KR20180087662A

KR20180087662A - 유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 포함하는 대장질환 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR20180087662A
Application number: KR1020170011967A
Authority: KR
Inventors: 정명준
Original assignee: 주식회사 쎌바이오텍
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2017-01-25
Publication date: 2018-08-02
Also published as: WO2018139703A1

Abstract

본 발명은 유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 포함하는 대장질환 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명의 유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 포함하는 약학조성물은 대장암에 대하여 유산균 유래 단백질, 또는 시스타틴은 단독으로 사용하는 경우보다 현저하게 상승된 대장암 억제 효과를 나타내므로, 효과적인 대장암 치료제로서 의학 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 포함하는 대장질환 치료용 약학조성물{A pharmaceutical composition comprising cystatin and protein derived from lactic acid bacteria}

본 발명은 유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 포함하는 대장질환 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

미생물 중에서 당류를 발효하여 에너지를 획득하고, 다량의 락트산을 생성하는 균종을 총칭하여 유산균이라고 한다. 유산균은 장 내에서 유해균의 번식을 억제하고, 원활한 배변 활동을 유도하는 등 건강한 장 환경을 조성하는 역할을 하므로, 잦은 스트레스와 서구화된 식습관, 음주 등의 영향으로 대장질환이 증가하고 있는 현대인에게 꼭 필요한 요소라 할 것이다.

이에 따라, 유산균을 포함하는 프로바이오틱스의 기능(KR10-2015-0066772A, KR0232639B, 및 EP1082964A1 등), 및 상기의 대장질환 치료 용도(US7887794B1, 및 US 7887794 B2 등) 관련 연구가 많이 이루어지고 있으나, 유산균 자체를 이용한 대장질환의 예방 또는 개선 효과일 뿐, 유산균으로부터 유효성분을 추출하여 대장암 등에 직접적인 치료제로 적용 가능한 기술은 미비한 실정이다.

한편, 시스타틴이란 세포 내 단백질 분해 효소의 작용을 저해하는 물질로서, 현재 세포 내에 존재하는 패밀리-1(시스타틴 알파, 시스타틴 베타), 분비성의 패밀리-2(시스타틴 C, 시스타틴 S, 난백 시스타틴, 우유 시스타틴), 패밀리-3(키니소겐) 등으로 분류된다. 시스타틴 알파는 표피, 소화관, 질 등의 상피 조직, 백혈구 등에 전재하며 병원균의 침입으로부터 우리 몸을 보호하고, 시스타틴 베타는 대부분의 세포질에 함유되어 있으며 단백질 분해효소의 작용을 저해하여 바이러스의 감염을 막는 작용을 한다. 난백 시스타틴도 바이러스로 인한 감염 방지에 도움이 되는데, 난백 시스타틴과 같은 작용을 하는 것이 오리자시스타틴으로 벼의 종자에서 발견된다. 시스타틴 C는 우리 몸의 모든 세포가 매 순간 일정량씩 만들어 발병을 예방하고 정상 생리를 유지하는 기능 단백질로서, 특히 면역계 방어 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명은 유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 포함하는 대장질환 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 대장암 성장 억제에 대하여 현저한 효과를 입증하였으므로, 대장암 치료제로서 의학 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 포함하는 대장질환 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서 “프로바이오틱스(probiotics)”란, 섭취되어 장에 도달하였을 때에 장내 환경에 유익한 작용을 하는 균주를 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균들이며 일부 바실러스(Bacillus) 등을 포함하고 있다. 러시아의 과학자 메치니코프(Elie Mechinikoff)가 불가리아 사람들이 장수를 누리는 이유가 락토바실러스로 발효된 발효유의 섭취 때문이라는 것을 밝혀내어 노벨상을 받은 이래로 유산균, 프로바이오틱스의 기능성은 오랫동안 연구되어 오고 있다. 유산균을 비롯한 세균들이 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산과 담즙산에서 살아남아 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여야 하며 장관 내에서 유용한 효과를 나타내어야 하고 독성이 없으며 비병원성이어야 한다.

