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KR20180093636A - dCas9/gRNA 복합체와 형광표지인자를 이용한 표적 유전자 검출 방법 - Google Patents

dCas9/gRNA 복합체와 형광표지인자를 이용한 표적 유전자 검출 방법 Download PDF

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KR20180093636A
KR20180093636A KR1020170020000A KR20170020000A KR20180093636A KR 20180093636 A KR20180093636 A KR 20180093636A KR 1020170020000 A KR1020170020000 A KR 1020170020000A KR 20170020000 A KR20170020000 A KR 20170020000A KR 20180093636 A KR20180093636 A KR 20180093636A
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gene
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김주옥
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한국생명공학연구원
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Abstract

본 발명은 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 표적 유전자를 포함하는 시료를 반응시키는 제1단계; 상기 반응물을 분리하는 제2단계; 및 형광표지인자를 처리하는 제3단계를 포함하는 표적 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 표적 유전자 검출 방법은 PCR을 수행하지 않고도 높은 감도로 표적 유전자의 검출이 가능하고, 별도의 유전자 분리 단계를 거치지 않고도 신속하면서도 정확하게 표적 유전자를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

dCas9/gRNA 복합체와 형광표지인자를 이용한 표적 유전자 검출 방법{Method for detecting a target gene using a dCas9/gRNA complex and fluorescence marker}
본 발명은 dCas9/gRNA 복합체와 형광표지인자를 이용한 표적 유전자 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 표적 유전자를 포함하는 시료를 반응시키는 제1단계; 상기 반응물에서 상기 복합체를 분리하는 제2단계; 및 형광표지인자를 처리하는 제3단계를 포함하는, 표적 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
지금까지 유전자를 검출하는 기술은 PCR 방법을 기초로 하는 방법들이 보고되어 왔다. 직접 PCR을 이용한 SDT/RT-PCR (simple-direct tube RT-PCR) 방법 및 PCR 반응을 저해시키는 요소를 제거하고 민감도를 높이기 위해서 면역학적 방법을 결합한 IC/RT-PCR (Immunocapture RT-PCR) 등이 개발되어 유전자 검출에 이용되어 왔다.
특히, 병원균 감염으로 인한 질병에 초기 대처 및 질병의 진행, 확산을 막기 위해서는 병원균의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하는 것이 필요하다. 감염 후 증상이 나타나기 전인 잠복기 때 병원균을 진단할 수 있다면 전염병의 확산을 효과적으로 예방하여 큰 피해를 막을 수 있다.
다만, 현재까지 개발된 방법들은 확인하고자 하는 유전자를 검출하기 위해 반드시 표적 유전자를 추출해야 하는 샘플의 준비과정이 까다롭고, 세포를 배양하는 경우 많은 시간이 소모되는 단점이 있다. 나아가, 신속한 진단법의 부재와 정확성의 결여로 약물의 오남용이 지속적으로 행해지는 문제가 있다. 따라서, 신속하면서도 정확한 유전자 검출에 대한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 신속하면서도 정확한 유전자 검출 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, PCR이 필수적으로 수반되어야 하거나 유전자만을 분리하여 분석하는 기존의 유전자 진단법과는 달리, 별도의 유전자 분리 단계 및 PCR 과정을 수행하지 않고도 높은 감도로 표적 유전자의 검출이 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
국내공개특허 제10-2013-0094498호
본 발명의 하나의 목적은 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 표적 유전자를 포함하는 시료를 반응시키는 제1단계; 상기 반응물에서 상기 복합체를 분리하는 제2단계; 및 형광표지인자를 처리하는 제3단계를 포함하는, 표적 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 표적 유전자를 포함하는 세포를 용해시키는 제1단계; 상기 용해물을 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 반응시키는 제2단계; 상기 반응물에서 상기 복합체를 분리하는 제3단계; 및 형광표지인자를 처리하는 제4단계를 포함하는, 표적 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 표적 유전자를 포함하는 시료를 반응시키는 제1단계; 상기 반응물에서 상기 복합체를 분리하는 제2단계; 및 형광표지인자를 처리하는 제3단계를 포함하는, 표적 유전자를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 표적 유전자를 검출함에 있어서, 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 형광표지인자를 사용하는 경우 DNA의 증폭 과정을 필수적으로 포함하는 기존의 분자진단 방법의 복잡한 절차를 간소화함과 동시에, 감도가 낮은 면역진단의 단점을 극복할 수 있음을 확인하여 신속하면서도 감도가 높은 표적 유전자 특이적 검출 방법을 완성하였다.
