KR20190090606A

KR20190090606A - 멜라닌 탈색 효능을 가지는 신규 페니오포라속 js17 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190090606A
Application number: KR1020180009514A
Authority: KR
Inventors: 전숭종; 손민정; 이주희
Original assignee: 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: KR102041699B1

Abstract

본 발명은 멜라닌 탈색능을 가지는 신규한 균주인 페니오포라속 JS17 균주 및 상기 균주를 통한 라카아제 생산 방법에 대한 것이다. 본 발명에서 제공하는 JS17 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 조성물은 사람 유래 천연 멜라닌에 대한 탈색 효능을 나타내어, 피부 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

멜라닌 탈색 효능을 가지는 신규 페니오포라속 JS17 균주 및 이의 용도 {Novel Peniophora sp. JS17 strain with melanin decolorization ability and uses thereof}

본 발명은 멜라닌 탈색 효능을 가지는 신규한 균주인 페니오포라속 JS17 균주, 상기 균주의 미백 용도, 및 상기 균주를 통한 라카아제 생산 방법에 대한 것이다.

멜라닌은 동물, 식물, 미생물에 널리 분포하는 흑색 또는 갈색의 페놀 고분자이다. 멜라닌은 주로 환경적인 스트레스로부터 개체를 보호하는 역할을 수행한다. 세균에서는 항생물질에 대한 저항성을 증가시키고, 곰팡이에서는 건조, 고온, 자외선, 살균제, 용해효소에 대한 세포 저항성을 증가시키며, 또한 식물의 진균증 발병에 관여하는 것으로 보고되었다. 식물에서 멜라닌은 세포벽의 중요한 강화 요소로 작용한다. 포유류에서는 흑색 및 갈색의 유멜라닌(eumelanin)과 분홍 내지 적색을 띄는 피오멜라닌(pheomelanin)의 2가지 형태로 나뉘고, 사람 신체에서 주로 머리카락과 피부에 존재하는 멜라닌은 과도한 빛을 차단하고 자외선으로부터 피부를 보호하는 역할을 수행한다.

현재까지 피부 미용적 측면에서 멜라닌 생성을 억제하기 위한 많은 연구가 진행되었고, 멜라닌의 생합성에 가장 중요한 역할을 하는 티로시나아제의 활성 저해 물질을 개발하는 방향으로 연구가 집중되었다. 그러나 티로시나아제 저해제들은 멜라닌 생성 억제작용 외에 피부괴사, 색소 세포 변성, 피부 세포 독성, 피부 자극 유발 등의 심각한 부작용을 동반하는 것으로 알려졌다. 따라서 다른 대안으로 멜라닌 색소를 직접 분해하는 방법이 대두되었고, 몇몇 곰팡이 유래의 효소들이 멜라닌을 탈색하는 것으로 보고 되었다.

Phlebia radiata BP-11-2 유래 티로시나아제는 곰팡이 유래 멜라닌(fungal melanin)을 탈색하였고, Phanerochaete chrysosporium 유래 리그닌 과산화효소와 Lentinus polychrous Lev 유래 라카아제는 합성 멜라닌을 탈색하는 것으로 보고 되었다. Sporotrichum pruinosum 유래 멜라닌 탈색 효소는 사람 피부 멜라닌을 탈색하였고, Ceriporiopsis sp . MD-1 유래 망간 과산화효소, Geotrichum sp . 유래 망간 과산화효소 및 Trametes versicolor 유래 라카아제는 사람 머리카락 유래의 천연 멜라닌을 탈색하는 것으로 보고되었다.

