CN112063604A

CN112063604A - 功能化的dCas9修饰蛋白及其在检测核酸中的应用

Info

Publication number: CN112063604A
Application number: CN202010964949.9A
Authority: CN
Inventors: 高玉舟; 乔善鹏; 刘珍妮; 李海超; 何欣
Original assignee: Jinan Guoke Medical Engineering Technology Development Co ltd
Current assignee: Jinan Guoke Medical Engineering Technology Development Co ltd
Priority date: 2020-09-15
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明公开了一种功能化的dCas9修饰蛋白及其在检测核酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明在dCas9基础上修饰得到两种功能化蛋白dCas9‑biotin和dCas9‑AP，在此基础上构建一种新型的检测核酸的化学发光方法；其中，通过固相修饰的dCas9‑biotin对DNA进行特异性捕获，通过碱性磷酸酶标记的dCas9进行定量检测，可实现体系中0.42fmol核酸(3.6kbp)的检出；dCas9‑biotin和dCas9‑AP的夹心识别更提高检测体系的特异性，为进一步降低核酸检测假阳/假阴结果提供有效手段。

Description

功能化的dCas9修饰蛋白及其在检测核酸中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及两种功能化的dCas9修饰蛋白及其在检测核酸中的应用。

背景技术

核酸检测可为生命科学、公共安全、医疗诊断和相关基础研究提供重要依据。目前，核酸检测作为一项重要的分子诊断实践不断发展。已经开发出诸如印迹杂交、聚合酶链式反应(PCR)、杂交捕获、基因芯片等技术。然而现有的多数技术在性能指标上具有偏重性，检测需繁琐的样品/试剂处理，容易产生假阳/阴结果。因此，设计开发便捷特异性高的核酸检测手段就显得尤为重要。

CRISPR/Cas是原核生物进化出的一类抵抗外来病毒入侵的免疫系统。这类工程编辑系统利用酶把一段作为引导工具的小RNA(sgRNA)切入DNA或RNA，能在特定的核酸序列处切断，具有很高的特异性。目前这种基因“魔剪”已经扩展到几乎所有的基因组目标，并被探索应用于生物传感新兴方向。

CRISPR/Cas9复合物是一种新的DNA靶向编辑工具，其包括一个Cas9蛋白和一条引导RNA(sgRNA)，其中，sgRNA负责识别外源DNA并与之杂交，而Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH两个独特的活性位点，在双链DNA剪切中发挥作用。目前CRISPR/Cas9被广泛应用基因编辑和调控，还没有充分的探讨用于核酸检测领域。

dCas9蛋白是Cas9蛋白的突变体，即Cas9内切酶的RuvC1和HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变，导致Cas9蛋白的内切酶活性全部消失，只保留由sgRNA引导进入基因组的能力。专利CN107574226A通过将Cas9的酶切位点定点突变，使得其酶切功能失活，能够仅应用其精确的靶向功能，实现核酸检测的技术，而避免了Cas9酶切功能对待检测基因进行剪切等不良作用。但在核酸的实际检测的过程中，由于Cas9的脱靶效应、样品成分复杂以及Ru(bpy)₃ ²⁺强正电性都会导致核酸的非特异性结合捕获，使定量不准，容易报告假阳、阴结果。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种功能化的dCas9修饰蛋白及其在检测核酸中的应用。本发明分别用生物素和碱性磷酸酶标记dCas9蛋白，得到功能化的dCas9修饰蛋白；然后在此基础上，利用固相磁性微球与CRISPR指导的“夹心识别”构建一种检测核酸的化学发光方法，可实现体系中0.42fmol核酸(3.6kbp)的检出。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供功能化的dCas9修饰蛋白，包括：dCas9-biotin和dCas9-AP；

所述dCas9-biotin由如下方法制备而成：

将dCas9蛋白液用pH＝8.0的PBS缓冲液超滤浓缩处理，使dCas9蛋白的终浓度大于或等于2mg/mL，得到dCas9蛋白溶液；向dCas9蛋白溶液中加入EZ-link-NHS-Biotin母液，混合均匀，室温反应30-60分钟，加入甘氨酸终止反应，以pH＝8.0的PBS缓冲液为流动相过除盐柱，除去未反应小分子，收集修饰蛋白，超滤浓缩，得到dCas9-biotin；

所述dCas9-AP由如下方法制备而成：

将dCas9蛋白液用pH＝8.0的PBS缓冲液超滤浓缩处理，使dCas9蛋白的终浓度大于或等于2mg/mL，得到dCas9蛋白溶液；向dCas9蛋白溶液中加入Traut’s试剂，混合均匀，20-30℃条件下反应80-100min，反应结束后超滤除盐，得到第一溶液；

向碱性磷酸酶(AP)溶液中加入SMCC试剂，混合均匀，20-30℃条件下反应80-100min，反应结束后超滤除盐，得到第二溶液；

将第一溶液和第二溶液按体积比1:1混合，4℃条件下反应12-24h，制备得到dCas9-AP。

优选的，所述dCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面，提供上述功能化的dCas9修饰蛋白在如下(1)或(2)中的应用：

(1)检测核酸；

(2)制备检测核酸的试剂。

优选的，所述核酸为DNA。

本发明的第三方面，提供一种检测核酸的试剂，所述试剂以上述功能化的dCas9修饰蛋白为有效成分。

进一步的，所述试剂还包含：sgRNA1、sgRNA2、清洗液和反应液。

优选的，所述sgRNA1的序列如SEQ ID NO.3所示；所述sgRNA2的序列如SEQ IDNO.4所示。

优选的，所述清洗液为添加有0.1～0.5mol/L NaCl、0.1～0.01％BSA、0.01～0.05％Triton X-100、1～5mmol/ml EDTA、0.01～0.05％叠氮钠、0.02-0.05％Proclin300、0.1～0.01％变性鲑鱼精DNA的0.1M PBS，pH 6.0～8.0。

