JP6560301B2 - 微生物によるラッカーゼ生産の促進方法 - Google Patents

Description

本発明は微生物によるラッカーゼ生産の促進方法に関し、微生物発酵の分野に属する。

ラッカーゼ（ベンゼンジオール：酸素酸化還元酵素，ＥＣ １．１０．３．２）は自然界に広く分布する銅含有ポリフェノールオキシダーゼであり、フェノール、芳香族アミンなどの多種の有機基質の酸化反応を直接触媒することができる。ラッカーゼは多種の基質に対して一電子酸化を行うことができ、パルプ化製紙、排水処理、有機合成などの多くの業界で将来的に応用が期待されている。

自然界で糸状菌、特に担子菌類と子嚢菌類は主なラッカーゼ合成菌類であるが、担子菌類と子嚢菌類のラッカーゼ生産量が低く、成長産業の需要を満たすことができない。担子菌類と子嚢菌類の発酵法によるラッカーゼ合成のレベルは菌種、栄養源、培養条件と関係がある以外に、いくつかの促進因子の影響を受ける。そのうち銅イオンは、ラッカーゼの活性中心の組成成分であり、ラッカーゼ合成の効果的な促進因子でもある。また、いくつかの小分子芳香族化合物は構造がリグニン構成単位と類似するため、ラッカーゼ合成の促進因子とすることができ、例えばグアイアコール、レスベラトロール、バニリン及び桂皮酸などが研究ではラッカーゼの歩留まりの向上に広く用いられている。しかしながら、既存の効果的な促進因子は、一般的に価格が高いため、ラッカーゼ生産コストがある程度上昇する。また、銅イオンと芳香族化合物が添加されると環境が汚染されるので、発酵が終了した後に、発酵液を解毒処理する必要があり、ラッカーゼ産業化に適用しにくい。したがって、経済的で、安全で、効果的な新たな促進因子を探求、発見することは、ラッカーゼ生産を促進する方向性として重要であり、微生物発酵によるラッカーゼ生産の実用化と工業化にとっても新しい可能性と活力をもたらす。

本発明の目的はまず微生物によるラッカーゼ生産の促進剤を提供することである。

本発明の目的はまず微生物によるラッカーゼ生産の促進剤を提供することである。

前記促進剤の有効成分はカロテノイドである。それはカロテノイドの一種又は複数種の組み合わせを含む。

前記微生物は主にラッカーゼ生産の糸状菌を含む。

本発明の実施形態において、前記促進剤の有効成分はβ-カロテン及び/又はリコピンである。

本発明の実施形態において、前記糸状菌はあぎタケ、カワラタケ、ヒラタケ、レイシを含むが、これらに限定されない。

本発明の実施形態において、前記促進剤はカロテノイド、カロテノイド生産の微生物又はカロテノイド含有の抽出物であってもよい。

本発明はさらに微生物によるラッカーゼ生産の促進方法を提供し、微生物によるラッカーゼ生産の過程において前記微生物によるラッカーゼ生産の促進剤を添加する。

本発明の実施形態において、前記微生物は主にラッカーゼ生産の糸状菌を含む。

本発明の実施形態において、前記糸状菌はあぎタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｆｅｒｕｌａｅ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、レイシ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ Ｌｕｃｉｄｕｍ）を含むが、これらに限定されない。

本発明の実施形態において、前記微生物によるラッカーゼ生産の促進剤の添加形態はカロテノイド化合物又はカロテノイド含有の混合物であってもよく、添加量と添加時間は微生物によるラッカーゼ生産の状況に応じて調整又は選択することができる。前記カロテノイド含有の混合物はカロテノイド生産の活性微生物又は不活化菌体、又はカロテノイド含有の抽出物などであってもよい。前記カロテノイド生産の活性微生物はロドトルラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、スポリディオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）を含むが、これらに限定されない。