본 발명의 표적 유전자를 검출하는 방법은 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 표적 유전자를 포함하는 시료를 반응시키는 제1단계를 포함한다.
상기 제1단계는 표적 유전자를 포함하는 2 이상의 유전자가 포함된 시료와 상기 복합체를 반응시키는 단계이며, 상기 반응을 통해 표적 유전자와 복합체가 결합된 결합물, 반응하지 않은 표적 유전자 이외의 유전자 및 반응하지 않은 복합체를 포함하는 반응물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체는 표적 유전자의 검출 방법을 수행하기 전 형성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 제1단계의 수행시 dCas9과 가이드 RNA가 순차적으로 또는 함께 시료와 반응하여 형성될 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료"는 표적 유전자를 포함하는 임의의 시료를 의미한다.
본 발명에서 용어 "가이드 RNA"는 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 서열을 포함하는 RNA로서, 본 발명 상기 가이드 RNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)로 구성될 수 있다.
crRNA는 표적 유전자와 결합할 수 있다.
tracrRNA는 crRNA와 결합하여 dCas9 단백질의 구조를 변화시키는 역할을 할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA의 역할을 유지하면서 하나의 가닥으로 연결된 sgRNA일 수 있다.
본 발명에서 용어 "특이적 결합"은 혼성화와 혼용되어 사용될 수 있다.
가이드 RNA가 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 것은 표적 유전자와 상보적인 서열의 가이드 RNA가 표적 유전자의 단일 가닥의 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자(혼성체)를 형성하는 것을 의미할 수 있다.
상기 가이드 RNA의 표적 유전자와 상보적인 서열은 표적 유전자의 일부분과 혼성화될 수 있고, 상기 상보적인 서열은 표적 유전자의 일부분과 90 % 이상, 구체적으로는 95 % 이상, 보다 구체적으로는 100 % 상보적인 서열일 수 있다.
본 발명에서 용어 "불활성화된 Cas9"은 뉴클레아제의 기능이 불활성화된 Cas9 뉴글레아제 단백질로서, dCas9으로도 명명될 수 있다. 불활성화된 Cas9 단백질의 제조는 뉴클레아제의 활성을 불활성화시키는 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 Cas9 단백질 및 이의 유전자 정보는 NCMBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
본 발명의 표적 유전자를 검출하는 방법은 반응물에서 복합체를 분리하는 제2단계를 포함한다.
상기 제2단계가 dCas9 단백질을 포함하는 복합체와 시료의 반응물로부터 복합체를 분리하는 단계인 특성상, 상기 dCas9 단백질은 목적에 따라 분리 또는 정제에 사용되는 친화성 태그(tag)를 포함할 수 있다.
상기 친화성 태그는 His 태그, Flag 태그, S 태그, GST(Glutathione S-transferase) 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그, CMP (chitin binding protein) 태그, Avi 태그, 칼모듈린 (calmodulin) 태그, 폴리글루타메이트 (polyglutamate) 태그, E 태그, HA 태그, myc 태그, SBP 태그, 소프태그 1 (softag 1), 소프태그 3(softag 3), 스트랩 (strep) 태그, TC 태그, Xpress 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier pretein) 태그, 및 GFP (green fluorescent protein) 태그를 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 dCas9 단백질은 His 태그를 포함할 수 있다.
상기 제2단계는 상기 태그에 결합하는 자성 비드(magnetic bead)를 이용하여 복합체를 분리할 수 있으며, 상기 자성 비드는 Ni-NTA 자성 비드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 표적 유전자를 검출하는 방법은 분리된 복합체에 형광표지인자를 처리하는 제3단계를 포함한다.
상기 제3단계는 분리된 복합체에 형광표지인자를 처리하는 단계로서, 복합체들 중에서 표적 유전자와 결합된 복합체만 특이적으로 형광신호를 갖게 하여 표적 유전자를 검출할 수 있다.
상기 표적 유전자와 결합된 복합체는 표적 유전자와 결합하지 않은 복합체와 달리 이중 가닥 DNA를 갖는 구성으로, 이중 가닥 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 형광표지인자로 표적 유전자와 결합된 복합체를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형광표지인자"는 핵산을 착색시키는데 사용되는 형광물질로서, 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는다. 본 발명에서 상기 형광표지인자는 복합체와 결합한 표적 유전자의 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 형광표지인자는 이중 가닥 DNA를 검출하는데 사용되는 형광표지인자일 수 있다.