이들 멜라닌 탈색 효소 중에서 라카아제는 구리를 함유하는 multi-copper blue oxidase의 일종으로 고등식물, 곰팡이, 곤충, 세균에 널리 분포하는 효소이고 모노페놀, 폴리페놀, 메톡시기 대체 페놀(methoxy-substituted phenol), 방향족 아민, 리그닌을 포함하는 다양한 페놀 화합물들을 산화시키므로 다양한 기질 특이성을 가진다. 라카아제는 종류별로 다양한 기질 특이성을 가지기 때문에 곰팡이에서만 약 100여종 이상의 종류가 보고되었지만, 멜라닌을 탈색시키는 라카아제는 Phlebia radiata BP-11-2, Lentinus polychrous Lev, Trametes versicolor의 3종에서만 보고되었다.

한편, 사람 신체 유래의 천연 멜라닌은 합성 멜라닌의 구조에는 없는 지방족 탄소(aliphatic carbon)가 존재하고, 단백질과 공유결합을 형성하기 때문에 합성 멜라닌과는 구조적으로 매우 다르고, 따라서 효소에 의한 탈색 양상도 달라진다.

따라서, 사람 유래 천연 멜라닌에 탈색 효과가 있는 균주를 발굴하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 페니오포라속 균주가 사람 머리카락 유래의 천연 멜라닌에 대하여 탈색 효능을 나타내는 것을 확인하였으며, 상기 균주의 효소 활성을 증가시키는 배양 조건을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 기탁번호 KCTC 13447BP로 기탁된 페니오포라속(Peniophora sp .) JS17 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 균주, 균주의 배양물, 및 상기 배양물의 농축물 또는 건조물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 성분을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 라카아제를 수득하는 단계를 포함하는, 라카아제의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13447BP로 기탁된 페니오포라속(Peniophora sp.) JS17 균주를 제공한다.

이하, 본 발명에서의 멜라닌 탈색능을 가지는 신규 페니오포라속 JS17 균주 및 이의 용도를 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 사용된 용어, “페니오포라속(Peniophora sp .) JS17 균주”는 껍질고약버섯과(Peniophoraceae)의 균주이고 고목의 표면에 배착성으로 증식하는 균주이다. 배착성으로 존재하기에 버섯대가 존재하지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC 13447BP로 기탁된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 멜라닌 탈색 효능을 갖는 것일 수 있다.

상기 멜라닌(melanin)은 동물, 식물, 미생물에 널리 분포하는 흑색 또는 갈색의 페놀 고분자이다. 멜라닌은 주로 환경적인 스트레스로부터 개체를 보호하는 역할을 수행한다. 세균에서는 항생물질에 대한 저항성을 증가시키고, 곰팡이에서는 건조, 고온, 자외선, 살균제, 용해효소에 대한 세포 저항성을 증가시키며, 또한 식물의 진균증 발병에 관여하는 것으로 보고되었다. 식물에서 멜라닌은 세포벽의 중요한 강화 요소로 작용한다. 포유류에서는 흑색 및 갈색의 유멜라닌(eumelanin)과 분홍 내지 적색을 띄는 피오멜라닌(pheomelanin)의 2가지 형태로 나뉘고, 사람 신체에서 주로 머리카락과 피부에 존재하는 멜라닌은 과도한 빛을 차단하고 자외선으로부터 피부를 보호하는 역할을 수행한다.

멜라닌의 양에 따라 피부색이 결정되는데, 멜라닌의 양이 많을수록 검은 피부색을 띤다. 인종마다 피부색이 다른 것은 멜라닌세포의 수가 다르기 때문이 아니라, 멜라닌세포의 크기와 만들어지는 멜라닌의 양이 다르기 때문이다.

사람 신체 유래의 천연 멜라닌은 합성 멜라닌의 구조에는 없는 지방족 탄소(aliphatic carbon)가 존재하고, 단백질과 공유결합을 형성하기 때문에 합성 멜라닌과는 구조적으로 매우 다르고, 따라서 효소에 의한 탈색 양상도 달라진다.

본 발명의 일 실시예에서는, 사람 머리카락 유래 천연 멜라닌을 포함하는 배지에 JS17 균주를 접종하고 배양한 결과, 접종부위 주변으로 투명환이 형성되는 것을 확인하여 JS17 균주의 멜라닌 탈색 효능을 확인하였다 (도 2).