优选的，所述反应液中含有1M二乙醇胺、5mM MgCl₂、0.2M KCl和20mM碱性磷酸酶底物AMPPD，反应液的pH为10.3。

本发明的第四方面，提供一种由dCas9介导特异性夹心识别DNA检测核酸的方法，利用上述试剂进行检测，具体包括以下步骤：

(1)将dCas9-biotin与固相磁性微球复合，得到dCas9包被的固相磁性微球；将dCas9包被的固相磁性微球用清洗液稀释至10-30μg/ml；向稀释后的dCas9包被的固相磁性微球中加入sgRNA1，孵育，得到R1&sgRNA1；

(2)将dCas9-AP用清洗液稀释至50-150μg/ml；向稀释后的dCas9-AP中加入sgRNA2，孵育，得到R2&sgRNA2；

(3)将系列浓度梯度的DNA标准品分别与R2&sgRNA2混合，37℃条件下孵育10-20min，反应结束后再加入R1&sgRNA1，37℃条件下孵育10-20min，磁性分离磁球，弃去上清，磁球用清洗液进行清洗，清洗后的磁球用清洗液重悬，检测其发光值，构建发光值与DNA标准品浓度的工作曲线，利用构建的工作曲线对待测样品进行核酸检测。

本发明的有益效果：

(1)本发明调取化脓链球菌(Streptococcus pyogene)的CRISPR/Cas9基因，利用分子生物学方法得到具有核酸结合而不具备切割能力的dCas9；本发明在dCas9基础上修饰得到两种功能化蛋白dCas9-biotin和dCas9-AP，在此基础上构建一种新型的检测核酸的化学发光方法；其中，通过固相修饰的dCas9-biotin对DNA进行特异性捕获，通过碱性磷酸酶标记的dCas9进行定量检测，可实现体系中0.42fmol核酸(3.6kbp)的检出；dCas9-biotin和dCas9-AP的夹心识别更提高检测体系的特异性，为进一步降低核酸检测假阳/假阴结果提供有效手段。

(2)为配合功能化蛋白dCas9-biotin和dCas9-AP的核酸检测，本发明在检测体系中还开发设计了清洗液和反应液，其中，清洗液能有效减少核酸、dCas9功能化蛋白的非特异结合，稳定蛋白，延长试剂效期，增加体系分散性；反应液则是提供反应底物，用于发光检测。

附图说明

图1：本发明的检测原理示意图；dCas9-biotin&sgRNA1和dCas9-AP&sgRNA2与DNA形成夹心复合物，使得dCas9-AP被捕获到dCas9-biotin修饰的磁性微球(MBs)表面，dCas9-AP催化发光底物AMPPD发光，其发光值与与DNA成正比，以此实现对核酸的检测。

图2：最终纯化后dCas9的SDS-PAGE蛋白电泳图；其中，M道是Marker，2道为纯净的dCas9样本。

图3：本发明制备的dCas-biotin及dCas9-AP的SDS-PAGE蛋白电泳图；其中，1道为生物素修饰的dCas-biotin样本，2道为AP样本，3道为AP修饰的dCas-AP样本，M道是Marker。

图4：本发明所述dCas9-biotin与dCas9-AP与DNA结合的凝胶阻滞实验；其中，M道是Marker，1道为dCas9-biotin+sgRNA1+DNA1，2道为dCas9-biotin+DNA1，3道为空白道，4道为dCas9-AP+sgRNA1+DNA1，5道为dCas9-AP+DNA1。

图5：本发明所述的dCas9功能蛋白夹心识别检测核酸化学发光方法的标准曲线。

图6：不同溶液孵育的电泳图；图中，道1marker；道2为3.6kbp DNA；道3为3.6kbpDNA与dCas9-biotin包被的磁性微球(不含sgRNA)在本发明的清洗液中孵育2h后的上清；道4为3.6kbp DNA与dCas9-biotin包被的磁性微球(不含sgRNA)在PBS溶液中孵育2h后的上清。由图可以看出，本发明的清洗液液能有效减少DNA的非特异性吸附。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

室温：本文中的“室温”，表示的温度范围为15-30℃。

正如背景技术部分所介绍的，目前CRISPR/Cas9被广泛应用基因编辑和调控，但还没有充分的探讨用于核酸检测领域。

基于此，本发明的目的在于提供一种通过CRISPR“夹心识别”检测核酸的方法。本发明所涉及的dCas9酶，其野生型来自化脓链球菌(Streptococcus pyogene)，命名为SpCas9，详见参考文献：Genome engineering using CRISPR-Cas9 system,Cong L，ZhangF,Methods in molecular biology(Clifton,N.J.)1239(2015):197。Cas9蛋白源自脓链球菌(Streptococcus pyogene)基因，dCas9是以Cas9为模板将其核酸酶结构域进行突变(HNH结构域中H840A，RuvC结构域中D10A)，使其失去切割DNA的能力，但在sgRNA的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合DNA。其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

将编码dCas9的基因序列优化后(优化后的基因序列如SEQ ID NO.1所示)连接到表达载体pET16b上获得重组表达质粒，并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到表达dCas9的工程菌。工程菌进行表达所得产物为可溶性蛋白，通过超声破碎、镍离子亲和柱、疏水层析和离子交换层析进行分离纯化得到纯净的目标，即dCas9。