구체적으로, 사이버 그린 Ⅰ(SYBR green Ⅰ), 사이버 그린 Ⅱ(SYBR green Ⅱ), 사이버 골드(SYBR gold), 옥사졸 옐로우(Oxazole yellow, YOYO) 및 티아졸 오렌지(Thiazole orange)를 포함하는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, sgRNA와 dCas9의 복합체를 표적 유전자를 비롯하여 다양한 유전자가 포함된 시료와 반응시킨 후 dCas9 단백질의 His 태그를 이용하여 자성 비드로 복합체를 분리한 뒤 용리한 샘플에 SYBR green Ⅰ을 처리하였다. 형광신호를 관찰한 결과, 표적 유전자에서 특이적으로 강한 형광 신호가 검출됨을 확인하여, 상기 방법을 통해 표적 유전자를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 2).
또한 본 발명은 다른 하나의 양태로서, 표적 유전자를 포함하는 생물학적 시료를 용해시키는 제1단계; 상기 용해물을 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 반응시키는 제2단계; 및 상기 반응물에 형광표지인자를 처리하는 제3단계를 포함하는, 표적 유전자를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 표적 유전자를 검출함에 있어서, 세포의 용해물로부터 유전자를 분리하는 단계를 거치지 않으면서도 높은 감도로 표적 유전자를 특이적으로 검출하는 방법을 완성하였다.
본 발명의 표적 유전자를 검출하는 방법은 표적 유전자를 포함하는 생물학적 시료를 용해시키는 제1단계를 포함한다.
상기 제1단계는 생물학적 시료 내에 존재하는 표적 유전자가 불활성화된 Cas9 및 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 결합할 수 있는 상태를 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체는 표적 유전자의 검출 방법을 수행하기 전 형성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 제1단계의 수행시 dCas9과 가이드 RNA가 순차적으로 또는 함께 시료와 반응하여 형성될 수 있다.
본 발명에서 용어 "용해"는 표적 유전자가 본 발명의 복합체와 결합할 수 있는 상태에 놓이게 하는 것으로, 상기 용해는 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"는 표적 유전자를 포함하는 임의의 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 표적 유전자를 포함하는 대상으로부터 수득한 임의의 조직 또는 체액일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 대상의 가래, 혈액, 혈청, 혈장, 혈구(예를 들어, 백혈구), 조직, 생검 샘플, 도말 샘플, 세척 샘플, 면봉 샘플, 세포 함유 체액, 유동 핵산, 소변, 복막액 및 흉수, 뇌 척수액, 대변, 누액 또는 이로부터의 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 시료는 조직학적 목적 하에 취해진 조직 절편, 즉 동결 또는 고정 절편 또는 그의 미세해부 세포 또는 세포외 부분을 또한 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 대상에게 위해를 끼치지 않는 방법으로 얻어질 수 있다.
본 발명의 표적 유전자를 검출하는 방법은 상기 용해물을 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 반응시키는 제2단계를 포함한다.
상기 제2단계는 표적 유전자를 포함하는 생물학적 시료의 용해물과 상기 복합체를 반응시키는 단계이며, 상기 반응을 통해 표적 유전자와 복합체가 결합된 결합물, 반응하지 않은 표적 유전자 이외의 유전자 및 복합체를 포함하는 반응물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어 "불활성화된 Cas9" 및 "가이드 RNA"는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 표적 유전자를 검출하는 방법은 반응물에서 복합체를 분리하는 제3단계를 포함한다.
상기 제3단계가 dCas9 단백질을 포함하는 복합체와 용해물의 반응물로부터 복합체를 분리하는 단계인 특성상, 상기 dCas9 단백질은 목적에 따라 분리 또는 정제에 사용되는 친화성 태그(tag)를 포함할 수 있다.
상기 친화성 태그는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 표적 유전자를 검출하는 방법은 분리된 복합체에 형광표지인자를 처리하는 제4단계를 포함한다.
상기 제4단계는 분리된 복합체에 형광표지인자를 처리하여, 복합체들 중에서 표적 유전자와 결합된 복합체만 특이적으로 형광신호를 갖게 하여 표적 유전자를 검출할 수 있다.
