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KR20180130500A - 인간 flt3l을 발현하는 재조합 mva 또는 mvaδe3l 및 고형 종양에 대한 면역요법제로서 그의 용도 - Google Patents

인간 flt3l을 발현하는 재조합 mva 또는 mvaδe3l 및 고형 종양에 대한 면역요법제로서 그의 용도 Download PDF

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KR20180130500A
KR20180130500A KR1020187027512A KR20187027512A KR20180130500A KR 20180130500 A KR20180130500 A KR 20180130500A KR 1020187027512 A KR1020187027512 A KR 1020187027512A KR 20187027512 A KR20187027512 A KR 20187027512A KR 20180130500 A KR20180130500 A KR 20180130500A
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South Korea
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mva
tumor
cells
hflt3l
tumors
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KR1020187027512A
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English (en)
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리앙 뎅
스튜워트 슈만
제드 월콕
타하 머굽
웨이위 왕
페이홍 다이
닝 양
Original Assignee
메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터
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Abstract

본 발명은 일반적으로 종양학, 바이러스학 및 면역요법 분야에 관한 것이다. 본 발명은 폭스바이러스, 특히 매우 약독화된 변형 백시니아 바이러스 안카라(Ankara)(MVA), 및 백시니아 병독성 인자 E3가 결실된 재조합 변형 백시니아 안카라 바이러스(MVAΔE3L)에 관한 것이며, 각각은 추가로 인간 Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드(Flt3L) 또는 GM-CSF를 발현하도록 변형된다. 본 발명은 암 면역요법제로서 전술한 재조합 바이러스의 용도에 관한 것이다. 전술한 재조합 폭스바이러스는 또한 면역 관문(immune checkpoint) 차단제 치료법과 조합되어 사용될 수 있다.

Description

인간 FLT3L을 발현하는 재조합 MVA 또는 MVAΔE3L 및 고형 종양에 대한 면역요법제로서 그의 용도
관련 출원
본 국제 출원은 하기의 가출원의 우선권을 주장한다: 2016년 2월 25일에 출원된 미국 가출원 62/300,066호; 2016년 11월 7일에 출원된 미국 가출원 62/418,786호; 및 2016년 11월 8일에 출원된 미국 가출원 62/418,788호. 이들 출원 모두의 내용은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 제공된 보조금 AI073736, AI095692, CA008748 및 CA56821하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 소정의 권리를 가진다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었으며 그 전체가 참고로 본원에 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2017년 2월 23일에 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 11000_005154-WO2_SL.txt이며 크기는 2,683 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 종양학, 바이러스학 및 면역요법 분야에 관한 것이다. 본 발명은 폭스바이러스, 특히 매우 약독화된 변형 백시니아 바이러스 안카라(Ankara)(MVA), 및 백시니아 병독성 인자 E3가 결실된 재조합 변형 백시니아 안카라 바이러스(MVAΔE3L)에 관한 것이며, 각각은 추가로 인간 Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드(Flt3L) 또는 GM-CSF를 발현하도록 변형된다. 본 발명은 암 면역요법제로서 전술한 재조합 바이러스의 용도에 관한 것이다. 전술한 재조합 폭스바이러스는 또한 면역 관문(immune checkpoint) 차단제 치료법과 조합되어 사용될 수 있다.
면역계 및 암
악성 종양은 선천적으로 종래의 치료법에 저항성이며 상당한 치료적 도전을 제시한다. 면역요법은 발전하는 연구 분야가 되었으며 소정의 암 유형의 치료를 위한 추가적인 옵션이 되었다. 면역요법 접근법은 면역계가 종양 세포를 확인하고 파괴를 위해 종양 세포를 타겟팅하기 위해 자극될 수 있다는 근거에 의존한다.
많은 연구는 암 진행에서 면역계 성분의 차등적 존재의 중요성을 지지한다(1)(Jochems et al., Exp Biol Med, 236(5): 567-579 (2011)). 임상 데이터는 고밀도의 종양-침윤성 림프구가 개선된 임상 결과에 연관됨을 제안한다(2)(Mlecnik et al., Cancer Metastasis Rev.; 30: 5-12, (2011)). 왕성한 림프구 침윤과 환자 생존 사이의 상관성은 흑색종, 난소암, 두경부암, 유방암, 요로상피암, 결장직장암, 폐암, 간세포암, 담낭암 및 식도암을 비롯한 다양한 유형의 암에서 보고되었다(3)(Angell et al., Current Opinion in Immunology, 25:1-7, (2013)). 종양 면역 침윤물은 대식세포, 수지상 세포(DC), 단핵구, 호중구, 천연 킬러(NK) 세포, 미자극(naive) 및 기억 림프구, B 세포 및 종양 세포에 의해 발현된 항원의 인식 및 후속하여 세포독성 T 세포에 의한 종양 세포의 파괴를 주로 책임지는 이펙터 T 세포(T 림프구)를 포함한다.
암세포에 의한 항원의 제시 및 종양 세포에 대해 잠재적으로 반응할 수 있는 면역 세포의 존재에도 불구하고, 많은 경우에 면역계는 활성화되지 않거나 확정적으로 억제된다. 이 현상의 핵심은 종양이 면역계의 세포가 면역계의 다른 세포를 억제하도록 강요함으로써 면역 반응으로부터 자신을 보호하는 능력이다. 종양은 항종양 면역 반응을 피하기 위하여 많은 면역조절 기전을 발달시킨다. 예를 들어, 종양 세포는 면역 억제 사이토카인(예를 들어, TGF-β)을 분비하거나 또는 종양 병변 내의 CD4+ T 조절 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포가 이들 사이토카인을 분비하도록 유도한다. 종양은 또한 CD4+ T 세포가 조절 표현형을 발현하도록 편향시키는 능력을 가진다. 전체적인 결과는 손상된 T-세포 반응 및 CD8+ 세포독성 T 세포의 어팝토시스(apoptosis) 유도 손상 또는 항-종양 면역 능력 감소이다. 부가적으로, 종양 세포의 표면 상의 MHC 클래스 I의 종양-관련 변화된 발현은 그들이 면역 반응에 '눈에 띄지 않도록' 한다(4)(Garrido et al. Cancer Immunol. Immunother. 59(10), 1601-1606 (2010)). 항원-제시 기능 및 수지상 세포(DC)의 억제는 부가적으로 항-종양 면역의 회피에 기여한다(5)(Gerlini et al. Am. J. Pathol. 165(6), 1853-1863 (2004)).
또한, 면역 편집(immune editing)과 함께, 종양 미세환경의 국소 면역억제 특성은 타겟 항원을 발현하지 않는 암세포 하위집단의 탈출을 유도할 수 있다. 따라서, 면역계의 항-종양 활성의 보존 및/또는 회복을 촉진할 접근법을 찾는 것은 상당한 치료적 이득이 될 것이다.
면역 관문은 항-종양 면역의 종양-매개된 하향조절에 관련된 것으로 나타났으며 치료 타겟으로 이용되었다. T 세포 기능장애가 CD28 패밀리 수용체의 일원인 억제성 수용체 CTLA-4 및 프로그램된 사멸 1 폴리펩티드(PD-1)의 유도된 발현과 동시에 발생함이 입증되었다. PD-1은 PD-1에 더하여 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA를 포함하는 CD28 패밀리 수용체의 억제성 일원이다. 하지만, 흑색종의 치료에서 면역요법의 사용에 관한 장래성은 항-CTLA-4(이필리무맙(ipilimumab)) 및 항-PD-1 약물(예를 들어, 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 및 니볼루맙(nivolumab))의 임상 사용 및 심지어 규제기관의 승인에 의해 강조된 반면, 이들 면역요법에 대한 환자의 반응은 제한되었다. T 세포에서의 이들 억제성 시그널(예를 들어, CTLA-4, PD-1, 및 PD-1의 리간드인 PD-L1)의 차단에 초점을 맞춘 최근의 임상 시험은 T 세포 억제를 역전시키는 것이 성공적인 면역요법을 위해 중요함을 보여주었다(6, 7)(Sharma et al., Science 348(6230), 56-61 (2015); Topalian et al., Curr Opin Immunol. 24(2), 202-217 (2012)). 이들 관찰은 암에 대하여 면역계를 활용하기 위한 새로운 치료적 접근법의 개발 필요성을 강조한다.
폭스바이러스
조작된 백시니아 바이러스와 같은 폭스바이러스는 전이성 암을 위한 종양용해(oncolytic) 치료법으로서 최전부에 있다(8)(Kirn et al.,Nature Review Cancer 9, 64-71 (2009)). 백시니아 바이러스는 빠른 생활사를 가지며 먼 조직으로 효율적으로 혈행 확산되는 대형 DNA 바이러스이다(9)(Moss, In Fields Virology (Lippincott Williams & Wilkins, 2007), pp.2905-2946). 폭스바이러스는 암세포에서 다수의 트랜스유전자를 발현시키고 따라서 치료 효능을 향상시키기 위한 벡터로서 적합하다(10)(Breitbach et al.,Current pharmaceutical biotechnology 13, 1768-1772 (2012)). 전임상 연구 및 임상 시험은 종양용해 백시니아 바이러스 및 다른 폭스바이러스를 종래의 치료법에 대해 반응하지 않는 진행된 암의 치료를 위해 사용하는 것의 효능을 입증하였다(11-13)(Park et al., Lacent Oncol 9, 533-542 (2008); Kirn et al., PLoS Med 4, e353 (2007); Thorne et al.,J Clin Invest 117, 3350-3358(2007)). 폭스바이러스계 종양용해 치료법은 세포 용해, 어팝토시스 및 괴사의 조합을 통해 암세포를 사멸시키는 효과를 갖는다. 이것은 또한 종양으로의 면역 세포의 동원 및 항-종양 획득 면역 반응의 발달을 촉진하는 선천적 면역 센싱 경로를 촉발한다. 현재의 임상 시험중인 종양용해 백시니아 균주(예를 들어, JX-594)는 복제성 균주이다. 이들은 종양 선택성을 향상시키기 위해 티미딘 키나제가 결실되고 면역 반응을 자극하기 위하여 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 같은 트랜스유전자의 발현을 가진 야생형 백시니아를 이용한다(10)(Breitbach et al., Curr Pharm Biotechnol 13, 1768-1772 (2012)). 하지만 많은 연구는 야생형 백시니아가 항원 제시 세포(APC)에 대해 면역 억제 효과를 가지며(14-17)(Engelmayer et al., J Immunol 163, 6762-6768 (1999); Jenne et al., Gene therapy 7, 1575-1583 (2000); P. Li et al., J Immunol 175, 6481-6488 (2005); Deng et al., J Virol 80, 9977-9987 (2006)), 따라서 종양 자체의 면역억제 및 면역회피 효과에 추가함을 보여주었다. 대조적으로, 매우 약독화된 백시니아 균주인 변형 백시니아 바이러스 안카라(MVA)는 온건한 면역 활성화 효과를 갖지만(18, 19)(Drillien et al., J Gen Virol 85, 2167-75 (2004); Dai et al., PLoS Pathog 10(4), e1003989 (2014)), 포유동물 세포에서 잘 증식하지 못하며 종양 항원의 발현을 위해 또는 종양용해 용도를 위해 적합하지 않은 것으로 간주될 것이다. 하지만, 본 발명자들은 만일 트랜스유전자를 가진 재조합 MVA가 충분한 양으로 제공되면, 감염된 세포의 대부분이 트랜스유전자를 발현할 것임을 발견하였다.
변형 백시니아 바이러스 안카라(MVA)는 감염성 질병과 암을 위한 중요한 백신 벡터인 매우 약독화된 백시니아 균주이다. MVA는 닭 배아 섬유아세포에서 570초과 계대를 통해 백시니아 균주로부터 유도되었다. MVA는 모 백시니아 게놈의 31-kb가 결실되고 대부분의 포유동물 세포에서 비-복제성(non-replicative)이다. MVA는 WHO-지원된 천연두 백신접종동안 120,000명 이상의 사람들에서 사용되었으며, 인간 사용을 위해 매우 안전한 것으로 나타났다. 그것의 안전성과 외래 유전자를 발현하는 그 능력때문에, MVA는 HIV, 결핵, 말라리아, 독감, 코로나바이러스 및 CMV 뿐만 아니라 암에 대한 백신 벡터로서 조사되었다(20-25)(Sutter et al., Current drug targets. Infectious disorders 3, 263-271 (2003); Gomez et al., Curr Gene Ther 8, 97-120 (2008); Gomez et al., Curr Gene Ther 11, 189-217 (2011); Goepfertet al., J Infect Dis 203, 610-619 (2011); Wyatt et al., Virology 372, 260-272 (2008); Garcia et al., Vaccine 29, 8309-8316 (2011)).
암 치료제로서 MVA의 조사는 지금까지 종양 항원을 발현시키기 위한 백신 벡터로서의 그 용도에 제한되었다(26, 27)(Tagliamonte et al. Hum Vaccin Immunother 10, 3332-3346 (2014); Verardi et al., Hum Vaccin Immunother 8, 961-970 (2012)). 다양한 종양 항원이 MVA-계 벡터에 의해 발현되었으며, 일부 재조합 바이러스는 다양한 임상 시험 단계에 있다. 예를 들어, MVA-PSA-PAP는 전립선 특이적 항원(PSA) 및 전립선 산 포스파타제(PAP) 둘 모두를 발현하며 전이성 전립선암을 가진 환자를 위한 임상 시험중이다. 종양 항원 브라키우리(brachyury) 및 T 세포 공자극성 분자를 발현하는 재조합 바이러스 MVA-브라키우리-TRICOM 또한 전이성 암을 가진 환자를 위한 임상 시험중이다. 역시 임상 시험중인, p53 종양 억제자를 발현하는 재조합 바이러스 MVA-p53은 안전한 것으로 나타났다. 타겟팅된 다른 종양 항원은 Her2, hMUC-1, TWIST, 등을 포함한다.
MVA가 매우 약독화되고 온건하게 면역자극성이지만, 이것은 핵심 병독성 인자 E3를 비롯한 다수의 면역 억제 바이러스 유전자를 보유한다. 백시니아 병독성 인자 E3의 결실에 의해 더 약독화된 재조합 MVA 바이러스인 MVAΔE3L은 일차 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서 복제할 수 없으나, 베이비 햄스터 신장 BHK-21 세포에서는 그의 복제 능력을 보유한다(28)(Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003)). MVAΔE3L은 CEF에서 바이러스 DNA 게놈을 복제할 수 있으며 바이러스 후기 단백질 합성은 결핍된다(28)(Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003)). 이것은 또한 CEF에서 어팝토시스를 유도한다(28)(Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003)). HeLa 세포의 MVAΔE3L 감염은 유사한 효과를 가져, 바이러스 복제, 바이러스 후기 유전자 전사 및 번역이 손상되었다(29)(Ludwig et al., J Virol 79(4), 2584-2596 (2005)). MVAΔE3L은 또한 아마도 미토콘드리아 경로를 활성화시킴으로써, HeLa 세포에서 어팝토시스를 유도한다(29)(Ludwig et al., J Virol 79(4), 2584-2596 (2005)). dsRNA는 중간 유전자 전사 동안 생산되어, 2'-5'-올리고아데닐레이트 신타제/RNase L 및 단백질 키나제 R(PKR)의 활성화를 유도할 수 있다. PKR-결핍 MEF에서는, MVAΔE3L은 중간 및 후기 단백질을 발현하는 능력을 수득한다((29)(Ludwig et al., J Virol 79(4), 2584-2596 (2005)).
한 연구는 프로-어팝토시스 단백질 Noxa가 MVAΔE3L 어팝토시스 유도에서 역할을 함을 제안한다(30)(Fischer et al., Cell Death Differ 13, 109-118 (2006)). 초기 연구는 MVAΔE3L이 MVA보다 더 높은 수준의 타입 I IFN을 유도함을 보여주었지만, 정확한 기전은 완전히 밝혀지지 않았다(28)(Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003)).
한 가지 MVAΔE3L이 참고로 포함되는 미국 특허 7,049,145호에서 개시되었다. 이것은 마우스와 인간을 비롯한 대부분의 포유동물 세포에서 감염 가능하지만 비복제성이다.
본 발명은 항암 면역요법제로서 hFlt3L을 발현하는 재조합 MVA 또는 MVAΔE3L의 종양내 전달에 초점을 맞춘다. 종양 항원을 발현하지 않는, 비변형 MVA 또는 결실 돌연변이 MVAΔE3L의 종양내 전달, 및 불활성화 MVA의 종양내 전달은 종양 침윤성 면역 세포(예를 들어, 백혈구), 종양 세포, 및 종양 연합 기질 세포로부터 선천적 면역 반응을 이끌어내었으며, 타입 I IFN 및 전염증성(proinflammatory) 사이토카인과 케모카인의 유도를 유발하여, 종양 면역 억제 미세환경의 변화를 야기한다. WO 2016/144564호 및 WO 2016/168862호를 참고한다. 골수 세포의 증식을 자극하는 타입 I 경막 단백질인 인간 Flt3L(Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드)은 1994년에 클로닝되었다(Lyman et al., 1994). hFlt3L의 용도는 골수 이식을 위한 제조에서 줄기 세포 동원, 수지상 세포의 증식과 같은 암 면역요법, 및 백신 아쥬반트를 비롯한 다양한 전임상 및 임상 상황에서 조사되었다. 재조합 인간 Flt3L(rhuFlt3L)이 500명이 넘는 인간 대상에서 시험되었으며 생활성이고, 안전하며 잘 용인된다(Fong et al., 1998; Maraskovsky et al., 2000; Shackleton et al., 2004; He et al., 2014; Anandasabapathy et al., 2015). CD8α+/CD103+ DC 및 pDC를 비롯한 DC 서브세트의 발달에서 성장 인자 Flt3L의 중요한 역할에 대한 이해에서 많은 진전이 최근에 이루어졌다(McKenna et al., 2000; Waskow et al., 2008; Liu et al., 2007; 2009; Naik et al., 2006; Ginhoux et al., 2009).
CD103+/CD8α+ DC는 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포의 자발적 교차-프라이밍(cross-priming)을 위해 요구되는 것으로 나타났으며(Hildner et al., 2008; Ginhoux et al., 2009, Zhang et al., 2015; Spranger et al., 2015), 브로즈(Broz) 등은 CD103+ DC가 종양 내에 드문드문 존재하며 그들이 풍부한 종양-관련 대식세포와 종양 항원에 대해 경쟁함을 보고하였다. CD103+ DC는 활성화된 CD8+ T 세포 뿐만 아니라 미자극 CD8+ T 세포를 유일하게 자극할 수 있으며, 적응 T 세포 치료법(adoptive T cell therapy)의 성공을 위해 중요하다(Broz, et al. Cancer Cell, 26(5):638-52, 2014). 스프란저(Spranger) 등은 발암 시그널링 경로 WNT/β-카테닌(catenin)의 활성화가 종양 내에서 CD103+ DC 및 항-종양 T 세포의 감소를 유도함을 보고하였다(Spranger et al., 2015). Flt3L-배양된 BMDC의 종양내 전달은 항-CTLA-4 및 항-PD-L1 면역요법의 조합에 대한 반응성을 유도한다(Spranger et al., 2015). CD103+ DC를 위한 성장 인자인 Flt3L의 전신성 투여, 및 폴리I:C (TLR3 아고니스트(agonist))의 종양내 주사는 종양 내에서 CD103+ DC 집단을 증식시키고 활성화시켰으며 쥐 흑색종 및 MC38 결장암 모델에서 면역요법에 대한 저항을 극복하거나 반응성을 향상시켰다(Salmon et al., 2016, Sanchez-Paulete et al., 2016).
다양한 고형 종양에서 종양 신생항원(neoantigen)의 최근 발견은 고형 종양이 일반적으로 사람마다 상이한 독특한 신생항원을 보유함을 나타낸다(31, 32)(Castle et al., Cancer Res 72, 1081-1091(2012); Schumacher et al., Science 348, 69-74(2015)). 본 명세서에 개시된 재조합 바이러스는 종양 항원을 발현함으로써 그들의 활성을 나타내지 않는다. 본 재조합 MVA 바이러스의 종양내 전달은 종양 신생항원의 효율적인 교차-제시 및 종양 내에서 항-종양 획득 면역의 생성(및 또한 전신적으로 확장시킴)을 가능하게 하여, 종양에 대한 면역 반응의 시작에서 종양 세포에 의해 발현된 종양 분화 항원 및 신생항원을 이용하는 "인 시추 암 예방접종"을 유도한다.
종양 내에서 체세포 돌연변이에 의해 생성된 신생항원의 존재에도 불구하고, 종양 항원-특이적 T 세포의 기능은 종종 여러 억제성 기전에 의해 저지된다(33)(Mellman et al., Nature 480, 480-489(2011)). 예를 들어, 활성화된 T 세포 상의 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA-4)의 상향조절은 수지상 세포(DC)상의 CD80 (B71)/CD86(B7.2)와 상호작용하기 위하여 T 세포 공-자극인자 CD28과 경쟁할 수 있으며, 따라서 T 세포 활성화 및 증식을 억제할 수 있다. CTLA-4는 또한 조절 T(Treg) 세포상에 발현되며 Treg의 억제성 기능을 매개함에 있어서 중요한 역할을 한다(34, 35)(Wing et al., Science 322, 271-275(2008);Peggs, et al., J Exp Med 206, 1717-1725 (2009)). 또한, 종양 세포 상의 PD-L/PD-L2의 발현은 CD28 패밀리의 억제성 수용체인 PD-1의 활성화를 유도하여, T 세포 소진을 유도할 수 있다. CTLA-4 및 프로그램된 사멸 1 폴리펩티드(PD-1)와 같은 억제성 수용체에 대한 항체를 이용하는 면역요법은 동물 연구 및 전이성 암을 가진 환자에서의 임상 반응에서 주목할만한 전임상 활성을 나타냈으며, 전이성 흑색종, 비소세포 폐암, 및 신장 세포 암종의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다(6, 36-39)(Leach et al., Science 271, 1734-1746 (1996); Hodi et al., NEJM 363, 711-723 (2010); Robert et al., NEJM 364, 2517-2526 (2011); Topalian et al.,Cancer Cell 27, 450-461 (2012) ; Sharma et al., Science 348(6230), 56-61 (2015)).
흑색종
가장 치명적인 암 중 하나인 흑색종은 미국과 전세계에서 가장 빠르게 성장하는 암이다. 흑색종의 발생은 1980년 이후 젊은 백인 여성에서 50%만큼 증가하였으며, 이는 주로 과다한 태양 노출 및 일광욕용 베드의 사용 때문이다. 미국 암 협회에 따르면, 2015년에 미국에서 약 78,000명의 사람들이 흑색종으로 진단될 것이며 거의 10,000명의 사람들(또는 시간 당 한 사람)이 흑색종으로 사망할 것이다. 대부분의 경우에, 진행된 흑색종은 화학요법 및 방사선을 비롯한 종래의 치료법에 저항성이다. 그 결과, 전이성 흑색종을 가진 사람은 매우 좋지 못한 예후를 가지며, 기대 수명이 단지 6 내지 10 개월이다. 흑색종의 약 50%가 BRAF(핵심 종양-촉진 유전자)에서 돌연변이를 갖는다는 발견은 이 질병에서 타겟팅된 치료법을 위한 문을 열었다. BRAF 억제제를 이용한 초기 임상 시험은 BRAF 돌연변이를 가진 흑색종을 가진 환자에서 주목할만하지만 불행히도 지속가능하지 못한 반응을 보여주었다. 따라서, 이들 환자 및 BRAF 돌연변이가 없는 흑색종을 가진 환자를 위한 대안적 치료 전략이 시급하게 필요하다.
인간 병리학 데이터는 흑색종 병변 내의 T-세포 침윤물의 존재가 더 긴 환자 생존과 긍정적으로 상관됨을 나타낸다(40)(Oble et al. Cancer Immun. 9, 3 (2009)). 흑색종으로부터의 보호에서 면역계의 중요성은 면역 활성인자 IFN-α2b 및 IL-2와 같은 면역요법의 부분적 성공(41)(Lacy et al. Expert Rev Dermatol 7(1):51-68 (2012)), 및 작용제 단독이거나 조합 치료법의 항-CTLA-4 및 항-PD-1/PD-L1을 비롯한 면역 관문 치료법에 대한 전이성 흑색종을 가진 환자의 전례없는 임상 반응에 의해 추가로 지지된다(6, 7, 37, 42-45)(Sharma and Allison, Science 348(6230), 56-61 (2015); Hodi et al., NEJM 363(8), 711-723 (2010); Wolchok et al., Lancet Oncol. 11(6), 155-164 (2010); Topalian et al., NEJM 366(26), 2443-2454 (2012); Wolchok et al., NEJM 369(2), 122-133 (2013); Hamid et al., NEJM 369(2), 134-144 (2013); Tumeh et al., Nature 515(7528), 568-571 (2014)). 하지만, 많은 환자가 면역 관문 차단 치료법 단독에 반응하지 못한다. 바이러스치료법의 추가는 면역 관문 차단제에 대한 저항을 극복할 수도 있으며, 이것은 동물 종양 모델에 의해 지지된다(46)(Zamarin et al., Sci Transl Med 6(226), 2014). 하지만, 이 저항성 극복의 기전은 잘 이해되고 있지 않다.
종양 면역에서 타입 I IFN 및 세포액 DNA-센싱 경로.
타입 I IFN은 숙주 항종양 면역에서 중요한 역할을 한다(47)(Fuertes et al., Trends Immunol 34, 67-73 (2013)). IFNAR1-결핍 마우스는 종양 세포의 이식 후 종양 발생에 더 민감하며; 자발적 종양-특이적 T 세포 프라이밍이 또한 IFNAR1-결핍 마우스에서는 결함이 있다(48, 49)(Diamond et al., J Exp Med 208, 1989-2003 (2011); Fuertes et al., J Exp Med 208, 2005-2016 (2011)). 더욱 최근의 연구는 세포액 DNA-센싱 경로가 종양-유래 DNA의 선천적 면역 센싱에서 중요하며, 항종양 CD8+ T 세포 면역의 발달을 야기함을 보여주었다(50)(Woo et al., Immunity 41, 830-842 (2014)). 이 경로는 또한 방사선-유도된 항종양 면역에서 역할을 한다(51)(Deng et al., Immunity 41, 843-852 (2014)). 자발적 항-종양 T 세포 반응이 암 환자에서 검출될 수 있지만, 암은 결국에는 대부분의 환자에서 숙주 항종양 면역을 이긴다. 종양 면역 억제 미세환경을 변화시키기 위한 새로운 전략이 암 치료법을 위해 유익할 것이다.