本発明の実施形態において、係る菌類はいずれも本分野の通常の菌類である。菌の培養方法はいずれも本分野の通常の培養方法であってもよい。

本発明の実施形態において、カロテノイドの添加量は０．１−３０ｍｇ／Ｌであり、添加方法は一定量のカロテノイドを秤量してアセトンに溶解し、溶液は有機濾過膜により除菌し、得られた無菌溶液は減圧ロータリーエバポレーターで乾燥させ、続いて上記物質を滅菌された植物油に溶解し、それぞれ油溶性物質を微生物によるラッカーゼ生産の発酵培地に添加する。

前記カロテノイド含有の混合物はカロテノイド生産の活性微生物又は不活化菌体、又はカロテノイド含有の抽出物であってもよい。

本発明の実施形態において、カロテノイド生産の活性微生物の添加は、カロテノイド生産の微生物を培養し、ラッカーゼ生産の微生物の発酵過程において、適量の微生物の菌体を添加し、一定の時間共培養することである。

本発明の実施形態において、カロテノイド生産の不活化菌体の添加は、培養されたカロテノイド生産の微生物を７０℃で１時間水浴させ、ラッカーゼ生産の微生物の発酵過程において、適量の不活化菌体を添加し、一定の時間共培養を続けることである。

本発明の実施形態において、カロテノイド含有の抽出物の添加は、菌体を収集し、凍結・融解を繰り返して菌体を破砕させ、続いて７０℃で１時間熱処理し、遠心分離後に上澄みを除去し、続いて沈殿物に一定の体積の植物油を添加し、軽く振盪して１時間抽出し、すなわち油抽出物を得て、上記操作過程において、油抽出物の無菌を保証し、油抽出物を発酵体系に加えて一定の時間発酵し続けることである。

本発明の利点は以下のとおりである：
１．添加形態は多様性がある。すなわち直接カロテノイドを添加し、またカロテノイド含有の抽出物又はカロテノイド生産の微生物を添加してもよいし、処理されたカロテノイド生産の微生物を添加してもよい。
２．作用範囲が広い。添加する物質は多種の微生物によるラッカーゼ生産に対していずれも促進作用がある。
３．促進作用が顕著である。本発明により、カロテノイド又はカロテノイド生産の酵母の添加により、いずれもあぎタケのラッカーゼ生産の活性を２倍以上高め、他の高等真菌のラッカーゼ生産の活性を１２倍高めることができることが発見された。

ラッカーゼ活性の測定方法：
ＡＢＴＳを基質とし、８８０μＬの０．１ｍｏｌ・Ｌ^−１の酢酸−酢酸ナトリウムの緩衝液（ｐＨ４．５）、１００μＬの最終濃度が１ｍｍｏｌ・Ｌ^−１のＡＢＴＳ基質と２０μＬの一定の倍数に希釈した粗酵素液（その最終吸光度を０．２−０．８の間にしなければならない）を含む１ｍＬ反応系において、３０℃で５ｍｉｎ反応した後に４２０ｎｍでその吸光度を測定する（熱不活化の酵素液をブランクとする）。

ラッカーゼの酵素活性の定義：
上記反応条件と反応系で、１分間あたり１μｍｏｌのＡＢＴＳの酸化に必要な酵素の量を１ユニットの酵素活性単位（Ｕ）として定義した。
酵素活性は以下の式により計算される：

Ａ_１−ブランクの吸光度；
Ａ_２−反応後の吸光度；
ｔ−反応時間；
ε−ＡＢＴＳのモル吸光係数であり、３．６×１０^４Ｌ・ｍｏｌ^−１・ｃｍ^−１である。

β-カロテンの測定方法：
（１）標準溶液の調製：
２ｍｇのβ−カロテン又はリコピン標準製品を正確に秤量し、クロロホルムを用いて１０ｍＬの褐色メスフラスコに定容し、−２０摂氏で日陰で保存して使用に備える。