상기 표적 유전자와 결합된 복합체는 표적 유전자와 결합하지 않은 복합체와 달리 이중 가닥 DNA를 갖는 구성으로, 이중 가닥 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 형광표지인자로 표적 유전자와 결합된 복합체를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형광표지인자"는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 유전자를 검출하는 방법은 상기 제1단계의 생물학적 시료의 용해물에 대하여 별도의 정제과정을 거치지 않을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 표적 유전자를 포함하는 세포를 용해시킨 후, 표적 유전자를 분리하지 않은 채, 상기 용해물을 sgRNA와 dCas9의 복합체와 반응시켰다. 그 후, dCas9 단백질의 His 태그를 이용하여 자성 비드로 복합체를 분리한 뒤 용리한 샘플에 SYBR green Ⅰ을 처리하였다. 형광신호를 관찰한 결과, 표적 유전자에서 특이적으로 강한 형광 신호가 검출됨을 확인하여, 상기 방법을 통해 표적 유전자를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 4). 이를 통해, 세포의 용해물로부터 유전자를 분리하는 단계를 거치지 않으면서도 높은 감도로 표적 유전자를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 표적 유전자 검출 방법은 PCR을 수행하지 않고도 높은 감도로 표적 유전자의 검출이 가능하고, 별도의 유전자 분리 단계를 거치지 않고도 신속하면서도 정확하게 표적 유전자를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 sgRNA/Cas9의 복합체와 표적 유전자의 반응시 표적 유전자가 절단됨을 확인한 전기영동 결과이다.
도 1b는 sgRNA/dCas9의 복합체와 표적 유전자의 반응시 표적 유전자의 이동상의 변화를 확인한 전기영동 결과이다.
도 2는 sgRNA/dCas9의 복합체와 SYBR green Ⅰ을 사용하여 형광신호를 확인한 결과, MRSA의 유전자에서 특이적으로 형광신호가 나타남을 확인한 그래프이다.
도 3은 sgRNA/dCas9의 복합체와 SYBR green Ⅰ을 사용하여 형광신호를 확인한 결과, #78의 MRSA의 유전자의 양에 따른 형광신호의 세기를 나타낸 그래프이다.
도 4는 별도의 유전자 정제과정 없이도 MRSA의 유전자에서 특이적으로 형광신호가 나타남을 확인한 그래프이다.
도 5는 MRSA의 용해물의 형광신호를 이용하여 LOD의 측정값을 확인한 그래프이다.
도 6a는 마이크로 어레이를 통해 MRSA의 유전자에서 특이적으로 형광신호가 나타남을 확인한 도이다.
도 6b는 마이크로 어레이를 통해 MRSA의 유전자에서 특이적으로 형광신호가 나타남을 확인한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: Cas9 또는 dCas9과 sgRNA 복합체의 표적 특이성
실시예 1-1: Cas9 - sgRNA 복합체
100 ng의 #1539(서열번호 1)와 #1545(서열번호 2)의 sgRNA 를 각각 100 ng의 mecA 유전자, 238.5 ng의 Cas9 단백질 및 10X 반응 버퍼와 37℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후, 1.2% 아가로스 젤을 사용하여 전기영동하여 mecA 유전자가 절단되었는지 확인하였다. 반응에 사용되는 sgRNA 유전자의 서열은 다음 표 1과 같다.
[표 1]
Figure pat00001
그 결과, #1539 또는 #1545의 sgRNA를 처리하지 않은 군(NC)의 경우 mecA 유전자가 유지되는 반면, 상기 sgRNA를 처리한 군에서는 mecA 유전자가 절단됨을 확인하였다(도 1a). 이를 통해 sgRNA와 Cas9 복합체의 sgRNA는 표적 유전자와 결합하고, Cas9은 표적 유전자를 절단할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-2: sgRNA / dCas9 복합체
100 ng의 #1539와 #1545의 sgRNA를 각각 100 ng의 mecA 유전자, 1.5 ug의 dCas9 단백질 및 10X 반응 버퍼와 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 0.8% 아가로스 젤을 사용하여 전기영동하여 mecA 유전자의 이동상의 이동(mobility shift) 여부를 확인하였다.