종양에 대한 숙주의 면역 반응을 개선함에 있어서 일부 단계는 이미 본 발명자들과 그 동료들에 의해 이루어졌다. 불활성화 MVA의 종양내 (또는 전신성) 전달이, 선천적 및 획득성의 세포 면역 반응의 활성화에 기인하며 타입 I IFN의 유도에 관련되는 항종양 면역을 유도하며, 이 활성화가 종양 면역을 극복하고 고형 종양의 감소 및 심지어 박멸을 유도하는 것으로 나타났다. 2016년 2월 25일에 출원되고 2016년 9월 15일에 WO 2016/144564호로서 공개되었으며, 그 전체가 참고로 포함되는 국제(PCT) 특허 출원을 참고한다. 부가적으로, 같은 그룹의 조사자들은 트랜스유전자를 발현하지 않는, MVA 및/또는 MVAΔE3L의 종양내 또는 전신성 전달이 또한 세포 반응의 유사한 활성화에 기인하며 타입 I IFN의 유도에 관련되며 흑색종과 같은 고형 종양의 감소 및 심지어 박멸을 유도하는 항종양 면역을 유도함을 보여주었다. 2016년 4월 18일에 출원되고 2016년 10월 20일에 WO 2016/168862호로 공개되었으며 그 전체가 참고로 포함되는 국제(PCT) 특허 출원을 참고한다. 그럼에도 불구하고, 악성 종양에 걸린 대상의 면역계의 능력을 개선하기 위한 노력이 계속되고 있다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 인간 Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드(hFlt3L)를 보유한 MVA(MVA-hFlt3L); 및 (ii) hFlt3L을 보유한 MVAΔE3L(MVAΔE3L-hFlt3L)로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 변형 백시니아 안카라(MVA) 바이러스를, 악성 고형 종양에 걸린 대상의 종양 세포에 전달시에, 종양을 치료하기에 효과적인 양으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 관련 양태에서, 본 발명은 단리되고, 악성 고형 종양에 대한 면역요법제로서 사용하기에 적합한, 인간 Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드(hFlt3L)를 발현하도록 변형된 백시니아 병독성 인자 E3가 결실된 재조합 변형 백시니아 안카라 바이러스(MVAΔE3L)에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 종양의 치료는 하기 중 하나 이상에 의해 나타난다: 대상에서 종양에 대한 면역 반응의 유도, 또는 대상에서 종양에 대해 진행중인 면역 반응의 향상 또는 촉진, 종양의 크기 감소, 종양의 박멸, 종양의 성장 억제, 종양의 전이 억제 및 전이성 종양의 감소 또는 박멸.
보다 구체적인 실시형태에서, 면역 반응의 유도, 향상 또는 촉진은 하기 중 하나 이상을 포함한다:
CD8+ 세포독성 T 세포의 증식 및 활성화;
CD4+ 이펙터 T 세포의 증식 및 활성화;
CD8+/Treg 및 Tconv/Treg의 비의 증가;
주사된 종양 및 원격(distant) 종양에서 CD45+ 세포 및 CD8+ T 세포의 동원;
주사된 종양 및 원격 종양에서 종양-관련 대식세포(TAM)의 감소;
주사된 종양 및 원격 종양내로 Ly6ChiCD11b+ 염증성 단핵구 및 Ly6ChiCD11b- 골수 세포의 유입; 및
타입 IFN 및 전염증성 사이토카인의 생산을 통해, 주사된 종양 및 원격 종양에서 교차-제시 CD103+ 수지상 세포의 활성화 및 이동(mobilization);
항-종양 CD8+ T 세포의 생성 및 이종성 종양(들)에 대한 교차-보호.
일부 실시형태에서, 재조합 MVA는 종양 항원을 인코딩하거나 발현하는 핵산을 보유하고 있지 않다. 추가 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 약학적 허용 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 부형제는 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균 작용제, 등장제, 흡수 지연제 및 전술한 것 중 둘 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, 재조합 MVA는 MVAΔE3L-hFlt3L을 포함한다.
일 양태에서, 조성물은 인간 Flt3L을 인코딩하고 발현하는 티미딘 키나제가 결실된 복제 가능 재조합 약독화 백시니아 바이러스의 제2의 양을 추가로 포함하되, 상기 제2의 양은 유도되거나 향상되거나 촉진된 면역 반응을 증대시키는데 기여한다. 다른 양태에서, 조성물은 제3의 양의 불활성화 MVA를 추가로 포함하되, 상기 제3의 양은 유도되거나 향상되거나 촉진된 면역 반응을 증대시키는데 기여한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 악성 고형 종양에 걸린 대상을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 MVA-hFlt3L 및 MVAΔE3L-hFlt3L 및 그 조합의 군으로부터 선택된 재조합 MVA 바이러스를 종양의 세포에 전달하여 종양을 치료하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 바이러스의 양은 하기 중 하나 이상을 야기하기에 효과적이다: 대상의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하거나 면역계에 의해 진행중인 종양에 대한 면역 반응을 향상시키거나 촉진함; 종양 크기의 감소; 종양의 박멸; 종양의 성장 억제; 종양의 전이 억제; 및 전이성 종양의 감소 또는 박멸. 일부 실시형태에서, 종양에 대한 면역 반응은 하기 중 하나 이상을 이룬다:
CD8+ 세포독성 T 세포의 증식 및 활성화;
CD4+ 이펙터 T 세포의 증식 및 활성화;
CD8+/Treg 및 Tconv/Treg의 비의 증가;
주사된 종양 및 원격 종양에서 CD45+ 세포 및 CD8+ T 세포의 동원;
주사된 종양 및 원격 종양에서 종양-관련 대식세포(TAM)의 감소;
주사된 종양 및 원격 종양내로 Ly6ChiCD11b- 염증성 단핵구 및 Ly6ChiCD11b- 골수 세포의 유입; 및
타입 IFN 및 전염증성 사이토카인의 생산을 통해, 주사된 종양 및 원격 종양에서 교차-제시 CD103+ 수지상 세포의 활성화 및 이동;
항-종양 CD8+ T 세포의 생성 및 이종성 종양(들)에 대한 교차-보호.
추가 실시형태에서, 상기 MVA 또는 MVAΔE3L은 종양 항원을 인코딩하거나 발현하는 핵산을 보유하고 있지 않다.
일부 실시형태에서, 재조합 MVA는 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차적 조합에 의해 전달된다.
일부 실시형태에서, 종양은 흑색종 또는 결장 암종 또는 유방 암종 또는 전립선 암종이다.
일부 실시형태에서, 한 가지 유형의 고형 종양에 걸린 대상을 MVAΔE3L-hFlt3L로 치료하는 것은 무관한 유형의 종양으로부터 보호하는 것을 증명하여, 본 발명의 면역요법제가 상이한 기원으로부터의 종양을 타겟팅하는 항종양 활성을 이끌어냄을 입증한다.
다른 추가 실시형태에서, 재조합 MVA의 전달은 수 주, 수 개월 또는 수 년동안 또는 효과가 지속되는 한 무기한으로 또는 최대 내약 용량이 도달할 때까지 계속된다. 일부 실시형태에서, 재조합 MVA의 전달은 종양내 주사에 의해서이다.
일부 실시형태에서, 대상은 인간이다.
다른 실시형태에서, 재조합 MVA는 투여당 약 106 - 1010 플라크 형성 단위(pfu)의 범위내, 바람직하게는 약 107 내지 약 109 플라크 형성 단위(pfu)의 범위 내의 투여량으로 전달된다. 일부 실시형태에서, 전달된 양은 모든 종양 세포를 감염시키기에 충분하다. 일부 실시형태에서, 전달은 한 달에 한번 내지 1주에 2회 범위 내의 빈도로 반복된다. 추가 실시형태에서, 전달은 매주 한번 반복된다.
일부 실시형태에서, 흑색종은 전이성 흑색종이다.
일부 실시형태에서, 재조합 MVA는 MVAΔE3L-hFlt3L이다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기 면역학적 효과 중 적어도 하나를 야기하기에 효과적인, MVA-hFlt3L, MVAΔE3L-hFlt3L 또는 둘의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 변형 백시니아 바이러스 안카라(MVA)의 양을 대상의 종양에 전달하는 것을 포함하는, 대상에서 고형 악성 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다:
CD8+ 세포독성 T 세포의 증식 및 활성화;
CD8+ 세포독성 T 세포의 증식 및 활성화;
CD8+ 세포독성 T 세포의 증식 및 활성화;
CD4+ 이펙터 T 세포의 증식 및 활성화;
CD8+/Treg 및 Tconv/Treg의 비의 증가;
주사된 종양 및 원격 종양에서 CD45+ 세포 및 CD8+ T 세포의 동원;
주사된 종양 및 원격 종양에서 종양-관련 대식세포(TAM)의 감소;
주사된 종양 및 원격 종양내로 Ly6ChiCD11b+ 염증성 단핵구 및 Ly6ChiCD11b- 골수 세포의 유입; 및
타입 IFN 및 전염증성 사이토카인의 생산을 통해 주사된 종양 및 원격 종양에서 교차-제시 CD103+ 수지상 세포의 활성화 및 이동;
항-종양 CD8+ T 세포의 생성 및 이종성 종양(들)에 대한 교차-보호.
다른 양태에서, 본 발명은 하기 중 하나 이상을 이루기 위하여, 대상의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하거나 종양에 대한 상기 대상의 진행중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하기에 효과적인 양의, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 그 조합을 대상의 종양 세포에 전달하는 것을 포함하는, 대상에서 고형 악성 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다: 종양의 크기 감소, 종양 박멸, 종양의 성장 억제, 종양의 전이성 성장 억제, 종양 세포의 어팝토시스 유도 또는 대상의 생존 연장.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상에서 악성 종양을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 대상의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하거나 종양에 대한 상기 대상의 진행중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하기에 효과적인 양의, MVA-hFlt3L , MVAΔE3L-hFlt3L 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스를 대상의 종양 세포에 전달하고, 종양 내에서 면역 억제 기전을 차단하기에 효과적인 면역 관문 차단제 또는 면역 관문 아고니스트의 제2 양을 대상에게 공동으로 투여하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 관문 억제제 또는 관문 아고니스트의 투여는 비경구 경로에 의해서이다. 일 실시형태에서, 전달은 종양내 주사에 의해서이고 투여는 정맥내 경로에 의해서이다. 다른 실시형태에서, 전달 및 투여 둘 모두는 정맥내 경로에 의해서이다. 일부 실시형태에서, 전달 및 투여 둘 모두는 종양내 주사에 의해서이다.
일부 실시형태에서 공동 투여는 이펙터 T-세포 반응을 향상시키며; 일부 실시형태에서, 공동 투여는 기억 T 세포 반응을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 공동 투여는 단독요법에 비하여 유의하게 생존을 증가시키거나, 적어도 전이성 종양을 비롯한 종양의 성장의 억제를 이룬다.
일부 실시형태에서, 면역 관문 차단제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, CTLA4 억제제, LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIM3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신(Mucin)-3), B7-H3, 및 TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 가진 T-세포 면역수용체)에 대한 억제성 항체로 이루어진 군으로부터 선택되며; 면역 관문 아고니스트는 항-ICOS 항체, 항-OX40 항체, 4-1BB(CD 137)에 대한 그리고 GITR에 대한 아고니스트 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 종양은 원발성 또는 전이성 흑색종 또는 원발성 또는 전이성 결장 암종이다. 다른 실시형태에서, 각각 간격을 두고 그 자신의 스케쥴에 따라, 바이러스는 전달되고 면역 관문 차단제는 투여된다.
일 실시형태에서, 바이러스의 첫번째 적용량(dose)이 먼저 전달되고 시간의 경과 후 면역 관문 차단제의 첫번째 적용량이 투여된다.
추가 실시형태에서, 전달과 투여는 동일한 전체 기간 동안 병행하여 발생한다. 일부 실시형태에서, 바이러스와 면역 관문 차단제 중 하나 또는 둘 모두는 각각 수 주, 수 개월 또는 수 년의 기간 동안, 또는 효과가 지속되고 최대 내약 용량이 도달하지 않는 한 무기한으로 전달되고 투여된다.
일부 실시형태에서, 바이러스와 면역 관문 차단제는 동시에 투여된다. 추가 실시형태에서, 바이러스와 면역 관문 차단제는 동일한 조성물로 투여된다.
일부 실시형태에서, 재조합 MVA 및 면역 관문 차단제는 종양내로 전달된다. 추가 실시형태에서, 재조합 MVA 및 면역 관문 차단제는 순차적으로 투여된다.
보다 구체적 실시형태에서, 본 방법은 인간 Flt3L을 인코딩하고 발현하는 티미딘 키나제가 결실된 복제 가능 재조합 약독화 백시니아 바이러스 또는 불활성화 MVA 또는 둘 모두를 각각 제2 및 제3의 양으로 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하며, 상기 제2의 양 또는 제3의 양 또는 둘 모두는 유도되거나 향상되거나 촉진된 면역 반응의 증대에 기여한다.
일 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 키트에 관한 것이다: 1) 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 제1 성분; 2) 각각 제2 및 제3의 양으로, 인간 Flt3L을 인코딩하고 발현하는 티미딘 키나제가 결실된 복제 가능 재조합 약독화 백시니아 바이러스 및 불활성화 MVA 중 하나 또는 둘 모두를 포함하며, 상기 제2의 양 또는 제3의 양 또는 둘 모두는 상기 대상에서 유도되거나 향상되거나 촉진된 면역 반응의 증대에 기여하는 제2 성분.
본 방법의 흥미로운 결과는 바이러스의 종양내 주사가 상이한 고형 종양에 대해 항-종양 면역을 야기한다는 것이다.
본 발명에서, 발명자들은 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 균주가 암 면역요법제로서 사용될 수 있는지 여부를 조사하였다. 사실상, 그들은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 전달이 종양의 박멸과 항종양 면역 생성에서 MVAΔE3L보다 더 효과적임을 관찰하였다. 유사하게, MVA-hFlt3L의 종양내 전달은 종양의 박멸과 항종양 면역 생성에서 MVA보다 더 효과적이다. 따라서, 치료 옵션으로서, 환자들은 개선된 치료 결과를 이루기 위하여 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 둘 모두로 치료될 수 있다.
여기서 MVA-hFlt3L과 MVAΔE3L-hFlt3L 사이에 나타난 유사성으로 볼때, hFlt3L가 결핍된 MVAΔE3L에 비하여 MVAΔE3L-hFlt3L에 대해 관찰된 특성과 효과는 또한 MVA 단독에 비하여 MVA-hFlt3L에 의해 나타내질 것으로 예상된다.
도 1은 티미딘 키나제(TK) 유전자좌에서 플라스미드 DNA pCB 벡터와 MVA 바이러스 게놈 DNA 사이의 상동성 재조합의 도식 다이아그램이다. pCB 플라스미드가 특정 관심 유전자(SG), 이 경우에는, 쥐 GM-CSF(mGM-CSF), 또는 인간 Flt3L(hFlt3L)을 백시니아 합성 초기 및 후기 프로모터(Pse/l)의 제어 하에 삽입하기 위해 사용되었다. 백시니아 P7.5 프로모터의 제어하에 있는 이. 콜라이 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(gpt)가 약물 선택 마커로서 사용되었다. 이들 2개의 발현 카세트는 각 측 상에 TK 유전자의 부분 서열(TK-L 및 TK-R)에 의해 인접(flank)되었다. SG가 결핍된 플라스미드 DNA가 벡터 대조군으로 사용되었다. 플라스미드 DNA와 변형 백시니아 바이러스(MVA) 또는 MVAΔE3L(E3L 유전자가 결실됨) 게놈 DNA의 TK 유전자좌에서 발생한 상동성 재조합은 SG 및 gpt 발현 카세트가 MVA 또는 MVAΔE3L 게놈 DNA TK 유전자좌내로 삽입되어 MVA-mGM-CSF, MVA-hFlt3L, MVAΔE3L- mGM-CSF, MVA-ΔE3L-hFlt3L이 생성되도록 한다. 재조합 바이러스는 미코페놀산(MPA), 잔틴 및 하이포잔틴을 포함하는 gpt 선택 배지의 존재하에서 농축되었으며, 플라크는 오염 MVA 또는 MVAΔE3L이 없는 적절한 재조합 바이러스가 수득될 때까지 4-5 라운드 동안 약물 선택 배지의 존재하에서 정제되었다.
도 2는 MVA-mGM-CSF, MVA-hFlt3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, 및 MVA-ΔE3L-hFlt3L을 비롯한 MVA 또는 MVAΔE3L 재조합 바이러스의 성공적인 생성을 입증하는 재조합 바이러스의 PCR 분석을 보여준다. 바이러스 게놈 DNA는 트랜스유전자의 삽입 및 TK의 결실을 확인하고 오염성 모 바이러스, MVA 또는 MVAΔE3L이 없음을 확실히 하기 위하여 PCR에 의해 분석되었다. 삽입된 트랜스유전자를 포함하는 PCR 생성물은 삽입된 유전자가 정확한 서열을 가짐을 확인하기 위하여 시퀀싱되었다.
도 3은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 양측 B16-F10 종양 이식 모델에서 주사된 종양 및 비-주사된 종양 둘 모두의 박멸에서 hFlt3L 삽입물이 없는 MVAΔE3L-mGM-CSF, 또는 MVAΔE3L보다 더 효과적임을 보여주는 데이터의 일련의 도해적 표시이다. (a) 양측 종양 이식 모델의 도식 다이아그램. B16-F10 흑색종 세포가 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피부내로 이식되었다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 1 x 105). 종양 이식 후 7-8일에, 발명자들은 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에 2 x 107 pfu의 MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L 바이러스, 또는 PBS 모의 주사 대조군을 종양내로 주사하였다. 종양 크기가 측정되었으며 종양에 매주 2회씩 재조합 바이러스 또는 PBS가 주사되었다. 마우스 생존이 모니터되었다. (b) PBS, MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 바이러스의 주사 후 여러날에 걸친 주사된 및 비-주사된 종양의 부피. (c) PBS(n=5), MVAΔE3L(n=9), MVAΔE3L-mGM-CSF(n=9), 또는 MVAΔE3L-hFlt3L(n=9; *, p < 0.05; ***, p < 0.001)로 처리된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르(Kaplan-Meier) 생존 곡선. (d) 치사량의 MC38 결장 선암종 세포(1 x 105)로 피부내로 재투여시험(rechallenge)된 미자극 마우스(흑색 원; n=5) 및 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 마우스(흑색 다이아몬드; n=4)의 카프란-메이에르 생존 곡선.
도 4는 양측 흑색종 모델에서 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 CD8+ T 세포의 증식과 활성화 유도에 있어서 MVAΔE3L-hFlt3L이 효과적임을 입증하는, MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사 후 수집된 데이터의 일련의 도해적 표시이다. (a)는 PBS, MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 양성 대조군으로서 열-불활성화 MVA(열-MVA)로 다양하게 처리된 마우스의 주사된(우측 플롯) 및 비-주사된(좌측 플롯) 종양에서 CD8+ 그랜자임(Granzyme) B+ 세포의 비율의 두 플롯으로 이루어진다(*, p < 0.05, **, p < 0.01, ***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM(PBS 그룹을 위해 n=3 그리고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5)이다. (b)는 주사된 및 비-주사된 종양에서 그랜자임 B를 발현하는 CD8+ 세포의 대표적 유세포분석 플롯의 시리즈이다. (c)는 PBS, MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L 또는 열-MVA로 다양하게 처리된 마우스의 주사된(우측) 및 비-주사된(좌측) 종양에서 CD8+Ki-67+ 세포의 비율의 두 플롯으로 이루어진다(**, p < 0.01, ***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM(PBS 그룹을 위해 n=3 그리고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5)이다. (d)는 주사된 및 비-주사된 종양에서 Ki-67을 발현하는 CD8+ 세포의 대표적 유세포분석 플롯의 시리즈이다.
도 5는 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 CD4+ T 세포의 증식과 활성화 유도에 있어서 MVAΔE3L-hFlt3L이 효과적임을 입증하는, MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사 후 수집된 데이터의 일련의 도해적 표시이다. (a)는 PBS, MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 열-MVA로 처리된 마우스의 주사된 및 비-주사된 종양에서 CD4+ 그랜자임 B+ 세포의 비율의 두 플롯으로 이루어진다(*, p < 0.05, **, p < 0.01, ***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM(PBS 그룹을 위해 n=3 그리고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5)이다. (b)는 주사된 및 비-주사된 종양에서 그랜자임 B를 발현하는 CD4+ 세포의 대표적 유세포분석 플롯의 시리즈이다. (c)는 주사된(우측 플롯) 및 비-주사된(좌측 플롯) 종양에서 CD4+Ki-67+ 세포의 비율의 두 플롯으로 이루어진다(**, p < 0.01, ***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM(PBS 그룹을 위해 n=3 그리고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5)이다. (d)는 주사된 및 비-주사된 종양에서 Ki-67을 발현하는 CD4+ 세포의 대표적 유세포분석 플롯의 시리즈이다.
도 6은 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 CD4+FoxP3+ 조절 T 세포의 감소 유도에 있어서 MVAΔE3L-hFlt3L이 효과적임을 보여주는, MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사 후 수집된 데이터의 일련의 도해적 표시이다. (a)는 PBS, MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 열-MVA로 처리된 양측 마우스 모델의 주사된 및 비-주사된 종양에서 CD4+FoxP3+ 세포의 비율의 두 플롯으로 이루어진다(**, p< 0.01, ****, p< 0.0001). 데이터는 평균 ± SEM(PBS 그룹을 위해 n=3 그리고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5)이다. (b)는 주사된 및 비-주사된 종양에서 FoxP3을 발현하는 CD4+ 세포의 대표적 유세포분석 플롯의 시리즈이다.
도 7은 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 CD45+ 세포와 CD8+ 세포의 동원에 있어서 효과적이며, 통상적 CD4+/Treg 뿐만 아니라 CD8+/Treg의 비를 증가시킴을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. (a, b) PBS, MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 열-MVA로 처리된 마우스의 주사된 및 비-주사된 종양의 그램 당 각각 종양-침윤성 CD45+ 및 CD8+ 세포의 절대 수의 두 플롯(*, p< 0.05, **, p< 0.01, ns: 유의하지 않음). (c) 주사된 및 비-주사된 종양에서 CD8+/Treg의 비(*, p< 0.05, **, p< 0.01, ns: 유의하지 않음). (d) 주사된 및 비-주사된 종양에서 통상적 CD4+/Treg의 비(*, p< 0.05, ns: 유의하지 않음). 데이터는 평균 ± SEM(PBS 그룹을 위해 n=3 그리고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5)이다.
도 8은 주사된 및 비-주사된 종양에서 F4/80+ TAM 및 CD24+ DC의 유세포분석 플롯의 일련의 도해적 표시이다. TAM 및 DC는 CD45+MHC-IIhiLy6Clo이다. 이들은 CD24 및 F4/80 발현 패턴에 의해 더 분리되었다. TAM은 F4/80hiCD24lo이며, 여기서 CD24+ DC는 높은 수준의 CD24를 발현한다.
도 9는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 종양-관련 대식세포(TAM)를 감소시킴을 보여주는 일련의 도해적 표시이다. (a, b) PBS, MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 열-MVA로 처리된 WT 마우스 및 PBS 또는 MVAΔE3L-hFlt3L로 처리된 Batf3-/- 마우스의 주사된 (b) 및 비-주사된 (a) 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중 TAM 세포의 비율(**, p < 0.01, ****, p < 0.0001). 데이터는 평균 ± SEM이다(WT 마우스에서 PBS 그룹을 위해 n=3이고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5이며; Batf3-/- 마우스에서 PBS 그룹을 위해 n=2이고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5임).
도 10은 바이러스 처리 후 주사된 및 비-주사된 종양에서 CD103+ 및 CD11b+ DC의 유세포분석 플롯의 일련의 도해적 표시이다. 종양-관련 CD24+ DC는 그들의 CD11b와 CD103의 발현에 의해 더 분리될 수 있다. CD11b+ DC는 높은 수준의 CD11b를 발현하는 한편, CD103+ DC는 높은 수준의 CD103을 발현한다.
도 11은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가, 주사된 종양에서는 CD24+, CD103+ 및 CD11b+ 수지상 세포의 감소를 그리고 비-주사된 종양에서는 CD24+, CD103+ 수지상 세포의 감소를 유도함을 보여주는 일련의 도해적 표시이다. (a, b) PBS, MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 열-MVA로 처리된 WT 마우스 및 PBS 또는 MVAΔE3L-hFlt3L로 처리된 Batf3-/- 마우스의 주사된 (b) 및 비-주사된 (a) 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중 CD24+ DC의 비율(**, p < 0.01, ***, p < 0.001, ****, p < 0.0001). 데이터는 평균 ± SEM이다(WT 마우스에서 PBS 그룹을 위해 n=3이고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5이며; Batf3-/- 마우스에서 PBS 그룹을 위해 n=2이고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5임). (c, d) 주사된 (d) 및 비-주사된 (c) 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중 CD103+ DC의 비율(*, p < 0.05, **, p < 0.01, ***, p < 0.001, ****, p < 0.0001). 데이터는 평균 ± SEM이다(WT 마우스에서 PBS 그룹을 위해 n=3이고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5이며; Batf3-/- 마우스에서 PBS 그룹을 위해 n=2이고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5임). (e, f) 주사된 (f) 및 비-주사된 (e) 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중 CD11b+ DC의 비율(*, p < 0.05, **, p < 0.01). 데이터는 평균 ± SEM이다(WT 마우스에서 PBS 그룹을 위해 n=3이고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5이며; Batf3-/- 마우스에서 PBS 그룹을 위해 n=2이고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5임).
도 12는 바이러스 처리 후 주사된 및 비-주사된 종양에서 골수 세포 집단의 유세포분석 플롯의 일련의 도해적 표시이다. CD45+ 종양 침윤성 골수 세포는 그들의 CD11b 및 Ly6C의 발현에 의해 더 분리되었다. Ly6C+ 세포는 Ly6ChiCD11b+ 염증성 단핵구, Ly6ChiCD11b- 세포, 및 Ly6CintCD11b+ 세포(호중구 가능성)를 비롯한 여러 집단으로 더 분리될 수 있다.