본 발명에 있어서, 상기 균주는 라카아제를 생산하는 것일 수 있다.

상기 라카아제는 구리를 함유하는 multi-copper blue oxidase의 일종으로 고등식물, 곰팡이, 곤충, 세균에 널리 분포하는 효소이고 모노페놀, 폴리페놀, 메톡시기 대체 페놀(methoxy-substituted phenol), 방향족 아민, 리그닌을 포함하는 다양한 페놀 화합물들을 산화시키므로 다양한 기질 특이성을 가진다.

라카아제는 종류별로 다양한 기질 특이성을 가지기 때문에 곰팡이에서만 약 100여종 이상의 종류가 보고되었지만, 멜라닌을 탈색시키는 라카아제는 Phlebia radiata BP-11-2, Lentinus polychrous Lev, Trametes versicolor의 3종에서만 보고되었다.

본 발명의 일 실시예에서는, JS17 균주를 배양하고 효소의 활성을 확인한 결과, 상기 균주의 배양물에서 라카아제 및 망간 과산화효소의 활성을 확인하여 JS17 균주가 라카아제를 생산하는 것을 확인하였다 (도 2).

본 발명의 일 실시예에서는, JS17 균주의 배양시간에 따른 멜라닌 탈색능 및 효소 활성을 분석한 결과, 라카아제의 활성과 멜라닌 탈색능이 비례하는 것을 확인하여 JS17 균주의 멜라닌 탈색능이 라카아제와 연관이 있음을 확인하였다 (도 3).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 균주, 균주의 배양물, 및 상기 배양물의 농축물 또는 건조물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 성분을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어, “배양물”은 균주를 배지에 배양하여 영양분을 섭취하고 물질대사를 통해 생겨난 부산물이 포함된 배지를 의미하며, 상기 배지의 희석액이나, 농축액, 상기 배지를 건조하여 얻은 건조물, 상기 배지의 조정제물이나 정제물 또는 이들의 혼합물 등, 상기 배지를 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 배양물을 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어, “피부 미백”은 피부를 하얗게 하는 것을 의미하고, 멜라닌의 합성 저해, 분해 또는 탈색을 통해 멜라닌의 피부 침착을 억제하거나 방지하는 모든 작용을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 미백은 멜라닌 탈색에 의해 달성되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다. 구체적으로, 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 라카아제를 수득하는 단계를 포함하는, 라카아제의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어, “배양물”, “라카아제”는 상기에서 기재한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 라카아제는 멜라닌 탈색 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배양 단계는 라카아제의 활성을 증가시키기 위해, 당 업계에서 사용하는 방법이라면 어떤 방법이라도 추가로 사용할 수 있다.

비제한적인 예로, 상기 방법은 배지의 종류, 배양 기간, 탄소원, 질소원 등을 변화시키는 것일 수 있다.

상기 배지의 종류는 이에 제한되지 않으나, CVM(Coriolus versicolor medium), CDM(Czapex dox medium), LEM(Lentinus edodes medium), MCM(mushroom complete medium), MYGM(malt yeast glucose medium), YM(yeast malt extract medium), LPM(laccase production medium), YSM(YpSs medium) 및 MNM(Minimal medium) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 배지일 수 있으며, 구체적으로 MNM(Minimal medium)배지일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 배지의 종류에 따른 JS17 균주 유래 라카아제 활성을 확인한 결과, MNM 배지에서 배양했을 경우 가장 우수한 라카아제 활성을 나타냄을 확인하였다(표 1).

상기 배양 기간은 3일 내지 12일, 구체적으로 4일 내지 12일, 보다 구체적으로 5일 내지 12일일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 배양 기간에 따른 JS17 균주 유래 멜라닌 탈색 효소 활성을 확인한 결과, 6일 이후에 멜라닌 탈색율이 최대 활성을 나타냈으며 12일 배양한 경우에도 그 활성이 감소하지 않음을 확인하였다(도 3).

