen der Lunge ausgetauscht werden. In gesunden Individuen wird dieser Austausch vermittelt durch die Anwesenheit eines Surfactant- Komplex enthaltenden Proteins, das in den mikrosomalen Membranen von alveolären Zellen des Typs II hergestellt wird. In Abwesenheit adäquater Levels dieses Komplexes kann eine Lunge nicht ordnungsgemäß arbeiten, d. h. die Alveolen kollabieren während des Ausatmens und können nachfolgend nicht durch Einatmen wieder aufgefüllt werden. Daher kann die unbehandelte Unfähigkeit zur Synthese dieses Komplexes im Tod oder in schweren physischen Schäden resultieren.
Der am besten dokumentierte Fall von inadäquaten Surfactant- Komplex-Levels tritt bei frühgeborenen Säuglingen und bei nach komplizierten Schwangerschaften geborenen Säuglingen auf und ist weithin bekannt als Atemnotsyndrom (respiratory distress syndrome, RDS). Eine verbreitet publizierte Form dieses Syndroms wurde als hyaline Membranerkrankung oder idiopathische RDS bezeichnet. RDS ist gegenwärtig Hauptursache für Säuglingssterblichkeit und Morbidität in den Vereinigten Staaten und den anderen entwickelten Ländern, und beachtliche Anstrengungen waren auf die Diagnose und Behandlung gerichtet. Die gegenwärtige Behandlung hat sich auf mechanische (Druck) Beatmung konzentriert, die im besten Fall eine invasive Notbehelfsmaßnahme ist, die häufig in Schäden an der Lunge und anderen schädlichen Nebeneffekten, einschließlich Komplikationen wie bronchopulmonare Dysplasie, interstitielles Emphysem und Pneumothorax resultiert. Mentale Retardation hat ebenfalls bei einer Gelegenheit resultiert, als diese Behandlung verwendet wurde (Hallman, M., et al, Pediatric Clinics of North America (1982) 29 : 1075-1075).
Es wurden begrenzte Versuche unternommen, das Syndrom durch Surfactant-Substitution zu behandeln. Dies wäre die Methode der Wahl, weil im allgemeinen nur eine Gabe benötigt wird und das Schadenspotentual reduziert wird. Beispielsweise verwendeten Fujwara et al, Lancet (1980) 1 : 55 ein aus Rinderlungen gewonnenes proteinarmes Surfactant-Präparat; das Präparat ist wirksam, aber immunogen. Hallman, M., et al, Pediatrics (1983), 71 : 473-482 verwendeten mit einigem Erfolg ein Surfactant-Isolat aus menschlicher Amnium-Flüssigkeit zur Behandlung einer begrenzten Anzahl von Säuglingen. US-Patent 4,312,860 von Clements offenbart ein künstliches Surfactant, das kein Protein enthält und von dem behauptet wird, daß es bei diesem Weg nützlich ist, obwohl keine Daten dargestellt sind. Kurz gesagt wurde die Surfactant-Substitution klinisch noch nicht verbreitet angewandt.
Das bevorzugte Surfactant-Substitut wäre der Lungen-Surfactant- Komplex selbst. Dieser Komplex ist aufgebaut aus Aproprotein, zwei Phospholipiden (Dipalmitoylphosphocholin (DPPC) und Phosphatidyl-glycerol (PG)), die als Hauptanteil vorhanden sind, verschiedenen Lipidkomponenten, die nur in sehr kleinen Mengen anwesend sind, und Calciumionen. Das Apoprotein enthält Proteine mit Molekulargewichten in der Größenordnung von 32 000 Dalton und sehr hydrophobe Proteine in der Größenordnung von etwa 10 000 Dalton (King, R. J. et al, Am. J. Physiol (1973) 224 : 788-795). Das 32 000 Dalton-Protein ist glykosyliert und enthält Hydroxyprolin. aber Analysen von humanen ASP-Spezies durch Gelelektrophorese wurde in Chemical Abstracs 99, Nr. 102 (1983), Abstract 155 807 m und in Biochimica et Biophysica Acta 791 (1984), 226-238 berichtet. Hunde-ASP-Spezies wurden von Sueishi et al, Biochimica et Biophysica Acta 665 (1981), 442-453 und von King et al, Am. J. Physiol. 224, 788-795 (1973) untersucht.
Ein Hauptgrund für den begrenzten Fortschritt in der Surfactant- Ersatz-Therapie war die fehlende Zugänglichkeit des Proteinanteils des Komplexes. Ersatztherapien haben sich auf Versuche konzentriert, die Lipidkomponenten allein zu verwenden, und es scheint, daß die Leistung einer solchen Behandlung bemerkenswert verbessert werden kann durch Zusatz des Apoproteins (Hallman, M., et al, Pediatric Clinics of North America (1982) (supra)). Gegenwärtig sind diese Proteine jedoch nur aus normaler menschlicher Lunge von Erwachsenen und aus Amnion-Flüssigkeit erhältlich. Sogar effiziente Isolationsverfahren würden kein adäquates Angebot zur Verfügung stellen. Daher wäre es wünschenswert, eine Methode zur Herstellung praktischer Mengen von Apoprotein verfügbar zu machen zur Verwendung allein oder in Verbindung mit dem gesättigten Phospholipid-Anteil des Komplexes.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein Mittel zur Herstellung des Apoprotein- Teils des Lungen-Surfactant-Komplexes in einer Menge und unter Bedingungen zur Verfügung, die die Optimierung seiner Merkmale erlauben. Die verbleibenden Komponenten des Komplexes, Dipalmitolyphosphocholin und Phosphatidylglycerol gemeinsam mit den Calciumionen sind bereits leicht erhältlich. Die Verfügbarkeit der benötigten Mengen von manipulierbarem Apoprotein ermöglicht sowohl Forschungsanstrengungen zur Optimierung des in der Therapie verwendbaren Komplexes und eröffnet auch die Möglichkeit für Routineersatztherapie bei Atemnotsyndrom.
Daher betrifft die Erfindung in einem Aspekt ein alveoläres Surfactant-Protein (ASP) aus Säugern in gereinigter und isolierter Form, das ist:
aus menschlicher Lunge isolierbares 32 K ASP mit der hier in Fig. 3 dargestellten codierten Aminosäuresequenz;
ein aus Hundelunge isolierbares ASP, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 16.5 kd bei Bestimmung auf einem nicht-reduzierenden Polyacrylamidgel und etwa 10-12 kd bei Bestimmung auf einem reduzierenden Polyacrylamidgel zeigt und eine hier in Fig. 2 als die reife Sequenz dargestellte Aminosäuresequenz aufweist; oder
ein aus menschlicher Lunge isolierbares ASP, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 16.5 kd bei Bestimmung auf einem nicht-reduzierenden Polyacrylamidgel und von etwa 10-12 kd bei Bestimmung auf einem reduzierenden Polyacrylamidgel zeigt und die hier in Fig. 6 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt.
Diese Proteine ermöglichen die Bildung von Oberflächenspannungserniedrigenden Filmen, wenn sie in Gegenwart von Calciumion mit Phospholipid komplexieren. Die Erfindung betrifft darüber hinaus für das erfindungsgemäße Säuger-ASP codierende DNA-Sequenzen, für die Herstellung dieser Proteine geeignete rekombinante Expressionssysteme, mit diesen Systemen transformierte rekombinante Wirtszellen und Verfahren für die Herstellung der rekombinanten ASPs. In anderen Aspekten betrifft die Erfindung erfindungsgemäßes ASP enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen und solche ASP für die Verwendung bei der Behandlung von RDS.
Im folgenden kann die 16.5 kd-Komponente des 10-12 oder 10-11 kd ASP als 10K ASP bezeichnet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die für Hunde 32K-ASP codierende DNA-Sequenz gemeinsam mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz.
Fig. 2 zeigt die für eine Hunde 10K-ASP codierende cDNA bestimmte DNA-Sequenz gemeinsam mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz.
Fig. 3 zeigt die Nucleotidsequenz des menschlichen 32K-ASP-Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz.
Fig. 4 ist ein Autoradiogramm von ³&sup5;S-Met-markierten, sekretierten Proteinen aus mit λ:gHS-15 transfizierten CHO-Zellen.
Fig. 5 zeigt die in pHS-6 enthaltene Sequenz des 3'-terminalen Anteils von menschlicher ASP-cDNA.
Fig. 6 zeigt eine für menschliches 10K-ASP codierende cDNA bestimmte DNA-Sequenz gemeinsam mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz.
Fig. 7 zeigt die relevante Verbindung und codierenden Sequenzen des Expressionsvektors pASPc-SV(10).
Fig. 8 zeigt die relevante Verbindung und codierenden Sequenzen des Expressionsvektors pASPcg-SV(10).
Fig. 9 zeigt die relevante Verbindung und codierenden Sequenzen des Expressionsvektors pMT-Apo: gHS (HinfI/EcoRI).
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse von mit ³&sup5;S markierten überstehenden Proteinen durchgeführte SDS-PAGE, mit und ohne Behandlung mit endo F, sekretiert von mit pMT-Apo:gHS(HinfI/EcoRI) transfizierten CHO-Zellen.
Fig. 11 zeigt die Ergebnisse von SDS-Page mit Western-Blot mit markiertem humanem antiASP, durchgeführt auf überstehenden Proteinen, mit und ohne Behandlung mit endo F, sekretiert von mit pMT- Apo:gHS(HinfI/EcoRI) transfizierten CHO-Zellen.
Fig. 12 zeigt die Ergebnisse der in vitro-Bestimmung der Fähigkeit von ASP zur Steigerung der Oberflächenspannungserniedrigung durch Phospholipide.

Wege zur Ausführung der Erfindung

A. Definitionen

Wie hier verwendet, bezeichnet "alveoläres Surfactant-Protein (ASP)" ein mit dem Lungen-Surfactant-Komplex assoziiertes Apoprotein, das ASP-Aktivität aufweist, wie im folgenden definiert. Das ASP aller untersuchten Spezies scheint eine oder mehrere Komponenten von relativ hohem Molekulargewicht (in der Größenordnung von 32 kd), hier "32K ASP" bezeichnet, und eine oder mehr ziemlich hydrophobe Komponenten von relativ niedrigem Molekulargewicht (in der Größenordnung von 10-20 kd), hier "10K ASP" bezeichnet, zu umfassen. (King, R.J., et al, J. Appl. Physiol (1977) 42 : 483-491; Phizackerley, P. J. R., Biochem J (1979) 183 : 731-736.) Diese Begriffe bezeichnen native Sequenzen und äquivalente Modifikationen davon. Beispielsweise hat humanes 32K-ASP die in Fig. 3 dargestellte Aminosäuresequenz; ASP-Proteine von annähernd 32 kd, die aus anderen Spezies wie Hunden, Affen oder anderen Säugern gewonnen wurden, haben substantielle Grade von Homologie mit diesen Sequenzen (siehe Figur 1 in Verbindung mit dem Hunde-ASP). Eine zusätzliche Sequenz für anderes spezifisches 32K-ASP (Hund) und 10K-ASP (Mensch und Hund) ist im folgenden offenbart.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten ASP-Proteine haben Aminosäuresequenzen, die denen des nativen Proteins entsprechen.
Wie es für alle Proteine der Fall ist, können die ASP-Proteine in neutraler Form oder in Form von Basen- oder Säure-Additions-Salzen vorliegen, in Abhängigkeit von dem Herstellungsweg oder, falls in Lösung, von der Umgebung. Es ist gut verstanden, daß Proteine im allgemeinen und daher irgend ein ASP im besonderen in Form seiner Säureadditionssalze gefunden werden kann, das die freien Aminogruppen einbezieht, oder als mit freien Carboxylen gebildete basische Salze. Pharmazeutisch verträgliche Salze können in der Tat die Funktionalität des Proteins erhöhen. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze schließen die aus anorganischen Säuren wie beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure oder aus organischen Säuren wie Essigsäure oder Glykolsäure gebildeten ein. Pharmazeutisch verträgliche Basen schließen die Alkalihydroxide wie Kalium- oder Natriumhydroxide oder solche organischen Basen wie Piperidin, Glucosamin, Trimethylamin, Cholin oder Coffein ein. Zusätzlich kann das Protein modifiziert sein durch Kombination mit anderen biologischen Materialien wie Lipiden und Sacchariden, oder durch Seitenkettenmodifikation wie Acetylierung von Aminogruppen, Phosphorylierung von Hydroxyseitenketten oder Oxidation von Sulfhydrylgruppen oder andere Modifikation der codierten Primärsequenz. In der Tat ist das 32K-ASP in seiner nativen Form ein glykosyliertes Protein, und bestimmte codierte Prolinreste wurden zu Hydroxyprolin konvertiert. Es wird auch in Verbindung mit den Phospholipiden DPPC und PG gefunden. In der Definition von irgendeinem ASP sind hier eingeschlossen glykosylierte und unglykosylierte Formen, hydroxylierte und nicht-hydroxylierte Formen, das Apoprotein allein oder in Verbindung mit Lipiden, und, kurz, irgendeine Zusammensetzung einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen gleich der der nativen Sequenzen ist, die die Fähigkeit behält, den Austausch von Gasen zwischen dem Blut und den Lungenlufträumen zu erleichtern und das Wiederauffüllen der Alveolen zu gestatten.
Es wird darüber hinaus verstanden, daß kleinere Modifikationen der primären Aminosäuresequenz in Proteinen resultieren können, die im wesentlichen äquivalente oder erhöhte Aktivität verglichen mit den nativen Sequenzen aufweisen. Diese Modifikationen können beabsichtigt sein, wie durch ortsspezifische Mutagenese, oder können zufällig sein, wie durch Mutation von Wirten, die ASP-produzierende Organismen sind. Alle diese Modifikationen sind eingeschlossen, solange die ASP-Aktivität erhalten bleibt.
"ASP-Aktivität" für ein Protein ist definiert als die Fähigkeit, bei Kombination mit Lipiden entweder allein oder in Kombination mit anderen Proteinen Aktivität im in vivo-Assay von Robertson, B. Lung (1980) 158 : 57-68 zu zeigen. In diesem Assay wird die zu prüfende Probe fötalen Kaninchen oder Lämmern, die frühreif durch Kaiserschnitt geboren wurden, durch eine endotrachiale Röhre gegeben. (Diese "Frühchen" haben kein eigenes ASP, und werden mit einem Ventilator beatmet.) Messungen von Lungenfunktion, Blutgasen und Ventilatordruck ergeben Aktivitätsindices. Vorläufige Messung der Aktivität können auch durch ein in vitro-Assay erhalten werden, beispielsweise das von King, R. J., et al, Am. J. Physiol (1972) 223 : 715-726, oder das unten illustrierte von Hawgood, et al, das eine direkte Messung der Oberflächenspannung an einer Luft-Wasser-Grenzfläche verwendet, wenn das Protein mit einem Phospholipid-Vesikel-Präparat gemischt wird.
"Funktional verbunden" bedeutet eine Nebeneinanderstellung, wobei die Komponenten so konfiguriert sind, daß sie ihre übliche Funktion ausüben. Daher sind mit codierenden Sequenzen funktionell verbundene Kontrollsequenzen in der Lage, die Expression der codierenden Sequenz zu bewirken.
"Kontrollsequenz" bedeutet eine DNA-Sequenz oder Sequenzen, die, wenn sie geeignet mit einer gewünschten codierenden Sequenz verbunden sind, in der Lage sind, deren Expression in mit solchen Sequenzen kompatiblen Wirten zu bewirken. Solche Kontrollsequenzen schließen Promotoren sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Wirten ein, und in prokaryotischen Organismen ebenfalls Ribosomen-Bindungsstellen-Sequenzen und in Eukaryoten Endsignale. Zusätzliche, für das Bewirken der Expression notwendige oder hilfreiche Faktoren können im folgenden identifiziert werden. Wie hier verwendet bedeutet "Kontrollsequenzen" einfach jedwede DNA-Sequenz, die zur Bewirkung der Expression in dem speziellen verwendeten Wirt benötigt wird.
"Zellen" oder "rekombinante Wirtszellen oder "Wirtszellen" werden oft untereinander austauschbar verwendet, wie aus dem Kontext klar wird. Diese Begriffe schließen die direkte Subjektzelle und selbstverständlich die Abkömmlinge davon ein. Es ist klar, daß nicht alle Abkömmlinge exakt identisch mit den Elternzellen sind, verursacht durch Zufallsmutationen oder Unterschiede in der Umgebung. Solche veränderten Abkömmlinge sind jedoch eingeschlossen, wenn die obigen Begriffe verwendet werden.