도 13은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가, 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 Ly6C+CD11b- 및 Ly6C+CD11b+ 세포의 유입을 유도함을 보여주는 데이터의 일련의 도해적 표시이다. (a, b) PBS, MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 열-MVA로 처리된 WT 마우스 및 PBS 또는 MVAΔE3L-hFlt3L로 처리된 Batf3-/- 마우스의 주사된 (b) 및 비-주사된 (a) 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중 Ly6ChiCD11b+ 세포의 비율(*, p < 0.05, **, p < 0.01, ****, p < 0.0001). (c, d) 주사된(b) 및 비-주사된(a) 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중 Ly6ChiCD11b- 세포의 비율(*, p < 0.05, **, p < 0.01, ***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM이다(WT 마우스에서 PBS 그룹을 위해 n=4이고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5이며; Batf3-/- 마우스에서 PBS 그룹을 위해 n=2이고 각 바이러스 그룹을 위해 n=5임).
도 14는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 양측 MC38 종양 이식 모델에서 바이러스-주사된 및 비-주사된(대측성) 종양 둘 모두의 성장을 지연시키는데 있어서 MVAΔE3L보다 더 효과적임을 보여주는 데이터의 일련의 도해적 표시이다. (a)는 양측 MC38 종양 이식 모델에서 PBS, MVAΔE3L, 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 바이러스의 주사 후 여러날에 걸친 주사된 및 비-주사된 종양의 부피의 12 플롯으로 이루어진다. 전술한 대로, 바이러스는 우측 옆구리 상의 더 큰 종양내로만 주사되었다. (b) PBS (n=10), MVAΔE3L(n=10), 또는 MVAΔE3L-hFlt3L(n=10; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001)로 처리된 MC38 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선.
도 15는 4T1 쥐 삼중 음성 유방 암종(TNBC) 양측 이식 모델에서 MVAΔE3L, 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사의 일련의 도해적 표시를 보여준다. 4T1 세포(2.5 x 105)는 BALB/c 마우스의 우측 옆구리 상의 면도된 피부 내로 피부내 이식되었으며 (5 x 104) 세포가 좌측 옆구리에 이식되었다. 이식 후 5일에, 우측 종양(약 3 mm 직경)에 PBS, MVAΔE3L(2 x 107 pfu), 또는 MVAΔE3L-hFlt3L(2 x 107 pfu)가 매주 2회 주사되었다. (a)는 양측 4T1 종양 이식 모델에서 PBS, MVAΔE3L, 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 바이러스를 주사한 후 여러날에 걸쳐 (주사된 및 비-주사된) 각 종양 부피의 일련의 그래프이다. (b, c)는 첫번째 주사 후 제18일에 (주사된 및 비-주사된) 각 종양 부피의 그래프이다.(PBS를 위해 n= 5이고 MVAΔE3L, 또는 MVAΔE3L-hFlt3L을 위해 n=10; ****, P < 0.0001). (d) PBS, MVAΔE3L, 또는 MVAΔE3L-hFlt3L로 처리된 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선. 생존 데이터는 로그-랭크(log-rank)(만텔-콕스(Mantel-Cox)) 시험에 의해 분석되었다(PBS를 위해 n= 5이고 MVAΔE3L, 또는 MVAΔE3L-hFlt3L을 위해 n=10; ***, P < 0.001).
도 16은 WT C57B/6 및 STINGGt/Gt 마우스에서의 전립선 암종 TRAMP-C2 일측 이식 모델에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사의 일련의 도해적 표시를 보여준다. (a-d)는 WT 또는 STINGGt/Gt 마우스에서 PBS, 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 주사 후 여러날에 걸친 각 종양 부피의 일련의 그래프이다. (e)는 바이러스의 첫번째 주사일에 각 초기 종양 부피의 그래프이다(WT 마우스에서 PBS를 위해 n=10이고 MVAΔE3L-hFlt3L을 위해 n=10; STINGGt/Gt 마우스에서 PBS를 위해 n=7이고 MVAΔE3L-hFlt3L을 위해 n=10 *, P < 0.05). (f)는 첫번째 주사 후 제24일에 각 종양 부피의 그래프이다. (WT 마우스에서 PBS를 위해 n= 10이고 MVAΔE3L-hFlt3L을 위해 n=10; STINGGt/Gt 마우스에서 PBS를 위해 n=7이고 MVAΔE3L-hFlt3L을 위해 n=10; *, P < 0.05; ****, P < 0.0001).
도 17은 양측 B16-F10 쥐 흑색종 이식 모델에서 종양의 성장을 지연시키거나 박멸하는데 MVA-hFlt3L의 종양내 주사의 조합이 효과적임을 보여주는 데이터의 일련의 도해적 표시이다. (a) 양측 B16-F10 쥐 흑색종 이식 모델에서 PBS, 또는 MVA-hFlt3L, 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 주사 후 여러날에 걸친 주사된 및 대측성 비-주사된 종양의 부피. (c) PBS (n=5), 또는 MVA-hFlt3L(n=9; ***, p < 0.001)로 처리된 B16-F10 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선. 또한, 도 17 (a-c)는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사와 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체의 전신성 전달의 조합이 B16-F10 양측 이식 모델에서 전체적 반응 및 치유 속도를 증가시킴을 보여준다. (b) 양측 B16-F10 쥐 흑색종 이식 모델에서 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체의 복강내 전달의 존재하에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사 후 여러날에 걸친 주사된 및 대측성 비-주사된 종양의 부피. (c) PBS(n=5), MVA-hFlt3L(n=8), MVAΔE3L-hFlt3L + 이소타입 대조군(n=9), MVAΔE3L-hFlt3L + 항-CTLA4 항체(n=9), MVAΔE3L-hFlt3L + 항-PD1 항체(n=9), 또는 MVAΔE3L-hFlt3L + 항-PD-L1 항체(n=8; ***, p < 0.001)로 처리된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선. (d) 미자극 마우스(n=5) 및 치사량의 MC38 결장 선암종 세포(1 x 105)로 피부내로 재투여시험된, MVAΔE3L-hFlt3L + 항-CTLA4 항체(n=2), MVAΔE3L-hFlt3L + 항-PD1 항체(n=3), 또는 MVAΔE3L-hFlt3L + 항-PD-L1 항체(n=4)로 처리된 생존 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선.
도 18은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 자가 및 이종성 종양에 대한 항종양 CD8+ T 세포 면역의 생성을 유도하며, 이것은 항-CTLA-4 항체의 존재하에서 향상됨을 보여주는 데이터의 일련의 도해적 표시이다. (a)는 세 벌의 엘리스팟(ELISPOT)의 스캔된 이미지이다. 미자극 마우스의 3 비장으로부터 단리된 모집된 CD8+ T 세포가 음성 대조군(미자극)으로 이용되었다. 항-CTLA-4없이(-Ab) MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 마우스의 3 비장으로부터 단리된 모집된 CD8+ T 세포는 조사된(irradiated) B16-F10 및 MC38 둘 모두에 대해 반응성을 나타냈다. 항-CTLA-4를 가지고(+αCT) MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 마우스의 3 비장으로부터 단리된 모집된 CD8+ T 세포는 바이러스-처리된 마우스로부터의 것들보다 조사된 B16-F10 및 MC38 둘 모두에 대해 더 강한 반응성을 나타냈다. (b)는 (a)에 개시된 조건하에서 조사된 B16-F10 또는 MC38에 대한 양성 스팟의 그래프이다(**, p < 0.01; ****, p < 0.0001).
도 19는 열-불활성화 MVA의 종양내 주사가 양측 B16-F10 종양 이식 모델에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN 및 염증성 사이토카인 및 케모카인 유전자 발현을 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 유도함을 보여주는 데이터의 일련의 도해적 표시이다. 여기서는 PBS, MVA 또는 열-MVA로 처리된 주사된 및 비-주사된 B16-F10 종양 둘 모두에서 Ifnb, Il6, Ccl4, Ccl5, Cxcl9, 및 Cxcl10 유전자 발현의 정량적 실시간 PCR 분석의 그래프가 나타난다.
도 20은 열-불활성화 MVA의 종양내 주사가 종양 배수 림프절(TDLN)에서 항-흑색종 CD8+ T 세포 반응을 유도함을 보여주는 일련의 도해적 표시이다. (a)는 PBS 또는 열-불활성화 MVA로 처리된 B16-F10 흑색종 모델에서 종양 배수 림프절에서 TRP-2 사량체 양성 CD8+ T 세포의 대표적 유세포분석 플롯의 시리즈이다. (b)는 PBS 또는 열-MVA로 처리된 B16-F10 흑색종을 가진 WT 및 Batf3-/- 마우스에서 TRP-2 사량체 양성 CD8+ T 세포의 비율의 그래프이다. 각 샘플은 동일한 조건으로 처리된 2-3 마우스로부터 모집된 림프절로부터 얻었다.(*, p < 0.05).
도 21은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 일측 종양 이식 모델에서 대형의 확립된 B16-OVA 흑색종의 치료에서 효과적임을 보여주는 일련의 도해적 표시이다. (a)는 대형의 확립된 B16-OVA 모델을 가진 일측 종양 이식 모델의 도식 다이아그램이다. B16-OVA 흑색종 세포(5 x 105 세포)가 C57B/6 마우스의 우측 옆구리에 피부내로 이식되었다. 종양 이식 후 8-9일에, 마우스에게 2 x 107pfu의 MVAΔE3L-hFlt3L, 열-MVA, 폴리(I:C), 또는 PBS 모의 대조군이 매주 2회 종양내로 주사되었다. 종양 크기가 측정되었으며 마우스의 생존이 모니터되었다. (b) PBS, MVAΔE3L-hFlt3L, 열-MVA, 또는 폴리(I:C)의 주사 후 여러날에 걸친 주사된 종양의 부피. (c)는 바이러스 또는 폴리(I:C)의 첫번째 주사일에 각 초기 종양 부피의 그래프이다(n= 10). (d)는 PBS, MVAΔE3L-hFlt3L, 열-MVA, 또는 폴리(I:C)로 종양내로 처리된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다(n=10; ****, p < 0.0001).
도 22는 대형의 확립된 흑색종 일측 이식 모델에서 열-불활성화 MVA의 종양내 주사와 면역 관문 항체의 전신성 전달의 조합이 항종양 효능을 개선함을 보여주는 일련의 도해적 표시이다. (a)는 대형의 확립된 B16-F10 모델을 가진 일측 종양 이식 모델의 도식적 다이아그램이다. B16-F10 흑색종 세포(5 x 105 세포)가 C57B/6 마우스의 우측 옆구리에 피부내로 이식되었다. 종양 이식 후 8-9일에, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체의 복강내 전달의 존재 또는 부재하에서 매주 2회 2 x 107 pfu의 열-MVA가 마우스에 종양내로 주사되었다. 종양 크기가 측정되었고 마우스의 생존이 모니터되었다. (b) 이소타입 대조군, 또는 항-CTLA-4, 또는 항-PD-1, 또는 항-PD-L1의 존재하에서 PBS 또는 열-MVA의 주사 후 여러날에 걸친 주사된 종양의 부피. (c)는 첫번째 처리 전의 각 초기 종양 부피의 그래프이다.(n=10). (d)는 이소타입 대조군, 또는 항-CTLA-4, 또는 항-PD-1, 또는 항-PD-L1의 존재하에서 PBS 또는 열-MVA로 처리된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다(n=10; *, p < 0.05, **, p < 0.01, ****, p < 0.0001).
정의:
본 명세서에서 사용될 때, 하기 용어는 문맥이 명확하게 달리 나타내지 않으면 하기에서 그들에 속하는 의미를 갖는다:
"암"은 제어되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 인간 및 동물의 질병 부류를 말한다. 달리 명시적으로 나타내지 않으면, 용어 "암"은 본 명세서에서 용어 "종양", "악성 종양", "과증식" 및 "신생물(들)"과 상호교환되어 사용될 수 있으며; 용어 "암 세포(들)"는 용어 "종양 세포(들)", "악성 세포(들)", "과증식 세포(들)" 및 "신생물 세포(들)"와 상호교환가능하다.
"흑색종"은 멜라닌을 생산할 수 있는 세포로부터 기원하는 악성 신생물을 말한다. 용어 흑색종은 "악성 흑색종"과 동의어이다. 흑색종은 환자의 림프절, 피부, 간, 폐 및 뇌 조직을 관련시키면서 널리 전이된다.
"고형 종양"은 림프종, 백혈병 및 다발성 골수종과 같은 혈액암을 제외하고, 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암 및 암성 세포 및 조직을 말한다. 고형 종양의 예는 연조직 육종, 예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종, 림프관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 윤활막종, 중피종, 유잉 종양(Ewing's 종양) 및 기타 골 종양(예를 들어, 골 육종, 악성 섬유성 조직구증), 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종, 기저 세포 암종, 선암, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두모양 암종, 유두모양 샘암종, 낭샘암종, 속질암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암종, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 배아 암종(embryonal carcinoma), 윌름 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 뇌/CNS 종양(예를 들어, 성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 아동 종양, 예를 들어, 비전형 기형/간상소체 종양, 생식세포종, 배아 종양, 상의세포종), 수모세포종, 머리인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경집종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 및 망막아종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물과 방법이 유용할 가장 일반적인 고형 종양 중 일부는 두경부암, 직장 선암, 신경교종, 수모세포종, 요로상피세포암종, 췌장 선암, 자궁(예를 들어, 자궁내막암, 자궁관 암), 난소암, 자궁경부암, 전립선 선암, 비-소세포 폐암(편평 및 선암종), 소세포폐암, 흑색종, 유방 암종, 유관상피내암(ductal carcinoma in situ), 신장 세포 암종 및 간세포 암종, 부신 종양(예를 들어, 부신피질 암종), 식도, 눈(예를 들어, 흑색종, 망막모세포종), 담낭, 위장, 윌름 종양, 심장, 두경부, 후두 및 하인두, 구강(예를 들어, 입술, 입, 침샘), 비인두, 신경모세포종, 복막, 뇌하수체, 카포시 육종, 소장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 부갑상선, 질 종양 및 전술한 것 중 어느 것의 전이물을 포함한다.
"전이"는 암이 그 원발 부위로부터 신체내 이웃 조직 또는 먼 위치로 확산하는 것을 말한다. 암 세포(암 줄기 세포 포함)는 원발 종양으로부터 나와서, 림프 및 혈액 관내로 침투하고, 혈류를 통해 순환하고, 신체내 그 밖의 곳의 정상 조직에서 자랄 수 있다. 전이는 원발 종양으로부터 나와서, 혈류 또는 림프관을 통해 이동하고, 먼 부위에서 멈추는 종양 세포(또는 암 줄기 세포)를 조건으로 하는, 순차적 과정이다. 일단 다른 부위에 가면, 암 세포는 혈관 또는 림프관 벽을 통해 재침투하고, 계속 증식하고, 결국에는 새로운 종양(전이성 종양)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 이 새로운 종양은 전이성(또는 이차) 종양으로 불린다.
"면역 반응"은 림프구, 항원 제시 세포, 포식 세포, 과립구 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체를 포함함) 중 하나 이상의 작용을 말하며 이 작용은 암 세포, 전이성 종양 세포 등에 대한 선택적 손상, 이들 세포의 파괴, 또는 인간 신체로부터 이들 세포의 제거를 야기한다. 면역 반응은 세포 반응, 예를 들어, 세포의, 즉 T 세포 기능의 변화(조절, 예를 들어, 유의한 향상, 자극, 활성화, 손상 또는 억제)인 T 세포 반응을 포함할 수 있다. T 세포 반응은 특정 유형의 T 세포, 또는 T 세포의 서브세트, 예를 들어, 이펙터 CD4+, CD4+ 헬퍼, 이펙터 CD8+, CD8+ 세포독성, 또는 천연 킬러(NK) 세포의 생성, 증식 또는 확장 또는 자극을 포함할 수 있다. 그러한 T 세포 서브세트는 하나 이상의 세포 수용체 또는 세포 표면 분자(예를 들어, CD 또는 분화 분자의 집단)을 검출함으로써 확인될 수 있다. T 세포 반응은 또한 다른 세포의 분화 또는 증식에 영향을 주는 가용성 매개자(예를 들어, 사이토카인, 림포카인, 사이토카인 결합 단백질 또는 인터루킨)와 같은 세포 인자의 변화된 발현(통계적으로 유의한 증가 또는 감소)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 타입 I 인터페론(IFN-α/β)은 선천적 면역의 중요한 조절자이다(52)(Huber et al. Immunology 132(4):466-474 (2011)). 동물 및 인간 연구는 항원 인식 및 항-종양 면역 반응의 초기 단계 동안 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두의 운명에 직접적으로 영향을 주는 데 있어서 IFN-α/β의 역할을 보여주었다. IFN 타입 I은 수지상 세포의 활성화 및 이어서 선천적 면역계의 감시병에 반응하여 유도된다. 면역 반응은 또한 체액(항체) 반응을 포함할 수 있다.
"종양 면역"은 종양이 면역계에 의한 인식과 소거를 회피하는 하나 이상의 과정을 말한다. 따라서, 치료적 개념으로서, 종양 면역은 그러한 회피가 약화되거나 제거되고 종양이 면역계에 의해 인식되고 공격될 때 "치료"된다(후자는 본 명세서에서 "항-종양 면역"으로 불림). 종양 인식의 예는 종양 결합이며, 종양 공격의 예는 종양 감소(수, 크기 또는 둘 모두에서) 및 종양 소거이다.
"T 세포"는 다양한 세포-매개 획득 면역 반응에 참여하는 흉선 유래 림프구를 말한다.
"헬퍼 T 세포"는 CD4+ T 세포를 말하며; 헬퍼 T 세포는 MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원을 인식한다. Th1과 Th2의 적어도 2가지 유형의 헬퍼 T 세포가 있으며, 이들은 상이한 사이토카인을 생산한다.
"세포독성 T 세포"는 보통 그 표면 상에 CD8 분자 마커를 보유하며(CD8+) 그 표면 상에 특정 항원성 분자를 가진 타겟 세포를 파괴함으로써 세포-매개 면역에서 기능하는 T 세포를 말한다. 세포독성 T 세포는 또한 펄포린-형성된 기공을 통해 타겟 세포로 들어가고 어팝토시스(세포 사멸)를 유도할 수 있는 세린 프로테아제인 그랜자임을 방출한다. 그랜자임은 세포독성 표현형의 마커로서 작용한다. 세포독성 T 세포를 위한 다른 명칭은 CTL, 세포용해 T 세포, 세포용해 T 림프구, 킬러 T 세포 또는 킬러 T 림프구를 포함한다. 세포독성 T 세포의 타겟은 바이러스-감염된 세포, 세균 또는 원생 기생충으로 감염된 세포, 또는 암 세포를 포함할 수 있다. 대부분의 세포독성 T 세포는 그들의 세포 표면상에 존재하는 단백질 CD8을 가진다. CD8은 클래스 I MHC 분자의 일부분에 이끌린다. 전형적으로, 세포독성 T 세포는 CD8+ 세포이다.
"종양-침윤성 백혈구"는 순환계(혈액 또는 림프액)내에 있거나 또는 다르게는 순환계를 떠났으며 종양 내로 이동한, 암(예를 들어, 흑색종)에 걸린 대상의 백혈구를 말한다.
"면역 관문 억제제" 또는 "면역 관문 차단제" 또는 "면역 관문 차단 억제제"는 하나 이상의 관문 단백질의 활성을 완전히 또는 부분적으로 감소, 억제, 방해 또는 조절하는 분자를 말한다. 관문 단백질은 T-세포 활성화 또는 기능을 조절한다. 관문 단백질은 CD28 수용체 패밀리 구성원인, CTLA-4 및 그의 리간드 CD80 및 CD86; PD-1 및 그의 리간드 PDL1 및 PDL2; LAG3, B7-H3, B7-H4, TIM3, ICOS, II DLBCL, BTLA 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(53). 본 명세서에서 사용하기 위해 고려되는 비제한적인 예는 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙(pidilizumab), AMP-224, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB 00107180, 또는 임의의 그 조합을 포함한다.
치료 물질 또는 조성물의 투여 맥락에서 사용될 경우 "비경구"는 소화관을 통한 투여 외의 다른 임의의 투여 경로를 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법을 위해 특히 관련되는 것은 정맥내(예를 들어, 간 전달을 위해 간문맥을 통한 것을 포함), 종양내 또는 척추강내 투여이다.
"항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자 또는 그러한 분자의 항원-결합 단편을 말한다. 따라서, 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 본래의 면역글로불린일 수 있으며 본래의 면역글로불린의 면역반응성(항원-결합) 단편 또는 일부일 수 있다. 항체는 예를 들어, 다클론 항체, 단클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단일쇄 항체(scFv) 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 재조합 항체 및 이중- 및 삼중-특이적 항체를 비롯한 다양한 형태로 존재할 수 있다.
"종양용해 바이러스"는 암세포를 우선적으로 감염시키며, 그러한 세포에서 복제하고, 그 복제 과정을 통해 암세포의 용해를 유도하는 바이러스를 말한다. 자연 발생 종양용해 바이러스의 비제한적인 예는 수포성 구내염 바이러스, 레오바이러스, 및 아데노바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus) 및 단순 포진 바이러스와 같은 종양선택적이도록 조작된 바이러스를 포함한다(예를 들어, Nemunaitis, J. Invest New Drugs. 17(4):375-86 (1999); Kirn, DH et al. Nat Rev Cancer. 9(1):64-71(2009); Kirn et al. Nat. Med. 7:781 (2001); Coffey et al. Science 282:1332 (1998) 참고)(8, 54-56). 백시니아 바이러스는 많은 타입의 세포를 감염시키지만, 종양 세포가 복제에 유리한 대사를 가지며, 역시 복제에 유리한 일부 경로의 활성화를 나타내며 그리고 역시 바이러스 복제에 유리한, 선천적 면역계를 회피하는 환경을 생성하는 사실로 인하여, 종양 세포에서 우선적으로 복제한다. 본 발명의 맥락에서, MVA 및 MVAΔE3L은 그들이 주로 종양 세포 내에서 복제하고 어팝토시스를 야기함으로써 항종양 효과를 생산하지 않으므로 종양용해 바이러스의 정의에 부합되지 않는다. (그들은 이들 바이러스가 종양 항원을 발현하지 않으므로 백신의 전통적 정의에도 부합하지 않는다. 하지만, 그들은 종양에 대한 숙주의 면역 반응을 촉진하고 향상시키기 위해 작용하므로, 아쥬반트와 유사하게, 면역자극 분자로서 작용한다고 말할 수 있다.)
"MVA"는 "변형 백시니아 안카라"를 의미하며, 안카라 균주로부터 유도되고 백신 및 백신 아쥬반트로서 사용하기 위해 개발된, 매우 약독화된 백시니아 균주를 말한다. 원래의 MVA는 닭 배아 세포를 통한 연속 계대에 의해 야생형 안카라 균주로부터 단리되었으며, 그렇게 처리되어, 영장류(인간 포함) 세포에서 효율적으로 복제하는 그 능력을 비롯하여 야생형 백시니아의 게놈의 약 15%를 상실하였다. (57)(Mayr et al., Zentralbl Bakteriol B 167, 375-390 (1978) The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behavior in organisms with a debilitated defense mechanism.) MVA는 유전자를 위한 재조합 벡터 또는 감염성 질병 또는 종양에 대한 예방접종 전달로서의 개발을 위한 적절한 후보로 간주된다. (58)(Verheust et al.,Vaccine30(16), 2623-2632 (2012)). MVA는 길이가 178 kb인 게놈을 가지며 서열은 (59)(Antoine et al.,Virol. 244(2): 365-396 (1998))에서 처음 개시되었다. 서열은 또한 Genbank U94848.1에서 개시된다. 임상 등급 MVA는 덴마크 크비스트가드(Kvistgaard) 소재의 바바리안 노르딕 에이/에스(Bavarian Nordic A/S)로부터 상업적으로 구매가능하다. 부가적으로, MVA는 메릴랜드주 록빌 소재의 ATCC로부터 그리고 프랑스 파리 소재의 CMCN(국립 파스퇴르 미생물 보존 센터(Institut Pasteur Collection Nationale des Microorganismes))로부터 입수가능하다.
"MVAΔE3L"은 기능성 E3L 유전자가 결핍되고 감염성이지만 복제불가능한 MVA의 결실 돌연변이체를 의미하며 숙주의 면역계를 피하는 능력이 추가로 손상된다. 이것은 종양 또는 바이러스 항원을 전달하기 위한 백신 벡터로서(다른 사람들에 의해) 사용되었다. 이 돌연변이체 MVAE3L 넉아웃 및 그의 제조는 예를 들어, 미국 특허 7,049,145호에 개시되었다.
"대상"은 암에 걸릴 수 있으며 암에 걸리면 치료를 필요로 하는 임의의 동물(포유동물, 인간 또는 기타) 환자를 의미한다.
본 명세서에서 사용될 때 "약학적 허용 부형제"는 동물 또는 인간에게 투여될 때 해로운, 알러지성의 또는 다른 원치않는 반응을 생산하지 않는 물질 및 조성물을 말한다. 본 명세서에서 사용될 때, 이 용어는 이들이 부적절한 부정적 방식으로 본 발명의 치료 물질과 반응하지 않는 한 모든 불활성, 비독성, 액체 또는 고체 충전제 또는 희석제, 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연 작용제, 방부제 등, 예를 들어, 액체 약학적 담체, 예를 들어, 멸균수, 염수, 당 용액, Tris 버퍼, 에탄올 및/또는 일부 오일을 포함한다.