（２）サンプルの調製：
ａ 発酵溶液中のβ−カロテン又はリコピン含有量の測定：８０ｍＬの発酵液を取り、８０ｍＬのクロロホルムを加えて１５分間振盪抽出し、分離後にクロロホルム溶液を減圧ロータリーエバポレーターで１０ｍＬまで濃縮させ、β−カロテン又はリコピン含有のクロロホルム抽出液に調製する；
ｂ ロドトルラ・ムチラギノーザ中のβ−カロテン含有量の測定：ロドトルラ・ムチラギノーザ菌体を凍結乾燥させた後に、１ｇの菌体を秤量してモルタルで十分に粉砕し、５ｍＬのＥＰチューブに移行し、２ｍＬのクロロホルムを加えて１５ｍｉｎ振盪抽出し、遠心分離後に上澄みを取りクロロホルムを用いて１０ｍＬに定容し、β−カロテン含有のクロロホルム抽出液に調製する；
ｃ 共培養体系中のβ−カロテン含有量の測定：１５０ｍＬの発酵液を取り、遠心分離後に上澄みを除去し、菌体を沈殿させて十分に粉砕した後に８０ｍＬのクロロホルムを加えて１５分間振盪抽出し、分離後にクロロホルム溶液を減圧ロータリーエバポレーターで１０ｍＬまで濃縮させ、β−カロテン含有のクロロホルム抽出液に調製する。

（３）ＬＣ−ＭＳ検出を行う。
クロマトグラフ条件：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１ｍｍｘ１００ｍｍ）を用いて分離させ、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＰＤＡで検出する。移動相：Ａ相：１０／９０のアセトニトリル/イソプロパノール；Ｂ相：アセトニトリル。カラム温度は４５oＣであり、流動速度は０．３ｍＬ・ｍＬ^−１であり、サンプル注入量は２μＬである。質量スペクトル条件：使用する機器はＷＡＴＥＲＳ ＭＡＬＤＩ ＳＹＮＡＰＴ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳである；イオン化形態：ＥＳＩ＋；キャピラリー電圧：３．５ｋＶ、錐穴電圧：３０Ｖ；脱溶媒ガス温度：４００oＣ；脱溶媒ガス流量７００Ｌ・Ｈｒ−１；衝突エネルギー：６６ｅＶ；質量範囲：１００−１５００；検出電圧１８００Ｖ。

（４）β−カロテン含有量は以下の式により計算される：

ｍ：１０ｍｌサンプル中のβ−カロテン又はリコピン含有量（ｍｇ）
ｍ_１：標準サンプル注入体積中のβ−カロテン含有量又はリコピン（ｍｇ）
ｍ_２：サンプル秤量質量（ｍｇ）
Ａ_１：標準ピーク面積
Ａ_２：サンプルピーク面積
Ｖ_１：サンプル注入質量（μｌ）
Ｖ_２：サンプル注入体積（ｍｌ）