사람의 장에는 약 1㎏의 균이 서식하고 있으며 음식물의 양과 균의 양이 거의 동일하게 존재하고, 매일 배설하는 분변 내용물도 수분을 제외하면 약 40%를 균이 차지한다. 사람의 분변을 현미경으로 관찰하면 거의 균 덩어리로 이루어져 있음을 알 수 있으며 이들 균의 99% 정도는 혐기성 균이다. 모유를 먹는 건강한 아기의 경우, 분변 균 중 90% 이상이 비피도박테리움으로 이루어져 있으나 나이가 들면서 점차 비피도박테리움은 감소하고 장내 유해균은 증가하게 된다(Bifido Microfl 7:35-43, 1998). 이러한 정상적인 노화 과정에서 장내 균총의 분포를 건강한 상태로 유지하도록 도와주는 것이 프로바이오틱스의 기능이다.

본 발명의 일 구체예에서 “유산균(lactic acid bacteria)”란, 젖산균이라고도 명명하며, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 젖산을 생성하는 세균의 총칭이다. “유산균”이라고 부르는 이름은 관용명이고 분류학적인 위치를 가리키는 것은 아니다. 유산균의 정의에 적합한 것은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 류코노스토크(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등의 균속이다. 형태적으로는 구균(락토코커스, 페디오코커스, 류코노스토크)과 간균(락토바실러스, 비피도박테리움)으로 나누어지고 그람(Gram) 염색성은 양성이다. 어느 것이나 산소가 적은 환경에서 잘 발육하여 각종 당으로부터 젖산을 생성한다. 산에 내성을 나타내는 것이 많고 영양요구성은 매우 복잡하여 당류 이외에 많은 종류의 아미노산이나 비타민을 요구하며 균종, 균주에 따라 미량 영양소를 가하지 않으면 생육할 수 없는 것도 있다. 유산균은 농산물이나 식품에서부터 사람이나 동물의 몸까지 자연계에 널리 분포하고 있으며 확실한 생육처를 알 수 없는 것도 있다. 락토코커스는 10℃에서 발육하지만 45℃에서는 발육하지 않고 최적온도가 30℃ 전후의 구균으로 정상발효를 한다. 유제품의 스타터(starter)로서 식품가공에 사용되는 균종이 많다. 페디오코커스는 정상발효를 하는 구균으로 4련의 세포배열을 한다. 생육온도, 유산의 선광성 등에 의해 8종류의 균종으로 분류되어 있다. 페디오코커스는 류코노스토크와 함께 발효에 관련된 주요 균으로서 동물의 생체와는 관계가 적다. 류코노스토크는 이상발효하는 연쇄구균으로 당 분해, 성장, 생육 pH 등에 의해 4종류의 균종으로 분류된다. 락토바실러스는 정상발효와 이상발효를 하는 2종류로 대별되는데 생육온도, 당분해, 성장, 생성 유산의 선광성 등에 따라 55균종 11아균종으로 분류되어 있다. 락토바실러스는 대표적인 유산균으로서 각종 발효식품에 사용되고 또한 장관 상재 균총으로서 사람이나 동물의 건강과 중요한 관계가 있다. 비피도박테리움은 이상발효를 하는 편성혐기성 그람 양성 간균으로서 주로 유산과 초산을 최종산물로 생산한다.

본 발명의 일 구체예에서 유산균 유래 단백질이란, 유산균으로부터 분리, 정제된 단백질을 의미하여, 상기 유산균은 당류를 발효하여 젖산을 생성하는 것이면 무엇이든 가능하나, 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus)이고, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 램노서스(Lactobacillus rhamnosus)이다.