本发明所述的功能化dCas9包含生物素修饰的dCas9和碱性磷酸酶偶联的dCas9两种，获得的方法如下：

(1)生物素修饰的dCas9(dCas9-biotin)制备方法：

(i)将1mL dCas9(1-2mg)用PBS(pH＝8.0)缓冲液稀释至5mL，用50kDa分子量超滤筒超滤浓缩至1mL；

(ii)重复上述步骤2次，目的为更换缓冲液，提高修饰效率；

(iii)取14-27μL EZ-link-NHS-Biotin母液加入到dCas9蛋白溶液中，均匀混合，室温反应30-60分钟；

(iv)加入甘氨酸终止反应，以PBS(pH＝8.0)缓冲液稀为流动相过除盐柱除去未反应小分子，收集修饰蛋白，超滤浓缩，得到dCas9-biotin。

(2)dCas9-碱性磷酸酶(dCas9-AP)的制备方法：

(i)dCas9 200μg，补加PBS(pH＝8.0)至体积为400μL，运用超滤管(50K)超滤三次，8000rpm离心5min，每次补加PBS(pH＝8.0)至体积为400μL，最后浓缩成体积为100μL的dCas9溶液(浓度为2mg/ml)，使dCas9的buffer更换为PBS(pH＝8.0)。

(ii)取已分装好的Traut’s试剂(母液浓度为10mg/ml)用PBS(pH＝8.0)稀释10倍后取3.7μL(20x)加入到100μL的dCas9溶液中，涡旋振荡使其充分混匀，25℃下反应90min，期间每10min涡旋混匀一次。

(iii)除盐：以PBS(pH＝8.0)缓冲液稀为流动相过除盐柱除去未反应小分子，收集修饰蛋白，超滤浓缩。最后浓缩成体积为100μL的dCas9溶液。

(iv)预处理AP：取AP600μg，补加conjugation buffer(PBS 100mM pH＝7.2，NaCl150mM，EDTA 1～5mM)至体积为400μL，运用超滤管(10K)超滤三次，8000rpm离心5min，每次补加conjugation buffer至体积为400μL，最后浓缩成体积为100μL的AP溶液(浓度为6mg/ml)。

(v)取已分装好的SMCC试剂(母液浓度为3.7mg/ml)10μL(20X)加入到100μL的AP溶液中，涡旋振荡使其充分混匀，25℃下反应90min，期间每10min涡旋混匀一次。

(vi)除盐：以PBS(pH＝7.2)缓冲液稀为流动相过除盐柱除去未反应小分子，收集修饰蛋白，超滤浓缩。最后浓缩成体积为100μL的AP溶液。

将上述步骤(iii)制备的100μL的dCas9溶液与步骤(vi)制备的100μL的AP溶液混合，涡旋混匀，置于4℃过夜反应，第二天上午补加300μL的保存液(pH＝7.2)重悬，4℃保存。

基于上述制备的生物素修饰的dCas9和碱性磷酸酶偶联的dCas9，本发明开发设计了一种由dCas9介导特异性夹心识别DNA检测核酸的化学发光方法，其检测原理如图1所示。检测试剂包含R1、R2、sgRNA1、sgRNA2、清洗液和反应液六项，其中R1、R2分别是由dCas9-biotin修饰的磁性固相微粒和dCas9-AP偶联蛋白配置的溶液，而sgRNA1、sgRNA2为针对待检测目标所设计的指导RNA。通过sgRNA1与修饰于磁性微粒上的dCas9形成RNP复合物，对待测DNA进行识别捕获，而dCas9-AP在sgRNA2指导下识别结合待测DNA，形成类似于免疫检测的“夹心”复合物，最终通过夹心吸附上的AP催化特异性底物AMPPD进行发光检测，待测DNA片段与发光值成正相关。

本发明所述的由dCas9介导特异性夹心识别DNA检测核酸的操作方法如下：

1)将制备的生物素修饰的dCas9(dCas9-biotin)30～100μg与1.0mg的链霉亲和素修饰磁性微球混合，在室温条件下孵育30min，洗涤，采用R1溶剂进行重悬，得到dCas9-biotin修饰的磁性固相微粒；作为R1。以碱性磷酸酶偶联的dCas9作为R2。

注：磁性微球为Invitrogen出售的Dynabeads^TMMyOne^TMStreptavidin C1，配基类型为链霉亲和素，平均直径为1.0μm。

2)如有需要，可用清洗液将R1、R2稀释至合适浓度(R1:10～30μg/ml(以磁性固相微粒计)、R2：50～150μg/ml)。

3)根据待测物向R1、R2中加入对应指导RNA进行孵育结合；具体为：向R1中加入sgRNA1、R2中加入sgRNA2，37℃孵育15min，分别得到R1&sgRNA1和R2&sgRNA2。

4)将待测样本与50μl的R2&sgRNA2混合均匀，37℃下孵育15min，每5min涡旋振荡一次；

5)上述反应结束后，加入R1&sgRNA1(磁球包被的dCas9 RNP)50μl，混合均匀，37℃下孵育15min，每5min涡旋振荡一次；

6)磁性分离磁球，弃去上清；

7)用400μl清洗液重悬洗涤磁球，磁性分离磁球，弃去上清；

8)重复上步骤两次；

清洗后磁球用50μl清洗液重悬，转移至96孔板中，加入150μl反应液，立即混匀上机检测。

为进一步的提高检测效果，本发明还对R1溶剂、清洗液和反应液的组成进行了优化。其中，R1溶剂用于悬浮着dCas9-biotin修饰的磁性固相微粒，优化后的R1溶剂的组成为：添加有0.1～0.5mol/L NaCl、0.1～0.01％BSA、5～100μg/ml肝素钠盐、0.01～0.05％Triton X-100、0.01～0.05％叠氮钠、0.02-0.05％Proclin300、0.1～0.01％变性鲑鱼精DNA的50mM Tris-HCl(pH 6.0～8.0)。叠氮钠、Proclin300作为常用抑菌剂能有效抑菌，肝素能够竞争消除DNA与dCas9(不含sgRNA)的非特异结合，因此，采用优化后的R1溶剂能有效减少核酸与dCas9的非特异结合，稳定蛋白，延长试剂效期。