"치료적 유효량" 또는 "유효량"은 하나 이상의 투여량으로 그리고 질병의 경감, 치유 또는 완화에서 원하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 기간동안 투여될 때 작용제의 충분한 양을 말한다. 본 발명에서, MVA 또는 MVAΔE3L 각각의 유효량은 (적절한 기간 동안 그리고 적절한 빈도로 투여될 때) 암세포의 수를 감소시키거나; 종양 크기를 감소시키거나 또는 종양을 박멸시키거나; 말초 기관내로의 암세포 침윤을 억제(즉, 지연 또는 중단)하거나; 전이성 성장을 억제(즉, 지연 또는 중단)하거나; 종양 성장을 억제(즉, 안정화 또는 중지)하거나; 종양의 치료를 허용하고, 및/또는 종양에 대한 면역 반응을 유도하고 촉진하는 양이다. 임의의 개별 케이스에서 적절한 치료양은 본 발명에 비추어 일상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 그러한 결정은 인 비트로에서 효과적인 것으로 밝혀진 양 및 동물에서 효과적인 것으로 밝혀진 양으로 시작할 것이다. 치료적 유효량은 처음에는 배양되는 세포에 효과를 제공하는 것으로 밝혀진 농도 또는 농도들에 기초하여 결정될 것이다. 유효량은 세포 배양 내에서의 데이터로부터 추정될 수 있으며 본 명세서에 설명된 것과 같은 인자에 기초하여 상향 또는 하향 조정될 수 있다. 바이러스 구조체의 유효량은 더 낮거나 높은 적용량이 투여될 수 있지만, 일반적으로 약 105 내지 약 1010 플라크 형성 단위(pfu) 범위내이다. 바람직한 실시형태에서, 투여량은 약 106-109 pfu이다. 일반적으로, 단위 투여량은 1 내지 10 ml 범위내의 부피로 투여된다. 바이러스 입자에 대한 pfu의 등가량(equivalence)은 사용되는 구체적인 pfu 적정법에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, pfu는 약 5 내지 100 바이러스 입자와 동일하다. hFlt3L 트랜스유전자 보유 바이러스의 치료적 유효량은 처방된 기간동안 그리고 처방된 투여 빈도로 하나 이상의 분할된 적용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 hFlt3L 보유 바이러스의 치료적 유효량은 대상의 질병 상태, 연령, 성별, 체중 및 일반적 상태, 및 바이러스 구조체가 구체적 대상에서 구체적 암에 대해 원하는 면역 반응을 이끌어내는 능력과 같은 인자들에 따라 변할 수 있다.
특히 본 명세서에 개시된 바이러스계 면역자극 작용제와 관련하여, "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 종양 세포 성장을 감소, 억제 또는 저지하여 종양을 감소 또는 박멸하기에 충분한, 또는 인 비트로에서, 엑스 비보에서 또는 대상에서 전이성 확산을 억제, 감소 또는 저지하거나 또는 경우에 따라 결과적으로 전이성 확산 감소, 억제 및/또는 저지 중 하나 이상을 야기할 종양에 대한 면역 반응을 이끌어내고 촉진하기에 충분한, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L을 포함하는 조성물의 양을 말한다. 종양 세포 성장의 감소, 억제 또는 박멸은 괴사, 어팝토시스 또는 면역 반응 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합의 결과일 수 있다(하지만, 예를 들어, 어팝토시스의 촉진은 종양용해 바이러스에서 관찰된 동일한 인자로 인한 것이 아닐 수 있다). 치료적으로 효과적인 양은 조성물에서 사용되는 구체적인 바이러스, 치료되는 대상의 연령과 병태, 종양 형성의 정도, 다른 치료 양식의 존재 또는 부재 등과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 유사하게, 투여될 조성물의 투여량 및 그의 투여 빈도는 활성 성분의 효능, 일단 투여된 후 그 활성의 지속기간, 투여 경로, 대상의 크기, 연령, 성별 및 건강 상태, 부작용의 위험과 의료 실무자의 판단과 같은 다양한 인자에 의존할 것이다. 조성물은 주사용 용액과 같은 다양한 투약 형태로 투여된다.
특히 면역 관문 억제제와의 조합 치료법과 관련하여, 면역 관문 차단제를 위한 "치료적 유효량"은 종양 미세환경에서 면역 억제를 역전하거나 감소시키고 치료되는 대상에서 숙주 면역을 활성화 또는 향상시키기에 충분한 면역 관문 차단제의 양을 의미한다. CTLA-4(세포독성 T 림프구 항원 4)와 같은 CD28 억제제에 대한 억제성 항체(예를 들어, 이필리무맙), 항-PD-1(프로그램된 사멸 1) 억제성 항체(예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 람브로리주맙), 및 항-PD-L1(프로그램된 사멸 리간드 1) 억제성 항체(MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB 00107180), 및 LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIM3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신-3), B7-H3, 및 TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 가진 T-세포 면역수용체)에 대한 억제성 항체를 비롯한, 승인되거나, 임상 시험중이거나 여전히 개발중인 여러가지 면역 관문 차단제가 있다. 전술한 것들의 투여량 범위는 당업계에서 알려지거나, 여러가지 투약 임상 시험이 완료되어 다른 작용제에의 추정이 가능하므로 당업계의 기술 범위 내이다.
바람직하게는, 종양은 특정 관문을 발현하지만, 본 발명의 맥락에서, 면역 관문 차단제가 종양 세포, 기질 세포 및 종양 침윤성 면역 세포에 의해 유발되는, 종양 내에서의 면역 억제 기전을 보다 일반적으로 차단하므로 이것은 엄격하게 필요하지는 않다.
예를 들어, 흑색종에서 수술 후 보조(adjuvant) 치료법으로서 투여될 경우, CTLA4 억제제 이필리무맙은 총 4 적용량을 위해 3주마다 3 mg/kg의 총 주입량을 위해 90분에 걸쳐 1-2 mg/mL로 투여된다. 이 치료법은 종종 심각한 심지어 생명을 위협하는 면역-매개 부작용이 수반되어, 내약 용량 및 투여될 수 있는 축적 양을 제한한다. 이필리무맙이 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L과 공동으로 투여될 경우 이필리무맙의 적용량 및/또는 축적양을 감소시키는 것이 가능할 것으로 예상된다. 구체적으로, 하기에 개시된 실험 결과에 비추어, 만일 CTLA4 억제제가 전술한 MVA 바이러스 중 하나 또는 둘 모두와 공동으로 종양에 직접적으로 투여된다면 CTLA4 억제제의 적용량을 감소시키는 것이 추가로 가능할 것으로 예상된다. 따라서, 이필리무맙을 위해 상기에서 제공된 양은 공동 투여에서 환자에게 주어질 구체적 투여량 및 축적양을 결정하기 위한 시작점일 것이며 최적의 양을 결정하기 위해서는 투약 연구가 요구될 것이다.
펨브롤리주맙은 25 mg/mL로 희석되어 흑색종에서의 보조 치료법으로서의 투여를 위해 처방된다. 이것은 3주마다 30분에 걸쳐 2 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 다시, 이것은 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L과의 공동 투여에서의 투여량 및 투여를 결정하기 위한 시작점일 것이다.
니볼루맙은 2주마다 60분에 걸친 정맥내 주입으로서 3 mg/kg으로 투여를 위해 처방되어, 본 명세서에 개시된 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L와 공동의, 또는 일반적으로 MVA 및 MVAΔE3L의 바이러스 및 바이러스 구조체와 동일한 범위 내의 양의 열-MVA(불활성화가 열-유도되거나 UV 조사-유도될 수 있는 불활성화 MVA)와 공동의 니볼루맙 및 다른 관문 억제제의 투여량 및 투약 계획을 결정하는데 있어서 유사한 출발점을 제공한다.
아고니스트 항체와 같은 면역 자극제가 또한 암을 위한 면역요법으로서 조사되었다. 예를 들어, 항-ICOS 항체는 ICOS의 세포외 도메인에 결합하여 ICOS 시그널링의 활성화 및 T 세포 활성화를 유도한다. 항-OX40 항체는 OX40에 결합할 수 있으며 T 세포 수용체 시그널링을 강화하여 T 세포 활성화, 증식 및 생존을 유도한다. 다른 예는 4-1BB(CD137), GITR에 대한 아고니스트 항체를 포함한다. 모든 이들 작용제는 임상 시험의 다양한 단계에 있다.
면역 자극 아고니스트 항체는 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L(또는 불활성화 MVA)의 종양내 주사와 조합되어 전신적으로 이용될 수 있다. 대안적으로, 면역 자극 아고니스트 항체는 동시에 또는 순차적으로 종양내 전달을 통해 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L과 공동으로 사용될 수 있다.
"약학적 허용 담체 및/또는 희석제" 또는 "약학적 허용 부형제"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등을 제한없이 포함한다. 생물학적 활성 물질을 위한 그러한 매질과 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 부형제의 추가의 상세사항은 하기에 제공된다. 항균제, 예를 들어, 항진균제와 같은 보충적 활성 성분이 또한 조성물내에 포함될 수 있다.
"전달"은 이것이 종양에의 국소 투여에 의해서이건(종양내) 또는 예를 들어 정맥내 경로에 의해서이건 간에, 본 발명의 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L(또는 특히 대형의 확립된 종양을 위한, 면역 관문 차단 억제제와의 공동 투여에서 열-MVA)를 종양 미세환경에 두는 것에 관련하여 사용된다. 이 용어는 종양 자체에 도달하는 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L에 초점을 맞춘다.
본 명세서에서 "공동 투여"는 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L과 조합된 제2 치료 양식의 투여, 예를 들어, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L과 시간적으로 매우 인접하여 투여되는 면역 관문 차단제의 투여를 말한다. 예를 들어, PD-1/PDL-1 억제제 및/또는 CTLA4 억제제(보다 구체적 실시형태에서는, 항체)는 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L과 동시에(MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L이 상술한 대로 종양내로 또는 전신성으로 투여될 때 정맥내 또는 종양내 주사에 의해) 또는 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 투여 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. 만일 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 투여 및 면역 관문 차단제가 1-7일 간격으로 또는 심지어 최대 3주 간격으로 투여되면, 이것도 여전히 본 명세서에서 개시된 "시간적으로 매우 인접한" 것이 될 것이며, 따라서 그러한 투여는 "공동"을 충족할 것이다.
"벡터"는 적절한 제어 요소와 연합될 때 복제할 수 있으며 세포 간에 유전자 서열을 전달할 수 있는, 플라스미드, 파아지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등과 같은 임의의 유전 요소를 말한다. 따라서, 이 용어는 바이러스 벡터뿐만 아니라, 클로닝 및 발현 비히클을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유용한 벡터는 전사될 핵산 분절이 프로모터의 전사 제어하에 위치되는 벡터일 것으로 고려된다. "프로모터"는 유전자의 특이적 전사를 시작하기 위해 요구되는, 세포의 합성 기계 또는 도입된 합성 기계에 의해 인식되는 DNA 서열을 말한다. 어구 "작동가능하게 위치된", "작동가능하게 연결된", "제어하" 또는 "전사 제어하"는 프로모터가 RNA 폴리머라제 개시 및 유전자의 발현을 제어하기 위하여 핵산과 관련하여 정확한 위치와 배향에 있음을 의미한다. 용어 "발현 벡터 또는 구조체"는 서열을 인코딩하는 핵산의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는, 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전적 구조체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 발현은 예를 들어, 생물학적-활성 폴리펩티드 생성물 또는 억제성 RNA(예를 들어, shRNA, miRNA)를 전사된 유전자로부터 생성하기 위한, 핵산의 전사를 포함한다.
본 발명에서, 발명자들은 CD103+/CD8α 수지상 세포(DC)를 비롯한 면역 세포의 동원, 분화 및 기능을 촉진하기 위하여 종양 미세환경에 Flt3L을 전달할 목적으로, 인간 Flt3L을 발현하는 재조합 MVA 및 MVAΔE3L 바이러스를 생성하였다. 하기에 개시된 구체적 실험에서는 TK 유전자를 분할하고 그것을 없애면서 트랜스유전자가 TK 유전자좌내로 삽입되었지만, 비복제성 바이러스의 경우에는 이것은 반드시 필요하지는 않으며 다른 적합한 유전자좌가 선택될 수 있으며 이것은 당업계의 기술범위내이다. 따라서, 라벨 TK-는 생략되었다.
젠네렉스(Jennerex)는 이전에 JX-594를 개발하였으며, 여기서는 종양 선택성을 증가시키기 위하여 백시니아 TK 유전자가 결실되고 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 인코딩하는 트랜스유전자를 발현하도록 백시니아 바이러스가 조작된다. GM-CSF는 말초 비-림프 조직에서의 DC 항상성을 위해 중요한 또 다른 성장 인자이다(King et al., 2010; Greter et al., 2012). 치사량으로 조사된, GM-CSF를 분비하는 동종이계 흑색종 세포를 포함하는 흑색종 백신(GVAX)은 일부 임상적 효과를 나타냈다(Dranoff et al., 2003). 예를 들어, 쿠란(Curran)과 알리슨(Allison)은 만일 백신이 종양으로부터 먼 부위에서 투여되면 흑색종세포주계 백신 B16-GMCSF(GVAX) 또는 백신 B16-Flt3L(Fl3VAX)과 CTLA-4 차단제의 조합이 마우스의 약 60%에서 확립된 흑색종을 박멸시킴을 보여주었다(Curran and Allison, 2009). 하지만, 백신이 CTLA-4 차단제와 조합되어 종양에 투여된 경우, GVAX는 인간에서 종양 박멸에서 효과적이지 않았던 반면, Fl3VAX 처리는 75%의 무종양 마우스를 야기하였다(인간 데이터 없음). 한 가지 가능한 설명은 종양에의 GM-CSF 투여가 종양 내에서 골수 억제자 세포 생성을 유도할 수 있다는 것이다(Serafini et al., 2004). 종양에의 GM-CSF의 투여가 면역 관용을 유도할 수도 있다는 걱정으로, 본 발명의 발명자들은 양측 B10-F10 흑색종 모델을 이용하여 확립된 B16 흑색종의 박멸에 대하여, 세 가지 재조합 바이러스 MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, 및 MVAΔE3L-hFlt3L의 직접적인 비교를 수행하였다(실시예 2, 도 3a 및 3b). 발명자들은 종양 성장의 박멸 또는 지연에서 MVAΔE3L-mGM-CSF 또는 MVAΔE3L보다 MVAΔE3L-hFlt3L이 더 효과적임을 발견하였다. 실시예 2에 개시된 대로, 발명자들은 대측성 종양의 성장을 지연시키고 생존을 연장하는데 있어서 MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-mGM-CSF보다 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 전달이 더 효과적임을 보여주었다. MVAΔE3L-hFlt3L의 이러한 전신적 효과는 비주사된 종양의 치료를 위해서뿐만 아니라 전이성 질병의 치료를 위해서도 중요하다.
본 발명의 발명자들은 또한 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 재투여시험시에 상이한 종양 유형에 대한 전신성 면역을 유도함을 보여주었다(실시예 3). 처음으로 흑색종에 걸린 생존 동물을 이용하여(실시예 2), 발명자들은 상이한 종양 유형(결장암 세포, 실시예 3)으로 동물을 재투여시험하였다. 결장암 세포 또는 바이러스에 노출된적이 없는 동물은 종양에 걸리고 사망한 반면, 이전에 MVAΔE3L-hFlt3L로 처리된 동물은 주사된 결장암 세포를 거부하였다.
B16-F10 흑색종에서 MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 열-MVA의 종양내 주사의 효과가 평가되었으며, 면역 억제성 조절 T 세포의 감소 뿐만 아니라, 세포독성 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화와 증식을 비롯한 종양 미세환경에서의 면역학적 변화를 포함하는 것으로 밝혀졌다(실시예 4).
종양-관련 대식세포(TAM)는 신생물 형질전환, 종양 면역 회피 및 후속 전이성 캐스캐이드를 촉진한다. 본 발명에서, 발명자들은 MVAΔE3L-hFlt3L이 TAM을 고갈시키는데 있어서 효과적임을 보여주었다(실시예 5). TAM 감소의 기전을 더 연구하기 위하여, 발명자들은 Batf3-결핍 마우스를 이용하였다. Batf3은 CD103+/CD8α+ 계통 DC의 발달에서 중요한 전사 인자이며, 이들 DC는 바이러스 및 종양 항원의 교차-제시에서 중요한 역할을 한다. 실시예 5에 나타난 대로, Batf3-/- 마우스의 종양에서 TAM의 수는 유의하게 감소되었으며, 이것은 TAM의 생성이 종양내에서의 CD8+ T 세포 침윤에 연결될 수 있음을 제안한다.
부가적으로, 발명자들은 MVAΔE3L-hFlt3L에 대한 반응에서 종양 수지상 세포 집단에서의 변화를 모니터하였다(실시예 6). 실시예 6에 나타난 대로, MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는, CD11b+ DC의 감소뿐만 아니라 CD24+ DC, CD103+ DC의 감소에 의해 명백한 것처럼 수지상 세포 집단에서 극적인 변화를 유도하였다.
Ly6ChiCD11b+ 세포는 손상 또는 감염 부위로 보충되는, C-C 케모카인 수용체(CCR2) 발현 염증성 단핵구이다. 본 발명의 발명자들은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 Ly6ChiCD11b+ 및 Ly6C+CD11b- 세포의 유입을 야기함을 관찰하였다(실시예 7).
흑색종에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 치료 효과를 시험하고 MVAΔE3L-hFlt3L 주사로 인해 발생하는 면역학적 변화를 설명하는 것에 더하여, 발명자들은 다른 종양 유형에서의 MVAΔE3L에 비하여 MVAΔE3L-hFlt3L이 월등한 효능을 나타내는지 여부를 결정하고자 하였다. 실시예 8(도 14a 및 14b)에 나타난 대로, MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 대측성 결장 종양의 성장을 지연시키고 생존을 연장시키는데 있어서 MVAΔE3L보다 더욱 효과적이다. 함께 고려할 때, 흑색종 및 결장암에서 관찰된 결과는 MVAΔE3L-hFlt3L이 다양한 고형 종양의 치료를 위해 사용될 수 있음을 제안한다.
본 발명의 발명자들은 또한 MVA-hFlt3L의 종양내 주사가 흑색종 종양 성장의 박멸 또는 지연에서뿐만 아니라 전신성 항-종양 면역의 생성에서 효과적임을 보여주었다(실시예 9). 따라서, 발명자들은 MVA-hFlt3L 및 MVAΔE3L-hFlt3L 둘 모두에 대해 견줄만한 치료 성능 패턴을 관찰하였다.
부가적으로, 발명자들은 본 발명의 조성물의 종양내 전달 및 방법이 면역 관문 차단제에 대한 저항성을 극복함을 보여주었다. 실시예 10에 나타난 대로, MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 전달과 항-CTLA-4, 항-PD1, 또는 항-PD-L1 항체의 전신성 전달의 조합은 양측 B16-F10 흑색종 이식 모델에서 상승적 항종양 효과를 유도한다. 또한, 발명자들은 면역 관문 억제제(항-CTLA-4, 항-PD1, 또는 항-PD-L1 항체)의 전신성 전달과 함께 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사로 처리된 생존 마우스가 상이한 종양 유형의 재투여시험에 대한 면역을 발달시킴을 입증하였다(실시예 11). 함께 고려할 때, 이들 결과는 MVAΔE3L-hFlt3L이 단독으로 또는 면역 관문 차단제와 조합되어, 고형 종양 환자(결장암 및 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않음)의 치료를 위한 성공적이며 사실상 월등한 옵션을 제공할 수 있음을 처음으로 나타낸다.
본 발명에서, 발명자들은 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 균주가 암 면역요법제로서 사용될 수 있는지 여부를 조사하였다. 사실상, 그들은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 전달이 종양 박멸 및 항종양 면역 생성에서 MVAΔE3L보다 더욱 효과적임을 관찰하였다. 유사하게, MVA-hFlt3L의 종양내 전달은 종양 박멸 및 항종양 면역 생성에서 MVA보다 더 효과적이다. 따라서, 치료 옵션으로서, 환자는 개선된 치료 결과를 이루기 위하여 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 둘 모두로 치료될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 둘 모두의 유효량을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 종양을 가진 대상에서 항종양 면역 반응을 이끌어내고 촉진하기 위한 방법에 관한 것이다. 면역계의 자극은 하기 면역학적 효과 중 하나 이상에 의해 나타날 수 있다.
본 발명자들에 의해 생성된 FACS 데이터는 hFlt3을 보유한 본 재조합 바이러스를 이용한 치료가 불활성화 MVA를 위해 또는 hFLT3L이 없는 MVA 또는 MVAΔE3L을 위해 이전에 보고된 것과 동일한 면역학적 효과를 정량적으로 가짐을 보여준다: CD8+ T 세포의 증가, CD4+ T 세포의 증가, 조절 T 세포의 감소. 이들 결과에 기초하여, 면역 반응 활성화의 기전이 이전 실험에서 나타난 것과 매우 유사할 것으로 예상된다: 타입 I IFN 및 다른 전염증성 사이토카인의 유도, 수지상 세포의 성숙의 유도, 종양-관련 대식세포의 감소.
전술한 하나 이상의 면역학적 효과는 치료에 대한 대상의 반응의 조기 지표로서 작용할 수 있으며 동일한 치료의 계속적인 효과의 모니터로서 작용할 수 있다.
MVA-hFlt3L과 MVAΔE3L-hFlt3L 사이에 나타난 유사성 면에서(실시예 2 및 9), hFlt3L이 결핍된 MVAΔE3L에 비하여 MVAΔE3L-hFlt3L에 대해 관찰된 특성과 효과는 또한 MVA 단독에 비하여 MVA-hFlt3L에 의해 나타내질 것으로 예상된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 유효량을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 종양에 걸린 대상에서 항종양 면역 반응을 이끌어내고 촉진하는 방법에 관한 것이다. 면역계의 자극은 하기 면역학적 효과 중 하나 이상에 의해 나타날 수 있다:
ㆍ 종양 내에서 항종양 세포독성 CD8+(타입 I 인터페론-관련 가능성) 및 이펙터 CD4+ T 세포의 증가;
ㆍ 상기 종양에 침윤하는 수지상 세포의 성숙의 유도(이것 또한 불활성화 MVA 및 트랜스유전자를 보유하지 않은 MVA 및 MVAΔE3L을 이용한 이전 작업에서 관찰된 대로 타입 I IFN의 유도로 인한 것일 가능성이 높음);
ㆍ 대상에서 활성화 항종양 이펙터 T 세포의 유도;
ㆍ 종양내에서 면역 억제 (조절) CD4+ T 세포의 감소;
ㆍ 세포독성 CD8+ T 세포 대 조절 T 세포의 비 및 통상적 T 세포 대 조절 T 세포의 비의 증가;
ㆍ 면역 억제 종양-관련 대식세포(TAM)의 감소
ㆍ CD24+, CD103+ 및 CD11b+의 감소, 및
ㆍ 염증성 Ly6hiCD11b+ 단핵구 및 Ly6hiCD11b- 골수 세포의 종양내로의 유입.
전술한 하나 이상의 면역학적 효과는 치료에 대한 대상의 반응의 조기 지표로서 작용할 수 있으며 동일한 치료의 계속적인 효과의 모니터로서 작용할 수 있다.
이들 효과의 관찰은 본 바이러스가 종양을 치료하는 방식이 종양 항원을 보유한 백신 벡터의 방식(종양내로 전달되지 않으며 근육내, 피하 또는 드물게는 정맥내 경로에 의해 전달됨)과 상이하며 또한 종양용해 바이러스(주로 종양 세포에서의 바이러스 복제로 인해 사이토패씨(cytopathy)를 야기함)의 방식과 상이함을 보여준다. 만일 어팝토시스가 본 치료에 따라 야기된다면, 이것은 이들 상이한 작용 방식으로부터 야기되거나 야기될 수 있는 어팝토시스와 동일한 기전으로 인한 것이 아니다.
일 실시형태에서, 본 발명은 고형 종양으로 진단된 대상을 치료하는 방법을 제공하며 상기 방법은 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 및 그 중 하나 또는 둘 모두를 함유하는 조성물의 치료적 유효량을 종양에 전달하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 암으로 진단된 대상에서 항-종양 면역을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 치료적 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 (비처리 또는 통상적으로 처리된 대상에 비하여) 종양의 크기를 감소시키거나, 종양을 박멸시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양의 전이를 억제하거나 종양의 전이성 성장을 감소시키거나 종양의 전이성 성장을 박멸하거나, 종양 세포의 어팝토시스를 유도하거나 대상의 생존을 연장시킬 수 있는 항-종양 면역의 유도를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L에 종양을 노출시킴으로써, 고형 악성 종양으로 진단된 대상에서, 선천적 면역 반응 및/또는 획득 면역 반응, 예를 들어, T 세포 반응을 포함할 수 있는 항-종양 면역 반응을 향상시키거나, 자극하거나 또는 이끌어내는 방법을 제공한다.
구체적 실시형태에서, 본 발명은 종양 세포에 대해 지향성을 갖는 T-세포 세포독성면에서 그리고 또한 종양 세포에 대해 지향성을 갖는 이펙터 T 세포를 이끌어내는 면에서 획득 면역 반응을 매개하는 면역 반응을 이끌어내는 방법을 제공한다. 상기 방법은 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L을 포함하는 조성물을 종양내로 또는 (본 발명자들이 예상하는 대로) 정맥내로 고형 종양에 걸린 대상에게 투여하는 것을 포함하며 이때 상기 조성물의 투여는 종양에 대한 종양-특이적 면역 반응 및 결과적으로는 종양 성장의 감소, 억제 또는 박멸, 전이성 성장의 억제, 종양 세포의 어팝토시스 및/또는 대상의 생존의 연장을 야기한다. 사실상 본 발명자들은 암 세포가 사멸되며, 전이의 경우에서처럼 면역 반응이 원격 위치로 이동할 수 있음을 보여주었다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 종양 세포에 대해 지향성을 갖는 T-세포 세포독성면에서 그리고 또한 종양 세포에 대해 지향성을 갖는 이펙터 T 세포를 이끌어내는 면에서 획득 면역 반응을 매개하는 면역 반응을 이끌어내는 방법을 제공한다. 상기 방법은 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L을 포함하는 조성물을 비경구로 대상에게 투여하는 것을 포함하며 이때 상기 조성물의 투여는 종양에 대한 종양-특이적 면역 반응 및 결과적으로는 종양 성장의 감소, 억제 또는 박멸, 및/또는 전이성 성장의 억제, 감소 또는 제거, 종양 세포의 어팝토시스 및/또는 종래의 치료 또는 무치료에 비하여 치료된 대상의 생존의 연장을 야기한다. 복강내 전이의 경우, 바이러스는 복강내로 주사될 수 있다.
사실상 본 발명자들은 암 세포가 사멸되며, 전이의 경우에서처럼 면역 반응이 원격 위치로 이동할 수 있으며 여전히 항-종양 효과를 나타냄을 보여주었다.