상기 탄소원은 이에 제한되지 않으나, 글루코오스(Glucose), 프락토오스(Frutose), 갈락토오스(Galactose), 만노오스(Mannose), 자일로오스(Xylose), 말토오스(Maltose), 수크로오스(Sucrose), 락토오스(Lactose), 셀로바이오스(Cellobiose), 전분(Starch), 셀룰로오스(Cellulose), 만니톨(Mannitol) 및 글리세롤(Glycerol)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 탄소원일 수 있으며, 구체적으로 자일로오스일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 탄소원에 따른 JS17 균주의 라카아제 활성을 확인한 결과, 자일로오스를 탄소원으로 사용한 경우 가장 높은 라카아제 활성을 확인하였다 (표 2).

상기 질소원은 이에 제한되지 않으나, 질산나트륨(Sodium nitrate), 황산암모늄(Ammonium sulfate), 질산암모늄(Ammonium niotraste), 펩톤(Peptone), 트립톤(Tryptone), 이스트 추출물(Yeast extract)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질소원일 수 있으며, 구체적으로 트립톤일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 질소원에 따른 JS17 균주의 라카아제 활성을 확인한 결과, 트립톤를 질소원으로 사용한 경우 가장 높은 라카아제 활성을 확인하였다 (표 3).

본 발명에서 제공하는 JS17 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 조성물은 사람 유래 천연 멜라닌에 대한 탈색 효능을 나타내어, 피부 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 JS17 균주의 18s rRNA 서열분석을 통한 계통수를 확인한 그래프이다.
도 2는 JS17 균주의 사람 머리카락 천연 멜라닌에 대한 탈색능을 나타낸 도면이다; (A) 배양 전 배지; (B) 배양 7일 후의 배지.
도 3은 배양 기간에 따른 페니오포라속 JS17의 건조 균체량, 멜라닌 탈색율, 라카아제 활성 및 망간 과산화효소 활성을 분석한 그래프이다; ●, 건조 균체량; ◆, 멜라닌 탈색율; ■, 라카아제 활성; ▲, 망간 과산화효소 활성.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 천연 멜라닌 추출

천연 멜라닌 추출 방법은 Krol 및 Libler의 방법을 사용하였다. 사람으로부터 수득한 머리카락 15g을 작은 조각 크기로 자르고 NaOH 500ml을 첨가한 후 교반기(stirrer)를 이용하여 24시간 동안 교반하였다. 혼합물을 원심분리(2,400×g, 15분) 한 후, 갈색의 상등액을 회수하고 0.1M HCL을 첨가하면서 pH를 감소시켜 멜라닌 침전을 형성하였다. 침전물을 원심분리(2,400×g, 15분)하고 0.1M HCL로 세척한 후 2M NaOH를 첨가하여 중화하였고 다시 6M HCl을 첨가하여 원심분리(2,400×g, 15분)하였다. 상기 과정을 상등액의 색이 없어질 때까지 5번 반복하였다. 마지막 침전물은 6M HCl에 6시간 동안 교반한 후 원심분리(2,400×g, 15분)하여 상등액을 제거하였다. 침전물은 NaOH로 세척한 후 MtOH에 용해시키고 증발기로 완전히 건조시켜 실험에 사용하였다.

실험예 1. 멜라닌 탈색 효능을 가진 균주 탐색

멜라닌 탈색능을 가진균주를 선별하기 위하여, 삼림지역의 토양 또는 썩은 나무 등에서 채취한 100여개의 균주 샘플을 PBS(phosphate buffered saline)와 혼합한 후, PDA(potato dextrose agar) 평판배지 상에 접종하여 25℃에서 5일 동안 배양하였다. 배양된 평판배지 상의 균사를 직경 5mm의 코르크 보러(cork borer)로 한천 플러그(agar plug)를 만들어 실시예 1을 통해 추출한 멜라닌 0.6g/L를 첨가한 MDB(malt extract dextrose) 배지(글루코오스 4g/L, 맥아 추출물 10g/L, 펩톤 4g/L, 한천 15g/L)에 접종하여 25℃에서 1~2주간 배양하였다.