본 발명에 있어서, 유산균 유래 단백질이란 “P8 단백질”, 또는 “P14 단백질”을 의미하나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서 “P8 단백질(Protein No.8)”이란, 본 발명의 실시예에 기재된 제조방법으로 유산균(락토바실러스 램노서스)로부터 추출된 8KDa 크기의 단백질 단편을 의미한다. 본 발명의 P8 단백질은 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 정의될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “P14 단백질(Protein No.14)”이란, 본 발명의 실시예에 기재된 제조방법으로 유산균(락토바실러스 램노서스)로부터 추출된 14KDa 크기의 단백질 단편을 의미한다. 본 발명의 P14 단백질은 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 정의될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “시스타틴(Cystatin)”이란, 세포 내 단백질 분해 효소의 작용을 저해하는 물질로서, 현재 세포 내에 존재하는 패밀리-1(시스타틴 A, 시스타틴 B), 분비성의 패밀리-2(시스타틴 C, 시스타틴 D, 시스타틴 S, 난백 시스타틴, 우유 시스타틴), 패밀리-3(키니소겐) 등으로 분류된다. 시스타틴 A는 표피, 소화관, 질 등의 상피 조직, 백혈구 등에 전재하며 병원균의 침입으로부터 우리 몸을 보호하고, 시스타틴 B는 대부분의 세포질에 함유되어 있으며 단백질 분해효소의 작용을 저해하여 바이러스의 감염을 막는 작용을 한다. 난백 시스타틴도 바이러스로 인한 감염 방지에 도움이 되는데, 난백 시스타틴과 같은 작용을 하는 것이 오리자시스타틴으로 벼의 종자에서 발견된다. 시스타틴 C는 우리 몸의 모든 세포가 매 순간 일정량씩 만들어 발병을 예방하고 정상 생리를 유지하는 기능 단백질로서, 특히 면역계 방어 기능에 중요한 역할을 한다. 그러나 여러 가지 종류의 병태에 따라 혈액 중 시스타틴 C의 농도가 증가한다고 보고되어 있다. 시스타틴 C의 혈중 농도가 1mg/L 이상인 경우 수치가 증가할수록 심장 마비, 뇌졸중, 돌연사, 만성 신부전 발생율이 증가하게 된다. 시스타틴 D는 분비 기전과 역할에 대한 규명이 아직 미비한 실정이다.

본 발명의 일 구체예에서 “대장질환”이란, 대장에 발생하는 여러가지 질병을 총칭하는 것으로, 이에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 장질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 크론병이고, 더욱 바람직하게는 대장암이다.

본 발명의 일 구체예에서 “약학조성물”이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 유효성분으로 포함하는 조성물이고, 바람직하게 상기 유산균 유래 단백질은 “P8 단백질” 또는 “P14 단백질”이고, 상기 시스타틴은 “시스타틴 A” 또는 “시스타틴 D”일 수 있으며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.

비경구적인 투여를 위해 본 발명의 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있으나, 가장 바람직하게는 액상 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 약학조성물은 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있고, 멸균될 수 있다. 상기 약학조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.

몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 액체로 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 또한 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물에 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학적 조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 추가적인 안정화제는 당, 아미노산, 또는 폴리머일 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 적용되는 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 완전멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, “식품 조성물”이란, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등에 사용할 수 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용할 수 있으며, 전체 식품 조성물에 포함되는 중량%는 제약 없이 이용 가능하다.