MVA-hFlt3L 및 MVAΔE3L-hFlt3L은 대부분의 포유동물 세포에서 복제 가능하지 않기 때문에, 이것은 복제 가능 백신 또는 벡터와 동일한 방식으로 면역계에 대한 그 효과를 나타내지 않는다. 따라서, 면역계의 자극이 종양용해를 위한 효능에 대한 장벽으로 생각되는 한편(8)(Kirn et al.,Nat Rev Cancer. (1), 64-71 (2009)), MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L은 또한 세포독성면에서 그리고 더욱 넓게는 종양에 대한 이펙터 T 세포 활성화면에서, 획득 면역을 자극하기 위하여 선천적 면역계를 이용할 수 있다.
본 발명은 따라서 고형 종양으로 진단된 대상에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하기에 효과적인 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 양을 대상의 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 악성 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 고형 악성 종양에 걸린 대상에서 항종양 전신 면역을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상에서 비-주사된 종양의 거부 및 종양 전이의 억제(본 발명자들은 종양 재투여시험에 의해 시험함) 중 하나 또는 둘 모두를 야기하기에 효과적인 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 양을 대상의 종양에 전달하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물을 이용한 치료의 효과를 증가시키기 위하여, 본 발명의 조성물과 방법은 복제 가능 종양용해 바이러스와 조합되어 사용될 수 있다. 종양용해 바이러스의 적합한 예는 백시니아 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 레오바이러스, 아데노바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 및 단순 포진 바이러스를 포함한다. 백시니아 바이러스는 많은 유형의 세포를 감염시키지만, 종양 세포가 복제에 유리한 대사를 가지며, 역시 복제에 유리한 일부 경로의 활성화를 나타내며 그리고 역시 바이러스 복제에 유리한, 선천적 면역계를 회피하는 환경을 생성하는 사실로 인하여, 종양 세포에서 우선적으로 복제한다. 본 발명의 조성물 및 방법과 조합하여 사용될 수 있는 복제 가능 바이러스의 구체적인 예는 트랜스유전자 E3L83N-TK, E3LΔ83N-TK--mGM-CSF, 및 E3LΔ83N-TK--hFlt3L이 있거나 없는 TK 결핍 백시니아계 바이러스를 포함한다.
본 발명자들에 의한 이전 연구에서, MVA는 cGAS/STING에 의해 매개된 세포액 DNA-센싱 경로를 통해 통상적 수지상 세포(cDC)에서 타입 I IFN 유도를 유도하였다. C57B/6 마우스에서 MVA의 정맥내 전달은 야생형 마우스에서 타입 I IFN을 유도하였으나, STING 또는 IRF3이 결핍된 마우스에서는 유도하지 못했다. 그들은 또한 MVAΔE3L이 cDC에서 MVA보다 더 높은 수준의 타입 I IFN 유전자 발현 및 IRF3의 인산화를 유도함을 보여주었다. MVAΔE3L은 cGAS/STING에 의해 매개된 세포액 DNA-센싱 경로 및 MDA5/MAVS에 의해 매개된 dsRNA-센싱 경로 둘 모두에 의해 검출된다. 또한, B16 흑색종 세포 및 MC38 결장 선암종 세포의 MVAΔE3L 감염은 타입 I IFN 및 전염증성 사이토카인 및 케모카인, 및 IRF3의 인산화의 활성화를 유도하였다. MVA 및 MVAΔE3L 둘 모두는 PARP 및 카스파제-3의 절단에 의해 입증되는 바와 같이 B16 및 MC38 세포에서 어팝토시스를 유도한다. 본 발명자들은 직접적인 항암 치료법으로서 이 연구의 MVA 또는 MVAΔE3L 바이러스를 이용하였다. 쥐 B16 흑색종 모델에서 MVA 또는 MVAΔE3L의 종양내 주사는 어팝토시스, 연장된 생존 및 종양 박멸, 및 전신성 항-종양 면역의 생성을 유도한다. 종양내에서 그리고 전신적으로의 둘 모두에서의 세포 면역 반응에서의 활발한 변화를 비롯한, 여기서 개시된 발견을 고려할 때, MVA 및 MVAΔE3L 바이러스에 관한 본 발명자들의 이전 발견과 관련된 기전은 여기서도 작용할 것으로 생각된다.
따라서, 현재의 문헌에 기초하여, 그리고 이론에 구애됨없이, 하기 기전이 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 항-종양 효과에 기여하는 것으로 생각된다: (i) 통상적 수지상 세포 및 대식세포를 비롯한 면역 세포에서 타입 I IFN 반응의 유도; (ii) 암세포에서 타입 I IFN 및 전염증성 사이토카인과 케모카인의 유도; (iii) 암세포에서 어팝토시스의 유도; 및 (iv) 종양 면역 억제 환경의 면역 활성화환경으로의 변화.
본 발명은 각각이 추가로 인간 Flt3L을 발현하도록 변형된, MVA 및 MVAΔE3L을 포함하는 조성물을 더 포함한다. 실시예 1에 나타난 대로, 발명자들은 도 1에 도시된 그리고 TK 유전자의 중앙 부분의 결실에 관련된 전략을 이용하여 인간 Flt3L을 발현하는 재조합 MVA 및 MVAΔE3L을 생성하였다. 따라서, 바이러스와 구조체는 TK-로 표시될 수 있다.
변형 백시니아 안카라(MVA)
변형 백시니아 안카라(MVA) 바이러스는 폭스바이러스과내의 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus) 속의 일원이다. MVA는 백시니아 바이러스의 안카라 균주의 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서의 대략 570 연속 계대에 의해 생성되었다(CVA) (60)(Mayr et al.,Infection 3, 6-14 (1975)). 이들 장기 계대의 결과로서, 생성되는 MVA 바이러스는 방대한 게놈 결실을 함유하며 숙주 세포가 조류 세포로 매우 제한된다(61)(Meyer et al.,J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)). 생성되는 MVA는 상당히 비독성인 것으로 다양한 동물 모델에서 나타났다(57) (Mayr et al.,Dev. Biol. Stand. 41, 225-34 (1978)).
MVA의 안전성과 면역원성은 방대하게 시험되었고, 특히 인간 천연두 질병에 대하여, 임상 시험에서 기록되었다. 이들 연구는 120,000명을 넘는 개인을 포함하였으며 뛰어난 효능과 안전성을 인간에서 입증하였다. 또한, 다른 백시니아계 백신에 비하여, MVA는 약화된 병독성(감염성)을 갖는 한편 우수한 특이적 면역 반응을 촉발한다. 따라서, MVA는 특이적 면역 반응을 유도하는 능력을 가진, 안전한 백신 벡터로서 확립되었다.
전술한 특징으로 인하여, MVA는 재조합 유전자 발현 및 백신을 위해 사용되는, 조작된 MVA 벡터의 개발을 위해 매력적인 후보가 되었다. 백신 벡터로서, MVA는 HIV, 결핵 및 말라리아, 및 암을 비롯한 많은 병리학적 병태에 대해 조사되었다(20, 21)(Sutter et al., Curr Drug Targets Infect Disord 3: 263-271(2003); Gomez et al.,Curr Gene Ther 8: 97-120 (2008)).
인간 단핵구-유래 수지상 세포(DC)의 MVA 감염은 공-자극 분자의 상향조절 및 전염증성 사이토카인의 분비를 특징으로 하는, DC 활성화를 야기하는 것으로 입증되었다(18)(Drillien et al., J Gen Virol 85: 2167-2175 (2004)). 이 점에 있어서, MVA는 DC를 활성화하지 못하는 표준 야생형 백시니아 바이러스(WT-VAC)와 상이하다. 수지상 세포는 두 가지 주요 서브타입으로 분류될 수 있다: 통상적 수지상 세포(cDC) 및 플라스마시토이드(plasmacytoid) 수지상 세포(pDC). 전자, 특히 CD103+/CD8a+ 서브타입은 특히 T 세포에 항원을 교차-제시하기에 적합하며; 후자는 타입 I IFN의 강한 생산자이다.
인간 세포의 바이러스 감염은 타입 I 인터페론, 특히 인터페론-알파(α)에 의해 매개된 선천적 면역 반응(제1차 방어)의 활성화를 야기한다. 이것은 보통은 활성화된 T 세포(CTL 및 헬퍼 둘 모두)의 보충과 증식 및 결국에는 항체 생산과 함께, 면역학적 "캐스캐이드"의 활성화를 유도한다. 하지만, 바이러스는 숙주의 면역 반응을 약화시키는 인자를 발현한다. MVA는 WT-VAC보다 더 나은 면역원이며 포유동물 세포에서 잘 복제하지 못한다.(예를 들어, Brandler et al.,J. Virol.84, 5314-5328 (2010) 참고)(62).
하지만, MVA는 전적으로 비복제성은 아니며 본 발명자들이 보여준 것처럼 일부 남은 면역억제 활성을 함유한다. 그럼에도 불구하고, 본 명세서에서 나타난 대로, MVA는 치료된 대상의 생존을 유의하게 연장시켰다. 이들 발견의 의미는 MVA(또는 MVAΔE3L)를 종양에 주사하거나 전신적으로 전달함으로써, 숙주의 선천적 및 획득 면역 반응을 향상시키고, 면역 반응을 회피하는 종양의 능력을 극복하고, 그 반응이 본래의 것이든 관문 억제제와 같은 다른 면역요법제에 의해 유도되거나 향상되는 것이건 간에 숙주가 종양에 대한 면역 반응을 시작하는 능력을 회복하는 것이 가능하다는 것이다.
E3가 결실된 변형 백시니아 안카라(MVAΔE3L)
직전 섹션에서 개시된 MVA의 항종양 효과는 또한 MVAΔE3L에서도 관찰된다. 후자는 MVA보다 덜 면역억제성이며 심지어 대부분의 포유동물 세포에서 덜 복제성이며, 그러한 점에서 바람직하다. 또한, MVAΔE3L의 효과는 일반적으로 본 명세서에 개시된 실험에서 나타난 대로 MVA에서의 효과보다 정량적으로 더 우수하였다.
면역 반응
특정 면역계 활성(예를 들어, 항체 및/또는 사이토카인 생산, 또는 세포 매개 면역의 활성화)의 상향-조절에 의한 면역 반응의 유도에 더하여, 면역 반응은 또한 항상성을 재확립하고 숙주 자신의 기관 및 조직에의 과다한 손상을 방지하기 위하여, 검출가능한 면역의 억제, 약화 또는 임의의 다른 하향-조절을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 유도되는 면역 반응은 종양 세포의 사멸, 또는 증식 능력의 상실을 직접적으로 또는 간접적으로 야기할 수 있는 이펙터 CD8+ (항종양 세포독성 CD8+) T 세포 또는 활성화된 T 헬퍼 세포 또는 둘 모두를 생성한다.
본 발명의 조성물 및 방법에 의한 면역 반응의 유도는 다양한 잘 알려진 면역학적 파라미터 중 임의의 것을 검출함으로써 결정될 수 있다(63, 64)(Takaoka et al., Cancer Sci. 94:405-11 (2003); Nagorsen et al., Crit. Rev. Immunol. 22:449-62 (2002)). 따라서 면역 반응의 유도는 면역 분석을 비롯한 잘 알려진 많은 분석 중 임의의 것에 의해 확립될 수 있다. 그러한 분석은 가용성 면역글로불린 또는 항체; 가용성 매개자, 예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 성장 인자 등 및 다른 가용성 소 펩티드, 탄수화물, 뉴클레오티드 및/또는 지질 매개자; 면역계의 세포의 변화된 기능적 또는 구조적 특성, 예를 들어, 세포 증식, 변화된 이동성, 변화된 세포내 양이온 구배 또는 농도(예를 들어, 칼슘)에 의해 결정된 세포 활성화 상태 변화; 세포 폴리펩티드의 인산화 또는 탈인산화; 특정 유전자 발현 또는 세포용해 거동과 같은 전문적인 활성의 유도; 변화된 표면 항원 발현 프로파일을 비롯한 면역계의 세포에 의한 세포 분화, 또는 어팝토시스(프로그램된 세포 사멸)의 개시; 또는 면역 반응의 존재가 검출될 수 있는 임의의 다른 기준의 인 비보, 엑스 비보 또는 인 비트로 결정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 면역 세포 유형을 구별하는 세포 표면 마커는 CD4+, CD8+, 또는 NK 세포에 결합하는 특이적 항체에 의해 검출될 수 있다. 검출될 수 있는 다른 마커 및 세포 성분은 인터페론 γ(IFN-γ), 종양 괴사 인자(TNF), IFN-α, IFN-β, IL-6, 및 CCL5를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 면역 반응을 검출하는 일반적인 방법은 유세포 분석, ELISA, 면역조직화학을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 및 유사 분석을 수행하기 위한 절차는 널리 알려져 있으며 예를 들어, Letkovits(Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, Current Protocols in Immunology, 1998)에서 찾을 수 있다.
약학 조성물 및 제제
MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L을 포함하는 약학 조성물은 담체 또는 희석제를 함유할 수 있으며, 이들은 예를 들어, 물, 염수, Tris 버퍼, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균 작용제, 및 방부제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당 또는 소듐 클로라이드 및 버퍼링제를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴 또는 담체 분자를 조성물내에 사용함으로써 야기될 수 있다. 다른 부형제는 습윤 또는 유화 작용제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 주사용 제제를 위해 적합한 부형제가 당업자에게 명백한 것처럼 포함될 수 있다.
MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L을 포함하는 약학 조성물 및 제제는 종래의 혼합, 용해, 과립화, 유화, 캡슐화, 포획(entrapping) 또는 동결건조 과정에 의해 제조될 수 있다. 약학 바이러스 조성물은 인 비트로, 인 비보 또는 엑스 비보 사용을 위해 적합한 바이러스 제제의 제형화를 촉진하는 하나 이상의 생리학적 허용 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 종래 방식으로 제형화될 수 있다. 조성물은 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성제와 조합될 수 있으며(예를 들어, GM-CSF의 병행 투여) 비경구 또는 종양내 투여를 위해 적합한 본 발명의 약학(생물학 포함) 또는 수의학 조성물을 생성하기 위하여 약학적 허용 담체, 희석제 또는 부형제로 제형화될 수 있다.
많은 유형의 제형이 당업자가 이해하듯이 가능하다. 선택된 구체적인 유형은 당업계에서 잘 인식되는 것처럼, 선택된 투여 경로에 의존한다. 예를 들어, 전신성 제형은 일반적으로 주사, 예를 들어, 정맥내 주사에 의한 투여를 위해 설계될 것이며 종양내 전달을 위해 설계된 것들도 있다. 바람직하게는 전신성 또는 종양내 제형은 멸균된다.
멸균 주사용 용액은 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L을 필요에 따라 본 명세서에 열거된 다양한 다른 성분을 가진 적절한 용매의 필요한 양에 포함시키고, 이어서 적합한 멸균 처리를 함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산물은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기에 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클내로 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에는, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조 기술이며, 이 기술들은 바이러스 및 앞서 멸균-여과된 그 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생산한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 조성물은 수용액에서, 또는 생리학적으로 적합한 용액 또는 버퍼, 예를 들어, 행크 용액( Hanks's solution), 링거액, 만니톨 용액 또는 생리학적 염수 버퍼에서 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 조성물 중 임의의 것은 제형화 작용제, 예를 들어, 현탁, 안정화, 침투화 또는 분산 작용제, 버퍼, 동결보호제(lyoprotectant) 또는 방부제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리소르베이트 80, 1-도데실헥사하이드로-2H-아제핀-2-온(라우로카프란(laurocapran)), 올레산, 소듐 시트레이트, Tris HCl, 덱스트로스, 프로필렌 글리콜, 만니톨, 폴리소르베이트 폴리에틸렌소르비탄모노라우레이트(트윈®20), 이소프로필 미리스테이트, 벤질 알코올, 이소프로필 알코올, 에탄올 수크로스, 트레할로스를 함유할 수 있으며 당업계에 일반적으로 알려진 다른 그러한 것들이 본 발명의 임의의 조성물에서 사용될 수 있다.(Pramanick et al., Pharma Times 45(3), 65-76 (2013))(65).
본 발명의 생물학 또는 약학 조성물은 그 조성물의 대상에의 투여시에 그안에 함유된 바이러스가 종양 세포를 감염시키기 위해 이용가능하도록 제형화될 수 있다. 투여 후 혈청, 종양, 및 원한다면 다른 조직에서의 바이러스의 수준은 항체계 분석(예를 들어, ELISA, 면역조직화학 등)과 같은 다양한 잘 확립된 기술에 의해 모니터될 수 있다.
본 발명의 재조합 바이러스는 약 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7.7에서 제형화된 3.5 x107 PFU/ml의 역가를 가지고 -80℃에서 저장될 수 있다. 백신 주사의 제조를 위하여, 예를 들어, 102-108 또는 102-109 바이러스 입자가 앰퓰, 바람직하게는 유리 앰퓰내에 2% 펩톤과 1% 인간 알부민의 존재하에서 포스페이트-완충 염수(PBS) 100 ml내에 동결건조될 수 있다. 대안적으로, 주사용 제제는 제형내의 재조합 바이러스의 단계적 동결-건조에 의해 생산될 수 있다. 이 제형은 인 비보 투여를 위해 적합한 추가의 첨가제, 예를 들어, 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토스 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 산화방지제 또는 불활성 가스와 같은 다른 첨가제, 안정화제 또는 재조합 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민)을 함유할 수 있다. 그 후 유리 앰퓰은 밀봉되고 수 개월 동안 4℃ 내지 실온에서 저장될 수 있다. 하지만, 앰퓰은 바람직하게는 -20℃ 미만의 온도에서 저장된다.
치료법을 위하여, 동결건조물은 생리식염수 또는 Tris 버퍼와 같은 수용액에서 용해될 수 있으며, 전신적으로 또는 종양내로 투여될 수 있다. 투여 방식, 적용량 및 투여 횟수는 공지 방식으로 당업자에 의해 최적화될 수 있으며 하기에 설명된다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 추가의 아쥬반트를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, "아쥬반트"는 종양 항원에 대한 숙주의 면역 반응을 향상, 증대 또는 강화시키는 물질을 말한다. 전형적인 아쥬반트는 알루미늄 염, 예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트, 퀼(Quil) A, 세균 세포벽 펩티도글리칸, 바이러스-유사 입자, 다당류, 톨(Toll)-유사 수용체, 나노-비드 등일 수 있다(Aguilar et al. (2007), Vaccine 25: 3752-3762).
재조합 MVA 바이러스를 포함하는 키트
본 발명은 본 명세서에 개시된 재조합 MVA 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 조성물을 포함하는 키트의 제공을 고려한다. 키트는 치료될 대상에의 재조합 MVA의 투여를 위한 설명서와 함께, 재조합 MVA의 용기 또는 바이알 하나 또는 다수를 포함할 수 있다. 설명서는 하기에 제공되는 바처럼 조성물 또는 조성물들을 투여하기 위한 투여량 계획을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 또한 재조합 MVA 조성물과 공동 투여하기 위한 관문 억제제를 포함하는 추가 조성물을 포함할 수 있다.
MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 유효량 및 투여량
일반적으로, 더 낮거나 더 높은 적용량이 투여될 수 있지만, 약 106 내지 약 1010 플라크 형성 단위(pfu) 범위의 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 투여량이 대상에게 투여된다. 바람직한 실시형태에서, 투여량은 약 107-109 pfu이다. 바이러스 입자에 대한 pfu의 등가량은 사용되는 구체적인 pfu 적정법에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, pfu는 약 5 내지 100 바이러스 입자와 동일하고 0.69 PFU는 약 1 TCID50이다. MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 치료적 유효량은 처방된 기간동안 그리고 처방된 투여 빈도로 하나 이상의 분할된 적용량으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 당업자에게 명백한 것처럼, 본 발명에 따른 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 치료적 유효량은 대상의 질병 상태, 연령, 성별, 체중 및 일반적 상태, 및 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L이 구체적 대상에서 원하는 면역 반응(치료법에 대한 대상의 반응)을 이끌어내는 능력과 같은 인자들에 따라 변할 수 있다. MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 대상으로의 전달에서, 투여량은 또한 일반적 질병, 이전의 병력, 질병 유형 및 진행, 종양 크기, 종양에서 종양 침윤성 면역 세포의 존재 또는 부재 등과 같은 인자들에 따라 변할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물을 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 이로울 수 있다. "본 명세서에서 사용될 때 투여량 단위 형태"는 치료될 포유동물 대상을 위한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 구별되는 단위를 말하며; 각 단위는 요구되는 약학적 또는 수의학적 허용 담체와 연합되어 원하는 치료 효과를 생산하기 위해 계산된 소정 양의 활성 물질을 함유한다.
MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 투여 및 치료 계획
MVA-hFlt3L 및 MVAΔE3L-hFlt3L의 투여는 비경구, 예를 들어, 종양내, 척추강내 또는 정맥내 투여를 비롯한 하나보다 많은 경로를 이용하여 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L은 예를 들어, 종양내 주사에 의해, 직접적인 국소 반응이 필요한 종양 내로 직접적으로 투여된다. 부가적으로, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 투여 경로는 변할 수 있으며, 예를 들어, 첫번째 투여는 종양내 주사를 이용하고, 후속 투여는 정맥내 주사를 통해서이거나, 또는 임의의 그 조합일 수 있다. MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 주사의 치료적 유효량은 처방된 기간동안 그리고 처방된 투여 빈도로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L은 다른 치료적 처리와 공동으로 이용될 수 있다. 예를 들어, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L은 큰 원발성 종양을 가진 대상을 위해 선행보조(수술전) 또는 보조(수술후) 상황에서 투여될 수 있다. 그러한 최적화된 치료 계획은 종양에 대한 면역 반응을 유도하고 수술과 같은 일차 치료법 전 또는 후에 대상에서 종양 크기를 감소시킬 것으로 예상된다. 또한, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L은 화학요법 또는 방사선과 같은 다른 치료적 처리와 공동으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 바이러스는 매주 또는 매월 적어도 1회 투여되지만, 수 주, 수 개월, 수 년 동안 또는 효과가 지속되는 한 무기한으로 매주 2회 투여와 같이, 필요하면 더 자주 투여될 수 있다. 만일 용인된다면 그리고 만일 그들이 지속적이거나 증가된 효과를 야기한다면, 더 빈번한 투여가 고려된다. 본 방법의 효과는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 암세포 수의 감소, 종양 크기 감소, 종양의 박멸, 말초 기관내로 암세포 침윤의 억제, 전이성 성장의 억제 또는 안정화 또는 박멸, 종양 성장의 억제 또는 안정화, 및 삶의 질의 안정화 또는 개선. 또한, 효과는 종양에 대한 면역 반응의 유도, 이펙터 CD4+ T 세포의 활성화, 이펙터 CD8+ T 세포의 증가, 또는 조절 CD4+ 세포의 감소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 흑색종의 맥락에서, 효과는 흑색종의 처음 진단 후 1, 2, 3, 4, 5년, 또는 그 이상 이내에 재발 또는 전이가 없는 것일 수 있다. 유사한 평가가 결장암 및 기타 고형 종양에 대해 이루어질 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 종양 덩어리 또는 종양 세포는 인 비보, 엑스 비보 또는 인 비트로에서 MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L로 치료된다.
벡터
하기에 설명된 실험에서 pCB 플라스미드계 벡터가 특정 관심 유전자(SG), 이경우에는 쥐 GM-CSF(mGM-CSF) 또는 인간 Flt3L(hFlt3L)을 백시니아 합성 초기 및 후기 프로모터(Pse/l)의 제어하에 삽입하기 위해 이용되었다. 벡터 제작을 위한 방법은 M. Puhlmann, C. K. Brown, M. Gnant, J. Huang, S. K. Libutti, H. R. Alexander, D. L. Bartlett. Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy: Biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant. Cancer Gene Therapy, 7(1), 66-73 (2000)에서 개시되었다. 백시니아 P7.5 프로모터의 제어하에 있는 이. 콜라이 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(gpt)가 약물 선택 마커로서 사용되었다. 이들 2개의 발현 카세트는 각 측 상에 TK 유전자의 부분 서열에 의해 인접되었다. TK 유전자의 선택은 편의성의 문제였으며 바이러스내의 다른 적합한 유전자좌가 사용될 수 있었다. 플라스미드 DNA와 변형 백시니아 바이러스(MVA) 또는 MVAΔE3L 게놈 DNA의 TK 유전자좌에서 발생한 상동성 재조합은 SG 및 gpt 발현 카세트가 MVA 또는 MVAΔE3L 게놈 DNA TK 유전자좌내로 삽입되어 MVA-mGM-CSF, MVA-hFlt3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVA-ΔE3L-hFlt3L이 생성되도록 한다. 재조합 바이러스는 MPA, 잔틴 및 하이포잔틴을 포함하는 gpt 선택 배지의 존재하에서 농축되었으며, 플라크는 오염 MVA 또는 MVAΔE3L이 없는 적절한 재조합 바이러스가 수득될 때까지 4-5 라운드 동안 약물 선택 배지의 존재하에서 정제되었다.
하지만, MVA 또는 MVAΔE3L 게놈내로의 통합을 위해 적합한 임의의 다른 발현 벡터뿐만 아니라 대안적 프로모터, 조절 요소, 선택성 마커, 절단 부위, MVA의 비필수 삽입 영역이 사용될 수 있었음이 이해될 것이다. MVA는 C11, C7, K3, F1, F2, F4, F6, F8, F9, F11, F14.5, J2, A46, C16을 비롯한 많은 면역 조절 유전자를 선형 게놈의 말단에서 인코딩한다. 이들 유전자는 바이러스의 면역 활성화 특성을 잠재적으로 향상시키고 트랜스유전자의 삽입을 허용하기 위해 결실될 수 있다.