그 결과, #1539 또는 #1545의 sgRNA를 처리하지 않은 군(NC)의 경우 mecA 유전자의 이동상에 변화가 없는 반면, 상기 sgRNA를 처리한 군에서는 mecA 유전자의 이동상에 변화가 나타남을 확인하였다(도 1b). 이를 통해 sgRNA가 표적 유전자와 결합하여 sgRNA/dCas9 복합체가 표적 유전자와의 결합상태를 유지할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2: 표적 유전자의 특이적 검출
sgRNA/dCas9의 복합체와 SYBR green Ⅰ 사용하여 표적 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 연세의대 피부과 환자의 피부병변 샘플에서 얻은 MRSA(#78, #81, #82 및 #84; # 은 환자 번호를 의미) 또는 MSSA(#85, #88, #94 및 ATCC25923; # 은 환자 번호를 의미)에서 분리한 유전자와, MRSA의 유전자와 상보적 결합이 가능한 서열번호 1의 sgRNA(#1539) 및 dCas9 단백질을 각각 반응시켰다. 상기 MRSA 또는 MSSA 유전자의 분리는 DNA 정제 키트(Wizard® Genomic DNA purification Kin, Promega 사)를 사용하여 실시하였다. 그 후, dCas9 단백질의 His 태그를 이용하여 Ni-NTA 자성 비드로 dCas9 단백질만을 분리한 뒤 용리(elution)한 샘플에 SYBR green Ⅰ을 처리하였다. 상온에서 20분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 기계로 형광 신호 및 세기를 관찰하였다.
그 결과, MSSA의 유전자에서는 형광 신호가 거의 검출되지 않은 반면, MRSA의 유전자에서는 매우 강한 형광 신호가 검출됨을 확인하였다(도 2). 이를 통해, sgRNA/dCas9의 복합체와 SYBR green Ⅰ을 사용하면 표적 유전자를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3: 표적 유전자의 농도에 따른 형광 세기
DNA 정제 키트(Wizard® Genomic DNA purification Kin, Promega 사)를 사용하여 #78의 MRSA에서 DNA를 분리하였다. 0 내지 1000 ng 범위의 다양한 양의 분리된 DNA를 dCas9/sgRNA 복합체와 반응시켰다. Ni-NTA 자성 비드로 반응물을 분리하여 용리(elution)한 샘플에 SYBR green Ⅰ을 처리하였다. 형광의 세기는 494 nm에서 관찰하였다.
그 결과, 매우 낮은 농도의 유전자를 처리한 경우에도 형광신호가 관찰되며, 처리한 MRSA 유전자의 양이 증가할수록 높은 세기의 형광 신호가 나타남을 확인하였다(도 3). 이를 통해, 미량의 유전자만으로도 표적 유전자를 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: MRSA의 용해물을 이용한 표적 유전자의 검출 확인
상기 실시예3과 달리, MRSA의 용해물에서 유전자를 정제하지 않고도 표적 유전자의 검출 가능 여부를 확인하였다.
구체적으로, #78, #81, #82 또는 #84의 MRSA 또는 #85, #88, #94 및 ATCC25923의 MSSA를 광학밀도(optical density)가 1.0이 되도록 배양한 다음, 라이소자임(lysozyme)과 리소스타핀(lysostaphin)을 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 별도의 정제과정 없이 세포 용해물의 샘플을 준비하였다. 상기 샘플을 dCas9/sgRNA 복합체와 반응시킨 후 Ni-NTA 자성 비드로 반응물을 분리하여 용리(elution)한 샘플에 SYBR green Ⅰ을 처리하였다. 상온에서 20분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 기계로 형광 신호 및 세기를 관찰하였다.
그 결과, 상기 실시예 2의 결과와 동일하게 MRSA의 세포 용해물 샘플과 반응한 군에서만 높은 형광신호가 나타남을 확인하였다(도 4). 이를 통해, dCas9/sgRNA 복합체를 사용하면 별도의 유전자 정제과정을 거치지 않고도 표적 유전자를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5: MRSA의 용해물을 이용한 LOD의 측정
다양한 광학 밀도를 갖는 MRSA를 라이소자임(lysozyme)과 리소스타핀(lysostaphin)을 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 별도의 정제과정 없이 세포 용해물의 샘플을 준비하였다. 상기 샘플을 dCas9/sgRNA 복합체와 반응시킨 후 Ni-NTA 자성 비드로 반응물을 분리하여 용리(elution)한 샘플에 SYBR green Ⅰ을 처리하였다. 형광신호를 관찰하고 광학 밀도를 그에 상응하는 cfu/mL로 환산하여 LOD를 측정한 결과, 10 cfu/mL의 LOD(limit of detection)를 나타냄을 확인하였다(도 5).