実施例１：β−カロテンとリコピンの添加による、あぎタケによるラッカーゼ生産の活性の向上
ふすま基本培地（ｇ・Ｌ^−１）：グルコース２０、トウモロコシ粉末１０、ふすま粉末１０、Ｋ_２ＳＯ_４ ０．１７４２、初期ｐＨ＝９．０、あぎタケの種子培養と液体発酵培養に用いられた。
あぎタケの種子培養：２枚の０．５ｃｍ^２の菌株を取り、８０ｍＬの種子培地に接種し、１５０ｒ・ｍｉｎ^−１で、２５℃で７ｄ培養した。
あぎタケの発酵培養：１５０ｍＬのふすま基本培地に３％（体積分率）の種子培地を加え、１５０ｒ・ｍｉｎ^−１で、２５℃で７ｄ培養した。
それぞれ４ｍＬのβ−カロテンと４ｍＬのリコピンを取ってそれぞれ３０ｍＬのアセトンに溶解し、溶液は０．２２ミクロンの有機濾過膜で滅菌し、無菌溶液を得て滅菌した５０ｍＬの遠心分離管に移行し、滅菌シーリングフィルムでノズルを密閉し、減圧ロータリーエバポレーターで乾燥させた。上記物質を滅菌した１．０ｍＬの植物油に入れ、それぞれ１ｍＬの油溶性物質をあぎタケの２日発酵した培地に加えて５日発酵し続けた。発酵過程に発酵液中のβ−カロテン、リコピンの含有量を測定した。その結果、発酵初期及び１、２、３、４日間発酵した後のβ−カロテンの含有量はそれぞれ２５．３７ｍｇ／Ｌ、１３．１３ｍｇ／Ｌ、６．９０ｍｇ／Ｌ、１．６６ｍｇ／Ｌ、０ｍｇ／Ｌであり、リコピンの含有量はそれぞれ２４．８３ｍｇ／Ｌ、３．２２ｍｇ／Ｌ、１．５９ｍｇ／Ｌ、０．３１ｍｇ／Ｌ、０ｍｇ／Ｌであった。
対照グループと比べ、実施例１の方法を用いて、β−カロテンを添加したラッカーゼ生産の酵素活性が７６００Ｕ・Ｌ^−１まで高まり、対照グループの２．１倍であった；リコピンを添加したラッカーゼ生産の酵素活性が７０００Ｕ・Ｌ^−１まで高まった。

実施例２：β−カロテン生産における、ロドトルラ・ムチラギノーザの添加による、あぎタケによるラッカーゼ生産の活性の向上
ＹＰＤ液体培地（ｇ・Ｌ^−１）：ペプトン２０、酵母エキス１０、グルコース２０、ｐＨが自然で、ロドトルラ・ムチラギノーザ種子培養に用いられた。
ロドトルラ・ムチラギノーザ種子培養：接種ループを用いて適量のロドトルラ・ムチラギノーザを取り、８０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２００ｒ・ｍｉｎ^−１で、３０℃で４８時間培養した。
あぎタケは実施例１の培養方法を用いた。
あぎタケとロドトルラ・ムチラギノーザの共培養：あぎタケの４８時間単独培養後に、３％（体積分率）のロドトルラ・ムチラギノーザ種子を接種し、５日培養し続けた。対照グループにロドトルラ・ムチラギノーザを添加せず、発酵が終了した後に、それぞれ酵素活性を測定した。発酵過程に共培養体系（発酵液と菌体）中のβ−カロテンを測定した。その結果、共培養１、３、５、日間のβ−カロテンの含有量はそれぞれ０．００１５ｍｇ／Ｌ、０．００４０ｍｇ／Ｌ、０．０１３ｍｇ／Ｌであった。
実施例２の方法を用いると、対照グループのラッカーゼ活性は３５００Ｕ・Ｌ^−１のみであり、ロドトルラ・ムチラギノーザを添加した実験グループのラッカーゼ活性は７６３０Ｕ・Ｌ^−１に達した。

実施例３：β−カロテン生産における、ファフィア・ロドチーマ、スポリディオボラス・パラロゼウス、ロドトルラ・グルチニスの添加による、あぎタケによるラッカーゼ生産の活性の向上
あぎタケは実施例１の培養方法を用いた。
ファフィア・ロドチーマ、スポリディオボラス・パラロゼウス、ロドトルラ・グルチニスは実施例２におけるロドトルラ・ムチラギノーザの培養方法を採用した。
あぎタケとファフィア・ロドチーマ、スポリディオボラス・パラロゼウス、ロドトルラ・グルチニスの共培養は実施例２におけるあぎタケとロドトルラ・ムチラギノーザの共培養方法を用いた。
そのうち実験グループの酵母接種量はそれぞれ１．２５ｍＬ、２．５ｍＬ、５ｍＬと１０ｍＬであり、対照グループはいずれの酵母も添加しなかった。
あぎタケ単独培養の２日目に２．５ｍＬのファフィア・ロドチーマ酵母種子液を加えて５日培養し続けた後では、ラッカーゼ酵素活性は単独培養の約２倍であった。
あぎタケとスポリディオボラス・パラロゼウスの共培養では、スポリディオボラス・パラロゼウスの接種量が２．５ｍＬ、５ｍＬと１０ｍＬのときに、あぎタケによるラッカーゼ生産に対して顕著な促進作用を有し、かつ接種量が２．５ｍＬのときに、ラッカーゼ生産の酵素活性が最も高く、１００００Ｕ・Ｌ^−１に達し、かつこの条件の共培養過程中の１、３、５日目のβ−カロテンの含有量はそれぞれ０．０２７ｍｇ／Ｌ、０．０３６ｍｇ／Ｌ、０．０４０ｍｇ／Ｌであった。
あぎタケとロドトルラ・グルチニスの共培養では、酵母接種量が１．２５ｍＬのときに、酵素活性が最も高く、約７１６１Ｕ・Ｌ^−１であった。そのうち対照グループの酵素活性は約３７００Ｕ・Ｌ^−１であった。