B. allgemeine Beschreibung

Die im folgenden dargestellten Methoden zur Herstellung von für ASP codierende DNA-Sequenzen sind hauptsächlich zum Zweck der Illustration gedacht und sind typisch für die, die verwendet worden könnten. Es können jedoch auch andere Verfahren verwendet werden, wie in dem Fachgebiet klar ist.

B.1. Die Natur des Surfactant-Komplexes

Die alveoläre Oberfläche der Lunge wurde intensiv durch eine Anzahl von Techniken und eine Anzahl von Gruppen untersucht. Es scheint, daß die Basismembran des Alveolus aufgebaut ist aus Typ 1 und Typ II- alveolären Zellen, von denen die Typ II-Zellen etwa 3% der Oberfläche umfassen. Die Typ II-Zellen sind verantwortlich für die exokrine Sekretion von Materialien in eine angrenzende, die Basismenbran bedeckende Flüssigkeitsschicht, wobei die Materialien die Oberflächenspannung zwischen der bedeckenden Schicht und der Gasphase des enthaltenen Volumens absenken. Die flüssige Schicht ist dann aufgebaut aus aus dem Blutplasma der alveolären Kapillaren gewonnenen Wasser und den Surfactant-Sekreten der Typ II-Zellen.
Die Typ II-Zellen selbst enthalten 60 bis 100 ug Protein und etwa 1 pg Lipidphosphor pro Zelle, wobei das Verhältnis zwischen Typ II- Zellen DPPC und PG-Phosphor etwa 8 zu 1 beträgt. Studien der Apoprotein- Komponenten wurden auf der Basis von Lungenspülungen verschiedener Spezies durchgeführt, und es wurde gezeigt, daß sie zwei Hauptproteine, wie oben diskutiert, von ungefähren Molekulargewichten von 10 bis 20 kd und 32 kd umfassen (Kikkawa, Y., et al, Laboratory Investigation (1983) 49 : 122-139). Es ist nicht klar, ob die Apoproteine an die Phospholipidkomponente gebunden sind, (King, R. J., et al Am Rev Respir Dis (1974) 110 : 273) oder nicht (Shelly, S. A., et al J Lipid Res (1975) 16 : 224).
Es wurde gezeigt, daß das durch Lungenspülung von Hunden und Trennung durch Gelelektrophorese erhaltene höhermolekulargewichtige Protein aus drei Hauptkomponenten des Molekulargewichts 29 000, 32 000 und 36 000 Dalton aufgebaut ist. Das 32 000 Dalton Protein wurde verwendet, um Sequenzdaten zu erhalten, wie unten ausgeführt; alle drei dieser Proteine haben jedoch identische N-terminale Sequenzen, und es gibt Hinweise, daß sie sich lediglich im Grad der Glykosylierung unterscheiden. Verdauung der 36 kd und 32 kd-Banden mit Endoglykosidase F, die Kohlenhydrat-Seitenketten entfernt, resultiert in Produkten, die mit der 29 kd-Komponente mitwandern. Die Mobilität der 29 kd-Komponente wird durch diese Behandlung nicht betroffen. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß die 32 kd-Fraktion zu Dimeren und Trimeren aggregiert.
Die niedrigermolekulargewichtigen Proteine werden mit größerer Schwierigkeit extrahiert, aber auch diese scheinen Mischungen zu sein (Phizackerley, et al (supra): Beschreibung unten).

B.2. Klonieren von codierenden Sequenzen für ASP-Proteine aus Hund und Mensch

Die genannten codierenden Sequenzen für Hunde- und humanes ASP- 32K-Protein sind kloniert worden und sind erhältlich für die Expression in einer Vielzahl von Wirtszellen wie unten in C. ausgeführt. Zusätzlich sind DNA-Sequenzen, die für einige der niedriger-molekulargewichtigen Proteine codieren, sowohl aus menschlichen Quellen als auch Hundequellen ebenfalls erhalten worden.
Die Hunde-32K-Sequenz wurde aus einer cDNA-Genbank erhalten, hergestellt aus adulter Hundelunge isolierter mRNA durch Proben mit zwei Sätzen synthetischer Oligonucleotide, wobei einer hergestellt wurde zur Akkomodierung aller möglichen für die Aminosäuren 1-5 der N- terminalen Sequenz codierenden Sequenzen und die anderen für Aminosäuren 7-11 dieser Sequenz, genau so wie ein einzelnes 15-mer, das für Aminosäuren 1 bis 5 codiert, ausgewählt basierend auf Säugercodon-Präferenz. Immobilisierte cDNA aus der in E. coli konstruierten Genbank wurde unter Verwendung dieser Oligonucleotid-Sätze geprobt. Falsche positive Ergebnisse wurden minimiert, indem Hybridisierung mit mehr als einem Satz benötigt wurde. Erfolgreich hybridisierende Klone wurden sequenziert, und von einem wurde gezeigt, daß er die richtige N-terminale Sequenz enthält.
Der cDNA-Einschub aus dem erfolgreichen Klon, exzisiert mit PstI, wurde dann als eine Probe der ursprünglichen Hunde-cDNA-Genbank verwendet zur Herstellung zweier zusätzlicher Klone, die für andere Regionen des ASP codierende Einschübe enthalten die gemeinsam mit dieser Probe 844 Nukleotide umspannen, die wiederum die vollständige codierende Sequenz des Hunde-32K-ASP enthalten. Die vollständige Nukleotid-Sequenz der drei geeigneten Einschübe und die abgeleitete 256-Aminosäure-Sequenz sind in Fig. 1 dargestellt.
Dasselbe, oben verwendete ursprünglich wieder hergestellte N- terminale codierende Fragment wurde auch als eine Probe verwendet zur Herstellung von Fragmenten aus einer humanen genomischen Genbank im λ- Phagen Charon 28. Es wurde gefunden, daß die gesamte codierende Sequenz für humanes ASP-32K-Protein in einem einzigen Phagen-Plaque enthalten ist, und in zwei aufeinanderfolgenden BamHI-Fragmenten, einem 5' 1.2 kb und einem 3' 3.5 kb-Fragment, enthalten ist. Die passenden Teile dieser Fragmente, die für humanes ASP codieren und 3 Introns enthalten, sind in Fig. 3 dargestellt; die abgeleitete Aminosäuresequenz von humanem ASP enthält 228 Aminosäuren, und es geht ihr eine Signalsequenz von mindestens 25 Aminosäuren voran. Die dem Protein voller Länge entsprechende humane 32K-ASP-cDNA wurde ebenfalls erhalten, indem humane cDNA-Genbanken, erhalten aus humaner fötaler und Erwachsenen-Lungen-mRNA geprobt wurden.
Es besteht eine extensive Homologie zwischen den Hunde- und humanen 32K-Aminosäuresequenzen.
Für die Herstellung der für humanes und Hunde-10K-ASP codierenden cDNA wurden ähnliche Strategien angewandt. Die oben beschriebene cDNA-Genbank aus Hundelunge wurde mit zwei synthetischen Oligomermischungen geprobt, die so angelegt waren, daß sie der N-terminalen Aminosäuresequenz eines 16.5 kd-Hunde-Proteins (auf unreduziertem Gel) entsprachen, und mit beiden Proben hybridisierende Klone wurden gewonnen und sequenziert. Einer dieser Klone, der die für Hunde-ASP codierende Sequenz enthielt, wurde zur Herstellung eines für humanes 10K ASP codierenden Klons verwendet, um eine cDNA-Genbank zu proben, die im Bakteriophagen gt10 aus aus menschlicher Erwachsenen-Lunge isolierter mRNA hergestellt wurde.

B.3. Expression von ASP

Da die für verschiedene humane und Hunde-ASP codierenden Nukleotidsequenzen jetzt erhältlich sind, können diese in einer Vielzahl von Systemen exprimiert werden, wie unten in C. beschrieben. Falls prokaryotische Systeme verwendet werden, sollte eine intronfreie codierende Sequenz zusammen mit geeigneten Kontrollsequenzen verwendet werden. Die cDNA-Klone für irgendeines der obigen ASP-Proteine kann mit geeigneten Restriktionsenzymen exzisiert und für eine solche Expression mit prokaryotischen Vektoren ligiert werden. Für die prokaryotische Expression der ASP-Genom-DNA sollte die DNA zum Entfernen der Introns modifiziert werden, entweder durch ortsspezifische Mutagenese oder durch Entfernen entsprechender Teile von cDNA und Substitution der Intron-enthaltenden Genomsequenzen damit. Die intronfreie codierende DNA wird dann mit Expressionsvektoren zur prokaryotischen Expression ligiert.
Wie unten beispielhaft dargestellt wird, können für ASP codierende Sequenzen auch direkt in einem zur Prozessierung der Introns fähigen Expressionssystems verwendet werden, üblicherweise in einer Säugerwirtszellenkultur. Um eine solche Expression zu bewirken, können die Genom-Sequenzen stromabwärts von einem kontrollierbaren Säugerpromotor ligiert werden, der die Expression dieser Sequenzen in CHO-Zellen reguliert.

B. 4. Proteingewinnung

Das ASP-Protein kann entweder als ein reifes Protein oder ein Fusionsprotein produziert werden, oder es kann gemeinsam mit einer Signalsequenz in Zellen produziert werden, die zur Prozessierung dieser Sequenz zur Sekretion fähig sind. Es ist vorteilhaft, Sekretion des Proteins zu erreichen, da dies die Schwierigkeiten bei der Reinigung minimiert; daher ist es bevorzugt, das humane ASP-Gen, das die Codons für die native Signalsequenz einschließt, in zur geeigneten Prozessierung fähigen Zellen zu exprimieren. Es wurde gezeigt, daß kultivierte Säugerzellen in der Lage sind, heterologe Säugerproteine, die Signalsequenzen enthalten, abzuspalten und zu prozessieren, und sie in das Medium zu sekretieren (McCormick, F., et al, Mol Cell Biol (1984) 4 : 166).
Wenn es in das Medium sekretiert wird, wird das ASP-Protein unter Verwendung von Standard-Proteinreinigungstechniken gewonnen. Der Reinigungsprozeß wird vereinfacht, weil relativ wenige Proteine in das Medium sekretiert werden, und die Mehrheit der sekretierten Proteine daher bereits ASP sein wird. Während jedoch die Verfahren arbeitsaufwendiger sind, liegt es im Bereich der in der Fachwelt bekannten Mittel, dieses Protein aus Sonicaten oder Lysaten von Zellen zu reinigen, in denen es intrazellulär in fusionierter oder reifer Form hergestellt wird.

B.5. Assay der ASP-Aktivität

In vitro-Methoden wurden so angelegt, daß die Fähigkeit von ASP- Proteinen festgestellt werden kann, durch Reduzierung der Oberflächenspannung (synonym mit steigendem Oberflächendruck) zur Herstellung eines Films auf einer Wasser/Luft-Grenzfläche zu erzeugen. Studien unter Verwendung dieser Methoden wurden mit dem isolierten nativen 10K-Hunde-ASP durchgeführt. (Benson, B. J., et al, Prog. Resp. Res. (1984) 18 : 83-92; Hagwood, S., et al, Biochemistry (1985) 24 : 184-190).
Tanaka, Y. et al, Chem Pharm Bull (1983) 31 : 4100-4109 offenbaren, daß ein aus Rinderlunge erhaltenes 35 kd-Protein die Oberflächenausbreitung von DPPC erhöhte; Suzuki, Y., J Lipid Res (1982) 23 : 62-69; Suzuki, Y., et al, Prog Resp Res (1984) 18 : 93-100 zeigten, daß ein 15 kd-Protein aus Schweinelunge die Oberflächenausbreitung des Lipid-Protein-Komplexes aus derselben Quelle erhöhte.
Da die Funktion des Surfactant-Komplexes in vivo darin liegt, einen Film an der Luft/Wasser-Grenzfläche zu bilden, um die Oberflächenspannung zu reduzieren, ist die Fähigkeit von ASP-Proteinen zur Steigerung der Bildung des durch Ausbreitung von Lipid oder Lipoprotein an einer solchen Oberfläche in einem in vitro-Modell klar relevant für seine Nützlichkeit.