실시예 6: 마이크로어레이를 통한 표적 유전자 검출 확인
에폭사이드 기능성 유리 슬라이드(epoxide functional glass slide)를 0.01M의 AB-NTA 유리 지방산(in 0.1M Tris-HCL, pH 8.0)과 상온(RT) 조건에서 밤새 반응시킨 후 에탄올로 세척하여 건조시켰다. 그 다음, 0.1M의 염화니켈(nickel chloride)(in 0.1M Tris-HCL, pH 8.0)과 상온(RT) 조건에서 밤새 반응시킨 후 에탄올로 세척하여 건조시켜, Ni-NTA 기능성 유리 슬라이드(Ni-NTA functional glass slide)를 준비하였다.
MRSA 또는 MSSA로부터 정제해서 얻은 유전자를 dCas9/sgRNA 복합체와 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 dCas9/sgRNA/유전자 복합체를 이루도록 샘플을 제조하였다. 상기 준비된 슬라이드에 상기 제조한 복합체 샘플을 스파팅하고, 상온(RT) 조건에서 1시간 동안 반응시킨 후 3회 세척하였다. 슬라이드에 1X SYBR green Ⅰ을 처리하고 ChemiDoc으로 이미지화 한 후, 형광 신호를 분석하였다.
그 결과, MSSA 유전자와 반응시킨 복합체를 스파팅한 위치에서는 형광신호가 전혀 검출되지 않은 반면, MRSA 유전자와 반응시킨 복합체를 스파팅한 위치에서는 높은 형광 신호가 검출됨을 확인하였다(도 6a 및 6b). 이를 통해 dCas9/sgRNA 복합체를 사용하여 표적 유전자를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.
따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Method for detecting a target gene using a dCas9/gRNA complex and fluorescence marker <130> P16-137-KRI <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA #1539 <400> 1 gctcaaattt caaacaaaaa tttagataat gaaatattat tagctgattc aggttacgga 60 caaggtgaaa 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA #1545 <400> 2 gctcaaattt caaacaaaaa tttagataat gaaatattat tagctgattc aggttacgga 60 caaggtgaaa 70

Claims (9)

  1. 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 표적 유전자를 포함하는 시료를 반응시키는 제1단계;
    상기 반응물을 분리하는 제2단계; 및
    형광표지인자를 처리하는 제3단계를 포함하는, 표적 유전자를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일 사슬 가이드 RNA (sgRNA)인 것인, 표적 유전자를 검출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 불활성화된 Cas9은 친화성 태그(tag)를 포함하는 것인, 표적 유전자를 검출하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 친화성 태그는 His 태그, Flag 태그, S 태그, GST(Glutathione S-transferase) 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그, CMP (chitin binding protein) 태그, Avi 태그, 칼모듈린 (calmodulin) 태그, 폴리글루타메이트 (polyglutamate) 태그, E 태그, HA 태그, myc 태그, SBP 태그, 소프태그 1 (softag 1), 소프태그 3(softag 3), 스트랩 (strep) 태그, TC 태그, Xpress 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier pretein) 태그, 및 GFP (green fluorescent protein) 태그를 포함하는 군에서 선택되는 것인, 표적 유전자를 검출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2단계는 상기 태그에 결합하는 자성 비드(magnetic bead)를 이용하여 수행되는 것인, 표적 유전자를 검출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 자성 비드는 Ni-NTA 자성 비드인 것인, 표적 유전자를 검출하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 형광표지인자는 사이버 그린 Ⅰ(SYBR green Ⅰ), 사이버 그린 Ⅱ(SYBR green Ⅱ), 사이버 골드(SYBR gold), 옥사졸 옐로우(Oxazole yellow, YOYO) 및 티아졸 오렌지(Thiazole orange)를 포함하는 군에서 선택된 것인, 표적 유전자를 검출하는 방법.
  8. 표적 유전자를 포함하는 세포를 용해시키는 제1단계;
    상기 용해물을 불활성화된 Cas9(dCas9) 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA로 이루어진 복합체와 반응시키는 제2단계;
    상기 반응물을 분리하는 제3단계; 및
    형광표지인자를 처리하는 제4단계를 포함하는, 표적 유전자를 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표적 유전자를 검출하는 방법은 세포의 용해물에 대하여 정제과정을 거치지 않는 것을 특징으로 하는 것인, 표적 유전자를 검출하는 방법.
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