清洗液主要用于清洗固相微球，也可在测试时用于稀释R1、R2。优化后的清洗液的组成为：添加有0.1～0.5mol/L NaCl、0.1～0.01％BSA、0.01～0.05％Triton X-100、1～5mmol/ml EDTA、0.01～0.05％叠氮钠、0.02-0.05％Proclin300、0.1～0.01％变性鲑鱼精DNA的0.1M PBS(pH 6.0～8.0)。经优化后的清洗液能有效减少R2、核酸在微球上的非特异性吸附，增加微球分散性，稳定蛋白，延长试剂效期(图6)。

反应液用于发光检测，反应液中含有1M二乙醇胺、5mM MgCl₂、0.2M KCl和20mM底物AMPPD，反应液的pH为10.3。

综上，目前已有利用dCas9酶切功能失活但靶向功能保留的特点实现核酸检测的报道(专利CN107574226A)。但在核酸的实际检测的过程中，由于Cas9的脱靶效应、样品成分复杂以及Ru(bpy)₃ ²⁺强正电性都会导致核酸的非特异性结合捕获，使定量不准，容易报告假阳、阴结果。

针对以上问题，本发明引入两种dCas9功能化蛋白，在两种sgRNA引导下，通过dCas9-biotin对待测核酸片段进行识别捕获，而dCas9-AP则对待测核酸片段另一处进行识别。与之相比，本发明具有如下技术优点：1.由于需要两处共40bp序列的特异性识别，该检测方法较其他专利所述的20bp片段长度的识别具有更高的特异性，能有效排除复杂样品所带来的潜在脱靶效应；2.由于通过dCas9-biotin对待测核酸进行捕获，免去对待测核酸进行生物素标记的处理，检测更便捷；3.与带强正电的Ru(bpy)₃ ²⁺相比，碱性磷酸酶是一种反应活性高、生物相容性好、电荷分布适中的功能酶，不会与负电性较强的核酸进行非特异相互作用。同时碱性磷酸酶在各种检测体系中应用更为广泛，本发明所述的体系可在酶标仪等小型仪器上进行检测报告；4.本发明还提供了相应试剂能有效减少核酸非特异结合，稳定蛋白，延长试剂效期，增加体系分散性。利于本发明所述的检测体系在核酸检测上的实际应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1：(E.coli)功能化dCas9-biotin蛋白的制备

(1)dCas9表达载体的构建

根据Cas9基因序列对Cas9进行基因合成及密码子优化，并突变两个氨基酸H840A和D10A，在5’端引入NdeⅠ酶切位点(CATATG)，3’端引入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)。目的基因与克隆载体PUC57相连形成重组质粒PUC57-dCas9。目的基因序列如SEQ ID NO.1所示。将重组质粒PUC57-dCas9用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，与经过NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的载体pET16b的骨架片段进行16℃过夜连接，获得重组载体pET16b-dCas9，测序验证。

酶切体系如下(20μL)：

连接体系如下(20μL)：

(2)dCas9的表达、纯化

将pET16b-dCas9表达载体转化进入E.coil BL21(ED3)感受态细胞中，操作如下：将-80℃冰箱保存的感受态细胞置于冰中融化5min。加入表达载体pET16b-dCas9 2μL，轻轻混匀后冰上放置30min。42℃水浴锅中放置90s后，立即于冰中放置2min。每管加入800μL预温的LB培养基，37℃培养45min(160r/min)。4000rpm离心1min后，取沉淀涂布平板，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜，培养形成单一菌落。

挑取上步所得单一菌落至含有100μg/mL氨苄的LB培养基中(20ml)，37℃、180r/min振荡培养过夜，获得种子液。将种子液以1％(v/v)的比例接种量接种至2L含有100μg/mL氨苄的LB培养基中，37℃、180r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，然后加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，18℃、180r/min继续振荡培养18h，离心收集菌体-80摄氏度冻存。

菌体中纯化dCas9方法如下：配置缓冲液A(pH7.5 Tris-HCl)的配方：取24.2gTris-base置于1L烧杯中，加入约800mL去离子水充分搅拌溶解，用浓HCl调pH至7.5，将溶液用容量瓶定容至1L，4℃保存。使用时稀释10倍。缓冲液B(pH8.0 Tris-HCl)的配方：取24.2gTris-base置于1L烧杯中，加入约800mL去离子水充分搅拌溶解，用浓HCl调pH至8.0，将溶液用容量瓶定容至1L，4℃保存。使用时稀释10倍。