본 발명의 식품 조성물은 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 필수 성분으로서, 상기 유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 포함하는 조성물에는 특별한 제한은 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 일 구체예에서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 유효성분으로 포함하는 조성물의 경우, 액상 제형의 형태로 정맥 투여하거나, 분말, 타블렛, 캡슐, 또는 액상 제형의 형태로 경구 투여하는 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 목적하는 적응증의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 유산균 유래 단백질과 시스타틴을 유효성분으로 포함하는 대장질환 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 유산균 유래 단백질은 서열번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 대장질환 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 시스타틴은 시스타틴 A, 또는 D인 대장질환 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 유산균은 락토바실러스 램노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 대장질환 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 유산균은 락토바실러스 램노서스(Lactobacillus rhamnosus)인 대장질환 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 대장질환은 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 장질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 및 크론병으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 대장질환 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 대장질환은 대장암인 대장질환 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 유산균 유래 단백질과 시스타틴을 유효성분으로 포함하는 대장질환 개선용 식품조성물을 제공하고, 상기 유산균 유래 단백질은 서열번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 대장질환 개선용 식품조성물을 제공하며, 상기 시스타틴은 시스타틴 A, 또는 D인 대장질환 개선용 식품조성물을 제공하며, 상기 유산균은 락토바실러스 램노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 대장질환 개선용 식품조성물을 제공하며, 상기 유산균은 락토바실러스 램노서스(Lactobacillus rhamnosus)인 대장질환 개선용 식품조성물을 제공하며, 상기 대장질환은 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 장질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 및 크론병으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인 대장질환 개선용 식품조성물을 제공하며, 상기 대장질환은 대장암인 대장질환 개선용 식품조성물을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

대장암, 대장염, 과민성대장증후군, 크론병 등을 포함하는 대장질환의 예방, 개선, 및 치료에 유산균이 유효하다는 것은 공지된 기술이나, 유산균 성분과 함께 사용되어 동반 상승효과를 나타내는 치료제의 개발은 매우 미비하였다.

본 발명의 유산균 유래 단백질 및 시스타틴을 포함하는 약학조성물은 대장암에 대하여 유산균 유래 단백질, 또는 시스타틴을 단독으로 사용하는 경우보다 현저하게 상승된 대장암 억제 효과를 나타내므로, 효과적인 대장암 치료제로서 의학 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험예 1-1 내지 실험예 1-9의 단백질 처리 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험예 2-1 내지 실험예 2-9의 단백질 처리 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험예 1-1 내지 실험예 1-9의 단백질 처리로 대장암 세포의 성장이 억제된 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 실험예 2-1 내지 실험예 2-9의 단백질 처리로 대장암 세포의 성장이 억제된 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 유산균 유래 단백질의 분리 및 정제

실시예 1-1. 유산균 유래 단백질의 정제

다양한 종류의 유산균 배양 상등액 또는 균체파쇄액을 대장암 세포주인 DLD-1에 처리하여 항암활성을 확인하였다. 그 중 항암활성이 가장 좋은 락토바실러스 램노서스(Lactobacillus rhamnosus, KCTC 12202BP) 균체파쇄액을 선별하였다.

상기 락토바실러스 램노서스 균체파쇄액으로부터 유효성분으로서 항암단백질을 정제하기 위하여, 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC, fast protein liquid chromatography, GE 헬스케어) 장비로 크기 배재 크로마토그래피(Size exclusion chromatography, 세파덱스G-25, 탈염 컬럼, GE 헬스케어)를 수행하여 단백질만을 분리하였다.

상기 단백질만을 분리한 구획을 20mM 트리스 버퍼(Tris buffer, pH8.0)로 투석하고, 하이트랩 DEAE FF(HiTrap DEAE FF, GE 헬스케어)에 흡착하지 않은 단백질을 회수하여 3KDa 크기 멤브레인으로 농축한 뒤, 0.05M 인산염 pH 6.0의 용액으로 재투석하고, 하이트랩 DEAE SP (HiTrap DEAE SP, GE 헬스케어)에 흡착시키고, 0.5M 염화나트륨의 농도 구배에 따라 순차적으로 분리하였다. 분리된 분획물별로 대장암 세포에 처리하여 항암활성을 확인하였고, 가장 항암활성이 좋은 분획물을 농축하여 SDS-PAGE에서 확인하는 방법으로 8 KDa 크기의 단백질과 14 KDa 크기의 단백질을 분리하였고, 이를 각각 “P8 단백질”, 및 “P14 단백질”이라 명명하였다.