배양한 결과, 투명환을 형성하는 균주 1종이 선별되었고 서열번호 1의 18s rRNA를 서열 분석을 통하여 계통학적으로 동정한 결과, 페니오포라 속(Peniophora sp.)에 속하는 것으로 판명되어 페니오포라속 JS17로 명명 하였다(도 1).

실험예 2. 페니오포라속 JS17 균주의 사람 유래 천연 멜라닌 탈색능 확인

페니오포라속 JS17 균주의 멜라닌 탈색능을 정확하게 확인하기 위해, 실시예 1의 사람 머리카락 유래 멜라닌을 첨가한 MNM 배지상에 페니오포라 JS17 균사체를 배양하면서 형성되는 투명환을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 배양시간이 경과함에 따라 투명환의 크기가 점점 커져 7일 배양시에 투명환의 지름이 5.5cm까지 늘어났다.

따라서, 페니오포라속 JS17 균주는 사람 머리카락 유래 천연 멜라닌을 탈색할 수 있음을 확인하였고, 배양시간에 따라 탈색능이 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 3. 페니오포라속 JS17 균주 내 멜라닌 탈색 효소 탐색

실험예 3-1. 페니오포라속 JS17 균주의 배지 조건에 따른 효소 활성 분석

페니오포라속 JS17 균주의 멜라닌 탈색능을 확인하였으나, 이에 대한 구체적인 기작은 확인되지 않았으므로, 이의 확인이 필요했다. 기존의 균주들이 멜라닌 탈색 효소에 의해 멜라닌 탈색능을 가지는 것으로 보고되었기에, 본 발명의 균주 또한 효소 활성의 분석을 통해 멜라닌 탈색능을 가진 효소를 탐색하기로 하였다.

페니오포라속 JS17 균사체로부터 멜라닌 탈색 효소를 탐색하고 상기 효소의 최적 생산을 위한 배지조성을 조사하기 위해, CVM(Coriolus versicolor medium), CDM(Czapex dox medium), LEM(Lentinus edodes medium), MCM(mushroom complete medium), MYGM(malt yeast glucose medium), YM(yeast malt extract medium), LPM(laccase production medium), YSM(YpSs medium), MNM(Minimal medium) 배지를 사용하였으며, 각 배지의 조성은 표 1에 나타내었다.

[표 1]

먼저, 페니오포라속 JS17을 PDA 평판배지 상에 접종하여 25℃에서 5일 동안 배양하였다. 배양된 평판배지 상의 균사를 직경 5mm의 코르크 보러로 한천 플러그를 만들어 각각의 액체배지 100 mL에 접종하여 25℃에서 100 rpm으로 15일간 진탕배양 하였다. 배양 후 페니오포라속 JS17 배양액을 whatman No. 1 필터 페이퍼를 사용하여 여과하고 원심분리(10,000×g, 10 분)를 통하여 균체를 완전히 제거한 후 상등액을 회수하여 조효소액으로 사용하였다. 라카아제 활성은 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5)에서 2 mM ABTS(2,2’-azino bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate))을 기질로 사용하여 37℃에서 5분간 조효소와 반응시켰으며, ABTS의 산화에 의해 생성된 산화물은 420 nm (ε_max= 36,000 M^-1cm^- ¹)에서 측정하였다. 망간 과산화효소(Manganese peroxidase) 활성은 반응액 0.9 mL (50 mM 말론산 나트륨 완충액 (pH 4.5), 0.5 mM MnSO₄, 0.1 mM H₂O₂)에 조효소액 0.1 ml을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 생성된 Mn³ ⁺-말론산 복합체(Mn³ ⁺-malonate complex)를 흡광도 270 nm (ε= 11,590 M^-1cm^- ¹)에서 측정하였다. 리그닌 과산화효소(Lignin peroxidase) 활성은 반응액 0.9 mL (50 mM 말론산 나트륨 완충액 (pH 4.5), 2 mM 베라트릴 알코올(veratryl alcohol), 0.1 mM H₂O₂)에 조효소액 0.1 ml을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 생성된 베라트룸 알데하이드(veratraldehyde)를 흡광도 310 nm에서 측정하였다. 효소 활성의 단위는 분당 1 μM의 기질을 산화시키는 효소의 양을 1 unit (U)로 정의하였다.