取冻存工程菌重悬于缓冲液A中，浓度为1g/mL，置于冰上超声破碎20min(分2次)，当菌液由粘稠状态变为透亮即可，4℃、12000r/min离心30min，收集上清蛋白液，对上清液中可溶的dCas9进行Ni柱亲和纯化，所得洗脱液加入氯化钠至终浓度1M,经Phenyl HP疏水层析纯化，用含有氯化钠浓度为1.5M-0M的缓冲液A线性洗脱，PAGE电泳验证，收集并合并目的蛋白，将收集的蛋白液用缓冲液B透析过夜除盐；将透析后的蛋白液进行High S阳离子交换层析，用含NaCl浓度为0M-0.5M的缓冲液B线性洗脱，PAGE电泳验证，收集并合并目的蛋白，将收集的蛋白液用缓冲液B透析过夜除盐；将透析后的蛋白液再次进行High S阳离子交换层析，用含NaCl浓度为0.1M-1M的缓冲液B线性洗脱，收集并合并目的蛋白，用缓冲液B透析除盐后，即得到本发明所述的dCas9蛋白，其SDS-PAGE电泳结果如图2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(3)dCas9-biotin、dCas9-AP的制备

将收集到的酶蛋白液用100mM PBS(pH8.0)超滤浓缩处理，使蛋白终浓度大于2mg/mL，取14-27μL EZ-link-NHS-Biotin母液加入到dCas9蛋白溶液中，均匀混合，室温反应30-60分钟，加入甘氨酸终止反应，以PBS(pH＝8.0)缓冲液稀为流动相过除盐柱除去未反应小分子，收集修饰蛋白，超滤浓缩，得到dCas-biotin，其SDS-PAGE电泳结果如图3中泳道1所示。

同样的，将收集到的酶蛋白液用100mM、pH8.0的PBS超滤浓缩处理，使蛋白终浓度大于2mg/mL，取Trauts试剂(10mg/ml)用PBS(pH＝8.0)稀释10倍后取3.7μL(20x)加入到100μL的dCas9溶液中，涡旋振荡使其充分混匀，25℃下反应90min，期间每10min涡旋混匀一次。超滤除盐，用SMCC预处理待连接的AP，最后浓缩成体积为100μL的AP溶液(浓度为6mg/ml)。将上述100μL的dCas9溶液与100μL的AP溶液混合，涡旋混匀，置于4℃反应16h，获得dCas9-AP，其SDS-PAGE电泳结果如图3中泳道3所示。

实施例2：功能化dCas9的特征

功能化dCas9(dCas9-biotin和dCas9-AP)可在RNA指导下与序列特异性双链DNA片段结合。本发明通过设计合成指导RNA(sgRNA1、sgRNA2，其RNA序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示)，可以指导dCas9与DNA1(DNA1序列如SEQ ID NO.5所示)特异性结合，我们用凝胶电泳验证了sgRNA1能够指导功能化dCas9蛋白与DNA1结合，由于功能化dCas9在sgRNA指导下可与DNA1特异性结合形成复合物，非变性电泳下其迁移率要小于游离的DNA1，表现为dCas9-sgRNA-DNA1条带比未形成复合物的DNA1条带靠上。

凝胶阻滞电泳方法如下

1)5％非变性PAGE胶的配置

2)电泳条件：0.5xTBE缓冲液作为电泳液，4℃，120V，1h。

凝胶阻滞电泳结果如图4所示。

实施例3：应用dCas9功能蛋白夹心识别检测核酸(化学发光方法)

1)配置清洗液、反应液：清洗液为0.1M PBS(pH 6.0～8.0)含NaCl(0.1～0.5mol/L)、BSA(0.1～0.01％)、Triton X-100(0.01～0.05％)、EDTA(1～5mmol/ml)还含有叠氮钠(0.01～0.05％)、Proclin300(0.02-0.05％)、变性鲑鱼精DNA(0.1～0.01％)；反应液中含有1M二乙醇胺、5mM MgCl₂、0.2M KCl和20mM底物AMPPD，反应液的pH为10.3。

2)配置DNA标准品：S0:0ng/ml，S1:11.25ng/ml，S2:22.5ng/ml，S3:45ng/ml，S4:90ng/ml。DNA标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，长度为3.6kbp。上述配制的DNA标准品换算成摩尔浓度分别为：0pM、4.725pM、9.45pM、18.9pM和37.8pM。

3)将dCas9-biotin修饰的磁性固相微粒(MBs-dCas9)用清洗液稀释到10～30μg/ml，将dCas9-AP用清洗液稀释到50～150μg/ml，以蛋白含量计。

检测操作方法如下：向MBs-dCas9加入sgRNA1，向dCas9-AP中加入sgRNA2，37℃孵育15min；将DNA标准品(S0～S4)50μl分别与50μl的dCas9-AP RNP混合均匀，37℃下孵育15min，每5min涡旋振荡一次；上述反应结束后，加入MBs-dCas9 RNP 50μl，混合均匀，37℃下孵育15min，每5min涡旋振荡一次；磁性分离磁球，弃去上清；用400μl清洗液重悬洗涤磁球，磁性分离磁球，弃去上清；重复洗涤步骤两次；清洗后磁球用50μl清洗液重悬，转移至96孔板中，加入150μl反应液立即混匀上机检测。dCas9-biotin&sgRNA1和dCas9-AP&sgRNA2与DNA形成夹心复合物，使得dCas9-AP被捕获到dCas9-biotin修饰的磁性微球(MBs)表面，dCas9-AP催化发光底物AMPPD发光，其发光值与与DNA成正比，此化学发光方法的标准曲线如图5所示。

经测算，采用本发明的方法可实现体系中0.42fmol核酸(3.6kbp)的检出。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南国科医工科技发展有限公司