실시예 1-2. 유산균 유래 단백질의 동정

실시예 1-1의 방법으로 정제된 P8 단백질, 또는 P14 단백질을 전기영동한 후에 코마시(Coomassie) 젤에서 밴드를 회수하여 탈염용액(Destaining, 50% MeOH/D.W) 100 ㎕를 넣고 5분간 교반한 후 탈염용액을 완전히 제거하였다. 그 후, 200 mM ABC (ammonium bicarbonate, pH 7.8) 용액을 100 ㎕ 넣고 20분간 보관한 후 ABC 용액을 제거하고, 100 ㎕의 아세토니트릴을 넣고 2분간 교반하고, 아세토니트릴 용액을 제거하고, 100 ㎕의 ABC 용액을 첨가하여 2분간 교반하고, ABC 용액을 제거한 후, 100 ㎕의 아세토니트릴을 첨가하여 다시 2분간 교반하였다. 상기 과정을 총 3회 반복하였다. 이후, 아세토니트릴을 완전히 제거하고, 상온에서 젤을 건조하고, 건조된 젤에 20 ㎕의 트립신 용액 (0.2㎍)을 넣고 얼음에서 45분간 반응시킨 후, 젤에 흡수된 트립신 용액 외 나머지는 다시 제거하고, 70 ㎕의 50mM ABC 용액을 넣고, 37℃에서 12시간 이상 보관하였다. Geload Tip과 Poros R2 레진을 이용하여 마이크로 스케일의 컬럼을 제작하고, 10 ㎖의 주사기를 이용하여 마이크로 컬럼에 압력을 줄 수 있도록 주사기 전방이 컬럼과 일치하도록 제작하였다. 제작된 컬럼에 20 ㎕의 5% 포름산 용액을 넣고 주사기를 이용하여 컬럼을 통과시키고(평형화), In-gel digestion에서 만들어진 펩타이드 용액 30 ㎕를 마이크로 컬럼에 넣고 주사기로 통과시켰다(로딩). 20 ㎕의 5% 포름산 용액을 넣고 주사기를 이용하여 컬럼을 통과시키고, 1.5 ㎕의 50% 메탄올/49% H₂O/1% 포름산 용액을 넣고 주사기를 이용하여 컬럼내 펩타이드를 용출하였다(세정). 1.5 ㎕의 용출물은 nanoelectrospray needle (EconoTipTM, New Objective, USA)에 넣고 Q-TOF 소스에 장착하여(elution), MS 기기: Hybrid Quadrupole-TOF LC/MS/MS Mass Spectrometer (AB Sciex Instruments, CA 94404 USA)를 이용하여 분리된 단백질의 아미노산 서열을 분석하였다. 상기 분석된 P8 단백질, 또는 P14 단백질의 서열 및 상응하는 염기서열을 표 1에 기재하였다.

서열번호	정의	서열
서열번호 1	P8 단백질 염기서열	gcaacagtagatcctgaaaagacattgtttctcgatgaaccaatgaacaaggtatttgactggagcaacagcgaagcacctgtacgtgatgcgctgtgggattattacatggaaaagaacagccgtgataccatcaagactgaagaagaaatgaaaccagtcctagacatgtccgacgatgaggtcaaagccctagcagaaaaggttctcaagaagtaa
서열번호 2	P8 단백질 아미노산서열	ATVDPEKTLFLDEPMNKVFDWSNSEAPVRDALWDYYMEKNSRDTIKTEEEMKPVLDMSDDEVKALAEKVLKK
서열번호 3	P14 단백질 염기서열	gctaaatcacaagatcaatttaacgaaaaagctggtaaaaaaattacagtttcagatgaagctgttgataaagctgctaaaaaaattgaacaagttggttacgttacagaaaaagatgttccagaaatgattgatcgtgattacacacgtgctctttcaaaaaaagtttcagctaaacttcatcaagataaagatgatgattacttttacgaagaaccatttgattacgaaaacggtcgtattgctaacattatttgggatatggataaaattaaaacacgtgaagaagctatgaaaacacttgctaacgaacttggtcttacagttccaaaaattgttatgcgtaaagttgatgaacaagttttt
서열번호 4	P14 단백질 아미노산서열	AKSQDQFNEKAGKKITVSDEAVDKAAKKIEQVGYVTEKDVPEMIDRDYTRALSKKVSAKLHQDKDDDYFYEEPFDYENGRIANIIWDMDKIKTREEAMKTLANELGLTVPKIVMRKVDEQVF