B.6. Verabreichung und Anwendung

Die gereinigten Proteine können allein und in Kombination in Zusammensetzungen verwendet werden, die geeignet sind für die Gabe zur Behandlung von Atemnotsyndrom bei Säuglingen oder Erwachsenen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Proteinprodukte sind ebenfalls nützlich bei der Behandlung verwandter Atemwegserkrankungen wie Pneumonie und Bronchitis. Für die Anwendung in solcher Behandlung wird eine der Komponenten, aber bevorzugt die 32K-Komponente, entweder allein oder sogar bevorzugter in Kombination mit der 10K-Komponente des humanen ASP mit natürlichen oder synthetischen Lipiden kombiniert, um einen Surfactant-Komplex wiederherzustellen. Der Komplex enthält etwa 50% bis fast 100% (M/M) Lipid und 50% bis weniger als 1% ASP; bevorzugt beträgt ASP 5 bis 20% des Komplexes. Der Lipidanteil ist bevorzugt 80 bis 90% (M/M) DPPC mit dem Rest ungesättigtes Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerol, Triacylglycerole, Palmitinsäure oder Mischungen davon. Der Komplex wird wieder zusammengefügt, indem eine Lösung von ASP mit einer Suspension von Lipid-Liposomen gemischt wird, oder indem die Lipidproteinlösungen direkt in Gegenwart von Detergens oder eines organischen Lösungsmittels gemischt werden. Das Detergens oder Lösungsmittel kann dann durch Dialyse entfernt werden.
Während es möglich ist, die natürliche Lipidkomponente aus Lungenspülung bei der Wiederherstellung des Komplexes zu verwenden und sie mit geeigneten Mengen an ASP-Proteinen zu versetzen, ist die Verwendung synthetischer Lipide klar bevorzugt. Zunächst gibt es den Aspekt des adäquaten Nachschubs, was sich von selbst versteht. Zweitens wird die Reinheit des Präparats und die Freiheit von Kontaminationen durch Fremdproteine, einschließlich infektiöser Proteine, die in den Lungen vorhanden sein können, aus denen die natürlichen Lipide isoliert werden, nur in den synthetischen Präparaten sichergestellt. Selbstverständlich ist die Rekonstituierung eines wirksamen Komplexes schwieriger, wenn synthetische Komponenten verwendet werden.
Während das humane 32K-ASP allein als Proteinkomponente der Zusammensetzungen verwendet werden kann, ist die Kombination von 32K- und 10K-Proteinen bevorzugt. Das Proteinverhältnis liegt typischerweise im Bereich von 80 : 20 der 32K:10K-Gruppe. Das 32K-Protein kann direkt zu einer wäßrigen Suspension von Phospholipid-Vesikeln in einer wäßrigen Lösung gegeben werden; weil es so hydrophob ist, wird das 10K-Protein in einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform zu den Lipiden gegeben, die Lösungsmittel verdampft, und die Vesikel durch Hydratation erneut gebildet.
Die den Komplex enthaltenden Zusammensetzungen sind bevorzugt für die endotracheale Gabe geeignete, d. h. allgemein eine flüssige Suspension, als ein trockenes "Staub"-Pulver oder als Aerosol. Für die direkte endotracheale Gabe wird der Komplex in einer Flüssigkeit mit geeigneten Hilfsstoffen, wie beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, oder Glycerol und ähnlichem suspendiert. Die Zusammensetzungen können auch kleine Mengen nicht-toxischer Hilfsstoffe wie pH-Puffermittel, beispielsweise Natriumacetat oder Phosphat, enthalten. Zur Herstellung des "Staubs" wird der Komplex, gegebenenfalls wie oben gemischt, lyophylisiert und als trockenes Pulver wiedergewonnen.
Für die Verwendung in der Aerosol-Gabe wird der Komplex in feinverteilter Form zusammen mit einem zusätzlichen oberflächenaktiven Mittel und einem Treibmittel zur Verfügung gestellt. Typische oberflächenaktive Mittel, die gegeben werden können, sind Fettsäuren und Ester, es ist jedoch im vorliegenden Fall bevorzugt, die anderen Komponenten des Surfactant-Komplexes, DPPC und PG, einzusetzen. Nützliche Treibmittel sind typische Gase bei Umgebungsbedingungen, die unter Druck kondensieren. Niedrige Alkane und fluorierte Alkane wie Freon können eingesetzt werden. Das Aerosol wird in mit einem geeigneten Ventil ausgerüsteten Container abgepackt, so daß die Bestandteile unter Druck gehalten werden können, bis sie freigesetzt werden.
Der Surfactant-Komplex wird, wie jeweils für die Dosierungsform geeignet, durch einen endotrachealen Schlauch, durch Aerosol-Gabe oder durch Vernebeln der Suspension oder des Staubs in das eingeatmete Gas verabreicht. Mengen des Komplexes zwischen etwa 0.1 mg und 10 mg werden in einer Dosis gegeben. Für die Verwendung bei neugeborenen Kindern ist eine Gabe im allgemeinen ausreichend. Für Erwachsene wird genügend rekonstituierter Komplex zum Ersatz nachgewiesener Mangel-Levels gegeben (Hallman, M., et al, J Clinical Investigation (1982) 70 : 673-682).

C. Standardmethoden

Die meisten der Techniken, die verwendet werden, um Zellen zu transformieren, Vektoren zu konstruieren, Messenger-RNA zu extrahieren, cDNA-Genbanken herzustellen und ähnliches werden in der Fachwelt weit verbreitet verwendet, und die meisten Fachleute sind mit den Standard- Informationsmaterialien vertraut, die spezifische Bedingungen und Verfahren beschreiben. Für die Bequemlichkeit können jedoch die folgenden Abschnitte als Richtlinie gelten.

C.1. Wirte und Kontrollsequenzen

Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Systeme können zur Expression der für ASP codierenden Sequenzen verwendet werden; prokaryotische Wirte sind die bequemsten für Klonierungsverfahren. Prokaryoten werden am häufigsten durch verschiedene Stämme von E. coli repräsentiert; andere mikrobielle Stämme können jedoch ebenfalls verwendet werden. So werden Plasmidvektoren eingesetzt, die Replikationsorte und Kontrollsequenzen enthalten, die aus einer mit dem Wirt kompatiblen Spezies gewonnen werden; beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322, eines durch Bolivar, et al, Gene (1977) 2 : 95 aus E. coli gewonnen Plasmids, transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt daher zusätzliche Marker zur Verfügung, die bei der Konstruktion des gewünschten Vektors entweder erhalten bleiben oder zerstört werden können. Üblicherweise verwendete prokaryotische Kontrollsequenzen, die hier so definiert sind, daß sie Promotoren für die Transkriptions-Initiation, gegebenenfalls mit einem Operator gemeinsam mit Ribosomen-Bindungsstellen-Sequenzen einschließen, schließen solche üblicherweise verwendeten Promotoren, wie das Beta-Lactamase-(Penicillinase-) und Lactose-(lac)-Promotor-System (Chang, et al, Nature (1977) 198 : 10569 und das Tryptophan (trp)- Promotor-System (Goeddel, et al Nucleic Acids Res (1980) 8 : 4057 und das von Lambda abgeleitete PL-Promotor und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle ein (Shimatake, et al, Nature (1981) 292 : 128).
Zusätzlich zu Bakterien können auch eukaryotische Mikroben wie Hefe als Wirte verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe, werden am häufigsten verwendet, obwohl eine Anzahl anderer Stämme üblicherweise verfügbar ist. Vektoren, die beispielsweise den 2 u-Replikationsursprung von Broach, J. R., Meth Enz (1983) 101 : 307, oder andere Hefe-kompatible Replikationsursprünge (siehe beispielsweise Stinchcomb et al, Nature (1979) 282 : 39, Tschempe et al, Gene (1980) 10 : 157 und Clarke, L., et al Meth Enz (1983) 101 : 300) verwenden, können eingesetzt werden. Kontrollsequenzen für Hefevektoren schließen Promotoren für die Herstellung glykolytischer Enzyme (Hess et al, J. Adv Enzyme Reg (1968) 7 : 149; Holland, et al, Biochemistry (1978) 17 : 4900) ein. Zusätzliche im Stand der Technik bekannte Promotoren schließen den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman, et al, J Biol Chem (1980) 255 : 2073) und solche für andere glykolytische Enzyme ein. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotor-Regionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoff-Metabolismus assoziierte degradative Enzyme und für Maltose- und Galactose-Verwendung verantwortliche Enzyme. Es wird ebenfalls angenommen, daß am 3'-Ende der codierenden Sequenzen Terminator-Sequenzen wünschenswert sind. Solche Terminatoren werden in der nicht-translatierten 3'-Region gefunden, die den codierenden Sequenzen in von Hefe abgeleiteten Genen folgt.
Es ist selbstverständlich ebenfalls möglich, für Polypeptide codierende Gene in eukaryotischen Wirtszellenkulturen zu exprimieren, die aus multizellulären Organismen gewonnen werden. Siehe beispielsweise Tissue Cultures, Academic Press, Cruz und Patterson, Herausgeber (1973). Diese Systeme haben den zusätzlichen Vorteil, daß sie die Fähigkeit zum Ausspleißen von Introns besitzen und so direkt zur Expression von Genomfragmenten eingesetzt werden können. Nützliche Wirtszellinien schließen VERO- und HeLA-Zellen und Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO)-Zellen ein. Expressionsvektoren für solche Zellen schließen üblicherweise Promotoren und Kontrollsequenzen ein, die mit Säugerzellen kompatibel sind wie beispielsweise die üblicherweise verwendeten frühen und späten Promotoren aus Simian Virus 40 (SV 40) (Fiers et al, Nature (1978) 273 : 113) oder andere virale Promotoren wie solche aus Polyoma, Adenovirus 2, Rinderpalilomvirus oder Vögelsarkomviren (avian sarcoma viruses) gewonnene. Der kontrollierbare Promotor, hMTII (Karin, M., et al, Nature (1982) 299 : 797-802) kann ebenfalls verwendet werden. Generelle Gesichtspunkte von Transformationen mit Säugerzellen-Wirtssystemen wurden von Axel beschrieben; US-Patent Nr. 4,399,216, veröffentlicht am 16. August 1983. Es scheint jetzt, daß auch "Enhancer"-Regionen wichtig sind bei der Optimierung der Expression; diese sind im allgemeinen stromaufwärts oder stromabwärts der Promotor-Region in nicht-codierenden DNA-Regionen gefundene Sequenzen. Replikationsursprünge können, falls benötigt, aus viralen Quellen erhalten werden. Integration in das Chromosom ist jedoch ein üblicher Mechanismus für die DNA-Replikation in Eukaryoten.

C.2. Transformationen

In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von für solche Zellen geeigneten Techniken durchgeführt. Die Calciumchlorid verwendende Calciumbehandlung, wie von Cohen, S. N., Proc. Natl Acad Sci (USA) (1972) 69 : 2110, oder die RbCl&sub2;- Methode in Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Press, S. 254 beschrieben, kann für Prokaryoten oder andere Zellen eingesetzt werden, die beachtliche Zellwandbarrieren enthalten. Für Säugerzellen ohne solche Zellwände kann die Calciumphosphat-Präzipitationsmethode von Graham und van der Eb, Virology (1978) 52 : 546 verwendet werden, gegebenenfalls wie von Wigler, M., et al, Cell (1979) 16 : 777-785 modifiziert. Transformationen in Hefe können entsprechend der Methode von Van Solingen, P., et al, J Bact (1977) 130 : 946 oder von Hsiao, C. L., et al Proc Natl Acad Sci (USA (1979 76 : 3829 durchgeführt werden.

C.3. Proben von cDNA- oder Genom-Genbanken

cDNA- oder Genom-Genbanken werden gescreent unter Verwendung des Kolonie-Hybridisierungsverfahrens. Jede Mikrotiterplatte wird auf doppelten Nitrocellulosefilterpapieren repliziert (S & 5-Typ BA-85), und man läßt die Kolonien bei 37ºC während 14 bis 16 Stunden auf 15 ug/ml Tetracyclin enthaltendem Agar wachsen. Die Kolonien werden mit 10% SDFS lysiert, und die DNA wird auf dem Filter fixiert durch nachfolgende 5- minütige Behandlung mit 500 mM NaOH/1.5 M NaCl, dann 0.5 M Tris HCl (pH 8.0)/1.5 M NaCl, gefolgt von 2 · Standard-Kochsalzlösung Citrat (SSC). Die Filter werden luftgetrocknet und bei 80ºC während 2 Stunden getrocknet.
Für die Nick-translatierte Probe werden die Duplikat-Filter bei 42ºC während 16 bis 128 Stunden mit 10 ml pro Filter DNA-Hybridisierungs- Puffer (50% Formamid (40% Formamid bei reduzierter Stringenz), 5 · SSC, pH 7.0, 5 · Dehnardt Lösung (Polyvinylpyrrolidon, plus Ficoll und Rinderserumalbumin; 1 · = 0.02% von jedem), 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7.0, 0.2% SDS, 50 ug/ml Hefe tRNA, und 50 ug/ml denaturierter und zerkleinerter (sheared) Lachssperma-DNA) vorhybridisiert.
Die Proben werden mit Nick-translatierten DNA-Proben bei 42ºC während 12 bis 36 Stunden für homologe Spezies und 37ºCfür heterologene Spezies, enthalten in 5 ml desselben DNA-Hybridisierungs-Puffers, hybridisiert. Die Filter werden zweimal während 30 Minuten gewaschen, jeweils bei 50ºC, in 0.2 · SSC, 0.1% SDS für Hybridisierung homologer Spezies und bei 50ºC in 3 · SSC, 0.1% SDS für Hybridisierung heterologer Spezies. Die Filter werden luftgetrocknet und während 1 bis 3 Tagen bei - 70 ºC autoradiographiert.
Für synthetische (15-30mer) Oligonukleotidproben werden die Duplikat-Filter bei 42ºC während 2 bis 8 Stunden mit 10 ml pro Filter Oligo-Hybridisierungspuffer (6 · SSC, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 5 · Denhardt's, 0.05% Natriumpyrophosphat und 50 ug/ml denaturierter und zerkleinerter Lachssperma-DNA vorhybridisiert.
Die Proben werden mit mit Kinase umgesetzten Oligonucleotidproben von 15-30 Nukleotiden unter Bedingungen hybridisiert, die von der Zusammensetzung des Oligonucleotids abhängen. Typische Bedingungen verwenden eine Temperatur von 30 bis 42ºC während 24 bis 26 Stunden mit 5 ml/Filter desselben Oligo-Hybridisierungs-Puffers, der die Probe enthält. Die Filter werden zweimal während 15 Minuten bei 23ºC gewaschen, jeweils mit 6 · SSC, 0.1% SDS und 50 mM Natriumpolyphosphatpuffer bei pH 7, dann einmal während 2 Minuten bei der berechneten Hybridisierungstemperatur mit 6 · SSC und 0.1% SDS gewaschen, luftgetrocknet, und bei -70ºC während 2 bis 3 Tagen autoradiographiert.

C.4. Herstellung der cDNA-Genbank

Doppelsträngige cDNA wird hergestellt und für die Insertion in den Plasmidvektor pBR322 vorbereitet, indem homopolymeres Tailing verwendet wird, vermittelt durch Kälberthymusterminaltransferase (Sutcliffe, J. G., Nucleic Acid Res (1978) 5 : 2721-2732). Der erste Strang cDNA wird mit der RNA-abhängigen DNA-Polymerase aus Vögel-Myeloblastosis-Virus hergestellt durch Priming mit Oligo (dT) 12-18 auf 5 ug mRNA. Das RNA- Templat wird dann vom naszierenden DNA-Strang durch Denaturierung bei 100ºC während 5 Minuten befreit, gefolgt von Eiskühlung. Der zweite Strang DNA wird unter Verwendung des großen Fragmentes von DNA-Polymerase I aus E. coli synthetisiert, wobei man sich auf das Selbst-Primen am Ende des ersten Strangmoleküls stützt, wodurch eine doppelsträngige Haarnadel-DNA gebildet wird. Diese Moleküle werden am offenkettigen Ende abgestumpft, und die Haarnadelschlauch wird mit S1-Nuklease aus Aspergillus oryzae aufgeschnitten. S1-Nuklease-Verdauung der doppelsträngigen cDNA findet in 300 mM NaCl, 30 mM NaOAc, pH 4.5, 3 mM CnCl&sub2; während 30 Minuten bei 37ºCmit 600 Einheiten Enzym statt. Die cDNA wird mit Phenol:Chloroform extrahiert, und kleine Oligonucleotide werden durch drei Ethanolfällungen in Gegenwart von Ammoniumacetat entfernt. Dies wird wie folgt durchgeführt: ein halbes Volumen 7.5 M Ammoniumacetat und 2 Volumina Ethanol werden zu der cDNA-Lösung gegeben, die bei -70ºC ausgefällt wird. Die glattendige, doppelsträngige cDNA wird dann nach Größe fraktioniert unter Verwendung einer Gelfiltration durch eine Säule (0.3 · 14 cm) Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) oder durch Ultrazentrifugieren in 5 bis 20% Glycerolgradient, gefolgt von Fraktionierung des Gradienten. cDNA einer größeren Länge als die gewünschte Länge, z. B. 300 Basenpaare, wird zurückbehalten und durch Ausfällen mit 70% Ethanol gewonnen. Kurze (10-30 Nukleotide) polymere Schwänze von Deoxycytosin werden an die 3'-Enden der cDNA angefügt, indem während 5 Minuten bei 22ºC eine Reaktion angewendet wird, die 0.2 M Kaliumcacodylat, 25 mM Tris, pH 6.9, 2 mM Dithiothreitol 0.5 mM CoCl&sub2;, 200 mM cDTP, 400 ug/ml BSA und 40 Einheiten Kälberthymusterminaldeoxynucleotid-Transferase enthält. Die Reaktion wird mit Phenol:Chloroform extrahiert, und kleine Oligonucleotide werden mit drei Ethanol-Fällungen in Gegenwart von Ammoniumacetat entfernt.
Die dC-schwänzige cDNA wird mit pBR322 anneliert, der mit PstI geschnitten und mit oligo dG verlängert wurde: 2.5 ug pBR322-dG-DNA wird mit der cDNA bei einer Vektorkonzentration von 5 ug/ml anneliert, und die Hybride werden durch die von Casabadan, M. et al, Mol Biol (1980 138 : 179-207 beschriebene CaCl&sub2;-Behandlung in E. coli MC1601 transferiert.