<120> 功能化的dCas9修饰蛋白及其在检测核酸中的应用

<130> 2020

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4124

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcatcatc atcatcatca cgtggataag aaatactcaa taggcttagc tatcggcaca 60

aatagcgtcg gatgggcggt gatcactgat gaatataagg ttccgtctaa aaagttcaag 120

gttctgggaa atacagaccg ccacagtatc aaaaaaaatc ttataggggc tcttttattt 180

gacagtggag agacagcgga agcgactcgt ctcaaacgga cagctcgtag aaggtataca 240

cgtcggaaga atcgtatttg ttatctacag gagatttttt caaatgagat ggcgaaagta 300

gatgatagtt tctttcatcg acttgaagag tcttttttgg tggaagaaga caagaagcat 360

gaacgtcatc ctatttttgg aaatatagta gatgaagttg cttatcatga gaaatatcca 420

actatctatc atctgcgaaa aaaattggta gattctactg ataaagcgga tttgcgctta 480

atctatttgg ccttagcgca tatgattaag tttcgtggtc attttttgat tgagggagat 540

ttaaatcctg ataatagtga tgtggacaaa ctatttatcc agttggtaca aacctacaat 600

caattatttg aagaaaaccc tattaacgca agtggagtag atgctaaagc gattctttct 660

gcacgattga gtaaatcaag acgattagaa aatctcattg ctcagctccc cggtgagaag 720

aaaaatggct tatttgggaa tctcattgct ttgtcattgg gtttgacccc taattttaaa 780

tcaaattttg atttggcaga agatgctaaa ttacagcttt caaaagatac ttacgatgat 840

gatttagata atttattggc gcaaattgga gatcaatatg ctgatttgtt tttggcagct 900

aagaatttat cagatgctat tttactttca gatatcctaa gagtaaatac tgaaataact 960

aaggctcccc tatcagcttc aatgattaaa cgctacgatg aacatcatca agacttgact 1020

cttttaaaag ctttagttcg acaacaactt ccagaaaagt ataaagaaat cttttttgat 1080

caatcaaaaa acggatatgc aggttatatt gatgggggag ctagccaaga agaattttat 1140

aaatttatca aaccaatttt agaaaaaatg gatggtactg aggaattatt ggtgaaacta 1200

aatcgtgaag atttgctgcg caagcaacgg acctttgaca acggctctat tccccatcaa 1260

attcacttgg gtgagctgca tgctattttg agaagacaag aagactttta tccattttta 1320

aaagacaatc gtgagaagat tgaaaaaatc ttgacttttc gaattcctta ttatgttggt 1380

ccattggcgc gtggcaatag tcgttttgca tggatgactc ggaagtctga agaaacaatt 1440

accccatgga attttgaaga agttgtcgat aaaggtgctt cagctcaatc atttattgaa 1500

cgcatgacaa actttgataa aaatcttcca aatgaaaaag tactaccaaa acatagtttg 1560

ctttatgagt attttacggt ttataacgaa ttgacaaagg tcaaatatgt tactgaagga 1620

atgcgaaaac cagcatttct ttcaggtgaa cagaagaaag ccattgttga tttactcttc 1680

aaaacaaatc gaaaagtaac cgttaagcaa ttaaaagaag attatttcaa aaaaatagaa 1740

tgttttgata gtgttgaaat ttcaggagtt gaagatagat ttaatgcttc attaggtacc 1800

taccatgatt tgctaaaaat tattaaagat aaagattttt tggataatga agaaaatgaa 1860

gatatcttag aggatattgt tttaacattg accttatttg aagataggga gatgattgag 1920

gaaagactta aaacatatgc tcacctcttt gatgataagg tgatgaaaca gcttaaacgt 1980

cgccgttata ctggttgggg acgtttgtct cgaaaattga ttaatggtat tagggataag 2040

caatctggca aaacaatatt agattttttg aaatcagatg gttttgccaa tcgcaatttt 2100

atgcagctga tccatgatga tagtttgaca tttaaagaag acattcaaaa agcacaagtg 2160

tctggacaag gcgatagttt acatgaacat attgcaaatt tagctggtag ccctgctatt 2220

aaaaaaggta ttttacagac tgtaaaagtt gttgatgaat tggtcaaagt aatggggcgg 2280

cataagccag aaaatatcgt tattgaaatg gcacgtgaaa atcagacaac tcaaaagggc 2340

cagaaaaatt cgcgagagcg tatgaaacga atcgaagaag gtatcaaaga attaggaagt 2400

cagattctta aagagcatcc tgttgaaaat actcaattgc aaaatgaaaa gctctatctc 2460

tattatctcc aaaatggaag agacatgtat gtggaccaag aattagatat taatcgttta 2520

agtgattatg atgtcgatgc cattgttcca caaagtttcc ttaaagacga ttcaatagac 2580

aataaggtct taacgcgttc tgataaaaat cgtggtaaat cggataacgt tccaagtgaa 2640

gaagtagtca aaaagatgaa aaactattgg agacaacttc taaacgccaa gttaatcact 2700

caacgtaagt ttgataattt aacgaaagct gaacgtggag gtttgagtga acttgataaa 2760

gctggtttta tcaaacgcca attggttgaa actcgccaaa tcactaagca tgtggcacaa 2820

attttggata gtcgcatgaa tactaaatac gatgaaaatg ataaacttat tcgagaggtt 2880

aaagtgatta ccttaaaatc taaattagtt tctgacttcc gaaaagattt ccaattctat 2940

aaagtacgtg agattaacaa ttaccatcat gcccatgatg cgtatctaaa tgccgtcgtt 3000

ggaactgctt tgattaagaa atatccaaaa cttgaatcgg agtttgtcta tggtgattat 3060

aaagtttatg atgttcgtaa aatgattgct aagtctgagc aagaaatagg caaagcaacc 3120

gcaaaatatt tcttttactc taatatcatg aacttcttca aaacagaaat tacacttgca 3180

aatggagaga ttcgcaaacg ccctctaatc gaaactaatg gggaaactgg agaaattgtc 3240

tgggataaag ggcgagattt tgccacagtg cgcaaagtat tgtccatgcc ccaagtcaat 3300

attgtcaaga aaacagaagt acagacaggc ggattctcca aggagtcaat tttaccaaaa 3360

agaaattcgg acaagcttat tgctcgtaaa aaagactggg atccaaaaaa atatggtggt 3420

tttgatagtc caacggtagc ttattcagtc ctagtggttg ctaaggtgga aaaagggaaa 3480

tcgaagaagt taaaatccgt taaagagtta ctagggatca caattatgga aagaagttcc 3540

tttgaaaaaa atccgattga ctttttagaa gctaaaggat ataaggaagt taaaaaagac 3600

ttaatcatta aactacctaa atatagtctt tttgagttag aaaacggtcg taaacggatg 3660

ctggctagtg ccggagaatt acaaaaagga aatgagctgg ctctgccaag caaatatgtg 3720

aattttttat atttagctag tcattatgaa aagttgaagg gtagtccaga agataacgaa 3780

caaaaacaat tgtttgtgga gcagcataag cattatttag atgagattat tgagcaaatc 3840

agtgaatttt ctaagcgtgt tattttagca gatgccaatt tagataaagt tcttagtgca 3900

tataacaaac atagagacaa accaatacgt gaacaagcag aaaatattat tcatttattt 3960

acgttgacga atcttggagc tcccgctgct tttaaatatt ttgatacaac aattgatcgt 4020

aaacgatata cgtctacaaa agaagtttta gatgccactc ttatccatca atccatcact 4080

ggtctttatg aaacacgcat tgatttgagt cagctaggag gtga 4124

<210> 2

<211> 1375

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met His His His His His His Val Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu

1 5 10 15

Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr

20 25 30

Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His

35 40 45

Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu

50 55 60

Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr

65 70 75 80

Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu

85 90 95

Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe

100 105 110

Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn

115 120 125

Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His

130 135 140

Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu

145 150 155 160

Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu

165 170 175

Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe

180 185 190

Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile

195 200 205

Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser

210 215 220

Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys

225 230 235 240

Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr

245 250 255

Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln

260 265 270

Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln

275 280 285

Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser

290 295 300

Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr

305 310 315 320

Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His

325 330 335

Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu

340 345 350

Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly

355 360 365

Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys

370 375 380

Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu

385 390 395 400

Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser

405 410 415

Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg

420 425 430

Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu

435 440 445

Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg

450 455 460

Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile

465 470 475 480

Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln

485 490 495

Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu

500 505 510

Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr

515 520 525

Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro

530 535 540

Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe

545 550 555 560

Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe

565 570 575

Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp

580 585 590

Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile

595 600 605

Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu

610 615 620

Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu

625 630 635 640

Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys

645 650 655

Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys

660 665 670

Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp

675 680 685

Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile

690 695 700

His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val

705 710 715 720

Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly

725 730 735

Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp

740 745 750

Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile

755 760 765

Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser

770 775 780

Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser

785 790 795 800

Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu

805 810 815

Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp

820 825 830

Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile

835 840 845

Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu

850 855 860

Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu

865 870 875 880

Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala

885 890 895

Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg

900 905 910

Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu

915 920 925

Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser

930 935 940

Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val

945 950 955 960

Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp

965 970 975

Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His

980 985 990

Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr

995 1000 1005

Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr

1010 1015 1020

Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys

1025 1030 1035

Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe

1040 1045 1050

Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro

1055 1060 1065

Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys

1070 1075 1080

Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln

1085 1090 1095

Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser

1100 1105 1110

Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala

1115 1120 1125

Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

1130 1135 1140

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys

1145 1150 1155

Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile

1160 1165 1170

Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe

1175 1180 1185

Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile

1190 1195 1200

Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys

1205 1210 1215

Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu

1220 1225 1230

Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His

1235 1240 1245

Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln

1250 1255 1260

Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu

1265 1270 1275

Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn

1280 1285 1290

Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro

1295 1300 1305

Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr

1310 1315 1320

Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile

1325 1330 1335

Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr

1340 1345 1350

Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp

1355 1360 1365

Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1370 1375

<210> 3

<211> 135

<212> RNA

<213> sgRNA1

<400> 3

ggauccuaau acgacucacu auaggugucc gggcuuuugu cacguuuaag agcuaugcug 60

gaaacagcau agcaaguuua aauaaggcua guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg 120

agucggugcu uuuuu 135

<210> 4

<211> 135

<212> RNA

<213> sgRNA2

<400> 4

ggauccuaau acgacucacu auagcuggcg ugggcgugau cagguuuaag agcuaugcug 60

gaaacagcau agcaaguuua aauaaggcua guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg 120

agucggugcu uuuuu 135

<210> 5

<211> 3627

<212> DNA

<213> 3.6Kbp DNA切割底物序列

<400> 5

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 60

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaacacggg ataataccgc gccacatagc 120