실시예
재료 및 방법
바이러스와 세포주
MVA 및 MVAΔE3L 바이러스는 게르트 수터(Gerd Sutter)(뮌헨 대학교)에 의해 친절하게 제공되었으며, BHK-21(베이비 햄스터 신장 세포, ATCC CCL-10) 세포에서 증식시켰다. MVA는 상업적으로 및/또는 공중이 입수가능하다. MVAΔE3L 바이러스의 생성 방법은 개시되었다(28)(Hornemann et al., J Virol 77, 8394-8407 (2003)). 바이러스를 36% 수크로스 쿠션을 통해 정제하였다. BHK-21은 10% FBS, 0.1 mM 비필수 아미노산(NEAA), 및 50 mg/ml 젠타마이신을 함유한 이글스 최소 필수 배지(Eagle's Minimal Essential Medium)(이글스 MEM, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 구매가능함, Cat# 11095-080)에서 배양하였다. 쥐 흑색종 세포주 B16-F10은 원래 아이. 피들러(I. Fidler)(MD 앤더슨 암센터(Anderson Cancer Center))로부터 입수하였다. B16-F10 세포를 10% FBS, 100 Units/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 및 10 mM HEPES 버퍼로 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지하였다. MC38 결장 선암종 암세포는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium)(DMEM, 인비트로겐(Invitrogen))에서 유지하였다. 쥐 삼중 음성 유방암 세포주 4T1은 10% FBS를 가진 RPMI 배지에서 배양하였다. TRAMP-C2 세포는 C57BL/6 마우스에서 트랜스제닉 선암종 마우스 전립선 모델(TRAMP)에서 유도된다. TRAMP-C2 세포는 동계 C57BL/6 마우스내로 그래프트될 경우 종양원성이다. TRAMP-C2 세포는 ATCC로부터 입수가능하다. 그들은 5%의 Nu-Serum IV, 5% FBS, 소 인슐린 및 DHT를 가진 DMEM에서 배양된다. 모든 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 성장시켰다.
본 발명에서 사용된 세포와 세포주는 달리 나타내지 않으면 상업적으로 또는 공중이 입수가능하다.
마우스
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 및 BALB/c 마우스를 잭슨 래보래토리(Jackson Laboratory)로부터 구매하고 인 비보 종양 이식 및 처리 실험을 위해 이용하였다. 이들 마우스는 슬로안 케터링 연구소(Sloan Kettering Institute)의 동물 설비에서 유지하였다. 모든 절차는 국립 보건원의 실험 동물의 보호와 이용에 대한 가이드에서의 권고를 엄격하게 따라 수행하였다. 프로토콜은 슬로안 케터링 암 연구소의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
Batf3-/- 및 STINGGt/Gt 마우스는 케네스 머피(Kenneth Murphy)(워싱턴 대학교; Batf3-/-), 및 러셀 반스(Russell Vance)(캘리포니아대학교 버클리캠퍼스; STINGGt/Gt) 실험실에서 생성되었다. 이들 마우스를 슬로안 케터링 연구소의 동물 설비에서 사육하고 유지하였다.
양측 종양 이식 모델 및 mGM-CSF 또는 hFlt3L을 발현하는 재조합 MVA 또는 MVAΔE3L 바이러스의 종양내 주사
요약하면, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피부내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 1 x 105). 종양 이식 후 8일에, 마우스가 마취상태일 때 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에 2 x 107 pfu의 MVAΔE3L-hFlt3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L, 또는 열-불활성화 MVA를 매주 2회 종양내로 주사하였다. 마우스를 매일 모니터하였으며 종양 크기를 매주 2회 측정하였다. 종양 부피는 하기 식에 따라 계산하였다: l(길이) x w(넓이) x h(높이)/2. 고통의 징후가 있거나 종양의 직경이 10 mm에 도달하면 마우스를 안락사시켰다.
일부 실험에서는, MC38 결장 선암종 세포를 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피부내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 1 x 105). 종양을 7-8일동안 성장시킨 후, MVAΔE3L-hFlt3L 또는 MVAΔE3L(2 x 107 pfu) 또는 PBS 대조군을 매주 2회 더 큰 종양내로 주사하였다. 종양 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터하였다.
일부 실험에서는, 4T1 쥐 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포를 BALB/c 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피부내로 이식하였다(우측 옆구리에 2.5 x 105 및 좌측 옆구리에 5 x 104). 종양 이식 후 5일에, MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L(2 x 107 pfu)을 매주 2회 우측 옆구리상의 더 큰 종양에 주사하였다. 마우스를 매일 모니터하고 종양 크기를 매주 2회 측정하였다. 마우스의 생존을 모니터하였다.
양측 종양 이식 모델 및 면역 관문 차단제의 전신성 또는 종양내 투여의 존재 또는 부재하에서 바이러스의 종양내 주사
B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피부내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 1 x 105). 종양 이식 후 8일에, 양측 종양을 가진 마우스를 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사 및 항-CTLA-4(100 ㎍/마우스), 항-PD-1(250 ㎍/마우스), 항-PD-L1(250 ㎍/마우스)를 비롯한 면역 관문 차단 항체, 또는 이소타입 대조군(100 ㎍/마우스)의 복강내 전달로 매주 2회 처리하였다. 종양 크기를 측정하였으며 종양에 매주 2회 주사하였다. 마우스의 생존을 모니터하였다.
일부 실험에서는, STINGGt/Gt, Batf3-/- 마우스 및 WT 연령-매치된 대조군을 양측 B16-F10 흑색종 이식을 위해 이용하였으며, 마우스의 우측 옆구리상의 더 큰 종양에 PBS 또는 열-MVA로 처리하였다.
일측 피부내 종양 이식 및 바이러스의 종양내 주사
B16-F10 흑색종(50 ㎕ 부피 내에 5 x 105 세포)을 WT C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리상의 면도된 피부내로 피부내 이식하였다. 이식 후 8-9일 후에, 종양 크기를 측정하였으며 마우스가 마취되었을 때 직경이 5-6 mm인 종양에 MVAΔE3L-hFlt3L(50 ㎕ 부피 내에 2 x 107 pfu의 MVA) 또는 열-MVA 또는 폴리(I:C)(50 ㎍/마우스) 또는 PBS를 매주 2회 주사하였다. 마우스를 매일 모니터하고 종양 크기를 1주에 2회 측정하였다. 종양 부피는 하기 식에 따라 계산하였다: l(길이) x w(넓이)x h(높이)/2. 고통의 징후가 있거나 종양의 직경이 15 mm에 도달하면 마우스를 안락사시켰다.
일부 실험에서는, B16-F10 흑색종(50 ㎕ 부피 내에 5 x 105 세포)을 WT C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리상의 면도된 피부내로 피부내 이식하였다. 이식 후 8-9일 후에, 종양 크기를 측정하였으며 마우스가 마취되었을 때 직경이 5-6 mm인 종양에 PBS, 또는 복강내로 전달된 이소타입 대조군, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1의 존재하에서 MVAΔE3L-hFlt3L을 주사하였다. 종양 크기를 측정하였으며 종양에 매주 2회 주사하였다. 마우스의 생존을 모니터하였다. 고통의 징후가 있거나 종양의 직경이 15 mm에 도달하면 마우스를 안락사시켰다.
일부 실험에서는, TRAMP-C2 세포를 STINGGt/Gt 마우스 및 연령-매치된 WT C57B/6 대조군의 면도된 우측 옆구리에 피부내 이식하였다(50㎕의 PBS내에 1 x 106 세포/마우스). 종양 이식 후 17일에, 우측 옆구리상의 종양(약 3-4 mm 직경)에 PBS 또는 MVAΔE3L-hFlt3L(2 x 107 pfu)를 매주 2회 주사하였다. 마우스를 매일 모니터하고 종양 크기를 매주 2회 측정하였다. 마우스의 생존을 모니터하였다.
종양 세포 현탁액의 제조, RNA 분리 및 실시간 PCR
요약하면, 2.5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 6-8주령의 C57B/6 마우스의 좌측 옆구리에 그리고 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 우측 옆구리에 피부내로 이식하였다. 이식 후 7일에, MVA(2 x 107 pfu) 또는 열-MVA, 또는 PBS를 우측 옆구리상의 더 큰 종양내로 주사하였다. 주사를 3일 후 반복하였다. 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두를 첫번째 주사 후 제7일에 수집하고, 세포 현탁액을 생성하였다.
RNA를 알엔이지 미니(RNeasy Mini) 키트(퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 전세포 용해물로부터 추출하고 퍼스트 스트랜드(First Strand) cDNA 합성 키트(퍼멘타스(Fermentas))를 이용하여 역전사시켰다. 정량적 실시간 PCR을 유전자-특이적 프라이머를 이용하여 SYBR 그린(Green) PCR 메이터 믹스(Mater Mix)(라이프 테크놀로지스) 및 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 7500 실시간 PCR 장비(라이프 테크놀로지스)를 이용하여 세벌로 수행하였다. 상대적 발현을 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)의 수준에 정규화시켰다.
유세포분석
종양 또는 종양 배출 림프절에서 면역 세포 표현형 및 특징을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 하기 프로토콜에 따라 FACS 분석 전에 세포 현탁액을 생성하였다(Zamarin et al., Science Translational Medicine 6, 226-232 (2014)). 먼저 본 발명자들은 MVA 또는 PBS를 이용한 처리 후 3일에 겸자 및 수술 가위를 이용하여 종양을 단리하였다. 그 후 종양을 칭량하였다. 종양 또는 종양 배출 림프절을 조각낸 후 리베라제(Liberase)(1.67 Wunsch U/ml) 및 DNase(0.2 mg/ml)와 37℃에서 30분동안 항온처리하였다. 세포 현탁액을 반복 피펫팅에 의해 생성하고, 70-㎛ 나일론 필터를 통해 여과하고, 그 후 피콜(Ficoll) 정제 전에 완전한 RPMI로 세척하여 사멸 세포를 제거하였다. 항-CD3, CD45, CD4, 및 CD8 항체를 이용한 표면 라벨링을 위해 세포를 가공하였다. 고정가능한 염료 이플루오르(eFluor)506(이바이오사이언스)(eBioscience))을 이용하여 살아있는 세포를 죽은 세포로부터 구별한다. 그들을 추가로 FoxP3 고정 및 투과화 키트(이바이오사이언스)를 이용하여 투과화하고, Ki-67, FoxP3, 및 그랜자임 B에 대해 염색하였다. 골수 세포 집단의 염색을 위하여, CD45.2(104), CD11b(M1/70), Ly-6C(HK1.4), MHC II(M5/114.15.2), CD24(M1/69), F4/80(BM8), CD103(2E7) 및 CD11c(N418)에 대한 형광단접합된 항체를 이바이오사이언스로부터 구매하였다. 모든 항체를 그들의 각 이소타입 대조군으로 시험하였다. LSRII 유세포분석기(비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 이용하여 데이터를 획득하였다. 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리스타(Treestar))를 이용하여 데이터를 분석하였다.
엘리스팟
미자극 또는 처리 마우스로부터의 마우스 비장을 수집하고 기계적으로 파괴하고, RBC를 용해시켰다. CD8+ T 세포는 자기 항-CD8+ 비드(밀테니바이오텍(MiltenyiBiotec))와의 항온처리에 의해 양성으로 선택되었다. BD 마우스 IFN-γ엘리스팟 세트를 제조사의 설명서에 따라 이용하였다. 요약하면, 엘리스팟 플레이트를 PBS내 항-마우스 IFN-γ 항체 100 ㎕로 코팅하고 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 플레이트를 PBS로 세척하여 미결합 항체를 제거하고 7% 태아 소 혈청을 가진 RPMI 배지로 실온에서 2시간 동안 차단시켰다. 1x105 정제된 CD8+ T 세포를 동일한 수의 조사된 B16 또는 MC38 세포와 혼합하고, 각 웰내로 접종하였다. 플레이트를 16시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈으로 철저하게 세척하고 마우스 IFN-γ에 대한 비오틴화된 검출 항체 100 ㎕/웰과 항온처리하였다. 효소 접합체(스트렙타비딘(Streptavidin)-HRP)를 세척 후 첨가하고, 이어서 스팟 현상을 위해 최종 기질 용액을 첨가하였다. KS 소프트웨어를 가진 자동화 엘리스팟 판독기 시스템(칼 자이스 인크.(Carl Zeiss Inc.))으로 스팟을 계수하였다.
TRP-2 사량체 염색
종양 배출 림프절을 단리하고 조각낸 후 리베라제(1.67 Wunsch U/ml) 및 DNase(0.2 mg/ml)와 37℃에서 30분동안 항온처리하였다. 세포 현탁액을 반복 피펫팅에 의해 생성하고, 70-㎛ 나일론 필터를 통해 여과하고, 완전 RPMI로 세척하였다. 림프절 세포 현탁액을 실온에서 30분 동안 항-FcγII(2.4G2) 항체 및 10 μL의 PE-H-2 Kb TRP2(티로시나제 관련 단백질-2)(SVYDFFVWL) 사량체(MBL)와 항온처리하고, 이어서 항-CD3 및 항-CD8 항체로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 세포를 MACS 버퍼(밀테니)에서 세척하고 플로우조 소프트웨어(트리 스타)를 이용하여 BD LSRII로 분석하였다.
시약
시약을 위한 상업적 공급원은 다음과 같다: 치료 항-CTLA4(클론 9H10 및 9D9), 항-PD1(클론 RMP1-14), 항-PD-L1(클론 10F.9G2)은 바이오엑셀(BioXcell)로부터 구매하였으며; 유세포분석을 위해 사용된 항체는 이바이오사이언스(CD45.2 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 700, CD3 PE-Cy7, CD4 APC-efluor780, CD8 PerCP-efluor710), 인비트로겐(CD4 QDot 605, 그랜자임 B PE-텍사스 레드(Texas Red), 그랜자임 B APC)로부터 구매하였다. CD45.2(104), CD11b(M1/70), Ly-6C (HK1.4), MHC II(M5/114.15.2), CD24(M1/69), F4/80(BM8), CD103(2E7) 및 CD11c(N418)에 대한 형광단접합된 항체는 이바이오사이언스로부터 구매하였다.
통계학
연구에서 두 그룹의 비교를 위하여 양측의, 대응 없는 스튜던츠(Two-tailed unpaired Student's) t 테스트를 이용하였다. 생존 데이터는 로그-랭크(만텔-콕스) 시험에 의해 분석하였다. 유의한 것으로 간주한 p 값은 하기와 같이 도면에 나타낸다: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001. 연구에 포함된 동물의 수는 각 도면 기호설명표에 토의된다.
실시예 1
mGM-CSF 또는 hFlt3L을 발현하는 재조합 MVA 또는 MVAΔE3L 바이러스의 생성
본 발명에서, 발명자들은 표준 재조합 바이러스 기술을 이용하여, 백시니아 합성 초기/후기 프로모터(Pse/l)하에서 인간 Flt3L 또는 쥐 GM-CSF를 발현하거나 발현하지 않으며 TK-결실을 포함하는 재조합 MVA 또는 MVAΔE3L 바이러스를 생성하였다. 먼저, 발명자들은 어느 일 측상에서 티미딘 키나제(TK) 유전자에 의해 인접된, 백시니아 Pse/l의 제어하의 특정 관심 유전자(SG) 및 백시니아 P7.5 프로모터의 제어하의 이. 콜라이 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(gpt)를 함유하는 플라스미드를 제작하였다(도 1).
BHK21 세포를 1 h 동안 0.05의 MOI로 MVA 또는 MVAΔE3L로 감염시킨 후, 상술한 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 감염된 세포를 48 h에 수집하였다. MPA, 잔틴 및 하이포잔틴을 포함하는 gpt 선택 배지에서의 추가 배양을 통해 재조합 바이러스를 선택하고, 플라크를 정제하였다(Lorenzo et al., 2004). PCR 분석을 수행하여 TK 유전자의 일부가 상실되고 쥐 GM-CSF, 또는 인간 Flt3L이 있거나 없는 재조합 바이러스를 확인하였다(도 2).
PCR을 이용하여 재조합 바이러스 MVA-mGM-CSF, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVA-hFlt3L, 및 MVAΔE3L-hFlt3L에서의 정확한 삽입을 확인하였다. 프라이머쌍 mGM-CSF-F1/R1을 이용하여 재조합 바이러스 MVA-mGM-CSF 또는 MVAΔE3L-mGM-CSF에 삽입된 mGM-CSF 유전자로부터 310 bp DNA 단편을 증폭시켰다. MVA-hFlt3L 및 MVAΔE3L-hFlt3L에서의 hFlt3L 유전자 삽입은 프라이머쌍 hFlt3L-F4/R4로 확인하였으며, 이것은 316 bp DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 프라이머쌍 TK-F4/TK-R4를 이용하여 TK 유전자좌에서의 특정 유전자 삽입을 확인하였다. TK-F4/R4는 MVA 또는 MVAΔE3L로부터 304bp DNA 단편을 증폭시킬 수 있으나, MVA-mGM-CSF, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVA-hFlt3L, 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 바이러스에서는 TK-R4 프라이머 유전자좌의 결실로 인해 증폭시킬 수 없다.
프라이머 서열: TK-F2(서열 번호 1): TGTGAAGACGATAAATTAATGATC; TK-F4(서열 번호 2): TTGTCATCATGAACGGCGGA;
TK-R4(서열 번호 3): TCCTTCGTTTGCCATACGCT;
TK-F5(서열 번호 4): GAACGGGACTATGGACGCAT;
TK-R5(서열 번호 5): TCGGTTTCCTCACCCAATCG;
pCB-R3(서열 번호 6): ACCTGATGGATAAAAAGGCG;
mGMCSF-F1(서열 번호 7): GGCATTGTGGTCTACAGCCT;
mGMCSF-R1(서열 번호 8): GTGTTTCACAGTCCGTTTCCG;
hFlt3L-F1(서열 번호 9): AACGACCTATCTCCTCCTGC;
hFlt3L-R1(서열 번호 10): GGGCTGAAAGGCACATTTGG.
실시예 2
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 양측 B16-F10 흑색종 모델에서 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두를 박멸하거나 성장을 지연시키는데 있어서 MVAΔE3L-mGM-CSF 또는 MVAΔE3L 보다 더 효과적이다
본 발명자들은 쥐 B16-F10 흑색종 양측 이식 모델을 이용하여 전이성 성장에 대한 MVAΔE3L-hFlt3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, 및 MVAΔE3L의 종양내 주사의 효과를 조사하였다. 요약하면, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피부내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 1 x 105). 종양 이식 후 7-8일에, 발명자들은 MVAΔE3L-hFlt3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, 및 MVAΔE3L(2 x 107 pfu) 또는 PBS를 우측 옆구리상의 더 큰 종양에 종양내로 매주 2회 주사하였다. 종양 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터하였다(도 3a). PBS-처리된 마우스는 다음 7-14일에 걸쳐 종양 성장이 증가하면서 빠르게 사망한 반면(도 135ba 및 cb), MVAΔE3L로 처리된 마우스는 대측성 측에서 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두의 지연된 종양 성장을 나타내어, 평균 생존을 PBS 그룹에서의 11일에서 MVAΔE3L-처리된 그룹에서의 25일로 연장시켰다(도 3b 및 c, ***, MVAΔE3L(n=9) vs. PBS(n=5)를 위해 P < 0.001). 또한, MVAΔE3L-mGM-CSF로 처리된 마우스는 또한 25일의 중앙 생존기간을 가졌으며 1/9 마우스에서 흑색종이 치유되었다. 또한, MVAΔE3L-hFlt3L로 처리된 마우스는 70일의 중앙 생존기간을 가졌으며 4/9 마우스가 치유되었다(도 3b 및 c, ***, MVAΔE3L-hFlt3L(n=9) vs. MVAΔE3L(n=9)을 위해 P < 0.001; *, MVAΔE3L-hFlt3L(n=9) vs. MVAΔE3L-mGM-CSF(n=9)를 위해 P < 0.05). 함께 고려할 때, 이들 결과는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 환자에서의 전이성 상황을 모방하는 양측 B16-F10 흑색종 모델에서 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두를 박멸하거나 성장을 지연시키는데 있어서 MVAΔE3L-mGM-CSF 또는 MVAΔE3L보다 더욱 효과적임을 나타낸다.
실시예 3
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 재투여시험시에 상이한 종양 유형에 대한 전신성 면역을 유도한다
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사 후 생존 마우스(n=4)가 상이한 종양 유형에 대한 면역을 발달시켰는지를 평가하기 위하여, 발명자들은 피부내로 이식된 치사량의 MC38(1 x 105)로 그들을 재투여시험하였다. 상기 종양 또는 바이러스에 전혀 노출된 적 없는 미자극 마우스(n=5)를 대조군으로 이용하였다. 모든 미자극 마우스가 종양을 발생시켰으며 29일의 중앙 생존기간으로 종양 이식 후 26-31일에 사망한 반면, 모든 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 생존 마우스가 MC38 종양 공격을 거부하였다(도 3d). 마우스가 이전에 MC38 종양에 노출된 적이 없었음을 고려할 때 이것은 상당히 놀랍다. 이들 결과는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 B16-F10 흑색종과 MC38 결장암 사이의 공통 항원의 인식 및 상이한 유형의 종양에 대한 항-종양 면역의 발달을 허용함을 제안한다.
실시예 4
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 CD8 + 및 CD4 + T 세포의 증식과 활성화 및 조절 T 세포의 감소에서 효과적이다.
B16-F10 흑색종에서 MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 열-MVA의 종양내 주사가 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화 및 증식을 유도하는지 여부를 평가하기 위하여, 2.5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 6-8주령의 C57B/6 마우스의 좌측 옆구리에 그리고 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 우측 옆구리에 피부내로 이식하였다. 이식 후 7일에, MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 열-MVA 또는 PBS를 우측 옆구리상의 더 큰 종양내로 주사하였다. 주사를 3일 후에 반복하였다. 첫번째 주사 후 제7일에 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두를 수집하고, 세포 현탁액을 생성하였다. 주사된 및 비-주사된 종양내의 살아있는 면역 세포 침윤물을 FACS에 의해 분석하였다. 주사된 종양에서 그랜자임 B를 발현하는 CD8+ T 세포가 PBS-처리된 종양에서의 58.9%에서 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 종양에서의 97%로 극적으로 증가하였다(p<0.0001; 도 4a, 4b). 비-주사된 종양에서는, 또한 그랜자임 B를 발현하는 CD8+ T 세포가 PBS-처리된 마우스에서의 61.9%에서 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 마우스에서의 91.6%로 그리고 MVAΔE3L-처리된 마우스에서의 83%로 증가하였다(p<0.001; 도 4a, 4b). MVAΔE3L-hFlt3L 및 MVAΔE3L-처리된 마우스 사이의 비-주사된 종양에서의 그랜자임 B를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율에서의 차이는 통계적으로 유의하였다(p<0.05; 도 4a, 4b).
주사된 종양에서, Ki-67+CD8+ T 세포는 PBS-처리된 종양에서의 58.3%에서 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 종양에서의 83.2%로 증가하였다(p<0.01; 도 4c, 4d). 비-주사된 종양에서, 또한 Ki-67을 발현하는 CD8+ T 세포가 PBS-처리된 마우스에서의 58.7%에서 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 마우스에서의 75.4%로 증가하였다 (p<0.01; 도 4c, 4d).
PBS로 처리된 마우스에 비하여 바이러스로 처리된 마우스로부터의 주사된 및 비-주사된 종양에서 CD4+ T 세포에 대해 유사한 변화가 관찰되었으며; 그랜자임 B+CD4+ T 세포는 PBS-처리된 종양에서의 20%에서 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 종양에서의 98.4%로 상승하였다(P=0.0002; 도 5a, 5b). 비-주사된 종양에서는, 그랜자임 B를 발현하는 CD4+ T 세포가 PBS-처리된 마우스에서의 18.7%에서 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 마우스에서의 67.8% 및 MVAΔE3L-처리된 마우스에서의 45.2%로 증가하였다(p<0.0001; PBS vs. MVAΔE3L-hFlt3L; p<0.01; PBS vs. MVAΔE3L, p<0.05; MVAΔE3L-hFlt3L vs. MVAΔE3L 도 5a, 5b).
또한, Ki-67+CD4+ T 세포가 PBS-처리된 종양에서의 40%에서 MVAΔE3L-처리된 종양에서의 59.6% 및 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 종양에서의 66.6%로 증가하였다(p<0.001; PBS vs. MVAΔE3L-hFlt3L, p<0.01; PBS vs. MVAΔE3L, p<0.05; MVAΔE3L-hFlt3L vs. MVAΔE3L, 도 5c, d). 비-주사된 종양에서는, Ki-67을 발현하는 CD4+ T 세포가 PBS-처리된 마우스에서의 40%에서 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 마우스에서의 61.2% 및 MVAΔE3L-처리된 마우스에서의 52.2%로 증가하였다(p<0.01; PBS vs. MVAΔE3L, p<0.05; PBS vs. MVAΔE3L-hFlt3L, 도 5c, 5d).
주사된 종양에서는, CD4+Foxp3+ T 세포가 PBS-처리된 종양에서의 45.1%에서 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 종양에서의 26.6%로 감소되었다(p<0.001; 도 6a, 6b). 비-주사된 종양에서는, CD4+Foxp3+ T 세포가 PBS-처리된 마우스에서의 51.6%에서 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 종양에서의 37.1%로 감소되었다(p<0.01; 도 6a, 6b).
발명자들은 바이러스 처리 후 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포, CD8+ 세포의 절대 수를 결정하였다. 주사된 종양에서는, MVAΔE3L-hFlt3L 또는 MVAΔE3L의 종양내 주사가 CD45+ 세포를 각각 3.8 x 106/g에서 1.6 x 107/g 또는 1.3 x 107/g로 증가시킨 것으로 밝혀졌다(P<0.01, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; P<0.01, MVAΔE3L vs. PBS; 도 7a). 비-주사된 종양에서는, 대측성 종양에서의 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 MVAΔE3L의 종양내 주사가 CD45+ 세포를 각각 3.3 x 106/g에서 9.5 x 107/g 또는 5.4 x 107/g로 증가시켰다(P<0.05, MVAΔE3L-hFlt3L vs. MVAΔE3L; P<0.05, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 7a).
발명자들은 또한 주사된 종양에서, MVAΔE3L-hFlt3L 또는 MVAΔE3L의 종양내 주사가 CD8+ 세포를 각각 2.9 x 105/g에서 2.9 x 106/g 또는 2.0 x 106/g으로 증가시켰음을 발견하였다(P<0.01, MVAΔE3L vs. PBS; P<0.001, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 7b). 비-주사된 종양에서는, 대측성 종양에서의 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 MVAΔE3L의 종양내 주사가 CD8+ 세포를 각각 2.8 x 105/g에서 1.6 x 106/g 또는 1.1 x 106/g으로 증가시켰다(P<0.001, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 7b).