C. 5. Vektorkonstruktion

Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschten Codierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, verwendet Standard-Ligations- und Restriktionstechniken, die in der Fachwelt gut verstanden sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der gewünschten Form religiert.
Ortsspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit dem geeigneten Restriktionsenzym (oder Enzymen) unter Bedingungen durchgeführt, die allgemein in der Fachwelt verstanden sind und deren Besonderheiten von den Herstellern dieser kommerziell erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben sind. Vgl. z. B. New England Biolabs, Produkt-Katalog. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Sequenz von einer Enzymeinheit in etwa 20 ul Pufferlösung gespalten; in den Beispielen hier wird typischerweise ein Überschuß an Restriktionsenzym verwendet, um komplette Verdauung des DNA-Substrats sicherzustellen.
Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bis 2 Stunden bei etwa 37ºC sind praktikabel, obwohl Veränderungen toleriert werden können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, was von Etherextraktion gefolgt sein kann, und die Nucleinsäure wird aus wäßrigen Fraktionen durch Ausfällen mit Ethanol gewonnen. Falls gewünscht, kann die Größentrennung der abgespaltenen Fragmente durch Polyacrylamidgel- oder Agarosegel-Elektrophorese unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt werden. Eine allgemeine Beschreibung von Größentrennungen findet sich in Methods in Enzymology (1980) 65 : 499- 560.
Durch Restriktion abgespaltene Fragmente können am Ende abgestumpft werden, indem sie mit dem großen Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Deoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) unter Verwendung von Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 Minuten bei 20 bis 25ºC in 50 mM Tris pH 7.6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM DTT und 5 bis 10 MM dNTPs behandelt werden. Das Klenow-Fragment fügt sich an "klebrigen" (überstehenden) (sticky ends) 5'-Enden ein, schneidet jedoch überstehende 3'-Einzelstränge zurück, sogar wenn die vier dNTPs anwesend sind. Falls gewünscht, kann selektive Reparatur durchgeführt werden durch Zugabe lediglich eines oder ausgewählter dTNPs innerhalb der durch die Natur der "klebrigen Enden" (überstehenden Enden) vorgegebenen Grenzen. Nach Behandlung mit Klenow wird die Mischung mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Behandlung unter geeigneten Bedingungen mit S1-Nuklease oder Bal-31 resultiert in Hydrolyse irgendeines Einzelstrangteils.
Synthetische Oligonucleotide werden mit der Methode von Efimov, V. A., et al (Nucleic Acids Res (1982) 6875-6894) hergestellt, und sie können unter Verwendung kommerziell erhältlicher automatisierter Oligonukleotid-Synthesizer hergestellt werden. Umsetzung der Einzelstränge mit Kinase vor der Verbindung oder zur Markierung wird unter Verwendung eines Überschusses, z. B. ungefähr 10 Einheiten Polynukleotidkinase auf 1 mM Substrat, in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7.6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 1-2 mM ATP, 1.7 pMol λ32P-ATP (2.9 mCi/mMol), 0.1 mM Spermidin, 0.1 mM EDTA erreicht.
Die Ligationen werden in 15 bis 50 ul-Volumen unter den folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 33 ug/ml BSA, 10 mM-SO mM NaCl und entweder 40 mM ATP, 0.01-0.02 (Weiss)-Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0ºC (für Ligation "klebriger Enden") oder ein 1 mM ATP, 0.3-0.6 (Weiss)-Einheiten T4- DNA-Ligase bei 14ºC (für Ligation "stumpfer Enden") (glatter Enden). Intermolekulare Ligationen "klebriger Enden" werden üblicherweise bei 33-100 ug/ml Gesamt-DNA-Konzentrationen durchgeführt (5-100 mM Gesamtendkonzentration). Intermolekulare Ligationen "stumpfer Enden" (glatter Enden) (üblicherweise unter Verwendung eines 10-30-fachen molaren Überschusses an Linkern) werden bei 1 uM Gesamtendkonzentration durchgeführt.
Bei der Vektor-Konstruktion unter Verwendung von Vektorfragmenten wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) oder alkalischer Kälberdarmphosphatase (CIP) behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und Religation des Vektors zu verhindern. Die Verdauungen werden bei pH 8 in etwa 150 mM Tris, in Gegenwart von Na&spplus; und Mg&spplus;² unter Verwendung von 1 Einheit BAP oder CIP pro ug des Vektors bei 60ºC während etwa 1 Stunde durchgeführt. Um die Nukleinsäurefragmente zu gewinnen, wird das Präparat mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Als Alternative kann die Religation in Vektoren, die doppelt verdaut wurden, durch zusätzliche Restriktionsenzymverdauung der nicht gewünschten Fragmente verhindert werden.
Für aus cDNA oder Genom-DNA gewonnene Teile von Vektoren, die Sequenzveränderungen erfordern, wird ortsspezifische Primer-gerichtete Mutagenese verwendet. Diese wird durchgeführt unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotid-Primers, der zu der zu mutierenden Einzelstrang-Phagen-DNA komplementär ist, mit Ausnahme der die gewünschte Mutation repräsentierenden begrenzten Fehlpaarung. Kurz gesagt, wird das synthetische Oligonucleotid als Primer der direkten Synthese eines zu dem Phagen komplementären Strangs verwendet, und die resultierende doppelsträngige DNA wird in ein Phagen-unterstützendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Top- Agarplatten plattiert, die die Plaquebildung aus Einzelzellen erlauben, die den Phagen beherbergen.
Theoretisch werden 50% der neuen Plaques den Phagen enthalten, der als Einzelstrang die mutierte Form aufweist; 50% werden die Originalsequenz aufweisen. Die resultierenden Plaques werden mit mit Kinase umgesetztem synthetischem Primer hybridisiert bei einer Temperatur, die die Hybridisierung eines exakten Paars erlaubt, bei der jedoch die Fehlpaaarungen mit dem Originalstrang ausreichend sind zur Verhinderung der Hybridisierung. Plaques, die mit der Probe hybridisieren, werden dann ausselektiert, kultiviert und die DNA gewonnen. Details der ortsspezifischen Mutationsverfahren sind unten in speziellen Beispielen beschrieben.

C.6. Überprüfung der Konstruktion

In den unten ausgeführten Konstruktionen werden die korrekten Ligationen für die Plasmidkonstruktion bestätigt, indem zunächst E. coli Stamm MC1061, erhalten von Dr. M. Casadaban (Casadaban, M., et al, J Mol Biol (1980) 138 : 179-207) oder ein anderer geeigneter Wirt mit der Ligationsmischung transformiert wird. Erfolgreiche Transformanden werden mit Ampicillin, Tetracyclin oder anderer Antibiotikaresistenz oder unter Verwendung anderer von der Art der Plasmidkonstruktion abhängiger Marker selektiert, wie es in der Fachwelt verstanden wird. Plasmide aus den Transformanden werden dann entsprechend der Methode von Clewell, D. B. et al, Proc Natl Acad Sci (USA 81969) 62 : 1159 hergestellt, gegebenenfalls gefolgt von Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell, D. B., J Bacteriol (1972) 110 : 667), präpariert. Die isolierte DNA wird durch Restriktion analysiert und/oder mit der Dideoxy-Methode von Sanger, F. et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1977) 74 : 5463 sequenziert wie weiter beschrieben von Messing, et al Nucleic Acids Res (1981) 9 : 309, oder durch die Methode von Maxam et al, Methods in Enzymology (1980) 65 : 499.

C.7. Beispielswirte

Hier für die Klonierung und Expression verwendete Wirtsstämme sind folgende:
Für das Klonieren und Sequenzieren und die Expression der Konstruktion unter Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren wurde E. coli Stamm MC1061 verwendet.
Für M13-Phagen-Rekombinanten wurden E. coli-Stämme verwendet, die der Phagen-Infektion zugänglich sind, sowie E. coli Stamm JM101.
Die für die Expression verwendeten Zellen sind Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO).

D. Klonierung und Expression von ASP

Sowohl menschliche als auch Hunde-ASP-Proteine wurden in gereinigter Form erhalten. Hunde-cDNA wurde verwendet, um Proben für die menschliche ASP-Genom- und cDNA-Genbank zur Verfügung zu stellen.

D.1. Reinigung von Hunde-ASP

D.1.a. Isolierung des Surfactant-Komplexes

Der Lungen-Surfactant-Komplex wurde aus aus ausgebluteten Hunden erhaltenen Hundelungen hergestellt. Alle Verfahrensschritte, einschließlich der Spülung, wurden bei 4ºC durchgeführt, und das isolierte Material wurde bei -15ºC gelagert.
Die Lungen wurden entgast und dreimal mit 1 Liter pro Spülung 5 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.4-Puffer gespült. Die Ca&spplus;²-Konzentration dieses Puffers betrug weniger als 5 · 10&supmin;&sup6; M (Radiometer F2112 Ca; Radiometer A/S, Kopenhagen, Dänemark). Die zusammengegebenen Lungen-Waschlösungen wurden bei 150 · gav während 15 Minuten zentrifugiert (Sorval RC12-B) zur Entfernung des zellulären Materials. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann bei 20 000 · gav während 15 Stunden zentrifugiert (Beckman L3-40) unter Verwendung eines Typ 15-Rotors (Beckman instruments), und das resultierende Pellet wurde in 1.64 M Natrimbromid enthaltendem Puffer dispergiert. Nach Äquilibrierung während 1 Stunde wurde die Suspension bei 100 000 · gav während 4 Stunden (Beckman L5- 50B) in einem SW28-Rotor (Beckman Instruments) zentrifugiert. Die Membran wurde in Puffer resuspendiert und bei 100 000 · gav während 1 Stunde zentrifugiert (Beckman L5-50B). Dieses den Komplex enthaltende Pellet wurde in zweifach destilliertem Wasser resuspendiert.

D.1.b. Extraktion von Lipid und 10 kd-Protein

Das in Wasser bei einer Konzentration von 10-15 mg Phospholipid/ml resuspendierte Pellet wurde in einen 50-fachen Volumenüberschuß n-Butanol injiziert (Sigrist, H., et al, Biochem Biophys Res Commun (1977) in4 : 178-184) und bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt. Nach Zentrifugieren bei 10 000 · gav während 20 Minuten (Sorval RC2-B) wurde das Pellet, das das 32K-ASP enthält, für die weitere Reinigung wie unten beschrieben gewonnen. Die überstehende Flüssigkeit, die eine einzige Phase ist, enthält die Lipide und die Proteine niedrigeren Molekulargewichts. Um die Lipide zu erhalten, wurde die überstehende Flüssigkeit unter Vakuum bei 40ºC getrocknet, und die Lipide wurden extrahiert (Folch, J., et al, J Biol Chem (1957) 226 : 497-509).
Um das hydrophobe Protein zu erhalten, wurde die überstehende Flüssigkeit im Rotationsverdampfer zur Entfernung des Butanols behandelt und weiter getrocknet durch Zugabe von Ethanol, gefolgt von Rotationsverdampfen. Der getrocknete Rückstand wurde in 0.1 N HCl enthaltendem destilliertem Chloroform suspendiert, und unlösliches Material durch Zentrifugieren entfernt.
Die resultierende Lösung wurde mit einer LH-20-Säule (Pharmacia) chromatographiert und in Chloroform entwickelt. (LH-20 ist das Hydroxypropyl-Derivat von Sephadex G-50; es ist ein hydrophobes Gel, das gegen organische Lösungsmittel inert ist.) Die Proteine werden ausgeschlossen; Lipide/Phospholipide werden von dem eingeschlossenen Volumen eluiert.
Das Protein wird von den Leervolumenfraktionen durch Verdampfen des Chloroforms unter Stickstoff isoliert, und dann der Größentrennung auf Polyacrylamidgelen unterworfen. Bei Durchführung unter nicht-reduzierenden Bedingungen werden 3 Banden von 16.5 kd, 12 kd und 10 kd erhalten; unter reduzierenden Bedingungen wurde eine einzelne breite Bande von 10-12 kd gefunden.
Die 16.5 kd und 12 kd-Banden aus den nicht-reduzierenden Gelen wurden N-terminaler Analyse durch Edman-Abbau unterworfen und ergaben die folgenden Sequenzen:
Für 16.5 kd:
Für 12 kd:

D.1.c. Proteinfraktionierung und Verifizierung als ASP-32K-Protein

Der Niederschlag der n-Butanol-Extraktion von oben wurde unter Stickstoff getrocknet und zweimal mit 20 ml 20 mM Octyl-β-D-glucopyranosid enthaltendem Puffer gewaschen. Nach Zentrifugieren bei 100 000 · gav während 1 Stunde (Beckman L5-50B) wurde das Pellet in 0.3 M Lithiumdiiodsalicylat, 0.05 M, Pyridin (pH 8.4) auf Eis dispergiert, mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt und mit einem dem Volumen der wäßrigen Phase gleichen Volumen n-Butanol gemischt. Insgesamt 9 n-Butanol-Wasser- Verteilungen wurden durchgeführt, um die Detergens-Konzentration in der wäßrigen Phase zu senken. Die letzte untere wäßrige Phase, die das Protein enthielt, wurde während 15 Stunden lyophilisiert, in 2 ml Puffer aufgenommen und bei 100 000 · gav (Beckman L5-50B) zu Entfernung irgendwelchen unlöslichen Materials zentrifugiert. Die Lithiumdiiodsalicylat- Konzentration in der letzten Probe, berechnet aus einem Extinktionskoeffizienten von 4 · 10³ bei 323 nm (Marchesi, V. T. und Andrews, E. P., Science (1971) 174 : 1247-1248)) war geringer als 10 uM.
Das so gereinigte Hunde-32K-ASP-Apoprotein wurde mit wie oben gereinigten Surfactant-Lipiden rekonstituiert. Das rekonstituierte Material hatte eine Oberflächenaktivität wie durch das Oberflächengleichgewicht gemessen, und die biologische in vivo-Aktivität wurde gezeigt durch Einatmen in fötale Kaninchen, die mit einem Ventilator beatmet wurden.