実施例４：熱処理ロドトルラ・ムチラギノーザを添加したときの、あぎタケによるラッカーゼ生産の活性に対する影響
実施例１の方法であぎタケを培養した。
実施例２の方法でロドトルラ・ムチラギノーザを培養した。得られたロドトルラ・ムチラギノーザ菌体をそれぞれ５５℃、６０℃、６５℃と７０℃で１時間水浴処理し、高温滅菌グループはロドトルラ・ムチラギノーザ菌体を１２１℃で２０ｍｉｎ滅菌した。対照グループ１にロドトルラ・ムチラギノーザを添加せず、対照グループ２に処理されないロドトルラ・ムチラギノーザを添加した。平板塗布の方式で異なる熱処理温度の効果を観測した。５５℃で１時間熱処理した後に、ロドトルラ・ムチラギノーザのコロニー数が５０％以上低下し、かつ温度の上昇に伴い、コロニー数が迅速に低下し、７０℃で１時間熱処理と高温滅菌処理は、いずれもすべてのロドトルラ・ムチラギノーザ細胞を殺すことができた。
あぎタケ培養の４８時間後にそれぞれ熱処理と高温で不活化された湿重量１．５ｇ、３．０ｇ、４．５ｇ、６．０ｇの酵母菌体を加え、５日培養し続けた後に酵素活性を測定した。５５−７０℃で熱処理したロドトルラ・ムチラギノーザはいずれもあぎタケによるラッカーゼ生産の活性を高め、そのうち７０℃で熱処理した不活化ロドトルラ・ムチラギノーザの添加はラッカーゼの酵素活性を高めることができた。また、酵母添加量の増加に伴ってラッカーゼの酵素活性が徐々に高まり、添加量が６ｇのときの酵素活性レベルは処理されないロドトルラ・ムチラギノーザ（活性酵母の接種量が３％）を添加したときに相当し、７２６０Ｕ・Ｌ^−１に達した。
同様に高温で不活化された菌体をあぎタケ発酵培地に加えたところ、ラッカーゼの酵素活性はほぼ変化せず、ロドトルラ・ムチラギノーザを添加しないグループの酵素活性とほぼ同じであった。高温滅菌によりβ−カロテンを破壊している可能性が認められた。

実施例５：β−カロテンの抽出物を添加したときの、あぎタケによるラッカーゼ生産の活性に対する影響
実施例１の方法であぎタケを培養した。
実施例２の方法でロドトルラ・ムチラギノーザを培養した。
無菌条件で４ｇ（湿重量）のロドトルラ・ムチラギノーザ菌体を収集し、等量の滅菌水を加えて繰り返し凍結融解し、菌体を粉砕させ、続いて７０℃で１時間熱処理した。遠心分離後に上澄みを除去し、沈殿物に一定の体積の滅菌植物油を加え、穏やかに振盪して１時間抽出し、すなわちロドトルラ・ムチラギノーザの油抽出物を得た。抽出物を２日目発酵したあぎタケ発酵培地に加え、５日培養し続けた後に酵素活性を測定した。対照グループに等量の植物油を加えた。
３ｍＬの植物油抽出物を加えた後、ラッカーゼの酵素活性が３５％程度高まり、４８５０Ｕ・Ｌ^−１に達した。