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 180

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 240

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 300

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 360

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 420

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 480

accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctt 540

caagaattct catgtttgac agcttatcat cgataagctt taatgcggta gtttatcaca 600

gttaaattgc taacgcagtc aggcaccgtg tatgaaatct aacaatgcgc tcatcgtcat 660

cctcggcacc gtcaccctgg atgctgtagg cataggcttg gttatgccgg tactgccggg 720

cctcttgcgg gatatccgga tatagttcct cctttcagca aaaaacccct caagacccgt 780

ttagaggccc caaggggtta tgctagttat tgctcagcgg tggcagcagc caactcagct 840

tcctttcggg ctttgttagc agccggatga aacaaagcac tattgcactg gcactcttac 900

cgttactgtt tacccctgtg acaaaagccc ggacaccaga aatgcctgtt ctggaaaacc 960

gggctgctca gggcgatatt actgcacccg gcggtgctcg ccgtttaacg ggtgatcaga 1020

ctgccgctct gcgtgattct cttagcgata aacctgcaaa aaatattatt ttgctgattg 1080

gcgatgggat gggggactcg gaaattactg ccgcacgtaa ttatgccgaa ggtgcgggcg 1140

gcttttttaa aggtatagat gccttaccgc ttaccgggca atacactcac tatgcgctga 1200

ataaaaaaac cggcaaaccg gactacgtca ccgactcggc tgcatcagca accgcctggt 1260

caaccggtgt caaaacctat aacggcgcgc tgggcgtcga tattcacgaa aaagatcacc 1320

caacgattct ggaaatggca aaagccgcag gtctggcgac cggtaacgtt tctaccgcag 1380

agttgcagga tgccacgccc gctgcgctgg tggcacatgt gacctcgcgc aaatgctacg 1440

gtccgagcgc gaccagtgaa aaatgtccgg gtaacgctct ggaaaaaggc ggaaaaggat 1500

cgattaccga acagctgctt aacgctcgtg ccgacgttac gcttggcggc ggcgcaaaaa 1560

cctttgctga aacggcaacc gctggtgaat ggcagggaaa aacgctgcgt gaacaggcac 1620

aggcgcgtgg ttatcagttg gtgagcgatg ctgcctcact gaattcggtg acggaagcga 1680

atcagcaaaa acccctgctt ggcctgtttg ctgacggcaa tatgccagtg cgctggctag 1740

gaccgaaagc aacgtaccat ggcaatatcg ataagcccgc agtcacctgt acgccaaatc 1800

cgcaacgtaa tgacagtgta ccaaccctgg cgcagatgac cgacaaagcc attgaattgt 1860

tgagtaaaaa tgagaaaggc tttttcctgc aagttgaagg tgcgtcaatc gataaacagg 1920

atcatgctgc gaatccttgt gggcaaattg gcgagacggt cgatctcgat gaagccgtac 1980

aacgggcgct ggaattcgct aaaaaggagg gtaacacgct ggtcatagtc accgctgatc 2040

acgcccacgc cagccagatt gttgcgccgg ataccaaagc tccgggcctc acccaggcgc 2100

taaataccaa agatggcgca gtgatggtga tgagttacgg gaactccgaa gaggattcac 2160

aagaacatac cggcagtcag ttgcgtattg cggcgtatgg cccgcatgcc gccaatgttg 2220

ttggactgac cgaccagacc gatctcttct acaccatgaa agccgctctg gggctgaaat 2280

aattcgatat ggccgctgct gtgatgatga tgatgatgat gatgatgatg gcccatggta 2340

tatctccttc ttaaagttaa acaaaattat ttctagaggg gaattgttat ccgctcacaa 2400

ttcccctata gtgagtcgta ttaatttcgc gggatcgaga tctcgatcct ctacgccgga 2460

cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac 2520

atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg tttcggcgtg 2580

ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt gcatgcacca 2640

ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac tgggctgctt cctaatgcag 2700

gagtcgcata agggagagcg tcgagatccc ggacaccatc gaatggcgca aaacctttcg 2760

cggtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg tgaaaccagt 2820

aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt cccgcgtggt 2880

gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtggaagcgg cgatggcgga 2940

gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt cgttgctgat 3000

tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg cggcgattaa 3060

atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac gaagcggcgt 3120

cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg ggctgatcat 3180

taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca ctaatgttcc 3240

ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac agtattattt tctcccatga 3300

agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc aaatcgcgct 3360

gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct ggcataaata 3420

tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa ggcgactgga gtgccatgtc 3480

cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg cgatgctggt 3540

tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg ggctgcgcgt 3600

tggtgcggat atctcggtag tgggata 3627

Claims

1.功能化的dCas9修饰蛋白，其特征在于，包括：dCas9-biotin和dCas9-AP；

所述dCas9-biotin由如下方法制备而成：

所述dCas9-AP由如下方法制备而成：

向碱性磷酸酶溶液中加入SMCC，混合均匀，20-30℃条件下反应80-100min，反应结束后超滤除盐，得到第二溶液；

2.根据权利要求1所述的dCas9修饰蛋白，其特征在于，所述dCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述的功能化的dCas9修饰蛋白在如下(1)或(2)中的应用：

(1)检测核酸；

(2)制备检测核酸的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸为DNA。

5.一种检测核酸的试剂，其特征在于，所述试剂以权利要求1或2所述的功能化的dCas9修饰蛋白为有效成分。

6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包含：sgRNA1、sgRNA2、清洗液和反应液。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述sgRNA1的序列如SEQ ID NO.3所示；所述sgRNA2的序列如SEQ ID NO.4所示。

8.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述清洗液为添加有0.1～0.5mol/LNaCl、0.1～0.01％BSA、0.01～0.05％Triton X-100、1～5mmol/ml EDTA、0.01～0.05％叠氮钠、0.02-0.05％Proclin300、0.1～0.01％变性鲑鱼精DNA的0.1M PBS，pH 6.0～8.0。

9.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述反应液中含有1M二乙醇胺、5mM MgCl₂、0.2M KCl和20mM底物AMPPD，反应液的pH为10.3。

10.一种由dCas9介导特异性夹心识别DNA检测核酸的方法，其特征在于，利用权利要求5-9任一项所述的试剂进行检测，具体包括以下步骤：