D.1.d. Weitere Proteinreinigung

Die im vorherigen Unterabschnitt erhaltene Proteinfraktion wurde reduziert durch Inkubation mit 50 mM DTT in 1% SDS, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5 bei 37ºC während 1 Stunde, mit 100 mM Iodacetamid (Sigma) bei 0ºC während 30 Minuten alkyliert und der Polyacrylamidgel-Elektrophorese nach dem Verfahren von Laemmli, U. K., Nature (1970) 227 : 680-685 unterworfen. Die Proteine wurden sichtbar gemacht durch Einweichen des Gels in 4 M Natriumacetatlösung, und die 32K-Bande wurde mit einer Rasierklinge ausgeschnitten und nach der Vorschrift von Hunkapiller, M.W. et al, Methods in Enzymology (1983) 91 : 227-235, New York, Academic Press, unter Verwendung der CBS Scientific (Del Mar, Californien)-Elektroeluiervorrichtung elektroeluiert.
Das eluierte Protein wurde lyophilisiert, und seine N-terminale Aminosäuresequenz wurde aus einem Nanomol Protein bestimmt unter Verwendung des Applied Biosystems 470A-Gas-Phasen-Sequenzierers (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers. PTH-Aminosäuren wurden mit einem Beckman 334T-HPLC unter Verwendung einer 0.46 · 25 cm IBM-CN-Säule identifiziert. Der angewendete Gradient war wie in Hunkapiller, N. W. und Hood, L. E., Methods in Enzymology (1983) 91 : 486-492, New York, Academic Press angegeben mit den folgenden Modifikationen: Anstatt eines binären Gradientensystems wurde ein ternäres Gradientensystem verwendet, in dem Acetonitril und Methanol mit separaten Pumpen gepumpt wurden und das Verhältnis der beiden mit der Zeit während des Gradienten variierte, mit geeigneter Modifikation des Gradientenprogramms; anstatt der Permaphase ETHr-Säule wurde eine "5 · 0.46 cm IBM CN" analytische "Mini-Säule" verwendet; und die Säule wurde auf 28ºC statt auf 32ºC erhitzt.
Die N-terminale Aminosäuresequenz war:
"Hyp" bedeutet die modifizierte Aminosäure Hydroxyprolin.
Aminosäuren-Zusammensetzungs-Daten für das 32K-Hunde-Protein zeigen einen Hydroxyprolin-Gehalt, der konsistent ist mit der Hydroxylierung von Prolinresten in der abgeleiteten Sequenz (siehe unten), die in dem Collagen-ähnlichen Muster Gly-X-Hyp erscheinen. Da dieses Muster auch in der menschlichen N-terminalen Sequenz gezeigt wird, ist es wegen der Analogie zu den Hunde-Daten wahrscheinlich, daß ähnlich angelegte Proline in der menschlichen Sequenz hydroxyliert sind.
Informationen im Hinblick auf die Prozessierung wurden durch Reinigung und Sequenzierung von Collagenase-behandeltem Hunde-ASP erhalten.
Gereinigtes Hunde-ASP wurde mit bakterieller Collagenase (Worthington, Freehold NJ) bei einem 1 : 1 Enzym:Substrat-Verhältnis in 5 mM Tris pH 7.4-5 mM CaCl&sub2; bei 37ºC verdaut. Dies lieferte ein 22 kd-Limit-Verdauungsprodukt wie auf SDS-Gelen analysiert. Diese 22 kd-Bande wurde von einem Gel elektroeluiert und der Aminosäure-Sequenzanalyse wie oben beschrieben unterworfen. Zwei Aminosäuren wurden in jedem Zyklus identifiziert, was darauf hindeutet, daß die Collagenase-Behandlung zwei Peptide produziert hatte, die mit einer Disulfidbrücke verbunden bleiben. Aus der cDNA-Klon-Sequenz kann gezeigt werden, daß die beiden Sequenzen den Aminosäuren 78-110 und 203-231 im intakten Molekül entsprechen. Die erhaltenen Sequenzen sind:
und zeigen, daß die Translation vollständig ist, und daß das C-Ende des Proteins intakt ist.

D.1.e. Isolierung von menschlichem ASP

Menschliches 32K- und niedrigermolekulargewichtiges ASP wurde entsprechend dem oben beschriebenen Verfahren für Hunde-Proteine aus einem Patienten erhalten, der an alveolärer Proteinosis litt (einem Syndrom, das aus der Anwesenheit von überschüssigem Surfactant in der Lunge resultiert).
Das 32K-ASP hat die N-terminale Sequenz:
Die Aminosäuren 3-17 der menschlichen Sequenz sind genau homolog zu Aminosäuren 6-20 des Hunde-32K-Proteins mit Ausnahme des Serins an Position 9.
Die isolierten niedermolekulargewichtigen hydrophoben Proteine zeigen 16.5 kd, 14 kd und 10 kd entsprechende Banden, wenn sie Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen unterworfen werden. Unter reduzierenden Bedingungen wird eine einzelne breite Bande entsprechend 10-11 kd erhalten.

D.2. Isolierung von Hunde-Lungen-mRNA

Die gesamte RNA wurde aus einer ausgewachsenen Hundelunge mit der Methode von Chirgwin, J. M. et al, Biochemistry (1979) 18 : 5294-5299 isoliert. Das Lungengewebe wurde zuerst durch Verreiben mit einem Mörser und Pistill in flüssigem N&sub2; pulverisiert und in einer Lösung von 6 M Guanidinthiocyanat, 0.05 M Tris-HCl, pH 7.0, 0.1 M β-Mercaptoethanol, 0.5% Sarcrosyl homogenisiert. Dieses Homogenat wurde auf 2.0 M in CsCl eingestellt und über ein 5.7 M CsCl-Kissen in 0.01 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0.05 M Tris-HCl, pH 9.0 geschichtet. Die RNA wurde durch dieses Kissen durch Zentrifugation bei 115 000 · g während 16 Stunden pelletiert, wodurch sie von der zellulären DNA und Proteinen abgetrennt wurde, die nicht durch die CsCl-Lösung höherer Dichte sedimentieren. Die RNA wurde dann in 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4, 0.005 M EDTA, 1.0% Natriumdodecylsulfat (SDS) gelöst, mit einer 1 : 1-Mischung von Chloroform und Phenol extrahiert und aus 70% Ethanol ausgefällt. Die polyadenylierte RNA (poly A&spplus; RNA)-Fraktion wurde durch Affinitätschromatographie durch Oligo-(dT)-Cellulose erhalten, wie von Aviv, H., und Leder, P., Proc Natl Acad Sci (USA) (1972) 69 : 1840-1412 beschrieben.

D.3. Konstruktion und Screening der Hundelungen-cDNA-Genbank

Die in D.2 hergestellte ausgewachsene Hundelungen-poly A&spplus; -RNA wurde verwendet, um eine cDNA-Genbank wie in C.4. beschrieben herzustellen. 5 ug mRNA ergaben etwa 25 ng cDNA, größenselektiert auf mehr als 300 Basenpaare. Die Genbank enthielt etwa 200 000 unabhängige Rekombinanten. Von diesen wurden 40 000 Rekombinanten auf Nitrocellulose-Filtern plattiert. Diese Filter dienten als Master für nachfolgende Repliken (in Übereinstimmung mit der Methode von Hanahan, D., und Meselson, M., Gene (1980) 10 : 63-75.

Für das 32K-Protein codierende cDNA

Drei Proben wurden konstruiert: Eine Mischung von 24 · 14-mer- Sequenzen, die komplementär sind zu den Aminosäuren 1-5, die die Sequenz aufweisen
(Probe a); 64 · 14-mers, die komplementär zu den Aminosäuren 7-11 sind, die die Sequenz aufweisen:
(Probe b); und ein einzelnes 15-mer
das basierend auf Säuger-Codon-Präferenz ausgewählt wurde (Probe c). Jede Oligonucleotidmischung und das einzelne einheitliche Oligonucleotid wurden auf einem Biosearch SAM I-Oligonucleotid-Synthesizer hergestellt (Biosearch, Inc., San Rafael, CA), durch Modifikation der Standard- Phosphotriester-Methode, indem Mesitylensulfonylchlorid in Gegenwart von N-Methylimidazol als Kondensierungsreagenzien verwendet wurden, wie von Efimov, V. A., et al, Nucleic Acids Res (1982) 10 : 6875-6894 beschrieben, und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.
Für die Hybridisierung wurden xix-Replik-Filter von jedem Masterfilter hergestellt, so daß jede Kolonie doppelt mit jedem der drei Oligonucleotid-Proben gescreent werden konnte. Nach der Replikation von den Master-Filtern gewonnene Kolonien wurden auf Agar-Platten während 18 Stunden plaziert, die 170 ug/ml Chloramphenicol enthielten. Die Kolonien wurden dann für die Hybridisierung vorbereitet, entsprechend der Methode von Grunstein, M., und Hogness D., Proc Natl Acad Sci (1975) 72 : 3961- 3972.
Die Filter wurden bei 80ºC unter Vakuum während 2 Stunden getrocknet und dann während 4 Stunden bei 68ºC unter Schütteln in einem großen Volumen 3 · SSC (wo 1 · SSC 0.15 M NaCl, 0.015 M Natriumcitrat, pH 7.5 bezeichnet), 0.1% SDS gewaschen. Die Filter wurden während mindestens 2 Stunden bei 42ºC vorhybridisiert in 6 · SSC, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 5 · Dehnhardts Lösung (0.1% Ficoll, 0.1% Polyvinylpyrrolidon, 0.1% Rinderserumalbumin), 0.05% Natriumpyrophosphat und 50 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA.
Duplikat-Filter wurden dann pro Filter in 10 ml Hybridisierungslösung je mit 5 · 10&sup6; cpm einer jeder ³²P-markierten Oligonucleotidprobe hybridisiert (phosphoryliert in Übereinstimmung mit Maniatis, T., et al, Molecular Cloning, (1982) Cold Spring Harbor Laboratories, S. 122-123), die die identischen Bestandteile enthielt wie die Prähybridisierungslösung. Filter mit Oligonukleotidproben a, b und c wurden jeweils bei 37ºC, 45ºC und 41ºC hybridisiert. Nach 1 Stunde wurde der Thermostat für Probe a auf 28ºC und für Probe b auf 37ºC gesenkt, wonach man das Bad sich äquilibrieren ließ. Filter mit Probe c wurden nicht bei einer niedrigeren Temperatur hybridisiert. Die Filter wurden zweimal in 6 · SSC, 0.1% SDS bei Raumtemperatur während 15 Minuten, dann in 6 · SSC, 0.1% SDS jeweils bei 37ºC, 45ºC und 41ºC für die Proben a, b und c während 2 Minuten gewaschen. Die endgültige Waschtemperatur wurde aus der empirischen Formel von Suggs, S. V., et al, Developmental Biology Using Purified Genes (Herausgeber D. D. Brown und C. F. Fox), Academic Press, NY. S. 683-693; erhalten, d. h., Td = 4 (G + C) + 2 (A + T). Die hybridisierten Filter wurden dann getrocknet und auf Kodakâ XAR-Film mit Dupontâ Cronex-Intensivierungsschirmen autoradiographiert, bis komplette Belichtungen erhalten wurden.
Eine Kolonie wurde als positiv betrachtet, falls sie doppelt mit allen drei Oligonukleotidproben oder mit beiden Proben a und b hybridisierte. Von einigen potentiellen positiven Klonen hybridisierte einer wesentlich intensiver mit Proben a und b verglichen mit den anderen. Sequenzierung dieses Klons zeigte, daß er für einen Teil der Sequenz von Hunde-32K-ASP codierte. Er wurde als DS-1 bezeichnet und zur Gewinnung des gesamten 32K-Hunde-ASP verwendet.
Der gereinigte DNA-Einschub aus 375 Basenpaaren wurde aus pDS-1 durch Restriktion mit PstI exzisiert und unter Verwendung kleiner Miniprep-Methoden (Maniatis, et al, supra auf S. 366) vorbereitet und auf Agarose-Gelen isoliert. Der intakte DNA-Einschub wurde dann in den Bakteriophagen M13 (Messing, J., und Vieira, J., Gene (1982) 19 : 259-268) subkloniert und unter Verwendung der Dideoxy-Methode von Sanger, F., et al, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) (1977) 74 : 5463-5469 sequenziert. Die Sequenz codierte den N-terminalen Teil des näherungsweise 300 Aminosäure-Proteins, d. h. die aus dem gereinigten Hunde-ASP aus D.1. bestimmte 32 Reste N-terminale Aminosäuresequenz und 101 zusätzliche stromabwärts angeordnete Aminosäuren. Sie enthielt auch 50 Basenpaare der nicht-translatierten 5'-Region.
Der mRNA-Pool wurde mit Northern-Blot untersucht, um die Gegenwart von Sequenzen genügender Länge für die Codierung der gesamten Hunde-ASP-Sequenz zu bestimmen. Poly A&spplus; RNA aus D.2 wurde dem Northern- Blot unterworfen unter Verwendung von Nick-translatierter DNA mit DS-1 Einfügung nach Fraktionierung durch Elektrophorese auf einem 1.4% Agarosegel, das Methylquecksilberhydroxid enthielt nach der Methode von Bailey, J. M. und Davidson, N., Anal Biochem (1976) 70: 75-85. Mit der Probe hybridisierende mRNA hatte eine Länge von 1800-2000 Nucleotiden, klar größer als die für die codierende Sequenz etwa benötigten 700 Nukleotide.
Die DS-1-Einschubprobe wurde daher zum erneuten Screenen eines doppelten Sets von Originalfiltern verwendet, das bei 100ºC während 10 Minuten zur Entfernung restlicher Oligonucleotidprobe behandelt worden war. Die Filter wurden in 0.75 NaCl, 0.075 M Na-citrat, 50% Formamid, 0.5% SDS, 0.02% Rinderserumalbumin, 0.02% Ficoll - 400 000, 0.02% Polyvinylpyrrolidon, 0.1% Natriumpyrophosphat, 50 ug/ml Hefe-tRNA und 50 ug/ml denaturierter zerkleinerter Lachssperma-DNA bei 42ºC während 18 Stunden vorhybridisiert. 5 · 10&sup5; cpm ³²P-markierter gekochter DS-1 cDNA wurde pro ml frischem Hybridisierungspuffer zugegeben, und die Filter wurden in diesem Puffer bei 42ºC während 16 Stunden inkubiert. Sie wurden dann in 0.03 M NaCl und 0.003 M Natriumcitrat und 0.1% SDS zweimal jeweils für 30 Minuten bei 50ºC gewaschen, und zur Autoradiographie über Nacht belichtet. Zwei zusätzliche Klone, DS-4 und DS-31, wurden identifiziert, die gemeinsam mit DS-1 grob gesagt 1700 Basenpaare umfassen (Fig. 1).
DS-4 und DS-31 wurden ebenfalls unter Verwendung von PstI exzisiert, in die PstI-Position von M13mp9 subkloniert und durch Dideoxy-Sequenzierung entsprechend der Methode von Sanger, F. (supra) sequenziert. Die gesamte Sequenz enthält zwei interne PstI-Schnittstellen. Bestätigung der korrekten Sequenzierung wurde erhalten durch Dideoxy-Sequenzierung von Fragmenten, die von abgeleiteten internen Restriktionsorten erhalten wurden, wie in Fig. 1 gezeigt. Die die Aminosäuresequenz von ASP einschließlich gesamte Nukleotidsequenz, die von dem offenen 256 Codon- Leserahmen abgeleitet wurde, ist in Fig. 1 gezeigt.