실시예 2. 대장암 세포에 대한 유산균 유래 단백질 및 시스타틴의 효과 확인

대장암 세포주 HCT116 및 DLD-1를 각각 96웰-플레이트에 1x10⁴cells/웰의 밀도로 배양하고, P8 단백질과 시스타틴 A의 병용처리 순서에 따라 하기 표 2와 같이 실험예를 구분하였다.

실험예	정의
실험예 1-1	비처리
실험예 1-2	P8 단백질(20 ㎍) 1회 처리
실험예 1-3	P8 단백질(50 ㎍) 1회 처리
실험예 1-4	P8 단백질(20 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리 후, 시스타틴 A(10 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리
실험예 1-5	P8 단백질(20 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리 후, 시스타틴 A(20 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리
실험예 1-6	P8 단백질(50 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리 후, 시스타틴 A(10 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리
실험예 1-7	P8 단백질(50 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리 후, 시스타틴 A(20 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리
실험예 1-8	P8 단백질(20 ㎍) 6일간(1일 1회) 처리
실험예 1-9	P8 단백질(50 ㎍) 6일간(1일 1회) 처리
실험예 2-1	비처리
실험예 2-2	시스타틴 A(10 ㎍) 1회 처리
실험예 2-3	시스타틴 A(20 ㎍) 1회 처리
실험예 2-4	시스타틴 A(10 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리 후, P8 단백질(20 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리
실험예 2-5	시스타틴 A(10 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리 후, P8 단백질(50 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리
실험예 2-6	시스타틴 A(20 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리 후, P8 단백질(20 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리
실험예 2-7	시스타틴 A(20 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리 후, P8 단백질(50 ㎍) 3일간(1일 1회) 처리
실험예 2-8	시스타틴 A(10 ㎍) 6일간(1일 1회) 처리
실험예 2-9	시스타틴 A(20 ㎍) 6일간(1일 1회) 처리

상기 표 2와 같이, HCT116, 또는 DLD-1 세포 각각에서 실험예 1-1 내지 실험예 2-9그룹으로 나누어 단백질을 처리하였다. 음성 대조군은 단백질 정제 시 사용한 완충용액인 0.1% PBS를 사용하였다. 보다 구체적으로, 단백질 처리 과정을 표현한 모식도를 도 1과 도 2에 기재하였다.