효소 활성을 확인한 결과, 모든 배지에서 리그닌 과산화효소 활성은 나타나지 않았고, MNM 배지를 사용하여 배양한 경우 가장 높은 라카아제 활성(19.9 U/ml)을 나타냈으며, CVM 배지를 사용하여 배양한 경우 가장 높은 망간 과산화효소 활성(74 U/ml)을 나타내었다(표 1).

실험예 3-2. 페니오포라속 JS17 균주의 배양 시간에 따른 효소 활성 분석

본 발명의 균주를 가장 높은 라카아제 활성과 비교적 높은 망간 과산화효소 활성을 나타낸 MNM 배지에서 배양하면서 배양시간에 따른 건조 균체량, 라카아제 및 망간 과산화효소 활성, 멜라닌 탈색율을 검토하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 라카아제 활성 및 멜라닌 탈색율은 대수증식기(exponential phase)에 급격히 증가하기 시작하여 6~7일 만에 최대 활성을 나타내었고, 그 이후 거의 일정하게 유지되었다. 반면, 망간 과산화효소 활성은 정지기 이후에 증가하기 시작하여 멜라닌 탈색율이 나타나는 배양시간과 일치하지 않았다. 따라서 배양시간에 따른 라카아제 생산량과 멜라닌 탈색율은 균체량과 함께 비례하였기 때문에 상기 균주의 멜라닌 탈색능은 라카아제의 촉매 반응에서 유래하는 것으로 확인되었다.

실험예 4. 라카아제의 최적 생산 조건 탐색

실험예 4-1. 라카아제 최적 생산을 위한 탄소원 분석

멜라닌 탈색과 연관된 라카아제의 최적 생산을 위하여 MNM 배지속에서 다양한 탄소원의 효과를 조사하였다. MNM 배지의 조성으로부터 글루코오스를 제거하고 각 종류별 탄소원을 각각 2%씩 첨가하여 균사체를 배양한 후 효소 활성을 측정하였다.

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 자일로오스를 탄소원으로 첨가한 경우, 라카아제 활성이 가장 우수하였고, 원 성분인 글루코오스와 비교하여 약 2.4배 정도 효소 활성이 증가하였다.

[표 2]

Kenkebashvili et al. (2012)의 경우, 라카아제를 생산하기 위한 탄소원 중에서 자일로오스가 가장 우수한 효과를 나타낸다고 보고된 바 있어, 본 연구의 결과와 일치하였다. 반면에 Trametes versicolor 유래 라카아제는 덱스트로스에서 배양할 때 최대 활성을 나타낸다고 보고되었고 (Mikiashvili, N., et al., 2005), Cynodon dactylon 유래 라카아제는 말토오스에서 최대활성을 나타내는 것으로 보고되었다(Wang, J. W., et al., 2006). 이와 같이 라카아제 생산을 위한 최적 탄소원은 곰팡이의 종류에 따라 제각기 다른 성향을 나타내는 것으로 추정되었다.

실험예 4-2. 라카아제 최적 생산을 위한 질소원 분석

멜라닌 탈색과 연관된 라카아제의 최적 생산을 위하여 MNM 배지속에서 다양한 질소원의 효과를 조사하였다. MNM의 배지 조성에는 질소원이 없기 때문에 MNM 배지에 각 종류별 질소원을 각각 0.4%씩 첨가하여 균사체를 배양한 후 효소 활성을 측정하였다.