Für Hunde-10K-ASP codierende cDNA

Zwei der N-terminalen Sequenz des 16.5 kd Proteins entsprechende oligomere Proben wurden hergestellt unter Verwendung von Säuger-Codon- Präferenztabellen zur Codon-Auswahl. Probe 1198 war ein 36-mer der Sequenz
Probe 1199 war ein 45-mer der Sequenz
Beide wurden mit ³²P durch Umsetzung mit Kinase markiert.
Für die Hybridisierung wurden Filter bei 80ºC während 2 Stunden unter Vakuum getrocknet und dann während 4 Stunden bei 68ºC unter Schütteln in einem großen Volumen aus 3 · SSC, enthaltend 0.1% SDS gewaschen. Die Filter wurden während mehrerer Stunden bei 42ºC in 6 · SSC, 5 · Dehnhardt's, 20% Formamid, 0.1% SDS und 100 ug/ml zerkleinerter, denaturierter Lachssperma-DNA prähybridisiert. Duplikat-Filter wurden in dem obigen Puffer bei einer Anfangstemperatur von 68ºC und dann bei 42ºC über Nacht hybridisiert, der entweder 13 ng/ml Probe 1198 oder 16 ng/ml Probe 1199 enthielt. Die Filter wurden zweimal während 15 Minuten bei Raumtemperatur in 6 · SSC, 0.1% SDS, 0.05% Natriumpyrophosphat und dann während 5 Minuten bei 65ºC in demselben Puffer gewaschen und dann getrocknet und autoradiographiert.
Von 40 000 gescreenten Klonen hybridisierten 8 mit beiden Proben und wurden der Restriktionsanalyse unterworfen. Zwei überlappende Klone, die bei Kombination 1520 Nukleotide abdeckten, wurden sequenziert mit den in Fig. 2 dargestellten Ergebnissen. Der Pfeil zeigt den Beginn des reifen 16.5 kd-Proteins an.

D.4. Isolierung des menschlichen 32K-ASP-Gens

Eine in den Bacteriophagen Charon 28 (Rimm, D. L., et al, Gene (1980) 12 : 301-310 klonierte menschliche Genom-Genbank wurde von Dr. T. Maniatis, Harvard University erhalten. Etwa 1.5 · 10&sup6; Phagen wurden auf E. coli K803 gezüchtet, und Plaque-Lysate wurden auf Nitrocellulosefilter transferiert wie bei Benton, W. D., et al , Science (1977) 196 : 180-182 beschrieben. Die Filter wurden mit DS-1 cDNA geprobt, die nach der Nick- Translationsmethode von Rigby, P. W. J. et al, J Mol Biol (1977) 113 : 237-251 mit Kinase umgesetzt worden war. Die Filter wurden bei 42ºC während 1 Stunde in Hybridisierungspuffer vorgewaschen (0.75 M NaCl, 0.75 M Natriumnitrat, 40% Formamid, 0.05% SDS, 0.02% Rinderserumalbumin, 0.02% Ficoll - 400 000, 0.02% Polyvinylpyrrolidon, 0.01% Natriumpyrophosphat, 50 ug/ml Hefe-tRNA, 50 ug/ml denaturierte zerkleinerte Lachssperma-DNA). 5 · 10&sup5; cpm-Probe wurde pro ml frischem Hybridisierungspuffer zugegeben, und die Filter wurden in diesem Puffer bei 37ºC während 16 Stunden inkubiert. Sie wurden dann in 0.45 M NaCl und 0.045 M Natriumcitrat und 0.1% SDS 2 mal bei 50ºC gewaschen und zur Autoradiographie über Nacht belichtet. Sechs potentielle Klone, die mit DS-1-cDNA hybridisierende Sequenzen enthielten, wurden gereinigt. Der am stärksten hybridisierende Klon, gHS-15, wurde charakterisiert.
Ein 700 bp EcoRI-Fragment aus gHS-15 hybridisierte mit der DS-1- Probe und wurde zur Sequenzanalyse ausgewählt. Dieses EcoRl-Fragment wurde gereinigt, in M13mp9 insertiert, sequenziert, und es wurde festgestellt, daß es stark homolog ist mit der entsprechenden Sequenz aus Hunden.
Die gesamte menschliche codierende Region war in zwei aufeinanderfolgende BamHI-Fragmenten enthalten: ein 5' 1.2 kb- und ein 3' 3.5 kb-Fragment. Beide BamHI-Fragmente wurden einzeln in den BamHI-Ort von M13mp8 subkloniert und sequenziert. Zusätzliche Fragmente wurden entsprechend der in Fig. 3 dargestellten Strategie ähnlich sequenziert. Die Sequenzinformation wurde unter Verwendung verschiedener Intelligenetics (Palo Alto, CA)-Computerprogramme analysiert entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die das Signalpeptid, die Vorläufersequenz und das reife Apoprotein enthaltenden Regionen wurden durch Vergleich mit der Hunde-ASP-cDNA identifiziert. Nach der Sequenzanalyse ist das 5'-Ende des Gens im 1.2 kb BamHI-Fragment und das 3'-Ende im 3.5 kb BamHI-Fragment codiert. Das Gen ist durch drei Introns an den Positionen 1218 bp, 1651 bp und 2482 bp unterbrochen, wobei Position 1 das erste Basenpaar des 1.2 kb BamHI-Fragments ist. Die gesamte Sequenz einschließlich der abgeleiteten Aminosequenz des menschlichen ASP-Proteins ist in Fig. 3 dargestellt.

D.5. Expression von menschlichem 32K-ASP

Das Phagen-Isolat gHS-15, von dem in D.5 festgestellt wurde, daß es einen Einschub von etwa 16 kb beherbergt, der das gesamte menschliche ASP-Gen enthält, wurde in CHO-Zellen transferiert, die in McCoy's 5A-Medium mit 10% fötalem Rinderserum durch Co-Transformation mit pSV2:NEO gezüchtet worden waren (Southern, P., et al, J Mol Appl Genet (1982) 1 : 327-341), einem Plasmid, das ein funktionelles Gen enthält, das Resistenz gegen das Neomycin-Analogon G148 überträgt, das für Säugerzellen toxisch ist. Bei der Transformation wurden 15 ug des X:gHS-15 und 2 ug pSV2:NEO zu einer 100 mm Petrischale CHO-Zellen in einem Calciumphosphat-DNA-Copräzipitat angewendet, entsprechend der Methode von Wigler, M., et al, Cell (1979) 16 : 777-785, einschließlich eines 2-minütigen "Schocks" mit 15% Glycerol 4 Stunden nach der Exposition mit der DNA. Die Zellen wurden in 1 ug/ml G418 enthaltendes Medium transferiert und ergaben etwa 50 stabile Transformanden pro 100 mm-Petrischale.
Stabile Transformanden wurden vor der Markierung in mit 0.25 mMol Ascorbinsäure versehenem Medium kultiviert. Zwei Pools von stabilen Transformanden und 1 Pool unbehandelter CHO-Zellen wurden während 1 Stunde in 1/10 normale Methionin-Konzentration enthaltendem Medium gezüchtet und dann mit ³&sup5;S-Methionin während 8 bis 16 Stunden markiert, und die ³&sup5;S-met-markierten gesamten sekretierten Proteine wurden durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Bahn 1 zeigt die normalen CHO-sekretierten Proteine. Die Bahnen 2 und 3 zeigen k:gHS-15-sekretierten Proteine: beide davon haben einem exprimierten ASP-Protein entsprechendes zusätzliches 30-36 kd-Protein. Um die Identität des 30-36 kd-Proteins weiter zu dokumentieren, kann man die gesamten sekretierten Proteinproben mit Hunde-ASP-Antikörpern immunopräzipitieren. Der Vektor k:gHS-15 wurde bei der American Type Culture Collection am 7. Dezember 1984 hinterlegt und hat die Zugangsnummer ATCC 40146.

D.6. Herstellung von humanen cDNA-Klonen für die 32K und 10K-Proteine

Menschliches 32K-ASP

Menschliche Lunge wurde aus zwei Föten erhalten, einer im Alter von 22 Wochen der andere im Alter von 24 Wochen. 7 g Lungengewebe wurden zunächst durch Verreiben mit einem Mörser und Pistill in flüssigem N&sub2; pulverisiert, und die gesamte poly A&spplus;-PNA wurde hergestellt wie in D.2 (supra) aufgeführt.
Eine cDNA-Genbank wurde aus der mRNA hergestellt wie in C.4 beschrieben. 5 ug Lungen poly A&spplus;-RNA ergaben etwa 25 ng cDNA, größenselektiert auf größer als 500 Basenpaare, und ergaben eine Genbank von 300 000 unabhängigen Rekombinanten.
60 000 Angehörige der menschlichen cDNA-Genbank wurden mit der Hunde DS-1-cDNA in der oben beschriebenen Art für das Screenen der Genom- Genbank gescreent. Die rekombinanten Kolonien wurden auf Nitrocellulose- Filter plattiert, die als Master für zwei Sets von Repliken dienten. Die Koloniefilter wurden dann für die Hybridisierung vorbereitet, entsprechend der Methode von Grunstein, M., und Hogness, D. (supra). Die Filter wurden während 2 Stunden bei 80ºC unter Vakuum getrocknet und dann während 4 Stunden bei 68ºC unter Schütteln in einem großen Volumen 3 · SSC und 0.1% SDS gewaschen. Als nächstes wurden die Filter in 0.75 M NaCl, 0.075 M Natriumnitrat, 40% Formamid, 0.5% SDS, 0.02% Rinderserumalbumin, 0.02% Ficoll - 400 000, 0.02% Polyvinylpyrrolidon, 50 ug/ml Hefe-tRNA, 50 ug/ml denaturierter zerkleinerter Lachssperma-DNA bei 37ºC während 18 Stunden vorhybridisiert. 1 · 10&sup6; cpm ³²P-markierte DS-1-Probe wurde pro ml frischer Hybridisierungspuffer zugegeben und dann während 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Filter wurden dann in 0.45 M NaCl und 0.045 M Natriumcitrat und 0.01% SDS jeweils während 30 Minuten bei 50ºC zweimal gewaschen und zur Autoradiographie über Nacht belichtet.
Ein positiv hybridisierender Klon, HS-6, wurde weiter durch Sequenzbestimmung analysiert; HS-6 beherbergt einen 1.2 kb-Einschub, der aus dem Vektor unter Verwendung von PstI-Verdauung freigesetzt werden kann, und der eine interne EcoRI-Schnittstelle trägt. Beide PstI-EcoRI- Fragmente aus dem Einschub wurden in den PstI-EcoRI-Ort von M13mp8 und mp9 subkloniert, und Partialsequenzen wurden erhalten. Der über 200 bp sequenzierte Teil entspricht perfekt dem 3'-Ende von gHS-15. Die Nucleotidsequenz von HS.-6 ist in Fig. 5 dargestellt.
Da der HS-6 cDNA-Einschub lediglich die 3'-terminale Region der ASP-mRNA enthielt, wurden die verbleibenden Klone nach benachbarten Surfactant-Sequenzen gescreent unter Verwendung von HS-6 als Probe. Im Rest der Genbank wurden keine Klone gefunden.
Um die komplette für menschliches 32K-ASP codierende cDNA zu erhalten, wurde aus menschlicher Lunge von Erwachsenen eine statistisch geprimte cDNA hergestellt und unter Verwendung von EcoRI-Linkern mit dem Verfahren von Huynh, T., et al, cDNA Cloning Techniques: A Practical Approach (Glover, D., ed) IRL, Oxford in den Bacteriophagen-Vektor gt10 kloniert. Menschliche Lunge ist stark angereichert mit ASP-Transkripten verglichen mit fötalem Lungengewebe (unsere Beobachtungen) und bietet daher eine größere Häufigkeit für die Gewinnung einer kompletten ASP- cDNA.
Phagenplaques wurden mit einem ³²P-markierten Einschub aus pHS-6 gescreent unter Verwendung von 5 · 10&supmin;&sup5; cpm/ml in 50% Formamid, 5 · SSC, 0.05% SDS, 5 · Dehnhardt's, tRNA und Lachssperma-DNA bei 47ºC während 16 Stunden. Die Filter wurden zweimal bei 50ºC während 30 Minuten jeweils in 0.2 · SSC, 0.1% SDS gewaschen, getrocknet und autoradiographiert.
Zwei positiv hybridisierende Klone, als pHS-2 und pHS-5 bezeichnet, wurden isoliert. Jeder enthielt die gesamte für 32K-ASP codierende Sequenz und den größten Teil der nicht translatierten 5'-Region. Jeder überlappte mit HS-6, der den größten Teil der nicht translatierten 3'- Region enthielt. Das 3'-Ende jedes Ions entspricht der EcoRI-Schnittstelle innerhalb der codierenden Region.

Menschliches 10K-ASP

Dieselbe cDNA-Genbank in Lambda gt10 wurde wie oben auf Nitrocellulosefiltern unter Verwendung von 1 · 106 cpm des oben beschriebenen Hundeklons pD10k-1 in 40% Formamid, 5 · SSC, 0.05% SDS, 5 · Dehnhardt's, 50 ug/ml Hefe-tRNA und 50 ug/ml Lachssperma-DNA während 16 Stunden bei 37ºC gescreent. Die Filter wurden zweimal bei 50ºC während 30 Minuten in 2 · SSC, 0.1% SDS gewaschen, getrocknet und autoradiographiert. Von 40 000 Plaques waren zwei positiv, und ein einen 1.5 kb-Einschub enthaltender als lambda H10k-1 bezeichneter wurde zur Sequenzierung ausgewählt. Vorläufige partielle Sequenzierungsergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Die unterstrichenen Aminosäurereste stellen Homologien mit dem Hunde-Protein dar.