CD8+ T 세포 대 조절 세포(Treg, CD4+FoxP3+ 세포로 정의됨) 및 Tconv (CD4+Foxp3- 세포) 대 Treg의 비를 또한 평가하였다. 주사된 종양에서는, MVAΔE3L-hFlt3L 또는 MVAΔE3L의 종양내 주사가 CD8+/Treg의 비를 2.8에서 18.6 또는 12.5로 증가시킨 것으로 관찰되었다(P<0.01, MVAΔE3L vs. PBS; P<0.001, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS, P<0.05, MVAΔE3L vs. MVAΔE3L-hFlt3L; 도 7c). 발명자들은 또한 비-주사된 종양에서는, 대측 종양에서의 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 MVAΔE3L의 종양내 주사가 CD8+/Treg의 비를 3.4에서 11 또는 7.8로 증가시킨 것을 발견하였다(P<0.01, MVAΔE3L vs. PBS; P<0.01, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 7c).
발명자들은 주사된 종양에서는, MVAΔE3L-hFlt3L 또는 MVAΔE3L의 종양내 주사가 CD4+/Treg의 비를 0.65에서 4.1 또는 3.2로 증가시킨 것을 관찰하였다(P<0.01, MVAΔE3L vs. PBS; P<0.01, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 7d). 또한 비-주사된 종양에서는, 대측성 종양에서의 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 MVAΔE3L의 종양내 주사가 이펙터 CD4+/Treg의 비를 0.7에서 3.3 또는 2.9로 증가시킨 것으로 밝혀졌다(P<0.0001, MVAΔE3L vs. PBS; P<0.05, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 7d).
이들 결과는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 종양 미세환경에서 면역학적 변화를 촉발하였으며, 이 변화는 세포독성 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식과 활성화 및 CD8+/Treg 및 Tconv/Treg의 비의 증가로 나타났음을 나타낸다.
실시예 5
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 종양-관련 대식세포의 고갈에서 효과적이다.
종양-관련 대식세포(TAM)는 하기의 표면 마커 CD45+MHC-II+F4/80hiCD24lo를 발현하는 종양 침윤성 골수 세포이다(Broz, et al. Cancer Cell, 26(5):638-52, 2014). 발명자들은 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중에서 TAM의 비율을 분석하였다. 발명자들은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 CD45+ 세포 중 TAM의 비율을 주사된 종양에서는 21.4%에서 0.7%로(P<0.0001, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 8, 9b) 그리고 비-주사된 종양에서는 22%에서 3.2%로 감소시켰음을(P<0.0001, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 8, 9a) 관찰하였다. MVAΔE3L-hFlt3L은 비-주사된 종양에서 TAM을 감소시키는데 있어서 MVAΔE3L보다 더 효과적이다(P<0.05, MVAΔE3L-hFlt3L vs. MVAΔE3L; 도 8, 9a). Batf3-/- 마우스에서는, PBS-처리된 마우스에서 CD45+ 세포 중에서 TAM의 비율이 주사된 종양에서 5.4%이고 비-주사된 종양에서 7.2%였다(P<0.01, WT PBS vs. Batf3-/- PBS에서 주사된 종양; 도 8, 9b; P<0.05, WT PBS vs. Batf3-/- PBS에서 비-주사된 종양; 도 8, 9b). MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 CD45+ 세포 중에서 TAM의 비율을 주사된 종양에서는 0.5%로 그리고 비-주사된 종양에서는 1.5%로 더 감소시켰다(P<0.0001, Batf3-/- MVAΔE3L-hFlt3L vs. Batf3-/- PBS에서 주사된 종양; 도 8, 9b; P<0.05, Batf3-/- MVAΔE3L-hFlt3L vs. Batf3-/- PBS에서 비-주사된 종양; 도 8, 9a). Batf3-/- 마우스의 종양에서 주목할만하게 감소된 TAM의 수는 TAM의 생성이 종양 내의 CD8+ T 세포 침윤과 연관될 수 있음을 제안한다. TAM은 종양 진행과 전이를 촉진하는 것으로 나타났었다. MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사에 의한 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두로부터의 TAM의 효과적인 고갈은 이 치료법의 효과에 기여할 수 있다.
실시예 6
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 수지상 세포 집단의 극적인 변화를 야기한다
본 발명자들은 다음으로 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 수지상 세포(DC) 집단을 분석하였다. 종양 침윤성 DC는 CD45+Ly6C-MHC-II+CD24hiF4/80lo 세포를 특징으로 한다(Broz et al., Cancer Cell, 2014). CD24hi DC 중에는, 두 가지 DC 집단, CD11b+ DC와 CD103+ DC가 있다. 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중 CD24hi DC(CD24+)의 비율을 조사하였다. WT 마우스에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 비주사된 종양에서는 3%에서 1.3%로(P=0.001, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 9a) 그리고 주사된 종양에서는 2.4%에서 0.2%로(P=0.0004, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 9b) CD24+ DC를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. Batf3-/- 마우스에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 또한 비주사된 종양에서는 3.4%에서 0.8%로 (P=0.05, Batf3-/- MVAΔE3L-hFlt3L vs. Batf3-/- PBS; 도 9a) 그리고 주사된 종양에서는 2.6%에서 0.3%로(P<0.0001, Batf3-/- MVAΔE3L-hFlt3L vs. Batf3-/- PBS; 도 9b) CD24+ DC를 감소시켰다. 이들 발견은 수지상 세포의 활성화와 일치한다.
CD103+ DC는 항원을 교차-제시하는 것을 전문으로 하는 말초 DC의 서브세트이다. Batf3은 CD103+ DC의 분화를 위해 중요한 전사 인자이다. CD103+ DC는 숙주 항-종양 면역에서 중요한 역할을 한다. 본 발명의 발명자들은 이전에 Batf3-의존성 CD103+ DC가 불활성화된 MVA-매개 항종양 효과를 위해 요구됨을 보여주었다(WO2016/168862). 여기서는, 본 발명자들은 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중에서 CD103+ DC의 비율을 조사하였다. WT 마우스에서는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 비-주사된 종양에서 1.0%에서 0.3%로(P<0.0001, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 10, 11a) 그리고 주사된 종양에서 0.9%에서 0.05%로(P<0.0001, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 10, 11b) CD103+ DC를 감소시킨 것으로 밝혀졌다. CD103+ DC는 예상대로 WT 마우스에 비하여 Batf3-/- 마우스에서 많이 감소되었다(P<0.0001, WT PBS vs. Batf3-/- PBS; 도 10, 11a, 11b). 이들 결과는 CD103+ DC가 바이러스의 종양내 주사 후 극적 변화를 일으킴을 나타낸다.
주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중 CD11b+ DC의 비율도 조사하였다. WT 마우스에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 주사된 종양에서는 0.9%에서 0.06%로(P<0.01, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 10, 11d) 그리고 비-주사된 종양에서는 1.0%에서 0.8%로(P=0.54, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 10, 11c) CD103+ DC를 감소시켰다. CD11b+ DC는 예상대로 WT 마우스에 비하여 Batf3-/- 마우스에서 영향을 받지 않았다(도 10, 11c, 및 11d). 이들 결과는 CD11b+ DC가 또한 주사된 종양에서 바이러스의 종양내 주사 후 극적인 변화를 겪을 수 있음을 나타낸다. 비-주사된 종양에서 CD11b+ DC는 CD103+ DC보다 덜 이동성이다.
실시예 7
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 Ly6C hi CD11b + 및 Ly6C + CD11b - 세포의 유입을 야기한다
Ly6ChiCD11b+ 세포는 C-C 케모카인 리간드 2(CCL2)로 인해 손상 또는 감염 부위로 보충되는 C-C 케모카인 수용체(CCR2) 발현 염증성 단핵구이다. 이들 세포는 TNF 및 iNOS-생산 수지상 세포(TipDC) 및 기타 염증성 세포 서브세트가 생기게 하여, 조직 손상 또는 미생물 사멸을 유도한다. 발명자들은 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 CD45+ 세포 중 Ly6ChiCD11b+ 단핵구의 비율을 조사하였다. WT 마우스에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 주사된 종양에서 11.7%에서 37%로(P=0.0011, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 12, 13b) 그리고 비-주사된 종양에서 13.5%에서 26%로(P=0.0102, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 12, 13a) Ly6ChiCD11b+ 단핵구가 증가하도록 하였다. Ly6ChiCD11b+ 단핵구는 예상대로 WT 마우스에 비하여 Batf3-/- 마우스에서 영향을 받지 않았다(도 12, 13a 및 13b). 흥미롭게, MVAΔE3L-mGM-CSF의 종양내 주사는 주사된 종양에서 11.7%에서 25.7%로(P=0.0011, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 12, 13b) 그리고 비-주사된 종양에서 13.5%에서 35.6%로(P<0.0001, MVAΔE3L-mGM-CSF vs. PBS; 도 12, 13a) Ly6ChiCD11b+ 단핵구의 증가를 야기하였다. 이들 결과는 바이러스 처리 후 Ly6ChiCD11b+ 단핵구가 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두로 보충됨을 나타낸다.
본 발명자들은 또한 바이러스-처리된 마우스에서 주사된 종양과 비-주사된 종양 둘 모두에서 Ly6ChiCD11b- 세포의 극적 증가를 관찰하였다. WT 마우스에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 주사된 종양에서 16.5%에서 32.7%로(P=0.0047, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 12, 13d) 그리고 비-주사된 종양에서 15.3%에서 32.7%로(P=0.0045, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; 도 12, 13c) Ly6ChiCD11b- 세포의 증가를 야기하였다. Ly6ChiCD11b- 세포는 PBS-처리된 마우스에서 WT 마우스에 비하여 Batf3-/- 마우스에서 감소되었다(WT 마우스에서 16.5% vs. Batf3-/- 마우스에서 4.9%, 도 12, 13c, 및 13d). MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 주사된 종양에서 4.9%에서 13.3%로(P=0.0117, Batf3-/- MVAΔE3L-hFlt3L vs. Batf3-/- PBS; 도 12, 13d) 그리고 비-주사된 종양에서 6.3%에서 13.9%로(P<0.05, Batf3-/- MVAΔE3L-hFlt3L vs. Batf3-/- PBS; 도 12, 13c) Ly6ChiCD11b- 세포의 증가를 야기하였다. 이들 결과는 Ly6ChiCD11b- 세포가 MVAΔE3L, MVAΔE3L-mGM-CSF, MVAΔE3L-hFlt3L 또는 열-MVA 처리와 같은 면역 자극 바이러스 후 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두로 보충됨을 나타낸다. 항-종양 CD8+ T 세포와 항바이러스 CD8+ T 세포가 종양 부위로의 Ly6ChiCD11b- 세포의 동원을 위해 중요할 수 있음이 가능하다.
실시예 8
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 양측 MC38 종양 이식 모델에서 MVAΔE3L보다 더 효과적이다
상이한 고형 종양 모델에서 MVAΔE3L-hFlt3L vs. MVAΔE3L의 항종양 효능을 비교하기 위하여, 발명자들은 C57B/6 마우스의 우측 옆구리내로 5 x 105 MC38 결장암 세포를 그리고 좌측 옆구리내로 1 x 105 세포를 피부내로 이식하였다. 종양을 7-8일 동안 성장시키고, 그 후 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 MVAΔE3L(2 x 107 pfu) 또는 PBS 대조군을 더 큰 종양내로 매주 2회 주사하였다. 종양 성장으로 인해 PBS-모의 처리 후 7-14일에 모든 PBS 대조군 마우스가 사망한 한편(중앙 생존기간이 10일)(도 14a 및 14b), MVAΔE3L의 종양내 주사는 중앙 생존기간을 PBS 그룹에서의 10일에서 MVAΔE3L 그룹에서의 21일로 연장시켰다(****, MVAΔE3L(n=10) vs. PBS(n=10)을 위해 P < 0.0001).
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 중앙 생존기간을 23일로 더 연장하였다(**, MVAΔE3L-hFlt3L(n=10) vs. MVAΔE3L(n=10)을 위하여 P < 0.003). 이들 결과는 MVAΔE3L-hFlt3L이 양측 MC38 종양 이식 모델에서 MVAΔE3L보다 더 효과적임을 나타낸다.
실시예 9
MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 또한 쥐 삼중-음성 유방암 4T1 양측 이식 모델에서 효과적이다
B16-F10 쥐 흑색종 및 MC38 결장 선암종 모델에 더하여, 발명자들은 MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 삼중-음성 유방암(TNBC) 4T1 양측 종양 이식 모델의 치료에서 효능을 갖는지 여부를 조사하였다. 요약하면, 4T1 쥐 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포를 BALB/c 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피부내로 이식하였다(우측 옆구리에 2.5 x 105 및 좌측 옆구리에 5 x 104). 종양 이식 후 5일에, 우측 옆구리상의 더 큰 종양에 MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L(2 x 107 pfu)를 매주 2회 주사하였다. 마우스를 매일 모니터하고 종양 크기를 매주 2회 측정하였다. 마우스의 생존을 모니터하였다. MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 PBS-처리된 종양과 비교하여 주사된 종양의 종양 부피의 극적인 감소를 유도한 것으로 밝혀졌다(도 15a). 처리 후 18-일에 주사된 및 비-주사된 종양의 종양 부피를 나타내었다(도 15, b, c; P<0.0001, MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS). 더욱 중요하게는, 마우스의 평균 생존은 PBS-처리된 마우스에서의 18일에서 MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 마우스에서의 21일로 연장되었다(도 15d; P=0.0001, MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS). 이들 결과는 양측 4T1 유방암 모델에서의 MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 처리된 마우스의 종양 성장을 지연시키고 생존을 연장하는데 있어서 효과적임을 나타낸다. 본 발명에서 보유된 결과에 기초하여, MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L과 항-CTLA-4 또는 항-PD-1/PD-L1 항체와 같은 면역 관문 차단의 조합이 또한 이 양측 4T1 이식 모델에서 단독의 바이러스요법보다 더 효과적일 것으로 예상된다.
실시예 10
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 STING을 요구하는, 쥐 전립선암 TRAMP-C2 일측 종양 이식 모델에서 효과적이다
발명자들은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 쥐 전립선 선암종 TRAMP-C2 일측 종양 이식 모델의 처리에서 효능을 갖는지를 조사하였다. 요약하면, TRAMP-C2 세포를 STINGGt/Gt 마우스 및 연령-매치된 WT C57B/6 대조군의 면도된 우측 옆구리에 피부내로 이식하였다(50㎕의 PBS 내의 1 x 106 세포/마우스). 종양 이식 후 17일에, 우측 옆구리 상의 종양(약 3-4 mm 직경)에 PBS 또는 MVAΔE3L-hFlt3L(2 x 107 pfu)을 매주 2회 주사하였다. 마우스를 매일 모니터하고 종양 크기를 매주 2회 측정하였다. 마우스의 생존을 모니터하였다. MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 PBS-처리된 종양과 비교하여 WT 마우스에서 주사된 종양의 종양 부피의 극적인 감소를 유도하였으나, STING-결핍 마우스에서는 덜 효과적인 것으로 밝혀졌다(도 16, a-d). 초기 종양 부피 및 주사 후 24-일에 종양 부피를 각각 도 16 e 및 f에 나타내었다. MVAΔE3L-hFlt3L-주사된 종양의 평균 부피는 WT 마우스에서 118 mm3이고 STINGGt/Gt 마우스에서는 282 mm3인 한편, PBS-주사된 종양의 평균 부피는 WT 마우스에서는 338 mm3이고 STINGGt/Gt 마우스에서는 433 mm3인 것으로 관찰되었다(도 16f; P<0.0001, WT 마우스에서 MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS; P<0.0001, STINGGt/Gt 마우스에서 MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS). 이들 결과는 MVAΔE3L-hFlt3L이 WT와 STINGGt/Gt 마우스 둘 모두에서 항종양 효과를 갖지만, STINGGt/Gt 마우스에서보다 WT 마우스에서 더 효과적이었음을 나타낸다(도 16f; P<0.0001, MVAΔE3L-hFlt3L로 처리된 STINGGt/Gt vs. WT 마우스). 이 실험은 PCT 출원시에 계속 진행중이다. 생존 데이터는 실험의 마지막에 입수가능할 것이다. 이들 결과는 STING-의존성 세포액 DNA-센싱 경로가 이 일측 쥐 전립선 선암종 모델에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 항종양 효과를 매개하는데 있어서 중요한 역할을 함을 나타낸다. 발명자들은 이전에 STING-의존성 세포액 DNA-센싱 경로가 B16-F10 흑색종 모델에서 열-불활성화 MVA-매개 항종양 효과를 위해 중요함을 보고하였다(국제 특허 출원 WO/2016/144564호 참고). 열-MVA와 유사하게, MVAΔE3L은 대부분 세포액 DNA-센싱 경로를 통해 BMDC에서 타입 I IFN을 유도한다(Ref MVAΔE3L 가특허 출원). 여기서 발명자들은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 전립선 암 모델에서 STING에 의해 매개된 항종양 효과를 유도함을 확인하였다.
실시예 11
MVA-hFlt3L의 종양내 주사는 또한 양측 B16-F10 흑색종 이식 모델에서 효과적이다
MVA-hFlt3L의 종양내 주사가 양측 B16-F10 이식 모델에서 항종양 효과를 나타내는지를 시험하기 위하여, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 PBS를 1주에 2회 더 큰 종양내로 주사하고 종양 크기와 생존을 모니터하였다. 발명자들은 MVA-hFlt3L의 종양내 주사가 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 종양 성장을 박멸시키거나 지연시키며 중앙 생존기간을 PBS 그룹에서의 11일에서 MVA-hFlt3L 그룹에서의 28일로 연장하였음을 발견하였다(***, MVA-hFlt3L(n=8) vs. PBS(n=5)를 위해 P =0.0008)(도 17a 및 17c). 이 결과는 MVA-hFlt3L의 종양내 주사가 또한 양측 종양 이식 모델에서 종양에 대해 효과적임을 나타낸다.
실시예 12
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사와 면역 관문의 전신성 전달의 조합이 양측 B16-F10 흑색종 이식 모델에서 상승적 항종양 효과를 가진다
발명자들은 양측 B16-F10 및 MC38 종양 이식 모델에서 어느 한 작용제 단독에 비하여 불활성화 MVA의 종양내 주사와 면역 관문 차단제의 전신적 전달의 조합이 향상된 효능을 야기함을 이전에 보여주었다. 본 발명에서는, 발명자들은 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사와 면역 관문 차단제의 전신적 전달의 조합이 또한 양측 B16-F10 흑색종 이식 모델에서 바이러스요법 단독보다 더 나은 종양 사멸 및 개선된 생존을 야기하는지 여부를 시험하였다. 종양 이식 후 8일에, MVAΔE3L-hFlt3L 바이러스를 우측 옆구리상의 더 큰 종양내로 매주 2회 주사하였다. 4 그룹의 마우스를 MVAΔE3L-hFlt3L로 처리하였으며, 각 그룹은 이소타입 대조군, 또는 항-CTLA-4, 또는 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체가 복강내 전달되었다(도 17a, b). PBS-처리된 마우스는 PBS-모의 처리 후 6-14일에 증가하는 종양 성장을 가지고서 빨리 사망한 반면, MVAΔE3L-hFlt3L + 이소타입 대조군으로 처리된 마우스는 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두의 성장을 제거하거나 지연시켰다(도. 17a, b). 그 결과, MVAΔE3L-hFlt3L + 이소타입을 이용한 처리(n=9)는 PBS 그룹(n=5)에 비하여 그들의 생존을 유의하게 연장시켰다(도 17c, **, P = 0.0011). MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사와 항-CTLA-4, 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체의 전신성 전달의 조합은 MVAΔE3L-hFlt3L 단독의 종양내 주사보다 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두의 성장을 박멸하거나 지연시키는데 더 효과적이었다. MVAΔE3L-hFlt3L+ 항-CTLA-4로 처리된 마우스의 2/9, MVAΔE3L-hFlt3L+ 항-PD-1로 처리된 마우스의 3/9, 및 MVAΔE3L-hFlt3L+ 항-PD-L1로 처리된 마우스의 4/8가 처리 후 112일에 무종양이었던 한편, MVAΔE3L-hFlt3L+ 이소타입으로 처리된 마우스의 2/9가 무종양이었다(도 17, a-c). 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 단독의 복강내 전달은 B16-F10 흑색종 모델에서 최소의 치료 효과를 가졌다. 이들 결과는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 전달이 전이성 B16 흑색종 모델에서 면역 관문 차단제에 대한 치료 저항성을 극복하여, 개선된 항-종양 효과를 유도함을 나타낸다.
실시예 13
면역 관문의 전신성 전달과 조합된 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사로 처리된 생존 마우스는 상이한 종양 유형의 공격에 대해 면역을 발달시켰다
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사 후 생존 마우스가 상이한 종양 유형에 대해 면역을 발달시키는지를 평가하기 위하여, 발명자들은 그들을 피부내로 이식된 치사량의 MC38(1 x 105)로 재투여시험하였다. 상기 종양 또는 바이러스에 노출된 적이 없는 미자극 마우스(n=4)를 대조군으로 이용하였다. 모든 미자극 마우스가 종양을 발생시키고 34일의 중앙 생존기간으로 종양 이식 후 34-42일에 사망한 한편, 모든 MVAΔE3L-hFlt3L+ 면역 관문 차단제-처리된 생존 마우스는 이 실험에서 MC38 종양 공격을 거부하였다(도 17d). 이들은 MVAΔE3L-hFlt3L + 항-CTLA-4 그룹으로부터의 2마리 생존 마우스, MVAΔE3L-hFlt3L + 항-PD-1 그룹으로부터의 3마리, 및 MVAΔE3L-hFlt3L + 항-PD-L1 그룹으로부터의 4마리를 포함한다. 이들 결과는 면역 관문 차단제의 존재하에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 B16-F10 흑색종과 MC38 결장암 사이의 공통 항원의 효율적인 인식 및 상이한 종양에 대한 항-종양 면역의 발달을 가능하게 함을 제안한다.
실시예 14
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 항-CTLA-4 항체의 존재하에서 향상되는, 항종양 CD8 + T 세포 면역의 생성을 유도한다
본 발명자들은 생존 마우스가 MVAΔE3L-hFlt3L 종양내 주사 단독 또는 항-CTLA-4 항체의 복강내 전달의 존재하에서의 MVAΔE3L-hFlt3L 종양내 주사로 처리 후 B16-F10 및 MC38 결장암에 대한 항종양 기억 T 세포 면역을 발달시키는지 여부를 효소-연결 면역스팟(Enzyme-linked ImmunoSpot)(엘리스팟)을 이용하여 조사하였다. 요약하면, CD8+ T 세포를 비장세포로부터 단리하고 1 x 105 세포를 항-IFN-γ-코팅된 BD 엘리스팟 플레이트 마이크로웰에서 밤새 37℃에서 배양하였다. CD8+ T 세포를 γ-조사기로 조사된 B16-F10 또는 MC38 세포로 자극하고 사이토카인 분비를 항-IFN-γ 항체로 검출하였다. 미자극 마우스로부터의 CD8+ T 세포는 B16-F10 또는 MC38 세포에 대해 어떤 반응성도 나타내지 않았으나, MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 마우스로부터의 CD8+ T 세포는 B16-F10 및 MC38 세포 둘 모두에 대해 반응성을 나타냈다(도 18, a 및 b). 마우스가 B16-F10로 이식되고 이어서 MVAΔE3L-hFlt3L이 종양내로 처리되었지만 MC38 세포에 노출된 적이 없는 별도의 실험에서는, MC38 세포에 대한 유사한 반응성이 또한 관찰되었다(데이터 도시 안함). 이들 결과는 B16-F10의 치료를 위한 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 B16-F10 흑색종뿐만 아니라 무관한 종양 유형, 이 경우에는, MC38 결장 선암종에 대한 항종양 면역의 발달을 유도하였음을 나타낸다. 이것은 B16-F10을 위해 MVAΔE3L-hFlt3L로 처리된 생존 마우스가 또한 치사량의 MC38의 공격을 성공적으로 거부하였다는 인 비보 발견을 지지한다(실시예 3, 도 3d). 교차-보호는 또한 MVAΔE3L 또는 열-불활성화 MVA 또는 열-불활성화 백시니아가 종양내로 전달되었을 때도 관찰되었다(데이터 도시 안함). 교차-보호의 효능은 E3LΔ83N-TK--hFlt3L과 같은 복제 종양용해 바이러스가 사용되었을 경우 더 약했다(데이터 도시 안함). 면역원성 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 열-불활성화 백시니아 감염이 B16-F10 및 MC38 암 세포 둘 모두에 존재하는 종양 항원의 효율적인 교차-제시를 야기하여 이종성 종양의 교차-보호의 발달을 유도하는 것이 가능하다.
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사와 항-CTLA-4 항체의 복강내 전달의 조합으로 처리된 마우스는 바이러스 단독으로 처리된 것보다 훨씬 더 강한 항-B16-F10 및 항-MC38 CD8+ T 세포 반응을 발달시켰음이 관찰되었다(도 18, a 및 b, **, P < 0.01, ****, P <0.0001, MVAΔE3L-hFlt3L 단독 vs. MVAΔE3L-hFlt3L + 항-CTLA-4에 의해 유도된 항-B16-F10 또는 항-MC38 CD8+ T 세포 반응). 이들 결과는 항-CTLA-4 항체와 바이러스요법의 조합이 이펙터 T 세포 반응을 향상시킬 뿐만 아니라 기억 T 세포 반응을 향상시킴을 나타낸다.