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 트립톤(tryptone)을 첨가하였을 때 효소 활성이 가장 높았고, 다른 질소원을 첨가한 경우에는 오히려 효소 활성이 감소하였다.

[표 3]

지금까지 보고된 바에 의하면, Botryosphaeria sp . (Vasconcelos et al., 2000), Cynodon dactylon (Wang, J. W., et al., 2006), Trametes hirsuta (Dhakar, K. et al., 2013) 및 Pleurotus sajor - caju [Bettin, F. et al., 2009] 유래 라카아제들은 각각 이스트 추출물(yeast extract), 타르타르산 암모늄(ammonium tartrate), 황산암모늄(ammonium sulfate) 및 카세인(casein)과 같이 제각기 다른 질소원에서 최대활성을 나타내었다. 이와 같이 라카아제 생산을 위한 최적 질소원은 탄소원과 마찬가지로 곰팡이의 종류에 따라 제각기 다른 성향을 나타내었다.

제조예 1. 멜라닌 탈색 효소의 제조

앞의 실험에서 밝혀낸 페니오포라속 JS17 균주의 라카아제 최적 생산 배지(1% 자일로오스, 0.2% 맥아추출물, 0.4% 트립톤, 0.1% KH₂PO₄, 0.4% MgSO₄7H₂O)에서 7일 동안 배양한 후, 여과, 농축, 동결건조를 통하여 화장품 조성물로 적합한 형태로 준비하였다. 배양액을 7 μm membrane을 통과시켜 균사체를 제거하고 다시 0.22 μm membrane을 통과시켜 불순물을 제거하였다. 여과시킨 배양액을 초미세여과(Pellicon 2 Ultrafiltration Casettes, Merck) 장치를 사용하여 20배 농축하여 약 98.5%의 배양액을 회수하였다(표 4). 마지막으로 농축액을 동결건조하여 약 94%의 회수율을 나타내었고 전체 효소 활성은 처음 여과액과 대비하여 약 6% 감소하였다.

[표 4]

비교예 1. 기존 멜라닌 탈색 라카아제 생산 균주와의 비교

비교예 1-1. 멜라닌 탈색 라카아제 생산 균주간의 라카아제 활성 비교

페니오포라속 JS17 균주와 멜라닌을 탈색시키는 라카아제를 생산하는 것으로 기존에 알려진 Trametes versicolor 균주(조정숙, 2002)에 대하여 라카아제 활성을 비교 분석하였다. Trametes versicolor는 농업진흥청 농업유전자원센터로부터 분양 받은 것을 사용하였다. 페니오포라속 JS17는 라카아제 최적 생산 배지(1% 자일로오스, 0.2% 맥아추출물, 0.4% 트립톤, 0.1% KH₂PO₄, 0.4% MgSO₄7H₂O)에서 배양하였고, Trametes versicolor는 참고문헌(조정숙, 2002)에서 제시하는 최적배지(배지 1L에 인산이수소칼륨(KH₂PO₄) 2g, 황산마그네슘(MgSO₄) 0.5g, 염화칼슘(CaCl₂) 0.1g , 1% 글루코오스(Glucose), 타르타르산 암모늄 (Ammonium Tartrate) 0.2g, 티아민-염산(Thiamin-HCl) 1mg, 0.4mM 베라트릴알코올(veratryl alcohol), 10% 트윈 80 (Tween 80) 5ml, 0.1M 디메틸숙신산염 완충용액 (Dimethylsuccinate Buffer, DMS) 100ml, 30 mM L-라이신(L-lysine) 10ml, 미량요소용액(Trace element solution) 70ml이 포함)에서 배양하였다. 상기와 같이 준비된 배지들은 100ml을 250ml 플라스크에 넣고 각각 균주를 접종하여 교반속도 200rpm, 25℃에서 7일간 배양하였다. 각각 2가지 균주의 배양 상등액을 여과하여 라카아제 활성을 측정하였다. 그 결과 페니오포라속 JS17 균주는 Trametes versicolor보다 약 2.6배 더 높은 활성을 나타내어 본 발명의 균주는 멜라닌 탈색에 있어 기존 보고된 균주보다 뛰어난 활성을 가지는 것으로 확인되었다(표 5).