D.7. Konstruktion von Expressionsvektoren

Vektoren wurden konstruiert, die geeignet sind für die Expression der genomischen für menschliches 32K-ASP codierenden Sequenz in Säugerzellen, die in der Lage sind, Intron-enthaltende DNA zu prozessieren. Expression wird durch die Metallothionein II (hMTII)-Kontrollsequenzen kontrolliert, wie von Karin, M., et al, Nature (1982) 299 : 797- 802 beschrieben.
Der Wirtsvektor pMT wird durch Ligation des Promotors in pUC8 wie folgt erhalten:
Plasmid 84H (Karin, M., et al (supra)), der das hMTII-Gen trägt, wurde vollständig mit BamHI verdaut, mit Exonuklease Bal-31 zur Entfernung terminaler Nukleotide behandelt und dann mit HindIII zur Freisetzung eines 840 bp-Fragments verdaut, das die Nukleotide -765 bis +70 des hMTII-Gens enthält (Nukleotid +1 ist das erste transkribierte Nukleotid). Das 840 bp-Fragment wurde isoliert und mit HindIII/HincII- verdautem pUC8 ligiert (Vieira, J., et al, Gene (1982) 19 : 259-268) und die Ligationsmischung in E. coli MC1061 transformiert. Die korrekte Konstruktion von pMT wurde durch Dideoxy-Nucleotid-Sequenzierung bestätigt.
Zusätzlich wurde ein Derivat von pMT, pMT-Apo, hergestellt, das C-terminale Regulationssignale enthielt. pMT-Apo beherbergt einen Teil des menschlichen Leberprotein-ApoA&sub1;-Gens (Shoulders, C. C., et al, Mucleic Acids Res (1983) 11:2827-2837), das die 3'-terminalen Regulationssignale enthält. Ein PstI/PstI 2.2 kb-Fragment des ApoA&sub1;-Gens (stumpfendig) wurde in den SmaI-Ort der pMT-Polylinker-Region kloniert, und der größte Teil des ApoA&sub1;-Gens durch Verdauen mit BamHI, Abstumpfen der Enden mit Klenow, Verdauung mit StuI, und Religation entfernt. Der resultierende Vektor enthält grob gesagt 500 bp des ApoA&sub1;-Gens vom 3'- Ende, wie durch Dideoxysequenzanalyse bestätigt.
Fünf Konstrukte des menschlichen ASP-Gens und des pMT und pMT- Apo-Expressionsvektors wurden unter Verwendung der 1.2 kb- und 3.5 kb- BamHI-Fragmente von gHS-15 hergestellt. Alle Konstrukte wurden isoliert und sowohl durch Restriktionsanalyse als auch Dideoxy-Sequenzierung bestätigt. Diese Konstrukte wurden hergestellt wie folgt:
1. Die 1.2 kb- und 3.5 kb-BamHI-Fragmente wurden zur Herstellung von pMT:GHS in den BamHI-Ort von pMT kloniert.
2. das 1.2 kb BamHI-Fragment wurde am 5'-Ende durch Verdauung mit HinfI (Position 950) zurückgeschnitten und mit Klenow aufgefüllt. Das abgeschnittene Fragment wurde gemeinsam mit dem 3.5 kb-Fragment in den BamHI-Ort von pMT kloniert zur Herstellung pMT:gHS (HinfI);
3. die Fragmente aus 2 wurden statt dessen in den BamHI-Ort von pMT-Apo kloniert und ergaben pMT-Apo:gHS(HinfI);
4. das 3.5 kb-BamHI-Fragment wurde am 3'-Ende durch Verdauung mit EcoRI (Position 3434) abgeschnitten und mit Klenow aufgefüllt. Dieses abgeschnittene Fragment wurde gemeinsam mit dem 1.2 kb-Fragment, das mit HinfI wie oben abgeschnitten war, in den BamHI-Ort von pMT-Apo kloniert und ergab pMT-Apo:gHS(HinfI/EcoRI);
5. das 1.2 kb-Fragment wurde am BstEII-Ort bei Position 356 und das 3.5 kb-Fragment am BstEII-Ort an Position 4024 abgeschnitten. Diese Fragmente wurden in den BamHI-Ort von pMT-Apo kloniert und ergaben pMT- Apo:gHS(BstEII).
Die resultierenden pMT:gHS-Konstrukte wurden in CHO-Zellen transferiert, wie in D.6 aufgeführt, außer, daß 10&supmin;&sup4; M ZnCl&sub2; mit ³&sup5;S- Methionin zugegeben wurde, um den Metallothionein-Promotor zu induzieren und die produzierten Proteine zu markieren.
Nach 8-16 Stunden wird das Medium auf das gesamte sekretierte ³&sup5;S-met-markierte Protein analysiert, das mit Antikörpern für Hunde-ASP immunopräzipitiert. Nicht-immune IgG werden als Kontrolle verwendet.

D.8. Optimierung der Expression

Die Expressionsbedingungen wurden optimiert, und zusätzliche den SV40 viralen Verstärker enthaltende Vektoren wurden zur Erhöhung des Expressionslevels in CHO-Zellen verwendet. Drei Vektoren wurden verwendet: pMT-Apo:gHS(Hinf I/EcoRI) wie oben beschrieben und unten weiter charakterisiert, und pASPc-SV(10) und pASPcg-SV(10), die konstruiert werden wie unten beschrieben.

Enhancer-enthaltende Vektoren

Um den SV40-Enhancer in funktioneller Verbindung mit dem MT-II- Promotor enthaltende Wirts-Expressionsvektoren zu erhalten, wurde ein 1100 bp-SV40-DNA-Fragment in den den MT-II-Promotor-Sequenzen in pMT vorangehenden HindIII-Art insertiert. Das SV40-DNA-Fragment überspannt den SV40-Replikationsursprung und schließt Nukleotid 5171 bis Nukleotid 5243 (am Ursprung), die duplizierte 72 bp-Wiederholung von Nukleotid 107-250 ein und setzt sich bis Nukleotid 1046 auf der Ursprungsseite fort, die das 5'-Ende später viraler mRNAs enthält. Dieses HindIII-110 bp-Fragment wird aus einer HindIII-Verdauung von SV40-DNA erhalten (J. Buchman, A.R., et al, DNA Tumor Viruses, m 2d ed (J. Tooze, ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1981), S. 799-841), und zur Amplifikation in pBR322 kloniert. Der Klonierungsvektor wurde mit HindIII geschnitten, und das 1100 bp SV40-DNA-Fragment durch Gelelektrophorese isoliert und mit HindIII-verdautem, CIP-behandeltem pMT ligiert. Die resultierenden Vektoren, als pMT-SV(9) und pMT-SV(10) bezeichnet, enthalten dem MT-II-Promotor vorhergehend das Fragment in entgegengesetzten Orientierungen. In pMT-SV(9) befindet sich der Enhancer etwa 1600 bp vom 5'-mRNA-Startort; in der umgekehrten Orientierung liegt er etwa 980 bp vom 5'-mRNA-Startort entfernt. Beide Orientierungen sind funktionell, aber die Orientierung, bei der die Enhancersequenzen proximal zum Startort sind, liefern höhere Expressionslevels.

pASPc-SV(10)

Die codierenden Sequenzen für ASP wurden in die oben beschriebene modifizierte Form des Wirtsvektors pMT-SV(10) insertiert. Zuerst wurde das 500 bp apoAI-Fragment in pMT-SV(10) insertiert, indem dieses durch Verdauung von pMT-Apo (oben beschrieben) erhaltene Fragment isoliert wurde und das Isolat in EcoRI/BamHI verdautes pMT- SV(10) ligiert wurde. Der modifizierte Vektor wurde mit BamHI verdaut, abgestumpft und mit den aus pHS-5 (White, R.T., et al, Nature (1985) 317 : 361-363) erhaltenen cDNA-Sequenzen als abgestumpfter EcoRI-Aufschluß gebunden. Das cDNA-Fragment erstreckt sich von dem an die nicht-translatierte 5'-Region gebundenen EcoRI-Linker bis zu der natürlich auftretenden EcoRI-Schnittstelle in der nicht translatierten 3'-Region (900 bp).
Die relevanten Nucleotidsequenzen sind in Fig. 7 dargestellt, wo die mit Stern versehenen Aminosäuren Unterschiede in der primären Aminosäuresequenz von der aus pMT-Apo:gHS(HinfI/EcoRI) erhaltenen repräsentieren. (Die Unterschiede resultieren aus Basenwechseln zwischen menschlicher cDNA und der Genom-Sequenz.) Die Initiation der Translation erfolgt am Nucleotid 56 wie in der nativen Sequenz.

pASPcg-SV(10)

Eine zusätzliche Modifikation wurde hergestellt durch Integration von pASPc-SV(10) und pMT-Apo: gHS(HinfI/EcoRI)-Sequenzen. Plasmid pASPc-SV(10) wurde mit BamHI und EcoRI verdaut, und das isolierte größere Fragment an den 3¹-Teil des ASP-Gens ligiert, das durch BamHI/EcoRI-Verdauung (partial) von pMT-Apo:gHS(HinfI/EcoRI erhalten wurde. Dieses stellt den Teil des menschlichen ASP-Gens dar, der beim Nucleotid 1154 beginnt und sich bis zum Nucleotid 3432 erstreckt, wobei dieses an das ApoAI-Genfragment ligiert ist wie oben. Dieses Konstrukt resultiert in einem Protein, das identisch ist mit dem aus pMT- Apo:gHS(Hinf I/EcoRI) erhaltenen), aber verschieden ist an den Aminosäurepositionen 25, 30 und 34 von dem aus pASPc-SV(10) erhaltenen. Die Nucleotidsequenz des relevanten Einschubs ist in Fig. 8 dargestellt.

pMT-Apo. gHS (HinfI/EcoRI)

Für den Genom-DNA-enthaltenden Vektor pMT-Apo:gHS(HinfI/EcoRI) wurden die codierenden Sequenzen als HinfI/EcoRI-Fragment des von Nukleotid 950 bis Nukleotid 3432 sich erstreckenden Gens erhalten, das Exons 2, 3 und 4 und einen Teil von Exon 5 enthält. Siehe auch White, R.T., et al, Nature (1985) 317 : 361-363. Dieses Fragment wurde mit einem 500 bp-Fragment vom 3'-Ende des menschlichen ApoAI-Gens (Shoulders, C.C., Nucleic Acids Res (1983) 11 : 2827-2837) ligiert, das das Polyadenylierungssignal und den Polyadenylierungsort enthält, wie oben dargestellt. Der gesamte ASP-codierende Genomeinschub ist in Fig. 9 an den MT-II-Promotor gebunden dargestellt.
Es wurde erwartet, daß dieser Vektor ein Protein produzieren würde, das 23 Aminosäuren länger ist als das native Präprotein (das die Signalsequenz einschließt). Dem Konstrukt fehlt Exon 1, und daher initiiert die Translation wahrscheinlich am ATG-Anfang bei Nukleotid 987 der Genomsequenz, die komplementär ist zu nativer Präprotein-mRNA, wobei das Nukleotid üblicherweise im ersten Intron angeordnet ist. Bei der Produktion von nativem Präprotein wird Exon 1 am Nukleotid 1022 zu Exon 2 gespleißt, wobei dieses Startcodon gelöscht wird, und die Translationsinitiation bei Nukleotid 1046 ermöglicht wird. Die zusätzlichen Reste scheinen jedoch nicht mit der Sezernierung zu interferieren, und das normale reife Protein wird von Zellen sekretiert, die diese modifizierte Form des Gens exprimieren.

Transformationsverfahren

Jeder der oben beschriebenen Vektoren wurde in CHO-Zellen wie folgt transformiert: Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO)-KI- Zellen wurden auf einem Medium gezüchtet, das aus einer 1 : 1 Mischung von Coon's F12-Medium und DME21-Medium mit 10% fötalem Kälberserum zusammengesetzt war. Die kompetenten Zellen wurden mit dem interessierenden Vektor und pSV2:NEC (Southern, P., et al, J Mol Appl Genet (1982) 1 : 327- 341) cotransformiert. pSV2:NEO enthält ein funktionales Gen, das Resistenz gegen das Neomycin-Analogon G418 überträgt. In einer typischen Transformation werden 0.5 ug pSV2-NE0 und 5 ug oder mehr der Expressionsvektor-DNA bei einer 100 mm-Petrischale Zellen angewandt. Die Calciumphosphat-DNA-Copräzipitation entsprechend dem Verfahren von Wigler, M., et al Cell (1979) 16 : 777-785, wurde verwendet, einschließlich einem 2 Minuten "Schock" mit 15% Glycerol in PBS nach 4 Stunden Exposition mit der DNA.
Kurz gesagt, wurden die Zellen bei 1/10 Konfluenz angeimpft, wuchsen über Nacht, wurden 2 · mit PBS gewaschen und in 0.5 ml Hepes-gepufferter Kochsalzlösung während 15 Minuten plaziert, die das CaPO&sub4;·DNA Co-Präzipitat enthielt und dann mit 10 ml Medium gefüttert. Das Medium wird durch Absaugen entfernt und mit 15% Glycerol in PBS während 1.5 bis 3 Minuten ersetzt. Die "geschockten" Zellen werden gewaschen und mit Kulturmedium gefüttert. Bis zur Induktion der MT-II-kontrollierten Expression enthält das Medium F12/DMEM21 1 : 1 mit 10% FBS. Einen Tag später werden die Zeilen 1 mg/ml G418 ausgesetzt, um einen Pool G418-resistenter Kolonien zur Verfügung zu stellen. Erfolgreiche Transformanden, die auch eine stabile Vererbung des gewünschten Plasmids aufweisen, werden dann bei niedriger Dichte für die Reinigung der klonalen Isolate plattiert.

Assay der Produktionslevels von ASP

Die Transformanden werden hinsichtlich der Herstellung des gewünschten Proteins mit einem Assay untersucht, zuerst als Pools, und dann als isolierte Kione in Mehrfachvertiefungsplatten. Die Plattenassay- Levels sind teilweise abhängig von der Vertiefungsgröße - beispielsweise sind Ergebnisse von Platten mit 24 Vertiefungen nicht direkt vergleichbar mit denen aus Platten mit 96 Vertiefungen. Klone, bei denen mit dem Platten-Assay gefunden wird, daß sie das Protein mit einem zufriedenstellenden Level produzieren, können dann in Herstellungsdurchläufen in Zylinderflaschen gezüchtet werden. Typischerweise werden die Produktionslevels höher, wenn Maßstabsvergrößerung durchgeführt wird. Es besteht jedoch keine absolute Korrelation zwischen der Leistung im Platten-Assay und in Zylinderflaschen - beispielsweise sind Kulturen, die die besten Produzenten in Platten-Assay sind, nicht notwendigerweise die besten nach der Maßstabsvergrößerung. Aus diesem Grund werden typischerweise 100-200 oder mehr Einzelklone mit verschiedenen Screening-Methoden auf Platten im Assay untersucht, und 5 bis 10 der besten Produzenten werden unter Produktionsbedingungen (Zylinderflasche) im Assay untersucht.