실시예 15
열-불활성화 MVA의 종양내 주사는 양측 B16-F10 종양 이식 모델에서 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 타입 I IFN 및 염증성 사이토카인 및 케모카인을 유도한다
본 발명자들은 이전에 인 비트로에서 종양 세포 또는 수지상 세포의 열-불활성화 MVA(열-MVA) 또는 MVAΔE3L 감염이 타입 I IFN 및 전염증성 사이토카인과 케모카인 생산을 유도함을 보여주었다(국제 특허 출원 WO/2016/144564호 및 WO2016/168862호 참고). 열-MVA의 종양내 주사가 인 비보에서 타입 I IFN 및 전염증성 사이토카인과 케모카인을 유도할 수 있는지 시험하기 위하여, 발명자들은 하기 실험을 수행하였다. 요약하면, 2.5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 6-8주령 C57B/6 마우스의 좌측 옆구리에 그리고 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 우측 옆구리에 피부내 이식하였다. 이식 후 7일에, MVA(2 x 107 pfu) 또는 열-MVA, 또는 PBS를 우측 옆구리상의 더 큰 종양내로 주사하였다. 3일 후에 주사를 반복하였다. 첫번째 주사 후 제7일에 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두를 수집하고, 세포 현탁액을 생성하였다. 세포로부터 RNA를 추출하고 정량적 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 결과는 열-MVA의 종양내 주사가 주사된 종양과 비-주사된 종양 둘 모두에서 Ifnb, Il6, Ccl4, Ccl5, Cxcl9, 및 Cxcl10을 비롯한 유전자를 MVA보다 훨씬 더 높은 수준으로 유도하였음을 보여주었다(도 19). 이것은 아마도 열-MVA가 MVA보다 주사된 종양에서 면역 및 종양 세포 둘 모두에서 cGAS/STING-매개 세포액 DNA-센싱 기전을 활성화시키는 능력이 더 높기 때문이다. 열-MVA의 종양내 주사가 비-주사된 종양에서 광범위한 사이토카인과 케모카인 생산을 유도할 수 있었다는 관찰은 흥미롭다. 이것은 종양-특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포 둘 모두가 주사된 및 비-주사된 종양으로 보충되고 활성화되어, 종양 세포의 사멸을 야기한다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 종양 DNA의 방출은 수지상 세포, 대식세포 및 단핵구를 비롯한 면역 세포에서 cGAS/STING 세포액 DNA-센싱 경로에 의해 감지되어, Ifnb, Il6, Ccl4, Ccl5, Cxcl9, 및 Cxcl10 유전자 발현의 유도를 야기할 수 있다.
E3는 면역 회피 병독성 인자이므로, MVAΔE3L은 cGAS/STING-의존성 세포액 DNA-센싱 경로와 MDA5/MAVS-의존성 세포액 dsRNA-센싱 경로 둘 모두의 활성화를 통해, 면역 세포와 종양 세포 둘 모두에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN 및 전염증성 사이토카인과 케모카인을 유도한다. 본 발명의 결과에 비추어, 발명자들은 MVAΔE3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사가 인 비보에서 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN 및 전염증성 사이토카인과 케모카인을 유도할 것으로 예상한다. STING 또는 Batf3의 존재하에서, 열-MVA의 종양내 주사에 의해 유도된 항-종양 T 세포 반응은 유의하게 약해진다(WO/2016/144564, 그 전체가 참고로 포함됨). 또한, MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 WT 마우스에서 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에의 Ly6ChiCD11b- 세포의 유입을 유도하였지만, 이 세포 유형의 유입은 Batf3-/- 마우스에서 유의하게 감소되었다(실시예 7, 도 13 c 및 d). 발명자들은 또한 주사된 및 비-주사된 종양 둘 모두에서의 MVAΔE3L-hFlt3L 유도된 Ifnb, Il6, Ccl4, Ccl5, Cxcl9, 및 Cxcl10 유전자 발현이 STING- 또는 Batf3-결핍 마우스에서 감소될 것으로 예상한다.
실시예 16
열-불활성화 MVA의 종양내 주사는 종양 배출 림프절(TDLN)에서 항-흑색종 CD8 + T 세포 반응을 유도한다
열-MVA의 종양내 전달은 TDLN에서 활성화된 CD8+ T 세포의 유도를 야기하는 것으로 나타났으며, 그들이 항-종양 T 세포 또는 항바이러스 T 세포인지는 불명확하다(그 전체가 참고로 포함되는 WO/2016/144564). 열-MVA의 종양내 주사가 활성화된 종양-특이적 CD8+ T 세포의 유도를 야기하는지 시험하기 위하여, 발명자들은 멜라닌세포 항원 TRP-2 면역원성 펩티드에 반응하는 CD8+ T 세포를 검출하기 위해 TRP-2 사량체 분석을 이용하였다. 요약하면, WT C57B/6 및 Batf3-/- 마우스에 B16-F10을 피부내로 이식하였다. 종양이 직경 4 mm일 때, 그들을 3일 간격으로 두 번 열-MVA의 피부내 주사로 처리하였다. 처음 주사 후 7일에, TDLN을 항온처리하고 세포 현탁액을 제조하고 실온에서 30분 동안 항-FcγR II(2.4G2) 항체 및 PE-H-2 Kb TRP2(SVYDFFVWL) 사량체(MBL)로 항온처리하고, 항-CD3 및 항-CD8 항체로 염색하였다. 세포를 FACS에 의해 분석하였다. 열-MVA의 종양내 주사는 PBS 대조군에 비하여 TDLN에서 TRP-2 사량체 양성 CD8+ T 세포의 비율을 증가시킴이 관찰되었다(도 20, a 및 b, *, P<0.05, 열-MVA에서의 9% vs. PBS-처리된 마우스에서의 1.6%). 이러한 유도는 Batf3-결핍 마우스에서는 감소하였다(도 20, a 및 b, *, P<0.05, 열-MVA-처리된 WT 마우스에서 9% vs. 열-MVA-처리된 Batf3-/- 마우스에서 1.1%). 이들 결과는 열-MVA의 종양내 주사가 항-종양-특이적 CD8+ T 세포 반응을 야기하며, 이것은 Batf3-의존성 DC를 요구함을 나타낸다. 본 명세서의 실험 증거에 비추어, 발명자들은 유사한 결과가 MVAΔE3L-hFlt3L 바이러스에서 얻어질 것으로 예상한다.
실시예 17
MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 일측 종양 이식 모델에서 대형의 확립된 B16-OVA 흑색종의 치료에서 효과적이다
본 발명자들은 대형의 확립된 B16-OVA 일측 종양 이식 모델에서 MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사의 항-종양 효능을 열-불활성화 MVA(열-MVA) 또는 폴리(I:C)와 비교하였다. 이 실험에서는, 오브알부민(OVA)을 구성적으로 발현하는 B16-OVA 흑색종(50 ㎕의 부피 내에 5x 105 세포)을 WT C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리상의 면도된 피부내로 피부내 이식하였다. 이식 후 9일에, 종양 크기를 측정하고 직경이 5-6 mm인 종양에 MVAΔE3L-hFlt3L(2 x 107 pfu), 또는 열-iMVA(2 x 107 pfu의 MVA의 등가량), 또는 폴리(I:C)를, 또는 PBS를 매주 2회 주사하였다. 마우스를 매일 모니터하고 종양 크기를 1주에 2회 측정하였다(도 21a). MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 주사는 모든 처리된 마우스에서 종양 성장을 지연시키는데 효과적이었다(도 21b). 이것은 또한 PBS-처리된 마우스에서의 9일에서 MVAΔE3L-hFlt3L-처리된 마우스에서의 23일로 중앙 생존기간을 연장시켰다(도 21d, P<0.0001, MVAΔE3L-hFlt3L vs. PBS). 주사가 시작되었을 때의 초기 종양 부피는 각 실험 그룹에서 유사하여, 평균 종양 부피는 45 mm3였다(도 21c). 대형의 확립된 종양에서 열-MVA의 종양내 주사는 또한 효과적이었으며 열-MVA-처리된 마우스의 중앙 생존기간은 26.5 일로 연장되었다(도 21d, P<0.0001, 열-MVA vs. PBS). 합성 dsRNA인 폴리(I:C)는 선천적 면역 아고니스트이다. 세포외 폴리(I:C)는 엔도솜 국소화 톨-유사 수용체 3(TLR3)을 활성화시킬 수 있는 한편, 세포내 폴리(I:C)는 세포액 dsRNA 센서 흑색종 분화-연합 단백질 5(MDA5)를 활성화시킬 수 있다. 종양 미세환경내의 CD103+ DC 및 종양 배출 림프절내의 CD8+ DC가 더 높은 수준의 TLR3을 발현하므로, 폴리(I:C)는 교차-제시 DC를 위해 효과적인 면역 조절자일 수 있다(Salmon et al., Immunity 2016). 폴리 I:C(50 ㎍/마우스)의 매주 2회 종양내 주사는 또한 이 대형의 확립된 일측 B16-F10 흑색종 모델에서 종양 수축을 유도하였다(도 21b). 이것은 또한 중앙 생존기간을 PBS-처리된 마우스에서의 9일에서 폴리(I:C)-처리된 마우스에서의 17일로 연장하였다(도 21d, P<0.0001, 폴리(I:C) vs. PBS). 그 차이가 통계적으로 유의하지 않았지만, 폴리(I:C)는 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 열-MVA보다 덜 강력한 것으로 보였다(도 21d). 또한, 폴리(I:C)로 처리된 마우스는 피로와 소모를 비롯한 전신 질환을 나타냈다. 아마도 종양내로 전달된 폴리(I:C)가 전신 순환계내로 누출되어 면역-관련 부작용을 야기하였을 것이다. 이 실험으로부터의 결과는 MVAΔE3L-hFlt3l 또는 열-MVA의 종양내 주사가 일측 이식 모델에서 대형의 확립된 고도로 공격적인 B16-OVA의 치료에서 효과적임을 보여주었다.
실시예 18
열-불활성화 MVA의 종양내 주사와 면역 관문 항체의 전신성 전달의 조합은 대형의 확립된 흑색종 일측 이식 모델에서 항종양 효능을 개선한다
발명자들은 열-불활성화 MVA(열-MVA)의 종양내 주사와 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체와 같은 면역 관문 차단제의 전신성 전달의 조합이 일측 종양 이식 모델에서 대형의 확립된 B16-F10을 박멸시키는데 있어서 향상된 효능을 갖는지를 추가로 시험하였다. 요약하면, B16-F10 흑색종 세포(5x 105 세포)를 WT C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리상의 면도된 피부내로 피부내 이식하였다. 이식 후 9일 후에, 직경이 5-6 mm인 종양에 열-MVA(2 x 107 pfu의 MVA의 등가량), 또는 PBS를 주사하였다. 마우스를 또한 항-CTLA-4 항체(100 ㎍/마우스), 항-PD-1 항체(250 ㎍/마우스), 또는 항-PD-L1(200 ㎍/마우스)의 복강내 전달로 매주 2회 처리하였다. 마우스를 매일 모니터하고 종양 크기를 매주 2회 측정하였다(도 22a). 열-MVA의 종양내 주사는 모든 처리된 마우스에서 종양 성장 지연에서 효과적이었으며 처리된 마우스의 1/10에서 종양 박멸에 효과적이었다(도 22b). 이것은 또한 중앙 생존기간을 PBS-처리된 마우스에서의 6일에서 열-처리된 마우스에서의 27일로 연장하였다(도 22d, ****, P<0.0001, 열-MVA vs. PBS). 주사가 시작되었을 때 평균 초기 종양 부피는 PBS 그룹에서는 76 mm3이고 열-MVA + 이소타입 그룹에서는 55 mm3이었다(도 22c, *, P<0.05, 열-MVA vs. PBS). 면역 관문 차단 항-CTLA-4 또는 항-PD-1의 존재하에서 열-MVA의 종양내 주사는 10마리 처리된 마우스 중에 4마리를 치유하였으나(도 22d), 열-MVA의 종양내 주사와 항- 항-PD-L1의 조합은 대형의 확립된 종양의 80% 치유를 야기하였다(도 22d, *, P<0.05, 열-MVA + 항-PD-L1 vs. 열-MVA + 항-CTLA-4 또는 열-MVA + 항-PD-1; **, P < 0.01, 열-MVA + 항-PD-L1 vs. 열-MVA + 이소타입). 이들 결과는 열-MVA의 종양내 주사와 면역 관문 차단제의 조합이 일측 이식 모델에서 대형의 확립된 빈약한 면역원성의 B16-F10의 치료에서 바이러스요법 단독보다 더 효과적임을 보여주었다. 열-MVA와 항-PD-L1 항체의 조합이 시험된 모든 조합 중 가장 강력한 것으로 보인다. MVAΔE3L-hFlt3L이 이 대형의 확립된 종양 모델에서 열-MVA와 유사한 효능을 가졌으므로(실시예 18, 도 21), MVAΔE3L-hFlt3L의 종양내 전달과 면역 관문 차단제의 조합이 흑색종 및 다른 고형 종양 모델에서 MVAΔE3L-hFlt3L 단독보다 향상된 항종양 효능을 가질 것으로 예상된다.
상기 설명, 실시예 및 데이터는 본 발명의 조성물의 제조와 사용의 완전한 설명을 제공한다. 하지만, 이들은 예시적이며 비제한적이다. 본 발명의 넓이는 청구범위에 있다.
본원에서 인용된 모든 특허와 문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함된다. 본 명세서에 개시된 임의의 실시형태 또는 청구 특징은 출원인의 재량으로 포기될 수 있다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER <120> RECOMBINANT MVA OR MVA-DELTA-E3L EXPRESSING HUMAN FLT3L AND USE THEREOF AS IMMUNO-THERAPEUTIC AGENTS AGAINST SOLID TUMORS <130> 11000/005154-WO2 <140> <141> <150> 62/418,788 <151> 2016-11-08 <150> 62/418,786 <151> 2016-11-07 <150> 62/300,066 <151> 2016-02-25 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 tgtgaagacg ataaattaat gatc 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 ttgtcatcat gaacggcgga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 tccttcgttt gccatacgct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gaacgggact atggacgcat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 tcggtttcct cacccaatcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 acctgatgga taaaaaggcg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 ggcattgtgg tctacagcct 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 gtgtttcaca gtccgtttcc g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 aacgacctat ctcctcctgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 gggctgaaag gcacatttgg 20

Claims (47)

  1. (i) 인간 Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드(hFlt3L)를 보유하는 MVA(MVA-hFlt3L); 및 (ii) hFlt3L을 보유한 MVAΔE3L(MVAΔE3L-hFlt3L)로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 변형 백시니아 안카라(Ankara)(MVA) 바이러스를, 악성 고형 종양에 걸린 대상의 종양 세포에 전달될 때, 종양을 치료하기에 효과적인 양으로 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 종양의 치료는 하기 중 하나 이상에 의해 나타나는 조성물: 대상에서 종양에 대한 면역 반응의 유도, 또는 대상에서 종양에 대해 진행중인 면역 반응의 향상 또는 촉진, 종양의 크기 감소, 종양의 박멸, 종양의 성장 억제, 종양의 전이 억제 및 전이성 종양의 감소 또는 박멸.
  3. 제1항에 있어서, 면역 반응의 유도, 향상 또는 촉진은 하기 중 하나 이상을 포함하는 조성물:
    CD8+ 세포독성 T 세포의 증식 및 활성화;
    CD4+ 이펙터 T 세포의 증식 및 활성화;
    CD8+/Treg 및 Tconv/Treg의 비의 증가;
    주사된 종양 및 원격 종양에서 CD45+ 세포 및 CD8+ T 세포의 동원;
    주사된 종양 및 원격 종양에서 종양-관련 대식세포(TAM)의 감소;
    주사된 종양 및 원격 종양내로 Ly6ChiCD11b+ 염증성 단핵구 및 Ly6ChiCD11b- 골수 세포의 유입;
    타입 IFN 및 전염증성 사이토카인의 생산을 통해, 주사된 종양 및 원격 종양에서 교차-제시 CD103+ 수지상 세포의 활성화 및 이동; 및
    항-종양 CD8+ T 세포의 생성 및 이종성 종양(들)에 대한 교차-보호.
  4. 제1항에 있어서, 재조합 MVA는 종양 항원을 인코딩하거나 발현하는 핵산을 보유하고 있지 않은 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 약학적 허용 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 하나 이상의 부형제는 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균 작용제, 등장제, 흡수 지연제 및 전술한 것 중 둘 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항에 있어서, 재조합 MVA는 MVAΔE3L-hFlt3L을 포함하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 인간 Flt3L을 인코딩하고 발현하는 티미딘 키나제가 결실된 복제 가능 재조합 약독화 백시니아 바이러스의 제2의 양을 추가로 포함하되, 상기 제2의 양은 유도되거나 향상되거나 촉진된 면역 반응을 증대시키는데 기여하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항, 제7항 및 제8항중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 제3의 양의 불활성화 MVA를 추가로 포함하되, 상기 제3의 양은 유도되거나 향상되거나 촉진된 면역 반응을 증대시키는데 기여하는 조성물.
  10. MVA-hFlt3L 및 MVAΔE3L-hFlt3L 및 그 조합의 군으로부터 선택된 재조합 MVA 바이러스를 종양의 세포에 전달하여 종양을 치료하는 것을 포함하는, 악성 고형 종양에 걸린 대상을 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스의 양은 하기 중 하나 이상을 야기하기에 효과적인 방법: 대상의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하거나 면역계에 의해 진행중인 종양에 대한 면역 반응을 향상시키거나 촉진함; 종양 크기의 감소; 종양의 박멸; 종양의 성장 억제; 종양의 전이 억제; 및 전이성 종양의 감소 또는 박멸.
  12. 제11항에 있어서, 종양에 대한 면역 반응은 하기 중 하나 이상을 이루는 방법:
    CD8+ 세포독성 T 세포의 증식 및 활성화;
    CD4+ 이펙터 T 세포의 증식 및 활성화;
    CD8+/Treg 및 Tconv/Treg의 비의 증가;
    주사된 종양 및 원격 종양에서 CD45+ 세포 및 CD8+ T 세포의 동원;
    주사된 종양 및 원격 종양에서 종양-관련 대식세포(TAM)의 감소;
    주사된 종양 및 원격 종양내로 Ly6ChiCD11b+ 염증성 단핵구 및 Ly6ChiCD11b- 골수 세포의 유입;
    타입 IFN 및 전염증성 사이토카인의 생산을 통해, 주사된 종양 및 원격 종양에서 교차-제시 CD103+ 수지상 세포의 활성화 및 이동; 및
    항-종양 CD8+ T 세포의 생성 및 이종성 종양(들)에 대한 교차-보호.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MVA 또는 MVAΔE3L은 종양 항원을 인코딩하거나 발현하는 핵산을 보유하고 있지 않은 방법.
  14. 제13항에 있어서, 재조합 MVA는 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차적 조합에 의해 전달되는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 종양은 흑색종 또는 결장 암종인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 재조합 MVA의 전달은 수 주, 수 개월 또는 수 년동안 또는 효과가 지속되는 한 무기한으로 또는 최대 내약 용량이 도달할 때까지 계속되는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 재조합 MVA의 전달은 종양내 주사에 의한 것인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 대상은 인간인 방법.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 MVA는 투여당 약 106 - 1010 플라크 형성 단위(pfu)의 범위내, 바람직하게는 약 107 내지 약 109 플라크 형성 단위(pfu)의 범위 내의 투여량으로 전달되는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 전달된 양은 모든 종양 세포를 감염시키기에 충분한 방법.
  21. 제13항 내지 제19항 중 한 항 이상에 있어서, 전달은 한 달에 한번 내지 1주에 2회 범위 내의 빈도로 반복되는 방법.
  22. 제13항 내지 제19항에 있어서, 전달은 매주 한번 반복되는 방법.
  23. 제13항 내지 제19항에 있어서, 흑색종은 전이성 흑색종인 방법.
  24. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항 이상에 있어서, 재조합 MVA는 MVAΔE3L-hFlt3L인 방법.
  25. 하기 면역학적 효과 중 적어도 하나를 야기하기에 효과적인, MVA-hFlt3L, MVAΔE3L-hFlt3L 또는 둘의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 변형 백시니아 바이러스 안카라(MVA)의 양을 대상의 종양에 전달하는 것을 포함하는, 대상에서 고형 악성 종양을 치료하는 방법:
    CD8+ 세포독성 T 세포의 증식 및 활성화;
    CD8+ 세포독성 T 세포의 증식 및 활성화;
    CD8+ 세포독성 T 세포의 증식 및 활성화;
    CD4+ 이펙터 T 세포의 증식 및 활성화;
    CD8+/Treg 및 Tconv/Treg의 비의 증가;
    주사된 종양 및 원격 종양에서 CD45+ 세포 및 CD8+ T 세포의 동원;
    주사된 종양 및 원격 종양에서 종양-관련 대식세포(TAM)의 감소;
    주사된 종양 및 원격 종양내로 Ly6ChiCD11b+ 염증성 단핵구 및 Ly6ChiCD11b- 골수 세포의 유입;
    타입 IFN 및 전염증성 사이토카인의 생산을 통해, 주사된 종양 및 원격 종양에서 교차-제시 CD103+ 수지상 세포의 활성화 및 이동; 및
    항-종양 CD8+ T 세포의 생성 및 이종성 종양(들)에 대한 교차-보호.
  26. 하기 중 하나 이상을 이루기 위하여, 대상의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하거나 종양에 대한 상기 대상의 진행중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하기에 효과적인 양의, MVA-hFlt3L 또는 MVAΔE3L-hFlt3L 또는 그 조합을 대상의 종양 세포에 전달하는 것을 포함하는, 대상에서 고형 악성 종양을 치료하는 방법: 종양의 크기 감소, 종양 박멸, 종양의 성장 억제, 종양의 전이성 성장 억제, 종양 세포의 어팝토시스 유도 또는 대상의 생존 연장.
  27. 대상의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하거나 종양에 대한 상기 대상의 진행중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하기에 효과적인 양의, MVA-hFlt3L, MVAΔE3L-hFlt3L 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스를 대상의 종양 세포에 전달하고, 종양 내에서 면역 억제 기전을 차단하기에 효과적인 면역 관문 차단제 또는 면역 관문 아고니스트의 제2의 양을 대상에게 공동으로 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 악성 종양을 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 관문 억제제 또는 관문 아고니스트의 투여는 비경구 경로에 의한 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 전달은 종양내 주사에 의한 것이고, 투여는 정맥내 경로에 의한 것인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 전달 및 투여 둘 모두가 정맥내 경로에 의한 것인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 전달 및 투여 둘 모두는 종양내 주사에 의한 것인 방법.
  32. 제27항에 있어서, 면역 관문 차단제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, CTLA4 억제제, LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIM3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신(Mucin)-3), B7-H3, 및 TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 가진 T-세포 면역수용체)에 대한 억제성 항체; CD80, CD86, PDL2, B7-H4, II 및 DLBCL 억제제, BTLA, 또는 임의의 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 면역 관문 아고니스트는 항-ICOS 항체, 항-OX40 항체, 4-1BB(CD 137)에 대한 그리고 GITR에 대한 아고니스트 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  33. 제27항에 있어서, 종양은 원발성 또는 전이성 흑색종 또는 원발성 또는 전이성 결장 암종인 방법.
  34. 제27항에 있어서, 각각 간격을 두고 그 자신의 투여 스케쥴에 따라, 바이러스가 전달되고 면역 관문 차단제가 투여되는 방법.
  35. 제27항에 있어서, 바이러스의 첫번째 적용량(dose)이 먼저 전달되고 시간의 경과 후 면역 관문 차단제의 첫번째 적용량이 투여되는 방법.
  36. 제27항에 있어서, 전달과 투여는 동일한 전체 기간 동안 병행하여 발생하는 방법.
  37. 제27항에 있어서, 바이러스와 면역 관문 차단제 중 하나 또는 둘 모두는 각각 수 주, 수 개월 또는 수 년의 기간 동안, 또는 효과가 지속되고 최대 내약 용량에 도달하지 않는 한 무기한으로 전달되고 투여되는 방법.
  38. 제27항에 있어서, 바이러스와 면역 관문 차단제는 동시에 투여되는 방법. 제61항에 있어서, 바이러스와 면역 관문 차단제는 동일한 조성물로 투여되는 방법.
  39. 제27항에 있어서, 재조합 MVA 및 면역 관문 차단제는 종양내로 전달되는 방법.
  40. 제27항에 있어서, 재조합 MVA 및 면역 관문 차단제는 순차적으로 투여되는 방법.
  41. 제13항 또는 제25항에 있어서, 인간 Flt3L을 인코딩하고 발현하며 티미딘 키나제가 결실된 복제 가능 재조합 약독화 백시니아 바이러스, 또는 불활성화 MVA, 또는 둘 모두를 각각 제2 및 제3의 양으로 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하며, 상기 제2의 양 또는 제3의 양 또는 둘 모두는 유도되거나 향상되거나 촉진된 면역 반응의 증대에 기여하는 방법.
  42. 1) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 제1 성분;
    2) 각각 제2 및 제3의 양으로, GM-CSF 또는 인간 Flt3L을 인코딩하고 발현하는 티미딘 키나제가 결실된 복제 가능 재조합 약독화 백시니아 바이러스 및 불활성화 MVA 중 하나 또는 둘 모두를 포함하되, 상기 제2의 양 또는 제3의 양 또는 둘 모두는 상기 대상에서 유도되거나 향상되거나 촉진된 면역 반응의 증대에 기여하는 제2 성분
    을 포함하는 키트.
  43. 대상의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하기에 효과적인 양의, MVA-hFlt3L, MVAΔE3L-hFlt3L 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로 이전에 치료되거나 투약되었던 대상에서 악성 종양을 치료하는 방법으로서, 종양 세포, 기질 세포 또는 종양 침윤성 면역 세포에 의해 유발된 종양 내의 면역 억제 기전을 차단하기에 효과적인 면역 관문 차단제의 양을 대상의 대상 종양 세포에 전달하는 것을 포함하는 방법.
  44. 종양 세포, 기질 세포 또는 종양 침윤성 면역 세포에 의해 유발된 종양 내의 면역 억제 기전을 차단하기에 효과적인 면역 관문 차단제의 양으로 이전에 치료되거나 투약되었던 대상에서 악성 종양을 치료하는 방법으로서, 대상의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하기에 효과적인 양을 대상의 종양 세포에 전달하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 면역 관문 차단제는 CTLA-4, CD80, CD86, PD-1, PDL1, PDL2, LAG3, B7-H3, B7-H4, TIM3, ICOS, II DLBCL 억제제, BTLA, 또는 임의의 그 조합을 포함하는 방법.
  46. 제43항, 제44항 또는 제45항에 있어서, 면역 관문 차단제는 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, AMP-224, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB 00107180, 또는 임의의 그 조합을 포함하는 방법.
  47. 단리되고, 악성 고형 종양에 대한 면역요법제로서 사용하기에 적합한, 인간 Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드(hFlt3L)을 발현하도록 변형된, 백시니아 병독성 인자 E3가 결실된 재조합 변형 백시니아 안카라 바이러스(MVAΔE3L).
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