단백질 처리 완료 후에 세포 생존율 측정용 시약(MTT formazan, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)을 웰당 10㎕씩 처리하여 2시간 동안 반응시켰다. 이를 마이크로플레이트리더(Microplate reader, amersham, Biorad, 미국, 일본)를 이용하여 450㎚에서 흡광도 측정하고, 측정값을 세포 생존율(Cell survival rate)로 산출하였다. 그 결과, HCT116와 DLD-1 세포 모두 P8 또는 시스타틴 단백질을 단독 투여한 경우보다, 병용 투여시 암세포의 성장이 유의하게 억제된 것을 확인하였다. 병용 투여시 P8 또는 시스타틴의 처리 순서는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> CELLBIOTECH INTERNATIONAL CO., LTD. <120> A pharmaceutical composition comprising cystatin and protein derived from lactic acid bacteria <130> DPB167504 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 219 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 1 gcaacagtag atcctgaaaa gacattgttt ctcgatgaac caatgaacaa ggtatttgac 60 tggagcaaca gcgaagcacc tgtacgtgat gcgctgtggg attattacat ggaaaagaac 120 agccgtgata ccatcaagac tgaagaagaa atgaaaccag tcctagacat gtccgacgat 180 gaggtcaaag ccctagcaga aaaggttctc aagaagtaa 219 <210> 2 <211> 72 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 2 Ala Thr Val Asp Pro Glu Lys Thr Leu Phe Leu Asp Glu Pro Met Asn 1 5 10 15 Lys Val Phe Asp Trp Ser Asn Ser Glu Ala Pro Val Arg Asp Ala Leu 20 25 30 Trp Asp Tyr Tyr Met Glu Lys Asn Ser Arg Asp Thr Ile Lys Thr Glu 35 40 45 Glu Glu Met Lys Pro Val Leu Asp Met Ser Asp Asp Glu Val Lys Ala 50 55 60 Leu Ala Glu Lys Val Leu Lys Lys 65 70 <210> 3 <211> 366 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 3 gctaaatcac aagatcaatt taacgaaaaa gctggtaaaa aaattacagt ttcagatgaa 60 gctgttgata aagctgctaa aaaaattgaa caagttggtt acgttacaga aaaagatgtt 120 ccagaaatga ttgatcgtga ttacacacgt gctctttcaa aaaaagtttc agctaaactt 180 catcaagata aagatgatga ttacttttac gaagaaccat ttgattacga aaacggtcgt 240 attgctaaca ttatttggga tatggataaa attaaaacac gtgaagaagc tatgaaaaca 300 cttgctaacg aacttggtct tacagttcca aaaattgtta tgcgtaaagt tgatgaacaa 360 gttttt 366 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 4 Ala Lys Ser Gln Asp Gln Phe Asn Glu Lys Ala Gly Lys Lys Ile Thr 1 5 10 15 Val Ser Asp Glu Ala Val Asp Lys Ala Ala Lys Lys Ile Glu Gln Val 20 25 30 Gly Tyr Val Thr Glu Lys Asp Val Pro Glu Met Ile Asp Arg Asp Tyr 35 40 45 Thr Arg Ala Leu Ser Lys Lys Val Ser Ala Lys Leu His Gln Asp Lys 50 55 60 Asp Asp Asp Tyr Phe Tyr Glu Glu Pro Phe Asp Tyr Glu Asn Gly Arg 65 70 75 80 Ile Ala Asn Ile Ile Trp Asp Met Asp Lys Ile Lys Thr Arg Glu Glu 85 90 95 Ala Met Lys Thr Leu Ala Asn Glu Leu Gly Leu Thr Val Pro Lys Ile 100 105 110 Val Met Arg Lys Val Asp Glu Gln Val Phe 115 120

Claims

유산균 유래 단백질과 시스타틴을 유효성분으로 포함하는, 대장질환 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 유산균 유래 단백질은 서열번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질인, 대장질환 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 시스타틴은 시스타틴 A, 또는 D인, 대장질환 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 램노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 대장질환 치료용 약학조성물.
제 4항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 램노서스(Lactobacillus rhamnosus)인, 대장질환 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 대장질환은 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 장질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 및 크론병으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 대장질환 치료용 약학조성물.
제 6항에 있어서,
상기 대장질환은 대장암인, 대장질환 치료용 약학조성물.
유산균 유래 단백질과 시스타틴을 유효성분으로 포함하는, 대장질환 개선용 식품조성물.
제 8항에 있어서,
상기 유산균 유래 단백질은 서열번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질인, 대장질환 개선용 식품조성물.
제 8항에 있어서,
상기 시스타틴은 시스타틴 A, 또는 D인, 대장질환 개선용 식품조성물.
제 8항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 램노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 대장질환 개선용 식품조성물.
제 11항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 램노서스(Lactobacillus rhamnosus)인, 대장질환 개선용 식품조성물.
제 8항에 있어서,
상기 대장질환은 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 장질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 및 크론병으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 대장질환 개선용 식품조성물.
제 13항에 있어서,
상기 대장질환은 대장암인, 대장질환 개선용 식품조성물.