Platten-Assays

Pools von mit verschiedenen für ASP codierenden Plasmiden transformierten Zellen wurden in Platten mit vielen Vertiefungen gezüchtet und dann einer 5 · 10&supmin;&sup5; bis 1 · 10&supmin;&sup4; Zinkionen-Konzentration ausgesetzt, um die Produktion von ASP zu induzieren. ASP-Assays wurden unter Verwendung von Western-Blot durchgeführt, wobei Immunopräzipitation mit polyklonalem anti-menschliches ASP-Antiserum aus Kaninchen, gefolgt von 1251 Protein A und Autoradiographie verwendet wurde.
Detaillierter gesagt, wurden semikonfluente Monoschichten von einzelnen Zellinien, die in McCoy's 5A-Medium mit 10% FBS wachsen, mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und erneut mit McCoy's gefüttert, das 10% FBS, 1 · 10&supmin;&sup4; Zinkchlorid und 0.25 mM Natriumascorbat enthielt. (Ascorbat kann bei der Vermittlung der Hydroxylierung von Prolinresten hilfreich sein.) 24 Stunden nach der Induktion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und erneut mit Serum-freiem McCoy's gefüttert, das das Zinkchlorid und Ascorbat enthielt. Nach 12 Stunden wurden die konditionierten Medien gesammelt, auf 20 mMol mit Tris, pH 8 eingestellt und durch Nitrocellulose in einer BRL-Dot-Blot-Apparatur filtriert. Der Nitrocellulosefilter wurde blockiert in 50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl (Tris/Salz), die 5% fettarme Trockenmilch enthielt, und dann mit 1 : 5000-Verdünnung von polyklonalem anti-menschlichen ASP- Antiserum aus Kaninchen in der Blockierlösung inkubiert, einige Male mit dem obigen Tris/Salz gewaschen und mit 25 uCi von ¹²&sup5;1-Protein A in Blockierlösung inkubiert, gewaschen und autoradiographiert.
Die meisten der mit den für ASP codierenden Vektoren transformierten Pools produzierten kein in diesem Assay detektierbares ASP. Eine positive ASP-sekretierende Zellinie, A-38 bezeichnet, wurde aus den pMT- Apo:gHS (HinfI/EcoRI)-Transformanden selektiert. Darüber hinaus produzierten einige der Pools aus mit pASPc-SV(10), als ASP-I bezeichnet, oder mit pASPcg-SV(10), als ASP-F und ASP-G bezeichnet, transformierten Zellen Levels von ASP, die mit denen von der unten beschriebenen D-4 bezeichneten Zellinie produzierten vergleichbar sind (-2-5 ug/ml.

Charakterisierung des ASP-Proteins

Die A-38-Zellen (supra) wurden bis 25% Konfluenz in 10% FBS enthaltendem McCoy's 5A-Medium gezüchtet und dann mit 10% FBS und 0.25 mM Natriumascorbat enthaltendem McCoy's mit 10&supmin;&sup4; M Zinkchlorid induziert. (Die Hälfte der Zellen wurde auch mit 10&supmin;&sup6; M Dexamethason behandelt.) 24 Stunden später wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit RPMI-Medium erneut gefüttert, das 10% dialysiertes FBS, 1 · 10 4 M Zinkchlorid, 0.25 mM Natriumascorbat und 0.5 mCi/ml ³&sup5;S-Methionin enthielt.
18 Stunden später wurde die überstehende Flüssigkeit der Zellen mit Phenylmethylsulfonylfluorid auf 1 mM eingestellt und unter Verwendung von Protein A als Träger mit anti-Hunde-ASP-Antiserum aus Kaninchen immunopräzipitiert. Die Hälfte des ausgefällten Proteins wurde in SDS- PAGE-Probenpuffer gekocht, und die andere Hälfte mit 0.75% Triton X- 100, 0.075% SDS, 0.075% 2-Mercaptoethanol, 30 mM EDTA, 75 mM Natriumphosphat, pH 1 eluiert und während 1 Stunde bei 37ºC mit 0.5 Einheiten Endoglycosidase-F (endo-F) inkubiert. Mit endo-F behandelte und unbehandelte Proteinfraktionen wurden SDS-Page unterworfen, mit denen in Fig. 10 dargestellten Ergebnissen. Die endo-F-behandelte Fraktion zeigte ein 30 kd-Protein (Bahn F) verglichen mit 38 kd-Protein für die unbehandelte Fraktion (Bahn E). (Bahn M enthält Größenmarker, Bahnen A und B überstehende Flüssigkeit aus nicht transformierten CHO-Zellen und Bahnen C und D überstehende Flüssigkeit von A-38-Zellen, die jeweils nicht behandelt und mit Dexamethason behandelt sind.)

Supertransfektion zur Herstellung von D-4

Eine zusätzliche Zellinie, D-4 bezeichnet, wurde erhalten durch Supertransfektion von A-38 mit einer Mischung von pMT- Apo:gHS(HinfI/EcoRI) (20 ug) und pSV2:GPT (1 ug). Semikonfluente Monoschichten von A-38, die in F12/DMEM21 mit 10% FBS wachsen, wurden wie oben beschrieben cotransfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen 1 : 5 verteilt in 10% FBS und HAT-Selektions-Arzneimittel enthaltende F12/DMEM21. Nach 17 Tagen HAT-Selektion wurde der Pool überlebender resistenter Klone nach individuellen Klonen mit der Immunofilter- Screening-Methode von McCracken, A.A., et al Biotechniques (März/April 1984) 82-87 gescreent, die hohe Levels produzieren. Kurz gesagt, wurden die Zellen in 100 Zellen pro 100 mm-Petrischale in F12/DMEM21, 10% FBS, auf Platten geimpft. Nach 5 Tagen (wenn die Kolonien jeweils 50 bis 200 Zellen enthalten) wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit Serum-freiem F12/DMEM21 erneut gefüttert und mit einem sterilen Teflon-Drahtnetz überschichtet. Auf dem Draht wurde ein Nitrocellulose-Filter plaziert, der 8 Stunden dort belassen wurde. Die Nitrocellulose wurde entfernt und als Immunoblot behandelt, zunächst mit polyklonalem anti-Hunde-ASP-Antiserum aus Kaninchen, dann mit ¹²&sup5;I-Protein A, gefolgt von Autoradiographie. Von etwa 2000 gescreenten Kolonien ergaben zwei ein detektierbares Signal und von einer, D-4 bezeichnet, wurde gezeigt, daß sie das ASP-Gen in 10-20fachem Level von A-38 exprimiert, oder in einer geschätzten 2-5 ug/ml ASP entsprechenden Menge.

Charakterisierung

Das sekretiert. ASP aus der D-4-Zellinie wurde aus dem serumfreien Medium durch Affinitätschromatographie isoliert und am N-Ende auf einem Gasphasen-Mikrosequenzierer sequenziert. Die Bestimmung einer 16- Aminosäure-Sequenz zeigte komplette Homologie mit dem N-terminalen Teil des aus der Lungenspülung isolierten Proteins; 70% insgesamt enthielten einen N-terminalen Glu-Rest; die restlichen 30% wurden so abgeschnitten, daß sie ein N-terminales Val enthielten (Position 2 relativ zu Glu). Dies ist dieselbe Zusammensetzung wie das isolierte Spülungs-Protein. Hydroxyproline waren an Positionen 10, 13 und 16 anwesend, wodurch die Fähigkeit der Zellen zur post-translationalen Prozessierung angezeigt wird.
Darüber hinaus wurde das von D-4 sekretierte Protein gemeinsam mit der von Pool-ASP-I (supra) und von Pool ASP-G (supra) sekretierten Proteinfraktion mit dem Lungenspülungs-Protein aus humaner Proteinose unter Verwendung von Western-Blot verglichen. Serum-freies Medium aus induzierten Zellen wurde mit TCA ausgefällt, mit endo-F behandelt (oder nicht) und SDS-Page in 12.5%-Gelen unterworfen. Das Gel wurde mit Elektroblot behandelt und mit polyklonalem anti-menschlichem-ASP-Antiserum aus Ratten durch Tüpfeln inkubiert, gefolgt von ¹²&sup5;I-Protein A. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 dargestellt.
Bahnen A und F enthalten 1 ug alveoläres Proteinosis-Protein vor und nach Endo-F-Verdauung; Bahnen B, C und D stellen Medien aus D-4, ASP- I Pool, und ASP-G Pool dar, jeweils nicht mit Endo-F behandelt; Bahnen G, H und 1 stellen mit Endo-F-behandelte Proteine aus diesen überstehenden Flüssigkeiten dar. Es ist offensichtlich, daß Endo-F-Behandlung das scheinbare Molekulargewicht aller Proteine reduziert und in schärfer abgegrenzten Banden resultiert.

Produktionsdurchläufe

Die multiple Kopien von pMT-Apo:gHS(HinfI/EcoRI) enthaltende supertransfizierte Zellinie (Zellinie D-4) wurde in einem Durchlauf auf Produktionslevel in Zylinderflaschen verwendet. Eine 850-cm quadratische Zylinderflasche wurde mit einer 10 cm-Petrischale geimpft, die 2 · 106 Zellen in 10% FCS, 15 mM Hepes, pen/strep, und Glutamin enthielt. Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten (2-3 Tage) wurden sie 2 · mit PBS gewaschen und durch 250 ml F12/DMEM21, 10 mM Hepes ohne FCS aufgefüllt. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 250 ml F12/DMEM21, 10 mM Hepes, 5 · 10&supmin;&sup5; Zinkchlorid, 10&supmin;&sup6; M Dexamethason und 0.25 mM Ascorbat erneut gefüttert. Die Zellen wurden alle 2 Tage gesammelt, während 10 Minuten bei 1000 Upm zentrifugiert und bei -20ºC eingefroren. Die Produktion betrug 1 bis 5 ug/ml/Tag, nachgewiesen durch Tüpfel-Westernblot unter Verwendung von polyklonalen anti-Hunde-ASP-Antiseren bei 1 : 5000- Verdünnung, wie oben beschrieben. Die Produktion fällt nach etwa 14 bis 17 Tagen ab.

D.9. Aktivität der ASP-Komponenten

Die Fähigkeit der isolierten ASP-Komponenten zur Erhöhung der Bildung von Lipidfilmen an einer Luft/Wasser-Grenzfläche wurde in vitro unter Verwendung der von Hagwood, S., et al, Biochemistry (1985) 24 : 184- 190 beschriebenen Methode untersucht. Kurz gesagt, wurde ein Präparat aus Phospholipidvesikeln im geeigneten Verhältnis mit Testproteinen sorgfältig in einem kleinen Volumen auf den Boden eines einen wäßrigen Puffer und einen Magnetrührer enthaltenden Teflon-Petrischale gegeben, eine Platinplatte an der Oberfläche des Puffers aufgehängt und mit einem Spannungsmesser verbunden. Mit dem Spannungsmesser registrierte Änderungen der Oberflächenspannung werden als eine Funktion der Zeit nach dem Starten des Rührers aufgezeichnet.
10K-Proteine wurden zu dem Phospholipid gegeben, in dem eine sie enthaltende Chloroform-Lösung mit einer 2 : 1 v/v-Chloroform: Methanol-Lösung des Lipids gemischt wurde. Zur Herstellung von Vesikeln wurden die Lösungsmittel verdampft und die Feststoffe in Puffer hydratisiert. 32K- Proteine können direkt in wäßriger Lösung zu einer Suspension der Vesikel gegeben werden, und Assoziierung mit und Aggregation der Vesikel kann durch Turbiditäts-Messungen detektiert werden.
Wie von Haggood et al (supra) berichtet, war 32K-Hunde-ASP in der Lage, Phospholipid-Vesikel zu aggregieren und die Bildung des Films bei Einschluß in die Phospholipid-Vesikel zu verstärken, wenn die Phospholipide aus dem Hunde-Lungen-Surfactant-Komplex erhaltene waren. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Proteins wird gemessen unter Verwendung der gleichen Verfahren für die Messung der Aggregation und der Filmbildungsverstärkung wie bei Hawgood beschrieben.
Sowohl das Phospholipid-Präparat aus Hundelunge, wie oben beschrieben (300 ug) und eine synthetische Mischung von Phospholipiden wurde verwendet. Das synthetische Phospholipid enthielt 240 ug kommerziell erhältliches DPPC und 60 ug Ei-PG, und ist in der Filmbildung stark verzögert, verglichen mit dem natürlichen Lipid. Das Test-Phospholipid wurde jedoch so ausgewählt, daß die Aktivität der Proteine am effektivsten verstärkt wurde.
Das 32K-Protein und die Mischung von 10K-ASP wurden aus Hundelunge wie oben beschrieben isoliert. Während Zugabe von 60 ug des 32K- Proteins fähig war, die Filmbildung durch das "natürliche" aus Lunge erhaltene Phospholipid praktisch auf den durch den Komplex als solchem gezeigten Level zu erhöhen, erhöhte es die Filmbildung unter Verwendung von synthetischem Lipid nur mäßig. Ähnliche Resultate wurden bei der Zugabe von 13 ug des 10K-Proteins allein erzielt. Wenn jedoch 13 ug des 10K-Präparats vor der Zugabe von 60 ug 32K-Protein mit den synthetischen Phospholipid-Vesikeln inkubiert wurde, trat die Filmbildung in einer Geschwindigkeit und in einem Grad auf, der vergleichbar war mit dem des natürlichen Komplexes an sich. Diese Ergebnisse sind in Fig. 12 dargestellt.

Claims

1. Ein alveoläres Surfactant-Protein aus Säugern (ASP) in gereinigter und isolierter Form, das ist:

aus menschlicher Lunge isolierbares 32 K ASP, das die hier in Fig. 3 dargestellte codierte Aminosäuresequenz aufweist;

ein aus Hundelunge isolierbares ASP, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 16.5 kd bei Bestimmung auf einem nichtreduzierenden Polyacrylamid-Gel und von etwa 10-12 kd bei Bestimmung auf einem reduzierenden Polyacrylamid-Gel zeigt und eine hier in Fig. 2 als die reife Sequenz dargestellte Aminosäuresequenz aufweist; oder

ein aus menschlicher Lunge isolierbares ASP, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 16.5 kd bei Bestimmung auf einem nichtreduzierenden Polyacrylamid-Gel und von etwa 10-11 kd bei Bestimmung auf einem reduzierenden Polyacrylamid-Gel zeigt, und die hier in Fig. 6 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt.

2. Eine rekombinante DNA, die für das ASP aus Anspruch 1 codiert.

3. Ein rekombinantes Expressionssystem, das, wenn es in einer rekombinanten Wirtszelle enthalten ist, in der Lage ist, die Expression einer für das erwähnte ASP aus Anspruch 1 codierenden Codier-Sequenz zu bewirken, wobei das erwähnte Expressionssystem eine funktionell mit Kontrollsequenzen, die seine Expression bewirken können, verbundene Codiersequenz umfaßt.

4. Mit dem Expressionssystem aus Anspruch 3 oder der DNA aus Anspruch 2 transformierte rekombinante Wirtszellen.

5. Ein Verfahren zur Herstellung von ASP, das Kultivieren der Zellen aus Anspruch 4 unter Bedingungen, die die Expression der erwähnten Codiersequenz begünstigen, um das codierte ASP zu produzieren; und Gewinnung des produzierten ASP aus der Zellkultur umfaßt.

6. Eine bei der Behandlung von Atemnotsyndrom bei Säugern wirksame pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung das ASP aus Anspruch 1 oder das mit dem Verfahren aus Anspruch 5 produzierte ASP im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff umfaßt.

7. Die pharmazeutische Zusammensetzung aus Anspruch 6, wobei der erwähnte Hilfsstoff ein Phospholipid-Vesikel- Präparat ist.

8. Das ASP aus Anspruch 1 oder das durch das Verfahren aus Anspruch 5 hergestellte ASP zur Verwendung bei der Behandlung von Atemnotsyndrom.