[표 5]

비교예 1-2. 멜라닌 탈색 라카아제 생산 균주간의 멜라닌 탈색율 비교

또한, 2가지 균주의 배양 상등액에 대하여 멜라닌 탈색율을 비교하였다. 멜라닌 탈색율은 합성 멜라닌(sigma) 0.2 g/l를 50 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5)에 첨가한 용액 0.9 ml에 조효소액 0.1 ml을 첨가하여 37℃에서 24시간 반응한 후 470 nm에서 흡광도를 측정하여 다음 공식에 따라 탈색율을 구하였다.

탈색율(%) = [(개시 흡광도값)-(반응 종결 후 흡광도값)]/(개시 흡광도값)×100

그 결과 페니오포라속 JS17 균주는 45%의 탈색율을 보여 22%를 나타낸 Trametes versicolor보다 약 2배 더 높은 멜라닌 탈색율을 나타내었다(표 5). 따라서, 페니오포라속 JS17 균주는 기존 보고된 Trametes versicolor 균주보다 멜라닌 탈색에 있어 매우 효율적이라고 할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

[수탁번호]

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13447BP

수탁일자 : 20180104

<110> Dong-eui University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Peniophora sp. JS17 strain with melanin decolorization ability and uses thereof <130> KPA171432-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 631 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peniophora sp. 18s rRNA sequence <400> 1 cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattagc gaagtccgga atgcgcgcga ggtgctgagc 60 tgcccagcaa tgggatgtgc tcgcccttgt gcgtgtccct tcactatcca ccccactgtg 120 aaccaagtgt gcgagcccaa gagagatcgg aagctcgcat gcaatcctta acatacccca 180 atgaagtatc agaatgtacc ttgcgttaac tcgcacaaat acaactttca acaacggatc 240 tcttggctct cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga 300 attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca ccttgcgccc tttggcattc cgaagggcac 360 gcctgtttga gtgtcgtgaa ctcctccacc ctctcctttt tcgaaaggtg ttgggctggg 420 atttgggagc tttgcaggtc cctggccgat ctgctctcct tgaatacatt agcgaagccc 480 ttgcggcctt ggtgtgatag tcatctacgc ctcggcttag cgaacttatg ggagtcgctt 540 ctaatcgtct cgcaagggac aacttttacc aacttgacct caaatcaggc gggactaccc 600 gctgaactta agcatatcaa taagcggagg a 631

Claims

기탁번호 KCTC 13447BP로 기탁된 페니오포라속(Peniophora sp .) JS17 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 멜라닌 탈색능을 갖는 것인, 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 라카아제(laccase)를 생산하는 것인, 균주.
제1항의 균주, 균주의 배양물, 및 상기 배양물의 농축물 또는 건조물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 성분을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 피부 미백은 멜라닌 탈색에 의해 달성되는 것인, 화장료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 균주는 라카아제를 생산하는 것인, 화장료 조성물.
제1항의 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 라카아제를 수득하는 단계를 포함하는, 라카아제의 생산 방법.
제7항에 있어서,
상기 라카아제는 멜라닌 탈색 효능을 갖는 것을 특징으로 하는, 라카아제의 생산 방법.
제7항에 있어서,
상기 배양은 MNM(Minimal medium)배지에서 배양하는 것인, 라카아제의 생산 방법.
제 7항에 있어서,
상기 배양은 자일로오스(Xylose)를 탄소원으로 이용하는 것인, 라카아제의 생산 방법.
제7항에 있어서,
상기 배양은 트립톤(Tryptone)을 질소원으로 이용하는 것인, 라카아제의 생산 방법.