実施例６：β−カロテン生産のロドトルラ・ムチラギノーザを添加したときの、他の高等真菌ラッカーゼ生産に対する影響
カワラタ、ヒラタケとレイシなどの多く研究されたラッカーゼ生産が高い真菌を選択し、その培養過程にロドトルラ・ムチラギノーザを添加して共培養した。
実施例２の方法でロドトルラ・ムチラギノーザを培養した。
カワラタ、ヒラタケとレイシの培地及び培養方式は以下のとおりである：ふすま１％；トウモロコシ粉末１％；グルコース１％；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２％；ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．３％；カワラタ、ヒラタケとレイシの一段種子の成長時間はそれぞれ５日、６日、８日であり、真菌接種量は３％であり、培養体系は５００ｍＬのフラスコに液量１５０ｍＬを入れた。同様に４８時間培養後にロドトルラ・ムチラギノーザを接種し、酵母の接種量はそれぞれ０、１．５％、３％、６％であり、５日間共培養発酵した後にラッカーゼの酵素活性を測定した。
ロドトルラ・ムチラギノーザの添加はいずれもカワラタ、ヒラタケとレイシによるラッカーゼ生産の活性を高めることができた。ロドトルラ・ムチラギノーザを添加しない時に、カワラタによるラッカーゼ生産の酵素活性が１８７３Ｕ・Ｌ^−１まで高く、添加量が６％時に３７９７Ｕ・Ｌ^−１まで達することができた；ロドトルラ・ムチラギノーザの添加量が３％であるとき、ヒラタケによるラッカーゼ生産の酵素活性が１１４７Ｕ・Ｌ^−１まで高くなり、添加しないときの約４倍であった；レイシがロドトルラ・ムチラギノーザを添加しないときのラッカーゼ生産の酵素活性は８０．３Ｕ・Ｌ^−１のみであり、ロドトルラ・ムチラギノーザ添加量の増加に伴い、ラッカーゼ生産の酵素活性も高まり、最も高い酵素活性は９８２．８Ｕ・Ｌ^−１であり、添加しない時の約１２倍であった。

以上は既に本発明の実施形態について説明し、当業者であれば様々な改良と変更を行うことができ、本発明の基本精神から逸脱するものではなく、例えば分子生物学的技術を用いて、β-カロテン又はリコピン生産の遺伝子組換え菌類を構築し、又は植物からβ-カロテン又はリコピン含有の物質などを抽出してあぎタケなどの高等真菌によるラッカーゼ生産の発酵過程に加え、ラッカーゼ生産活性を高める作用を果たすこともできる。したがって、これらの改良と変更の全てはいずれも本発明の保護範囲にある。

本発明の好ましい実施例が以上に公開されるが、本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を行うことができ、したがって本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲によって定義されるべきである。

Claims (2)

1. ラッカーゼ生産性の糸状菌によるラッカーゼ生産の促進方法であって、
   ラッカーゼ生産性の糸状菌によるラッカーゼ生産の発酵過程において、カロテノイド生産性の微生物を添加することを含み、
   ラッカーゼ生産性の糸状菌とカロテノイド生産性の微生物との組み合わせが、以下である、促進方法：
   （１）あぎタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｆｅｒｕｌａｅ）とスポリディオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）との組み合わせ；
   （２）ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）とロドトルラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）との組み合わせ；または
   （３）レイシ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ Ｌｕｃｉｄｕｍ）とロドトルラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）との組み合わせ。
2. カロテノイド生産性の微生物を培養すること、および、共培養のために、発酵過程においてカロテノイド生産性の微生物を添加することを含む、請求項１記載の方法。